CN108018377B

CN108018377B - 一种罗湖病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN108018377B
Application number: CN201711282120.5A
Authority: CN
Inventors: 曾伟伟; 王庆; 王英英; 尹纪元; 汤亚方; 石存斌; 张德峰; 李莹莹; 任燕; 常藕勤
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2017-12-07
Filing date: 2017-12-07
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2037-12-07
Also published as: CN108018377A

Abstract

本发明公开了一种罗湖病毒的RT‑LAMP检测引物组、试剂盒及方法。本发明试剂盒包括RT‑LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、荧光染料，RT‑LAMP引物组，蒸馏水，阳性和阴性对照样品；所述的RT‑LAMP组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成。本发明罗湖病毒RT‑LAMP检测试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、快速准确等特点，非常适用于出口检疫及养殖场的现场检测，易于大规模推广应用。

Description

一种罗湖病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于病毒分子生物学领域，具体涉及一种罗湖病毒的RT-LAMP可视化快速检测试剂盒，更具体涉及一种罗湖病毒的RT-LAMP引物组、检测方法及其可视化快速检测试剂盒。

背景技术

从2000年至今，我国罗非鱼养殖量一直居世界第一，近年来，我国罗非鱼养殖产量仍保持增长态势，2015 年总产量约178 万t，约占全球总产量的30%。罗非鱼产业作为我国出口导向型产业，主要依靠出口贸易来维持产业运转。国内共有133家罗非鱼加工出口企业，总出口量约40 万吨，销往97 个国家和地区。2002 年开始我国罗非鱼的出口量与出口额基本都呈持续增长的态势，2005年罗非鱼出口量为10.74 万吨，2009 年为25.89 万吨，2013年为40.67 万吨，创下历史最高水平，总出口额为15.13 亿美元。罗非鱼养殖已成为我国出口创汇和渔民增收的重要途径。然而，近年来以色列、厄瓜多尔和埃及等国相继暴发的与病毒有关的养殖和野生罗非鱼大量死亡事件，给这些国家的罗非鱼养殖业造成了重大损失。经研究发现引起这些死鱼事件的病原均为罗湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV），是一种新型鱼RNA 病毒。从以色列和厄瓜多尔死鱼事件中病鱼的肝、脑病灶中均发现病毒核酸，同时观察到由病鱼组织分离到的TiLV 在培养细胞中繁殖后，接种到健康鱼体内后，可产生相同症状的疾病，提示TiLV 为以色列和厄瓜多尔死鱼事件的病因。以色列和埃及两国相邻，但另一个地理上相隔甚远的南美国家厄瓜多尔也发生了由同种病毒引起死鱼事也发生了由TiLV 导致的大规模死鱼事件，说明该病毒已经对全球性罗非鱼养殖业造成了威胁。

罗湖病毒病是近几年新出现的一种高致病性和高死亡率的罗非鱼病毒病，病原为罗湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV），感染该病毒的罗非鱼死亡率高达90%以上，TiLV为正粘样病毒科，负链RNA病毒，基因组分为10个节段。截止目前为止，厄瓜多尔、以色列、哥伦比亚、埃及、泰国等多个国家和区域均由此病爆发的报道，中国目前虽然未见罗湖病毒病的相关报道，但多地爆发的罗非鱼病害，其症状与罗湖病毒病及其相似，并且已检测出TiLV，但国内罗湖病毒的流行情况还完全未知。针对TiLV的检测方法，有巢式和半巢式RT-PCR，和原位杂交，这些检测方法操作过程均较为复杂，耗时长，需要特定的仪器设备，且巢式和半巢式RT-PCR的假阳性率比较高，因此，已有的这些检测方法都不适用于罗湖病毒的高效、快速现场检测。

LAMP技术是2000年由日本学者Notomi等发明的一种恒温扩增方法，它通过针对靶基因的6个区域而设计4对特异性引物，只有在引物与靶序列结合扩增反应才能进行，特异性很高。在60-65℃等温条件下利用链置换DNA聚合酶催化几十分钟就可以扩增出10⁹靶序列拷贝。相对于传统的核酸扩增方法，LAMP法扩增克服了需要昂贵仪器的特点，整个检测过程在等温条件下只需要1-2个小时就可以完成；该方法还具有很高的敏感性和特异性，且在反应体系中加入染料之后可以通过肉眼观察颜色的变化就能进行结果判定。该技术自产生之后已经在转基因食品检测、动物疫病诊断及动物胚胎的性别鉴定等领域得到广泛的推广及应用。LAMP适合基层养殖户及出入境检疫对病原进行快速检测。因此，建立TiLV的RT-LAMP快速检测的技术，不仅可以做到对罗湖病毒进行快速检测，而且可以简化操作程序、节约成本。对于罗湖病毒病的流行病学调查、病原监测及早期预警都具有重要的意义。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种罗湖病毒的RT-LAMP可视化快速检测试剂盒，在罗湖病毒特异性检测中，使用RT-LAMP检测试剂盒完成对罗湖病毒的特异性检测，通过反应产物中加入荧光染料后的颜色变化来判断被测样品是否含有TiLV。

本发明的目的之一在于提供一种罗湖病毒的RT-LAMP检测引物组。

本发明的另一目的在于提供一种罗湖病毒的RT-LAMP检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种罗湖病毒的RT-LAMP检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测罗湖病毒的RT-LAMP引物组，所述RT-LAMP引物组包括外引物、内引物和环引物，具体序列如下：

内引物：

TiLV-FIP：5’-CTTCTGCGAGTCTTTGAGGCACCTGATGGCCCAGACACTA-3’（SEQ ID NO：1）；

TiLV-BIP: 5’-AGAACCCGACTAGAGGCTCTCTCTGACACGAGGAGCCTATG-3’ （SEQ ID NO：2）；

外引物：

TiLV-F3：5’-CTGACTTGGGATTGCCACC-3（SEQ ID NO：3）；

TiLV-B3：5’-TGCCTAGCTGCTCTGATCT-3（SEQ ID NO：4）；

环引物：

TiLV-LF：5’-AGGACAGACAGGACTTTCTGATC-3（SEQ ID NO：5）；

TiLV-LB：5’-CAGACTTGGACCCCCTGGT-3（SEQ ID NO：6）。

一种检测罗湖病毒的RT-LAMP试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物组。

进一步的，上述试剂盒中外引物、环引物、内引物的摩尔含量比为1:3～5:7～9。

进一步的，上述试剂盒还包含RT-LAMP反应液，Bst DNA聚合酶，AMV反转录酶，荧光染料，阳性和阴性对照样品。

进一步的，所述RT-LAMP反应液包含23~2.7 mM dNTPs、14~18mM MgSO₄、1.4~1.8mM的甜菜碱、18~22mM的KCl、0.15~0.25%的Tween20、18~22mM的(HN₄)₂SO₄、35~45mM的Tris-ClpH8.6~9.0。

进一步的，所述荧光染料为钙黄绿素。

进一步的，所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。

一种罗湖病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：

1）提取待检样品的RNA；

2）以提取的RNA为模板，用上述所述的引物组进行RT-LAMP扩增；

3）结果分析：反应结束后向反应物中加入钙黄绿素染料，观察是否发生变色，如果变色为黄绿色，说明样品为阳性；或者通过电泳分析是否出现梯形条带；如果出现梯状条带，说明样品为阳性，否则为阴性；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

进一步的，所述RT-LAMP扩增的反应体系为22～27μL，含有TiLV-FIP 1.4～1.8μM、TiLV-BIP 1.4～1.8μM、TiLV-F3 0.15～0.25μM、TiLV-LB 0.15～0.25μM、TiLV-B3 0.6～1.0μM、TiLV-LF 0.6～1.0μM，上述任一项所述的RT-LAMP反应液12～13μL、Bst DNA聚合酶6～10U，AMV反转录酶 3～5U， RNA模板 5～100ng，余量为DEPC水。

进一步的，所述RT-LAMP扩增的反应程序为62～66℃反应30～60min。

本发明的有益效果是：

（1）本发明通过对RT-LAMP条件的优化，以及敏感性，特异性试验的研究，建立了罗湖病毒的RT-LAMP诊断方法，确定了检测效果具有高特异性、高敏感性的6条引物，为罗湖病毒的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法，该方法具有反应条件简单，结果判定方便，敏感性稿，特异性强，快速等优点。

（2）本发明的优势还在于已经将这种RT-LAMP检测方法研制成试剂盒。本发明所提供的TiLV的RT-LMAP可视化快速检测试剂盒，操作简单，且直接通过产物加入荧光染料后的颜色变化进行判定，实现了可视化，反应结果易判定，非常易于检验检疫及临床推广。

附图说明

图1 为不同反应时间对罗湖病毒RT-LAMP检测效果的影响；M:DL2000 DNAmarker，泳道1-6依次为10min、20min、30min、40min、50min、60min；

图2 为反应温度对罗湖病毒RT-LAMP检测效果的影响；M:DL2000 DNA marker，泳道1-6依次为60、61、62、63、64、65℃；

图3 为本发明试剂盒检测罗湖病毒的特异性试验的琼脂糖凝胶电泳检测结果；M:DL2000 DNA marker，1-6为RT-LAMP方法扩增的罗非鱼无乳链球菌、GCRV、KHV、ISKNV、SCRV、CyHV-2、阴性对照和TiLV；

图4 为本发明试剂盒检测罗湖病毒的特异性试验的显色检测结果；M:DL2000 DNAmarker，1-8为RT-LAMP方法扩增的罗非鱼无乳链球菌、GCRV、KHV、ISKNV、SCRV、CyHV-2、阴性对照和TiLV；

图5 是本发明试剂盒检测罗湖病毒的灵敏度试验琼脂糖凝胶电泳检测结果；M:DL2000 DNA marker，泳道1-7为使用10⁶-10⁰稀释的TiLV阳性RNA模板。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施案例尽是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明任何技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 检测罗湖病毒的RT-LAMP引物组

本申请经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物组TiLV-FIP、TiLV-BIP、TiLV-F3、TiLV-LB、TiLV-B3、TiLV-LF对用RT-LAMP法检测罗湖病毒的效果最好，其碱基序列如下所示。

内引物：

外引物：

TiLV-F3：5’-CTGACTTGGGATTGCCACC-3（SEQ ID NO：3）；

TiLV-B3：5’-TGCCTAGCTGCTCTGATCT-3（SEQ ID NO：4）；

环引物：

TiLV-LF：5’-AGGACAGACAGGACTTTCTGATC-3（SEQ ID NO：5）；

TiLV-LB：5’-CAGACTTGGACCCCCTGGT-3（SEQ ID NO：6）。

实施例2 检测罗湖病毒的RT-LAMP试剂盒

试剂盒包括以下组分：

（1）实施例1所设计的RT-LAMP引物组。

（2）RT-LAMP反应液：包含23~2.7 mM dNTPs、14~18mM MgSO₄、1.4~1.8mM的甜菜碱、18~22mM的KCl、0.15~0.25%的Tween20、18~22mM的(HN₄)₂SO₄、35~45mM的Tris-Cl pH8.6~9.0。

（3）Bst DNA聚合酶。

（4）AMV反转录酶。

（5）荧光染料：钙黄绿素。

（6）阳性和阴性对照样品：阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。

实施例3 检测罗湖病毒RT-LAMP的方法

①病毒RNA的提取

按Trizol试剂盒（购自Invitrogen公司，货号：15596-026）的说明书或按照QiagenRNA提取试剂盒（购自Qiagen公司，货号：74104）的说明书步骤，从感染相应病毒的鱼体内脏组织中提取RNA，作为RT-PCR反应的模板。Trizol法提取总RNA的主要步骤如下：取组织样品加入500μl Trizol试剂，混匀后静置5分钟，加入400μl氯仿，振荡混匀1min，12000rpm于4℃离心15min，取上清加入等体积异丙醇，颠倒混匀，4℃放置15min, 12000rpm于4℃离心15min，弃上清，用70%乙醇洗沉淀，12000rpm于4℃离心5min，用30μl 无RNAse水重悬沉淀。

②试剂配制

在每个PCR 反应管放入组分如表1 中所示的检测试剂和RNA 样本，其中罗湖病毒RT-LAMP反应液按照表2配制，RT-LAMP反应液包含TiLV-FIP 2μL、TiLV-BIP 2μL、TiLV-F30.25μL、TiLV-LB 0.25μL、TiLV-B3 1.0μL、TiLV-LF 1.0μL，RT-LAMP反应液12.5μL、Bst DNA聚合酶 1.0μL，AMV反转录酶 0.5μL，待检RNA 5～100ng，用DEPC水补齐到25μL。

表1 RT-LAMP反应体系

表 2 RT-LAMP反应液的成分及浓度

③反应程序

反应程序为63 ℃扩增 60 min，80℃灭活5min。

④结果分析

反应结束后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析或者在扩增产物中加入钙黄绿素，当琼脂糖凝胶电泳分析出现特异性梯度条带或者扩增管颜色变为黄绿色时，则判断为罗湖病毒阳性；当没有出现特异性梯度条带或者扩增管颜色没有变化，则判断为罗湖病毒阴性。

实施例4 反应温度和扩增时间优化

按照实施例3配置反应体系，包含TiLV-FIP 2μL、TiLV-BIP 2μL、TiLV-F3 0.25μL、TiLV-LB 0.25μL、TiLV-B3 1.0μL、TiLV-LF 1.0μL，RT-LAMP反应液12.5μL、Bst DNA聚合酶1.0μL，AMV反转录酶 0.5μL，待检RNA 5～100ng，用DEPC水补齐到25μL。然后分别固定扩增温度和扩增时间，分别对反应温度和扩增时间进行优化；以63 ℃的温度分别扩增10min、20min、30min、40min、50min和60min，比较扩增时间对扩增效果的影响；分别以60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃均反应60min,比较不同温度对扩增效果的影响。

实验结果表明，本发明试剂盒反应40min以后，其扩增效果较佳（图1）；其中63℃作为发明试剂盒的反应温度效果最佳（图2），因此，确定本发明试剂盒的最佳扩增时间和扩增温度为63℃扩增40min。

实施例5 本发明罗湖病毒RT-LAMP试剂盒特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，用本发明的罗湖病毒RT-LAMP试剂盒以最佳反应条件来检测罗非鱼无乳链球菌、GCRV、KHV、ISKNV、SCRV、CyHV-2、DEPC水阴性对照和TiLV来分析本方法对鱼类其它常见病原和罗湖病毒检测情况，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳和加入钙黄绿素显色检测。

检测结果表明：RT-LAMP试剂盒仅对罗湖病毒进行扩增，如电泳检测只有罗湖病毒组被检测出扩增条带（图3），显色检测只有罗湖病毒组发生颜色变化，呈黄绿色（图4），而用其它病原的核酸作为模板时没有出现特异性的梯度条带（图3）和颜色变化（图4）。表明本发明检测试剂盒只能特异性扩增出罗湖病毒的核酸，而不与其它病原核酸发生交叉反应。

实施例6 比较了本发明罗湖病毒RT-LAMP方法和RT-PCR方法的敏感性

本试验对罗湖病毒RNA进行10倍倍比稀释，比较了RT-LAMP和RT-PCR方法对10⁰至10⁶ 这7个稀释梯度罗湖病毒RNA的检测效果，两种方法的扩增产物都用琼脂糖凝胶电泳来检测，此外，RT-LAMP扩增产物同时还进行显色检测。

结果表明，无论是琼脂糖凝胶电泳还是显色检测，本发明RT-LAMP方法在TiLV的RNA稀释至10⁵时仍任检测为阳性（图5），而RT-PCR这个稀释度则检测为阴性，其最低检测浓度为10⁴，可见，本发明RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高一个数量级，表明本发明试剂盒对于罗湖病毒的诊断具有较高的灵敏性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种罗湖病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttctgcgag tctttgaggc acctgatggc ccagacacta 40

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaacccgac tagaggctct ctctgacacg aggagcctat g 41

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgacttggg attgccacc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcctagctg ctctgatct 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggacagaca ggactttctg atc 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagacttgga ccccctggt 19

Claims

1.一种检测罗湖病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于，所述RT-LAMP引物组由外引物、内引物和环引物组成，具体序列如下：

内引物：

TiLV-FIP：5’-CTTCTGCGAGTCTTTGAGGCACCTGATGGCCCAGACACTA-3’；

TiLV-BIP:5’-AGAACCCGACTAGAGGCTCTCTCTGACACGAGGAGCCTATG-3’；

外引物：

TiLV-F3：5’-CTGACTTGGGATTGCCACC-3’；

TiLV-B3：5’-TGCCTAGCTGCTCTGATCT-3’；

环引物：

TiLV-LF：5’-AGGACAGACAGGACTTTCTGATC-3’；

TiLV-LB：5’-CAGACTTGGACCCCCTGGT-3’。

2.一种检测罗湖病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含RT-LAMP反应液，BstDNA聚合酶，AMV反转录酶，荧光染料，阳性和阴性对照样品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为钙黄绿素。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。