CN109762939A

CN109762939A - 用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针以及试剂盒

Info

Publication number: CN109762939A
Application number: CN201910106678.0A
Authority: CN
Inventors: 梁红茹; 蔡秀珠; 范芷仪; 林强; 付小哲; 李宁求; 刘礼辉; 黄志斌; 牛银杰
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2019-02-02
Filing date: 2019-02-02
Publication date: 2019-05-17

Abstract

本发明提供了用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。本发明可对鳜鱼弹状病毒进行快速检测，可以做到对鳜鱼弹状病毒定量分析，而且可以简化操作程序、节约成本。本发明对鳜鱼弹状病毒临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测鳜鱼弹状病毒提供了便利条件。

Description

用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针以及试剂盒

技术领域

本发明属于水产病害微生物检测技术领域，具体涉及用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针以及试剂盒。

背景技术

鳜鱼是一种肉质优良的名优鱼类，味道鲜美，因其蛋白质含量高而深受欢迎。而鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)对鳜鱼危害很大，流行颇广，对鳜鱼养殖造成极大的影响，成为鳜鱼养殖的瓶颈之一。鳜鱼一旦感染SCRV，没有有效的治疗措施。因此，对SCRV的监测，尽早的发现病原是防治该病的有效方式之一。

SCRV由核蛋白基因(nucleoprotein,N)、磷酸化蛋白基因(phosphoprotein,P)、基质蛋白基因(matrix protein,M)、糖蛋白基因(glycoprotein,G)和RNA依赖的RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNApolymerase protein,L)这五个主要基因构成。其中，N基因为一个保守基因，序列的保守性强。

虽然鳜鱼弹状病毒对鱼类养殖业的巨大危害，但目前还没有较有效的检测方法对SCRV进行定量检测。本发明针对SCRV的N基因的保守区设计引物，建立SCRV的荧光定量PCR(taqMan Real-time PCR)检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供了用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述引物和探针在制备用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒中应用，每20μL反应体系具有以下浓度的组分：cDNA模板1μL、阳性标准品1μL、0.6μL 0.2-1.0μmol/L引物和0.2-1.0μmol/L探针、PCR预混液10μL，Premix ExTaq TM 10μL、ROX Reference DyeⅡ(50×)0.5μL，余量为无菌蒸馏水；所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，所述探针序列如SEQ ID NO:3所示，所述阳性标准品为含有鳜鱼弹状病毒的DNA质粒。

本发明还提供一种用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，包括如权利要求1所述的引物和探针。

优选地，所述试剂盒中所述引物和探针的终浓度均为0.2～1.0μmol/L。

优选地，所述试剂盒中所述引物终浓度为0.3μmol/L，所述探针终浓度为0.3μmol/L。

优选地，所述的试剂盒还包括阳性标准品、PCR预混液和无菌蒸馏水，所述阳性标准品为含有鳜鱼弹状病毒N基因的DNA质粒。

本发明的有益效果在于：可对鳜鱼弹状病毒进行快速检测，可以做到对鳜鱼弹状病毒定量分析，而且可以简化操作程序、节约成本。本发明对鳜鱼弹状病毒临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测鳜鱼弹状病毒提供了便利条件。

附图说明

图1为重组质粒P-N的PCR扩增电泳图(M：Marker DL2000；1：N基因的ORF扩增产物；2：阴性对照)；

图2为SCRV实时荧光顶定量PCR标准曲线图；

图3为SCRV实时荧光定量PCR灵敏度检测的扩增曲线图(从左到右依次为1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL的标准品的扩增结果)；

图4为SCRV常规PCR灵敏度检测的电泳图(M：Marker DL2000；1-8为质粒的浓度依次是1×10⁹～1×10²(拷贝/μL)；9空白对照)；

图5为SCRV实时定量PCR 40次重复实验结果的扩增曲线图；

图6为SCRV实时定量PCR特异性检测结果扩增曲线图(1为重组质粒；2为SCRV；3为ISKNV、SCRV、GCRV、KHV、SGIV、TiLV、NNV、SVCV)。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

1、引物的设计

根据GenBank中SCRV的N蛋白基因序列，应用Primer5软件设计特异性引物和探针，第一对引物(SCRV-QY-N-F、SCRV-QY-N-R)用于扩增SCRV的N基因的ORF框，扩增产物长度为1290bp，用于构建重组质粒：P-N，为制作标准曲线提供模板；第二对引物(Rhabdovirus140-F、Rhabdovirus140-R)和探针(Rhabdovirus140 TAP)用于荧光定量PCR扩增，扩增产物长度为140bp。引物和探针由广州擎科生物科技有限公司合成，引物和探针序列如下：

Rhabdovirus140-F:5'-GACATGTTCTTCTACAGATTCAAC-3'(SEQ ID NO:1)

Rhabdovirus140-R:5'-CAATCCAGCACTCCACTG-3'(SEQ ID NO:2)；

Rhabdovirus140-TAP:5'-AGGTTCAAAGACTGTGCAGCTCTGT-3'(SEQ ID NO:3)；

SCRV-QY-N-F：5'-GTAGCTAGCGCCACCATGGAAAACCAAATCATCAAGAG-3'(SEQ ID NO:4)

SCRV-QY-N-R：5'-GTAGCGCCGCATTTCACAAAGCTTGGTGTTTCAGC-3'(SEQ ID NO:5)。

2、阳性标准品的制备

用SCRV感染SCC，待细胞出现病变后收集细胞病毒材料，提取病毒总RNA，经DNaseI RNase-free(Fermentas)处理后，分别测量RNA样品在260和280nm波长下的吸光度值，计算RNA样品的浓度和纯度。利用PrimeScript TM RT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒进行反转录得到cDNA。以获得的cDNA为模板，SCRV-QY-N-F、SCRV-QY-N-R为引物进行PCR扩增。反应参数为98℃预变性2min，98℃10s，60℃10s，72℃1min20s，共30个循环，最后72℃延伸10min。同时设立无模板的阴性对照。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物经胶回收纯化后与simpleblunt载体(TaKaRa)连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒酶切及电泳检测正确后进行测序。测序正确的重组质粒经测定在260和280nm处的吸光度后，根据以下方法计算重组质粒的DNA拷贝数。质粒拷贝数(拷贝数/μL)＝6.02×10²³(拷贝数/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒分子量(g/mol)。

结果如图1所示，在电泳图上可看出获得1290bp左右的片段，将该片段连接到克隆载体，重组质粒提取后经分光光度计测定浓度为122μg/mL，PCR扩增、测序分析证实与预期插入片段相同，表示成功构建了标准重组质粒。

3、荧光定量PCR的建立和条件优化

采用TaqMan探针技术，将上、下游引物、探针、Premix(TaKaRa)Ex Taq TM和ROXReferenceDyeⅡ(50×)加入到反应体系中，用7500型荧光定量PCR仪进行PCR扩增。对引物和探针浓度进行筛选，以获得最低的Ct值和最高的荧光强度增加值标准。选用0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0μmol/L的引物浓度和0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0μmol/L的探针浓度，筛选引物和探针的最佳浓度。

结果表明，重组质粒采用荧光定量PCR引物Rhabdovirus140-F、Rhabdovirus140-R进行普通PCR扩增后，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，在150bp左右有一条特异性条带，与预期片段长度(140bp)基本一致，表明该引物可用于荧光定量PCR反应。经过荧光定量PCR反应条件的优化，最终确定反应体系为：Premix ExTaq TM 10μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.5μL，PCR Rhabdovirus140-F和Rhabdovirus140-R各0.6μL，终浓度均为0.3μmol/L，探针Rhabdovirus140-TAP为0.6μL，终浓度为0.3μmol/L，DNA模板1μL，dd H₂O 6.7μL，总体系为20μL。采用2步法PCR扩增程序：预变性1个循环，95℃30s；PCR反应，40个循环，95℃5s，60℃34s。

4、构建标准曲线

将重组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为1×10⁹～1×10²个/μL作为标准品模板，每个稀释度设3个平行。在荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析，以灭菌的ddH₂O代替模板作为阴性对照。20μL体系：Premix(TaKaRa)Ex Taq TM 10μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.5μL，PCR Rhabdovirus140-F和Rhabdovirus140-R各0.6μL，终浓度均为0.2μmol/L，Rhabdovirus140-TAP为0.6μL，终浓度为0.4μmol/L，标准质粒模板1μL，ddH₂O 6.7μL。采用2步法PCR扩增程序：预变性1个循环，95℃30s；PCR反应，40个循环，95℃5s，60℃34s，反应结束后绘制标准曲线。

结果如图2所示，以10倍梯度稀释重组质粒后选取10⁹～10²个稀释度进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线，以重组质粒拷贝数为X轴、Ct值为Y轴作图，得到一条标准曲线(Y＝-3.163x+45.216)，其相关系数为0.999，该实时荧光定量PCR在10⁹～10²范围内有较好的线性关系。

5、荧光定量PCR的敏感性和重复性检测

将重组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为1×10⁹～1×10²个/μL作为标准品模板，以灭菌的ddH₂O代替模板作为阴性对照，用优化的反应体系和条件进行荧光定量PCR反应，根据样品拷贝数与Ct值之间的线性关系和相关系数确定最小检测量。同时用引物Rhabdovirus140-F、Rhabdovirus140-R进行普通PCR反应，计算出2种方法所能检测出的最低模板浓度，比较2种方法的敏感性。

实验结果见图3所示，从左到右依次为1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²个拷贝/μL的标准品的扩增结果。检测结果表明，本发明试剂盒检测的灵敏度可达1.0×10²拷贝/μL，并且Ct值随浓度减少呈梯度改变，精确性优于普通PCR方法，表明本发明试剂盒对鳜鱼弹状病毒的诊断具有高度的灵敏性。

对同一样品在1次实验中重复40次进行实时荧光定量PCR检测，通过组内的Ct值变异系数来初步评估该方法的重复性。

结果如图4所示，传统PCR方法最低在1×10⁵处能检测到条带；荧光定量PCR对重组质粒进行扩增，最低可检测10个病毒核酸分子拷贝数。2种方法阴性对照均检测不到。

结果如图5所示，对同一阳性样品在同一次实验间获得Ct值进行统计分析，同一次实验内的40个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合，Ct值读数范围为21.51～21.89，标准偏差为0.11，变异系数为0.51％。

6、荧光定量PCR的特异性检测

分别将ISKNV、GCRV、KHV、SGRV、TiLV、SCRIV、SGIV、NNV等几种病毒2ul的核酸为模板，用建立的SCRV TaqMan Real-time PCR方法进行特异性检测，以质粒为阳性对照，灭菌的ddH₂O为阴性对照。

结果如图6所示，显示阳性对照和SCRV有扩增曲线外，其他病毒均没有扩增曲线，说明该检测方法有较好的特异性。

实施例2荧光定量PCR的应用

将实验室中保存的20份鱼类疑似样品，利用本发明的试剂盒进行荧光定量PCR检测，同时利用普通PCR检测，并结合细胞培养和电镜等试验进行验证。

结果显示，定量显示阳性样品5份，普通PCR检测为2份，对结果不一致的样品进行电镜和细胞接种进一步验证，结果证实均为阳性。

以上所述实施方式仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针以及试剂盒

<130> 1.23

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gacatgttct tctacagatt caac 24

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

caatccagca ctccactg 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aggttcaaag actgtgcagc tctgt 25

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtagctagcg ccaccatgga aaaccaaatc atcaagag 38

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtagcgccgc atttcacaaa gcttggtgtt tcagc 35

Claims

1.用于检测鳜鱼弹状病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，所述探针序列如SEQ ID NO:3所示。

2.如权利要求1引物和探针在制备用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒中应用，其特征在于，每20μL反应体系具有以下浓度的组分：cDNA模板1μL、阳性标准品1μL、0.6μL 0.2-1.0μmol/L引物和0.2-1.0μmol/L探针、PCR预混液10μL，Premix ExTaq TM 10μL、ROX ReferenceDyeⅡ(50×)0.5μL，余量为无菌蒸馏水；所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，所述探针序列如SEQ ID NO:3所示，所述阳性标准品为含有鳜鱼弹状病毒的DNA质粒。

3.一种用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物和探针。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针的终浓度均为0.2～1.0μmol/L。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物终浓度为0.3μmol/L，所述探针终浓度为0.3μmol/L。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性标准品、PCR预混液和无菌蒸馏水，所述阳性标准品为含有鳜鱼弹状病毒N基因的DNA质粒。