CN110305988A - 鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鸽新城疫病毒LAMP‑TaqMan检测试剂盒。本发明以鸽新城疫病毒NDV F基因为靶基因，将环介导等温扩增技术的高特异性、高敏感性、简便、成本低的优势与TaqMan探针相结合，建立鸽新城疫病毒LAMP‑TaqMan的检测方法，基于该检测方法构建了鸽新城疫病毒LAMP‑TaqMan检测试剂盒。本发明的检测试剂盒含有6条特异性引物和1条TaqMan荧光探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑7所示。本发明试剂盒可将浓度为10拷贝/μl的标准质粒有效检出，反应时间仅为25min。结果证实本发明试剂盒可实现快速、准确的检测鸽新城疫病毒的目的，具有良好的应用前景。

Description

鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测试剂盒
技术领域
本发明涉及PCR检测技术领域，具体地说，涉及一种鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测试剂盒。
背景技术
鸽新城疫(Newcastle disease，ND)又被称为鸽瘟，是由新城疫病毒(Newcastledisease Virus，NDV)变异株鸽I型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus Type 1，PPMV-1)引起的一种急性传染病，该病是危害养鸽业的主要疾病之一，给养鸽业造成很大的经济损失。目前鸽新城疫的的检测方法有病毒分离培养、血凝试验(HA)、血凝抑制(HI)试验、荧光抗体检测和普通PCR。应用这些检测方法鸽新城疫病毒进行检测，不仅对仪器及实验室环境要求较高，并且操作过程复杂，对操作人员技术要求严格，检测时间较长。
因此，迫切需要建立快速、简便、特异性高的检测鸽新城疫病毒的技术，以满足检测的需求，建立一种灵敏度高、准确性高的快速筛查的检测方法成为当务之急。
环介导恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是2000年由日本学者Notomi开发的一门新兴的基因扩增技术，具有特异性强、灵敏性高、等温高效、操作简便、成本低廉等优点。但由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度在300bp以内，大于500bp则较难扩增，故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高，极易受到污染而产生假阳性结果，因此特别注意严谨操作，来防范非特异性扩增与污染。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于LAMP和TaqMan技术的鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测试剂盒及检测方法。
本发明的试剂盒含有6条特异性引物和1条TaqMan探针，其以鸽新城疫病毒NDV F基因为靶基因，所述靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述6条特异性引物分别为两条外引物，两条内引物、两条环引物。
所述两条外引物为：
NVDF2F3：5’-TCATTAATAGGCAGTGGCT-3’
NVDF2B3：5’-TGTACAGTATAGATCCtGATC-3’；
两条内引物为：
NVDF2FIP：5’-AGGTTCCCGACTGAGGGTACTGTATGACTCACAGACTC-3’
NVDF2BIP：5’-TTGCCTCAGCACTTGTCCGGTGTCAAGTTCTTCTATCAC-3’；
两条环引物为：
NVDF2LoopF：5’-AATTTACCTGGATGCCCAAG-3’
NVDF2LoopB：5’-CGAAGGTAGTGACACAAGTC-3’。
所述1条TaqMan探针为：
5’-GTGCCACCTACCTGGAAACTTTATCTGTAAGCACAA-3’。
本发明的试剂盒在使用时，引物和探针的浓度分别为：引物NVDF2F3:2μM和NVDF2B3:2μM，NVDF2LoopF:8μM和NVDF2LoopB:8μM，NVDF2FIP:16μM和NVDF2BIP:16μM以及荧光探针8μM。
本发明的试剂盒还包括dNTP，Bst5.0聚合酶、海藻糖，阴性对照、阳性对照。所述阳性对照为鸽新城疫病毒阳性质粒。
本发明提高了一种检测鸽新城疫病毒的引物探针组合，含有6条特异性引物和1条TaqMan探针，所述6条特异性引物分别为两条外引物，两条内引物、两条环引物；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-6所示；所述TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述探针两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
在本发明的实施例中，探针为：5’-(FAM)GTGCCACCTACCTGGAAACTTTATCTGTAAGCACAA(BHQ)-3’。
本发明提供了一种检测鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan的方法，以待检样品的基因组DNA为模板，以上述的引物探针组合对模板进行LAMP-TaqMan检测，使用恒温荧光设备或标准定量PCR仪收集FAM荧光信号，曲线上升的样本判定为阳性结果，曲线没有上升的判定为阴性结果。
上述方法中，所述LAMP-TaqMan检测的检测体系中，引物NVDF2F3:2μM和NVDF2B3:2μM，NVDF2LoopF:8μM和NVDF2LoopB:8μM，NVDF2FIP:16μM和NVDF2BIP:16μM以及荧光探针8μM。
所述LAMP-TaqMan检测的方法为：65℃10s；65℃50s收集信号，循环25次，总反应时间为25min。
本发明的有益效果在于：本发明以鸽新城疫病毒NDV F基因为靶基因，将环介导等温扩增技术的高特异性、高敏感性、简便、成本低的优势与TaqMan探针相结合，建立鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan的检测方法，基于该检测方法构建了鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测试剂盒。本发明试剂盒可将浓度为10拷贝/μl的标准质粒有效检出，反应时间仅为25min。结果证实本发明试剂盒可实现快速、准确的检测鸽新城疫病毒之目的，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为病毒感染组织A1提取RNA后，应用本发明试剂盒进行不同RNA用量的检测结果。用量：10ng、1ng、0.1ng、0.01ng，1pg，0.1pg，0.01pg，NTC。在25μl LAMP-TaqMan反应体系中分别加入RNA模板量如下，1：10ng、2：1ng、3：0.1ng、4：0.01ng、5：1pg、6：0.1pg、7：0.01pg、8：ddH2O(NTC)。使用该方法可在25min内检测到0.1ng提取的RNA核酸分子，0.01ng以下样本不能检测出，无荧光信号。
图2为本发明试剂盒对标准质粒模板的灵敏度检测结果。在25μl LAMP-TaqMan反应体系中加入扩增用模板浓度分别如下，1：107copy/μl、2：106copy/μl、3：105copy/μl、4：104copy/μl、5：103copy/μl、6：102copy/μl、7：10copy/μl、8：0copy/μl(NTC)。使用该方法可在25min内完成病毒检测，阴性扩增无荧光信号。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别说明，本申请实施例中的生化试剂、材料均为市售可得。
实施例1鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测引物探针的确定
本实施例针对鸽新城疫病毒NDV F基因的高度保守片段(SEQ ID NO.8)，依据LAMP引物设计原则，使用LAMP Designer软件进行6引物组合的设计，原则为确保F1引物的3’端与B1引物的5’端间隔大于50bp，以利于TaqMan探针的设计。LAMP引物设计完毕后，依据LAMP扩增引物设计TaqMan探针，TaqMan探针的设计原则为：长度在30～45碱基、TM值大于72℃、探针远离F1引物的3’端4～8碱基进行LAMP引物探针的设计，通过DNAMAN对引物进行分析，挑选出若干条候选引物和探针。
本试剂盒共筛选了3组引物探针，序列见下表1。
表1针对鸽新城疫病毒NDV F基因的高度保守片段设计的3组引物探针
因组合1特异性强，敏感性高。而组合2和组合3有二聚体的产生因此淘汰组合2，3，选择组合1作为试剂盒的引物。
最终，本实施例确定检测鸽新城疫病毒的试剂盒中的6条特异性引物和1条TaqMan探针为以下组合，针对9个结合区。
所述两条外引物为：
NVDF2F3：5’-TCATTAATAGGCAGTGGCT-3’(SEQ ID NO.1)
NVDF2B3：5’-TGTACAGTATAGATCCtGATC-3’；(SEQ ID NO.2)
两条内引物为：
NVDF2FIP：5’-AGGTTCCCGACTGAGGGTACTGTATGACTCACAGACTC-3’(SEQ ID NO.3)
NVDF2BIP：5’-TTGCCTCAGCACTTGTCCGGTGTCAAGTTCTTCTATCAC-3’(SEQ ID NO.4)；
两条环引物为：
NVDF2LoopF：5’-AATTTACCTGGATGCCCAAG-3’(SEQ ID NO.5)
NVDF2LoopB：5’-CGAAGGTAGTGACACAAGTC-3’(SEQ ID NO.6)。
所述1条TaqMan探针为：5’-(FAM)GTGCCACCTACCTGGAAACTTTATCTGTAAGCACAA(BHQ)-3’(SEQ ID NO.7)。
实施例2鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测方法的建立
采用实施例1确定的引物探针组合，对鸽新城疫病毒阳性质粒进行LAMP-TaqMan检测。
检测体系为：
检测方法为：65℃10s；65℃50s收集信号，循环25次，总反应时间为25min。
阴性NTC样本不起峰，并且阳性标准品(NDVF-pJET质粒，该标准质粒参考文献[鸽新城疫病毒分离鉴定及动物感染实验，李复煌等，2016，动物医学进展，37(9):57-61]，通过RT-PCR扩增并连接入pJET-T载体)起峰情况下，实验条件成立。检测样品起峰标示为含有新城疫病毒核酸分子。病毒感染组织A1提取RNA后，应用本发明建立的方法或基于本发明设计的特异性引物探针构建的试剂盒进行不同RNA用量的检测，结果见图1。说明本发明方法、试剂盒可在25min内检测到0.1ng提取的RNA核酸分子，0.01ng以下样本不能检测出，无荧光信号，能够特异灵敏地检测鸽新城疫病毒。
实施例3灵敏度实验
将鸽新城疫病毒阳性质粒进行10倍比稀释，稀释度为10-1到10-7七个稀释度，按照实施例2所建立的方法进行LAMP-TaqMan扩增，以确定本研究所建立的实时荧光LAMP检测的灵敏度。
灵敏度分析结果表明，以NDVF-pJET质粒为检测模板，LAMP-TaqMan技术可将浓度为10拷贝/μl的标准质粒有效检出，反应时间仅为25min。结果见图2。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测试剂盒
<130> KHP191113597.7
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcattaatag gcagtggct 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtacagtat agatcctgat c 21
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggttcccga ctgagggtac tgtatgactc acagactc 38
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgcctcagc acttgtccgg tgtcaagttc ttctatcac 39
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatttacctg gatgcccaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgaaggtagt gacacaagtc 20
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgccaccta cctggaaact ttatctgtaa gcacaa 36
<210> 8
<211> 1662
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgggctcca aaccccacat caggatcccg gcacctctga cgctgatcac tcgaatcact 60
ctggtactga gctgcatctg ctcgacgagc tctctcgatg gcaggccact tgcagctgcg 120
gggattgtgg taacaggaga taaagcaatc aatatataca cctcatctca gacagggtca 180
atcatagtca agttgctccc aaatatgccc aaggacaaag aggcatgtgc aaaagcccca 240
ctagaggcat acaatagaac actgaccact ttactcaccc cccttggtga ttccatccgc 300
aggatacaag gatctgtgtc cacatcagga ggaaggaggc agaagcgctt tataggtgcc 360
attataggca gtgtagctct tggggttgcg acatcggcac agataacagc ggctgcggcc 420
ttaatacaag ctaaccagaa tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag catcgctgcg 480
accaatgaag ctgtgcatga ggtcaccgac ggattatcgc aactagcagt ggcaattggg 540
aagatgcaac agtttgtaaa cgaccaattt aataatacag cgcgagaatt ggactgtata 600
aaaatttcac aacaagtcgg catagaactc aacttatacc taactgaact gactacagtg 660
ttcgggccac aaatcacttc ccctgcccta actcagctaa ccatccaagc gctttataat 720
ttagctggcg gtaacatgga ttacctattg actaaattag gtatagggaa caatcatctc 780
agctcattaa taggcagtgg cttgatcaca ggcaacccta tactgtatga ctcacagact 840
caactcttgg gcatccaggt aaatttaccc tcagtcggga accttaataa tatgcgtgcc 900
acctacctgg aaactttatc tgtaagcaca accaaagggt ttgcctcagc acttgtcccg 960
aaggtagtga cacaagtcgg ctctgtgata gaagaacttg acacctcata ctgtatagaa 1020
tctgatctgg atctatactg tacaaagata gtgacattcc ctatgtctcc aggaatttat 1080
tcttgtctga gcggtaatac atcagcttgc atgtactcaa agactgaagg cgcactcaat 1140
acgccataca tggccctcaa gggctcagtc attgccaatt gcaaaataac aacctgcaga 1200
tgtgcagacc ccccaggtat catatcgcag aactatggag aagctgtatc tctgatagat 1260
agacattcat gcaatgtctt atcattagat gggataaccc tgaggctcag tggggagttt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa tatctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaac 1380
ctcgatatat caaccgagct tggaaatgtc aacaattcaa taagcaatgc cctggacagg 1440
ttagcagaaa gtaatagcaa actagacaaa gtcaatgtca aattaaccag cacatctgct 1500
ctcattacct atatcatcct aaccaccata tctcttgttt tcggtgcact tagcttggtt 1560
ttagcatgct atctaatgta caaacaaaag gcacagcaaa agactttact gtggcttggg 1620
aataataccc tcgatcagat gagagcaact acaagaacat ga 1662

Claims (10)

1.鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有6条特异性引物和1条TaqMan探针，其以鸽新城疫病毒NDV F基因为靶基因，所述靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述6条特异性引物分别为两条外引物，两条内引物、两条环引物。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，
所述两条外引物为：
NVDF2 F3：5’-TCATTAATAGGCAGTGGCT-3’
NVDF2 B3：5’-TGTACAGTATAGATCCtGATC-3’；
两条内引物为：
NVDF2 FIP：
5’-AGGTTCCCGACTGAGGGTACTGTATGACTCACAGACTC-3’
NVDF2 BIP：
5’-TTGCCTCAGCACTTGTCCGGTGTCAAGTTCTTCTATCAC-3’；
两条环引物为：
NVDF2 LoopF：5’-AATTTACCTGGATGCCCAAG-3’
NVDF2 LoopB：5’-CGAAGGTAGTGACACAAGTC-3’。
3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述1条TaqMan探针为：
5’-GTGCCACCTACCTGGAAACTTTATCTGTAAGCACAA-3’。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针浓度分别为：引物NVDF2 F3:2μM和NVDF2 B3:2μM，NVDF2 LoopF:8μM和NVDF2 LoopB:8μM，NVDF2 FIP:16μM和NVDF2 BIP:16μM以及荧光探针8μM。
5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于，其还包括dNTP，Bst5.0聚合酶、海藻糖，阴性对照、阳性对照。
6.一种检测鸽新城疫病毒的引物探针组合，其特征在于，含有6条特异性引物和1条TaqMan探针，所述6条特异性引物分别为两条外引物，两条内引物、两条环引物；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-6所示；所述TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述探针两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
7.权利要求6所述的引物探针组合在制备检测鸽新城疫病毒试剂盒中的应用。
8.一种检测鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan的方法，其特征在于，以待检样品的基因组DNA为模板，以权利要求6所述的引物探针组合对模板进行LAMP-TaqMan检测，使用恒温荧光设备或标准定量PCR仪收集FAM荧光信号，曲线上升的样本判定为阳性结果，曲线没有上升的判定为阴性结果。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述LAMP-TaqMan检测的检测体系中，引物NVDF2 F3:2μM和NVDF2 B3:2μM，NVDF2 LoopF:8μM和NVDF2 LoopB:8μM，NVDF2 FIP:16μM和NVDF2 BIP:16μM以及荧光探针8μM。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述LAMP-TaqMan检测的方法为：65℃10s；65℃50s，收集信号，循环25次，总反应时间为25min。
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