CN110578019A

CN110578019A - 二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组

Info

Publication number: CN110578019A
Application number: CN201911046368.0A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 曾婷婷; 谢丽基; 罗思思; 黄娇玲; 张艳芳; 张民秀; 范晴; 王盛; 邓显文; 谢志勤
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2019-12-17
Anticipated expiration: 2039-10-30
Also published as: CN110578019B

Abstract

本发明公开了二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测引物组，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列，其中引物5和引物6为taqman探针，它们使扩增反应具有很高的特异性，能分别与NDV强毒和弱毒的F基因裂解位点杂合，反应后在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光，从而实现快速敏感特异的鉴别NDV强弱毒株。据此，发明人还研制了相应试剂盒并建立相应二重荧光LAMP方法。总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅和荧光成像仪，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。

Description

二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的以感染禽类为主的一种急性、烈性传染病。尽管新城疫只有一个血清型，但是不同毒株之间的生物学特性存在明显差异。目前主要以NDV F蛋白的裂解位点为鉴别NDV强弱毒株的分子标记。

传统的检测方法需要使用昂贵的仪器和试剂等。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛运用。传统的LAMP检测方法中，创新性的加入taqman探针，反应时特异性的taqman探针会与扩增产物杂合并随着扩增进行过程水解，发出荧光。

目前，国内外均未见有建立二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒可视化检测试剂盒和方法的相关报道。“新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立”虽然报道了通过LAMP区分NDV强弱毒，但是该法需要3套不同的引物，并且检测时需要在3个不同反应管中进行并观测结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、快速简便的二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测引物组，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

引物5和引物6为taqman探针，引物5在5’端和3’端分别标记5-FAM荧光基团和淬灭基团BHQ-1，引物6在5’端和3’端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ-3。

引物1至引物6的摩尔比为16:16:2:2:1:1。

上述二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测引物组在环介导等温扩增中的应用。

环介导等温扩增的条件为62℃反应60min，80℃作用5min灭活。

二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

上述二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒，还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl₂。

括引物1至引物6在环介导等温扩增试剂中的终浓度分别为40μmol/L、40μmol/L、5μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L和2.5μmol/L。

针对目前新城疫强弱毒检测存在的问题，发明人根据NDV的保守序列针对6个特异区域设计了二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测引物组，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列，其中引物5和引物6为taqman探针它们使扩增反应具有很高的特异性，能分别与NDV强毒和弱毒的F基因裂解位点杂合，反应后在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光(引物5与强毒株的特异性序列杂合，在延伸过程中再水解，发出绿色荧光；引物6与弱毒株的特异性序列杂合，在延伸过程中再水解，发出红色荧光)，从而实现快速敏感特异的鉴别NDV强弱毒株。

据此，通过优化反应体系和条件，发明人还研制了相应试剂盒并建立相应二重荧光LAMP方法。该法只需要在62-64℃的水浴锅中反应60分钟即可完成，能特异的检测NDV，并且通过荧光区分强弱毒株，反应后，发出绿色荧光的为强毒株，发出红色荧光的为弱毒株，若样品中同时存在强弱毒株，则为黄色荧光。试验证实，本发明检测灵敏度非常高，每个反应体系能检测到100拷贝的NDV cDNA样品。

本发明只需要用1套引物，即可扩增所有的NDV F基因，并通过针对强弱毒株的F基因裂解位点特异序列的taqman探针只分别与强毒株和弱毒株序列杂合，反应过程中杂合探针水解释放游离荧光基团。反应只需要在一个反应管中进行反应，就可以根据反应后在荧光核酸成像仪下的颜色进行读取结果。且通过taqman杂合的方法，特异性更高，不受非特异性扩增的影响，也不受引物二聚体扩增的影响。而“新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立”中用SYBR GREENⅠ，则不能对这些非特异性扩增或引物二聚体导致的假阳性加以区分。

总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅和荧光成像仪，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。

附图说明

图1是本发明LAMP方法检测NDV强弱毒的特异性结果图。

图2是本发明LAMP方法检测NDV强弱毒的敏感性结果图。

图3是本发明LAMP方法检测临床分离NDV毒株的结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中：

Bst DNA聚合酶(大片段)购自New England Biolabs公司。Viral DNA/RNA Kit购自北京全式金生物。Reverse Transcriptase[M-MLV，RNaseH-]购自北京全式金生物。

NDV、禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，大肠杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体等均为已知病毒，这些病毒为自留存，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、引物的设计

根据GenBank中NDV的F基因序列，使用在线软件Primer Explorer V4(http：//primerexplorer.jp/e/v4-manual/index.html)设计LAMP引物。引物由广州Invitrogen公司合成，其具体序列见表1。

表1 LAMP引物序列

LF和LB引物不加也可以，加入可以提高检测的敏感性。

实施例2、引物在二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒的的应用

一、核酸的提取

参照Viral DNA/RNA Kit DNA/RNA共提试剂盒说明书，提取新城疫病毒，禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，大肠杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体的基因组DNA/RNA，并使用反转录试剂盒进行反转录。

二、优化LAMP反应体系、反应条件和试剂盒的构建

25μL LAMP反应体系：1-4μL dNTPs(10mmol/L，终浓度为0.4mmol/L-1.6mmol/L)、2.5μL 10×Bst buffer、1μl Bst DNA聚合酶8U(终浓度为320U/L)、4-7μL甜菜碱Betaine(5mmol/L，终浓度为0.8mmol/L-1.4mmol/L)、2-9μL MgSO₄(25mmol/L，终浓度为2mmol/L-9mmol/L)、1μL引物(FIP 40μmol/L、BIP 40μmol/L、B3 5μmol/L、F3 5μmol/L；终浓度为FIP1.6μmol/L、BIP 1.6μmol/L、P1 0.1μmol/L、P2 0.1μmol/L、B3 0.2μmol/L、F3 0.2μmol/L)和1μL模板(NDV的基因组cDNA)，加水至25μL。

反应条件：温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增反应50h，80℃作用5min灭活。

分别按照上述的反应体系和反应条件进行摸索，获得下述的最佳反应体系和条件：

最佳反应体系如下：25μL LAMP反应体系：2μL dNTPs(10mmol/L，终浓度为0.4mmol/L)、2.5μL 10×Bst buffer、1μL Bst DNA聚合酶8U(终浓度为320U/L)、5μL甜菜碱Betaine(5mmol/L，终浓度为1mmol/L)、3μL MgSO₄(25mmol/L，终浓度为3mmol/L)、1μL引物(FIP 40μmol/L、BIP 40μmol/L、LF 20μmol/L、LB 20μmol/L、B3 5μmol/L、F3 5μmol/L，其中各条引物的终浓度为FIP 1.6μmol/L、BIP 1.6μmol/L、LF 0.8μmol/L、LB 0.8μmol/L、B30.2μmol/L、F3 0.2μmol/L)、1μL钙黄绿素Calcein(625μmol/L，终浓度为25μmol/L)、1ulMnCl₂(12.5mmol/L，终浓度为0.5mmol/L)、1μL模板DNA，加水至25μL。

最佳反应条件：62℃反应60min，80℃作用5min灭活。

二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒包括FIP、BIP、F3、B3、P1、P2的6条引物或上述最佳反应体系(除去模板)。

三、特异性检测

分别以上述一得到禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体DNA或cDNA为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

LAMP反应结果的判断：

1)使用荧光核酸成像仪：分别使用FAM通道和CY5通道成像，若反应产物颜色变为绿色，则说明样品中含有NDV且为强毒株，若反应产物颜色变为红色，则说明样品中含有NDV且为弱毒株，若反应产物颜色变为黄色，则说明样品中含有NDV且为强毒株和弱毒株同时存在，若没荧光显色则说明样品中不含有NDV。

结果如图1所示，A图为浊度仪扩增结果，B图为荧光核酸成像仪观察结果，其中A-1为NDV强毒株扩增、A-2为NDV弱毒扩增、A-3为NDV强毒和弱毒混合扩增；B-1为NDV强毒株荧光图，1为NDV强毒株、为2为禽流感病毒、3为传染性支气管炎病毒、4为传染性喉气管炎病毒、5为副鸡嗜血杆菌、6为禽巴氏杆菌、7为鸡毒支原体、8为阴性对照(水)；B-2为NDV弱毒株荧光图，1为NDV弱毒株、为2为禽流感病毒、3为传染性支气管炎病毒、4为传染性喉气管炎病毒、5为副鸡嗜血杆菌、6为禽巴氏杆菌、7为鸡毒支原体、8为阴性对照(水)；B-3为NDV强毒株和弱毒株混合荧光图，1为强毒和弱毒混合、为2为禽流感病毒、3为传染性支气管炎病毒、4为传染性喉气管炎病毒、5为副鸡嗜血杆菌、6为禽巴氏杆菌、7为鸡毒支原体、8为阴性对照(水)。可以看出，A-1和B-1只有NDV强毒株检测为阳性结果(A-1浊度仪扩增NDV强毒株有扩增曲线，B-1只有NDV强毒株荧光下呈绿色荧光)，而对禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体的检测均为阴性(A-1浊度仪没有扩增曲线，B-1没有呈绿色荧光)。A-2和B-2只有NDV弱毒株检测为阳性结果(A-2浊度仪扩增NDV弱毒株有扩增曲线，B-2只有NDV弱毒株荧光下呈红色荧光)，而对禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体的检测均为阴性(A-2浊度仪没有扩增曲线，B-2没有呈红色荧光)。A-3和B-3只有NDV强毒株和弱毒株混合检测为阳性结果(A-3浊度仪扩增NDV强毒株和弱毒株混合有扩增曲线，B-3只有NDV强毒株和弱毒株混合荧光下呈黄色荧光)，而对禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体的检测均为阴性(A-3浊度仪没有扩增曲线，B-3没有呈黄色荧光)。

四、灵敏度检测

将NDV的cDNA按10倍倍比稀释至100000copies/μL、10000copies/μL、1000copies/μL、100copies/μL、10copies/μL、1copies/μL和阴性对照(水)为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

结果如图2所示，A-1图为NDV强毒株浊度仪扩增结果，B-1图为NDV强毒株荧光核酸成像仪观察结果，其中A-1中，1为100000copies/μL、2为10000copies/μL、3为1000copies/μL、4为100copies/μL，5为10copies/μL，6为1copies/μL，7为阴性对照(水)；B-1中，1为100000copies/μL、2为10000copies/μL、3为1000copies/μL、4为100copies/μL，5为10copies/μL，6为1copies/μL，7为阴性对照(水)。可以看出，LAMP对NDV强毒株的cDNA的最小检测限为100copies/μL(A-1浊度仪扩增有扩增曲线，B-1有绿色荧光)。同理，NDV弱毒株的cDNA的最小检测限也为100copies/μL。

五、对NDV临床分离株的检测

将临床分离的NDV毒株，抽提基因组RNA并反转录为cDNA为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

结果如图3所示，2，3，9，10，12，13为NDV强毒株，1，4，5，7，8，11，16为弱毒株，6，14，15为强毒株和弱毒株混合感染，17为阴性对照(水)。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcgccaaga ggagtgagca aacaaaagcc ccattagagg ca 42

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agggtctgtg tccacatctg gagcaacccc aagagctaca c 41

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agggataagg aggcgtgtg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgctgtta tctgtgccg 19

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggagrcara racgctttat aggtgc 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggaracagg grcgycttat aggcgc 26

Claims

1.二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测引物组，其特征在于包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测引物组，其特征在于：所述引物5和引物6为taqman探针，引物5在5’端和3’端分别标记5-FAM荧光基团和淬灭基团BHQ-1，引物6在5’端和3’端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ-3。

3.根据权利要求1所述的二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测引物组，其特征在于：所述引物1至引物6的摩尔比为16:16:2:2:1:1。

4.权利要求1所述的二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测引物组在环介导等温扩增中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于环介导等温扩增的条件为62℃反应60min，80℃作用5min灭活。

6.二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒，其特征在于包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

7.根据权利要求1所述的二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒，其特征在于：所述引物5和引物6为taqman探针，引物5在5’端和3’端分别标记5-FAM荧光基团和淬灭基团BHQ-1，引物6在5’端和3’端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ-3。

8.根据权利要求1所述的二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒，其特征在于还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl₂。

9.根据权利要求1所述的二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒，其特征在于：所述括引物1至引物6在环介导等温扩增试剂中的终浓度分别为40μmol/L、40μmol/L、5μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L和2.5μmol/L。