CN111663008B

CN111663008B - 禽肾炎病毒和h9亚型禽流感病毒二重lamp检测试剂盒及其引物组

Info

Publication number: CN111663008B
Application number: CN202010707588.XA
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 方庆; 张艳芳; 邓显文; 谢志勤; 谢丽基; 刘加波; 曾婷婷; 范晴; 罗思思; 张民秀; 黄娇玲; 王盛
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: CN111663008A

Abstract

本发明公开了禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测引物组，包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2。据此，发明人还建立了的LAMP检测方法。优化反应条件后，本发明所建立的LAMP检测方法只需要在63℃恒温反应55min即可完成，能特异地检测禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒，并且检测的灵敏度非常高，最低能检测到3.83fg/μL的禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒核酸混合样品。总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，且通过荧光基团的颜色检测阳性结果，有效的抑制了假阳性结果，并且减少了气溶胶污染，具有较好的应用前景。

Description

禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒及其引物组

技术领域

本发明涉及禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒检测技术领域，尤其涉及一种禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒及其引物组。

背景技术

禽肾炎病毒(Avian Nephritis Virus，ANV)是禽类星状病毒的一种，1976年学者从肉鸡的直肠内容物中分离出。该病毒经口接种雏鸡或易感染鸡接触病毒，引起不同程度的肾炎并使雏鸡生长发育变迟缓，表现出不同的致病性，产生从亚临床感染到死亡的不同表现形式。禽流感(Avian Influenza，AIV)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的病毒性烈性传染病，对禽类的经济发展和公共卫生安全造成了严重威胁。以H9亚型为代表的低致病性禽流感引起的症状较轻微且死亡率低，但感染后会引起禽类的呼吸道症状和免疫抑制，并可诱发混合感染。

传统的检测方法，如二温式PCR，PCR和荧光PCR，需要使用昂贵的仪器和试剂，且操作繁琐，耗时耗力等。而环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点。现如今，LAMP法已经广泛应用于病原微生物检测。

目前，国内外均未见有建立禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP可视化检测试剂盒和方法的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异、敏感、准确且污染少的禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒及其引物组。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测引物组，包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。

探针1在5’端和3’端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ-2，探针2在5’端和3’端分别标记FAM荧光基团和淬灭基团BHQ-1。

引物1至引物5的摩尔比为8:8:1:1:4，引物6至引物10的摩尔比为8:8:1:1:4。

上述二重LAMP检测引物组在环介导等温扩增中的应用。

环介导等温扩增的条件为63℃反应50min，80℃作用5min灭活。

环介导等温扩增中引物1、引物2、引物6和引物7在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40μmol/L，引物3、引物4、引物8和引物9在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5μmol/L，引物5和引物10在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5μmol/L。

禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒，包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。

针对目前禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒检测存在的问题，发明人根据ANV的ORF基因和AIV-H9的NA基因序的保守序列设计了禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测引物组，包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。该引物组针对病毒的8个特异区域，使扩增反应具有很高的特异性，在F3-B3区间设计探针ANV-P和AIV-H9-P，探针ANV-P 5′用CY5标记，3′用BHQ2标记，在694nm波长下呈现大红色。探针AIV-H9-P5′用FAM标记，3′用BHQ1标记，在520nm下呈现绿色，通过荧光基团的显色来降低了LAMP反应的污染几率。据此，发明人还建立了的LAMP检测方法。优化反应条件后，本发明所建立的LAMP检测方法只需要在63℃恒温反应55min即可完成，能特异地检测禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒，并且检测的灵敏度非常高，最低能检测到3.83fg/μL的禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒核酸混合样品。总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，且通过荧光基团的颜色检测阳性结果，有效的抑制了假阳性结果，并且减少了气溶胶污染，具有较好的应用前景。

附图说明

图1是本发明LAMP方法检测禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒的特异性结果图，图中：A是实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果，B是荧光基团显色结果；1ANV，2ANV+AIV-H9，3AIV-H9，4AIV-H6，5AIV-H13，6NDV，7MDV，8无菌水。

图2是LAMP方法检测禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒的敏感性结果图，图中：A是实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果，B是荧光基团显色结果；1是38.3ng/μL，2是3.83ng/μL，3是0.383ng/μL，4是3.83pg/μL，5是0.383pg/μL，6是3.83fg/μL，7是0.383fg/μL，8是无菌水。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。其中，实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例所用部分材料如下：LAMP DNA扩增试剂盒、Loopamp LA-320C实时浊度仪均购自日本荣研公司；DNA/RNA抽提试剂盒、PCR试剂和质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；NanoDrop 2000核酸测定仪购自美国ThermoFisher Scientific公司；多色荧光成像分析系统购自美国BIO-RAD公司；禽肾炎病毒(ANV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、H6亚型禽流感病毒(AIV-H6)、H13亚型禽流感病毒(AIV-H13)、新城疫病毒(NDV)、马立克病病毒(MDV)、腺病毒4型(FAV-4)均从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、引物的设计

根据GenBank中ANV的ORF基因(登录号：AB046864.1)和AIV-H9的NA基因(登录号：KT779577.1)的保守序列，使用在线软件Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计LAMP引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，最终所得引物和探针序列见表1。

表1 LAMP引物和探针

实施例2、禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒的LAMP检测方法的建立

一、标准品的制备

使用PCR分别扩增ANV ORF基因和AIV-H9 NA基因的目的片段，回收纯化的产物与pGM-T载体连接，经PCR筛选出阳性克隆菌，其阳性克隆菌的质粒用试剂盒提取，并使用反转录试剂盒转录为cDNA。通过核酸检测仪测定cDNA浓度，并根据相对分子质量及阿弗加德罗常数将浓度计算为拷贝数。于–70℃保存，备用。

二、优化LAMP反应体系、反应条件和试剂盒的构建

反应体系为20μL，分别为2μL DNA模板(含ANV和AIV-H9 DNA模板各1μL)，10×buffer 2.5μL，MgSO4(100mM)1.5μL，dNTP Mix(10mM)3.5μL，Bst 2.0DNA Polymerase(8000U/mL)1μL，内引物各40pmol(ANV-FIP，ANV-BIP，AIV-H9-FIP和AIV-H9-BIP)，外引物各5pmol(ANV-F3，ANV-B3，AIV-H9-B3和AIV-H9-F3)，探针各1μL(ANV-P和AIV-H9-P)，加水至25μL。各组份混合彻底，63℃(或58～68℃范围内均可反应)反应50min，最后80℃作用5min终止反应。

反应条件：温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增反应50min，80℃作用5min灭活。

分别按照上述的反应条件进行摸索，获得下述的最佳反应和条件：

最佳反应体系如下：25μL LAMP反应体系：1μL dNTP Mix(10mmol/L，终浓度为1.4mM)、2.5μL 10×Bst buffer、1μL Bst DNA聚合酶8000U(终浓度为320U/mL)、1.5μLMgSO₄(100mM，终浓度为6mM)、1μL探针(终浓度分别为ANV-P 100μmol/L、AIV-H9-P 100μmol/L)、1μL引物(FIP 40μmol/L、BIP 40μmol/L、B3 5μmol/L、F3 5μmol/L，其中各条引物的终浓度为FIP 1.6μmol/L、BIP 1.6μmol/L、B3 0.2μmol/L、F3 0.2μmol/L)，模板cDNA 2μL(含ANV和AIV-H9 cDNA模板各1μL)，加水至25μL。

最佳反应条件：63℃反应50min，80℃作用5min灭活。

为便于基层使用，可参照上述最佳反应体系(除去模板)制备LAMP检测试剂盒，其试剂包括FIP、BIP、F3、B3、LB的10条引物和ANV-P、AIV-H9-P 2条探针。

三、特异性检测

按照上述一制备禽肾炎病毒(ANV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、马立克病病毒(MDV)、腺病毒4型(FAV-4)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)的cDNA/DNA模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

LAMP反应结果判断：

使用多色荧光成像分析系统分析荧光基团颜色变化：若产物显色为黄色(黄绿色)，则说明样品中同时含有禽肾炎病毒(ANV)和H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)；若产物显色为大红色，则说明样品中含有禽肾炎病毒(ANV)；若产物显色为绿色，则说明样品中含有H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)，反之，则说明样品中不同时含有禽肾炎病毒(ANV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)或不含有H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)或不含有禽肾炎病毒(ANV)。

结果如图1所示，A图为由时实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果，B图为荧光基团显色结果，其中1为禽肾炎病毒(ANV)模板、2为禽肾炎病毒(ANV)和H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)混合模板、3为H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)模板、4为H6亚型禽流感病毒(AIV-H6)、5为H13亚型禽流感病毒(AIV-H13)、6为新城疫病毒(NDV)、7为马立克病病毒(MDV)、8为阴性对照(无菌水)，其余病毒特异性检测未在图中标出。可以看出，只有ANV模板(1)、ANV与AIV-H9混合模板(2)、AIV-H9模板(3)检测为阳性结果(荧光基团显色分别为绿色、黄色和红色)，而H6、H13、NDV、MDV、FAV-4、AILTV的检测均为阴性(结果无颜色变化)。

四、灵敏度检测

将禽肾炎病毒(ANV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)混合模板cDNA按10倍倍比稀释至38.3ng/μL、3.83ng/μL、0.383ng/μL、3.83pg/μL、0.383pg/μL、3.83fg/μL和0.383fg/μL为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。

结果如图2所示，A图为由时实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果，B图为荧光基团显色结果，其中1为38.3ng/μL、2为3.83ng/μL、3为0.383ng/μL、4为3.83pg/μL、5为0.383pg/μL和6为3.83fg/μL、7为0.383fg/μL、8为阴性对照(水)；可以看出，LAMP对禽肾炎病毒(ANV)和H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)的混合cDNA模板的最小检测限为3.83fg/μL。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒及其引物组

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttgaatggt cacggtttgc ccgccaggac ttcaaacgct 40

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagcctacag attcgctcgc tggcccagat tgtctgagac t 41

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctacgggttt gccaactaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagcatcaac tgcagaacct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctttctccc cgggttggtg 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgatgggtc tcttataatg ac 22

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccattatgct ctgtgtggag caactaacag aaaacaatgt ccct 44

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatgctgtgt gcaacaagct gattgccata gattagccct t 41

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acaaactcca cagaaactgt 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccagcaata gatcacaaga a 21

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgggacaacc tcttatttta gacac 25

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tattttagac acctgcacca t 21

Claims

1.禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测引物组，其特征在于包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2，它们分别为序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7至SEQID NO.12的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的二重LAMP检测引物组，其特征在于：所述探针1在5’端和3’端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ-2，所述探针2在5’端和3’端分别标记FAM荧光基团和淬灭基团BHQ-1。

3.根据权利要求1所述的二重LAMP检测引物组，其特征在于：所述引物1至引物5的摩尔比为8:8:1:1:4，所述引物6至引物10的摩尔比为8:8:1:1:4。

4.权利要求1所述的二重LAMP检测引物组在环介导等温扩增中的非诊断应用。

5.根据权利要求4所述的非诊断应用，其特征在于环介导等温扩增的条件为63℃反应50min，80℃作用5min灭活。

6.根据权利要求5所述的非诊断应用，其特征在于环介导等温扩增中引物1、引物2、引物6和引物7在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40μmol/L，引物3、引物4、引物8和引物9在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5μmol/L，引物5和引物10在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5μmol/L。

7.禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒，其特征在于包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2，它们分别为序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7至SEQID NO.12的碱基序列。