CN111270021B - 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用，该荧光RT‑RAA引物和荧光探针可以快速、定性检测患者样本中的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2。本发明提供的荧光RT‑RAA引物和荧光探针，应用该荧光RT‑RAA引物和荧光探针检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2时，检测时间较PCR方法或荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至更高。
Description
技术领域
本发明涉及体外核酸检测技术领域，具体涉及一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用。
背景技术
2019年12月以来，新型冠状病毒SARS-CoV-2导致的感染性疾病（COVID-19）疫情对社会稳定、人民身体健康造成了巨大威胁。面对疫情复杂态势，将防控关口前移到社区医疗中心和镇级卫生院，解决病人就诊途中的传染、院感交叉感染问题，做到“早发现”是疫情处置的重要手段，这就面临解决基层单位核酸检测技术问题。
目前诊断依赖的实时荧光RT-PCR（rRT-PCR）法需要昂贵仪器，专业人员操作，难以在基层推广应用。武汉一线医生曾反馈“最大的缺点就是病毒核酸检测试剂盒”，“使用条件严格，很多人不会用，时间久，过程复杂，这是瓶颈”；央视反馈“病人无法进行及时的病原检测，导致交叉感染存在”。这也导致疫情防控关口很难前移，大量疑似病例积压，增加了院感、交叉感染风险。
重组酶介导等温核酸扩增（RAA）技术是一种模拟生物体内复制扩增的新的核酸快速检测技术，使用多种酶组成高效扩增体系，引入逆转录酶，在恒温下5-20min可一步法快速完成逆转录和扩增。逆转录RAA（RT-RAA）能克服rRT-PCR方法耗时长、操作复杂缺点，样品纯度要求低，检测速度、温度与仪器成本等方面优势明显，在疫情处置中具有较大的应用前景。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明立足SARS-CoV-2疫情防控关口前移及基层检测需求，建立SARS-CoV-2荧光RT-RAA检测方法，25 min内完成检测，方法灵敏度等指标不低于rRT-PCR，适合在基层医疗卫生单位使用，为疫情防控关口前移技术难题及当前核酸检测方法局限性提供有效解决方案。
本发明采用的技术解决方案是：一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对,所述的引物对包括下列核苷酸序列中的一种或几种：
（1）序列表中SEQ ID No.：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID No.：2所示核苷酸序列；
（2）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
（3）与1)、或2)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同能用于检测SARS-CoV-2的核苷酸序列功能的核苷酸序列。
具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。
所述的高严谨条件为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针， 所述探针包括下列核苷酸序列中的一种或几种：
1)所述探针的核苷酸序列为：
5'- GGTGAAATCAAGGATGCTACTCCTTCAGANMNTGTTCGCGCTACTG-3’,
其中，所述N代表任意核苷酸或任意修饰后的核苷酸，所述M代表具环状结构的化合物；
具体的，所述N代表携带有荧光报告基团的胸腺嘧啶脱氧核苷酸或携带有荧光淬灭基团的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，所述M代表四氢呋喃。
具体的，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。
具体的，所述荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
2)在高严谨条件下可与1)所述的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
3)与1)、或2)所述的探针的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同能用于检测SARS-CoV-2的核苷酸序列功能的核苷酸序列。
具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。
所述的高严谨条件为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述的探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.：3所示核苷酸序列。
一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的组合物，所述的组合物包括本发明所述的引物对和本发明任一所述的探针。
一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒， 所述试剂盒包括本发明所述的引物对、本发明任一所述的探针或本发明所述的组合物中的一种或几种。
具体的，当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为3.5：3.5：1。
一种引物对、探针或组合物作为检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂的应用， 所述的检测试剂为本发明所述的引物对； 本发明任一所述的探针； 本发明所述的组合物中的一种或几种。
具体的，所述的检测试剂同时包括所述的引物对和所述的探针，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为3.5：3.5：1。
本发明的再一个目的是提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法，所述检测方法不包括疾病治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：
1)本发明所述的引物对；
2)本发明任一所述的探针；
3)本发明所述组合物。
具体的，所述检测方法还包括下述1)-2)中的至少一种：
1)当所述检测方法同时使用了所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为3.5：3.5：1；
2)提取待检测样品的RNA进行RT-RAA反应，所述RT-RAA反应的反应温度包括37℃-42℃；反应时间包括15分钟以上。
本发明的又一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在检测新型冠状病毒SARS-CoV-2中的应用，所述应用不包括涉及疾病治疗方法的应用。
本发明的还一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在制备检测新型冠状病毒SARS-CoV-2相关产品中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用，该荧光RT-RAA引物和荧光探针可以快速、定性检测患者样本中的新型冠状病毒SARS-CoV-2。本发明提供的荧光RT-RAA引物和荧光探针，应用该荧光RT-RAA引物和荧光探针检测新型冠状病毒SARS-CoV-2时，检测时间较PCR方法或荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至更高。
在RT-RAA反应过程中，新型冠状病毒SARS-CoV-2 RNA首先通过反转录酶合成cDNA，再利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以cDNA为模板合成目的产物。反应在37℃-42℃下进行20分钟。此外，RAA技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套RAA多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的。
本发明可以实现单管现场、快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2，其它检测技术相比具有以下优点：
1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；
2、能在37-42℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；3、本发明提供的荧光RT-RAA引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，可满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。
附图说明
图1为灵敏度实验结果图。
图2为特异性实验结果图。
图3为临床阳性样品检测结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的荧光RT-RAA引物、探针的设计
针对于新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光RAA探针，其序列分别是：
正向引物，如序列表中SEQ ID No.：1所示核苷酸序列：
5'- CCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTAC -3'
反向引物，如序列表中SEQ ID No.：2所示核苷酸序列：
5'- AAAACAGCAAGAAGTGCAACGCCAACAATA -3'
寡核苷酸探针，如序列表中SEQ ID No.：3所示核苷酸序列：
5'-GGTGAAATCAAGGATGCTACTCCTTCAGA[BHQ-dT][THF][FAM-dT]TGTTCGCGCTACTG-3'；
其中：FAM-dT表示携带有荧光素基团FAM(6-Carboxyfluorescein)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；
THF表示四氢呋喃(tetrahydrofuran)连接子；
BHQ-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ (black hole quencher)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；
实施例2、一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的荧光RT-RAA方法的建立
(一)荧光RT-RAA反应
1)样本RNA的提取：所述样本RNA可以采用德国凯杰生物工程有限公司的viralRNA核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。
2)采用实施例1设计的正向引物、反向引物和探针，以及RT-RAA反应试剂盒(本实施例具体采用了江苏奇天基因生物科技有限公司的RT-RAA基础试剂盒)，以本实施例步骤1)制备的待检测样本RNA为模板，进行扩增反应，其中反应体系如下：
25μl RT-RAA反应缓冲液(江苏奇天基因生物科技有限公司RT-RAA基础试剂盒提供)；
实施例1设计的正向引物、反向引物(10μM)各2.1μL；
0.6μL实施例1设计的探针(10μM)；
1-5μL步骤1)制备的待检测样本RNA模板；
补充不含RNase的双蒸水至47.5μL，混合均匀，然后加入到有干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司RT-RAA基础试剂盒提供)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μL 280mM醋酸镁溶液并混匀。
(二)荧光检测
将上述反应管放置于RAA F1620恒温核酸扩增检测仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)，在42℃反应20min，进行荧光检测。
阴性对照：FAM通道无扩增曲线，或扩增曲线斜率<20mV/min；
阳性对照：FAM通道有扩增曲线，扩增曲线斜率≥20mV/min。
上述对阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。
4)样品检测结果判读：
当所检测的样品FAM通道均有扩增曲线且扩增曲线斜率≥20mV/min，质量控制正常时，可判定SARS-CoV-2病毒阳性；
当所检测的样品FAM通道无扩增曲线，且Tt值显示为Undet或No Tt，质量控制正常时，可判定SARS-COV-2病毒阴性。
(三)灵敏度实验
该实验验证该检测方法的最低检测限，采用浓度为1.0×105copies/μL、1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL、1.0×102copies/μL、1.0×101copies/μL、1.0×100copies/μL等的阳性质粒作为检测限参比品，通过该实验表明该检测方法的检测限达到10copies/μL，具体实验结果如图1所示。
图1中105、104、103、102、10、1分别表示浓度为1.0×105copies/μL、1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL、1.0×102copies/μL、10copies/μL、1copies/μL的阳性质控品扩增曲线，阴性为阴性质控品，横坐标表示反应时间，纵坐标表示荧光值。图1所示结果表明，该检测方法的检测限达到10copies/μL。
(四)特异性实验
该实验选择与新型冠状病毒SARS-CoV-2具有相同感染部位的常见病原体作为特异性参考品。特异性参考品分别为H1流感病毒、H3流感病毒、腺病毒3型、腺病毒7型、贝氏柯克斯体。利用TAKARA公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取以上样本中的核酸作为模板进行实验。特异性实验结果如图2所示。
图2中横坐标表示反应时间，纵坐标表示荧光值。出现扩增曲线的为阳性质粒对照，其余特异性参考品均无扩增曲线，未区分开。图2所示结果表明该检测方法的特异性良好。
(五)临床阳性样品检测实验
选择东部战区疾控中心保存的3例新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性样本（样本1、样本2、样本3）对该方法进行检测、验证。具体实验结果如图3所示。
图3中横坐标表示反应时间，纵坐标表示荧光值。图3所示结果表明，该检测方法扩增效果优异，具有良好的性能。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 齐永
<120> 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagtgctca aaggagtcaa attacattac 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaacagcaa gaagtgcaac gccaacaata 30
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgaaatca aggatgctac tccttcagan mntgttcgcg ctactg 46
Claims (5)
1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对,其特征在于，所述的引物对核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.：1和SEQ ID No.：2所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对，其特征在于，还包括一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针；
所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.：3所示核苷酸序列：
5'-GGTGAAATCAAGGATGCTACTCCTTCAGA[BHQ-dT][THF][FAM-dT]TGTTCGCGCTACTG -3'；
其中：FAM-dT表示携带有荧光素基团FAM(6-Carboxyfluorescein)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；
THF表示四氢呋喃(tetrahydrofuran)连接子；
BHQ-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ (black hole quencher)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
3.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的组合物，其特征在于，所述的组合物包括权利要求1所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对和权利要求2所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针。
4.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对和权利要求2所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针，或权利要求3所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的组合物。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对和权利要求2所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针，其中引物对与探针的摩尔比为3.5：3.5：1。
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