CN111910016A - 通用型甲型流感病毒核酸检测的引物和探针以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物核酸检测技术领域，具体涉及一种通用型甲型流感病毒核酸检测的引物和探针以及试剂盒。本发明根据甲型流感病毒基质蛋白M1和M2序列新的突变位点设计引物及荧光探针，本发明提供的甲型流感病毒的通用型核酸检测的引物和探针简并性强，针对甲型流感各分型病毒具有较高的检出率。

Description

通用型甲型流感病毒核酸检测的引物和探针以及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种通用型甲型流感病毒核酸检测的引物和探针以及试剂盒。

背景技术

流行性感冒病毒简称流感病毒，分为甲、乙、丙三型。根据流感病毒囊膜上血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的序列差异可将甲型流感病毒分为多个型别。而甲型流感病毒内能够感染人的有H1N1、H3N2、H5N3、H5N2、H7N9等多个型别。甲型流感病毒之间的不仅重配现象非常普遍，而且在基因组复制过程易产生碱基突变，进一步增加的遗传的多样性，同时也为临床诊断带来了困难。

通过Real-time RT-PCR（rRT-PCR）方法对甲型流感病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内对疑似感染样本进行确诊，该方法应用于临床标本检测时，可用于肠道病原监测以及临床流行病学 研究。应用PCR方法对病毒核酸进行检测时， 其难点之一在于病毒的变异为引物和探针设计带来困难，为了准确对流行中的甲型流感病毒进行鉴定，需要定期对流行毒株的序列进行比对和分析，对引物和探针序列进行更新优化。随着新的甲型流感病毒新型别的发现和甲型流感病毒保守区基质蛋白（M1）和膜蛋白（M2）区产生新的突变位点的发现，为提高检测的灵敏度和特异度，需根据新的突变位点设计新的引物。急需建立一种可靠的适用于多种甲型流感病毒新型别的检测试剂盒。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种通用型甲型流感病毒核酸检测的引物、探针以及试剂盒。采用本发明的引物和探针或试剂盒及其他常规试剂组分，能够实现针对甲型流感病毒保守区基质蛋白（M1）和膜蛋白（M2）区产生新的突变位点的定量PCR检测，灵敏性、准确性相近或优于中华人民共和国医药行业标准YY/T 1596-2017。

根据本发明的第一个方面，本发明提供一种用于甲型流感病毒的通用型核酸检测的引物和探针序列，包括有核苷酸序列如SEQ ID No:1所示的正向引物，核苷酸序列如SEQID No:2所示的反向引物，以及核苷酸序列如SEQ ID No:3所示的探针，所述探针的5’端标记有 FAM 荧光染料，3’端标记有TAMRA 荧光染料。

根据本发明的第二个方面，本发明提供一种甲型流感病毒的通用型RT-PCR检测的试剂盒，本发明所述的试剂盒包含有检测引物，检测探针；所述的检测引物的序列如如 SEQID No:1 和 SEQ ID No:2 所示；所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No:3 所示，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料，作为优选的，上述探针的5’端标记有FAM 荧光染料，3’端标记有TAMRA 荧光染料。

上述试剂盒还包括有核苷酸序列如SEQ ID No:4所示的阳性对照质粒，所述阳性对照质粒是将登录号为MK212436.1的部分片段与PUC11载体相连接后得到的。

上述试剂盒还包括有rRT-PCR 反应液，所述rRT-PCR 反应液与上述引物和探针共同构成rRT-PCR 检测体系。

所述rRT-PCR 检测体系含有以下含量的各组分：25μl rRT-PCR 检测体系中含有：2×OneStep RT-PCR Buffer 12.5μl，10μM正向引物 1.5μl，10μM反向引物 1.5μl，10μM探针 0.5μl，Rox Reference Dye Ⅱ (50×)0.5μl，5U/μl Ex Taq HS 0.5μl，40U/μlPrimeScript RT enzyme Mix 0.5μl，RNA 5μl，RNase Free dH₂O 2.5μl 。

进一步的，上述试剂盒核酸检测的反应条件：50℃反转录20min，95℃反应3min，95℃ 变性15s，60℃退火/延伸40s，PCR扩增反应45个循环。

作为本发明的优选方案，上述试剂盒的检测对象为咽喉拭子液、痰液、肺泡灌洗液、组织渗出液、粪便或尿液。

本发明的有益效果是：

本发明根据甲型流感病毒基质蛋白M1和M2序列新的突变位点设计引物及荧光探针，本发明提供的甲型流感病毒的通用型核酸检测的引物和探针简并性强，其在正向引物的5’端18碱基处发现有T碱基突变，21碱基处发现有A突变；反向引物5’端16碱基处出现T碱基突变，17碱基处出现T突变；探针5’端出现A突变。采用本发明引物及探针进行rRT-PCR检测，对甲型流感病毒保守区M1和M2区突变产生的新型别流感病毒具有较高的检出率，灵敏度高；为甲型流感病毒感染的相关疾病诊断提供科学依据。

附图说明

图1是部分流感病毒样本的扩增曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。下述实施例中所使用的实验原料如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1：引物及探针的设计和合成

本发明的关键之一在于，设计一组能够用于甲型流感病毒的通用型核酸检测的引物和探针。根据GenBank数据库中的甲型流感病毒的基因组序列，利用MAFFT软件比对分析不同型别基因序列的一致性，选择甲型流感病毒基质蛋白M1和M2序列突变位点相对保守区设计全基因组特异性扩增引物序列，

所设计的引物及探针序列为：

正向引物IFN-UN-F的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，即： 5’-CAAGACCAATCCTGTCACCTYTR -3’；反向引物IFN-UN-R的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，即：5’-TCTACGCTGCAGTCCTCGCTC -3’；以及探 针IFN-UN-P的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，即：5’-ACGCTCACCGTGCCCAGTGAGC-3’；通用探针的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料TAMRA。

实施例2：RNA的提取

按照《分子克隆实验指南（第三版）》进行甲型流感病毒克隆和测序。分别对临床收集的60例有感冒症状患者的咽喉拭子液、痰液、肺泡灌洗液、组织渗出液、粪便及尿液为样本，提取流感病毒细胞培养物，使用高纯病毒RNA试剂盒（High Pure Viral RNA Kit）提取流感病毒样品中的RNA，具体抽提步骤按操作说明书进行。其中，痰液、咽喉拭子液以及粪便样品需经过预处理，痰液以及咽喉拭子样品需在抽提前加 0.01M PBS，PH7.5；粪便样品（0.5ml 液态粪便）加 5mLPBS，然后将悬液 12000×g 离心 10min，取上清液进行 RNA 抽提，用 50μlDEPC 水洗脱，于-80℃保存。

实施例3：Real-time RT-PCR扩增方法的建立

以实施例2中各样本提取出的流感病毒RNA 为模板，进行实时 RT-PCR 反应（反应用试剂购自 TaKaRa）。

荧光定量 RT-PCR 反应体系如下所示：

25μl rRT-PCR 检测体系中包含有：2×OneStep RT-PCR Buffer 12.5μl、10μM正向引物（SEQ ID No:1）1.5μl、10μM反向引物（SEQ ID No:2）1.5μl、10μM探针（SEQ ID No:3）0.5μl、Rox Reference Dye Ⅱ (50×)0.5μl、5U/μl Ex Taq HS 0.5μl、40U/μl PrimeScriptRT enzyme Mix 0.5μl、待检测样本RNA 5μl、RNase Free dH₂O 2.5μl。将上述反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪中，rRT-PCR 反应条件设置如下：50℃反转录20min，95℃反应3min，95℃ 变性15s，60℃ 退火/延伸40s，PCR扩增反应45个循环，在每个循环的退火/延伸阶段收集FAM荧光信号数据。反应结束后根据Ct值或扩增曲线判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本甲型流感病毒是否阳性。图1是部分流感病毒样本的扩增曲线图；如图1所示，扩增出明显的S型曲线，可见出现相应的特异性荧光扩增曲线，呈阳性反应，确定为甲型流感病毒。

实施例4：甲型流感病毒Real-time RT-PCR方法的特异性确定

采用实施例3中的步骤对临床收集的60例有感冒症状患者的咽拭子样本进行直接扩增RT-PCR。分别提取样本核酸逆转录后，分析是否有甲型流感病毒感染。同时以YY/T 1596-2017为标准的甲型流感病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)对比。

分析结果显示，采用医药行业标准YY/T 1596-2017方法鉴定结果显示：60份样本中有23个样品荧光定量PCR荧光信号，判定为甲型流感病毒阳性，其余样品均没有荧光信号；采用本发明中的检测试剂盒共检测出24个阳性样本，其中，包含上述采用常规方法判定出的23个甲型流感病毒阳性样本；均检出有FAM荧光信号，判定为甲型流感病毒阳性，其余样品均没有荧光信号；阳性对照组均成立，结果准确可信。可能基于对照方法中假阴性结果的存在，本发明所提供的试剂盒检测结果多出1个阳性样本。可见，本发明所提供的检测方法可以准确的鉴定甲型流感病毒，且有更高的敏感性，对基于甲型流感病毒保守区M1和M2区突变产生的多个流感病毒亚型均有较高的鉴别准确度，满足对于甲型流感病毒的通用检测需求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏派森杰生物科技有限公司

江苏大学

<120> 通用型甲型流感病毒核酸检测的引物和探针以及试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagaccaatc ytgtcacctc tga 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaarcgtct acgctgcagt cc 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgctcaccg tgcccagtga gcg 23

<210> 4

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccccctcaaa gccgagatcg cgcagagact tgaagatgtc tttgcaggga aaaacaccga 60

tctcgaggct ctcatggaat ggctaaagac aagaccaatc ctgtcacctt taactaaggg 120

gattttagga tttgtgttca cgctcaccgt gcccagtgag cgaggactgc agcgtagacg 180

ctttgtccaa aatgccctaa atgggaatgg agacccaaac aacatggaca aggcagtcaa 240

actgtacagg aagttgaaaa gagagataac attccacggg gctaaagaag ttgcactcag 300

ctactcaacc ggtgcacttg ccagttgtat gggtctcata tacaacagga tgggaacagt 360

gaccacagaa gtggcttttg gcctagtgtg tgccacctgt gaaca 405

Claims (8)

1.通用型甲型流感病毒核酸检测的引物与探针序列，其特征在于，包含有核苷酸序列如SEQ ID No:1所示的正向引物，核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的反向引物，以及核苷酸序列如SEQ ID No:3所示的探针，所述探针的5’端标记有 FAM 荧光染料，3’端标记有TAMRA荧光染料。

2.一种通用型甲型流感病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括有用于扩增甲型流感病分型的特异基因位点的检测引物和配合使用的探针，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有 FAM 荧光染料，3’端标记有TAMRA 荧光染料。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有核苷酸序列如SEQID No:4所示的阳性对照质粒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照质粒是将登录号为MK212436.1的部分片段与PUC11载体相连接后得到的。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括有rRT-PCR 反应液，所述rRT-PCR 反应液与引物和探针共同构成rRT-PCR 检测体系；所述rRT-PCR 检测体系含有以下含量的各组分：25μl rRT-PCR 检测体系中含有：2×OneStep RT-PCR Buffer 12.5μl，10μM正向引物 1.5μl，10μM反向引物 1.5μl，10μM探针 0.5μl，Rox Reference Dye Ⅱ (50×)0.5μl，5U/μl Ex Taq HS 0.5μl，40U/μl PrimeScript RT enzyme Mix 0.5μl，RNA 5μl，RNase Free dH₂O 2.5μl。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸检测的反应条件为：50℃反转录20min，95℃反应3min，95℃ 变性15s，60℃退火/延伸40s，PCR扩增反应45个循环。

8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述剂盒的检测对象为咽喉拭子液、痰液、肺泡灌洗液、组织渗出液、粪便或尿液。

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