CN111534637B - 肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒。本发明根据肠道病毒5‘UTR序列新的突变位点设计引物及荧光探针，本发明提供的肠道病毒的通用型核酸检测的引物、探针简并性强，其在上游引物的3’端起8碱基处引入兼并碱基；下游引物5’端16碱基处根据T碱基突变引入兼并碱基。采用本发明引物及探针进行rRT‑PCR检测，对肠道病毒5‘UTR序列突变产生的新型肠道病毒具有较高的检出率，灵敏度高；为肠道病毒感染的相关疾病诊断提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒。
技术背景
肠道病毒属于小RNA病毒家族，肠道病毒属内能够感染人的有4个种：分别为A、B、C和D。根据遗传及表型的相似性肠道病毒又进一步划分为多个血清型，截至目前有超过 110个血清型。肠道病毒在基因组复制过程易产生错误，随着时间的累积而发生突变。肠道病毒之间的重组现象非常普遍，重组又进一步增加的遗传的多样性，同时也为临床诊断带来了困难。
通过Real-time RT-PCR (rRT-PCR)方法对肠道病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内对疑似感染样本进行确诊，应用于临床标本检测时，可用于肠道病原监测以及临床流行病学研究。但因病毒的变异为引物、探针设计带来困难，为准确对流行中的肠道病毒进行鉴定，需要定期对流行毒株的序列进行比对和分析。如分型鉴定引物探针不再适用于流行的毒株，则需要对引物、探针序列进行更新优化。随着新的肠道病毒血清型的发现和肠道病毒5‘UTR区产生新的突变位点被发现，为提高检测的灵敏度和特异度，需根据新的突变位点设计新的引物。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒。采用本发明的引物、探针或试剂盒及其他常规试剂组分，能够实现针对肠道病毒5’UTR新突变位点的PCR检测。
根据本发明的第一个方面，本发明提供一种用于肠道病毒的通用核酸检测的引物、探针序列，包括有核苷酸序列如SEQ ID No:1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示的下游引物，以及核苷酸序列如SEQ ID No:3所示的探针，所述探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。优选的，所述探针的5’端标记有 FAM 荧光染料，3’端标记有TAMRA 荧光染料。
根据本发明的第二个方面，本发明提供一种肠道病毒的通用核酸检测的试剂盒，本发明所述的试剂盒包含有检测引物，检测探针；所述的检测引物的序列如如 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 所示；所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No:3 所示，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料，作为优选的，上述探针的5’端标记有 FAM荧光染料，3’端标记有TAMRA 荧光染料。
上述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID No:4所示的阳性对照质粒。所述阳性对照质粒是登录号为的JN048468的人柯萨奇病毒B3，Nancy株多蛋白序列。
上述试剂盒还包括有rRT-PCR 反应液，所述rRT-PCR 反应液与上述引物、探针共同构成rRT-PCR 检测体系。
所述rRT-PCR 检测体系含有以下含量的各组分：25μl rRT-PCR 检测体系中含有：2×OneStep RT-PCR Buffer 12.5μl，10μM正向引物3.0μl，10μM反向引物 3.0μl，10μM探针0.5μl，Rox Reference Dye Ⅱ (50×)0.5μl，5U/μl Ex Taq HS 0.5μl，40U/μlPrimeScript RT enzyme Mix 0.5μl，RNA 4.5μl。
进一步的，上述试剂盒的检测反应条件：50℃反转录20min，95℃反应3min，95℃变性15s，60℃退火/延伸40s，PCR扩增反应45个循环。
作为本发明的优选方案，上述试剂盒的检测对象为咽喉拭子液、泄殖腔拭 子液、组织渗出液、粪便或尿液。
本发明的有益效果是：
本发明根据肠道病毒5‘UTR序列新的突变位点设计引物及荧光探针，本发明提供的肠道病毒的通用核酸检测的引物、探针简并性强，其在上游引物的3’端起8碱基处引入简并碱基；下游引物5’端16碱基处根据T碱基突变引入兼并碱基。采用本发明引物及探针进行rRT-PCR检测，对肠道病毒5‘UTR序列突变产生的新型肠道病毒具有较高的检出率，灵敏度高；为肠道病毒感染的相关疾病诊断提供科学依据。
附图说明
图1是部分肠道病毒样本的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。下述实施例中所使用的实验原料如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
实施例1：引物及探针的设计和合成
本发明的关键之一在于，设计一组能够用于肠道病毒的通用型核酸检测的引物、探针。本发明根据GenBank数据库中肠道病毒的基因组序列，利用MAFFT软件比对分析不同型别肠道病毒基因序列的一致性，选择相对保守区设计全基因组特异性扩增引物序列。所设计的引物对大多数肠道病毒都有匹配序列，基于病肠道病毒种类多达100多种，而且近几年如D68、C105、C107等新的肠道病毒层出，引入简并引物。由于肠道病毒D68血清型的变异位点，本发明在正向引物（EV-UN-R）的3’第三个碱基处引入”Y”简并引物。由于C105、C109病毒的突变，本发明在反向引物（EV-UN-R）的3’第四个碱基处引入”K”简并引物。对于上游引物的设计，由于C117、C118、C105、C104和C109血清型的病毒学列对应设计的3‘端第八个碱基处与其它多数病毒序列不同，由此设计引入”Y”简并引物；C104、C109血清型的病毒序列对应，本发明设计的3’端第五个碱基处与其它多数病毒序列不同，由此位点引入”M”简并引物。探针（EV-UN-P）的设计上在5’端的第十四个碱基处部分D68病毒序列位点有变异，由此引入”W”简并引物。
所设计的引物及探针序列为：
正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，即： 5’-CCTCCGGCCCCTGAATGYGGMTAAT-3’ ；
反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，即：5’- TTGTCACCATAARCAKYCA -3’；
探针的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，即：5’- FAM- ACTACTTTGGGTGWCCGTGTTTC-TAMRA-3’；该探针的5’端标记有报告荧光染料 FAM， 3’端标记有淬灭荧光染料TAMRA。
实施例2：RNA的提取
以肠道病毒细胞培养物、疱疹液、粪便样品、肛拭子和咽喉拭子等为肠道病毒样品。使用高纯病毒RNA试剂盒（High Pure Viral RNA Kit）提取肠道病毒样品中的RNA，具体抽提步骤按操作说明书进行。其中肠道病毒细胞培养物、疱疹液中RNA抽提依照说明书直接提取，粪便样品、肛拭子以及咽喉拭子样品需经过预处理，预处理具体为：肛拭子以及咽喉拭子样品需在抽提前加 0.01M PBS，PH7.5；粪便样品（0.5ml 液态粪便）加 5mLPBS，然后将悬液 12000×g 离心 10min，取上清液进行 RNA 抽提，用 50μl DEPC 水洗脱，于-80℃保存。
实施例3：Real-time RT-PCR扩增方法的建立
以 实施例2中提取出的肠道病毒RNA 为模板，进行实时 RT-PCR 反应（试剂购自于TaKaRa公司）。
荧光定量 RT-PCR 反应体系如下所示：
25μl rRT-PCR 检测体系中包含有：2×OneStep RT-PCR Buffer 12.5μl、10μM正向引物（SEQ ID No:1）3.0μl、10μM反向引物（SEQ ID No:2）3.0μl、10μM探针（SEQ ID No:3）0.5μl、Rox Reference Dye Ⅱ (50×)0.5μl、5U/μl Ex Taq HS 0.5μl、40U/μlPrimeScript RT enzyme Mix 0.5μl、待检测样本RNA4.5μl。将上述反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪中，rRT-PCR 反应条件设置如下：50℃反转录20min，95℃反应3min，95℃ 变性15s，60℃ 退火/延伸40s，PCR扩增反应45个循环，在每个循环的退火/延伸阶段收集FAM荧光信号数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。图1是部分肠道病毒样本的扩增曲线图。如图1所示，扩增出明显的曲线，可见出现相应的特异性荧光扩增曲线，呈阳性反应。
实施例4：肠道病毒Real-time RT-PCR方法的特异性确定
分别选取柯萨奇病毒A6（CVA6）、柯萨奇病毒B3（CVB3）、EV-C105和EV-D68作为肠道病毒A、B、C和D种的代表。利用本发明建立起的荧光 RT-PCR 反应体系对这4种毒株进行检测。以江苏硕世生物科技有限公司的肠道病毒通用型核酸检测试剂盒(荧光PCR法)作为对照组，检测结果显示，采用本发明中的引物、探针对4种病毒的PCR结果显示均得到了特异性荧光扩增曲线，呈阳性反应；对照组只检测出CVA6和CVB3病毒，并未检出C、D种的代表病毒EV-C105及EV-D68。结果表明，本发明所提供的引物、探针对A、B、C和D四种肠道病毒均有较强的特异性和敏感性，满足于不同肠道病毒的通用检测需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏派森杰生物科技有限公司
江苏大学
<120> 肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒
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agatgagtat accgcagggg gttttattac gtgctggtat caaacaaaca tagtggtccc 2340
agcggatgcc caaagctcct gttacatcat gtgtttcgtg tcagcatgca atgacttctc 2400
tgtcaggcta ttgaaggaca ctcctttcac ttcgcaggaa aactttttcc agggcccagt 2460
ggaagacgcg ataacagccg ctatagggag agttgcggat accgtgggta cagggccaac 2520
caactcagaa gctataccag cactcactgc tgctgagaca ggtcacacgt cacaagtagt 2580
gccgggtgac accatgcaga cacgccacgt taagaactac cattcaaggt ccgagtcaac 2640
catagagaac ttcctatgta ggtcagcatg cgtgtacttt acggagtatg aaaactcagg 2700
tgccaagcgg tatgctgaat gggtattaac accacgacaa gcagcacaac ttaggagaaa 2760
gctagaattc tttacctacg tccggttcga cctggagctg acgtttgtca taacaagtac 2820
tcaacagccc tcaaccacac agaaccaaga cgcacagatc ctaacacacc aaattatgta 2880
tgtaccacca ggtggacctg taccagataa agttgattca tacgtgtggc aaacatctac 2940
gaatcccagt gtgttttgga ccgagggaaa cgccccgccg cgcatgtcca taccgttttt 3000
gagcattggc aacgcctatt caaatttcta tgacggatgg tctgaatttt ccaggaacgg 3060
agtttacggc atcaacacgc taaacaacat gggcacgcta tatgcaagac atgtcaacgc 3120
tggaagcacg ggtccaataa aaagcaccat tagaatctac ttcaaaccga agcatgtcaa 3180
agcgtggata cctagaccac ctagactctg ccaatacgag aaggcaaaga acgtgaactt 3240
ccaacccagc ggagttacca ctactaggca aagcatcact acaatgacaa atacgggcgc 3300
atttggacaa caatcagggg cagcgtatgt ggggaactac agggtagtaa atagacatct 3360
agctaccagt gctgactggc aaaactgtgt gtgggaaagt tacaacagag acctcttagt 3420
gagcacgacc acagcacatg gatgtgatat tatagccaga tgtcagtgca caacgggagt 3480
gtacttttgt gcgtccaaaa acaagcacta cccaatttcg tttgaaggac caggtctagt 3540
agaggtccaa gagagtgaat actaccccag gagataccaa tcccatgtgc ttttagcagc 3600
tggattttcc gaaccaggtg actgtggcgg tatcctaagg tgtgagcatg gtgtcattgg 3660
cattgtgacc atggggggtg aaggcgtggt cggctttgca gacatccgtg atctcctgtg 3720
gctggaagat gatgcaatgg aacagggagt gaaggactat gtggaacagc ttggaaatgc 3780
attcggctcc ggctttacta accaaatatg tgagcaagtc aacctcctga aagaatcact 3840
agtgggtcaa gactccatct tagagaaatc tctaaaagcc ttagttaaga taatatcagc 3900
cttagtaatt gtggtgagga accacgatga cctgatcact gtgactgcca cactagccct 3960
tatcggttgt acctcgtccc cgtggcggtg gctcaaacag aaggtgtcac aatattacgg 4020
aatccctatg gctgaacgcc aaaacaatag ctggcttaag aaatttactg aaatgacgaa 4080
tgcttgcaag ggtatggaat ggatagctgt caaaattcag aaattcattg aatggctcaa 4140
agtaaaaatt ttgccagagg tcagggaaaa acacgaattc ctgaacagac ttaaacaact 4200
ccccttatta gaaagtcaga tcgccacaat cgagcagagc gcgccatccc aaagtgacca 4260
ggaacaatta ttttccaatg tccaatactt tgcccactat tgcagaaagt acgctcccct 4320
ctacgcagct gaagcaaaga gggtgttctc ccttgagaag aagatgagca attacataca 4380
gttcaagtcc aaatgccgta ttgaacctgt atgtttgctc ctgcacggga gccctggtgc 4440
cggcaagtcg gtggcaacaa acttaattgg aaggtcgctt gctgagaaac tcaacagctc 4500
agtgtactca ctaccgccag acccagatca cttcgacgga tacaaacagc aggccgtggt 4560
gattatggac gatctatgcc agaatcctga tgggaaagac gtctccttgt tctgccaaat 4620
ggtttccagt gtagattttg taccacccat ggctgcccta gaagagaaag gcattctgtt 4680
cacctcaccg tttgtcttgg catcgaccaa tgcaggatct attaatgctc caaccgtgtc 4740
agatagcaga gccttggcaa ggagatttca ctttgacatg aacatcgagg ttatttccat 4800
gtacagtcag aatggcaaga taaacatgcc catgtcagtc aagacttgtg acgatgagtg 4860
ttgcccggtc aattttaaaa agtgctgccc tcttgtgtgt gggaaggcta tacaattcat 4920
tgatagaaga acacaggtca gatactctct agacatgcta gtcaccgaga tgtttaggga 4980
gtacaatcat agacatagcg tggggaccac gcttgaggca ctgttccagg gaccaccagt 5040
atacagagag atcaaaatta gcgttgcacc agagacacca ccaccgcccg ccattgcgga 5100
cctgctcaaa tcggtagaca gtgaggctgt gagggagtac tgcaaagaaa aaggatggtt 5160
ggttcctgag atcaactcca ccctccaaat tgagaaacat gtcagtcggg ctttcatttg 5220
cttacaggca ttgaccacat ttgtgtcagt ggctggaatc atatatataa tatataagct 5280
ctttgcgggt tttcaaggtg cttatacagg agtgcccaac cagaagccca gagtgcctac 5340
cctgaggcaa gcaaaagtgc aaggccctgc ctttgagttc gccgtcgcaa tgatgaaaag 5400
gaactcaagc acggtgaaaa ctgaatatgg cgagtttacc atgctgggca tctatgacag 5460
gtgggccgtt ttgccacgcc acgccaaacc tgggccaacc atcttgatga atgatcaaga 5520
ggttggtgtg ctagatgcca aggagctagt agacaaggac ggcaccaact tagaactgac 5580
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gagaatgctt atgtacaact tccccacaag agcaggccag tgtggtggag tgctcatgtc 5820
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actcctcaaa cactacttca atgatgagca aggtgaaata gaatttattg agagctcaaa 5940
ggacgccggg tttccagtca tcaacacacc aagtaaaaca aagttggagc ctagtgtttt 6000
ccaccaggtc tttgagggga acaaagaacc agcagtactc aggagtgggg atccacgtct 6060
caaggccaat tttgaagagg ctatattttc caagtatata ggaaatgtca acacacacgt 6120
ggatgagtac atgctggaag cagtggacca ctacgcaggc caactagcca ccctagatat 6180
cagcactgaa ccaatgaaac tggaggacgc agtgtacggt accgagggtc ttgaggcgct 6240
tgatctaaca acgagtgccg gttacccata tgttgcactg ggtatcaaga agagggacat 6300
cctctctaag aagactaagg acctaacaaa gttaaaggaa tgtatggaca agtatggcct 6360
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agcatttgat tactctgggt acgatgctag cttaagccct gtctggtttg cttgcctaaa 6660
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gctaaaagtg tacaaaggga ttgacttgga ccaattcagg atgatcgcat atggtgatga 6900
tgtgatcgca tcgtacccat ggcctataga tgcatcttta ctcgctgaag ctggtaaggg 6960
ttacgggctg atcatgacac cagcagataa gggagagtgc tttaacgaag ttacctggac 7020
caacgtcact ttcctaaaga ggtattttag agcagatgaa cagtacccct tcctggtgca 7080
tcctgttatg cccatgaaag acatacacga atcaattaga tggaccaagg atccaaagaa 7140
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tgaggagttc atccgtaaaa ttagaagcgt cccagtcgga cgttgtttga ccctccccgc 7260
gttttcaact ctacgcagga agtggttgga ctccttttag attagagaca atttgaaata 7320
atttagattg gctcaaccct actgtgctaa ccgaaccaga taacggtaca gtaggggtaa 7380
attctccgca ttcggtgcgg aaaaaaaaaa aaaaa 7415
Claims (5)
1.肠道病毒核酸检测的通用引物与探针，其特征在于，包含有核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的下游引物，以及核苷酸序列如SEQIDNo:3所示的探针，所述探针的5’端标记有FAM荧光染料，3’端标记有TAMRA荧光染料。
2.一种肠道病毒核酸检测的通用试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括有用于扩增肠道病毒的特异基因位点的检测引物和配合使用的探针，所述检测引物的核苷酸序列如SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；所述探针的5’端标记有FAM荧光染料，3’端标记有TAMRA荧光染料，所述试剂盒还包括有rRT-PCR反应液，所述rRT-PCR反应液与引物、探针共同构成rRT-PCR检测体系；所述rRT-PCR检测体系含有以下含量的各组分：25μl rRT-PCR检测体系中含有：2×OneStep RT-PCR Buffer 12.5μl，10μM正向引物3.0μl，10μM反向引物3.0μl，10μM探针0.5μl，Rox Reference DyeⅡ(50×)0.5μl，5U/μl Ex Taq HS 0.5μl，40U/μl PrimeScript RT enzyme Mix 0.5μl，RNA4.5μl。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有核苷酸序列如SEQIDNo:4所示的阳性对照质粒。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸检测的反应条件为：50℃反转录20min，95℃反应3min，95℃变性15s，60℃退火/延伸40s，PCR扩增反应45个循环。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述剂盒的检测对象为咽喉拭子液、泄殖腔拭子液、粪便或尿液。
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