CN106435026A - 用于检测肠道病毒的引物组、探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测肠道病毒的引物组、探针及试剂盒，所述引物组可以一次检测包括肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5和Echo30在内的7种病毒，本发明还公开了与所述引物组配合使用的探针，以及包含所述引物组和探针的试剂盒。本发明提供的试剂盒，通过以上所述的引物组、探针混合物建立7种易致病的肠道病毒RT‑RPA检测的引物组、探针、试剂盒，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对所述7种肠道病毒同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

用于检测肠道病毒的引物组、探针及试剂盒

技术领域

本公开涉及肠道病毒的检测，具体地，涉及用于检测肠道病毒的引物组、探针及试剂盒。

背景技术

医院、畜禽养殖及屠宰场等分散点源的污水中含有大量的病原微生物，使水源成为了传染性疾病传播的重要因子。大量的研究发现污水中肠道病毒造成的传染性疾病对于公众健康造成了巨大的威胁。肠道病毒属于小核糖核酸病毒科，其为单正链RNA的无包膜病毒，具有感染性，可引起手足口病，又称发疹性水疱型口腔炎。根据近几年的报道，由肠道病毒EV71和CA16所引起的手足口病容易形成爆发流行，严重的导致患者死亡，造成大众的恐慌。除此之外，肠道病毒中的CA10、CA6、CB3、CB5和肠道病毒Echo30也是引发手足口病的常见血清型，因而成为相关人员研究手足口病检测对象的热点。

由肠道病毒的流行病学可知，环境因素中经由水传播造成的病原体感染是其主要的途径之一。2006年开始执行的《医疗机构水污染物排放标准》(GB18466-2005)对医疗机构污水处理全过程的无害化提出了新的要求，增加了肠道病毒这一检测指标。因此，建立快速、准确、简便的污水中肠道病毒的检测技术为污水中致病因子及相关疾病的监测和预警提供了重要的参考，对于提高我们应对肠道病毒引发疾病的处置能力具有重要意义。

目前，聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)与环式介导等温扩增(Loop-mediated isothermal Amplification，LAMP)技术是最常用的肠道病毒感染诊断方法，但是，LAMP检测RNA样本需要设置单独的逆转录步骤，60-90min才可以完成反应，且对SNP识别度不够，引物结合区域单位点突变不能被LAMP识别。LAMP采用65℃恒温扩增，若待检测区域的GC含量过低、过高或者二级结构复杂，则扩增效果较差；此外LAMP采用多组引物进行滚环复制，产物量巨大，极易污染实验环境，产生假阳性结果。而PCR存在试验程序繁琐、耗时较长、产物量巨大、易污染实验环境产生假阳性结果的缺点，并且检测需要使用精密仪器，非实验室环境下难以现场检测。

发明内容

本公开的目的是解决现有肠道病毒检测中存在的检测仪器平台昂贵、检测耗时长、敏感性和特异性差、检出率低和覆盖度差的问题。

为了实现上述目的，本公开提供一种用于检测肠道病毒的引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1-14所示的引物；所述肠道病毒包括肠道病毒EV71、肠道病毒CA16、肠道病毒CA10、肠道病毒CA6、肠道病毒CB3、肠道病毒CB5和肠道病毒Echo30。

上述引物组适用于重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)，RPA是模拟生物体内DNA复制、基于重组酶、聚合酶介导的扩增原理发展而来。重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single strand DNA-binding protein，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形成复制所需的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下，在25-43℃进行复制延伸，形成新的DNA互补链。随着反应进行，反应产物以指数级增长，5-20min即可完成检测。与常规PCR反应不同的是，RPA反应所需引物长度通常为30-38nt。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要，其长度的增加也使引物设计及选择难度增加。本发明中提供的引物组在适宜的引物浓度条件下，可以互不影响的在一次扩增中同时检测肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，多重检测时每个目标最低检出限均达到5拷贝/体系。

本发明还提供一种与权利要求1所述的引物组配合使用的探针，其中，所述探针包括SEQ ID NO.17-23所示的探针混合物。

上述探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因在一个反应体系中共扩增的问题，还考虑到了要避免探针出现发夹结构、引物二聚体的情况，本发明中的探针混合物能够全面覆盖肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，特异性良好并且覆盖度高。

在RPA扩增体系中，本发明提供的上述探针混合物与引物组配合使用可以实现模板扩增的实时监控，所述探针其中两个碱基上各标记一个荧光基团和淬灭基团，在两个基团之间有双脱氧间臂(dSpacer)位点，该位点可被来自大肠杆菌的3’-5’核酸外切酶识别，可以使两个基团分离，从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步，这样结合荧光扩增检测仪便可在10-20分钟内检测到荧光曲线。

本发明还提供一种用于检测肠道病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒含有SEQ IDNO.1-14所示的引物组和SEQ ID NO.17-23所示的探针混合物。

本发明提供的试剂盒，通过以上所述的引物组、探针混合物建立了7种易致病的肠道病毒RPA检测的引物组、探针、试剂盒，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对7种肠道病毒同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下是对本发明具体实施方式的详细说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅限于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种用于检测肠道病毒的引物组，其中，该引物组包括SEQ IDNO.1-14所示的引物；所述肠道病毒包括肠道病毒EV71、肠道病毒CA16、肠道病毒CA10、肠道病毒CA6、肠道病毒CB3、肠道病毒CB5和肠道病毒Echo30。

本发明中提供的引物组在适宜的引物浓度条件下，可以互不影响的在一次RPA扩增中同时检测肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，多重检测对所有检测目标的最低检出限均达到5拷贝/体系。

本发明还提供一种与权利要求1所述的引物组配合使用的探针，其中，所述探针包括SEQ ID NO.17-23所示的探针混合物。

上述探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因在一个反应体系中共扩增的问题，还考虑到了要避免探针出现发夹结构、引物二聚体的情况，本发明中的探针混合物能够分别全面覆盖肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，特异性良好并且覆盖度高。

在RPA扩增体系中，本发明提供的上述探针混合物与引物组配合使用可以实现模板扩增的实时监控，所述探针其中两个碱基上各标记一个荧光基团(ROX、FAM、VIC、CY5)和淬灭基团(BHQ1、BHQ2、BHQ3)，在两个基团之间有双脱氧间臂(dSpacer)位点，该位点可被来自大肠杆菌的3’-5’核酸外切酶识别，可以使两个基团分离，从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步，这样结合荧光扩增检测仪便可在10-20分钟内检测到荧光曲线。

本发明还提供一种用于检测肠道病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒含有SEQ IDNO.1-14所示的引物组和SEQ ID NO.17-23所示的探针混合物。

本发明提供的试剂盒，通过以上所述的引物组、探针混合物可以建立了7种易致病的肠道病毒RPA检测的引物组、探针、试剂盒，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对7种肠道病毒同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性内质控、逆转录酶、反应体系缓冲液、DNA重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、3’-5’核酸外切酶、dNTP和水。

通过以上方案，逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)只需将RPA体系与逆转录酶、RNA混合，构建RT-RPA反应体系，就可直接以RNA为模板，20min内实现逆转录与检测过程的一体化。因此，RPA技术比其他等温扩增或PCR技术更适用于肠道病毒的现场诊断。RT-RPA技术极大地缩短了检测时间，简化了反应程序，与核酸快速提取技术相结合使野外和现场检测成为可能。

进一步地，所述的阳性内质控含有SEQ ID NO.15-16所示的引物序列、SEQ IDNO.24所示的探针和模板pET28a质粒；所述阳性内质控(Internal AmplificationControl，IAC)，可以有效提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。

进一步地，为了增强检测结果的准确性，所述的试剂盒检测项目分为两管；A管含有SEQ ID NO.1-8所示的引物序列和SEQ ID NO.17-20所示的探针序列；B管含有SEQ IDNO.9-16所示的引物序列和SEQ ID NO.21-24所示的探针序列。

进一步地，为了增加检测结果的准确性，所述试剂盒的优选工作程序为：每个循环为3个39℃10s，在每个循环结束时收集荧光，共有40个循环。

进一步地，所述试剂盒用于检测污水、废物或土壤中肠道病毒或者来源于人体样本如水疱液、唾液或粪便中的肠道病毒。其中，所述肠道病毒包括肠道病毒EV71、肠道病毒CA16、肠道病毒CA10、肠道病毒CA6、肠道病毒CB3、肠道病毒CB5和肠道病毒Echo30。

特别地，本发明的技术方案，能够实现形态学、免疫学、LAMP以及单重实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：

(一)多重检测覆盖面广

目前，肠道病毒检测仅限于CA16、EV71等最常见的血清型，对于其它肠道病毒多采取通用方案的检测，缺乏特异性。本发明所建立的检测方法可以一次性的检测7种血清型的肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，检测流程简单，结果简易且可靠，节省了时间、人力和物力成本。

(二)耗时短

逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)只需要将RPA体系与逆转录酶混合，构建RT-RPA反应体系，就可以RNA为模板实现逆转录与检测过程的一体化。整个反应20min即可完成，而RT-PCR、Real-time PCR、LAMP等技术需要60-90min才可完成。

(三)对仪器平台要求低

RT-RPA反应可在常温下进行，不需要配备专门的热循环扩增仪，更好的实现了肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的现场应急检测。

(四)特异性好

RPA可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力，而LAMP和普通Real-time PCR则无法识别SNP，这使得RPA检测的特异性明显优于LAMP和Real-timePCR。本发明所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性：所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；特异性实验证实本发明能够很好的区分包括轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、腺病毒、鼻病毒、EV72、CB1、CB2、Echo9肠道病毒等其他病毒，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。

(五)灵敏度高

本发明所建立的检测方法的最低检出限可达到5拷贝/反应。

(六)成本较低

本发明所建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，降低了仪器成本。

(七)预防假阴性结果

本发明反应体系中添加的阳性内质控(IAC)，可以有效的提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。

本发明建立了7种易致病的肠道病毒RPA检测的引物组、探针、试剂盒，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对7种肠道病毒同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。

以下通过实施例进行进一步详细说明本发明，但是本发明并不因此受到任何限制。

以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在上海生工生物技术有限公司合成。

实施例1

1.引物、探针合成：

按照表1和表2所示的引物、探针序列，进行序列合成。序列中Y代表简并碱基T/C；R代表简并碱基A/G；探针中ROX、FAM、VIC、CY5为荧光基团，BHQ1、BHQ2、BHQ3为淬灭基团，均用于修饰T碱基；在探针的3’末端还连接有磷酸基团(phosphate)。

表1

表2

2.特异性验证：

选择以下9个样本作为模拟干扰样本：轮状病毒(来自山东CDC，3001)、诺如病毒(来自山东CDC，3002)、札如病毒(来自山东CDC，3003)、腺病毒(来自山东CDC，3004)、鼻病毒(来自山东CDC，3005)、肠道病毒EV72(来自山东CDC，3008)、CB1(来自山东CDC，3010)、CB2(来自山东CDC，3011)、Echo9(来自山东CDC，3014)的核酸，用于特异性评估，将上述每个样本混合作为特异性检测模板，进行RT-RPA扩增。

RT-RPA反应体系配制：本试剂盒包括阳性内质控在内共有八个检测目标，分为两管进行检测：A管检测目标为EV71、CA16、CA10和CA6；B管检测目标为CB3、CB5、Echo30以及IAC。每管总体系50μl，向含有RPA冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反应管中加入再水化缓冲液29.5μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/L)；按照表3所示分别配制A、B组引物混合物和探针混合物；0.00003ng/ul pET28a 1μl；逆转录酶1μl(200U/μl)，模板5μl，剩余用水补足。

表3

RT-RPA反应程序如下：选择FAM、VIC、CY5、ROX作为报告基团，每个循环为3个39℃、10s，再循环结束时收集荧光，共有40个循环。

RT-RPA反应结果判断：空白对照、IAC成立，否则视实验结果无效；若A管中FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.1-2的引物对和SEQ ID NO.17的探针有非特异性扩增；若A管中ROX通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.3-4的引物对和SEQ ID NO.18的探针有非特异性扩增；若A管中VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.5-6引物对和SEQ ID NO.19的探针有非特异性扩增；若A管中CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.7-8和SEQ ID NO.20的探针引物对有非特异性扩增；若B管中FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.9-10的引物对和SEQ ID NO.21的探针有非特异性扩增；若B管中VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.11-12和SEQ ID NO.22的探针的引物对有非特异性扩增；若B管中CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.13-14的引物对和SEQ ID NO.23的探针有非特异性扩增。

结果显示A管、B管中均未出现非特异性扩增。

3.最低检出限验证：

使用浓度均为10⁴拷贝/μl的肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的核酸等比例混合作为模板I、同样方法配制浓度均为10³拷贝/μl、10²拷贝/μl、10¹拷贝/μl、2拷贝/μl、10⁰拷贝/μl的7种肠道病毒等比例混合核酸作为模板II、III、IV、V、VI。按照以上所述反应体系分别加入模板I-VI，并按照以上所述的反应程序进行试验。

RT-RPA反应结果判断：空白对照、IAC成立，否则视实验结果无效；若A管中FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.1-2的引物对和SEQ ID NO.17的探针可检测出该浓度的模板；若A管中ROX通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.3-4的引物对和SEQ ID NO.18的探针可检测出该浓度的模板；若A管中VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.5-6的引物对和SEQ ID NO.19的探针可检测出该浓度的模板；若A管中CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.7-8的引物对和SEQID NO.20的探针可检测出该浓度的模板；若B管中FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.9-10的引物对和SEQ ID NO.21的探针可检测出该浓度的模板；若B管中VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.11-12的引物对和SEQ ID NO.22的探针可检测出该浓度的模板；若B管中CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.13-14的引物对和SEQ ID NO.23的探针可检测出该浓度的模板。

结果显示本试剂盒对于目标肠道病毒的最低检出限度均达到了5拷贝/体系(即为1拷贝/μl)。

4.样本耐受性检测

以乙醇沉淀法提取肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30各10株的，提取的RNA作为模板，根据以上所述的反应体系与反应程序进行扩增。

RT-RPA反应结果判断与最低检出限反应判断方法相同。

结果显示本发明试剂盒对如上所述的以乙醇简单提取的RNA为模板扩增均获得阳性结果，本发明试剂盒对样本的耐受性极好。

5.覆盖度检测

以肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30RNA核酸各5株分别作为模板进行覆盖度检测，根据如上所述反应体系和反应程序进行扩增。

RT-RPA反应结果判断与最低检出限反应判断方法相同。

结果显示本发明试剂盒对所有35株肠道病毒均可覆盖检测出。

对比例1

1.引物、探针合成

根据表4所示的序列合成引物、探针序列，序列中Y代表简并碱基T/C；R代表简并碱基A/G。所述引物、探针用于RT-RPA检测肠道病毒；探针中ROX、FAM、VIC、CY5为荧光基团，BHQ1、BHQ2、BHQ3为淬灭基团，均用于修饰T碱基；在探针的3’末端还连接有磷酸基团(phosphate)

表4

2.特异性验证

选择以下9个样本作为模拟干扰样本：轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、腺病毒、鼻病毒、肠道病毒EV72、CB1、CB2、Echo9的核酸，用于特异性评估，将上述样本的核酸混合物作为特异性检测模板，进行扩增。

RT-RPA反应体系配制、RT-RPA的反应程序、反应结果判断均与实施例1中的特异性验证相同。

结果显示，以上反应结果均为阴性，对比例的引物、探针特异性高。

3.最低检出限验证

使用浓度均为10⁴拷贝/μl的肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的核酸等比例混合作为模板I、同样方法配制浓度均为10³拷贝/μl、10²拷贝/μl、10¹拷贝/μl、2拷贝/μl、10⁰拷贝/μl的7种肠道病毒等比例混合核酸作为模板II、III、IV、V、VI。按照以上所述反应体系分别加入模板I-VI，并按照以上所述的反应程序进行试验。

反应结果判断与实施例1中的最低检出限验证相同。

结果显示对比例对7种肠道病毒的最低检出限为100拷贝/体系。

4.样本耐受性验证

以乙醇沉淀法提取肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的RNA各5株，作为模板，根据以上所述的RT-PRA反应体系与反应程序进行扩增。

反应结果判断与实施例1中的样本耐受性验证相同。

结果显示对比例有2株EV71、2株CA16、2株CA10、1株CB3的漏检。

5.覆盖度检测

以肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30各10株分别作为模板进行覆盖度检测，根据如上所述RT-PCR反应体系和反应程序进行扩增。

反应结果判断与实施例1中的覆盖度检测相同。

结果显示对比例漏检1株肠道病毒EV71、1株肠道病毒CA16、2株肠道病毒CB3。

经过实施例1与对比例1可以看出，本发明所建立的检测方法可以一次性的检测7种血清型的肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30。本发明试剂盒可识别引物结合区的单个核苷酸突变位点(SNP)，对非检测目标有极强的辨识能力。并且本试剂盒对于样本中痕量的肠道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30病毒检测能力更强，本发明试剂盒的最低检出限以及覆盖度显著低于对比例。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (9)

1.一种用于检测肠道病毒的引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1-14所示的引物；所述肠道病毒包括肠道病毒EV71、肠道病毒CA16、肠道病毒CA10、肠道病毒CA6、肠道病毒CB3、肠道病毒CB5和肠道病毒Echo30。

2.一种与权利要求1所述的引物组配合使用的探针，其中，所述探针包括如SEQ IDNO.17-23所示的探针。

3.一种用于检测肠道病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒含有SEQ ID NO.1-14所示的引物组和SEQ ID NO.17-23所示的探针混合物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性内质控、逆转录酶、反应体系缓冲液、DNA重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、3’-5’核酸外切酶、dNTP和水中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述的阳性内质控含有SEQ ID NO.15-16所示的引物、SEQ ID NO.24所示的探针和模板pET28a质粒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的试剂盒包括A管和B管；A管含有SEQ IDNO.1-8所示的引物和SEQ ID NO.17-20所示的探针；B管含有SEQ ID NO.9-16所示的引物和SEQ ID NO.21-24所示的探针。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒的工作程序为：每个循环包括3个39℃、10s，在每个循环结束时收集荧光，共有40个循环。

8.权利要求3-7中任意一项所述试剂盒的应用，其中，所述试剂盒用于检测污水、废物或土壤中肠道病毒或者来源于人体样本如水疱液、唾液或粪便中的肠道病毒。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述肠道病毒包括肠道病毒EV71、肠道病毒CA16、肠道病毒CA10、肠道病毒CA6、肠道病毒CB3、肠道病毒CB5和肠道病毒Echo30。