CN107058628A

CN107058628A - 一种用于检测手足口病相关病原体的lamp引物组合物及其相关应用

Info

Publication number: CN107058628A
Application number: CN201710305674.6A
Authority: CN
Inventors: 方雪恩; 李杨; 严俊; 闵建峰; 孔继烈
Original assignee: Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Current assignee: Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Priority date: 2017-05-03
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2037-05-03
Also published as: CN107058628B

Abstract

本发明提供了一种用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物及其相关应用，本发明提供的用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物灵敏度高、准确性好，同时本发明将基于LAMP法的微流控芯片技术应用于手足口病相关病原体的检测，利用微流控芯片高通量、快速、灵敏、特异性好的特点，提高手足口病相关病原体的检测速度、通量和灵敏度，大大降低成本，缩短检测时间。

Description

一种用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物及其相关应用

技术领域

本发明涉及传染性疾病诊断技术领域，尤其涉及一种用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物及其相关应用。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。

引起手足口病的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括柯萨奇病毒A组(CoxasckievirusA,CVA)的2、4、5、7、9、10、16型等，B组(Coxasckievirus B,CVB)的1、2、3、4、5型等；肠道病毒71型(Human Enterovirus 71,EV71)；埃可病毒(Echovirus,ECHO)等。柯萨奇病毒是从1948年Dolldorf和Sickles在美国纽约州Coxsackie镇，从临床诊断为脊髓灰质炎的患儿粪便中分离出来的一组病毒。该病毒的毒粒为二十面体，立体对称，呈球形状，裸露的核衣壳，直径约23-30nm，无包膜，无突起，病毒有核酸和蛋白质组成。人类手足口病中以EV71、CVA16、CA10以及CA6型较为常见。人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的，EV71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。近年来，国内陆续发现CA6以及CA10型逐渐流行，慢慢占据主要流行株。

人类是肠病毒唯一的传染来源，主要经由肠胃道(粪-口、水、食物污染)或呼吸道(飞沫、咳嗽或打喷嚏)传染，也可经由接触病人皮肤水泡的液体而受到感染。在发病前数天，喉咙部位与粪便就可发现病毒，此时即有传染力，通常以发病后一周内传染力最强；而患者可持续经由肠道释出病毒，时间长达8到12周之久。潜伏期为2到10天，平均约3到5天。肠病毒适合在湿、热的环境下生存与传播。截至2016年12月31日，全国已累计报告手足口病发病例数为2468174例，其中，死亡数为201例。全国的手足口病防控形势十分严峻。

目前手足口病肠道病毒核酸检测类的产品都是胶体金、酶联免疫以及荧光PCR产品。其中以荧光PCR法居多，但是该检测方法具有检测靶点少，灵敏度较低，操作繁琐，检测耗时，检测仪器费用昂贵等缺陷。因此，因此，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、容易普及、安全有效且适用于现场操作的快速检测方法。

环介导等温基因扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速、灵敏、特异性强等优点，可以用于病原体的核酸快速检测。微流控芯片作为一种新型核酸检测技术具有高通量、快速、准确、可靠等特点，能够实现对组群病原体样品进行多目标同时检测。如果将两者进行结合，则极大的提高病原体核酸检测的效率。因此，将LAMP等温扩增与微流控芯片相结合，尚属首次应用于手足口病相关病原体的检测与分型。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物及其相关应，本发明的具体技术方案包括：

首先，本发明的第一个方面提供了一种用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物，包括肠道病毒EV通用型引物组、肠道病毒EV71型引物组、肠道病毒CA16型引物组、肠道病毒CA10型引物组、肠道病毒CA6型引物组中的任意一组或几组；

其中：所述肠道病毒EV通用型引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.5所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.6所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.7所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.8所示；

所述肠道病毒EV71型引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.9所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.10所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.11所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.12所示；

所述肠道病毒CA16型引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.13所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.14所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.15所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.16所示；

所述肠道病毒CA10型引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.17所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.18所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.19所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.20所示；

所述肠道病毒CA6型引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.21所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.22所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.23所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.24所示。

进一步地，本发明的用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物，还包括内参血红蛋白HBB内参引物组，所述内参引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.1所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.2所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.3所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.4所示。

另一方面，本发明还提供上述的LAMP引物组合物在制备检测手足口病相关病原体的试剂或试剂盒的相关应用。

同时，本发明进一步提供了一种检测手足口病相关病原体的芯片，所述芯片固定有上述的LAMP引物组合物；优选地，所述芯片为恒温扩增微流控芯片。

本发明还提供了一种用于检测手足口病相关病原体的试剂盒，所述试剂盒包括上述的LAMP引物组合物；进一步地，试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、MgSO₄以及显色染料等；所述显色染料选自HNB、Calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝任意一种或几种。本发明的对肠道病毒EV、EV71型、CA16型、CA10型、CA6型病原体核酸的最低检测限均为10²TU/mL。

最后，本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的检测手足口病相关病原体的方法，其特征在于，包括步骤：

提取待测样本的核酸，用上述的LAMP引物组合物进行环介导等温扩增，检测扩增产物，确定待测样本是否含有相应引物组对应的手足口病相关病原体；

或

提取待测手足口病相关病原体的核酸，用上述的LAMP引物组合物进行环介导等温扩增，检测扩增产物，确定待测手足口病相关病原体是否为相应引物组对应的手足口病相关病原体。

上述方法适用于芯片检测方法，芯片中设置有阴性对照和内标对照(内标对照采用了人源性的HBB-LAMP引物)。这样有助于该微流控芯片的检测结果避免产生假阳性和假阴性结果。

本发明提供了高效的用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物，同时将基于LAMP法的微流控芯片技术应用于手足口病相关病原体的检测，利用微流控芯片高通量、快速、灵敏、特异性好的特点，提高手足口病相关病原体的检测速度、通量和灵敏度，大大降低成本，缩短检测时间；建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的肠道病毒EV、EV71型、CA16型、CA10型、CA6型病原体检测微流控芯片及其检测方法。本发明提供的5个引物组能特异性地检测上述病原体并且进行准确分型，而且与其他病原体无交叉反应，如甲型流感病毒、乙型流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。同时，本发明提供的5个引物组对肠道病毒EV、EV71型、CA16型、CA10型、CA6型病原体核酸的最低检测限均为10²TU/mL。本发明中所述待测样本具体可来自于疑似肠道病毒感染的儿童咽拭子样本以及粪便样本。本发明还可以肉眼可视化判定检测结果，摆脱昂贵的PCR检测仪器，使本发明在科学研究和生产实践中快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作。对于临床而言，能够在1h内获得对肠道病毒的定性检测，同时还能够对该病原体进行分型，检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的分型检测也可以用于流行病学调研和疫情监控，以研究手足口病优势流行株的进化。

附图说明

图1为实施例二中圆盘式微流控芯片及引物点样池示意图；其中，反应池1#，9#，17#，25#固定肠道病毒EV通用性环介导等温扩增引物；反应池2#，10#，18#，26#固定肠道病毒EV71型环介导等温扩增引物；反应池3#，11#，19#，27#固定肠道病毒CA16型环介导等温扩增引物；反应池5#，13#，21#，29#固定肠道病毒CA10型环介导等温扩增引物；反应池6#，14#，22#，30#固定肠道病毒CA6型环介导等温扩增引物；反应池7#，15#，23#，31#固定人内标基因环介导等温扩增引物；反应池4#，8#，12#，16#，20#，24#，28#，32#未固定任何环介导等温扩增引物的阴性对照。

图2为实施例二中手足口病相关病原体圆盘式微流控芯片检测结果图。将相应型别的肠道病毒咽拭子样本进行核酸提取后，作为模板，加入到芯片盘对应的孔进行等温扩增，结果如下：1-8为肠道病毒EV71型临床样本在1-8#反应池的肉眼可视化检测结果；9-16为肠道病毒CA16型临床样本在9-16#反应池的肉眼可视化检测结果；17-24为肠道病毒CA10型临床样本在17-24#反应池的肉眼可视化检测结果；25-32为肠道病毒CA6型临床样本在17-24#反应池的肉眼可视化检测结果。

图3为实施例二中手足口病相关病原体圆盘式微流控芯片检测结果图。将肠道病毒咽拭子样本以及干扰样本进行核酸提取后，作为模板，加入到芯片盘对应的孔进行等温扩增，结果如下：1-8为肠道病毒EV非EV71/CA16/CA10/CA6型临床样本在1-8#反应池的肉眼可视化检测结果；9-16为干扰样本甲型流感病毒临床样本在9-16#反应池的肉眼可视化检测结果；17-24为肠道病毒EV71/CA10/CA16/CA10/CA6型混合临床样本在17-24#反应池的肉眼可视化检测结果；25-32为干扰样本乙型肝炎病毒临床样本在25-32#反应池的肉眼可视化检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物的设计和制备

1.1序列获得：

(1)肠道病毒5’UTR区域序列的获得：从GeneBank公共数据库下载肠道病毒的5’UTR区域核酸序列(如SEQ ID NO.26所示)。

(2)VP1基因序列的获得：从GeneBank公共数据库分别下载肠道病毒EV71型基因序列(如SEQ ID NO.27所示)、CA16型基因序列(如SEQ ID NO.28所示)、CA10型基因序列(如SEQ ID NO.29所示)以及CA6型的VP1基因序列(如SEQ ID NO.30所示)。

(3)内参HBB基因序列的获得：从GeneBank公共数据库分别下载HBB基因核酸序列(如SEQ ID NO.25所示)。

1.2引物设计

(1)特异性基因引物：将上述从GeneBank公共数据库下载得到的特异基因序列用序列对比软件DNAMAN比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件中，选取F1c和B1c的Tm值相近、F3/B3/F2/B2的Tm值相近，且F1c和B1c的Tm值比F3/B3/F2/B2的Tm值大5℃，5’dG和3’dG的绝对值小于4的DNA序列作为候选引物。

(2)内参HBB引物：将上述从GeneBank公共数据库下载得到的特异基因序列用序列对比软件DNAMAN比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件中，选取F1c和B1c的Tm值相近、F3/B3/F2/B2的Tm值相近，且F1c和B1c的Tm值比F3/B3/F2/B2的Tm值大5℃，5’dG和3’dG的绝对值小于4的DNA序列作为候选引物。

(3)引物合成：将下表1中的引物序列委托英潍捷基公司合成，备用。

(4)引物筛选：将合成好的引物溶解并适量稀释后进行引物筛选，最终得到用于制备本发明微流控芯片所需要的特异、灵敏的引物，将筛选好的引物连同反应液一起冷冻干燥在微流控芯片的反应池中。

在本实施例中，筛选好的24条引物如表1所示。

其中，编号NO.1-4(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4)的引物序列选自HBB基因的核酸序列，作为内参用。

编号NO.5-8(SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:8)的引物选自肠道病毒EV通用型的5’UTR区域核酸序列；

编号NO.9-12(SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:12)的引物选自肠道病毒EV71型的VP1区域核酸序列；

编号NO.13-16(SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:16)的引物选自肠道病毒CA16型的VP1区域核酸序列；

编号NO.17-20(SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:20)的引物选自肠道病毒CA10型的VP1区域核酸序列；

编号NO.21-24(SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:24)的引物选自肠道病毒CA6型的VP1区域核酸序列；

编号37(SEQ ID NO:NA)的引物为阴性对照。

表1：引物组合物中的引物序列

实施例二用于检测肠道病毒相关病原体的试剂盒的制备及其使用

下列实施例中的肠道病毒EV，肠道病毒EV71型，肠道病毒CA16型，肠道病毒CA10型，肠道病毒CA6型，甲型流感病毒，乙型肝炎病毒等临床样本均来源于复旦大学附属儿科医院。

2.1用于检测肠道病毒相关病原体的试剂盒的制备

本发明所提供的用于检测肠道病毒相关病原体的试剂盒组成如下：

2.1.1恒温扩增缓冲液

恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：12mM dNTPs、10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液、150μM HNB。

2.1.2恒温扩增酶溶液

恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：Bst酶1U/μl。

2.1.3装载有引物对的32反应池圆盘式微流控芯片

所述32反应池圆盘式微流控芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其型号为4X8，示意图如图1所示。

所述4X8反应池圆盘式微流控芯片的1#至32#反应池分别存放上述实施例1的引物对。其中，所述引物对1用于扩增人基因组中管家基因HBB，由序列表中序列1-4所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池7、反应池15、反应池23以及反应池31；所述引物对2用于扩增肠道病毒EV通用型，由序列表中序列5-8所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池1、反应池9、反应池17以及反应池25；所述引物对3用于扩增肠道病毒EV71型，由序列表中序列9-12所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池2、反应池10、反应池18以及反应池26；所述引物对4用于扩增肠道病毒CA16型，由序列表中序列13-16所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池3、反应池11、反应池19以及反应池27；所述引物对5用于扩增肠道病毒CA10型，由序列表中序列17-20所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池5、反应池13、反应池21以及反应池29；所述引物对6用于扩增肠道病毒CA6型，由序列表中序列21-24所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池6、反应池14、反应池22以及反应池30；所述阴性对照的反应池4、反应池8、反应池12、反应池16、反应池20、反应池24、反应池28以及反应池32，不包埋任何引物。其中，将引物包埋入圆盘式微流控芯片的方法为：将引物与琼脂糖混合，配制成混合溶液，使所述引物和所述琼脂糖在所述混合液中的终浓度分别为0.2μM和0.1％(质量百分比)；取0.5μL所述混合液点入相应的圆盘式微流控芯片反应池，于洁净超净台内晾干后，冲压抽真空干燥2小时，备用。

2.2用于检测手足口病相关病原体的试剂盒的使用方法

2.2.1提取基因组

用磁珠法病毒核酸提取试剂盒提取肠道病毒、肠道病毒EV71型、CA16型、CA10型、CA6型、甲型流感病毒以及乙型肝炎病毒核酸，操作步骤如下：

核酸提取纯化准备

a.裂解液如有沉淀，请于56℃温浴至沉淀完全溶解后使用。

b.使用前，加24mL无水乙醇至洗液三中，混匀，并做好标记(确保瓶盖拧紧，防止乙醇挥发)。

c.将蛋白酶混合物充分混匀后，按照每管20μL分装至各离心管中。

d.按照每管分装10μL内标的量至各离心管中。

核酸提取纯化步骤

a.向上述已分好蛋白酶和内标的离心管中加入200μl临床样本和阴阳性对照，轻轻混匀；然后再加入400μl裂解液，漩涡振荡10s,56℃孵育10分钟。

b.然后加入300μl核酸共沉剂和2μl磁珠，上下颠倒离心管10次，使管内磁珠分布均匀。

c.静置离心管10分钟，期间每隔两分钟上下颠倒离心管5次，使管内磁珠分布均匀。

d.离心管置于离心机上，8000g离心1min,用移液器吸去管内液体。

e.加入500μl洗液一，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10s,直至其分布均匀。

f.将离心管置于离心机上，8000g离心1min,用移液器吸去管内液体。

g.加入500μl洗液二，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10s,直至其分布均匀。

h.将离心管置于离心机上，8000g离心1min,用移液器吸去管内液体。

i.加入500μl洗液三，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10s,直至其分布均匀。

j.将离心管置于离心机上，8000g离心1min,用移液器吸去管内液体。

k.将离心管置于离心机上，8000g离心30s,用移液器吸去管内残余液体。

l.打开管盖，室温干燥2分钟。

m.加入60μl洗脱液，用移液器枪头打散管壁磁珠，直至其分布均匀。56℃孵育3分钟。

n.将离心管置于离心机上，10000g离心1min.将收集到的60μl上清液吸取至一个无核酸酶干净的离心管中，即为纯化后的核酸溶液用于恒温荧光扩增。

2.2.2反应体系配制

分别取72μl恒温扩增缓冲液(见2.1.1)、4μl恒温扩增酶溶液(见2.1.2)、上述各个肠道病毒临床样本以及干扰临床样本提取的核酸24μl组成的100μl反应混合溶液，旋涡震荡均匀后取80μl反应溶液注入每个1X8加样孔中(2.1.3)，贴封口膜后迅速离心1200rpm/min 15s，3200rpm/min 30s。

2.2.3恒温扩增反应与检测

将圆盘式微流控芯片置于干燥箱中，设置37℃反应5min，61℃反应1h。

2.2.4结果判断

a.结果见图2：固定有肠道病毒EV通用型、肠道病毒EV71型以及内标引物的反应池1#，2#，7#所对应的颜色为天蓝色，固定有肠道病毒CA16型、CA10型、CA6型引物的反应池3#、5#、6#以及不固定引物的反应池4#、8#所对应的颜色为紫罗兰色，说明1号样本为肠道病毒EV71型阳性临床样本。固定有肠道病毒EV通用型、肠道病毒CA16型以及内标引物的反应池9#，11#，15#所对应的颜色为天蓝色，固定有肠道病毒EV71型、CA10型、CA6型引物的反应池10#、13#、14#以及不固定引物的反应池12#、16#所对应的颜色为紫罗兰色，说明2号样本为肠道病毒CA16型阳性临床样本。固定有肠道病毒EV通用型、肠道病毒CA10型以及内标引物的反应池17#，21#，23#所对应的颜色为天蓝色，固定有肠道病毒EV71型、CA16型、CA6型引物的反应池18#、19#、22#以及不固定引物的反应池20#、24#所对应的颜色为紫罗兰色，说明3号样本为肠道病毒CA10型阳性临床样本。固定有肠道病毒EV通用型、肠道病毒CA6型以及内标引物的反应池25#，30#，31#所对应的颜色为天蓝色，固定有肠道病毒EV71型、CA16型、CA10型引物的反应池26#、27#、29#以及不固定引物的反应池28#、32#所对应的颜色为紫罗兰色，说明4号样本为肠道病毒CA6型阳性临床样本。

b.结果见图3：固定有肠道病毒EV通用型以及内标引物的反应池1#，7#所对应的颜色为天蓝色，固定有肠道病毒EV71型、CA16型、CA10型、CA6型引物的反应池2#、3#、5#、6#以及不固定引物的反应池4#、8#所对应的颜色为紫罗兰色，说明1号样本为非EV71/CA16/CA10/CA6型肠道病毒阳性临床样本。固定有内标引物的反应池15#所对应的颜色为天蓝色，固定有肠道病毒EV通用型、EV71型、CA16型、CA10型、CA6型引物的反应池9#、10#、11#、13#、14#以及不固定引物的反应池12#、16#所对应的颜色为紫罗兰色，说明2号样本为肠道病毒阴性的临床干扰性样本甲型流感病毒临床样本。固定有肠道病毒EV通用型、肠道病毒EV71型、CA16型、CA10型、CA6型以及内标引物的反应池17#，18#，19#，21#，22#，23#所对应的颜色为天蓝色，不固定引物的反应池20#、24#所对应的颜色为紫罗兰色，说明3号样本为肠道病毒EV71/CA16/CA10/CA6型阳性混合临床样本。固定有内标引物的反应池31#所对应的颜色为天蓝色，固定有肠道病毒EV通用型、EV71型、CA16型、CA10型、CA6型引物的反应池25#、26#、27#、29#、30#以及不固定引物的反应池28#、32#所对应的颜色为紫罗兰色，说明4号样本为肠道病毒阴性的临床干扰性样本乙型肝炎病毒临床样本。

结果表明，本发明的检测手足口病相关病原体的环介导等温扩增的成套引物和试剂可准确的检测肠道病毒通用型，肠道病毒EV71型，肠道病毒CA16型，肠道病毒CA10型，肠道病毒CA6型病原体。

反应池中所对应的颜色为天蓝色，即为阳性；反应池中所对应的颜色问紫罗兰色，即为阴性。

检测结果见表2。

结果表明本发明能特异性地检测肠道病毒通用型，肠道病毒EV71型，肠道病毒CA16型，肠道病毒CA10型，肠道病毒CA6型而与其他病原体无交叉反应，如甲型流感病毒，乙型流感病毒，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。

表2.LAMP特异性检测结果

实施例三：检测恒温扩增微流控芯片的灵敏度

利用实施例二中2.1制备的恒温扩增微流控芯片进行灵敏度实验

将实施例二中2.2.2制备的肠道病毒通用型，肠道病毒EV71型，肠道病毒CA16型，肠道病毒CA10型，肠道病毒CA6型核酸分别稀释后混合得到新的混合体系。新的混合体系中肠道病毒通用型，肠道病毒EV71型，肠道病毒CA16型，肠道病毒CA10型，肠道病毒CA6型的核酸浓度均为102TU/μl，将得到的该混合体系命名为混合核酸LP。

将混合核酸LP与恒温扩增体系混匀，然后进样至恒温扩增微流控芯片中，按照37℃5min，61℃1h进行恒温扩增反应。

检测结果显示，固定有检测肠道病毒通用型，肠道病毒EV71型，肠道病毒CA16型，肠道病毒CA10型，肠道病毒CA6型以及检测内参的引物组对应的反应池的颜色为天蓝色，不固定引物的反应池所对应的颜色为紫罗兰色。可见，本发明对肠道病毒通用型，肠道病毒EV71型，肠道病毒CA16型，肠道病毒CA10型，肠道病毒CA6型核酸的最低检测限均为10²TU/μl。

通过上述实施例能够知道，

本发明提供的5个引物组能特异性地检测上述病原体并且进行准确分型，而且与其他病原体无交叉反应，如甲型流感病毒、乙型流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。同时，本发明提供的5个引物组对肠道病毒EV、EV71型、CA16型、CA10型、CA6型病原体核酸的最低检测限均为10²TU/mL。

同时本发明提供的检测手足口病相关病原体的试剂盒，可快速、准确地检测肠道病毒EV、EV71型、CA16型、CA10型、CA6型病原体，以弥补针对上述病原体检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原体检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。本发明还可以肉眼可视化判定检测结果，摆脱昂贵的PCR检测仪器，使本发明在科学研究和生产实践中快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作。对于临床而言，能够在1h内获得对肠道病毒的定性检测，同时还能够对该病原体进行分型，检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的分型检测也可以用于流行病学调研和疫情监控，以研究手足口病优势流行株的进化。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海速创诊断产品有限公司

<120> 一种用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物及其相关应用

<130> IPI171086

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 1

ccttggaccc agaggttctt 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 2

acgtgcagct tgtcacag 18

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 3

agccttcacc ttagggttgc ctgagtcctt tggggatctg t 41

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 4

aagtgctcgg tgcctttagt gacagctcac tcagtgtggc 40

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 5

tcatgaagac tgcaaagcgt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 6

ccggaggact actacctagc 20

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 7

acagtcgcct gtgaggaatg cctcagcaca accccagtg 39

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 8

cggcctgcct atggggaaac tcagtagact cttcgcacca 40

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 9

aacatgatgg gcacgttct 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 10

ccaagagtag tgatcgccg 19

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 11

acgctctgac gtgcttcatt ctcagtgcgg actgtaggaa c 41

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 12

gccgatgcgc aaccaaaact gcaccagttg gcttaatgga 40

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 13

gggcatcgtc aaatgctaga 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 14

acaactcgca tttccgcc 18

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 15

accaaaccgg cacggctaaa gaccagatgt gtgttgaacc a 41

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 16

attacaatgc ccaccacggg tagcagttga gcatacccca t 41

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 17

gccacttcta atgccacaga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 18

ttctgcgttg aacctcatgt 20

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 19

gagcgggaga agaagtggtt gacccgttgt gtggttaaca ga 42

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 20

taacctcaca gatgggggga cgctgcggag ttggacaaag c 41

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向外引物F3

<400> 21

taagtgcgct cgctgaca 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向外引物B3

<400> 22

tgttccacac tcgcctcat 19

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向内引物FIP

<400> 23

cctgtaccca gggagtgggt ccacaatatc ccgggtaacc 40

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向内引物BIP

<400> 24

tgcagaaacg ggagcaagtt ctgaccccgt ttcgattcat ca 42

<210> 25

<211> 701

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 内参HBB基因核酸序列

<400> 25

accctagggt tggccaatct actcccagga gcagggaggg caggagccag ggctgggcat 60

aaaagtcagg gcagagccat ctattgctta catttgcttc tgacacaact gtgttcacta 120

gcaacctcaa acagacacca tggtgcatct gactcctgag gagaagtctg ccgttactgc 180

cctgtggggc aaggtgaacg tggatgaagt tggtggtgag gccctgggca ggttgctatc 240

aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcatgtggag acagagaaga 300

ctcttgggtt tctgataggc actgactctc tctgcctatt ggtctatttt cccaccctta 360

ggctgctggt ggtctaccct tggacccaga ggttctttga gtcctttggg gatctgtcca 420

ctcctgatgc tgttatgggc aaccctaagg tgaaggctca tggcaagaaa gtgctcggtg 480

cctttagtga tggcctggct cacctggaca acctcaaggg cacctttgcc acactgagtg 540

agctgcactg tgacaagctg cacgtggatc ctgagaactt cagggtgagt ctatgggacg 600

cttgatgttt tctttcccct tcttttctat ggttaagttc atgtcatagg aaggggataa 660

gtaacagggt acagtttaga atgggaaaca gacgaatgat t 701

<210> 26

<211> 328

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 肠道病毒的5’UTR区域核酸序列

<400> 26

tcaaaccagc gtctggtagg ccgtaacgcg caagtcggtg gcggaaccaa ctactttggg 60

tgtccgtgtt tccttttatc tttttgaatg tttatggtga caattgttgt gtacagttgt 120

taccatagtt tgcattcaga aataaaccta acactttcca attatttgtt acaatgggtg 180

ctcaagtttc cgcgcagaat aacggtactc atgaaaattc caatagtgcg agtggtggat 240

caactatcaa ttacaccaca ataaactatt ataaagacag cgccagtaac gcggcgtcca 300

agttagattt ctctcaggac ccttccaa 328

<210> 27

<211> 450

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 肠道病毒EV71型的VP1区域核酸序列

<400> 27

atgtttgttc cacccggggc ccccaagcca gattccaggg aatccctcgc atggcaaact 60

gccaccaacc cctcagtttt tgttaagctg tcagaccctc cagcacaggt ttcagtacca 120

ttcatgtcac ctgcaagtgc ttatcaatgg ttttatgacg gatatcccac attcggagaa 180

cacaaacagg agaaagatct tgaatatggg gcatgtccta acaacatgat gggcacgttc 240

tcagtgcgga ctgtaggaac ctcaaagtcc aagtaccctt tagtggttag gatttacatg 300

agaatgaagc acgtcagagc gtggatacct cggccgatgc gcaaccaaaa ctacctgttc 360

aaagccaacc caaattatgc tggcaactcc attaagccaa ctggtgccag tcgcacggcg 420

atcactactc ttgggccacc aatccggcgc 450

<210> 28

<211> 557

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 肠道病毒CA16型的VP1区域核酸序列

<400> 28

gcagaacagc taatatacaa ggggtatcct attgcagaca tgattgatca ggctgtgaat 60

aatcaagtga accgctcctt aactgcattg caagtactac ctacagctgc caatactgaa 120

gcaagtactc acagattaag cactggtgtt gtaccatcac tacaagccga ggatacaagg 180

gcatcgtcaa atgctagaga caagaatctc attgagacca gatgtgtgtt gaaccatcat 240

tccacacagg agacagccat tgggaatttc tttagccgtg ccggtttggt cagcattatt 300

acaatgccca ccacgggtac tcagaacaca gatggttacg taaattggga cattgatttg 360

atggggtatg ctcaactgcg gcggaaatgc gagttgttca cctacatgcg ctttgatgct 420

gaatttacat ttgtcgtagc caaacccaat ggtgagctag tcccccaatt actgcagtac 480

atgtacgtcc cgccaggggc tccgaaaccc acttccagag attcattcgc atggcaaact 540

gccaccaacc catctgt 557

<210> 29

<211> 894

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 肠道病毒CA10型的VP1区域核酸序列

<400> 29

ggtgaccctg tggaggatat aatccatgac gctctgggaa acacagcgcg cagagctatt 60

agcagtgcta caaatgttga atccgcagcc aacaccactc ccagttcaca ccgattagag 120

actggacgcg tgccagcgct acaagccgca gagacgggtg ccacttctaa tgccacagat 180

gagaacatga ttgaaacccg ttgtgtggtt aacagaaatg gggtgttgga aaccactatc 240

aaccacttct tctcccgctc tggattagtg ggagtagtta acctcacaga tggggggacg 300

gacactactg ggtatgctac atgggacata gatattatgg gctttgtcca actccgcaga 360

aaatgcgaga tgttcacata catgaggttc aacgcagaat tcacatttgt cacaacgact 420

gagaatggag aggctcgtcc gtacatgctg caatatatgt atgtgccccc tggcgccccc 480

aaaccgacag gaagggatgc ctttcaatgg caaacagcaa ctaacccatc agtcttcgtc 540

aaactcactg accctcctgc acaagtctca gttcctttca tgtcaccagc tagtgcatat 600

cagtggtttt atgatggtta ccccactttc ggccagcacc cggagacctc aaacacaaca 660

tacggattgt gcccaaacaa tatgatgggc acctttgcgg tgagagttgt tagtagggag 720

gcaagccaac tgaaactaca gactagagtg tacatgaaac ttaagcatgt gagggcctgg 780

gtcccaagac cgatcaggtc tcagccatac ttgctcaaaa acttccccaa ttacgacagt 840

ggcaagattg ccaacagtgc acgggaccga tccagtatca agcaagctaa tatg 894

<210> 30

<211> 915

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 肠道病毒CA6型的VP1区域核酸序列

<400> 30

aatgatccta tcacaaatgc agtggaaagt gctgtaagtg cgctcgctga caccacaata 60

tcccgggtaa ccgcagctaa cactgcagcc agcacccact ccctgggtac aggacgtgta 120

cctgcactgc aagctgcaga aacgggagca agttctaatt ctagtgacga gaatctcatt 180

gaaactcgct gtgtgatgaa tcgaaacggg gtcaatgagg cgagtgtgga acacttttac 240

tctcgtgcgg ggctggtagg agttgtggag gtgaaggact cgggcactag cctagatggg 300

tatacagtgt ggcctataga cgtgatggga tttgtgcaac agcggcgcaa actagagcta 360

tcaacatata tgcgctttga tgctgagttc acttttgtgt ccaacctcaa tgatagtaca 420

acccctggaa tgctattgca gtacatgtat gtaccaccag gagcccctaa accggatagt 480

agaaaatcat accagtggca gactgctacc aacccgtcag tatttgcaaa attgagtgat 540

ccaccccccc aagtgtcagt cccgttcatg tctccagcaa cagcttatca gtggttttat 600

gatggttatc ctacatttgg tgagcacaag caagccacta atttgcagta tgggcagtgt 660

cctaacaaca tgatgggaca ttttgccatc cgaacagtca gcgagtccac taccgggaaa 720

aacatccacg ttcgggtgta catgagaatc aaacacgtga gagcttgggt gcctaggccc 780

ctccgatccc aagcttacat ggttaagaat tatccaacat atagccagac aataactaac 840

actgcaaccg accgtgcaag cataaccacc acggattatg aaggcggggt acctgcaaat 900

ccgcaaagaa catct 915

Claims

1.一种用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物，其特征在于，包括肠道病毒EV通用型引物组、肠道病毒EV71型引物组、肠道病毒CA16型引物组、肠道病毒CA10型引物组、肠道病毒CA6型引物组中的任意一组或几组，以及任何手足口病肠道病毒亚型引物组合，

2.根据权利要求1所述的一种用于检测手足口病相关病原体的LAMP引物组合物，其特征在于，还包括内参引物组，所述内参引物组正向外引物F3序列如SEQ ID NO.1所示，反向外引物B3序列如SEQ ID NO.2所示，正向内引物FIP序列如SEQ ID NO.3所示，反向内引物BIP序列如SEQ ID NO.4所示。

3.如权利要求1或2所述的LAMP引物组合物在制备检测手足口病相关病原体的试剂或试剂盒的相关应用。

4.一种检测手足口病相关病原体的芯片，其特征在于，所述芯片固定有如权利要求1或2所述的LAMP引物组合物。

5.根据权利要求4所述的一种检测手足口病相关病原体的芯片，其特征在于，所述芯片为恒温扩增微流控芯片。

6.一种用于检测手足口病相关病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的LAMP引物组合物。

7.根据权利要求6所述的一种用于检测手足口病相关病原体的试剂盒，其特征在于，还包括Bst DNA聚合酶、显色染料。

8.根据权利要求7所述的一种用于检测手足口病相关病原体的试剂盒，其特征在于，所述显色染料选自HNB、Calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝任意一种或几种。

9.根据权利要求6所述的一种用于检测手足口病相关病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒对病原体核酸的最低检测限均为10²TU/mL。

10.一种非诊断和治疗目的的检测手足口病相关病原体的方法，其特征在于，包括步骤：

提取待测样本的核酸，用如权利要求1或2所述的LAMP引物组合物进行环介导等温扩增，检测扩增产物，确定待测样本是否含有相应引物组对应的手足口病相关病原体；

或

提取待测手足口病相关病原体的核酸，用如权利要求1或2所述的LAMP引物组合物进行环介导等温扩增，检测扩增产物，确定待测手足口病相关病原体是否为相应引物组对应的手足口病相关病原体。