CN108486262A - 一种检测肺炎支原体的lamp引物组合物、试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测肺炎支原体的LAMP引物组合物，包括肺炎支原体引物组和内标引物组；还涉及一种包含该引物组合物的试剂盒，包括真空干燥预混液、核酸提取试剂和微流控芯片；还涉及一种采用上述试剂盒的检测方法，包括制备混合液、引物组合物的包埋、待测样本核酸提取、LAMP反应和结果判读。其优点在于，将肺炎支原体的特异核酸序列与微流控芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的肺炎支原体核酸提取以及检测的微流控芯片及其检测方法；与其他病原微生物无交叉反应，且该引物组的最低检测限为10拷贝/μl；可快速、准确地检测肺炎支原体，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期；有效的防止扩增产物的污染。

Description

一种检测肺炎支原体的LAMP引物组合物、试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及核酸扩增技术领域，尤其涉及一种检测肺炎支原体的LAMP引物组合物，以及基于微流控芯片的检测肺炎支原体的试剂盒及其方法。
背景技术
肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，MP)是一类介于细菌与病毒之间的病原体微生物，可引起原发性非典型肺炎及其他呼吸道感染性疾病，由口、鼻分泌物经空气传播，主要见于儿童和青少年。由于MP感染临床表现无特异性，常易漏诊，因此，快速、灵敏、特异的诊断方法是预防MP感染的关键。
长期以来，MP感染的常规检测方法是培养法，一直被视为确诊MP感染的金标准，但存在对样本采集和培养条件要求高、耗时、易污染、灵敏度低等不足之处；血清抗原/抗体检测，虽简便、快速，但无法提供现症感染资料，且特异性和灵敏度不够。实时荧光定量PCR是近几年兴起来的一种融会了PCR高敏感性、探针杂交高特异性和光谱检测高精确性等技术优点的检测技术，具有快速、高特异、高敏感、可定量等优点，可作为临床检测实用方法，尤其实用于MP感染的早期诊断和无症状携带者的检测。但目前国内此类试剂提取核酸费时、费力，在操作过程中容易导致污染，而且大部分试剂没有预防假阴性的内标控制和防污染体系，影响检测结果的重复性和稳定性。
Bst酶介导的等温扩增具有快速、灵敏、特异性强等优点。另外，微流控芯片作为一种病原体分子检测技术具有高通量、快速、准确、可靠的特点，能够实现对组群样品、多目标同时检测，极大的提高了检测效率。本试剂盒使用的核酸提取试剂是一种化学整合树脂，可以整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力，能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质，提取过程在微流控芯片中5min即可完成，进而通过Bst酶介导的等温基因扩增技术在微流控芯片中实现肺炎支原体的核酸扩增。
目前许多研究将环介导恒温扩增与微流控芯片结合，对病原体核酸、肿瘤标记基因、耐药位点等进行快速检测，但是以上研究需要借助其他仪器对结果进行判定。
因此，目前面临的技术性难点在于研发一款快速检测肺炎支原体，并且便于判定结果的系统。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测肺炎支原体的LAMP引物组合物、试剂盒及其方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一方面，本发明提供一种用于检测肺炎支原体的LAMP引物组合物，包括肺炎支原体引物组和内标引物组；
所述肺炎支原体引物组包括SEQ ID NO：1的外引物F3、SEQ ID NO：2的外引物B3、SEQ ID NO：3的内引物FIP和SEQ ID NO：4的内引物BIP；
所述内标引物组包括SEQ ID NO：5的外引物F3、SEQ ID NO：6的外引物B3、SEQ IDNO：7的内引物FIP和SEQ ID NO：8的内引物BIP。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，所述肺炎支原体引物组和所述内标引物组中，每个引物组中的各引物的摩尔比为：
外引物F3：6～8μM；
外引物B3：6～8μM；
内引物FIP：55～57μM；
内引物BIP：55～57μM。
优选地，所述肺炎支原体引物组和所述内标引物组中，每个引物组中的各引物的摩尔比为：
外引物F3：7μM；
外引物B3：7μM；
内引物FIP：56μM；
内引物BIP：56μM。
上述肺炎支原体引物组及内标引物组的序列如下所示：
表1扩增引物序列表
另一方面，本发明提供一种含有上述LAMP引物组的试剂盒，其还包括真空干燥预混液、核酸提取试剂和微流控芯片。
优选地，所述真空干燥预混液包括Bst酶、dNTPs、荧光染料和MgSO4。
优选地，所述Bst酶的浓度为1U/μl、所述dNTPs的浓度为12mM，以及所述荧光染料的浓度为0.5μM。
优选地，所述Bst酶为Bst DNA酶。
优选地，所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
优选地，所述真空干燥预混液还包括防污染体系，所述防污染体系包括UDG酶和dUTP。
优选地，所述UDG酶的浓度为0.2U/μl。
优选地，所述核酸提取试剂包括树脂材料、10×IsothermalAmplification反应缓冲液和Mg2+水溶液。
优选的，所述树脂材料的用量为5％，所述Mg2+水溶液的浓度为120mM。
优选地，所述微流控芯片设有4个互不连通的反应检测部分，每一反应检测部分具有2个加样孔和2组反应池，每一反应检测部分的1个加样孔对应1组反应池，每一反应检测部分的1组反应池包括1个阳性对照反应池、2个阴性对照反应池和1个临床样本扩增反应池。
优选地，所述微流控芯片为圆盘形微流控芯片。
最后，本发明还提供一种采用上述试剂盒来检测肺炎支原体的用于非诊断目的的方法，包括以下步骤：
步骤1、制备混合溶液
分别制备阳性对照混合溶液、阴性对照混合溶液和临床样本扩增混合溶液；
步骤2、引物组合物的包埋
将步骤1制备的所述阳性对照混合溶液、阴性对照混合溶液和所述临床样本扩增混合溶液分别包埋在所述微流控芯片的相应反应池内，经过真空干燥固定在反应池中；
步骤3、待测样本核酸提取
将待测样本与所述核酸提取试剂混合后加入经步骤2处理后的所述微流控芯片的相应加样孔内，并用膜封住所述加样孔；
步骤4、LAMP反应
将经步骤3处理后的所述微流控芯片放置到一核酸恒温分析装置内进行LAMP反应；
步骤5、结果判读
根据扩增结束后各反应池的扩增曲线进行判读。
优选地，在步骤1中，所述阳性对照混合溶液包括内标引物组和真空干燥预混液，所述阴性对照混合溶液为真空干燥预混液，所述临床样本扩增混合溶液包括肺炎支原体引物组和真空干燥预混液。
优选地，在步骤2中，从三组混合溶液中各取一定量加入相应的反应池中，抽真空干燥一定时间后，将微流控芯片的背面封膜备用。
优选地，取2μl的混合液加入相应的反应池中，并抽真空干燥2h。
优选地，在步骤3中，将50μl所述待测样本与50μl所述核酸提取试剂进行混合。
优选地，在步骤4中，将微流控芯片放入全自动核酸分析仪中95℃加热5，min后，进行离心扩增程序，50℃5min，64℃扩增60min。
优选地，在步骤1)之前，还包括微流控芯片的清洗步骤，具体如下：微流控芯片采用等离子清洗，用等离子清洗机冲洗微流控芯片表面，用惰性气体风干。
优选地，在步骤1)包被引物组合物的微流控芯片采用压敏键合膜进行封装。该压敏键合膜粘性强度、能够耐受常规加热温度、对所进行的反应没有显著不良影响。
所述制备下述任一产品的方法也属于本发明的保护范围：
a.所述检测肺炎支原体的环介导等温扩增的引物组合物；
b.所述检测肺炎支原体的微流控芯片；
所述的检测肺炎支原体的等温扩增成套引物组合物的下述任一种用于非诊断目的的应用也属于本发明的保护范围：
a.所述检测肺炎支原体的等温扩增的成套引物组合物在制备所述检测肺炎支原体的微流控芯片中的应用；
b.所述检测肺炎支原体的等温扩增的成套引物组合物在制备所述检测肺炎支原体的试剂或试剂盒的应用；
c.所述检测肺炎支原体的等温扩增的成套引物组合物在制备所述检测肺炎支原体的系统中的应用。
本发明还保护一种用于非诊断目的的检测肺炎支原体的方法，包括a或b：
a.提取待测样本的核酸，用所述检测肺炎支原体的等温扩增的成套引物组合物进行等温扩增，检测扩增产物，确定待测样本是否含有所述成套引物组合物中对应的肺炎支原体；
b.提取待测肺炎支原体的核酸，用所述检测肺炎支原体的等温扩增成套引物进行等温扩增，检测扩增产物，确定待测肺炎支原体是为所述成套引物组合物中对应的肺炎支原体。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的一种用于检测肺炎支原体的引物组合物、试剂盒及其方法，将肺炎支原体的特异核酸序列与微流控芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的肺炎支原体核酸提取以及检测的微流控芯片及其检测方法；本发明提供的肺炎支原体引物组与其他病原微生物无交叉反应，如解脲脲原体、肺炎衣原体、结核分支杆菌、EB病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒，且该引物组的最低检测限为10拷贝/μl；本发明提供的检测肺炎支原体的试剂盒，可快速、准确地检测肺炎支原体，以弥补针对肺炎支原体检测技术存在的费时耗力的缺陷，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期；检测试剂盒还加入了防污染体系，能有效的防止扩增产物的污染；对于临床而言，能够在1h内获得检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。
附图说明
图1是本发明使用的微流控芯片的结构示意图。
图2是本发明使用的微流控芯片的包埋示意图。
其中的附图标记为：底片1；反应检测部分2；加样孔3；反应池4。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1
本实施例为本发明所采用的用于检测肺炎支原体的LAMP引物组合物。
用于检测肺炎支原体的LAMP引物组合物包括肺炎支原体引物组合物和内标引物组合物。
其设计和合成的步骤如下：
首先是进行序列获得：通过对GeneBank中肺炎支原体16s rRNA基因序列查询，用VectorNTI软件对各种来源的基因序列进行比对后发现，其序列高度保守并具有很好的同源性。
其次是进行引物设计：将肺炎支原体和内标HBB基因的保守区段导入软件中，选取F1c和B1c的Tm值相近、F3/B3/F2/B2的Tm值相近，且F1c和B1c的Tm值比F3/B3/F2/B2的Tm值大5℃，5’dG和3’dG的绝对值小于4的DNA序列作为候选引物；将引物序列进行合成；
再次是进行引物筛选：将合成好的引物溶解后进行引物筛选，最终得到用于制备本发明微流控芯片所需要的特异、灵敏的引物，将筛选好的引物连同反应液一起冷冻干燥在微流控芯片的反应池中。
肺炎支原体引物组和内标引物组的各引物序列详见表1。
其中，SEQ ID NO：1～4的引物序列选自肺炎支原体16s rRNA基因，SEQ ID NO：5～8的引物序列选自HBB基因的mRNA序列。
其中，肺炎支原体和内标的引物序列见下表。
表2
实施例2
本实施例描述了本发明所采用的微流控芯片。
如图1所示，本发明采用的微流控芯片为圆盘形微流控芯片，包括底片1，底片1包括4个反应检测部分2，每一反应检测部分2包括加样孔3和反应池4。每一反应检测部分2包括2个加样孔3和2组反应池4，每1个加样孔3对应1组反应池4，每1组反应池4包括4个反应池4，分别为1个阳性对照反应池、2个阴性对照反应池和1个临床样本扩增反应池。
如图2所示，反应池A1、A5、B1、B5、C1、C5、D1、D5为阳性对照反应池，反应池A2、A3、A6、A7、B2、B3、B6、B7、C2、C3、C6、C7、D2、D3、D6、D7为阴性对照反应池，反应池A4、A8、B4、B8、C4、C8、D4、D8为临床样本扩增反应池。
本发明的采用的微流控芯片进行肺炎支原体的检测。其中，肺炎支原体引物组用于扩增肺炎支原体，包埋于反应池A4、A8、B4、B8、C4、C8、D4、D8；内标引物组用于扩增人基因组中管家基因HBB mRNA，包埋于反应池A1、A5、B1、B5、C1、C5、D1、D5；用于阴性对照的反应池A2、A3、A6、A7、B2、B3、B6、B7、C2、C3、C6、C7、D2、D3、D6、D7不包埋任何引物。
实施例3
本实施例为本发明所采用的用于检测肺炎支原体的试剂盒。
本发明所涉及的试剂盒，包括实施例1所述肺炎支原体引物组、内标引物组，实施例2所述的微流控芯片，还包括真空干燥预混液、核酸提取试剂。
对于肺炎支原体引物组和内标引物组，每一引物组中的4种引物的的摩尔比为：
外引物F3：6～8μM；
外引物B3：6～8μM；
内引物FIP：55～57μM；
内引物BIP：55～57μM。
其中，各引物优选的摩尔比为：外引物F3：7μM；外引物B3：6～8μM；内引物FIP：55～57μM；内引物BIP：55～57μM。
其中，外引物F3为名称带有“F3-Z”的引物，外引物B3为名称带有“B3-Z”的引物，内引物FIP为名称带有“FIP-Z”的引物，内引物BIP为名称带有“BIP-Z”的引物。
对于真空干燥预混液，真空干燥预混液包括Bst酶、dNTPs、荧光染料和MgSO4。
其中，Bst酶的浓度为1U/μl、dNTPs的浓度为12mM，荧光染料的浓度为0.5μM。
进一步地，Bst酶为Bst DNA酶。
进一步地，dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
为了进一步提高真空干燥预混液的性能，真空干燥预混液还包括防污染体系，防污染体系包括UDG酶和dUTP。
其中，UDG酶的浓度为0.2U/μl。
对于核酸提取试剂，核酸提取试剂包括树脂材料、10×IsothermalAmplification反应缓冲液和Mg2+水溶液。
其中，树脂材料的用量为5％，Mg2+水溶液的浓度为120mM。
实施例4
本实施例为采用实施例3所述的试剂盒进行检测肺炎支原体的非诊断目的的方法。
步骤1、制备混合溶液
分别制备阳性对照混合溶液、阴性对照混合溶液和临床样本扩增混合溶液。
将肺炎支原体引物组、内标引物组分别与真空干燥预混液进行混合，得到临床样本扩增混合溶液、阳性对照混合溶液，阴性对照混合液为不添加任何引物的真空干燥预混液。
步骤2、引物组合物的包埋
将步骤1制备的阳性对照混合溶液、阴性对照混合溶液和临床样本扩增混合溶液分别包埋在微流控芯片的相应反应池内，经过真空干燥固定在反应池中。
分别从三种混合溶液中各自量取2μl混合溶液并添加到相对应的反应池中，即取2μl阳性对照混合溶液添加到阳性对照反应池中，取2μl临床样本扩增混合溶液添加到临床样本扩增反应池中，取2μl阴性对照混合液添加到阴性对照反应池中。
添加完成后，抽真空干燥2h，然后将微流控芯片的背面封膜备用。
步骤3、待测样本核酸提取
将待测样本与核酸提取试剂混合后加入经步骤2处理后的微流控芯片的相应加样孔内，并用膜封住加样孔。
具体的，将50μl待测样本与50μl核酸提取试剂进行混合后得到核酸提取混合液，然后将核酸提取混合液加入到加样孔中。
步骤4、LAMP反应
将经步骤3处理后的微流控芯片放置到一核酸恒温分析装置内进行LAMP反应。
具体的，将微流控芯片放入全自动核酸分析仪中95℃加热5，min后，进行离心扩增程序，50℃5min，64℃扩增60min。
步骤5、结果判读
根据扩增结束后各反应池的扩增曲线进行判读。
一般的，若扩增正常，阳性对照反应池呈现“S”型扩增曲线，阴性对照反应池呈现直线扩增曲线。对于临床样本反应池，如呈现直线扩增曲线，则表明待测样本不含有肺炎支原体；如呈现“S”型扩增曲线，则表明待测样本含有肺炎支原体。
通过上述检测步骤，可以在短时间内，即1h左右，完成肺炎支原体的检测，检测通过扩增曲线即可快速判断待测样本是否含有肺炎支原体，大幅度减少了检测时间，判断效率提升，判断准确率高。
为了提高检测方法的准确性，在进行步骤1之前，还可以对微流控芯片进行清洗，具体的清洗方法为：采用等离子清洗，用等离子清洗机冲洗微流控芯片表面，用惰性气体风干。
实施例5
本实施例用于对微流控芯片进行特异性实验。
本实施例的实验步骤同实施例4，待测样本包括肺炎支原体、解脲脲原体、肺炎衣原体、结核分支杆菌、EB病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒。
步骤1、制备混合溶液
将肺炎支原体引物组、内标引物组分别与真空干燥预混液进行混合，得到临床样本扩增混合溶液、阳性对照混合溶液，阴性对照混合液为不添加任何引物的真空干燥预混液。
步骤2、引物组合物的包埋
取2μl阳性对照混合溶液添加到阳性对照反应池A1、A5、B1、B5、C1、C5、D1、D5中，取2μl临床样本扩增混合溶液添加到临床样本扩增反应池A4、A8、B4、B8、C4、C8、D4、D8中，取2μl阴性对照混合液添加到阴性对照反应池A2、A3、A6、A7、B2、B3、B6、B7、C2、C3、C6、C7、D2、D3、D6、D7中。
添加完成后，抽真空干燥2h，然后将微流控芯片的背面封膜备用。
步骤3、待测样本核酸提取
将50μl解脲脲原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔1；
将50μl肺炎衣原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔2；
将50μl结核分支杆菌样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔3；
将50μl EB病毒样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔4；
将50μl甲型流感病毒2型样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔5；
将50μl乙型流感病毒样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔6；
将50μl腺病毒样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔7；
将50μl肺炎支原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔8；
用膜封住8个加样孔。
步骤4、LAMP反应
将微流控芯片放入全自动核酸分析仪中95℃加热5，min后，进行离心扩增程序，50℃5min，64℃扩增60min。
步骤5、结果判读
反应结束后，阳性对照反应池A1、A5、B1、B5、C1、C5、D1、D5均呈现“S”型扩增曲线，说明阳性对照扩增正常；阴性对照反应池A2、A3、A6、A7、B2、B3、B6、B7、C2、C3、C6、C7、D2、D3、D6、D7均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；临床样本扩增反应池A4、A8、B4、B8、C4、C8、D4呈现直线扩增曲线，说明肺炎支原体引物组对解脲脲原体、肺炎衣原体、结核分支杆菌、EB病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒样本无交叉反应；临床样本扩增反应池D8呈现“S”型扩增曲线，表明肺炎支原体引物组可以扩增肺炎支原体样本。
实施例6
本实施例用于对微流控芯片进行灵敏度实验。
本实施例的实验步骤同实施例4。
步骤1、制备混合溶液
将肺炎支原体引物组与真空干燥预混液进行混合，得到临床样本扩增混合溶液。
步骤2、引物组合物的包埋
取2μl阳性对照混合溶液添加到阳性对照反应池A1-A9、B1-B8、C1-C8、D1-D8。
添加完成后，抽真空干燥2h，然后将微流控芯片的背面封膜备用。
步骤3、待测样本核酸提取
将10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mM Mg2+水溶液、ddH2O配制的混合液加入微流控芯片的加样孔1和加样孔2；
将10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mM Mg2+水溶液、101copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔3；
将10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mM Mg2+水溶液、102copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔4；
将10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mM Mg2+水溶液、103copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔5；
将10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mM Mg2+水溶液、104copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔6；
将10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mM Mg2+水溶液、105copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔7；
将10×IsothermalAmplification反应缓冲液、150mM Mg2+水溶液、106copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔8；
用膜封住8个加样孔。
步骤4、LAMP反应
将微流控芯片放入全自动核酸分析仪中95℃加热5，min后，进行离心扩增程序，50℃5min，64℃扩增60min。
步骤5、结果判读
反应结束后，加样孔1和2对应的反应池A1-A8均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；加样孔3对应的反应池B1-B4、加样孔4对应的反应池B5-B8、加样孔5对应的反应池C1-C4、加样孔6对应的反应池C5-C8、加样孔7对应的反应池D1-D4、加样孔8对应的反应池D5-D8均呈现“S”型扩增曲线，说明肺炎支原体引物组的最低检测限为101copies/μl。
上述结果表明，本发明所述的检测肺炎支原体的试剂盒及其方法通过运用在微流控芯片上进行可视化判定的方法，可实现肺炎支原体的即时检测，不仅实现向各小体积加样孔配液，避免操作人员不易辨认是否加样成功的问题，同时通过扩增曲线判定结果从而达到可视化的要求，这使本发明在实际应用中更加简便、快捷、并且容易操作、适用于现场操作。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海速创诊断产品有限公司
上海速芯生物科技有限公司
<120> 一种检测肺炎支原体的LAMP引物组合物、试剂盒及其方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>

Claims (10)

1.一种用于检测肺炎支原体的LAMP引物组合物，其特征在于，包括肺炎支原体引物组和内标引物组；
所述肺炎支原体引物组包括SEQ ID NO：1的外引物F3、SEQ ID NO：2的外引物B3、SEQID NO：3的内引物FIP和SEQ ID NO：4的内引物BIP；
所述内标引物组包括SEQ ID NO：5的外引物F3、SEQ ID NO：6的外引物B3、SEQ ID NO：7的内引物FIP和SEQ ID NO：8的内引物BIP。
2.根据权利要求1所述的用于检测肺炎支原体的LAMP引物组合物，其特征在于，所述肺炎支原体引物组和所述内标引物组中，每个引物组中的各引物的摩尔比为：
外引物F3：6～8μM；
外引物B3：6～8μM；
内引物FIP：55～57μM；
内引物BIP：55～57μM。
3.一种含有权利要求1或2所述LAMP引物组合物的试剂盒，其特征在于，还包括真空干燥预混液、核酸提取试剂和微流控芯片。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述真空干燥预混液包括Bst酶、dNTPs、荧光染料和MgSO4；
其中，所述Bst酶的浓度为1U/μl、所述dNTPs的浓度为12mM，以及所述荧光染料的浓度为0.5μM。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述真空干燥预混液还包括防污染体系，所述防污染体系包括UDG酶和dUTP，所述UDG酶的浓度为0.2U/μl。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂包括树脂材料、10×Isothermal Amplification反应缓冲液和Mg2+水溶液；
其中，所述树脂材料的用量为5％，所述Mg2+水溶液的浓度为120mM。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片设有4个互不连通的反应检测部分，每一反应检测部分具有2个加样孔和2组反应池，每一反应检测部分的1个加样孔对应1组反应池，每一反应检测部分的1组反应池包括1个阳性对照反应池、2个阴性对照反应池和1个临床样本扩增反应池。
8.一种采用权利要求3～7任一所述试剂盒来检测肺炎支原体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、制备混合溶液
分别制备阳性对照混合溶液、阴性对照混合溶液和临床样本扩增混合溶液；
步骤2、引物组合物的包埋
将步骤1制备的所述阳性对照混合溶液、所述阴性对照混合溶液和所述临床样本扩增混合溶液分别包埋在所述微流控芯片的相应反应池内，经过真空干燥固定在反应池中；
步骤3、待测样本核酸提取
将待测样本与所述核酸提取试剂混合后加入经步骤2处理后的所述微流控芯片的相应加样孔内，并用膜封住所述加样孔；
步骤4、LAMP反应
将经步骤3处理后的所述微流控芯片放置到一核酸恒温分析装置内进行LAMP反应；
步骤5、结果判读
根据扩增结束后各反应池的扩增曲线进行判读。
9.根据权利要求8所述的检测肺炎支原体的方法，其特征在于，在步骤3中，将50μl所述待测样本与50μl所述核酸提取试剂进行混合。
10.根据权利要求8所述的检测肺炎支原体的方法，其特征在于，在步骤4中，LAMP反应的步骤为：
恒温加热：95℃加热5min；
离心扩增：先在50℃加热5min，后在64℃扩增60min。
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