CN113088578A - 一种检测肺炎支原体的lamp引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测肺炎支原体的LAMP引物组、试剂盒及方法，本发明通过将肺炎支原体的RNA作为检测靶标与LAMP技术联用，克服了现有技术中采用DNA与LAMP技术联用准确性不高、容易产生的假阳性的缺陷，提高了检测的准确性和灵敏度，灵敏度可达10copies/μL，且RNA易降解，污染更加易控。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测肺炎支原体的LAMP引物组、试剂盒及方法。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，Mp)是一种常见的病原微生物。Mp感染广泛存在于世界各地，平时散在性发病，每隔3-7年出现一次地区流行，每次流行持续1-2年。肺炎支原体感染容易引起多种脏器感染和不典型症状，因此需要准确的检测方法。目前，市面上检测MP的方法有培养法、免疫法等，但培养法培养时间较长，对操作者技术要求较高，敏感性较差，培养阳性率低；免疫法虽然检测速度快，但灵敏度低。
环介导等温扩增技术(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种简单、快速、特异性强、耗费低的核酸扩增技术，可以在等温条件下一步完成，该方法于2000年由Notomi等建立，现已被广泛应用于病原微生物、胚胎性别鉴定、转基因相关检测等方面。
目前，环介导等温扩增技术已经被用于肺炎支原体的检测中，但是检测靶标为DNA，DNA检测法虽然敏感性和特异性高，但在菌体死亡后DNA降解需要一定时间，DNA检测阳性可能是近期MP感染后残留的DNA的假阳性结果。因此，现有技术中存在准确性不高，容易出现假阳性的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测肺炎支原体的LAMP引物组、试剂盒及方法，本方案采用RNA作为检测靶标与LAMP技术联用，提高了检测的准确性和灵敏度，且RNA易降解，污染易控。
为实现本发明的目的，本发明提供了一种用于检测肺炎支原体的LAMP引物组，所述引物组用于引导肺炎支原体的RNA扩增，所述引物组的核苷酸序列如下所示：
肺炎支原体外引物：
MP-F3：5'-GACCTGCAAGGGTTCGTTAT-3'，
MP-B3：5'-ACCTTCATCGTTCACGCG-3'；
肺炎支原体内引物：
MP-FIP：5'-CACGTCATTGCCTTGGTAGGCCTTGATGAGGGTGCGCCATA-3'，
MP-BIP:5'-ATGGGACTGAGACACGGCCCGCTCCATCAAGCTTTCGCT-3'；
肺炎支原体环引物：
MP-LF:5'-ACCCCACCAACTAGCTGA-3'，
MP-LB:5'-CAGCAGTAGGGAATTTTTCACA-3'
进一步地，所述引物组中，MP-F3、MP-B3、MP-FIP、MP-BIP、MP-LF、MP-BF、MP-F4、MP-B4的摩尔比为2:2:16:16:4:4。
本发明的还提供了一种用于检测肺炎支原体的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含上述的LAMP引物组。
进一步地，所述试剂盒还包含缓冲液和显色剂，或者缓冲液和显色剂的预混液。
本发明还提供了一种肺炎支原体的检测方法，其包括以下步骤:
S1、获得上述的引物组和待测样本的RNA；
S2、配制LAMP反应体系，利用上述的引物组引导所述RNA进行环介导等温扩增反应，观察反应体系的颜色变化；
所述检测方法不用于疾病的诊断和治疗。
进一步地，所述待测样本的RNA通过磁珠法提取获得或者通过免提取法获得。
进一步地，所述反应体系包括LAMP 2X Mix 9-20μL，LAMP Primer Mix(10X)1-8μL，待测样本RNA 1-8μL，dH2O 7-15μL。
进一步地，所述LAMP Primer Mix(10X)中，MP-FIP和MP-BIP浓度为16μmol/L，MP-F3和MP-B3浓度为2μmol/L，MP-LF和MP-LB浓度为4μmol/L。
进一步地，所述环介导等温扩增反应的温度为65℃，反应时间为15-30min。
进一步地，所述反应时间为20min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过将肺炎支原体的RNA作为检测靶标与LAMP技术联用，克服了现有技术中采用DNA与LAMP技术联用准确性不高、容易产生的假阳性的缺陷，提高了检测的准确性和灵敏度，灵敏度可达10copies/μL，且RNA易降解，污染更加易控。
附图说明
图1：实施例2中不同RNA浓度的待测样本反应20min后的变色情况；
图2:实施例2中39个样本的准确性测试结果；
图3：实施例2的抗干扰性实验结果。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种快速高效、灵敏度高、准确性好、特异性高的检测肺炎支原体的LAMP引物组、试剂盒及方法。
为更加清楚的表示，下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若无特别说明，本发明选用的原料、试剂或设备均为市售所得。
实施例1：
本实施例提供了一种用于检测肺炎支原体的LAMP引物组，该引物组的引物通过引物设计软件(例如NEB网站https://lamp.neb.com/#！/)设计得出，本实施例最终设计筛选得到多重LAMP引物组合的引物序列见表1。
表1实施例1的LAMP引物组的引物序列
人工合成表1中各引物组的引物，备用。本实施例的引物组中，MP-F3、MP-B3、MP-FIP、MP-BIP、MP-LF、MP-BF、MP-F4、MP-B4的摩尔比为2:2:16:16:4:4。
本实施例中的用于检测肺炎支原体的LAMP引物组可以应用于制备检测肺炎支原体的试剂盒，所述试剂盒包含上述的LAMP引物组。所述试剂盒还可以包含缓冲液和显色剂，或者缓冲液和显色剂的预混液。为方便检测，所述试剂盒中还可进一步包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为肺炎支原体标准株RNA，所述阴性对照为不含RNA的LAMP扩增体系，如双蒸水。
实施例2:
本实施例提供了一种肺炎支原体的检测方法，该检测方法不用于疾病的诊断和治疗。该方法具体包括以下步骤：
S1、获得实施例1所述的引物组，和待测样本的RNA；
具体的，步骤S1中，所述待测样本的RNA可以通过磁珠法提取获得或者通过免提取法获得。磁珠法可以是利用市面上已经商品化的磁珠法总RNA提取试剂盒进行操作提取。免提取法可以是利用市面上的裂解液，核酸提取液，直接进行反应；也可以是将Proteinase K加入含有缓冲剂的样本中，反应5分钟，再进行后续LAMP反应。
S2、配制LAMP反应体系置于反应管中，利用上述的引物组引导所述RNA进行环介导等温扩增反应，观察反应体系的颜色变化；
具体的，步骤S2中的LAMP反应体系包括LAMP 2X Mix 9-20μL，LAMP Primer Mix(10X)1-8μL，待测样本RNA 1-8μL，dH2O 7-15μL。所述引物混合物LAMP Primer Mix(10X)中，MP-FIP和MP-BIP浓度为16μmol/L，MP-F3和MP-B3浓度为2μmol/L，MP-LF和MP-LB浓度为4μmol/L。将各引物稀释至指定浓度后，再将所有稀释后的引物混合即可得LAMP PrimerMix。
LAMP检测的预混液LAMP 2X Mix由实验人员自己准备，内含10X等温扩增缓冲液1-4μL，10mM dNTPs 2-6μL，100mM MgSO4 0.5-3μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)0.5-1.5μL,耐热逆转录酶0.1-1μL，dH2O 1-4μL，酚红0.2-0.8μL，RNA酶抑制剂0.1-1μL。其中含有pH指示剂，在LAMP的反应过程中，DNA/RNA聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变pH值，使粉红色/红色反应液变成黄色，整个反应过程快速，颜色改变清晰，肉眼可见。在其他实施例中，预混液也可以根据需要选择其他商业化产品。
本实施例中，环介导等温扩增反应的条件为：将装有反应体系的反应管置于65℃恒温保持20min。反应结束后，根据反应液颜色变化判断结果，黄色表示待测样品中存在肺炎支原体(结果阳性)，粉色表示待测样品中不存在肺炎支原体(结果阴性)。
本实施例对不同RNA浓度(所述浓度包括0(称为NTC)、10(也可写成10^1)、102(也可写成10^2)、103(也可写成10^3)copies/μL)的待测样本进行了检测，按照本实施例中提供的反应体系进行扩增反应20min后，反应管内溶液中的颜色变化情况见图1所示。根据图1可知，与阴性对照相比，本方法检测RNA浓度为10copies/μL的结果呈现明显的黄色，且随着RNA浓度增加(从10到102、103copies/μL)，黄色更加明显。这证明本方法的灵敏度可达10copies/μL。
本实施例还对39个样本(每个样品两个平行测试，见图2中标号1-39管)进行了测试，同时进行了阳性对照试验(对应图2中的标号P管)和阴性对照试验(对应图2中的标号NTC管)，以验证本方法的准确性，所述阳性对照试验只需将待测样本的RNA替换成为肺炎支原体标准株RNA，所述阴性对照试验为不含RNA的LAMP扩增体系，即双蒸水。测试结果如图2所示。图2中，39个样品中，每个样品的两平行测试结果均相同，证明本方法的测试准确性好。
本实施例还进行了抗干扰性测试实验，该实验是指将已知其他呼吸道传染病阳性而肺炎支原体阴性的样本进行检测，每个样本中包含季节性H1N1流感病毒、H3N2、H7N9、乙型流感Yamagata、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型中的一种或几种，每个样本同时进行两个平行测试(图3中一共有8个样本，每个样本等量放入两根管中进行平行测试)。图3显示了该实验的结果，检测结果均为粉色，表明肺炎支原体阴性，证明本方法不受季节性H1N1流感病毒、H3N2、H7N9、乙型流感Yamagata、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型干扰，特异性高。
以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。
序列表
<110> 厦门健康工程与创新研究院
<120> 一种检测肺炎支原体的LAMP引物组、试剂盒及方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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<213> 人工合成
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<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cagcagtagg gaatttttca ca 22
Claims (10)
1.一种用于检测肺炎支原体的LAMP引物组，其特征在于：所述引物组用于引导肺炎支原体的RNA扩增，所述引物组的核苷酸序列如下所示：
肺炎支原体外引物：
MP-F3：5'-GACCTGCAAGGGTTCGTTAT-3'，
MP-B3：5'-ACCTTCATCGTTCACGCG-3'；
肺炎支原体内引物：
MP-FIP：5'-CACGTCATTGCCTTGGTAGGCCTTGATGAGGGTGCGCCATA-3'，
MP-BIP:5'-ATGGGACTGAGACACGGCCCGCTCCATCAAGCTTTCGCT-3'；
肺炎支原体环引物：
MP-LF:5'-ACCCCACCAACTAGCTGA-3'，
MP-LB:5'-CAGCAGTAGGGAATTTTTCACA-3'。
2.如权利要求1所述的用于检测肺炎支原体的LAMP引物组，其特征在于：所述引物组中，MP-F3、MP-B3、MP-FIP、MP-BIP、MP-LF、MP-BF、MP-F4、MP-B4的摩尔比为2:2:16:16:4:4。
3.一种用于检测肺炎支原体的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的LAMP引物组。
4.如权利要求3所述的用于检测肺炎支原体的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含缓冲液和显色剂，或者缓冲液和显色剂的预混液。
5.一种肺炎支原体的检测方法，其特征在于：包括以下步骤:
S1、获得权利要求1或2所述的引物组和待测样本的RNA；
S2、配制LAMP反应体系，利用权利要求1或2所述的引物组引导所述RNA进行环介导等温扩增反应，观察反应体系的颜色变化；
所述检测方法不用于疾病的诊断和治疗。
6.如权利要求5所述的肺炎支原体的检测方法，其特征在于：所述待测样本的RNA通过磁珠法提取获得或者通过免提取法获得。
7.如权利要求5所述的肺炎支原体的检测方法，其特征在于：所述反应体系包括LAMP2X Mix 9-20μL，LAMP Primer Mix(10X)1-8μL，待测样本RNA 1-8μL，dH2O 7-15μL。
8.如权利要求7所述的肺炎支原体的检测方法，其特征在于：所述LAMP Primer Mix(10X)中，MP-FIP和MP-BIP浓度为16μmol/L，MP-F3和MP-B3浓度为2μmol/L，MP-LF和MP-LB浓度为4μmol/L。
9.如权利要求5所述的肺炎支原体的检测方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的温度为65℃，反应时间为15-30min。
10.如权利要求9所述的肺炎支原体的检测方法，其特征在于：所述反应时间为20min。
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| CN202110406999.XA Pending CN113088578A (zh) | 2021-04-15 | 2021-04-15 | 一种检测肺炎支原体的lamp引物组、试剂盒及方法 |
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102618655A (zh) * | 2012-04-16 | 2012-08-01 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种检测肺炎支原体的lamp试剂盒 |
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-
2021
- 2021-04-15 CN CN202110406999.XA patent/CN113088578A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
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