CN113265479A

CN113265479A - 检测莫氏立克次体的引物组合物及其应用

Info

Publication number: CN113265479A
Application number: CN202110576976.3A
Authority: CN
Inventors: 焦俊; 熊小路; 赵月峨; 周冬生; 欧阳譞; 于永慧; 吴妮尔
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: CN113265479B

Abstract

本发明公开了检测或辅助检测莫氏立克次体的引物组合物,所述引物组合物是特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.7的片段在内的莫氏立克次体基因组DNA片段的引物对。所述引物组合物由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA、名称为BIP的单链DNA、名称为LoopF的单链DNA和名称为LoopB的单链DNA组成。本发明的实验结果证明，使用所述引物组合物用环介导等温扩增检测莫氏立克次体，快速且高效，扩增反应在60分钟内即可完成，只需在恒定温度就能完成大量扩增反应，无需专业PCR设备；检测结果特异性好、灵敏度高；鉴定方法简单方便，适用于临床标本的快速检测。

Description

检测莫氏立克次体的引物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一组莫氏立克次体的引物组合物及其应用。

背景技术

斑疹伤寒(Scrub typhus)是由斑疹伤寒立克次体所致的一类自然疫源性人兽共患病，在传染病管理法中属于乙类传染病管理。莫氏立克次体(Rickettsia typhi)是斑疹伤寒立克次体的一种，其感染引起地方性斑疹伤寒呈世界性分布，鼠类是贮存宿主，蚤是传播媒介，呈鼠―蚤―人传播循环。人感染莫氏立克次体后，经两周左右的潜伏期后发病，主要表现为发热、头痛、皮疹和淋巴结肿大，伴有神经系统、心动过缓、中耳炎、肺炎等临床症状。

目前没有标准化的莫氏立克次体临床诊断方法。传统的外斐实验特异性和敏感性差，只能作为辅助诊断。实验室诊断方法主要有血清学方法和分子生物学方法。血清学诊断以间接免疫荧光为主，然而此方法在发病后1-2周才能检测到斑疹伤感立克次体抗体，时效性差，且与其他立克次体存在交叉反应。分子生物学诊断方法准确，现有的方法基于普通PCR或实时荧光定量PCR检测斑疹伤寒立克次体，但需要使用专业的仪器，反应时间也较长，且检测的敏感性有待提高，并不能适应临床的、“简便、快速、灵敏”的要求。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)能在等温条件下，短时间内完成痕量核酸大量扩增，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可判断靶基因是否存在，是一种适合现场的、“简便、快速、灵敏、精确”的基因扩增检测方法。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何以高灵敏度、高特异性的方法快速、简便的实现莫氏立克次体的现场检测。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：

提供检测或辅助检测莫氏立克次体的引物组合物，所述引物组合物是特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.7的片段在内的莫氏立克次体基因组DNA片段的引物对。

进一步地，所述引物组合物是特异扩增核苷酸序列是SEQ ID No.7的片段的引物对。

进一步地，所述特异扩增为环介导等温扩增。

所述引物组合物由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA、名称为BIP的单链DNA、名称为LoopF的单链DNA和名称为LoopB的单链DNA组成；

所述F3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的单链DNA或其衍生物；

所述B3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的单链DNA或其衍生物；

所述FIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA或其衍生物；

所述BIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的单链DNA或其衍生物；

所述LoopF为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的单链DNA或其衍生物；

所述LoopB为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的单链DNA或其衍生物。

所述衍生物为如下1)-3)中任一种：

1)、将各引物的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与各引物的核苷酸序列具有相同功能的DNA分子；

2)、与各引物的核苷酸序列具有大于等于85％同源性且与各引物的核苷酸序列具有相同功能的DNA分子；

3)、各引物核苷酸序列的反向互补序列。

进一步地，所述引物组合物中，所述F3、B3、FIP、BIP、LoopF和LoopB的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

在本发明的实施例中，引物F3的浓度为5pmol/L、引物B3的浓度为5pmol/L、引物FIP的浓度为40pmol/L、引物BIP的浓度为40pmol/L、引物LoopF的浓度为20pmol/L和引物LoopB的浓度为20pmol/L。

本发明提供检测或辅助检测莫氏立克次体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有权利要求所述的引物组合物。

进一步地，所述试剂或试剂盒为环介导等温扩增试剂或试剂盒。所述试剂或试剂盒还包括进行环介导等温扩增需要的其它试剂(如Bst DNA聚合酶)。

如上所述系统的制备方法，包括将所述F3、所述B3、所述FIP、所述BIP、所述LoopF和所述LoopB分别单独包装的步骤。

上述环介导等温扩增的引物组合物在如下A1)-A6)至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

A1)检测或辅助检测莫氏立克次体；

A2)检测或辅助检测待测样本是否感染莫氏立克次体；

A3)检测或辅助检测待测菌体为莫氏立克次体；

A4)制备检测或辅助检测莫氏立克次体的产品；

A5)制备检测或辅助检测待测样本是否感染莫氏立克次体的产品；

A6)制备检测或辅助检测待测菌体为莫氏立克次体的产品。

所述产品可以是试剂、试剂盒或系统。

本发明提供了一种检测或辅助检测待测菌体是否为莫氏立克次体的方法，包括如下步骤：用上述环介导等温扩增的成套引物对待测立克次体进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增反应产物；根据所述环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测菌体是否为莫氏立克次体。

上述根据环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测菌体是否为莫氏立克次体方法如下1)-3)中任一种：

1)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若所述环介导等温扩增反应产物具有典型的扩增曲线，则待测菌体为或候选为莫氏立克次体；

2)检测所述环介导等温扩增反应产物是否浑浊，若所述环介导等温扩增反应产物浑浊(与反应前的体系相比)，则待测立克次体为或候选为莫氏立克次体；

3)在环介导等温扩增的体系中加入荧光染料，若所述环介导等温扩增反应产物荧光颜色与反应前有变化，则待测菌体为或候选为莫氏立克次体。

或，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测样本是否感染莫氏立克次体的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述环介导等温扩增的成套引物对待测立克次体进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增反应产物；根据所述环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测样本是否感染莫氏立克次体。

上述根据环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测样本是否感染莫氏立克次体的方法如下：

1)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若所述环介导等温扩增反应产物具有典型的扩增曲线，则待测样本感染或候选感染莫氏立克次体；

2)检测所述环介导等温扩增反应产物是否浑浊，若所述环介导等温扩增反应产物浑浊(与反应前的体系相比)，则待测样本感染或候选感染莫氏立克次体；

3)在环介导等温扩增的体系中加入荧光染料，若所述环介导等温扩增反应产物荧光颜色与反应前有变化，则待测样本感染或候选感染莫氏立克次体。

上述方法中的环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃反应30-90min，再80℃孵育5min终止反应。

本发明的实验证明，发明人设计合成了环介导等温扩增的引物组合物，采用环介导等温扩增法对莫氏立克次体进行特异性检测，优点如下：(1)只需在恒定温度就能完成大量扩增反应，无需专业PCR设备；(2)特异性高，可以准确检测莫氏立克次体，实验结果表明与贝氏柯克斯体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、金黄色葡萄球菌、小蛛立克次体、嗜肺军团菌、猪链球菌、查菲埃立克体、汉赛巴通体、澳大利亚立克次体等均无交叉反应；(3)灵敏度高，最低检测限为1×10¹个基因组/μL；(4)快速且高效，扩增反应在60分钟内即可完成；(5)鉴定方法简单方便，适用于临床标本的现场检测。

附图说明

图1为特异性检测的实时浊度仪扩增结果和扩增曲线；其中：A、B为扩增结果，C、D为对应的扩增曲线，图C为图A的扩增曲线，图D为图B的扩增曲线；图A、B中纵坐标为浊度仪检测样本管内的浊度，用来反应扩增的程度；横坐标代表样品管号；图C、D中横坐标为反应时间；图A1-8分别是贝氏柯克斯体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、金黄色葡萄球菌、小蛛立克次体、嗜肺军团菌和猪链球菌，图B1-5分别是查菲埃立克体、汉赛巴通体、澳大利亚立克次体、莫氏立克次体和阴性对照。

图2为灵敏度检测的实时浊度仪扩增结果和扩增曲线；其中：A为扩增结果，B为对应的扩增曲线；图A中纵坐标为浊度仪检测样本管内的浊度，用来反应扩增的程度；横坐标代表样品管号；图B中横坐标为反应时间；其中1-7分别为1×10⁵个基因组/μL、1×10⁴个基因组/μL、1×10³个基因组/μL、1×10²个基因组/μL、1×10¹个基因组/μL、1×10⁰个基因组/μL和阴性对照。

图3为重复性检测的实时浊度仪扩增结果和扩增曲线；其中：A为扩增结果，B为对应的扩增曲线；图A中纵坐标为浊度仪检测样本管内的浊度，用来反应扩增的程度；横坐标代表样品管号；图B中横坐标为反应时间；其中1-6均为1×10⁵个莫氏立克次体基因组DNA，7为阴性对照。

图4为扩增结束后自然光下目视反应液荧光染料颜色变化；1-6管莫氏立克次体浓度依次为1×10⁵个基因组/μL、1×10⁴个基因组/μL、1×10³个基因组/μL、1×10²个基因组/μL、1×10¹个基因组/μL、1×10⁰个基因组/μL，第7管为阴性对照。

图5为相同靶序列的不同引物筛选结果；其中：A为扩增结果，B为扩增曲线；图A中纵坐标为浊度仪检测样本管内的浊度，用来反应扩增的程度；横坐标代表样品管号；图B中横坐标为反应时间；图中，1为实施例1的F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB，2为对比引物，3为阴性对照，1、2组引物都有扩增；图B左1曲线为实施例1的F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB扩增结果，图B左2边的曲线为对照引物扩增结果。

图6为普通PCR检测莫氏立克次体的灵敏度；其中：M泳道为核酸marker(DL2000)，1-5泳道为PCR产物的琼脂糖凝胶结果，模板为莫氏立克次体DNA，1-5泳道模板浓度分别为1×10³个基因组/μL、1×10²个基因组/μL、1×10¹个基因组/μL、1×10⁰个基因组/μL、阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

以下实施例中DNeasy Blood&Tissue Kit全基因组提取试剂盒：Qiagen公司。

环介导等温扩增法脱氧核糖核酸扩增试剂盒：北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP206。

环介导等温扩增法荧光目视检测试剂盒：北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP221。

环介导等温扩增法专用PCR管：北京蓝谱生物科技有限公司。

仪器LA-320C实时浊度仪：北京蓝谱生物科技有限公司。

下述实施例中部分材料如下：

贝氏柯克斯体(新桥株，文献中记载的名称为Coxiella burnetii)在文献“JiaoJun,Xiong Xiaolu,Qi Yong,Gong Wenping,Duan Changsong,Yang Xiaomei,WenBohai.Serological characterization of surface-exposed proteins of Coxiellaburnetii.Microbiology.2014Dec；160(Pt 12):2718-31.”中公开。

莫氏立克次体、汉赛巴通体(Houston-1)(以下简称汉赛巴通体)DNA、小蛛立克次体(Kaplan)(以下简称小蛛立克次体)DNA和澳大利亚立克次体(Phillips)(以下简称澳大利亚立克次体)DNA在文献“实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体的方法建立，解放军医学杂志，第33卷，第11期，1297-1299，2008”中公开，猪链球菌基因组DNA、金黄色葡萄球菌基因组DNA、立氏立克次体基因组DNA、西伯利亚立克次体基因组DNA、康氏立克次体基因组DNA、嗜肺军团菌基因组DNA、查菲埃立克体基因组DNA在“实时荧光定量PCR同时快速检测4类致病性立克次体，寄生虫与医学昆虫学报，第26卷，第2期，110-117，2019.”中公开。在符合国家和军队有关规定且经相关部门批准后，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。

实施例1、检测莫氏立克次体环介导等温扩增引物组合物及试剂盒的制备

1.1、莫氏立克次体环介导等温扩增引物组合物

根据莫氏立克次体全基因组序列信息设计专用环介导等温扩增引物如下：

F3(序列1)：5’-TCAGTTAGATTGAACGTTACCA-3’；

B3(序列2)：5’-ACAGATATATAAACACCACTTT-3’；

FIP(序列3)：5’-AACATGTTAAAAGCGTTTAGCATGAAATTGTGAATCAAATCTGC-3’；

BIP(序列4)：5’-AATAAGTTCCCTCAGCTCAATAGAAACTAATTTAAGTGACAGT-3’。

LoopF(序列5)：5’-TTAAATGTGCACATGAAGTTT-3’

LoopB(序列6)：5’-AGGACTATAATGTCATGATGTA-3’

人工合成上述引物，用于下述实施例的检测。

1.2、检测莫氏立克次体的方法的建立

1.2.1、提取DNA

提取感染莫氏立克次体待测样本中基因组DNA。

1.2.2、LAMP反应

以上述基因组DNA为模板，用上述一制备的F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB按照如下表1所示的LAMP反应体系(表1，25μL)加入引物1μL(由F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB和水混匀得到，其中，F3和B3的浓度均为5pmol/L，BIP和FIP的浓度均为40pmol/L，LoopF和LoopB的浓度均为20pmol/L)，2×RM反应混合液(北京蓝谱生物科技有限公司)12.5μL，Bst DNA聚合酶(北京蓝谱生物科技有限公司)1μL，待测样本中基因组DNA 1μL，无核酸酶和脱氧核酶的去离子水6.5μL。以上浓度均为体系中的终浓度。

LAMP反应体系在63℃反应60min，然后80℃5min终止反应。

表1：LAMP反应体系

组分	体积/μL
		F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB引物	各1
2×RM反应混合液	12.5
		Bst DNA聚合酶	1
模板DNA	1
		H<sub>2</sub>O	4.5
合计	25

得到的LAMP反应产物通过如下1)-3)任一种方法判断：

1)、实时浊度仪判断

LAMP反应产物采用实时浊度仪及其配套程序软件实时检测，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则表明待测样本感染或候选感染莫氏立克次体，或待测菌体为或候选为莫氏立克次体；反之则无。

2)、分析反应液的浊度变化

反应过程中，dNTP析出的焦磷酸根离子与LAMP体系中的金属离子Mg²⁺(或Mn²⁺)结合，从而产生大量焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀。因此可以根据反应液的浊度变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否含靶序列。

若LAMP反应产物浑浊，则表明待测样本感染或候选感染莫氏立克次体，或待测菌体为或候选为莫氏立克次体；反之则无。

3)、分析荧光染料的颜色变化：

应用本方法进行判断时，LAMP体系中需要另加入钙黄绿素(加入1μL)；反应初始时钙黄绿素与Mg²⁺结合，反应液呈透明橙色，核酸大量合成时，生成的焦磷酸根使使得Mg²⁺游离出来，钙黄绿素和Mn²⁺结合，反应液显示浑浊的黄绿色。因此可以根据反应液中荧光染料颜色变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列。

若反应产物由透明橙色变为浑浊的黄绿色，则表明待测样本感染或候选感染莫氏立克次体，或待测菌体为莫氏立克次体；反之则无。

1.3、检测莫氏立克次体的试剂盒的构建

将上述一的F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB引物单独包装，作为检测莫氏立克次体的试剂盒的组分。

或将表1中的LAMP反应体系中除去模板DNA的其他试剂，作为检测莫氏立克次体的试剂盒的组分。

实施例2、检测莫氏立克次体的引物组合物的应用

2.1、莫氏立克次体基因组DNA的制备

取莫氏立克次体感染的鸡胚卵黄囊膜，加入PBS进行研磨；采用差速离心法联合泛影葡胺密度梯度离心纯化莫氏立克次体，纯化后的菌体用DNeasy Blood&Tissue Kit提取全基因组DNA(具体方法见该试剂盒说明书)，得到莫氏立克次体基因组DNA。

最后用Nanodrop1000测定提取的菌体DNA的浓度(ng/μL)，计算所纯化的莫氏立克次体的菌体拷贝数浓度(个基因组/μL)。

使用纯水将提取的菌体DNA进行梯度稀释(浓度分别为1×10⁵个基因组/μL、1×10⁴个基因组/μL、1×10³个基因组/μL、1×10²个基因组/μL、1×10¹个基因组/μL、1×10⁰个基因组/μL)。

纯水为阴性对照。

2.2、引物组合物检测莫氏立克次体(实时浊度仪法)

2.2.1、特异性检测

用实施例1中1.2的方法对11种非莫氏立克次体DNA和莫氏立克次体基因组DNA进行LAMP产物，得到LAMP反应产物。

11种非莫氏立克次体分别如下：贝氏柯克斯体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、金黄色葡萄球菌、小蛛立克次体、嗜肺军团菌、猪链球菌、查菲埃立克体、汉赛巴通体、澳大利亚立克次体。所有反应均在专用离心管中进行。

实时浊度仪(LA-320C)检测LAMP反应产物，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则表明待测样本感染或候选感染莫氏立克次体，反之则无。

结果见图1，只有在扩增莫氏立克次体DNA时，才出现明显扩增曲线，其他样本DNA扩增为阴性；说明本发明的引物和方法的特异性好，特异检测莫氏立克次体，与其他病原体无交叉。

2.2.2、灵敏度检测

用实施例1中1.2的方法对上述莫氏立克次体DNA(1×10⁵个基因组/μL、1×10⁴个基因组/μL、1×10³个基因组/μL、1×10²个基因组/μL、1×10¹个基因组/μL、1×10⁰个基因组/μL)进行LAMP反应。

实时浊度仪检测LAMP反应产物，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则表明待测样本感染或候选感染莫氏立克次体，反之则无。

结果见图2，模板DNA拷贝数为1×10¹个基因组/μL可见明显扩增曲线，说明本发明的引物和方法的灵敏度为1×10¹个基因组/反应体系。

2.2.3、重复性检测

用实施例1中1.2的方法对莫氏立克次体DNA(1×10⁵个基因组/μL)，重复检测6次。

结果见图3，6次重复均检测到明显扩增曲线，说明本发明的引物和方法的重复性较好。

实施例3、专用引物检测莫氏立克次体(目视荧光染料颜色变化)

用实施例1中1.2的方法检测莫氏立克次体DNA，反应体系额外直接加入试剂盒内含钙黄绿素(环介导等温扩增法荧光检测试剂盒，北京蓝谱生物科技有限公司，LMP221)1μL，模板DNA分别为5份莫氏立克次体感染的鸡胚卵黄囊膜提取的DNA。以正常鸡胚卵黄囊膜提取的DNA为阴性对照。

若反应产物由透明橙色变为浑浊的黄绿色，则表明待测样本感染或候选感染莫氏立克次体；反之则无。

结果见图4，前5管其荧光染料颜色均由透明橙色变为浑浊的黄绿色；第6、7管颜色没有发生变化，仍为透明橙色。

说明说明采用所述引物LAMP检测莫氏立克次体的灵敏度可为1×10¹个基因组/μL。

对比例1：相同靶序列的不同引物筛选。

本发明采用相同的靶序列同时设计如下对照引物：

F3(序列1)：5’-TCAGTTAGATTGAACGTTACCA-3’；

Rt B3-2：5’-TGTACAGATATATAAACACCAC-3’；

FIP(序列3)：5’-AACATGTTAAAAGCGTTTAGCATGAAATTGTGAATCAAATCTGC-3’；

BIP(序列4)：5’-AATAAGTTCCCTCAGCTCAATAGAAACTAATTTAAGTGACAGT-3’；

LoopF(序列5)：5’-TTAAATGTGCACATGAAGTTT-3’；

LoopB(序列6)：5’-AGGACTATAATGTCATGATGTA-3’。

以实施例2中的莫氏立克次体基因组DNA为模板，用实施例中的F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB和对照引物进行LAMP反应，方法和体系同实施例2。

结果如图5所示，可见实施例1的F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB在32min左右有大量扩增，而对照引物在36min左右有大量扩增。

因此，针对同一批次的样品，实施例1的F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB引物组比对照引物扩增效果好。

对比例2：普通PCR扩增莫氏立克次体。

本发明以实施例2中的莫氏立克次体基因组DNA为模板，普通PCR对莫氏立克次体DNA进行检测。普通PCR引物序列为F：5’-CAGGATTGGTAACTGCTTCCACGGC-3’、R：5’-CAAACCCTAAGGTAGTATTTTCATT-3’。

结果如图6所示，可见1、2泳道有PCR产物扩增出来，说明普通PCR检测莫氏立克次体的灵敏度为1×10²个基因组/μL。

因此，针对同一批次的样品，实施例1的F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB引物组采用LAMP扩增灵敏度比普通PCR扩增的灵敏度高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 检测莫氏立克次体的引物组合物及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcagttagat tgaacgttac ca 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acagatatat aaacaccact tt 22

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacatgttaa aagcgtttag catgaaattg tgaatcaaat ctgc 44

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aataagttcc ctcagctcaa tagaaactaa tttaagtgac agt 43

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaaatgtgc acatgaagtt t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggactataa tgtcatgatg ta 22

<210> 7

<211> 305

<212> DNA

<213> Rickettsia typhi

<400> 7

tcagttagat tgaacgttac cataatttta acttaaaaca taaactaacc ccccttgaaa 60

ttgtgaatca aatctgcata atctttttct attctttttt gtacactaga taataaaaac 120

ttcatgtgca catttaatgc taaacgcttt taacatgtta ataagttccc tcagctcaat 180

aaataaagtc ataatttcat taattaaatc gtttaggact ataatgtcat gatgtaaata 240

ttaatgtata ctgtcactta aattagtttc taatatacta attaaagtgg tgtttatata 300

tctgt 305

Claims

1.检测或辅助检测莫氏立克次体的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物是特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.7的片段在内的莫氏立克次体基因组DNA片段的引物对。

2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物是特异扩增核苷酸序列是SEQ ID No.7的片段的引物对。

3.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，所述特异扩增为环介导等温扩增。

4.如权利要求1、2或3所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA、名称为BIP的单链DNA、名称为LoopF的单链DNA和名称为LoopB的单链DNA组成；

5.如权利要求1-4中任一所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物中，所述F3、B3、FIP、BIP、LoopF和LoopB的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

6.检测或辅助检测莫氏立克次体的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒含有权利要求1-5中任一所述的引物组合物。

7.权利要求6所述试剂或试剂盒的制备方法，包括将权利要求4-6中任一所述的引物组合物中的所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LoopF和所述LoopB分别单独包装的步骤。

8.权利要求1-5中任一所述的引物组合物或权利要求6所述的试剂或试剂盒在如下A1)-A6)中的应用：

A1)检测或辅助检测莫氏立克次体；

A2)检测或辅助检测待测样本是否感染莫氏立克次体；

A3)检测或辅助检测待测菌体为莫氏立克次体；

A4)制备检测或辅助检测莫氏立克次体的产品；

A6)制备检测或辅助检测待测菌体为莫氏立克次体的产品。

9.检测或辅助检测莫氏立克次体的方法，其特征在于，使用权利要求1-5中任一所述的引物组合物或权利要求6所述的试剂或试剂盒对待测样品进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增反应产物，根据所述环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测样品是否为莫氏立克次体或是否含有莫氏立克次体或是否感染莫氏立克次体。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应条件为：60-65℃反应30-90min，再80℃孵育5min终止反应。