CN105018610A - 莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量pcr检测体系及检测方法 - Google Patents

莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量pcr检测体系及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法及检测体系，检测体系由引物、探针、TaqMan？mix？buffer、ddH2O、pMD18-T-Rm、pMD18-T-Ot组成。引物包括Pr47F、Pr47？R、Ot-F、Ot-R，探针包括Probe-P、Probe-O。该引物和探针具有特异性好、敏感性高等特点，该检测方法与普氏立克次体、立氏立克次体、Q热立克次体等均无交叉反应；可同时检测到8.24个拷贝的莫氏立克次体标准品和43.6个拷贝的恙虫病东方体标准品。本发明可同时对莫氏立克次体及恙虫病东方体进行检测，适合国境口岸卫生检疫部门开展对上述病原体的监测检测工作。

Description

莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系及检测方法
技术领域
    本发明属于生物技术检测领域，特别涉及实时荧光定量PCR检测方法及检测体系，可同时对莫氏立克次体和恙虫病东方体进行核酸检测。
背景技术
    虫媒病是一类重要的传染病，在我国每年传染病总发病病例中约占5 %～10 %，死亡病例数占传染病总死亡数的30 %～40 %。目前，虫媒病流行和爆发呈现出新趋势：原有虫媒病再度爆发，流行区域不断扩展；新发虫媒病不断被发现，且流行范围在不断扩大；虫媒病流行的频率不断加大。
    鼠型斑疹伤寒（Murine Typhus）是由莫氏立克次体（Rickettsia mooseri）经鼠、蚤等媒介生物传播的自然疫源性疾病；恙虫病（Tsutsugamushi Disease）又称丛林斑疹伤寒，是由恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）引起的自然疫源性疾病。莫氏立克次体和恙虫病东方体均以鼠类为主要传染源。
    鼠型斑疹伤寒及恙虫病在我国许多地区均有流行，如鼠型斑疹伤寒在我国东北、上海及长沙等地均有流行。我国目前有港口、机场、车站及陆路边境口岸约400个，每年均有大量媒介生物借助交通工具、集装箱及货物等在口岸间输入输出。仅2002年到2007年的五年间，卫生检疫机构就在入境交通工具、集装箱、货物中共捕获各类病媒生物1.8亿多只，且捕获数量呈现逐年上升的趋势。大量媒介生物的输入对我国的卫生安全特别是口岸地区的卫生安全造成极大的威胁。强化对出入境交通工具及集装箱、货物等的排查和对输入性医学媒介生物携带病原体的检测，是有效防止虫媒传染病通过国境口岸输入、输出，避免疫情大范围爆发的基础和前提，也是国境口岸检疫执法和疾病监测的迫切需要。
    在样品检测过程中，因样品感染情况、操作者技术水平等因素影响，传统检测方法往往具有一定的局限性。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR技术被广泛应用到医学和生物学领域，该技术具有灵敏度高、特异性好和可靠性强等特点，而且能够实现多重反应，自动化程度高。TaqMan技术是一种对单管PCR产物进行实时荧光定量检测的技术，通过加入与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号的积累来实时监测整个PCR进程，从而对靶标基因进行定量或定性检测。与常规TaqMan探针相比，美国应用公司推出的TaqMan-MGB探针技术不仅荧光本底得以降低，荧光光谱分辨率得以改善，由于探针3’端结合了Minor groove binder结合物，使得探针的Tm值得以提高，同时提高了探针的杂交稳定性和特异性。
发明内容
    本发明的目的是解决同时检测莫氏立克次体及恙虫病东方体的问题，提供了莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，包括引物和TaqMan-MGB探针序列，特异性强，敏高性高；另外，本发明还提供一种莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法，PCR反应体系和反应条件，特异性强，敏高性高，且具有良好的重复性。
    本发明莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，包括莫氏立克次体和恙虫病东方体的引物和探针，其中，
莫氏立克次体引物及Taqman-MGB探针序列：
Pr47F：5’-TGTTGATGGTGCAGGATTTGA -3’
Pr47R：5’-CGAATTTGTAGCGACAGGAAG A -3’
Probe-P：5’- FAM - CAAACTGGCGCTGGTGT -3’
恙虫病东方体引物及Taqman-MGB探针序列：
Ot-F：5’-TCT RCR CCAGTAATYATTCCTCC-3’    R=A/G  Y=T/C
Ot-R：5’-TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3’
Probe-O：5’-HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3’。
所述检测体系统PCR反应体系：
TaqMan mix buffer         10 μL
Pr47F/ R (10 μM)          0.4 μL
Ot-F/ R (10 μM)           0.8 μL
Probe-P(10 μM)           0.6 μL
Probe-O(10 μM)           0.6 μL
pMD18-T-Rm             1 μL
pMD18-T-Ot              1 μL
补足ddH2O到20μL              ；
其中莫氏立克次体阳性对照样品pMD18-T-Rm，合成序列如下：
AATAGAACAACAAATGCAGCAGCTACAACTGTTGATGGTGCAGGATTTGATCAAACTGGCGCTGGTGTTAATCTTCCTGTCGCTACAAATTCGGTTATTACTGCTAATTCTAATAATGCT；
    恙虫病东方体阳性对照样品pMD18-T-Ot，合成序列如下：
GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG。
本发明莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法：
（1）首先是引物及探针的设计与合成：
    以GenBank公布的莫氏立克次体基因序列（GI:51459527）的ompB蛋白基因序列设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为64bp，
Pr47F：5’-TGTTGATGGTGCAGGATTTGA -3’
Pr47R：5’-CGAATTTGTAGCGACAGGAAG A -3’
Probe-P：5’- FAM - CAAACTGGCGCTGGTGT -3’；
    以GenBank公布的恙虫病东方体Karp型基因序列（GI:63079111），56-kDa蛋白基因序列设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为130bp，
Ot-F：5’-TCT RCR CCAGTAATYATTCCTCC-3’    R=A/G  Y=T/C
Ot-R：5’-TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3’
Probe-O：5’-HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3’；
（2）阳性对照样品的合成：
莫氏立克次体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的莫氏立克次体基因序列（GI:51459527），选取莫氏立克次体引物扩增区域核酸序列（120 bp），委托宝生物工程（大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为莫氏立克次体阳性对照样品，命名为pMD18-T-Rm，合成序列如下：
AATAGAACAACAAATGCAGCAGCTACAACTGTTGATGGTGCAGGATTTGATCAAACTGGCGCTGGTGTTAATCTTCCTGTCGCTACAAATTCGGTTATTACTGCTAATTCTAATAATGCT；
    恙虫病东方体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的恙虫病东方体基因序列（GI:63079111），选取恙虫病东方体引物扩增区域核酸序列（153 bp），委托宝生物工程（大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，命名为pMD18-T-Ot，合成序列如下：
GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG；
    （3）PCR反应体系的建立：莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体系的建立，以循环阈值和荧光强度等作为评价指标，通过四因素三水平正交试验（L34）优化PCR反应体系中莫氏立克次体引物（Pr47F/R）和探针(Probe-P)浓度及恙虫病东方体引物(Ot-F/R)和探针(Probe-O)浓度等，建立最佳PCR反应体系如下：
                      TaqMan mix buffer         10 μL
Pr47F/ R (10 μM)          0.4 μL
Ot-F/ R (10 μM)           0.8 μL
Probe-P(10 μM)           0.6 μL
Probe-O(10 μM)           0.6 μL
pMD18-T-Rm             1 μL
pMD18-T-Ot              1 μL
补足ddH2O到20μL                ；
    （4）实时荧光定量PCR反应条件优化：通过优化退火温度，最佳PCR反应条件如下：50℃
2min；95℃  10min ；95℃  15s，60℃ 1min，循环45次，退火时收集荧光信号。
（5）对所述的莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体系和反应条件进行评价，包括敏感性评价、特异性评价及重复性评价。
    所述的敏感性评价方法及结果如下：
    分别以制备的pMD18-T-Rm标准品、pMD18-T-Ot标准品为模板，进行多重定量PCR扩增反应，FAM通道和HEX通道均可获得较为理想的扩增曲线，以lg（浓度）为横坐标,以循环阈值Ct值为纵坐标，以102-107标准品测试结果绘制定量关系曲线；
    以pMD18-T-Rm标准品和pMD18-T-Ot标准品的混合物为模板进行进行多重定量PCR扩增反应，FAM通道和HEX通道均获得较为理想的扩增曲线。
所述的特异性评价方法及结果如下：
    以普氏立克次体、立氏立克次体、Q热立克次体、噬吞噬细胞无形体及伯氏疏螺旋体等病原体DNA为模板，同时以ddH2O、莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA及莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA、pMD18-T-Rm和pMD18-T-Ot的混合物作为空白对照、阴性对照及阳性对照进行多重定量PCR扩增，通过FAM通道和HEX通道分析。
    所述的重复平评价方法及结果如下：
以同一批次制备的106个拷贝的pMD18-T-Rm的标准品和pMD18-T-Ot的标准品的混合物做为模板进行定量PCR扩增，FAM通道和HEX的扩增曲线重合性较高，通过对5次扩增结果进行统计学分析；
    以不同批次制备的103和107个拷贝的pMD18-T-Rm的标准品和pMD18-T-Ot的标准品的混合物作为模板进行定量PCR扩增，103批间重复性FAM通道和HEX及107批间重复性FAM通道和HEX扩增曲线重合性均较高，通过对5次扩增结果循环阈值（Ct值）进行统计学分析。
本发明与同类技术相比，具有显著的技术特点：以TaqMan探针技术为基础，应用TaqMan-MGB探针技术设计并合成莫氏立克次体和恙虫病东方体探针，建立莫氏立克次体和恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法，在同一反应管内可同时对莫氏立克次体和恙虫病东方体进行检测，极大的缩短了检测周期，操作简便，满足对莫氏立克次体和恙虫病东方体同时进行快速检测的工作要求。
附图说明
    图1为双重实时荧光定量PCR法敏感性试验检测莫氏立克次体时的扩增曲线，其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图2为双重实时荧光定量PCR法敏感性试验检测恙虫病东方体时的扩增曲线，其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图3为双重实时荧光定量PCR法敏感性试验检测莫氏立克次体的定量关系曲线，其中横轴为标准品拷贝数的对数，纵轴为循环数；
    图4为双重实时荧光定量PCR法敏感性试验检测恙虫病东方体的定量关系曲线，其中横轴为标准品拷贝数的对数，纵轴为循环数；
    图5为双重实时荧光定量PCR法敏感性试验同时检测莫氏立克次体和恙虫病东方体的扩增曲线（FAM通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图6为多重实时荧光定量PCR法敏感性试验同时检测莫氏立克次体和恙虫病东方体的扩增曲线（HEX通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图7 为双重实时荧光定量PCR法特异性试验扩增曲线（FAM通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图8为双重实时荧光定量PCR法特异性试验扩增曲线（HEX通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图9为双重实时荧光定量PCR法批内重复性（106）试验扩增曲线（FAM通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图10为双重实时荧光定量PCR法批内重复性（106）试验扩增曲线（HEX通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图11为双重实时荧光定量PCR法批间重复性（103）试验扩增曲线（FAM通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图12为双重实时荧光定量PCR法批间重复性（103）试验扩增曲线（HEX通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图13为双重实时荧光定量PCR法批间重复性（107）试验扩增曲线（FAM通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度；
    图14为双重实时荧光定量PCR法批间重复性（107）试验扩增曲线（HEX通道），其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1
莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，包括莫氏立克次体和恙虫病东方体的引物和探针，其中，
莫氏立克次体引物及Taqman-MGB探针序列：
Pr47F：5’-TGTTGATGGTGCAGGATTTGA -3’
Pr47R：5’-CGAATTTGTAGCGACAGGAAG A -3’
Probe-P：5’- FAM - CAAACTGGCGCTGGTGT -3’
恙虫病东方体引物及Taqman-MGB探针序列：
Ot-F：5’-TCT RCR CCAGTAATYATTCCTCC-3’    R=A/G  Y=T/C
Ot-R：5’-TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3’
Probe-O：5’-HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3’。
所述检测体系统PCR反应体系：
TaqMan mix buffer         10 μL
Pr47F/ R (10 μM)          0.4 μL
Ot-F/ R (10 μM)           0.8 μL
Probe-P(10 μM)           0.6 μL
Probe-O(10 μM)           0.6 μL
pMD18-T-Rm             1 μL
pMD18-T-Ot              1 μL
补足ddH2O到20μL              ；
其中莫氏立克次体阳性对照样品pMD18-T-Rm，合成序列如下：
AATAGAACAACAAATGCAGCAGCTACAACTGTTGATGGTGCAGGATTTGATCAAACTGGCGCTGGTGTTAATCTTCCTGTCGCTACAAATTCGGTTATTACTGCTAATTCTAATAATGCT；
    恙虫病东方体阳性对照样品pMD18-T-Ot，合成序列如下：
GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG。
实施例2
莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法：
（1）首先是引物及探针的设计与合成：
    以GenBank公布的莫氏立克次体基因序列（GI:51459527）的ompB蛋白基因序列设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为64bp，
Pr47F：5’-TGTTGATGGTGCAGGATTTGA -3’
Pr47R：5’-CGAATTTGTAGCGACAGGAAG A -3’
Probe-P：5’- FAM - CAAACTGGCGCTGGTGT -3’；
    以GenBank公布的恙虫病东方体Karp型基因序列（GI:63079111），56-kDa蛋白基因序列设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为130bp，
Ot-F：5’-TCT RCR CCAGTAATYATTCCTCC-3’    R=A/G  Y=T/C
Ot-R：5’-TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3’
Probe-O：5’-HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3’；
（2）阳性对照样品的合成：
莫氏立克次体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的莫氏立克次体基因序列（GI:51459527），选取莫氏立克次体引物扩增区域核酸序列（120 bp），委托宝生物工程（大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为莫氏立克次体阳性对照样品，命名为pMD18-T-Rm，合成序列如下：
AATAGAACAACAAATGCAGCAGCTACAACTGTTGATGGTGCAGGATTTGATCAAACTGGCGCTGGTGTTAATCTTCCTGTCGCTACAAATTCGGTTATTACTGCTAATTCTAATAATGCT；
    恙虫病东方体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的恙虫病东方体基因序列（GI:63079111），选取恙虫病东方体引物扩增区域核酸序列（153 bp），委托宝生物工程（大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，命名为pMD18-T-Ot，合成序列如下：
GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG；
    （3）PCR反应体系的建立：莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体系的建立，以循环阈值和荧光强度等作为评价指标，通过四因素三水平正交试验（L34）优化PCR反应体系中莫氏立克次体引物（Pr47F/R）和探针(Probe-P)浓度及恙虫病东方体引物(Ot-F/R)和探针(Probe-O)浓度等，建立最佳PCR反应体系如下：
                      TaqMan mix buffer         10 μL
Pr47F/ R (10 μM)          0.4 μL
Ot-F/ R (10 μM)           0.8 μL
Probe-P(10 μM)           0.6 μL
Probe-O(10 μM)           0.6 μL
pMD18-T-Rm             1 μL
pMD18-T-Ot              1 μL
补足ddH2O到20μL                ；
    （4）实时荧光定量PCR反应条件优化：通过优化退火温度，优化最佳PCR反应条件如下：
50℃  2min；95℃  10min ；95℃  15s，60℃ 1min，循环45次，退火时收集荧光信号。
（5）对所述的莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体系和反应条件进行评价，检测方法评价包括敏感性评价、特异性评价及重复性评价。
    所述的敏感性评价方法及结果如下：
    分别以制备的pMD18-T-Rm标准品、pMD18-T-Ot标准品为模板，进行多重定量PCR扩增反应，FAM通道（附图1）和HEX通道（附图2）均可获得较为理想的扩增曲线，检测敏感性分别为：82.4个拷贝和43.6个拷贝。以lg（浓度）为横坐标,以循环阈值Ct值为纵坐标，以102-107标准品测试结果绘制定量关系曲线，其线性拟合系数R2分别为：0.999和0.9974，说明该双重定量PCR检测方法检测莫氏立克次体（附图3）或恙虫病东方体时（附图4），满足线性检测应用要求。
    以pMD18-T-Rm标准品和pMD18-T-Ot标准品的混合物为模板进行进行多重定量PCR扩增反应，FAM通道（附图5）和HEX通道（附图6）均获得较为理想的扩增曲线，检测敏感性分别为8.24个拷贝和43.6个拷贝。
所述的特异性评价方法及结果如下：
    以普氏立克次体、立氏立克次体、Q热立克次体、噬吞噬细胞无形体及伯氏疏螺旋体等病原体DNA为模板，同时以ddH2O、莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA及莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA、pMD18-T-Rm和pMD18-T-Ot的混合物作为空白对照、阴性对照及阳性对照进行多重定量PCR扩增。通过FAM（附图7）通道和HEX（附图8）通道分析表明，该多重实时荧光定量PCR检测方法具有较好的特异性，与上述病原体间无交叉反应。
    所述的重复平评价方法及结果如下：
以同一批次制备的106个拷贝的pMD18-T-Rm的标准品和pMD18-T-Ot的标准品的混合物做为模板进行定量PCR扩增，FAM（附图9）通道和HEX（附图10）的扩增曲线重合性较高。通过对5次扩增结果进行统计学分析，5次批内重复性试验Ct值均值分别为17.79和21.50，变异系数分别为0.85%和1.48%，结果表明该多重实时荧光定量PCR法具有较好批内重复性（表1）。
表1  批内重复性评价结果
    以不同批次制备的103和107个拷贝的pMD18-T-Rm的标准品和pMD18-T-Ot的标准品的混合物作为模板进行定量PCR扩增，103批间重复性FAM（附图11）通道和HEX（附图12）及107批间重复性FAM（附图13）通道和HEX（附图14）扩增曲线重合性均较高。通过对5次扩增结果循环阈值（Ct值）进行统计学分析，103个拷贝的标准品5批次重复性试验Ct值均值分别为27.02和33.04，变异系数为0.62%和1.67%；107个拷贝的标准品5批次重复性试验Ct值均值分别为14.03和16.19，变异系数为1.18%和1.64%，结果表明，结果表明该多重实时荧光定量PCR法具有较好批间重复性（表2）。
    表2批间重复性评价结果
SEQUENCE LISTING
<110>  宋, 锋林
       高, 玉峰
 
<120>  莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系及检测方法
 
<130>  2015
 
<160>  8    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Unknown
 
<220>
<223>  莫氏立克次体上游引物
 
<400>  1
tgttgatggt gcaggatttg a                                               21
 
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Unknown
 
<220>
<223>  莫氏立克次体下游引物
 
<400>  2
cgaatttgta gcgacaggaa ga                                              22
 
 
<210>  3
<211>  17
<212>  DNA
<213>  Unknown
 
<220>
<223>  莫氏立克次体Taqman-MGB探针序列
 
<400>  3
caaactggcg ctggtgt                                                    17
 
 
<210>  4
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Unknown
 
<220>
<223>  恙虫病东方体上游引物
 
 
<220>
<221>  misc_feature
<223>  (4,6,15)R=A/G  Y=C/T
 
<400>  4
tctrcrccag taatyattcc tcc                                             23
 
 
<210>  5
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Unknown
 
<220>
<223>  恙虫病东方体下游引物
 
<400>  5
tgttaattgc tagtgcaatg tctgc                                           25
 
 
<210>  6
<211>  17
<212>  DNA
<213>  Unknown
 
<220>
<223>  恙虫病东方体Taqman-MGB探针序列
 
<400>  6
aaggaccaca ctctaat                                                    17
 
 
<210>  7
<211>  120
<212>  DNA
<213>  Unknown
 
<220>
<223>  莫氏立克次体阳性对照样品
 
<400>  7
aatagaacaa caaatgcagc agctacaact gttgatggtg caggatttga tcaaactggc     60
 
gctggtgtta atcttcctgt cgctacaaat tcggttatta ctgctaattc taataatgct    120
 
 
<210>  8
<211>  153
<212>  DNA
<213>  Unknown
 
<220>
<223>  恙虫病东方体阳性对照样品
 
<400>  8
gaaaaaaatt atgttaattg ctagtgcaat gtctgcgttg tcgttgccat tttcagctag     60
 
tgcaatagaa ttgggggaag aaggattaga gtgtggtcct tatgctaaag ttggagttgt    120
 
tggaggaatg attactggcg tagaatctgc tcg                                 153

Claims (7)

1.莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，其特征是：包括莫氏立克次体和恙虫病东方体的引物和探针，其中，
莫氏立克次体引物及Taqman-MGB探针序列：
上游引物Pr47F：5’-TGTTGATGGTGCAGGATTTGA -3’
下游引物Pr47R：5’-CGAATTTGTAGCGACAGGAAG A -3’
探针Probe-P：5’- FAM - CAAACTGGCGCTGGTGT -3’
恙虫病东方体引物及Taqman-MGB探针序列：
上游引物Ot-F：5’-TCT RCR CCAGTAATYATTCCTCC-3’    R=A/G  Y=T/C
下游引物Ot-R：5’-TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3’
探针Probe-O：5’-HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3’。
2.根据权利要求1所述的莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，其特征是：所述检测体系统PCR反应体系：
TaqMan mix buffer         10 μL
Pr47F/ R (10 μM)          0.4 μL
Ot-F/ R (10 μM)           0.8 μL
Probe-P(10 μM)           0.6 μL
Probe-O(10 μM)           0.6 μL
pMD18-T-Rm             1 μL
pMD18-T-Ot              1 μL
补足ddH2O到20μL              ；
其中莫氏立克次体阳性对照样品pMD18-T-Rm，合成序列如下：
AATAGAACAACAAATGCAGCAGCTACAACTGTTGATGGTGCAGGATTTGATCAAACTGGCGCTGGTGTTAATCTTCCTGTCGCTACAAATTCGGTTATTACTGCTAATTCTAATAATGCT；
    恙虫病东方体阳性对照样品pMD18-T-Ot，合成序列如下：
GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG。
3.莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：
（1）首先是引物及探针的设计与合成：
    以GenBank公布的莫氏立克次体基因序列（GI:51459527）的ompB蛋白基因序列设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为64bp，
Pr47F：5’-TGTTGATGGTGCAGGATTTGA -3’
Pr47R：5’-CGAATTTGTAGCGACAGGAAG A -3’
Probe-P：5’- FAM - CAAACTGGCGCTGGTGT -3’；
    以GenBank公布的恙虫病东方体Karp型基因序列（GI:63079111），56-kDa蛋白基因序列设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为130bp，
Ot-F：5’-TCT RCR CCAGTAATYATTCCTCC-3’    R=A/G  Y=T/C
Ot-R：5’-TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3’
Probe-O：5’-HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3’；
（2）阳性对照样品的合成：
莫氏立克次体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的莫氏立克次体基因序列（GI:51459527），选取莫氏立克次体引物扩增区域核酸序列（120 bp），委托宝生物工程（大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为莫氏立克次体阳性对照样品，命名为pMD18-T-Rm，合成序列如下：
AATAGAACAACAAATGCAGCAGCTACAACTGTTGATGGTGCAGGATTTGATCAAACTGGCGCTGGTGTTAATCTTCCTGTCGCTACAAATTCGGTTATTACTGCTAATTCTAATAATGCT；
    恙虫病东方体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的恙虫病东方体基因序列（GI:63079111），选取恙虫病东方体引物扩增区域核酸序列（153 bp），委托宝生物工程（大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，命名为pMD18-T-Ot，合成序列如下：
GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG；
    （3）PCR反应体系的建立：莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体系的建立，以循环阈值和荧光强度等作为评价指标，通过四因素三水平正交试验（L34）优化PCR反应体系中莫氏立克次体引物（Pr47F/R）和探针(Probe-P)浓度及恙虫病东方体引物(Ot-F/R)和探针(Probe-O)浓度等，建立最佳PCR反应体系如下：
                      TaqMan mix buffer         10 μL
Pr47F/ R (10 μM)          0.4 μL
Ot-F/ R (10 μM)           0.8 μL
Probe-P(10 μM)           0.6 μL
Probe-O(10 μM)           0.6 μL
pMD18-T-Rm             1 μL
pMD18-T-Ot              1 μL
补足ddH2O到20μL                ；
    （4）实时荧光定量PCR反应条件优化：通过优化退火温度，优化最佳PCR反应条件如下：
50℃  2min；95℃  10min ；95℃  15s，60℃ 1min，循环45次，退火时收集荧光信号。
4.根据权利要求3莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：对所述的莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体系和反应条件进行评价，包括敏感性评价、特异性评价及重复性评价。
5.    根据权利要求3莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征是： 所述的敏感性评价方法及结果如下：
    分别以制备的pMD18-T-Rm标准品、pMD18-T-Ot标准品为模板，进行多重定量PCR扩增反应，FAM通道和HEX通道均可获得较为理想的扩增曲线，以lg（浓度）为横坐标,以循环阈值Ct值为纵坐标，以102-107标准品测试结果绘制定量关系曲线；
    以pMD18-T-Rm标准品和pMD18-T-Ot标准品的混合物为模板进行进行多重定量PCR扩增反应，FAM通道和HEX通道均获得较为理想的扩增曲线。
6.根据权利要求3莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：所述的特异性评价方法及结果如下：
    以普氏立克次体、立氏立克次体、Q热立克次体、噬吞噬细胞无形体及伯氏疏螺旋体等病原体DNA为模板，同时以ddH2O、莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA及莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA、pMD18-T-Rm和pMD18-T-Ot的混合物作为空白对照、阴性对照及阳性对照进行多重定量PCR扩增，通过FAM通道和HEX通道分析。
7.    根据权利要求3莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：所述的重复平评价方法及结果如下：
以同一批次制备的106个拷贝的pMD18-T-Rm的标准品和pMD18-T-Ot的标准品的混合物做为模板进行定量PCR扩增，FAM通道和HEX的扩增曲线重合性较高，通过对5次扩增结果进行统计学分析；
    以不同批次制备的103和107个拷贝的pMD18-T-Rm的标准品和pMD18-T-Ot的标准品的混合物作为模板进行定量PCR扩增，103批间重复性FAM通道和HEX及107批间重复性FAM通道和HEX扩增曲线重合性均较高，通过对5次扩增结果循环阈值（Ct值）进行统计学分析。
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