CN104962628A - 一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒及引物和探针 - Google Patents

一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒及引物和探针 Download PDF

Info

Publication number
CN104962628A
CN104962628A CN201510357565.XA CN201510357565A CN104962628A CN 104962628 A CN104962628 A CN 104962628A CN 201510357565 A CN201510357565 A CN 201510357565A CN 104962628 A CN104962628 A CN 104962628A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
probe
seq
group
rickettsia mooseri
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510357565.XA
Other languages
English (en)
Inventor
田洁
郭惠琳
陆琳
田茵
赵静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Original Assignee
Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China filed Critical Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Priority to CN201510357565.XA priority Critical patent/CN104962628A/zh
Publication of CN104962628A publication Critical patent/CN104962628A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的双重荧光PCR的检测试剂盒及引物和探针。所述检测用引物和探针为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测斑点热群立克次体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测斑点热群立克次体的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5分别为检测莫氏立克次体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测莫氏立克次体的荧光探针。本发明还提供了斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒。本发明所选引物和探针特异性非常强，且一次能检测两种立克次体病原微生物，提高效率。

Description

一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒及引物和探针
技术领域
本发明涉及检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体用引物、探针及检测试剂盒。
背景技术
斑点热群立克次体(SFGR)和莫氏立克次体(RM)它们引起的疾病分别称为斑点热和地方性斑疹伤寒。斑点热的地理分布较广泛，遍布于世界各大洲。斑点热群立克次体的常见传播媒介为蜱，其次是螨、蚤。地方性斑疹伤寒又称鼠型斑疹伤寒，由鼠蚤传播，多散发，症状较轻。地方性斑疹伤寒的流行与当地的鼠患猖獗以及温度、湿度适合于蚤的孳生密切有关，易形成地方性爆发流行。
立克次体病临床表现一般缺乏特异性，如表现为不明原因的高热、头痛、全身酸痛、食欲不振等，常常误疹为其它传染病，确诊主要依靠实验室检查，包括血清学检测和病原的分离与鉴定。特异性抗体的检出一般在发病2周以后，所以血清学检测不能用于立克次体感染的早期诊断。由于大多数立克次体不能在人工培养基上生长，需要靠动物接种、细胞培养等对立克次体病原进行分离。立克次体病原分离操作复杂，费时费力且成功率很低。因此立克次体的传统检测方法已逐渐被酶联免疫吸附技术、PCR技术、芯片技术等现代检测方法所代替。如今，研究的趋势更是进一步转向了在一个检测平台上同时检测多种致病菌，以此缩短检测周期、减少检测成本。因此，能同时快速有效检测多种病原微生物的高通量检测技术已成为临床疾病检测，国境口岸卫生检疫，公共安全等领域研究的热点。
多重荧光PCR技术是在同一个反应体系中同时扩增两个或两个以上的目标基因序列。多重荧光PCR技术可同时检测多种病原，具有快速、简便、准确、特异的优点，应用前景十分广阔。
本研究着重研究影响检测鼠源性立克次体病多重荧光PCR技术方法的关键因素，提出解决方案，促使形成技术升级的同时，形成产业化。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的核苷酸序列，包括引物和探针。
本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了检测斑点热群立克次体的引物和探针，具体如下：
通过序列比较，根据斑点热群立克次体(Spotted fever group rickettsiae,SFGR)OmpB基因的序列(GenBank：EF219464)，在其保守区1020-1090位置设计一对引物及一条探针：
1)SFG正义引物(SFG-F)5'-TGACGTTGGTACAGACGGTACT-3’(SEQ ID NO：1)；
2)SFG反义引物(SFG-R)5'-TTGAGTTTTGGGTTATTGCAACTTTAGAA-3’(SEQ ID NO：2)；
3)SFG探针(SFG-probe)5'-FAM-CTGCCTTTAAAACAGC-3'-MGB(SEQ ID NO：3)，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团MGB；
扩增目的片段为71bp。
通过序列比较，根据莫氏立克次体(Rickettsia mooseri,RM)OmpB基因的序列(GenBank：KF241858)，在其保守区147-210位置设计一对引物及一条探针：
4)RM正义引物(RM-F)5’-TGTTGATGGTGCAGGATTTGA-3’(SEQ ID NO：4)；
5)RM反义引物(RM-R)5’-TCTTCCTGTCGCTACAAATTCG-3’(SEQ ID NO：5)；
6)RM探针(RM-probe)5’-TET-CAAACTGGCGCTGGTGT-3’-MGB(SEQ ID NO：6)，该探针的5’端标记报告荧光基团TET，3’端标记淬灭基团MGB；
扩增目的基因大小为64bp。
本发明还提供了一种检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒，由以下组分组成：
1)DNA提取试剂；通常可以使用商业购买的DNA提取试剂盒或按照常规方法来提取DNA，所述的试剂盒例如DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit,cat.no DP304)；
2)DNA标准品为：斑点热群立克次体OmpB基因片段的阳性重组质粒DNA；和莫氏立克次体OmpB基因片段的阳性重组质粒DNA；
3)实时定量PCR反应液，其包括：PCR反应混合液，荧光定量PCR参比染料， 检测斑点热群立克次体的正义引物、反义引物和荧光探针，检测莫氏立克次体的正义引物、反义引物和荧光探针，
优选为：2×PCR反应混合液，1×荧光定量PCR参比染料，检测斑点热群立克次体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测莫氏立克次体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM；
进一步地，所述PCR反应混合液(Premix Ex TaqTM)，购自大连宝生物公司(Takra)，货号RR390A。所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成。
4)阴性对照：DEPC水；
5)DEPC水；1mL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于18.0MΩ.CM。
其中，检测斑点热群立克次体的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团MGB；检测莫氏立克次体的正义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：6所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团TET，3’端标记淬灭基团MGB。
本发明还提供了一种检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒的使用方法：
1.样品采集、运送
解剖鼠取其脾脏置于冻存管中，或将检获蜱虫置于冻存管中，将冻存管置于干冰或液氮中运送回实验室。-70℃冻存备用。
2.DNA提取
按照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提供的方法提取立克次体DNA，具体方法如下：
(1)动物组织(脾组织用量应少10mg)应先打碎处理为细胞悬液，然后10,000rpm离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
(2)加入20μlProteinase K溶液，混匀，在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
(3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复操作步骤7。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
3.实时定量PCR反应：
96孔PCR板，第一排12孔作为标准曲线和阴性对照孔，其余为样品检测孔。
反应体系为20μL，见表1：
表1
其中荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。
所述的模板DNA，如果是制作标准曲线，用斑点热群立克次体OmpB基因片段 (SEQ ID No:9)和莫氏立克次体OmpB基因片段(SEQ ID No:12)的阳性重组质粒DNA标准品作为模板，浓度为101-108，如果是样品检测，用鼠脾脏或蜱虫提取的DNA为模板，阴性对照模板为DEPC水，
检测条件为：在ABI7900荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为95℃10分钟，然后经过95℃15秒钟，58℃60秒钟40个循环。
本发明的优点是：
本方法在一个PCR管中同时检测两种立克次体，大大提高了检测效率，并能做到鉴别诊断两种立克次体。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1、试剂盒的组成
一、试剂盒的组成
1)DNA提取试剂；天根公司的DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit,cat.no DP304)；
2)DNA标准品：斑点热群立克次体OmpB基因片段的阳性重组质粒DNA；和莫氏立克次体OmpB基因片段的阳性重组质粒DNA；
3)实时定量PCR反应液，其包括：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)混合液，检测斑点热群立克次体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测莫氏立克次体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，1×荧光定量PCR参比染料；
其中，所述2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)混合液购自Takra，(RR390A)，所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye购自大连宝生物公司，货号(DR0X01)，所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成。
4)阴性对照：DEPC水；
5)DEPC水；1mL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于18.0MΩ.CM。
其中，检测斑点热群立克次体的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团MGB；检测莫氏立克次体的正义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，反义引物 为序列表SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：6所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团TET，3’端标记淬灭基团MGB。
二、DNA标准品的制备 
通过序列比较，根据斑点热群立克次体(Spotted fever group rickettsiae,SFGR)OmpB基因的序列(GenBank：EF219464)，在其保守区设计一对引物:
上游引物：OmpB-SFGF 5'-TGCAAAATGTTGCGGTGA-3'(SEQ ID No：7)
下游引物：OmpB-SFGR 5'-TACGTTACCGGGACCAGA-3'(SEQ ID No：8)
扩增目的片段大小为1195bp，见序列表SEQ ID No：9所示的核苷酸序列。
通过序列比较，根据莫氏立克次体(Rickettsia mooseri,RM)OmpB基因的序列(GenBank：KF241858)，在其保守区位置设计一对引物:
上游引物：PrF25’-CAGGATTGG TAACTGCTTCCACGGC-3’(SEQ ID No：10)
下游引物：PrR25'-CAAACCCTAAGGTAGTATTTTCATT-3’(SEQ ID No：11)
扩增目的片段大小为297bp，见序列表SEQ ID No：12所示的核苷酸序列。
用上述所示的两对引物序列对阳性样本进行PCR反应，回收PCR产物，获得高纯度的1195bpOmpB基因保守区序列(SEQ ID No:9)和297bpOmpB基因保守区序列(SEQ ID No:12)，与pGEM-Teasy载体进行连接，转化E.coli Competent Cells DH5α感受态细胞，进行培养，使用质粒提取试剂盒提取，经PCR和序列测定鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-PA和pGEM-EC,以此阳性质粒为模板大量扩增DNA，并纯化，测其浓度和纯度。利用公式：(6.02x 1023拷贝数/摩尔)x(浓度g/ml)x10-3/(MW g/mol)＝拷贝/μL，分别计算出pGEM-PA和pGEM-EC拷贝数，共同十倍稀释，以103～107拷贝/μl的DNA为模板，在ABI7900荧光定量PCR仪上进行反应，反应体系为20μL，其中Premix Ex Taq(Probe qPCR)混合液10μL，SFG-F和RM-F(10μM)各0.4μL，SFG-R和MR-R(10μM)各0.4μL，SFG-Probe和MR-Probe(10μM)各0.8μL，ROX Reference Dye(50x)0.4μL，模板DNA 2μL，DDH至25μL。反应条件为95℃10分钟，然后经过95℃15秒钟，58℃60秒钟40个循环。利用软件对数据进行分析，得到标准曲线。其R值分别为0.995746(SFG)、0.998935(MR)。
实施例3、试剂盒的特异性试验
1材料，
用于特异性评价的阴性鼠脾脏及蜱虫样本及常见立克次体以及其他细菌DNA样本来自本室和军事医学科学院微生物流行病研究所，包括查菲埃立克体，普氏立克次体，汉赛巴通体，出血性大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，鼠疫菌的DNA。
2方法：
利用本发明所述的试剂盒使用方法对阴性鼠脾脏及蜱虫样本及常见立克次体及细菌DNA进行检测，同时以105浓度的质粒DNA为阳性控制，验证其特异性。
3结果
阴性鼠脾脏及蜱虫样本及常见立克次体及细菌DNA样本检测结果均为阴性，说明该方法对上述病原体无交叉反应，表明该体系具有良好的特异性。
实施例4试剂盒的敏感性检测
为了验证本发明试剂盒的检测敏感性，以10倍稀释的DNA标准品(2×100～2×107拷贝/μL)为模板，每个稀释度的模板分别加2μL，同时设阴性对照，按照所建立的方法，在定量PCR仪上进行扩增反应，得出动力学曲线和标准曲线，当模板为2×10拷贝/μL时，其CT值仍在可检测范围内(CT<40)，表明本实验所建立的方法最低能检测到2×10拷贝/μL的DNA。
实施例5临床验证
利用本发明TaqMan双重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，对从北京、东北及国际航班截获的30只鼠及30只蜱虫样品及10份模拟样本进行了SFG和RM的检测，同时设阴阳性对照。检测结果为：其中30只鼠及30只蜱虫样品SFG、RM均为阴性，模拟标本中SFG阳性2份，RM阳性1份，混合感染1份。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (8)

1.一组用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6，其中序列SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2分别为检测斑点热群立克次体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测斑点热群立克次体的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5分别为检测莫氏立克次体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测莫氏立克次体的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团MGB。
3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO：6的5’端标记报告荧光基团TET，3’端标记淬灭基团MGB。
4.一种检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
1)DNA提取试剂；
2)DNA标准品；
3)实时定量PCR反应液，其包括：PCR反应混合液，荧光定量PCR参比染料，检测斑点热群立克次体的正义引物、反义引物和荧光探针，检测莫氏立克次体的正义引物、反义引物和荧光探针；
4)阴性对照；
5)DEPC水；
其中，检测斑点热群立克次体的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ IDNo：3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团MGB；检测莫氏立克次体的正义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：6所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团TET，3’端标记淬灭基团MGB。
5.根据权利要求4所述的的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA标准品为斑点热群立克次体OmpB基因片段的阳性重组质粒DNA和莫氏立克次体OmpB基因片段的阳性重组质粒DNA。
6.根据权利要求4所述的的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂为斑点热群立克次体和莫氏立克次体DNA提取试剂盒。
7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述实时定量PCR反应液包括：2×PCR反应混合液，检测斑点热群立克次体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测莫氏立克次体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM；1×荧光定量PCR参比染料。
8.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应混合液为PremixEx TaqTM混合液，所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。
CN201510357565.XA 2015-06-25 2015-06-25 一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒及引物和探针 Pending CN104962628A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510357565.XA CN104962628A (zh) 2015-06-25 2015-06-25 一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒及引物和探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510357565.XA CN104962628A (zh) 2015-06-25 2015-06-25 一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒及引物和探针

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104962628A true CN104962628A (zh) 2015-10-07

Family

ID=54216713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510357565.XA Pending CN104962628A (zh) 2015-06-25 2015-06-25 一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒及引物和探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104962628A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114836579A (zh) * 2022-06-02 2022-08-02 昆明理工大学 中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测引物组合
CN117327822A (zh) * 2023-11-16 2024-01-02 河南中检食安生物科技有限公司 用于检测汉赛巴通体的引物组及试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286617A (zh) * 2011-07-19 2011-12-21 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 无形体及立克次体实时荧光定量pcr试剂盒及其方法
CN104651498A (zh) * 2015-01-23 2015-05-27 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 立克次体甄别检测基因芯片的制备和用途
CN105018610A (zh) * 2015-07-14 2015-11-04 宋锋林 莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量pcr检测体系及检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286617A (zh) * 2011-07-19 2011-12-21 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 无形体及立克次体实时荧光定量pcr试剂盒及其方法
CN104651498A (zh) * 2015-01-23 2015-05-27 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 立克次体甄别检测基因芯片的制备和用途
CN105018610A (zh) * 2015-07-14 2015-11-04 宋锋林 莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量pcr检测体系及检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张军等: "基于ompB基因序列的立克次体精河株的系统发育分析与鉴定", 《寄生虫与医学昆虫学报》 *
杨晓: "检测斑疹伤寒病原体荧光定量PCR方法的建立黑龙江立克次体和立克次体精河株毒力和杭原性", 《中国优秀硕士学论全文数据库》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114836579A (zh) * 2022-06-02 2022-08-02 昆明理工大学 中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测引物组合
CN114836579B (zh) * 2022-06-02 2024-05-07 昆明理工大学 中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测引物组合
CN117327822A (zh) * 2023-11-16 2024-01-02 河南中检食安生物科技有限公司 用于检测汉赛巴通体的引物组及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105112519A (zh) 一种基于crispr的大肠杆菌o157:h7菌株检测试剂盒及检测方法
CN103382507B (zh) 1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重rt-pcr检测试剂盒、引物对及方法
CN105420412B (zh) 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法
CN104928376B (zh) 用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的组合物与试剂盒以及方法
CN105420379A (zh) 牛支原体的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针
CN103642910B (zh) 定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用
BRPI0607194B1 (pt) Método e Kit para analisar quantitativamente um microrganismo por marcação de rRNA
CN106868167A (zh) 用于现场快速检测牛支原体的引物、探针及试剂盒
CN109680084A (zh) 一种用于荧光定量pcr检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法
CN102286617B (zh) 斑疹伤寒群立克次体荧光定量pcr试剂盒
CN108048584A (zh) Raa荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒
CN106868224A (zh) 检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和nadc‑30毒株的rt‑pcr方法
WO2015196778A1 (zh) 对普罗威登斯菌o3，o4，o8，o12，o13和o20特异的核苷酸及其应用
CN103627812B (zh) 奶牛乳房炎主要致病菌四重pcr快速检测试剂盒
CN103725793B (zh) Prrsv的多重荧光定量rt-pcr扩增试剂
CN105400910B (zh) 猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法
CN110016512A (zh) 同时检测三种牛呼吸道病原体的多重荧光定量pcr检测试剂盒及方法
CN104263842B (zh) 一种鱼源无乳链球菌的荧光定量pcr检测方法
Klafack et al. Genetic variability of Koi herpesvirus in vitro—a natural event?
CN103725794A (zh) 检测prrsv的荧光定量rt-pcr引物、探针及其方法
CN104962628A (zh) 一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒及引物和探针
CN103993090B (zh) 对普罗威登斯菌o31，o41，o42，o43和o50特异的核苷酸及其应用
Huang et al. Detection of Phytophthora nicotianae in soil with real‐time quantitative PCR
CN105063228B (zh) 一种柱状黄杆菌的检测试剂盒及检测方法
CN104293960A (zh) 一种用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的双重荧光pcr的检测试剂盒及引物和探针

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151007

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication