CN104928376B - 用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的组合物与试剂盒以及方法 - Google Patents

用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的组合物与试剂盒以及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的组合物与试剂盒以及方法。本发明组合物、试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑47所示引物、探针和标准品，使用该组合物或试剂盒通过荧光定量PCR可以检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型。本发明灵敏度高、特异性强，通过检测tcdC基因突变或缺失并配合艰难梭菌毒力基因检测包括tcdA/B、二元毒力基因cdtA/B能准确判断艰难梭菌的毒素类型和毒力。

Description

用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的组合物与试 剂盒以及方法
技术领域
本发明属于抗生素耐药艰难梭菌基因的快速分子诊断领域，具体涉及用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的组合物与试剂盒以及方法。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)是一种具有芽胞结构的革兰氏阳性严格厌氧杆菌，是全球范围内公认的医院内感染与抗生素性腹泻最为重要的病原微生物。它能够引起抗生素相关性腹泻、结肠炎、致死性伪膜性肠炎等。2013年，艰难梭菌被美国国家卫生部列为抗生素相关耐药菌三大病原菌之首，威胁程度指定为“最紧急”。我国已将艰难梭菌研究纳入“十二五”国家传染病重大科技专项，由于培养分离条件严格苛刻，相关研究报道仍然较少。2015年2月份发表在《新英格兰医学杂志》的最新文章《美国艰难梭菌感染的负担》显示，在美国每年感染患者超过50万人，死亡人数超过2.9万，平均病死率为5.5-6.9％，重症死亡率在60％以上，每年用于治疗的医疗费用在100亿美金以上。在中国，抗生素滥用和严重，据最新报道艰难梭菌感染占院内腹泻中患者人数25％以上，抗生素相关腹泻中20-30％；肿瘤放疗患者中感染患者在30％以上。艰难梭菌感染易出现抗生素耐药、反复复发、传染性、高致死性；在全球范围内，艰难梭菌早已成为医院感染与抗生素耐药领域臭名昭著的“超级臭虫”。
长期以来一直认为艰难梭菌是一种不能引起严重感染后果的病原微生物，然而最近十年艰难梭菌感染流行范围、发生率、致死率、复发性等感染特点发生颠覆性变化。自2002年以来，加拿大、美国以及欧洲一些国家相继发生100多次出现艰难梭菌爆发流行，流行期间死亡率迅速上升。研究表明这主要归因于新的艰难梭菌高毒力菌株的出现。在中国，因艰难梭菌导致的腹泻从5年前的占院内腹泻的0.05％直线上升到最近的28％，院内获得性艰难梭菌感染从1.3/1000上升到11.6/1000，院感人数上升近十倍。
艰难梭菌高毒菌株tcdC突变如图1所示，包括△117突变、18bp缺失和36bp缺失或39bp缺失或54bp缺失。BI/NAPI/027菌株为美国、加拿大等国家艰难梭菌流行爆发的驱动菌株，它拥有以往菌株没有的特点，BI/NAP1/027含有tcdC基因117位点缺失引起tcdC基因发生移码突变，导致tcdC基因翻译提前终止，产生严重截断的65氨基酸残基；部分BI/NAP1还含有18bp缺失导致tcdC蛋白截断而无法产生功能。tcdC为艰难梭菌A毒素(tcdA)与B毒素(tcdB)的抑制基因，tcdC突变体菌株较之传统菌株，导致产生16倍以上毒素A和产生23倍以上毒素B，引起喹诺酮类药物耐药；此外BI/NAPI/027菌株也产生二元毒素cdtA或cdtB。艰难梭菌078型与BI/NAP1/027有类似的毒素，tcdC基因含有39bp缺失，并含有184位点突变，导致终止密码子提前出现。由于人与动物之间艰难梭菌078性基因序列高度一致，这有利于艰难梭菌078型的传播。此外，其他艰难梭菌高度菌株包含36bp缺失、54bp缺失等，均导致tcdC蛋白截短而无法产生功能。
因此，通过检测tcdC基因突变或缺失并配合艰难梭菌毒力基因检测包括tcdA/B、二元毒力基因cdtA/B，有利于确定高毒艰难梭菌感染并检测毒力基因类型。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于检测艰难梭菌高毒菌株和/或毒力类型的组合物。本发明的目的还在于提供基于该组合物的试剂盒及检测方法。本发明的组合物、试剂盒及检测方法能够检测高毒菌株tcdC突变(包括△117突变、18bp缺失和36bp缺失或39bp缺失或54bp缺失)以及艰难梭菌保守基因TPI、毒力基因tcdA与tcdB、二元毒力基因cdtA与cdtB。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于检测高毒艰难梭菌的组合物，为下述引物对中的至少一对：
引物对1：
tcdC△117上游引物：5’-TTGCTCTACTGGCATTTATTTGG-3’，SEQ ID NO.1，
tcdC△117下游引物：5’-ACCATGGTTCAGCATCAGACAA-3’，SEQ ID NO.2；
引物对2：
tcdC上游引物：5’-AGCAAATTGTCTGATGCTGAACC-3’，SEQ ID NO.4，
tcdC下游引物：5’-TCAGGTGTTCTAGCTAATTGGTCA-3’，SEQ ID NO.5。
所述的用于检测高毒艰难梭菌的组合物还包括与引物对匹配的探针，与引物对1匹配的探针为：
tcdC△117探针：5’-FAM/GAAGCTAAAAAGGCTGAAGAACAA/BHQ1-3’，SEQ ID NO.3；
与引物对2匹配的探针为：
tcdC探针：5’-FAM/AGCTAAAAAAGCTGAAGAAGC/MGBNFQ-3’，SEQ ID NO.6。
引物对1及其匹配的探针的靶核酸是具有△117(117位点缺失)单核苷酸独特型(SNP)的tcdC基因，tcdC基因117位点存在A、T、G与缺失等四种基因型(图2)。使用引物对1及其匹配的探针能够在不使用别的引物或探针的情况下实现高灵敏度检测艰难梭菌tcdC基因是否含有117位点缺失。另外，引物对2及其匹配的探针的靶核酸是具有18bp、36bp、39bp或54bp缺失的tcdC基因(图3)，这些缺失是一种在高毒艰难梭菌菌株中确认的高毒突变，使用能够特异性识别该重叠区域的引物对2及其匹配的探针能够高灵敏度检测tcdC基因的缺失情况。序列如SEQ ID NO.6所示的探针能结合tcdC野生型序列而不能识别tcdC基因缺失(包括18bp、36bp、39bp、54bp缺失)。为了便于描述，本文使用tcdC 18△表示tcdC 18bp、36bp、39bp、54bp四种缺失中任一类型。
一种用于检测艰难梭菌毒素类型(包括tcdA、tcdB、cdtA和cdtB)的组合物，为下述引物对中的至少一对：
引物对3：
tcdB上游引物1：5’-TGGTGTCATGCAGATTGGAGT-3’，SEQ ID NO.7，
tcdB下游引物1：5’-ACTGAACCAGTTGCTGCAATA-3’，SEQ ID NO.8；
引物对4：
tcdB上游引物2：5’-TGGTTCAGGAGGAACTTATGC-3’，SEQ ID NO.10，
tcdB下游引物2：5’-ATTTAATAGAAGGTATTTTATC-3’，SEQ ID NO.11；
引物对5：
tcdA上游引物：5’-CCAACACCTTAACCCAGCCA-3’，SEQ ID NO.13，
tcdA下游引物：5’-ATTGTGGAGCGAGCTTCTGG-3’，SEQ ID NO.14；
引物对6：
cdtA上游引物：5’-GGGAAGGACAAGCACTGTCTTA-3’，SEQ ID NO.16，
cdtA下游引物：5’-GATAAGCTCCAGGAGAACCTTT-3’，SEQ ID NO.17；
引物对7：
cdtB上游引物：5’-TTACCCTAGTACATGGAGTAATGT-3’，SEQ ID NO.19，
cdtB下游引物：5’-TCTTTTGCTTTTATCTTTACAATT-3’，SEQ ID NO.20。
所述的用于检测艰难梭菌毒素类型的组合物还包括与引物对匹配的探针，与引物对3匹配的探针为：
tcdB探针1：5’-FAM/ATGAGAATTTTGAGGGAGAATCAATAAACTATT/BHQ1-3’，SEQ IDNO.9；
与引物对4匹配的探针为：
tcdB探针2：5’-FAM/TATAAATATAGAATTAAGTGAAAGTGA/BHQ1-3’，SEQ ID NO.12。
与引物对5匹配的探针为：
tcdA探针：5’-FAM/TTTAATTCAGCTACCGCAGAAAACTCTATGTTT/BHQ1-3’，SEQ IDNO.15；
与引物对6匹配的探针为：
cdtA探针：5’-FAM/CTAGTATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCATTTG/BHQ1-3’，SEQ IDNO.18。
与引物对7匹配的探针为：
cdtB探针：5’-FAM/AAGATGGTTTACAAGGCTCAGCAAATAA/BHQ1-3’，SEQ ID NO.21。
引物对3和4及其匹配的探针的靶核酸是艰难梭菌毒素B(tcdB)基因。tcdB基因保守性较差，在各种艰难梭菌菌株间具有较高的突变，引物对3和4分别识别tcdB基因两段保守序列，通过使用引物对3和4能高灵敏度检测有毒艰难梭菌的tcdB基因，减小因基因突变造成的漏检。引物对5及其匹配的探针的靶核酸是艰难梭菌毒素A(tcdA)基因，使用引物对5能高灵敏度检测有毒艰难梭菌的tcdA基因。引物对6及其匹配的探针的靶核酸是编码一种二元毒素的cdtA基因，使用引物对6能高灵敏度检测艰难梭菌二元毒力基因cdtA。引物对7及其匹配的探针的靶核酸是cdtB基因，使用引物对7能高灵敏度检测艰难梭菌二元毒力基因cdtB。
一种用于检测艰难梭菌有无的组合物，为下述引物对中的至少一对：
引物对8：
TPI上游引物：5’-CTAGCTAAACTAGCTCCACCTAC-3’，SEQ ID NO.22，
TPI下游引物：5’-TGCAACTGCTGAAGATGCTAATG-3’，SEQ ID NO.23；
引物对9：
GluD上游引物：5’-GAAGTTGCTGAATCTATAAAAG-3’，SEQ ID NO.25，
GluD下游引物：5’-GCATTAGTTAATATATCTGGAGTA-3’，SEQ ID NO.26；
所述的用于检测艰难梭菌有无的组合物还包括与引物对匹配的探针，与引物对8匹配的探针为：
TPI探针：5’-FAM/AGCTCCATCTATATCACTTTGACCCA/BHQ1-3’，SEQ ID NO.24；
与引物对9匹配的探针为：
GluD探针：5’-FAM/GTTTGTGAGGCTGCTAATGGACCAAC/BHQ1-3’，SEQ ID NO.27。
引物对8及其匹配的探针的靶核酸是看家基因TPI基因。由TPI编码的磷酸丙糖异构酶在无毒艰难梭菌菌株和有毒艰难梭菌菌株中均表达，因此可以通过检测TPI基因特异性检测艰难梭菌，不区分艰难梭菌是产毒素的还是不产毒素。另外，引物对9及其匹配的探针的靶核酸是GluD基因，GluD基因为艰难梭菌保守基因编码谷氨酸脱氢酶(它是一种在艰难梭菌中稳定表达的代谢酶)在无毒艰难梭菌菌株和有毒艰难梭菌菌株中均表达。通过检测GluD基因可降低因致病基因的基因变异所致的错误发生的可能性或假阳性测定的可能性。
一种用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的组合物，包含上述用于检测高毒艰难梭菌的组合物、用于检测有毒艰难梭菌毒力类型的组合物和/或用于检测艰难梭菌有无的组合物。
一种用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的试剂盒，包含上述用于检测高毒艰难梭菌的组合物、用于检测有毒艰难梭菌毒力类型的组合物和/或用于检测艰难梭菌有无的组合物。
所述的试剂盒还包含下述标准品中的一种或多种：核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的TPI标准品，如SEQ ID NO.29所示的GluD标准品，如SEQ ID NO.30所示的tcdA标准品，如SEQ ID NO.31所示的tcdB标准品1，如SEQ ID NO.32所示的tcdB标准品2，如SEQ IDNO.33所示的cdtA标准品，如SEQ ID NO.34所示的cdtB标准品，如SEQ ID NO.35所示的tcdC△117标准品，如SEQ ID NO.36所示的tcdC 117A标准品，如SEQ ID NO.37所示的tcdC117G标准品，如SEQ ID NO.38所示的tcdC 117T标准品，如SEQ ID NO.39所示的tcdC野生型标准品，如SEQ ID NO.40所示的tcdC 18bp缺失标准品，如SEQ ID NO.41所示的tcdC36bp缺失标准品，如SEQ ID NO.42所示的tcdC 39bp缺失标准品，如SEQ ID NO.43所示的tcdC 54bp缺失标准品。
TPI标准品：
TTAGAAATTAACAAGGTCTAGGTAATCATTACTAGCTAAACTAGCTCCACCTACTAAAGCTCCATCTATATCACTTTGACCCATTATTTCGGCTACATTTGAAGGTTTAACACTTCCACCGTATTGTATTCTAACTTCATTAGCTAATTCTCCATATAATCCTTTTATAACTTCTCTTATATAAGATATAACGTCATTAGCATCTTCAGCAGTTGCAGTTTTACCAGTTCCAATAGCCCAGATTGGCTCA，SEQ ID NO.28；
GluD标准品：
CTATAACTAAAGAAGTTGCTGAATCTATAAAAGCTAAATTAGTTTGTGAGGCTGCTAATGGACCAACTACTCCAGAGGCTGATGAAGTATTTGCTGAAAGAGGAATAGTTCTTACTCCAGATATATTAACTAATGCTGGTGGAGTTACAGTTTCTTACTTTGAGTGGGTACAAAACTTATATGGATACTACTGGTCAGAAGAAGAAGTAG，SEQ ID NO.29；
tcdA标准品
CTTACTAACCTAGTAATAGAACAAGTAAAAAATAGATATCAATTTTTAAACCAACACCTTAACCCAGCCATAGAGTCTGATAATAACTTCACAGATACTACTAAAATTTTTCATGATTCATTATTTAATTCAGCTACCGCAGAAAACTCTATGTTTTTAACAAAAATAGCACCATACTTACAAGTAGGTTTTATGCCAGAAGCTCGCTCCACAATAAGTTTAAGTGGTCCAGGAGCTTATGCGTCAGCTT，SEQ ID NO.30；
tcdB标准品1
AGATAAGATGTTCTATTTTGGTGAAGATGGTGTCATGCAGATTGGAGTATTTAATACACCAGATGGATTTAAATACTTTGCACATCAAAATACTTTGGATGAGAATTTTGAGGGAGAATCAATAAACTATACTGGTTGGTTAGATTTAGATGAAAAGAGATATTATTTTACAGATGAATATATTGCAGCAACTGGTTCAGTTATTATTGATGGTGAGGAGTATTATTTTGATCCTGATACAGCTCAATTA，SEQ ID NO.31；
tcdB标准品2
TCTATGGTTCAGGAGGAACTTATGCATTGTCTCTTTCTCAATATAATATGGGTATAAATATAGAATTAAGTGAAAGTGATGTTTGGATTATAGATGTTGATAATGTTGTGAGAGATGTAACTATAGAATCTGATAAAATTAAAAAAGGTGATTTAATAGAAGGTATTTTATCTACA，SEQ ID NO.32；
cdtA标准品
TAACTCTTACTTCCCCTGAATATGATTTTAACAAACTAGAAAATATAGATGCTTTTAAATCAAAATGGGAAGGACAAGCACTGTCTTATCCAAACTTTATTAGTACTAGTATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCATTTGCTAAAAGAAAAATAGTACTACGTATAACTATACCTAAAGGTTCTCCTGGAGCTTATCTATCAGCTATTCCAGGTTATGCAGGTGAATATGAAGTGCTTTTAAATCATGGAAG，SEQ ID NO.33；
cdtB标准品
GATGATTATAATAATTACCCTAGTACATGGAGTAATGTCAATACTACGAATCAAGATGGTTTACAAGGCTCAGCAAATAAATTAAATGGTGAGACGAAGATTAAAATCCCTATGTCTGAGCTAAAACCTTATAAACGTTATGTTTTTAGTGGATATTCAAAGGATCCTTTAACATCTAATTCAATAATTGTAAAGATAAAAGCAAAAGAAGAGAAAACGGATTATTTGGTACCAGAACAAGGATATACAA，SEQ ID NO.34；
tcdC△117标准品
AATTCTTTAAGAGCACAAAGGGTATTGCTCTACTGGCATTTATTTTGGTGTGTTTTTTGGCAATATATCCTCACCAGCTTGTTCTGAAGACCATGAGGAGGTCATTTCTAATCAAACATCAGTTATAGATTCTCAAAAAACAGAAATAGAAACTTTAAATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCATGGTTCAA，SEQ ID NO.35；
tcdC 117A标准品
AATTCTTTAAGAGCACAAAGGGTATTGCTCTACTGGCATTTATTTTAGGTGTGTTTTTTGGCAATATATCCTCACCAGCTTGTTCTGAAGACCATGAGGAGGTCATTTCTAATCAAACATCAGTTATAGATTCTCAAAAAACAGAAATAGAAACTTTAAATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCATGGTTCAA，SEQ ID NO.36；
tcdC 117G标准品
AATTCTTTAAGAGCACAAAGGGTATTGCTCTACTGGCATTTATTTTGGGTGTGTTTTTTGGCAATATATCCTCACCAGCTTGTTCTGAAGACCATGAGGAGGTCATTTCTAATCAAACATCAGTTATAGATTCTCAAAAAACAGAAATAGAAACTTTAAATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCATGGTTCAA，SEQ ID NO.37；
tcdC 117T标准品
AATTCTTTAAGAGCACAAAGGGTATTGCTCTACTGGCATTTATTTTTGGTGTGTTTTTTGGCAATATATCCTCACCAGCTTGTTCTGAAGACCATGAGGAGGTCATTTCTAATCAAACATCAGTTATAGATTCTCAAAAAACAGAAATAGAAACTTTAAATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCATGGTTCAA，SEQ ID NO.38；
tcdC野生型标准品
AAATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCATGGTTCAAAATGAAAGACGACGAAAAGAAAGCTATTGAAGCTGAAAATCAACGTAAAGCTGAAGAAGCTAAAAAAGCTGAAGAAGCTAAAAAGGCTGAAGAACAACGTAAAAAAGAAGAAGAAGAGAAGAAAGGATATGATACTGGTATTACTTATGACCAATTAGCTAGAACACCTGATGAT，SEQ ID NO.39；
tcdC 18bp缺失标准品
AAATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCATGGTTCAAAATGAAAGACGACGAAAAGAAAGCTATTGAAGCTGAAAATCAACGTAAAGCTGAAGAAGCTAAAAAGGCTGAAGAACAACGTAAAAAAGAAGAAGAAGAGAAGAAAGGATATGATACTGGTATTACTTATGACCAATTAGCTAGAACACCTGATGAT，SEQ ID NO.40；
tcdC 36bp缺失标准品
AAATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCATGGTTCAAAATGAAAGACGACGAAAAGAAAGCTATTGAAGCTGAAGAAGCTAAAAAGGCTGAAGAACAACGTAAAAAAGAAGAAGAAGAGAAGAAAGGATATGATACTGGTATTACTTATGACCAATTAGCTAGAACACCTGATGAT，SEQ ID NO.41；
tcdC 39bp缺失标准品
AAATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCATGGTTCAAAATGAAAGACGACGAAAAGAAAGCTATTGAAGCTGAAGAAGCTAAAAAGGCTGAAGAACGTAAAAAAGAAGAAGAAGAGAAGAAAGGATATGATACTGGTATTACTTATGACCAATTAGCTAGAACACCTGATGAT，SEQ ID NO.42；
tcdC 54bp缺失标准品
AAATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCATGGTTCAAAATGAAAGACGACGAAAAGAAAGCTATTGAAGCTGAAAATCAACGTAAAAAAGAAGAAGAAGAGAAGAAAGGATATGATACTGGTATTACTTATGACCAATTAGCTAGAACACCTGATGAT，SEQ ID NO.43。
所述的TPI标准品或GluD标准品、tcdA标准品、tcdB标准品1或tcdB标准品2、cdtA标准品、cdtB标准品、tcdC△117标准品、tcdC野生型标准品分别作为检测艰难梭菌、tcdA基因、tcdB基因、cdtA基因、cdtB基因、tcdC△117、tcdC野生型基因(相对于tcdC 18△)的阳性对照品；tcdC 117A标准品、tcdC 117T标准品和tcdC 117G标准品混合物作为tcdC△117基因的阴性对照品；tcdC 18bp缺失标准品、tcdC 36bp缺失标准品、tcdC 39bp缺失标准品和tcdC 54bp缺失标准品混合物作为tcdC野生型基因的阴性对照品；其它基因的阴性对照品用生理盐水。用引物对1扩增tcdC基因117位点四种SNP标准品的结果见图4，该引物对能特异性检测tcdC117位点缺失，不能检测117A、117C、117G三种SNP。用引物对2扩增tcdC基因野生型、18bp缺失、36bp缺失、54bp缺失标准品的结果见图5。
所述的试剂盒还包含内控E.coil标准品：
E.coil标准品
TGTTATTGCCGGGAAAAGTGTACGTATCACTGTTTGTGTGAACAACGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGACGAAAACGGCAAGAAAAAGCAGTCTTACTTTCATGATTTCTTTAACTACGCCGGGATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACCACGCCGAACACCTGGGTGGACGATAT，SEQ ID NO.44；
扩增该标准品的引物对为引物对10：
E.coil上游引物：5’-TCTTACCCTAGTACATGGAGTAATGTTG-3’，SEQ ID NO.45，
E.coil下游引物：5’-GCATGTTCTGGTACCAAATAATCCGTGA-3’，SEQ ID NO.46；
与该引物对匹配的探针为：
E.coil探针：5’-HEX/CGGGAATGGTGATTACCGACGAAAACG/BHQ1-3’，SEQ ID NO.47。
用上述引物对扩增的PCR产物的尺寸均在40bp至200bp(图6)的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性检测高毒艰难梭菌菌株。上述探针可选用下述任一荧光标记物在其5'端标记：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXAS RED、RED670、NED，选用下述任一猝灭剂在其3'端标记：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非突光粹灭剂(MinorGroove Binder nonf luorescent quencher,MGBNFQ)；其中，内控E.coil探针与其它引物对所匹配探针5'端的荧光标记物不同。
一种用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的荧光定量PCR方法，包括如下步骤：在检测体系中加入待检样本DNA、所检测基因对应的引物和探针、扩增内控的引物和探针、PCR反应试剂等进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量PCR的结果分析艰难梭菌高毒菌株与毒力类型；或在检测体系中加入待检样本DNA、所检测基因对应的引物、扩增内控的引物、PCR反应试剂、荧光嵌入剂等进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量PCR的结果分析艰难梭菌高毒菌株与毒力类型。荧光嵌入剂是能够与双链DNA结合而发出荧光的试剂，包括SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR Gold、噁唑黄、噻唑橙、溴化乙锭、PICO GREEN等。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明中检测的TPI或GluD基因为艰难梭菌特异性保守基因，对TPI或GluD基因的检测可以准确检测到艰难梭菌是否存在；
(2)本发明中检测的tcdA或tcdB毒力基因，有益于辨别艰难梭菌是否为致病菌株；
(3)本发明中检测的cdtA或cdtB基因用来判断艰难梭菌的毒性程度，二元毒素cdtA、cdtB基因可独立致病或增强tcdB毒素的毒力；
(4)本发明中实时定量PCR检测的tcdC突变包括117位点缺失、18bp缺失、36bp缺失、39bp缺失、54bp缺失等以判断高毒艰难梭菌。
附图说明
图1是艰难梭菌tcdC基因117位点缺失与tcdC基因野生型、18bp缺失、36bp缺失、39bp缺失、54bp缺失示意图。
图2是艰难梭菌tcdC基因117位点四种单核苷酸多态性序列比对结果图，tcdC基因117位点存在117缺失、117A、117C、117G四种多态性，“-”代表核苷酸缺失。
图3是艰难梭菌tcdC基因野生型、18bp缺失、36bp缺失、39bp缺失、54bp缺失四种核苷酸序列比对结果图，“-”代表核苷酸缺失。
图4是使用引物对1分别扩增tcdC基因117位点四种SNP标准品的凝胶电泳结果图，该引物对能特异性检测tcdC117位点缺失，不能检测117A、117C、117G三种SNP，所扩增△117的条带为164bp。
图5是使用引物对2分别扩增tcdC基因野生型、18bp缺失、36bp缺失、54bp缺失标准品的凝胶电泳结果图，所扩增条带分别为200bp、182bp、164bp、146bp。
图6是使用本发明所述引物对扩增TPI标准品、tcdA标准品、tcdB标准品、cdtA标准品、cdtB标准品的凝胶电泳结果图，TPI大小为186bp，tcdA大小为165bp，tcdB大小为174bp，cdtA大小为129bp，cdtB大小为199bp。
图7实施例1中使用tcdC基因117位点缺失的检测引物和探针检测tcdC基因117位点的扩增结果图，横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度。
图8实施例1中使用tcdC 18△的检测引物和探针检测tcdC基因18△的扩增结果图，横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度。
图9是实施例1中使用TPI基因、GluD基因的检测引物和探针检测100-103拷贝含TPI和GluD标准品的混合质粒的扩增结果图；扩增结果为同时检测TPI基因与GluD基因的荧光信号，横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度。
图10是实施例1中使用tcdA基因的检测引物和探针检测100-103拷贝含tcdA标准品的阳性质粒的扩增结果图，横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度。
图11是实施例1中使用两种tcdB基因的检测引物和探针检测100-103拷贝含tcdB标准品1和2的混合质粒的扩增结果图，横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度。
图12是实施例1中使用cdtA基因的检测引物和探针检测100-103拷贝含cdtA标准品的阳性质粒的扩增结果图，横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度。
图13是实施例1中使用cdtB基因的检测引物和探针检测100-103拷贝含cdtB标准品的阳性质粒的扩增结果图，横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度。
图14是实施例1中使用tcdC基因117位点缺失的检测引物和探针检测100-103拷贝含tcdC△117标准品的阳性质粒的扩增结果图，横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度。
图15是实施例1中使用tcdC 18△的检测引物和探针检测100-103拷贝含tcdC野生型标准品的阳性质粒的扩增结果图，横坐标表示循环次数，纵坐标表示荧光强度。
具体实施方式
本发明实施方案可具有不同的形式，而不能理解为本发明限定于此范围。结合具体实施案例对本发明进行描述，仅是为了便于理解本发明的方方面面。
实施例1.敏感性检测
1.材料和仪器
pUC57质粒(购自金斯瑞生物技术有限公司)、dNTPs(购自TaKaRa公司)、Taq酶(购自TaKaRa公司)、10×PCR缓冲液(购自TaKaRa公司)、Bio-Rad PCR仪、ABI 3500PCR仪等。
2.引物与探针的设计与合成
以艰难梭菌的TPI基因、GluD基因、tcdA基因、tcdB基因、cdtA基因、cdtB基因、tcdC基因高毒突变(包括117位点缺失、18bp缺失、36bp缺失、39bp缺失、54bp缺失)为靶标，设计特异性的引物和Taqman(包括MGBNFQ修饰)探针。
其中，tcdC基因117位点缺失的检测引物和探针为：
tcdC△117上游引物：5’-TTGCTCTACTGGCATTTATTTGG-3’，SEQ ID NO.1，
tcdC△117下游引物：5’-ACCATGGTTCAGCATCAGACAA-3’，SEQ ID NO.2，
tcdC△117探针：5’-FAM/GAAGCTAAAAAGGCTGAAGAACAA/BHQ1-3’，SEQ ID NO.3。
tcdC 18△(包括18bp、36bp、39bp、54bp缺失)的检测引物和探针为：
tcdC上游引物：5’-AGCAAATTGTCTGATGCTGAACC-3’，SEQ ID NO.4，
tcdC下游引物：5’-TCAGGTGTTCTAGCTAATTGGTCA-3’，SEQ ID NO.5，
tcdC探针：5’-FAM/AGCTAAAAAAGCTGAAGAAGC/MGBNFQ-3’，SEQ ID NO.6；
tcdC基因18bp缺失、36bp缺失、39bp缺失、54bp缺失序列设计了一对引物以及匹配的探针，探针能结合野生型tcdC基因而与tcdC基因缺失不结合。
tcdB基因的检测引物和探针为：
tcdB上游引物1：5’-TGGTGTCATGCAGATTGGAGT-3’，SEQ ID NO.7，
tcdB下游引物1：5’-ACTGAACCAGTTGCTGCAATA-3’，SEQ ID NO.8，
tcdB探针1：5’-FAM/ATGAGAATTTTGAGGGAGAATCAATAAACTATT/BHQ1，SEQ ID NO.9；
tcdB上游引物2：5’-TGGTTCAGGAGGAACTTATGC-3’，SEQ ID NO.10，
tcdB下游引物2：5’-ATTTAATAGAAGGTATTTTATC-3’，SEQ ID NO.11，
tcdB探针2：5’-FAM/TATAAATATAGAATTAAGTGAAAGTGA/BHQ1-3’，SEQ ID NO.12；
因为tcdB基因突变率高，所以设计两对引物与匹配探针以避免漏检。
tcdA基因的检测引物和探针为：
tcdA上游引物：5’-CCAACACCTTAACCCAGCCA-3’，SEQ ID NO.13，
tcdA下游引物：5’-ATTGTGGAGCGAGCTTCTGG-3’，SEQ ID NO.14，
tcdA探针：5’-FAM/TTTAATTCAGCTACCGCAGAAAACTCTATGTTT/BHQ1-3’，SEQ IDNO.15。
cdtA基因的检测引物和探针为：
cdtA上游引物：5’-GGGAAGGACAAGCACTGTCTTA-3’，SEQ ID NO.16；
cdtA下游引物：5’-GATAAGCTCCAGGAGAACCTTT-3’，SEQ ID NO.17；
cdtA探针：5’-FAM/CTAGTATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCATTTG/BHQ1-3’，SEQ IDNO.18。
cdtB基因的检测引物和探针为：
cdtB上游引物：5’-TTACCCTAGTACATGGAGTAATGT-3’，SEQ ID NO.19，
cdtB下游引物：5’-TCTTTTGCTTTTATCTTTACAATT-3’，SEQ ID NO.20，
cdtB探针：5’-FAM/AAGATGGTTTACAAGGCTCAGCAAATAA/BHQ1-3’，SEQ ID NO.21。
TPI基因、GluD基因的检测引物和探针为：
TPI上游引物：5’-CTAGCTAAACTAGCTCCACCTAC-3’，SEQ ID NO.22，
TPI下游引物：5’-TGCAACTGCTGAAGATGCTAATG-3’，SEQ ID NO.23，
TPI探针：5’-FAM/AGCTCCATCTATATCACTTTGACCCA/BHQ1，SEQ ID NO.24；
GluD上游引物：5’-GAAGTTGCTGAATCTATAAAAG-3’，SEQ ID NO.25，
GluD下游引物：5’-GCATTAGTTAATATATCTGGAGTA-3’，SEQ ID NO.26，
GluD探针：5’-FAM/GTTTGTGAGGCTGCTAATGGACCAAC/BHQ1-3’，SEQ ID NO.27；
TPI与GluD基因为艰难梭菌保守基因，同时检测TPI与GluD基因以避免漏检。
以上引物与探针由南京金斯瑞生物技术公司合成、纯化。
3.阳性质粒合成
以艰难梭菌标准菌株ATCC43598、包含二元毒力基因、tcdC基因突变菌株为模板，由南京金斯瑞生物技术公司合成如发明内容所述的各标准品。
将各标准品分别连接到pUC57载体，并测序校对，得到各标准品阳性质粒。
4.阳性质粒稀释
将合成的阳性质粒约100ng/μL(每微升含有3×1010拷贝DNA)，将质粒分别稀释为103、102、101、100拷贝/微升，以上述稀释后质粒为模板，检测扩增体系灵敏度。
5.加样体系
组分 体积
反应混合液 35μL
Taq酶 1μL
阳性质粒 4μL
ddH2O 补足到40μL
其中，反应混合液包括8μL 10×PCR缓冲液，dNTPs 0.8mmol，上下游引物各0.8μmol，探针0.6μmol。检测TPI、GluD的体系中同时加入TPI上游引物、TPI下游引物，GluD上游引物、GluD下游引物，TPI探针，GluD探针；阳性质粒为含有TPI标准品和GluD标准品的混合质粒。检测tcdB的体系中同时加入tcdB上游引物1、tcdB下游引物1，tcdB上游引物2、tcdB下游引物2，tcdB探针1，tcdB探针2；阳性质粒为含有cdB标准品1和cdB标准品2的混合质粒。
扩增各组分组合关系
6.扩增程序
荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、58℃30s，10个循环；第三阶段：94℃20s、58℃30s，40个循环，收集FAM信号。以FAM达到设定的阈值所需的循环数Ct作为判断标准，且呈现S型扩增曲线为阳性，否则为阴性。tcdC△117位点缺失的检测结果见图7。若tcdC 18△的FAM信号为阳性，表示tcdC野生型，即tcdC 18△为阴性；反之，若tcdC 18△的FAM信号为阴性，表示tcdC 18bp、36bp、39bp或54bp缺失，即tcdC18△为阳性(见图8)。
7.扩增结果
检测结果参见图9-15，以上扩增组合均最低检出1拷贝/μL，检测灵敏度高。
实施例2：特异性检测
1.菌株
菌株及编号见下表：
菌株 编号 菌株 编号
艰难梭菌1 ATCC BAA1804 艰难梭菌2 ATCC43598
艰难梭菌3 ATCC9689 艰难梭菌4 ATCC BAA1805
大肠埃希氏菌 ATCC8739 枯草芽孢杆菌 ATCC6633
福氏志贺氏菌 CMCC44149 致病性大肠杆菌 CMCC44149
产气肠杆菌 ATCC13048 痢疾致贺氏菌 CMCC51105
痢疾志贺菌 CMCC51105 阴沟肠杆菌 CMCC45301
产毒大肠杆菌 CMCC44814 鼠伤寒沙门氏菌 CMCC50013
创伤枯菌 CICC10383 金黄色葡萄球菌 ATCC25923
出血性大肠杆菌 ATCC12900 阪崎肠杆菌 ATCC29544
其中，艰难梭菌1-3(ATCC BAA1804、ATCC43598、ATCC9689)为tcdA、tcdB阳性；艰难梭菌4(ATCC BAA1805)为tcdA、tcdB、cdtA、cdtB阳性并含有tcdC△117缺失。
2.菌培养
所有的菌株在培养基中于37℃培24h至48h。
3.使用天根粪便基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，具体操作如下：
1)取200μL菌液至2mL离心管中，并将管子置于冰上。
2)向样本中加入1.4mL缓冲液ASL，间歇振荡1分钟至样本混匀。
3)70℃孵育5分钟；
4)涡旋15秒，13000rpm离心1分钟，转移上清液1.2mL至新的2mL离心管。
5)加入一个抑制剂吸附片Inhibit EX，振荡至吸附片彻底打开重悬，室温孵育1分钟，使吸附片能充分作用。
6)13000rpm离心3分钟。
7)将上一步所得上清液转移至新的1.5mL离心管，重复步骤6)。
8)转移所得上清液200μL至新的1.5mL离心管，加入15μL蛋白酶K。
9)加入200μL缓冲液AL，涡旋15秒。
10)70℃孵育10分钟。
11)加入200μL无水乙醇，涡旋混匀。
12)将上一步所得溶液加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
13)向吸附柱中加入500μL缓冲液AW1，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸柱放入收EP管中。
14)向吸附柱中入700μL漂洗液AW2，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸柱放入收EP管。
15)将吸柱放入收EP管，12000rpm(～13400×g)离心2分钟，倒掉废液，吸附柱置于室温放置数分钟，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗。
16)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液AE，室温放置2-5分钟，12000rpm(～13400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
4.加样体系
组分 体积
反应混合液 35μL
Taq酶 1μL
基因DNA 4μL
ddH2O 补足到40μL
其中，反应混合液包括8μL 10×PCR缓冲液，dNTPs 0.8mmol，上下游引物各0.8μmol，探针0.6μmol。体系中的引物与探针同实施例1，检测TPI、GluD的体系中同时加入TPI上游引物、TPI下游引物，GluD上游引物、GluD下游引物，TPI探针，GluD探针；检测tcdB的体系中同时加入tcdB上游引物1、tcdB下游引物1，tcdB上游引物2、tcdB下游引物2，tcdB探针1，tcdB探针2。
5.扩增程序
荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、58℃30s，10个循环；第三阶段：94℃20s、58℃30s，40个循环，收集FAM信号。以FAM达到设定的阈值所需的循环数Ct作为判断标准，且呈现S型扩增曲线为阳性，否则为阴性。在TPI(GluD)为阳性的前提下，若tcdC 18△的FAM信号为阳性，表示tcdC野生型，即tcdC18△为阴性；反之，若tcdC 18△的FAM信号为阴性，表示tcdC 18bp、36bp、39bp或54bp缺失，即tcdC 18△为阳性。
检测结果见下表：
检测结果与菌种培养、细胞毒力实验(参见J Clin Microbiol.2013Nov；51(11):3624–3630.Correlation between Clostridium difficile bacterial load,commercialreal-time PCR cycle thresholds,and results of diagnostic tests based onenzyme immunoassay and cell culture cytotoxicity assay.)检测结果一致，将扩增产物切胶后进行测序验证，与公开序列的同源性达到100％。
实施例3：实时荧光PCR法检测临床粪便样本
1.标本来源
从湖北省肿瘤医院采集48例粪便中，将利用CCFA选择培养法确认分离了艰难梭菌的8个检体的粪便DNA用于本实施例。CCFA选择培养法具体过程如下：肛拭标本采用98％乙醇等体积混合30分钟至1小时，将混合液0.1mL接种于环丝氨酸头孢西丁甘露醇琼脂培养基，将本培养基置于35℃厌氧培养24小时将冻结便融解后，悬浮于9倍容量的厌氧输送培养基。对于在培养基上检测到的菌落，从性状和革兰氏染色性来确定艰难梭菌。
2.使用天根粪便基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA
称取粪便标本200mg至2mL离心管中，并将管子置于冰上，其余步骤同实施例2。
3.加样体系
组分 体积
反应混合液 35μL
Taq酶 1μL
基因DNA 4μL
ddH2O 补足到40μL
其中，反应混合液包括8μL 10×PCR缓冲液，dNTPs 0.8mmol，所检测基因上下游引物、E.coil上下游引物各0.8μmol，引物匹配的探针各0.6μmol。E.coil上下游引物如下：
E.coil上游引物：5’-TCTTACCCTAGTACATGGAGTAATGTTG-3’，SEQ ID NO.45，
E.coil下游引物：5’-GCATGTTCTGGTACCAAATAATCCGTGA-3’，SEQ ID NO.46，
E.coil探针：5’-HEX/CGGGAATGGTGATTACCGACGAAAACG/BHQ1-3’，SEQ ID NO.47。
体系中的其他引物与探针同实施例1，检测TPI、GluD的体系中同时加入TPI上游引物、TPI下游引物，GluD上游引物、GluD下游引物，TPI探针，GluD探针；检测tcdB的体系中同时加入tcdB上游引物1、tcdB下游引物1，tcdB上游引物2、tcdB下游引物2，tcdB探针1，tcdB探针2。
4.扩增程序
荧光定量PCRPCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、58℃30s，10个循环；第三阶段：94℃20s、58℃30s，40个循环，收集FAM和HEX信号。
5.阳性判断
以E.coil作为内控同时同条件下进行荧光定量PCR，以HEX达到设定的阈值所需的循环数Ct作为判断标准，且呈现S型扩增曲线为阳性，否则为阴性。
利用实施例1中的引物检测目的基因，通过反应体系的FAM/HEX的荧光强度来判断检测结果；HEX是内控信号，用于检测上样的DNA量是否在允许范围内或者有无上样，HEX信号应达到设定阈值(Ct值为25±5)；FAM是检测信号，用于检测目的基因或突变类型；TPI(GluD)、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB与tcdC△117位点缺失的检测依据FAM信号，当内控信号满足要求后，以FAM达到设定的阈值所需的循环数Ct作为判断标准，且呈现S型扩增曲线为阳性，否则为阴性。在TPI(GluD)为阳性的前提下，若tcdC 18△的FAM信号为阳性，表示tcdC野生型，即tcdC 18△为阴性；反之，若tcdC 18△的FAM信号为阴性，表示tcdC 18bp、36bp、39bp或54bp缺失，即tcdC 18△为阳性。
检测结果见下表：
检测结果与菌种培养、细胞毒力实验检测结果一致，将扩增产物切胶后进行测序验证，与公开序列的同源性达到100％。

Claims (6)

1.一种用于检测高毒艰难梭菌的组合物，其特征在于：包含下述引物对：
引物对1：
tcdC△117上游引物：5’-TTGCTCTACTGGCATTTATTTGG-3’，
tcdC△117下游引物：5’-ACCATGGTTCAGCATCAGACAA-3’；
引物对2：
tcdC上游引物：5’-AGCAAATTGTCTGATGCTGAACC-3’，
tcdC下游引物：5’-TCAGGTGTTCTAGCTAATTGGTCA-3’；
引物对3：
tcdB上游引物1：5’-TGGTGTCATGCAGATTGGAGT-3’，
tcdB下游引物1：5’-ACTGAACCAGTTGCTGCAATA-3’；
引物对4：
tcdB上游引物2：5’-TGGTTCAGGAGGAACTTATGC-3’，
tcdB下游引物2：5’-ATTTAATAGAAGGTATTTTATC-3’；
引物对5：
tcdA上游引物：5’-CCAACACCTTAACCCAGCCA-3’，
tcdA下游引物：5’-ATTGTGGAGCGAGCTTCTGG-3’；
引物对6：
cdtA上游引物：5’-GGGAAGGACAAGCACTGTCTTA-3’，
cdtA下游引物：5’-GATAAGCTCCAGGAGAACCTTT-3’；
引物对7：
cdtB上游引物：5’-TTACCCTAGTACATGGAGTAATGT-3’，
cdtB下游引物：5’-TCTTTTGCTTTTATCTTTACAATT-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测高毒艰难梭菌的组合物，其特征在于：还包括与所述引物对匹配的探针，
与引物对1匹配的探针为：
tcdC△117探针：5’-荧光标记物/GAAGCTAAAAAGGCTGAAGAACAA/猝灭剂-3’；
与引物对2匹配的探针为：
tcdC探针：5’-荧光标记物/AGCTAAAAAAGCTGAAGAAGC/猝灭剂-3’；
与引物对3匹配的探针为：
tcdB探针1：5’-荧光标记物/ATGAGAATTTTGAGGGAGAATCAATAAACTATT/猝灭剂-3’；
与引物对4匹配的探针为：
tcdB探针2：5’-荧光标记物/TATAAATATAGAATTAAGTGAAAGTGA/猝灭剂-3’；
与引物对5匹配的探针为：
tcdA探针：5’-荧光标记物/TTTAATTCAGCTACCGCAGAAAACTCTATGTTT/猝灭剂-3’；
与引物对6匹配的探针为：
cdtA探针：5’-荧光标记物/CTAGTATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCATTTG/猝灭剂-3’；
与引物对7匹配的探针为：
cdtB探针：5’-荧光标记物/AAGATGGTTTACAAGGCTCAGCAAATAA/猝灭剂-3’。
3.一种用于检测高毒艰难梭菌的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的组合物。
4.一种用于检测高毒艰难梭菌的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的组合物和下述标准品中的一种或多种：如SEQ ID NO.30所示的tcdA标准品，如SEQ ID NO.31所示的tcdB标准品1，如SEQ ID NO.32所示的tcdB标准品2，如SEQ ID NO.33所示的cdtA标准品，如SEQ ID NO.34所示的cdtB标准品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包含核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示的内控E.coil标准品；扩增该E.coil标准品的引物对为：
E.coil上游引物：5’-TCTTACCCTAGTACATGGAGTAATGTTG-3’，
E.coil下游引物：5’-GCATGTTCTGGTACCAAATAATCCGTGA-3’；
与该引物对匹配的探针为：
E.coil探针：5’-荧光标记物/CGGGAATGGTGATTACCGACGAAAACG/猝灭剂-3’。
6.一种用于权利要求4或5所述的试剂盒检测高毒艰难梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于包括如下步骤：在检测体系中加入待检样本DNA、所检测基因对应的引物和探针、扩增内控的引物和探针、PCR反应试剂进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量PCR的结果分析艰难梭菌毒力类型；或在检测体系中加入待检样本DNA、所检测基因对应的引物、扩增内控的引物、PCR反应试剂、荧光嵌入剂进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量PCR的结果分析所检测艰难梭菌是否为高毒艰难梭菌；所述的方法为非疾病诊断的目的。
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CN103361434A (zh) * 2013-07-24 2013-10-23 浙江省疾病预防控制中心 艰难梭菌毒素基因多重荧光pcr检测试剂盒及检测方法

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