CN104232783B

CN104232783B - 牛种布氏菌弱毒疫苗株a19的快速检测方法

Info

Publication number: CN104232783B
Application number: CN201410521587.0A
Authority: CN
Inventors: 陈义平; 南文龙; 谭鹏飞; 巩明霞; 张风霞; 张悦勇
Original assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2034-09-30
Also published as: CN104232783A

Abstract

本发明的目的在于提供一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组，引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-3。本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：在1.5h的时间里，即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为4.0×10^-5ng/μl；2)特异性强：采用Cycling标记的荧光探针，特异性针对A19基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号；3)操作简便：配置好的Cycleave PCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定；4)高通量：根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现48～384个样品的检测。

Description

牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的快速检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的Cycleave PCR快速检测方法。

背景技术

布氏菌病(简称“布病”)是由布氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病，不仅给畜牧业造成严重的经济损失，并威胁人类健康。弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段，但弱毒疫苗的使用往往对布病的诊断和监测造成干扰。实现布氏菌弱毒疫苗与野生菌株的鉴别，对于布病防控工作具有重要现实意义。

A19株是我国目前在用的布氏菌弱毒疫苗株之一，其鉴别包括血清抗体和病原检测两个方面。A19为光滑型菌株，其LPS含有O-侧链，能刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力，但也使常规血清学检测方法难以区分疫苗免疫与自然感染。病原分离鉴定，所需营养条件复杂，分离培养需在P2级以上生物安全实验室进行，且难以区分A19与同生物型的其它菌株，限制其广泛应用。

近年，Real-time PCR技术发展迅速，其检测特异、敏感、操作简便，为A19的鉴别提供了新技术手段。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形态，SNP位点广泛的应用于细菌耐药性基因、细菌分种分型、病毒分型等鉴别检测中。基于Cycling荧光探针的Cycleave PCR方法可以区分SNP位点的差异，其检测具有特异、敏感、快速以及荧光背景低、信噪比高等优势。目前，还没有有效的基于Cycling探针鉴别A19的Cycleave PCR扩增引物。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的Cycleave PCR快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组，引物信息如下：

ATT-F:CCAGAATGCGAACGGAGATG(SEQ ID NO:1)

ATT-R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG(SEQ ID NO:2)

ATT-P:GCTCACGGA(SEQ ID NO:3)

其中ATT-P的5′端用FAM进行标记；3′端用Eclipse进行标记。

本发明还提供一种利用上述的Cycleave PCR引物组检测A19的方法，包括有如下的步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA；

2)Cycleave PCR步骤：根据本发明设计A19的Cycleave PCR引物组，加入反应体系中各组分。反应程序：95℃30s；95℃5s，55℃10s，72℃20s，在72℃进行FAM荧光信号采集，进行40个循环。

3)结果检测：根据荧光扩增曲线情况，判定检测结果。

另一方面，本发明的Cycleave PCR引物组可用于制备检测试剂盒。

本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：在1.5h的时间里，即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为4.0×10^-5ng/μl；2)特异性强：采用Cycling标记的荧光探针，特异性针对A19基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号；3)操作简便：配置好的Cycleave PCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定；4)高通量：根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现48～384个样品的检测。

附图说明

图1：阳性结果荧光扩增曲线图，其中：曲线1.阳性对照，即A19基因组的荧光扩增曲线；曲线2.阴性对照，即水的荧光扩增曲线。

图2：Cycleave PCR方法检测A19基因组DNA的灵敏度检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1-8.A19基因组DNA的质量浓度分别为40ng/μl，4ng/μl，4.0×10^-1ng/μl，4.0×10^-2ng/μl，4.0×10^-3ng/μl，4.0×10^-4ng/μl，4.0×10^-5ng/μl，4.0×10^-6ng/μl；曲线9.阴性对照。

图3：Cycleave PCR方法检测A19基因组DNA的特异性检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1,Brucella suis biovar 1 S1330；曲线2,B.suis biovar 2Thomsen；曲线3,B.suis biovar 3 686；曲线4,B.suis biovar 4 40；曲线5,B.abortus biovar 1 A544；曲线6,B.abortus biovar 2 86/8/59；曲线7,B.abortus biovar 3 Tulya；曲线8,B.abortus biovar 4 292；曲线9,B.abortus biovar 5B3196；曲线10,B.abortus biovar 6 870；曲线11,B.abortus biovar 7 63/75；曲线12,B.abortus biovar 9C68；曲线13,B.melitensis biovar 1 16M；曲线14,B.melitensis biovar 2 63/9；曲线15,B.melitensis biovar 3 Ether；曲线16,B.ovis 63/290；曲线17,B.canis RM6/66；曲线18,B.neotomae 5K33；曲线19,S2；曲线20,104M；曲线21,M5-90；曲线22，Escherichia coli K99；曲线23，Pasteurella multocida C48-1；曲线24，Streptococcus suis ST171；曲线25，Pseudomonas aeruginosa DI-1；曲线26,阳性对照；曲线；27，阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

一、用于检测A19的Cycleave PCR引物组的设计

牛种布鲁氏菌A19株于1923年由美国自牛奶中分离，经实验室自然传代减毒后，成为一株毒力稳定的弱毒菌株，是我国在用的布氏菌弱毒疫苗株之一。S19是在A19的基础上筛选出的赤藓糖醇敏感株，两者基因组比较，S19较A19存在Ery基因缺失，而我国目前未推广S19株弱毒疫苗。本发明首先根据GeneBank中公布的S19全基因组序列，经与GeneBank中其它布氏菌株全基因组序列BLAST比对，分析获得S19SNP位点，再测序鉴定A19基因组中对应S19SNP位点处的核苷酸序列。之后，选择经鉴定存在的A19SNP位点，与我国布氏菌地方流行株和常用布氏菌弱毒疫苗株相应SNP处核苷酸序列测序比较，验证该SNP的A19特异性。经上述筛选，本发明获得Att基因上一处A19特异的SNP位点。

本发明依据Att基因上A19特异的SNP位点，在其两翼用 PCR Assay Designer软件进行引物与探针设计。设计合适的引物是进行PCR反应的关键，通过考虑碱基组成、GC含量、二级结构的形成、Tm值等因素来设计检测A19的Cycleave PCR反应的引物及探针。其中，引物用于扩增Att片段基因，探针用于检测该Att片段基因中SNP位点存在与否。用上述引物及探针进行检测时，当布氏菌基因组DNA中，存在SNP位点时，扩增后出现荧光扩增曲线，可判定该模板来源于A19株；当布氏菌基因组DNA中不含SNP位点或模板本身为非布氏菌时，扩增后不出现荧光扩增曲线。引物及探针由大连宝生物工程有限公司合成。引物及探针如表1所示：

表1：A19的Cycleave PCR引物及探针

注：下划线标记为SNP位置

二、牛种布氏菌弱毒疫苗株A19Cycleave PCR的效果检测

1.1试验材料

菌株：使用的布氏菌常见种、生物型参考株及布氏菌疫苗株，见表1；四个非布氏菌参考菌株：大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌DI-1。

表2：使用的布氏菌株及登录号

1.2细菌DNA提取

将上述菌株菌种接种胰蛋白琼脂培养基，37℃培养24—72h，根据需要不添加或添加5—10％CO₂。培养菌落用0.5％甲醛的生理盐水洗涤后，37℃灭活24h，用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA，微量核酸蛋白测定仪测定细菌基因组DNA浓度，冻存于-20℃，备用，作为Cycleave PCR扩增模板。

1.3Cycleave PCR反应体系及条件

反应体系为：

反应条件：95℃预变性30s，；95℃5s，55℃10s，72℃20s，在72℃进行FAM荧光信号采集，进行40个循环。

1.4Cycleave PCR方法的灵敏度评价

灵敏度评价：经超微量核酸蛋白测定仪测得布氏菌A19株基因组DNA的浓度为40.0ng/μl。首先将质量浓度为40.0ng/μl的细菌基因组DNA进行10倍系列梯度稀释，再依次取1μl作模板，进行Cycleave PCR扩增。根据图像判定结果，扩增曲线有明显对数增长期，且Ct值≤37，为A19检测阳性；扩增曲线无对数增长期或Ct值>37，为A19检测阴性。以无菌水代替细菌DNA模板作为阴性对照。

1.5Cycleave PCR方法的特异性评价

特异性评价：分别提取布氏菌常见种、生物型参考株与布氏菌疫苗株(见表2，编号1-23)以及大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌DI-1的基因组DNA。用所建立的布氏菌A19株Cycleave PCR检测体系进行特异性试验。以无菌水代替细菌DNA模板作为阴性对照。

2结果与分析

2.1以A19基因组DNA为模板，Cycleave PCR后出现典型扩增曲线(含明显对数增长期)，且Ct值≤37；而以无菌水代替细菌DNA模板，Cycleave PCR后未出现扩增信号，无Ct值。

2.2Cycleave PCR灵敏度检测结果

图2的荧光曲线扩增结果显示这个方法的最低检出限为4.0×10^-5ng/μl基因组DNA模板。

2.3Cycleave PCR特异性检测结果

用本试验中建立的布氏菌A19株Cycleave PCR检测体系，可以检测出A19株，而检测不到其它常见种、生物型布氏菌与疫苗株，以及大肠杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、绿脓杆菌，如图3所示。说明引物具有特异性，可作为我国布氏菌A19株的检测引物。

上述结果表明本发明的布氏菌A19株Cycleave PCR引物及检测方法检测灵敏度高、特异性好，通过单次检测即可快速、有效的鉴别检测样品是否为布氏菌A19株。操作简便，在荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时，可以实现样品的高通量检测。

Claims

1.一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组，其特征在于，所述的引物组的序列信息如下：

ATT-F:CCAGAATGCGAACGGAGATG、

ATT-R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG、

ATT-P:GCTCACGGA；

所述的ATT-P的5′端用FAM进行标记；3′端用Eclipse进行标记。

2.权利要求1所述的引物组在检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的引物组检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；

2)Cycleave PCR步骤：将权利要求1所述的引物组加入到反应体系中，反应程序为95℃30s；95℃5s，55℃10s，72℃20s，在72℃进行FAM荧光信号采集，进行40个循环；

3)结果检测：根据荧光扩增曲线情况，判定检测结果。

4.一种检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。