CN105463133A - 猪瘟病毒dna/rna杂合探针法检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

猪瘟病毒dna/rna杂合探针法检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明适用于病毒检测试剂盒技术领域，提供了一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针，该检测方法使用实时荧光PCR法进行检测。本发明猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法与现有技术比较，能够一步同时实现对猪瘟病毒野毒株和疫苗株的分型检测，且具有灵敏度高、特异性强、周期短、准确度高等优点。

Description

猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用，其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所示，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。
猪瘟病毒(Hogcholeravirus,Swinefevervirus)是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。猪瘟病毒主要危害猪(包括野猪)，其他动物不发病。猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失。猪瘟病毒兔化疫苗株是使用猪瘟病毒强毒株反复感染钝感动物家兔，通过传代使其毒力减弱而获得适应兔体的毒株，由此制成的疫苗。猪瘟病毒兔化疫苗株已被广泛应用于各国的养猪产业，为控制猪瘟起到了重要的作用。但同时，如何区分感染猪瘟病毒的猪和接种了兔化疫苗株的猪也成了行业内一大难题。传统的猪瘟病毒检测方法是病毒毒分离培养和ELISA为代表的血清学的检测，但在检测猪瘟野毒株和疫苗株时，检测结果毫无差别。基因检测可以作为区分野毒株和疫苗株的方案。现今广泛使用的方案是对猪瘟病毒基因组5’UTR区域进行序列分析，5’UTR兔化疫苗株和野毒株碱基序列分别为：
5’UTR兔化疫苗株：GGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGC；
5’UTR野毒株：GGACTAGCAAACGGAGGGACTAGC；
5’UTR兔化疫苗株比野毒株多一个碱基A，在设计引物对5’UTR区域进行扩增后通过序列分析可以有效的区分野毒株和疫苗株。
现有区分野毒株和疫苗株猪瘟病毒的方法通常有一下几种：
1)PCR-测序：设计引物将猪瘟病毒5’UTR区域进行PCR扩增，并将产物进行测序，从而区分；
2)PCR-溶解曲线分析：使用荧光染料法(SYBRgreen)对猪瘟病毒5’UTR区域进行Real-timePCR扩增检测，实时荧光PCR结果呈阳性后对产物进行溶解曲线分析，根据解链温度的不同来区分野毒株和疫苗株；
3)PCR-Taqman探针法：根据突变区域，设计两条不同标记的Taqmen探针，分别和野毒株、疫苗株完全互补，然后优化荧光PCR体系分辨率至足以区分野毒株和疫苗株。
然而，PCR-测序法操作步骤繁琐，成本高，很难作为常规检测使用；PCR-溶解曲线法分辨率低，单碱基突变再溶解曲线结果上判断偏主观，而且对仪器要求较高，市面上大部分仪器不适用；PCR-Taqman探针法对扩增体系的分辨率优化要求较高，且当样本浓度较低时，对结果的判断也偏主观。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，旨在解决现有技术不能高效、准确区分野毒株和疫苗株猪瘟病毒的问题。
本发明的另一目的在于提供一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法。
本发明是这样实现的，一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针；
所述猪瘟病毒5’UTR引物包括：
猪瘟病毒5’UTR上游引物：5’-GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3’；
猪瘟病毒5’UTR下游引物：5’-TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’；
所述DNA/RNA杂合探针包括：
所述野毒株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTGC-3’；
所述疫苗株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTTGC-3’。
以及，一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法，该方法使用上述猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
样本RNA提取；
RT-PCR一步法检测；
结果判断；
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
42-50℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；40个循环。
本发明提供的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法，采用特异性设计的引物和DNA/RNA杂合探针，使用实时荧光PCR法进行检测，能够一步同时实现对猪瘟病毒野毒株和疫苗株的分型检测。与免疫法猪瘟病毒检测试剂相比具有可分型检测，本发明具有操作简单、安全等优点，可快速排除疫苗株对检测结果的影响。此外，所述试剂检测盒与其他分子检测试剂相比，具有快速、灵敏和方便等优点，可应用于猪瘟病毒的检测。
附图说明
图1是提供的实时荧光定量PCR扩增曲线示意图；
图2是本发明实施例提供的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法示意图；
图3是本发明实施例提供的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法阳性结果和阴性结果示意图；
图4是本发明实施例1提供的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法扩增图谱；
图5是本发明对比例1提供的猪瘟病毒荧光PCR法扩增图谱。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例中，对下述名词作出如下解释。
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。
实时荧光PCR法：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性定量分析的方法。
逆转录PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)：是反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增目的片段。RT-PCR包括两步：1、mRNA逆转录为cDNA；2、以cDNA为模版进行PCR。将这两个步骤合二为一个反应管进行即为一步法，将两个步骤分开两管反应为两步法。一步法更方便快捷。
DNA/RNA杂合探针法是由RNA和DNA构成的杂合探针与RNaseH组合使用的高灵敏度检出法。DNA/RNA杂合探针内部含有RNA碱基、5’端标记荧光物质、3’端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光。当探针与模板DNA序列完全匹配后，杂合探针中的RNA碱基与模板形成RNA-DNA复合体，此时RNaseH在RNA碱基处切断探针，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光。此时通过测定荧光强度，能够实时监控扩增产物量。如果探针的RNA部分或与RNA部分相邻的2～3个碱基与模板不匹配，RNaseH将不能切断探针，所以该检出方法是一种即使有一个碱基不同也能识别的高特异性检出方法。
Ct值：每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
本发明实施例提供了一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针；
所述猪瘟病毒5’UTR引物包括：
猪瘟病毒5’UTR上游引物：5’-GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3’；
猪瘟病毒5’UTR下游引物：5’-TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’；
所述DNA/RNA杂合探针包括：
所述野毒株DNA/RNA杂合探针(CSV-W)：5’-AGTCCCTCCGTTTGC-3’；
所述疫苗株DNA/RNA杂合探针(CSV-V)：5’-AGTCCCTCCGTTTTGC-3’。
本发明实施例所述试剂盒上述猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针，是针对猪瘟病毒5’UTR区域基因设计。所述DNA/RNA杂合探针分别为与野毒株和疫苗株互补的DNA/RNA杂合探针CSV-W和CSV-V。优选的，所述DNA/RNA杂合探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述DNA/RNA杂合探针上标记的荧光信号不相同，提高了单一反应管中可识别的探针的数目，从而提高PCR单管中能够检测的靶的数目。具体的，所述DNA/RNA杂合探针为采用不同荧光标记物进行编码标记的DNA/RNA杂合探针，包括：
所述野毒株DNA/RNA杂合探针(CSV-W)：
5’-FAM-AGTCCCTCCGTTTGC-DABCYL-3’；
所述疫苗株DNA/RNA杂合探针(CSV-V)：
5’-HEX-AGTCCCTCCGTTTTGC-DABCYL-3’。
其中，所述野毒株DNA/RNA杂合探针CSV-W由FAM标记5’端，DABCYL标记3’端，其碱基13-T设计为核糖核酸(RNA)；所述疫苗株DNA/RNA杂合探针CSV-V由HEX标记5’端，DABCYL标记3’端，其碱基14-T设计为核糖核酸(RNA)。当反应体系中含有猪瘟病毒野毒株基因RNA模板的情况下，所述野毒株DNA/RNA杂合探针CSV-W中碱基13-T与模板相应位置的A形成DNA-RNA配对，探针被RnaseH水解从而释放出荧光信号，并被FAM通道检测出。当反应体系中含有猪瘟病毒疫苗株基因RNA模板的情况下，所述野毒株DNA/RNA杂合探针CSV-W中碱基13-T和所述疫苗株DNA/RNA杂合探针CSV-V中碱基14-T皆与模板相应位置的A形成DNA-RNA配对，由于所述野毒株DNA/RNA杂合探针CSV-W的13-T下游两个碱基无法配对，所以只有所述疫苗株DNA/RNA杂合探针CSV-V被RnaseH水解从而释放出荧光信号。在此体系中，可一步法实现猪瘟病毒的mRNA逆转录与cDNA的PCR反应，并释放荧光信号，利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析，对猪瘟病毒进行分型检测。
进一步的，本发明实施例所述PCR反应液还包括M-MLV逆转录酶、Taq酶、dNTPs、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、溴酚蓝、RnaseH。更进一步地，所述试剂盒运用分装技术，将所述溴酚蓝、M-MLV逆转录酶、Taq酶、RnaseH与所述不含镁离子的缓冲液、氯化镁、dNTPs、猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针采用石蜡隔离，有效保证了DNA聚合酶的活性，延长了本发明实施例试剂盒的保存时间。在PCR反应过程中，由于温度在95℃，石蜡熔融，使得上述反应液混合，PCR反应得以进行。
本发明实施例中，所述PCR反应液的规格为8管×3条，20μL/管。作为优选实施例，所述PCR反应液含有MgCl2、dNTPs、热启动(HotStart)Taq酶、M-MLV逆转录酶、RnaseH、RNA酶抑制剂及猪瘟病毒特异性引物和探针。具体的，所述PCR反应液的组成如下所述：
本发明实施例猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒是通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系的荧光扩增曲线图，当扩增曲线图Ct值≤36，并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值＞38或无Ct值，结果表现为阴性。因此，为了形成对照，猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒设置阴性对照液和阳性对照液。具体的，所述阳性对照包括猪瘟病毒野毒株和疫苗株的基因组RNA。更具体的，所述阳性对照使用Tris-EDTA缓冲液对所述猪瘟病毒野毒株和疫苗株的基因组RNA进行稀释后冷冻保存，所述Tris-EDTA缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.0，可以用0.6mL普通带盖离心管包装。作为具体实施例，每个试剂盒中设置40μL/管的所述阳性对照1管。所述阴性对照为不含有猪瘟病毒野毒株和疫苗株基因组RNA的Tris-EDTA缓冲液，所述Tris-EDTA缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.0，可以用0.6mL普通带盖离心管包装。作为具体实施例，每个试剂盒中设置40μL/管的所述阴性对照1管。
应当理解，应不同实验需要，本发明实施例各组分的规格可依照上述含量进行调整。为了避免操作时取错组分或实验过程中由于混淆瓶盖造成的标品交叉污染，本发明实施例优选采用不同类型和/或颜色的盖子对不同样品进行区分，具体的，所述PCR反应液采用无色透明PCR反应管；阴性对照使用紫色透明带盖离心管；阳性对照使用橙红色透明带盖离心管。
以及，本发明实施例还提供了一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法，该方法使用上述猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒进行检测，包括以下步骤，如图2所示：
S01.样本RNA提取；
S02.RT-PCR一步法检测；
S03.结果判断；
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
42-50℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；40个循环。
具体的，上述步骤S01中，样本RNA提取的操作可采用如下方法实现：
S011.取100μL全血或者血清于1.5mL离心管中，加入500μLTrizol试剂，室温剧烈震荡15秒，静置5分钟，再加入120μL氯仿/异戊醇(体积比24:1)，用手剧烈震荡15秒，室温静置5分钟。
S012.12000rpm4℃离心15分钟，取上清置于另一新离心管中(切忌吸出中间白色层)；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟。
S013.12000rpm4℃离心10分钟，弃上清，用75％的冰乙醇洗涤沉淀，12000rpm4℃离心5分钟，弃乙醇。
S014.沉淀室温干燥除去乙醇，用20-50μL的DEPC-H2O溶解沉淀待检。
S015.可使用商品化的RNA提取试剂盒。
当然，应当理解，也可以采用其他方法进行样本RNA提取。
上述步骤S02中，包括取待检样本RNA，加入RT-PCR反应液，上机检测。值得注意的是，每次试验设置有阴性对照和阳性对照，否则该次试验视为无效试验。本发明实施例中，用于猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测的荧光定量PCR仪包括但不限于：ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJOpticon2)、StratageneMX系列、RocheLightCycler、CepheidSmartCycler、CorbettRotor-Gene、杭州博日系列。
作为优选实施例，所述RT-PCR一步法检测时，对不同的所述DNA/RNA杂合探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针上标记的荧光信号不相同。
上述步骤S03中，根据检测的荧光强度结果进行分析判断，当扩增曲线图Ct值≤36，并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性，如图3A所示；当扩增曲线图Ct值＞38或无Ct值，结果表现为阴性，如图3B所示。本发明实施例中，通过不同的通道(采用不同荧光基团标记)得到的结果可进行判定，具体的，当采用FAM标记野毒株猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针时，阳性结果表示样品中检测出野毒株猪瘟病毒，而阴性结果未检出野毒株猪瘟病毒；当采用HEX标记疫苗株猪瘟病毒时，阳性结果表示样品中检测出疫苗株猪瘟病毒，而阴性结果未检出疫苗株猪瘟病毒。
本发明实施例提供的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法，采用特异性设计的引物和DNA/RNA杂合探针，使用实时荧光PCR法进行检测，能够一步同时实现对猪瘟病毒野毒株和疫苗株的分型检测。与免疫法猪瘟病毒检测试剂相比具有可分型检测，本发明具有操作简单、安全等优点，可快速排除疫苗株对检测结果的影响。此外，所述试剂检测盒与其他分子检测试剂相比，具有快速、灵敏和方便等优点，可应用于猪瘟病毒的检测。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，包括PCR反应液、阴性对照和阳性对照，其中，所述PCR反应液的规格为：8管×3条，20μl/管，成分如下表1所示；所述阳性对照规格为1管，40μl/管，成分为猪瘟病毒野毒株和疫苗株的基因组RNA，使用Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)稀释后冷冻保存；所述阴性对照规格为1管，40μl/管，成分为不含有猪瘟病毒野毒株和疫苗株的基因组RNA的Tris-EDTA缓冲液(0.01MpH8.0)。
表1
一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法，该方法使用上述猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
S11.样本RNA提取：待检样本4例(2例野毒，2例疫苗株)；
S12.RT-PCR一步法检测；
S13.结果判断；
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
42-50℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；40个循环。
PCR扩增图谱如图4所示。
对比例1
待检样本4例(2例野毒，2例疫苗株)采用猪瘟病毒核酸检测试剂(荧光PCR法)进行对比检测，操作流程与实施例1相同。PCR扩增图谱如图5所示。
由图可见，使用猪瘟病毒(野毒株，疫苗株)DNA/RNA杂合探针法一步法检测试剂盒检测4例样本皆为阳性，其中2例为FAM通道阳性，可判定为猪瘟病毒野毒株(图4)，2例为HEX通道阳性，可判定为猪瘟病毒疫苗株。使用猪瘟病毒核酸检测试剂(荧光PCR法)检测4个样本皆为阳性，但不能区分野毒株和疫苗株(图5)。由此可见，本发明实施例所述一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法，对区分野毒株和疫苗株猪瘟病毒具有高效、准确的优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针；
所述猪瘟病毒5’UTR引物包括：
猪瘟病毒5’UTR上游引物：5’-GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3’；
猪瘟病毒5’UTR下游引物：5’-TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’；
所述DNA/RNA杂合探针包括：
所述野毒株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTGC-3’；
所述疫苗株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTTGC-3’。
2.如权利要求1所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特征在于，所述DNA/RNA杂合探针为采用不同荧光标记物进行编码标记的DNA/RNA杂合探针，包括：
所述野毒株DNA/RNA杂合探针：
5’-FAM-AGTCCCTCCGTTTGC-DABCYL-3’；
所述疫苗株DNA/RNA杂合探针：
5’-HEX-AGTCCCTCCGTTTTGC-DABCYL-3’。
3.如权利要求1所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括M-MLV逆转录酶、Taq酶、dNTPs、不含镁离子的缓冲液、氯化镁、溴酚蓝、RnaseH。
4.如权利要求3所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特征在于，所述溴酚蓝、M-MLV逆转录酶、Taq酶、RnaseH与所述不含镁离子的缓冲液、氯化镁、dNTPs、猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针采用石蜡隔离。
5.如权利要求1-4任一所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照包括猪瘟病毒野毒株和疫苗株的基因组RNA。
6.如权利要求1-4任一所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为不含有猪瘟病毒野毒株和疫苗株基因组RNA的Tris-EDTA缓冲液。
7.如权利要求1-4任一所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液的组成如下所述：
8.一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法，其特征在于，该方法使用如权利要求1-7任一项所述猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
样本RNA提取；
RT-PCR一步法检测；
结果判断；
其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：
42-50℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；40个循环。
9.如权利要求8所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法，其特征在于，所述RT-PCR一步法检测时，对不同的所述DNA/RNA杂合探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针上标记的荧光信号不相同。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282411A (zh) * 2016-09-26 2017-01-04 湖南新南方养殖服务有限公司 一种检测猪脐带血猪瘟病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途
CN106435033A (zh) * 2016-11-22 2017-02-22 湖南新南方养殖服务有限公司 一种检测鉴别猪脐带血中猪瘟病毒野毒株与疫苗株的双重实时荧光rt‑pcr试剂盒及其用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101191143A (zh) * 2006-11-22 2008-06-04 上海生物芯片有限公司 无需核酸标记的基因芯片及其检测方法和应用
CN101985652A (zh) * 2010-08-06 2011-03-16 南京农业大学 禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测
CN102002522A (zh) * 2009-11-10 2011-04-06 复旦大学附属华山医院 一种检测肺炎支原体耐药突变的方法
CN104232783A (zh) * 2014-09-30 2014-12-24 中国动物卫生与流行病学中心 牛种布氏菌弱毒疫苗株a19的快速检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101191143A (zh) * 2006-11-22 2008-06-04 上海生物芯片有限公司 无需核酸标记的基因芯片及其检测方法和应用
CN102002522A (zh) * 2009-11-10 2011-04-06 复旦大学附属华山医院 一种检测肺炎支原体耐药突变的方法
CN101985652A (zh) * 2010-08-06 2011-03-16 南京农业大学 禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测
CN104232783A (zh) * 2014-09-30 2014-12-24 中国动物卫生与流行病学中心 牛种布氏菌弱毒疫苗株a19的快速检测方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAN-JUN ZHAO等: "Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative and differential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine of Classical swine fever virus", 《VETERINARY MICROBIOLOGY》 *
余以刚等: "猪瘟病毒野生株和疫苗株荧光RT-PCR鉴别方法的建立", 《现代食品科技》 *
杭柏林等: "猪瘟野毒与疫苗弱毒鉴别方法的研究进展", 《贵州农业科学》 *
林万明等: "《PCR技术操作和应用指南》", 30 September 1993 *
温国元等: "基于Taqman-MGB探针的猪瘟病毒野毒株荧光RT-PCR检测方法的研究", 《第三届全球猪业论坛暨第十一届（2013）中国猪业发展大会论文集》 *
王伟等: "猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282411A (zh) * 2016-09-26 2017-01-04 湖南新南方养殖服务有限公司 一种检测猪脐带血猪瘟病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途
CN106435033A (zh) * 2016-11-22 2017-02-22 湖南新南方养殖服务有限公司 一种检测鉴别猪脐带血中猪瘟病毒野毒株与疫苗株的双重实时荧光rt‑pcr试剂盒及其用途

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