CN102002522A - 一种检测肺炎支原体耐药突变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物、医药领域，具体涉及一种检测肺炎支原体耐药突变的方法。本发明采用Real-time PCR及可分辨单碱基差异的cycling探针技术，通过在肺炎支原体23S rRNA基因2063位/2064位碱基上下游序列中寻找针对肺炎支原体的特异性引物，根据肺炎支原体无突变敏感株及突变耐药株23S rRNA基因2063位/2064位的碱基差异，分别设计针对无突变敏感株、2063位突变耐药株及2064位突变耐药株的特异性cycling探针；采用肺炎支原体特异性引物进行PCR扩增，通过Real-time PCR扩增仪实时读取荧光强度变化，确定被检样品中的序列的突变类型。本发明能正确区分肺炎支原体临床分离株无突变敏感株和突变耐药株，特异性为100％。敏感性可达102拷贝/PCR反应。

Description

一种检测肺炎支原体耐药突变的方法
技术领域
本发明属生物、医药领域，涉及耐药病原微生物检验的方法，具体涉及一种检测肺炎支原体耐药突变的方法。尤其是一种检测肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变的方法。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)属于柔膜体纲，支原体科，支原体属。由Chanock等于1962年从胸水中首次分离。肺炎支原体可引起支气管炎和非典型肺炎。Foy报道1962～1975年间15％～20％的社区获得性肺炎由肺炎支原体引起(Clin InfectDis.1993，17：S37)，儿童中18％的支原体肺炎需要入院治疗(Clin Microbiol Rev.2004，17：697)。亚洲地区近期进行的一项成人社区获得性肺炎流行病学调查显示，肺炎支原体肺炎约占的12.2％(Int J Infect Dis.2005，9：144)。因此，肺炎支原体是引起社区获得性呼吸道感染的主要和重要病原体之一。
由于肺炎支原体缺乏细胞壁结构，因此对β-内酰胺类、糖肽类和磺胺类等作用于细胞壁的抗生素固有耐药。临床用于治疗肺炎支原体感染的抗菌药物主要包括大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类。四环素类药物因可引起牙齿着色故在妊娠后期、新生儿以及8岁以下儿童中限制使用，氟喹诺酮类可能引起软骨发育异常因此不能应用于儿童。因此，尤其是对于儿童患者而言，大环内酯类药物是治疗肺炎支原体感染的首选药物。
以往认为肺炎支原体对红霉素等大环内酯类敏感性高，无耐药株产生，但近年日本、法国以及中国地区先后报道临床分离到对红霉素等大环内酯类高度耐药的肺炎支原体，给临床治疗，特别是儿童感染者的治疗带来很大挑战。耐药机制研究显示，肺炎支原体23S rRNA发生2063位、2064位或2617位核苷酸的突变是红霉素高耐药的决定因素(Antimicrob Agents Chemother.2004，48：4624；Antimicrob Agents Chemother，2005，49：2302)。近年红霉素耐药肺炎支原体感染发生率逐年上升，上海地区2005～08年肺炎支原体对红霉素耐药率为83％(Antimicrob Agents and Chemother.2009，53：2160)，耐药均由2063位突变所致，北京学者亦有类似报道，发现耐药主要由2063位突变引起，少数由2064位核苷酸突变导致。如能提供以上肺炎支原体耐药突变信息，可为临床医生正确诊断疾病、合理选用抗生素提供客观依据。
基于分离培养的肺炎支原体检测及药敏测定技术，由于肺炎支原体生长缓慢、培养周期长(1～2周)、技术要求高、分离费用昂贵，临床应用困难。因此在临床常规工作中国内外均以血清学方法或聚合酶链反应(PCR)方法进行检测。然而，血清学需比较急性期和恢复期双份血清抗体滴度，只能提供回顾性诊断依据，对临床治疗指导意义不大。PCR方法快速、灵敏，但多数方法只能检测肺炎支原体，而不能检测引起耐药的23S rRNA突变，无法提供药敏方面的信息。目前虽然已有少量检测肺炎支原体耐药突变的PCR检测方法，但由于采用的是限制性酶切片段长度多态性(RFLP，Restriction FragmentLength Polymorphism)、高分辨解链温度分析(HRM，High-Resolution Melt Analysis)等费时、特异性欠佳的PCR产物分析技术，实际应用受到很大限制。
Cycling探针技术是由RNA和DNA构成的杂合探针与Rnase H酶组合使用的高灵敏度检测方法，能够高效率地检出扩增过程中形成的目的基因片段，具体原理如图1所示：Cycling探针是内部含有RNA碱基的嵌合探针(Chimera probe)，探针一端标记荧光物质(Fluorescer)、另一端标记淬灭物质(Quencher)，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭物质作用抑制荧光物质发出荧光。当探针与扩增产物中互补序列杂交(Hybridformation)后，Rnase H酶在RNA碱基处切断探针，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光。此时通过测定荧光强度，能够实时监控扩增产物量。如果探针的RNA及邻近碱基与模板不匹配，Rnase H将不能切断探针，所以cycling探针技术是一种单碱基突变的高特异性检测方法，该技术在肺炎支原体耐药突变检测方面尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、高敏感性、高特异性的检测耐药病原微生物的方法，具体涉及一种检测肺炎支原体耐药突变的方法。尤其是一种检测肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变的方法。
为实现快速、高敏感性的目的，本发明采用PCR技术，为确保检测的高特异性，本发明采用了Real-time PCR及可分辨单碱基差异的cycling探针技术。
本发明通过生物信息学分析，在肺炎支原体23S rRNA基因2063位/2064位碱基上下游序列中寻找针对肺炎支原体的特异性引物，引物序列为：
上游引物5’-CTGAAGCCCCAGTGAACGG-3’
下游引物5’-ATTAGAACAGCACACAACCAAG-3’
本发明中，根据肺炎支原体无突变敏感株及突变耐药株23S rRNA基因2063位/2064位的碱基差异，分别设计了针对无突变敏感株、2063位突变耐药株及2064位突变耐药株的特异性cycling探针，探针序列为：
FAM荧光标记的无突变敏感株检测探针：5’-(Eclipse)GACGGAaAGAC(FAM)-3’
HEX荧光标记的2063位突变耐药株探针：5’-(Eclipse)GACGGGaAGAC(HEX)-3’
ROX荧光标记的2064位突变耐药株探针：5’-(Ecl ipse)GACGGAgAGAC(ROX)-3’
探针序列中，小写字母为cycling探针引入的RNA碱基。
当采用肺炎支原体特异性引物进行PCR扩增过程中，如果被检标本中有肺炎支原体23S rRNA序列时，不同荧光基团标记的相应探针会与PCR扩增产物完全匹配杂交，并被Rnase H切断释放特定荧光，通过Real-time PCR扩增仪实时读取荧光强度变化，可确定被检样品中的序列的突变类型。例如：被检样品为2063位突变耐药株，扩增过程中PCR产物会与HEX标记的探针杂交并被Rnase H切断释放HEX荧光，而其它2种探针由于不能与PCR产物完全匹配杂交，不被Rnase H切断释放荧光，随PCR循环数(扩增曲线X轴)增加，产物逐渐累积致使HEX荧光强度(扩增曲线Y轴)增强，PCR扩增结束时分析软件可自动生成HEX荧光强度逐渐上升的扩增曲线，以HEX荧光通道读取窗口可呈现图4所示曲线，无2063位突变的则维持在水平的基线附近。同理，无突变及2064位突变的肺炎支原体样品可在FAM通道及ROX通道分别出现图3与图5所示曲线。
本发明不需要额外的限制性酶切片段长度多态性分析、高分辨解链温度分析等费时、复杂的PCR产物方法，可在2小时内完成样品处理及Real-time PCR扩增，快速检出肺炎支原体。
采用本发明检测肺炎支原体临床分离株，能正确区分无突变敏感株和突变耐药株，特异性为100％。敏感性可达102拷贝/PCR反应，与目前检测其它病原微生物的PCR试剂盒敏感性相当。
本发明引物及探针与含Rnase H酶的PCR扩增试剂组合，可用于肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变的检测。本发明具有操作简便、快速，且敏感性、特异性高等优点。
附图说明
图1是Cycling探针技术原理图。
图2是肺炎支原体敏感标准株及临床株PCR扩增产物电泳图，
其中，1.DNA marker，DL2000；2.肺炎支原体标准株(ATCC15531)；3肺炎支原体标准株(ATCC29342)；4.大肠埃希菌标准株(ATCC25922)；5.肺炎克雷伯菌标准株(ATCC700603)；6.金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)；7.肺炎链球菌标准株(ATCC49619)；8.铜绿假单胞菌标准株(ATCC27853).肺炎支原体大环内酯类敏感临床株；10.肺炎支原体2063位突变耐药株临床株；11.肺炎支原体2064位突变耐药临床株。
图3是cycling探针法扩增肺炎支原体敏感株的实时荧光PCR扩增曲线(FAM荧光通道)，
其中，A为敏感株阳性对照扩增曲线，B为敏感株阳性对照和临床敏感株扩增曲线(X轴为PCR循环数，Y轴为FAM荧光强度)，显示FAM荧光随扩增循环数增加而增强，结果表明：样品中有与FAM荧光标记的无突变敏感株检测探针互补杂交的序列，即该样品含无突变的敏感肺炎支原体。
图4是cycling探针法扩增2063位突变耐药株的实时荧光PCR扩增曲线(HEX荧光通道)，
其中，A为2063位突变耐药株阳性对照扩增曲线，B为2063位突变耐药株阳性对照和临床耐药株扩增曲线(X轴为PCR循环数，Y轴为HEX荧光强度)，显示HEX荧光随扩增循环数增加而增强，结果表明：样品中有与HEX荧光标记的2063位突变耐药株探针互补杂交的序列，即该样品含2063位突变耐药株。
图5是cycling探针法扩增2064位突变耐药株的实时荧光PCR扩增曲线(ROX荧光通道)，
其中，A为2064位突变耐药株阳性对照扩增曲线，B为2064位突变耐药株阳性对照和临床耐药株扩增曲线(X轴为PCR循环数，Y轴为ROX荧光强度)，显示HEX荧光随扩增循环数增加而增强，结果表明：样品中有与HEX荧光标记的2064位突变耐药株探针互补杂交的序列，即该样品含2064位突变耐药株。
具体实施方式
实施例1：本发明的PCR引物的特异性分析
采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(产品编号：DP302-02)提取肺炎支原体标准株(ATCC15531)、肺炎支原体标准株(ATCC29342)、大肠埃希菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、肺炎链球菌(ATCC49619)、肺炎支原体大环内酯类敏感临床株、肺炎支原体2063位突变耐药株临床株、肺炎支原体2064位突变耐药临床株的基因组DNA为扩增模板(抽提时间约25分钟)。以针对肺炎支原体的特异性上、下游引物与Takara PCR扩增试剂(产品编号：DR100A)按说明书配制扩增体系。扩增条件为：预变性94℃5分钟；变性94℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃35秒，循环40次。扩增产物采用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析。结果如图2所示，肺炎支原体标准株、肺炎支原体临床分离株的DNA样品经扩增有预期大小(316bp)阳性条带，其它DNA样品均无阳性条带及非特异扩增，表明引物具有良好的特异性。
实施例2：本发明的肺炎支原体临床分离株
将肺炎支原体标准株(ATCC15531，大环内酯类敏感株)、2063位突变株及2064位突变株的PCR扩增产物切胶纯化，插入PCR产物克隆载体，经测序确认无误，纯化、读取OD值后计算质粒拷贝数，并将此载体稀释至105拷贝/毫升每次PCR取1微升(约含102拷贝)作为阳性对照，阴性对照为相同浓度的大肠埃希菌基因组DNA。以上、下游引物、无突变敏感株检测探针、2063位突变耐药株探针、2064位突变耐药株探针与Takara公司的CycleavePCRTM Core Kit(产品编号：DCY501)按说明书配制PCR反应体系，3种探针浓度经优化分别为1.5μM、6μM和6μM，采用ABI7300型PCR仪进行扩增。扩增条件为：预变性95℃30秒；变性95℃5秒，退火55℃15秒，延伸72℃31秒，循环50次(扩增时间约80分钟)。采用不同的荧光通道进行检测结果读取，检测结果如图3～图5所示，各阳性对照在相应的荧光通道均有特异性扩增曲线，相应临床分离株有相似的扩增曲线。
采用本发明检测54株肺炎支原体临床分离株(经23S rRNA测序确认8株为无突变敏感株，45株2063位耐药突变株，1株为2064为耐药突变株)，结果显示，本发明可在2小时内快速检出肺炎支原体，并能正确区分无突变敏感株和突变耐药株，本发明的检测结果与测序结果完全相符，特异性达100％。同时，阳性对照的检测结果显示，本发明检测敏感性可达102拷贝/PCR反应，与目前多数PCR检测试剂盒的敏感性相当。

Claims (7)

1.一种检测肺炎支原体耐药突变的方法，其特征在于，采用Real-time PCR及可分辨单碱基差异的cycling探针技术，通过下述步骤：
1)在肺炎支原体23S rRNA基因2063位/2064位碱基上下游序列中寻找针对肺炎支原体的特异性引物，引物序列为：
上游引物5’-CTGAAGCCCCAGTGAACGG-3’
下游引物5’-ATTAGAACAGCACACAACCAAG-3’；
2)根据肺炎支原体无突变敏感株及突变耐药株23S rRNA基因2063位/2064位的碱基差异，分别设计针对无突变敏感株、2063位突变耐药株及2064位突变耐药株的特异性cycling探针；
3)采用肺炎支原体特异性引物进行PCR扩增，通过Real-time PCR扩增仪实时读取荧光强度变化，确定被检样品中的序列的突变类型。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2的特异性cycling探针及其序列分别为：
FAM荧光标记的无突变敏感株检测探针：5’-(Eclipse)GACGGAaAGAC(FAM)-3’
HEX荧光标记的2063位突变耐药株探针：5’-(Eclipse)GACGGGaAGAC(HEX)-3’
ROX荧光标记的2064位突变耐药株探针：5’-(Ecl ipse)GACGGAgAGAC(ROX)-3’
其中，粗体小写字母为cycling探针引入的RNA碱基。
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的不同荧光基团标记的相应探针与PCR扩增产物完全匹配杂交，并被Rnase H切断释放特定荧光，通过Real-time PCR扩增仪实时读取其荧光强度变化。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的HEX标记的探针与PCR产物杂交并被Rnase H切断释放HEX荧光，而其它探针不与PCR产物完全匹配杂交，不被Rnase H切断释放荧光，随PCR循环数增加，产物累积致使HEX荧光强度增强，生成HEX荧光强度逐渐上升的扩增曲线，无2063位突变的则维持在水平的基线附近。
5.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的FAM标记的探针与PCR产物杂交并被Rnase H切断释放FAM荧光，而其它探针不与PCR产物完全匹配杂交，不被Rnase H切断释放荧光，随PCR循环数增加，产物累积致使FAM荧光强度增强，生成FAM荧光强度逐渐上升的扩增曲线，无突变的则维持在水平的基线附近，
6.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的ROX荧光标记的探针与PCR产物杂交并被Rnase H切断释放FAM荧光，而其它探针不与PCR产物完全匹配杂交，不被Rnase H切断释放荧光，随PCR循环数增加，产物累积致使ROX荧光强度增强，生成ROX荧光强度逐渐上升的扩增曲线，无2064位突变的则维持在水平的基线附近。
7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，本方法正确区分肺炎支原体临床分离株的无突变敏感株和突变耐药株，特异性为100％，敏感性达102拷贝/PCR反应。
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