一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测领域,具体设计一种检测细菌性脑膜炎六种常见病原体的多重PCR试剂盒。
技术背景
多重PCR是在普通PCR的基础上,于同一个反应体系中利用多对引物同时扩增多段靶序列的PCR技术。自多重PCR报道以来,由于其高效性、灵敏性和经济简便性,已广泛应用于核酸诊断的多个领域,如遗传疾病诊断、突变和多态性分析、转基因鉴定、病原体检测等;多重PCR体系,一般包括以下试剂:PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、引物、模板和去离子水。
细菌性脑膜炎(BacterialMeningitis,BM)是由各种细菌感染引起的脑膜和脑脊髓膜炎症,是一种较为常见的急性严重性中枢神经系统感染性疾病,临床主要症状表现为头痛、发热、呕吐、意识改变、脑膜刺激征。该病多发于婴幼儿,起病急、病情发展迅速,病死率较高,易遗留有严重的后遗症,如听力障碍、癫痫发作、瘫痪、智力低下等。在发达国家,BM的发病率为1.4~6.0/10万,病死率约为5%,发展中国家发病率为其10倍以上,而且具有更高的病死率。目前我国婴幼儿细菌性脑膜炎的病死率高达60%,1月龄至15岁BM患儿后遗症发生率为22.6%,严重影响患者的身心健康。早期、快速和明确的病原体鉴别诊断,合理的抗菌治疗是降低本病死亡率和致残率的关键。
BM感染病原体种类繁多,而不同年代的这些致病菌在BM病因学上所占地位不同,并存在明显的地域差异,不同的国家和地区,其发病率和所感染的病原体类型也不同。随着疫苗的不断开发推广和抗生素的广泛应用,BM病原菌的种类也在发生变化。参考临床细菌性脑膜炎的发病情况,最常见的六种病原菌为肺炎链球菌、B型链球菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟菌。
目前,临床常用的细菌性脑膜炎病原体的检测方法为培养、镜检、革兰染色以及乳胶凝集试验。细菌培养法对菌的筛选范围较广,一直被视为金标准,但培养时间较长,一般2~7天以上,而且抗生素的使用、样品质量和培养条件等因素都会影响阳性率。镜检仅作为辅助方法,革兰染色和乳胶凝集试验虽然快速简便但准确度有限,常出现假阳性。多重PCR技术可对多个病原体同时进行检测,是细菌性脑膜炎病原体检测中最适宜的方法之一。作为PCR的衍生技术,多重PCR有其特有的优势:(1)高效性,同一反应中可同时检测多个靶标,省时省力;(2)经济简便性,减少了操作流程,并节约试剂成本。随着引物对数的增加,引物间的抑制作用降低了多重PCR的检测通量,在多重PCR技术的实际应用过程中,由于在同一反应管内添加多条引物,因此如何提高引物的特异性避免非特异的扩增、如何减少多条引物之间形成的二聚体、如何调控PCR反应试剂的浓度及其反应条件,使之对每个目的片段都能达到有效的扩增等问题,都限制了多重PCR技术的应用。因此,开发高通量和高敏感性的病原体多重PCR检测技术和相应的检测试剂盒对脑膜炎的诊断、治疗及预后具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒,用于细菌性脑膜炎六种常见病原体的多重PCR检测,通过设计公共引物及菌特异性引物,结合六种病原体的多重PCR检测体系和条件,可检测临床细菌性脑膜炎感染的病原体。
为达到上述发明目的,本发明采用的技术方案是:一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒,包括公共引物、针对细菌性脑膜炎病原体的嵌合引物对;所述公共引物的序列SEQIDNO.1及所述针对细菌性脑膜炎病原体的嵌合引物对如下核苷酸序列所示:
。
上述技术方案中,检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒还包括Taq聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水。
上述技术方案中,检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒还包括阳性对照引物对,可用来检测DNA模板质量和反应体系扩增效率,本发明优选的阳性对照引物具体序列为:SEQIDNO.14,5’-AGCGGGAAATCGTGCGTGA-3’;SEQIDNO.15,5’-AGTGAGGACCCTGGATGTGA-3’。
上述技术方案中,公共引物与细菌性脑膜炎病原体相关基因组无同源性,当以细菌性脑膜炎病原体基因组为模板进行扩增时,不论条件如何,均应没有特异性产物;当以嵌合引物的扩增产物为模板时,公共引物可以扩增出特异性产物;并且公共引物的Tm值比病原体靶特异性引物的Tm值低8~10℃。
上述技术方案中,进行PCR反应时,针对细菌性脑膜炎感染病原体的每条嵌合引物的终浓度为10nM,本发明嵌合引物用于扩增六种病原体SP、GBS、LM、SA、NM、HI。
上述技术方案中,进行PCR反应时,公共引物的终浓度为2000nM,针对细菌性脑膜炎感染病原体的每条嵌合引物的终浓度为10nM;进行PCR反应时,采用两步退火温度法,第一步退火温度高于第二步退火温度8~10℃。
上述试剂盒可用于临床细菌性脑膜炎感染病原体的检测,本发明公开的是公共引物介导的多重PCR结合两步退火温度法。以细菌性脑膜炎感染病原体基因为靶标序列,采用两步退火温度法,用嵌合引物先扩增10个循环,退火温度为63.5℃,进行第一步多重PCR扩增,可产生公共引物末端的PCR产物;然后以带有公共引物末端的PCR产物为模板,用公共引物进行25个循环的第二步多重PCR扩增,退火温度为55℃;即完成细菌性脑膜炎感染病原体的多重PCR扩增;前10个循环的多重PCR扩增退火温度高于后面25个循环的多重PCR扩增退火温度8~10℃。循环早期,在高退火温度下,低浓度的嵌合引物扩增靶标序列,产生带有公共引物末端的PCR产物;循环后期,在低退火温度下,高浓度的公共引物以早期产生的PCR产物为模板进行大量扩增。已构建的用于检测体系特异性和敏感性的质粒模板有cfb,hly,lytA,ctrA,P6和nuc基因。多重PCR采用的25μL反应体系包括:10μM的公共引物5μL,0.05μM(每条)的嵌合引物混合物5μL,5U/μL的Taqpolymerase0.15μL,25mM的MgCl22μL,10mM的dNTP0.5μL,10×TaqBuffer2.5μL,DNA模板1μL,灭菌ddH2O8.85μL;PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,63.5℃退火30s,72℃延伸45s,共10个循环;72℃延伸3min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共25个循环;最后72℃延伸7min。然后进行琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明本发明的检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒可特异性检测六种细菌的基因组;利用构建的质粒模板,本发明的检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒的敏感性最高可达10拷贝/25μL。
本发明进一步公开了针对细菌性脑膜炎病原体的嵌合引物对及公共引物,如下列核苷酸序列所示:
。
由于上述技术方案运用,本发明与现有技术相比具有以下优点:
(1)本发明公开的检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒,可同时检测六种常见致病菌,比如肺炎链球菌、B型链球菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟菌,不仅可以节约试剂使用量和降低检测成本,同时提高了检测效率,具有灵敏度高,经济、快速、操作简单等优点;
(2)本发明公开的试剂盒进行检测时,嵌合引物浓度低至10μM/每条,公共引物浓度为2000μM;降低嵌合引物的浓度有利于加入更多对嵌合引物,提高多重PCR检测通量;采用单条公共引物且较短,有利于减少二聚体的形成,高浓度可以放大特异性产物的量,进而提高敏感性;
(3)本发明公开的试剂盒采用一个PCR反应中的两步退火温度法,前10个循环扩增采用高退火温度(63.5℃)有利于嵌合引物的特异性结合,减少非特异性产物;后25个循环扩增低退火温度(55℃)使公共引物发挥放大作用;中间额外增加3min延伸,有利于为公共引物获得足够的模板。
(4)本发明公开的试剂盒中,公共引物与每条多重PCR特异引物的5'末端连接,一起构成了嵌合引物;公共引物介导的多重PCR可以降低引物对的浓度,抑制二聚体的形成,从而提高多重PCR的检测通量;通过创造性的设计克服了现有多重PCR体系存在的非特异性扩增、易存在二聚体的缺陷;
(5)本发明的多重PCR检测体系特异性高,敏感性高达10拷贝/25μL,单管进行,操作简单,且具有灵敏度高、经济、快速等优点,能用于开发相关的检测试剂盒,具有临床应用价值。
附图说明
图1是实施例一中多重体系的特异性检测电泳图;
图2是实施例一中多重体系的敏感性检测电泳图;
图3是实施例二中临床脑脊液标本的检测图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明作进一步的描述
实施例一多重体系的特异性和敏感性检测
1.多重体系的特异性检测
检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒,包括常规多重PCR组件,还包括针对常见脑膜炎感染细菌的嵌合引物和公共引物;嵌合引物和公共引物序列见表1,常规多重PCR组件包括Taq聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水;阳性对照引物对,可用来检测DNA模板质量和反应体系扩增效率,具体序列为:SEQIDNO.14,5’-AGCGGGAAATCGTGCGTGA-3’;SEQIDNO.15,5’-AGTGAGGACCCTGGATGTGA-3’。
表1针对脑膜炎感染细菌病原体的嵌合引物和公共引物
多重体系的特异性检测:采用多引物+单模板的PCR方法,扩增各个检测细菌的基因组或靶标基因,HI、SA、SP、GBS和LM的模板采用基因组DNA,NM采用合成的ctrA质粒DNA,模板DNA浓度均约为2ng/μL。多重PCR采用的25μL反应体系包括:10μM的公共引物5μL,0.05μM(每条)的嵌合引物混合物5μL,5U/μL的Taqpolymerase0.15μL,25mM的MgCl22μL,10mM的dNTP0.5μL,10×TaqBuffer2.5μL,DNA模板2.5μL,灭菌ddH2O7.35μL;PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,63.5℃退火30s,72℃延伸45s,共10个循环;72℃延伸3min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共25个循环;最后72℃延伸7min。图1为多重体系的特异性检测,其中1-6泳道是PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果,依次为NM、HI、SA、SP、GBS、LM,N为阴性对照,M为DNA标准分子量(目的带大小依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000bp);结果显示,运用本发明的多重体系检测靶标DNA,可以从相应模板中扩增出预期大小的单一产物,且条带清晰,结果表明本发明的多重体系具有高特异性。
2.多重体系的敏感性检测
采用构建的含六种细菌检测靶标基因的质粒进行模板梯度PCR检测,SP、GBS、HI、LM、SA、NM的靶基因依次是lytA、cfb、P6、hly、nuc、ctrA。将各质粒模板用ddH2O进行10倍梯度稀释,依次得到107到101copies/μL稀释度的质粒模板。每个稀释度取1μL作为模板,分别对6个靶标基因进行模板梯度PCR反应。多重PCR采用的25μL反应体系包括:10μM的公共引物5μL,0.05μM(每条)的嵌合引物混合物5μL,5U/μL的Taqpolymerase0.15μL,25mM的MgCl22μL,10mM的dNTP0.5μL,10×TaqBuffer2.5μL,DNA模板1μL,灭菌ddH2O8.85μL;PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,63.5℃退火30s,72℃延伸45s,共10个循环;72℃延伸3min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共25个循环;最后72℃延伸7min。检测结果见图2,a-f分别对应的质粒模板是cfb,hly,lytA,ctrA,P6,nuc基因,1-7泳道对应的模板浓度分别为101到107拷贝,N为阴性对照,M为100bpDNA标准分子量;a-f敏感性依次为102,103,10,102,102和104拷贝,最高敏感性可达10拷贝。结果显示本发明的多重检测体系具有较高的敏感性,可用于细菌性脑膜炎病原体的检测。
实施例二临床脑脊液标本的检测
收集60份疑为中枢神经系统感染的脑脊液标本(CSF),按照QIAgen公司的DNAminiKit(货号51304)中革兰阳性菌的提取方法,对收集到的CSF标本进行基因组提取。采用本发明的检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒,对提取标本基因组DNA进行检测,多重PCR采用的25μL反应体系包括:10μM的公共引物5μL,0.05μM(每条)的嵌合引物混合物5μL,5U/μL的Taqpolymerase0.15μL,25mM的MgCl22μL,10mM的dNTP0.5μL,10×TaqBuffer2.5μL,DNA模板1μL,灭菌ddH2O8.85μL;PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,63.5℃退火30s,72℃延伸45s,共10个循环;72℃延伸3min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共25个循环;最后72℃延伸7min。利用本发明试剂盒对临床标本的检测结果见图3,泳道1是B型链球菌,泳道2为金黄色葡萄球菌,泳道3~6为肺炎链球菌,N为阴性对照,M为DNA标准分子量(目的带大小依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000bp),检测结果均通过扩增产物测序进一步确认。共检测出六例标本,其中四例标本临床培养阴性,两例与临床培养一致。结果表明利用本发明公开的细菌性脑膜炎的多重PCR检测试剂盒可检测出临床培养阴性标本,说明本发明的试剂盒检测敏感性高于临床细菌培养方法,可用于临床检测。
SEQUENCELISTING
<110>苏州大学
<120>一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒
<160>15
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
ATGGTCGTCATCTTCTC17
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
ATGGTCGTCATCTTCTCTTGGCGGTTACTCTGTTGCT37
<210>3
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
ATGGTCGTCATCTTCTCTGCAGGTTTTTCTTCACCGT37
<210>4
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
ATGGTCGTCATCTTCTCAATCTCTGCCTCACTGCCAT37
<210>5
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
ATGGTCGTCATCTTCTCAATCTCTGCCTCACTGCCAT37
<210>6
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
ATGGTCGTCATCTTCTCGAACAGATTTGCCTCAAGTCGG39
<210>7
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
ATGGTCGTCATCTTCTCTAAACTGCTCACGGCTAATGC38
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成
<400>8
ATGGTCGTCATCTTCTCCATCACAAACAGATAACGGCG38
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
ATGGTCGTCATCTTCTCCTTTAGCCAAGCCTTGACGAA38
<210>10
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成
<400>10
ATGGTCGTCATCTTCTCGATGACGAAATGGCTTACAGTG39
<210>11
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成
<400>11
ATGGTCGTCATCTTCTCAGCAACGTATCCTCCAGAGT37
<210>12
<211>37
<212>DNA
<213>人工合成
<400>12
ATGGTCGTCATCTTCTCCTAGTGGCTGGTGCATTGTT37
<210>13
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成
<400>13
ATGGTCGTCATCTTCTCGATTGTAGCTCTATCAGTTGGT39
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>14
AGCGGGAAATCGTGCGTGA19
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>15
AGTGAGGACCCTGGATGTGA20