CN1548545A - 一种用于多靶序列pcr检测的公共引物及其对多靶核酸序列进行pcr扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
涉及一种采用公共引物进行多种靶核酸的PCR扩增技术，主要用于在核酸水平上对多靶核酸的检测。用于多靶序列PCR检测的公共引物为一对寡核苷酸片断，公共引物的碱基序列及其数目不限，包括荧光标记型和非标记型两种。利用公共引物进行多靶序列PCR检测的方法为：设计公共引物、特异引物、实时荧光PCR检测。公共引物设计简单，引物序列设计不依赖靶序列，可以根据需要设计出能达到最少引物二聚体的引物。成本低，可以做到制备一对公共引物能对多个靶序列进行PCR检测。能与常用的荧光PCR检测技术兼容，可在同一反应体系中实现多种检测技术并用，增加检测准确度。
Description
(1)技术领域
本发明涉及一种采用公共引物进行多种靶核酸的PCR扩增技术，主要用于在核酸水平上对多靶核酸的检测。
(2)背景技术
核酸扩增技术应用的最广泛的是PCR技术，它可在数小时内将及微量的目的核酸片段扩增至几百万倍。该技术自发明以来已广泛应用于生物和医学研究的各个领域。其原理是：双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA，单链DNA(模板)在互补寡核苷酸片段(引物)的引导下，可以利用DNA聚合酶(Taq酶)按5’-3’方向复制出互补DNA(PCR产物)。PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列(靶序列)DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA 5’端的引物对应于正链DNA单链的序列，3’端的引物对应于负链DNA单链的序列。在含有引物、Taq酶、DNA合成底物dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物)的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增，所以这一反应称为聚合酶链式扩增反应。
常用简易的PCR产物检测方法有：核酸电泳、PCR-ELISA、实时荧光PCR等。核酸电泳、PCR-ELISA等由于操作烦琐，需要对PCR产物进行后处理，很容易造成PCR产物的污染，导致PCR检测结果假阳性，严重制约PCR检测在临床上的应用。实时荧光PCR是近几年发展起来的新技术，具有许多优点，其采用的闭管检测在临床诊断中的优势尤其明显，消除了传统PCR等核酸检测技术的扩增产物污染问题。其原理是在PCR反应过程中利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到对原始模板的定量。荧光PCR的原理不同，一般采用荧光共振能量转移原理使荧光信号发生变化。荧光PCR主要有以下几类：SYBR Green、分子信标(Molecular Beacons)、TaqMan探针、ScorpionsTM探针和AmplifluorTM系统等。
对于多靶核酸序列的检测，需要设计多对引物和荧光探针，成本比较高。
(3)发明内容
本发明的目的旨在提供一种设计简单，成本低，可用于多靶序列实时荧光PCR检测的公共引物及其对多靶核酸序列进行PCR扩增的方法。
所说的用于多靶序列PCR检测的公共引物为一对(两条)寡核苷酸片断，公共引物的碱基序列及其数目不限，包括荧光标记型和非标记型两种。荧光标记型公共引物是由两条碱基互补配对寡核苷酸片断组成，其中一条核酸链标记荧光供体，另一条核酸链标记荧光受体。荧光标记型公共引物两条链在稳定的双链结构时，荧光受体靠近荧光分子，荧光分子的荧光被淬灭，此时公共引物不发荧光。当在酸、碱、热等变性条件下公共引物两条链互相分开，荧光受体与荧光分子分开，荧光分子发出荧光。当恢复到温和条件时，两条链复性为双链状态，荧光受体靠近荧光分子，荧光分子的荧光被淬灭。
非标记型公共引物的两条寡核苷酸片断不需要碱基互补配对。非标记型公共引物设计必须符合以下原则：
1)公共引物的碱基序列应选择与待扩增模板序列同源性最小的序列，引物的3’端与模板互补的碱基数不能超过3个；
2)公共引物的碱基序列及其数目的设计应遵守引物设计的常用规则，如碱基数目不能大于50个或小于10个，碱基(G+C)的含量不能太高，退火温度不能太低或太高、引物内或引物间不能形成有利于产生引物二聚体的结构等。
荧光标记型公共引物设计在遵循非标记型设计的基础上还必须符合以下条件：
1)公共引物采用两条碱基互补配对的寡核苷酸片断，在公共引物的一条寡核苷酸链上标记荧光供体，另一条寡核苷酸链上标记荧光受体。荧光供体和荧光受体间的距离应小于120埃。
2)公共引物两条链间的互补配对的碱基数应满足两条寡核酸链复性时荧光供体与其受体能产生有实用价值的荧光淬灭效果。
利用荧光标记型公共引物进行多靶序列PCR检测方法如下：
1)根据荧光标记型公共引物设计的规则设计公共引物。
2)特异引物的设计：特异引物由与公共引物序列相同的公共引物部分和与待扩增靶序列互补的靶引物部分组成。靶引物位于特异引物的3’端，采用常规PCR的引物设计方法，使碱基序列与所需要的靶序列互补。公共引物部分位于特异引物部分的5’端，与靶引物连接，构成同一条寡核苷酸链，碱基序列与公共引物相同。
3)实时荧光PCR检测：在常用的PCR反应混合体系(PCR缓冲液、Taq酶、dNTP)中，加入荧光公共引物、特异引物、待测样品。进行复性、延伸、热变性三步热循环反应，在第一个循环的热变性阶段，公共引物、特异引物及模板均发生变性，公共引物中的荧光分子和其受体分离发出荧光。在复性阶段，由于这时的反应体系中没有与公共引物序列同源的模板，公共引物两条链发生复性，荧光分子靠近其受体，不发出荧光。特异引物中的靶引物分别和模板中对应的靶序列复性，Taq酶以它作为扩增引物进行PCR扩增，同时公共引物序列信息被导入PCR产物。第二个PCR反应与第一个PCR反应的情况类似，公共引物两条链的序列信息都被导入到同一条PCR产物中。在第三个循环的复性阶段，反应体系中PCR产物两端已含公共引物同源序列，公共引物与PCR产物复性，Taq酶以公共引物作为扩增引物进行PCR扩增，这时公共引物两条链被分离。荧光分子远离荧光受体，发出荧光。在随后的反应中，通过检测复性阶段PCR反应体系中的荧光强度可知反应体系中PCR扩增产物的量。
利用荧光标记型公共引物进行多靶序列PCR检测的优点：
1、荧光公共引物设计简单，引物序列设计不依赖靶序列，可以根据需要设计出能达到最佳荧光效果的引物。
2、成本低，由于荧光公共引物在靶序列检测时通用，可以做到制备一对公共引物能对多个靶序列进行荧光PCR检测。
3、能与常用的荧光PCR检测技术兼容，可在同一反应体系中实现多种检测技术并用，增加检测准确度。
利用非标记型公共引物进行多靶序列PCR检测方法如下：
1)根据非标记型公共引物设计的规则设计公共引物。
2)特异引物的设计：特异引物由与公共引物序列相同的公共引物部分和与待扩增靶序列互补的靶引物部分组成。靶引物位于特异引物的3’端，采用常规PCR的引物设计方法，使碱基序列与所需要的靶序列互补。公共引物部分位于特异引物部分的5’端，与靶引物连接，构成同一条寡核苷酸链，碱基序列与公共引物相同。
3)PCR检测：在常用的PCR反应混合体系(PCR缓冲液、Taq酶、dNTP)中，加入公共引物、特异引物、待测样品。进行复性、延伸、热变性三步热循环反应，在第一个循环的热变性阶段，公共引物、特异引物及模板均发生变性。在退火阶段，由于这时的反应体系中没有与公共引物序列同源的模板，公共引物不引起PCR扩增，而靶引物可和模板中的靶序列复性，Taq酶以它作为扩增引物进行PCR扩增，公共引物序列信息被导入PCR产物。第二个PCR反应与第一个PCR反应的情况类似，公共引物两条链的序列信息都被导入到同一条PCR产物中。在第三个循环的退火阶段，反应体系中PCR产物已含公共引物同源序列，公共引物的两条寡核苷酸链分别与PCR产物复性，Taq酶以公共引物作为扩增引物，以含有公共引物序列信息的PCR产物为靶序列进行PCR扩增。
4)PCR产物的检测：在荧光PCR检测上的应用，可采用一种荧光嵌入剂，它能嵌入双链DNA发出特定波长的荧光，常用的荧光嵌入剂是SYBR Green I。在常规PCR检测上的应用，可采用电泳、PCR-ELISA等常规的PCR检测方法。
利用非标记型公共引物进行多靶序列PCR检测的优点：
1、公共引物设计简单，引物序列设计不依赖靶序列，可以根据需要设计出能达到最少引物二聚体的引物。
2、成本低，可以做到制备一对公共引物能对多个靶序列进行PCR检测。
3、能与常用的荧光PCR检测技术兼容，可在同一反应体系中实现多种检测技术并用，增加检测准确度。
(4)附图说明：
图1为公共引物结构示意图。其中1代表公共引物第1条寡核苷酸链，2代表公共引物第2条寡核苷酸链。
图2为特异引物结构示意图。其中1代表特异引物第1条寡核苷酸链上的靶引物序列部分：与对应的靶序列同源；2代表特异引物第1条寡核苷酸链上的公共引物序列部分：与公共引物第1条寡核苷酸链序列同源；3代表特异引物第2条寡核苷酸链上的靶引物序列部分：与对应的靶序列同源；4代表特异引物第2条寡核苷酸链上的公共引物序列部分：与公共引物第2条寡核苷酸链序列同源。
图3为荧光公共引物结果示意图。其中1代表荧光公共引物第1条寡核苷酸链；2代表标记在第1条链上的荧光分子；3代表荧光公共引物第2条寡核苷酸链(与第1条寡核苷酸链互补配对)；4代表标记在第2条寡核苷酸链上的荧光受体；5代表公共引物两条链发生复性后荧光分子的荧光被淬灭。
图4为荧光公共引物实时荧光PCR多靶序列扩增原理图。
图5为荧光公共引物实时荧光PCR单靶序列扩增原理图。
图6为非标记公共引物多靶序列PCR扩增原理图。
图7为人柠檬酸脱氢酶实时荧光PCR检测图。
图8为PCR产物琼脂糖电泳图。其中1代表阴性对照；2代表多靶序列PCR扩增产物琼脂糖电泳图，相应的片段大小分别为230bp、345bp、564bp；3代表人柠檬酸脱氢酶基因PCR扩增产物琼脂糖电泳图，相应的片段大小为230bp；4代表人CAPN6基因PCR扩增产物琼脂糖电泳图，相应的片段大小为345bp；5代表鱼生长激素基因PCR扩增产物琼脂糖电泳图，相应的片段大小为564bp。
图9为鱼生长激素实时荧光定量检测图。
图10为鱼生长激素实时荧光定量检测定量曲线图。
图11为荧光公共引物多靶序列(人柠檬酸脱氢酶基因、人CAPN6基因、鱼生长激素基因)实时荧光PCR检测图。
(5)具体实施方式
如图1所示，所说的用于多靶序列PCR检测的公共引物为一对(两条)寡核苷酸片断，公共引物的碱基序列及其数目不限，包括荧光标记型和非标记型两种。荧光标记型公共引物是由两条碱基互补配对寡核苷酸片断组成，其中一条核酸链标记荧光供体，另一条核酸链标记荧光受体。如图3所示，荧光标记型公共引物两条链在稳定的双链结构时，荧光受体靠近荧光分子，荧光分子的荧光被淬灭，此时公共引物不发荧光。当在酸、碱、热等变性条件下公共引物两条链互相分开，荧光受体与荧光分子分开，荧光分子发出荧光。当恢复到温和条件时，两条链复性为双链状态，荧光受体靠近荧光分子，荧光分子的荧光被淬灭。
利用荧光标记型公共引物进行多靶序列PCR检测：
在特异引物的设计中：特异引物由与公共引物序列相同的公共引物部分和与待扩增靶序列互补的靶引物部分组成。靶引物位于特异引物的3’端，采用常规PCR的引物设计方法，使碱基序列与所需要的靶序列互补。公共引物部分位于特异引物部分的5’端，与靶引物连接，构成同一条寡核苷酸链，碱基序列与公共引物相同，参见图2，在多靶序列PCR检测体系中，同一个体系需要扩增2个以上靶序列，就需要设计多对特异引物，其中特异引物中的靶引物部分应分别设计成与所要扩增的靶序列互补，公共引物部分的序列与公共引物相同。
实时荧光PCR检测过程：在常用的PCR反应混合体系(PCR缓冲液、Taq酶、dNTP)中，加入荧光公共引物、特异引物、待测样品。进行复性、延伸、热变性三步热循环反应，在第一个循环的热变性阶段，公共引物、特异引物及模板均发生变性，公共引物中的荧光分子和其受体分离发出荧光。在复性阶段，由于这时的反应体系中没有与公共引物序列同源的模板，公共引物两条链发生复性，荧光分子靠近其受体，不发出荧光。特异引物中的靶引物分别和模板中对应的靶序列复性，Taq酶以它作为扩增引物进行PCR扩增，同时公共引物序列信息被导入PCR产物。第二个PCR反应与第一个PCR反应的情况类似，公共引物两条链的序列信息都被导入到同一条PCR产物中。在第三个循环的复性阶段，反应体系中PCR产物两端已含公共引物同源序列，公共引物与PCR产物复性，Taq酶以公共引物作为扩增引物进行PCR扩增，这时公共引物两条链被分离。荧光分子远离荧光受体，发出荧光。在随后的反应中，通过检测复性阶段PCR反应体系中的荧光强度可知反应体系中PCR扩增产物的量，参见图4，其中，A为PCR反应前，B为以特异引物为扩增引物，C为以公共引物为扩增引物，A1为靶序列1，A2为靶序列2，A3为荧光公共引物，A4为特异引物1，A5为特异引物2，A11，A21分别为靶序列1和靶序列2的PCR扩增，B1为第1个PCR反应，B2为第2个PCR反应，C1为第3个PCR反应(发出荧光)，C2为第4个PCR反应(发出荧光)。
除了可利用荧光标记型公共引物进行多靶序列的PCR检测外，也可用它对单靶序列进行荧光PCR检测，其过程和原理与多靶序列PCR检测相同。参见图5，其中，A为PCR反应前，B为以特异引物为扩增引物，C为以公共引物为扩增引物，A0为靶序列，A3为荧光公共引物，A4为特异引物，B1为第1个PCR反应，B2为第2个PCR反应，C1为第3个PCR反应(发出荧光)，C2为第4个PCR反应(发出荧光)。
公共引物和特异引物的设计与荧光标记型相同。
在常用的PCR反应混合体系(PCR缓冲液、Taq酶、dNTP)中，加入公共引物、特异引物、待测样品。进行复性、延伸、热变性三步热循环反应，在第一个循环的热变性阶段，公共引物、特异引物及模板均发生变性。在退火阶段，由于这时的反应体系中没有与公共引物序列同源的模板，公共引物不引起PCR扩增，而靶引物可和模板中的靶序列复性，Taq酶以它作为扩增引物进行PCR扩增，公共引物序列信息被导入PCR产物。第二个PCR反应与第一个PCR反应的情况类似，公共引物两条链的序列信息都被导入到同一条PCR产物中。在第三个循环的退火阶段，反应体系中PCR产物已含公共引物同源序列，公共引物的两条寡核苷酸链分别与PCR产物复性，Taq酶以公共引物作为扩增引物，以含有公共引物序列信息的PCR产物为靶序列进行PCR扩增。参见图6，其中A为PCR反应前，B为以特异引物为扩增引物，C为以公共引物为扩增引物，A1为靶序列1，A2为靶序列2，A3为公共引物，A4为特异引物1，A5为特异引物2，A11、A21分别为为靶序列1和靶序列2的PCR扩增，B1为第1个PCR反应，B2为第2个PCR反应，C1为第3个PCR反应，C2为第4个PCR反应。
PCR产物的检测：在荧光PCR检测上的应用，可采用一种荧光嵌入剂，它能嵌入双链DNA发出特定波长的荧光，常用的荧光嵌入剂是SYBR Green I，在PCR检测开始时加入反应混合体系。在常规PCR检测上的应用，可采用电泳、PCR-ELISA等常规的PCR检测方法。
以下给出几个实施例：
实施例1：人柠檬酸脱氢酶公共引物实时荧光PCR检测：
1)模板、靶序列及公共引物与特异引物：
靶序列为人柠檬酸脱氢酶基因，扩增片段长230bp；
模板为含人柠檬酸脱氢酶基因的质粒；
公共引物为：
5’-ACG AAC TCG CAC TTG AX(X为dT-FAM)G ACA-3’
5’-CCC AX(X为dT-DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3’
特异引物为：
5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’
5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA TCA CAT GGA CTA CGT TGG CA-3’
2)PCR反应：
PCR反应总体积为25μL，内含10mM Tris-HCL，pH8.3，50mM KCL，2.0U Taq酶，200μM dNTP，2.0mM MgCL2，0.01μM特异引物，0.5μM公共引物，模板1μL。
PCR反应条件：95℃，5分钟预变性后进入PCR循环95℃35秒，55℃40秒，72℃30秒，共40个循环。荧光数据采集在退火阶段55℃时采集。实时荧光检测结果见图7(横坐标为循环数(cycle)，纵坐标为荧光强度(Fluorescence)。PCR产物琼脂糖电泳图见图8。
实施例2：鱼生长激素公共引物实时荧光定量PCR检测：
1)模板、靶序列及公共引物与特异引物：
靶序列为鱼生长激素基因，扩增片段长564bp；
模板为含鱼生长激素CDNA的质粒；
公共引物为：
5’-ACG AAC TCG CAC TTG AX(X为dT-FAM)G ACA-3’
5’-CCC AX(X为dT-DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3’
特异引物为：
5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAC GTA TCA GAA AAC CAA CGG CTC TTCA-3’
5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA GCG GCC GCC TAC AGG GTG CAG TTG GAATCC-3’
2)PCR反应：
PCR反应总体积为25μL，内含10mM Tris-HCL，pH8.3，50mM KCL，2.0U Taq酶，200μM dNTP，2.0mM MgCL2，0.01μM特异引物，0.5μM公共引物，梯度模板各1μL。
PCR反应条件：95℃，5分钟预变性后进入PCR循环95℃35秒，55℃45秒，72℃40秒，共60个循环。荧光数据采集在退火阶段55℃时采集。实时荧光定量检测结果及数据分析见图9(横坐标为循环数(cycle)；纵坐标为荧光强度(Fluorescence))、图10(横坐标为模板浓度(concentration)，纵坐标为CT值)，PCR产物琼脂糖电泳图见图8。
实施例3：多靶序列公共引物实时荧光PCR检测：
1)模板、靶序列及公共引物与特异引物：
靶序列1为鱼生长激素基因，扩增片段长564bp；
靶序列2为人柠檬酸脱氢酶基因，扩增片段长230bp；
靶序列3为人CAPN6基因，扩增片段长345bp；
模板分别为含鱼生长激素CDNA的质粒、含人柠檬酸脱氢酶基因的质粒、含人CAPN6基因的质粒；
公共引物为：
5’-ACG AAC TCG CAC TTG A X(X为dT-FAM)G ACA-3’
5’-CCC AX(X为dT-DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3’
特异引物为：
1、鱼生长激素基因特异引物
5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAC GTA TCA GAA AAC CAA CGG CTC TTCA-3’
5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA GCG GCC GCC TAC AGG GTG CAG TTG GAATCC-3’
2、人柠檬酸脱氢酶基因特异引物
5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’
5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA TCA CAT GGA CTA CGT TGG CA-3’
3、人CAPN6基因特异引物
5’-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3’
5’-CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA CCA GAA ACG AAA GTG AAA-3’
2)PCR反应：
PCR反应总体积为25μL，内含10mM Tris-HCL，pH8.3，50mM KCL，2.0U Taq酶，200μM dNTP，2.0mM MgCL2，3种特异引物各0.01μM混合，0.5μM公共引物，模板1μL分别为含鱼生长激素CDNA的质粒、含人柠檬酸脱氢酶基因的质粒、含人CAPN6基因的质粒、三种质粒的混合物。
PCR反应条件：95℃，5分钟预变性后进入PCR循环95℃35秒，55℃45秒，72℃40秒，共60个循环。荧光数据采集在退火阶段55℃时采集，实验结果见图11(横坐标为循环数(cycle)，纵坐标为荧光强度(Fluorescence))，PCR产物琼脂糖电泳图见图8。
Claims (7)
1、一种用于多靶序列PCR检测的公共引物，其特征在于用于多靶序列PCR检测的公共引物为一对寡核苷酸片断，公共引物的碱基序列及其数目不限，包括荧光标记型和非标记型两种。
2、如权利要求1所述的一种用于多靶序列PCR检测的公共引物，其特征在于荧光标记型公共引物由两条碱基互补配对寡核苷酸片断组成，其中一条核酸链标记荧光供体，另一条核酸链标记荧光受体。
3、如权利要求1所述的一种用于多靶序列PCR检测的公共引物，其特征在于非标记型公共引物的两条寡核苷酸片断不需要碱基互补配对，非标记型公共引物设计必须符合以下原则：
1)公共引物的碱基序列应选择与待扩增模板序列同源性最小的序列，引物的3’端与模板互补的碱基数不能超过3个；
2)公共引物的碱基序列及其数目的设计应遵守引物设计的常用规则，如碱基数目不能大于50个或小于10个，碱基(G+C)的含量不能太高，退火温度不能太低或太高、引物内或引物间不能形成有利于产生引物二聚体的结构。
4、如权利要求1所述的一种用于多靶序列PCR检测的公共引物，其特征在于荧光标记型公共引物设计在遵循非标记型设计的基础上必须符合以下条件：
1)公共引物的碱基序列应选择与待扩增模板序列同源性最小的序列，引物的3’端与模板互补的碱基数不能超过3个；
2)公共引物的碱基序列及其数目的设计应遵守引物设计的常用规则，如碱基数目不能大于50个或小于10个，碱基(G+C)的含量不能太高，退火温度不能太低或太高、引物内或引物间不能形成有利于产生引物二聚体的结构；
3)公共引物采用两条碱基互补配对的寡核苷酸片断，在公共引物的一条寡核苷酸链上标记荧光供体，另一条寡核苷酸链上标记荧光受体，荧光供体和荧光受体间的距离应小于120埃；
4)公共引物两条链间的互补配对的碱基数应满足两条寡核酸链复性时荧光供体与其受体能产生有实用价值的荧光淬灭效果。
5、如权利要求1所述的一种用于多靶序列PCR检测的公共引物，其特征在于所说的公共引物为：
5’-ACG AAC TCG CAC TTG A X(X为dT-FAM)GACA-3’
5’-CCC A X(X为dT-DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3’。
6、利用荧光标记型公共引物进行多靶序列PCR检测方法，其特征在于步骤为：
1)根据荧光标记型公共引物设计的规则设计公共引物；
2)特异引物的设计：特异引物由与公共引物序列相同的公共引物部分和与待扩增靶序列互补的靶引物部分组成，靶引物位于特异引物的3’端，采用常规PCR的引物设计方法，使碱基序列与所需要的靶序列互补；公共引物部分位于特异引物部分的5’端，与靶引物连接，构成同一条寡核苷酸链，碱基序列与公共引物相同；
3)实时荧光PCR检测：在常用的PCR反应混合体系中，加入荧光公共引物、特异引物、待测样品，进行复性、延伸、热变性三步热循环反应。
7、利用非标记型公共引物进行多靶序列PCR检测方法，其特征在于步骤为：
1)根据非标记型公共引物设计的规则设计公共引物；
2)特异引物的设计：特异引物由与公共引物序列相同的公共引物部分和与待扩增靶序列互补的靶引物部分组成，靶引物位于特异引物的3’端，采用常规PCR的引物设计方法，使碱基序列与所需要的靶序列互补；公共引物部分位于特异引物部分的5’端，与靶引物连接，构成同一条寡核苷酸链，碱基序列与公共引物相同；
3)PCR检测：在常用的PCR反应混合体系中，加入公共引物、特异引物、待测样品，进行复性、延伸、热变性三步热循环反应；
4)PCR产物的检测。
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| CN (1) | CN1548545A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101809170A (zh) * | 2007-09-28 | 2010-08-18 | 3M创新有限公司 | 用于检测核酸的双寡核苷酸方法 |
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| CN103571822A (zh) * | 2012-07-20 | 2014-02-12 | 中国科学院植物研究所 | 一种用于新一代测序分析的多重目的dna片段富集方法 |
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| CN111424077A (zh) * | 2019-01-10 | 2020-07-17 | 北京福安华生物科技有限公司 | 一种基于人工模拟核酸技术的增效pcr法富集dna目标区域的方法 |
-
2003
- 2003-05-14 CN CNA031361072A patent/CN1548545A/zh active Pending
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