CN1536088A - 一种多重引物的pcr方法及其反应液和在制备检测试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多重引物的聚合酶链式反应方法及其反应液和在制备微生物检测试剂中的应用，特别涉及在PCR过程中采用92－97℃和65－87℃两种变性温度分别进行最初2或3个循环和其他后续循环，克服了现有的针对同一DNA链的多重PCR中正反引物间相互非专一性配对扩增，形成非特异产物的缺陷。通过合适的产物设计和两种变性温度的设置，显著降低了PCR前期合成的非目标产物参与后续循环的可能性，适用于制备单管式多重PCR快速检测试剂，在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒等病毒各种变异株、血清型、基因型或其亚型检测和结核杆菌等细菌耐药基因检测等方面有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种聚合酶链式反应的方法及其反应液和在制备检测试剂中的应用。
技术背景
经典聚合酶链式反应方法发明于八十年代中期，它采用正、反引物各一个来扩增特定的基因片段。不久，又发展了在一个反应管内用二对或二对以上引物同时扩增几种产物的多重PCR(Multiplex-PCR)方法。现行的多重PCR的几个引物对通常与几个不同的目标基因顺序互补，这些目标基因顺序承载于各自独立的cDNA上，或承载于同一基因组DNA上但彼此相隔的距离相当远。现行的多重PCR常用于比较不同基因的表达水平，在临床检测上则可用多重PCR同时检测二种或二种以上的病源体，如同时检测HAV，HBV和HCV。现行多重PCR除了同时使用几对引物外，在引物的设计和反应条件上与标准PCR几乎完全一致，在标准PCR方法中扩增产物的专一性主要是靠退火温度来控制的，因而非专一产物的形成在现行的多重引物PCR中往往难以避免，这使得多重PCR的引物对数不能太多，否则，多对目标产物和每一对引物所形成的非专一产物使PCR反应本身趋于复杂化，最后产物也难以从电泳条带上得到确认。现行的多重PCR方法更不适合用于扩增同一基因，因为这种情况下除了目标产物和非专一产物外，还常常会形成目标基因的非配对引物之间的扩增产物。然而，用多重PCR扩增同一目标基因在临床检验上特别是在减少病毒基因检测的假阴性上有极大的应用价值。
PCR已广泛用于人体内微生物的检测包括感染性疾病病原体的检测，其原理是病毒、细菌或其他微生物的基因顺序与人体不同，根据目标微生物的某种基因顺序可以设计高度专一的引物，如果人感染该微生物，则从人体某些部位如血液中提取DNA或RNA，通过PCR方法能扩增得到特定的基因片段，反之则否。但是，临床检验实践表明用PCR方法检测微生物特别是检测病毒时存在着严重的假阴性问题。例如已有数十篇论文指出根据临床及免疫方法检测已证明为乙型肝炎阳性的病人，却往往PCR方法检测为阴性。假阴性产生除了技术层面的原因如核酸提纯失误和样品含抑制PCR反应的物质外，主要是病毒基因的多变性所造成的。已发现并阐明其顺序的HBV，HCV和HIV等病毒基因的变种是如此之多，以至于任何一对引物即使是在最保守的区域选择，也几乎不可能与所有的变种完全匹配，如在非常严谨的温度下退火就可能造成假阴性。所以采用一对引物的标准PCR方法不可能克服由于变种顺序多样性而造成的假阴性。
我们从文献报导的35对检测HBV的引物中选取正引物和反应物各六个，用引物设计软件Oligo分析他们与7个HBV基因型中的每一个基因型的代表性菌株顺序的互补情况，结果如表1。
表1.12条HBV引物与7个代表性菌株顺序的互补情况分析
| 引物与模板的结合强度/引物与模板的错配碱基数 | ||||||||
| 引物名称 | 基因型 | A | B | C | D | E | F | G |
| 编号 | M57663 | D00331 | AB048704 | AB048702 | X75664 | X69798 | AF160501 | |
| MD14 | 362/3 | 362/3 | 362/3 | 362/3 | 362/3 | 362/3 | 362/3 | |
| S12 | 328/1 | 369/0 | 369/0 | 369/0 | 369/0 | 369/0 | 369/0 | |
| hp5 | 417/8 | 417/8 | 426/7 | 417/8 | 426/8 | 288/8 | 417/8 | |
| C7 | 143/12 | 210/10 | 210/10 | 210/10 | 210/10 | 210/10 | 164/12 | |
| C5 | 333/1 | 558/0 | 287/3 | 333/1 | 333/1 | 333/1 | 251/6 | |
| S3 | 231/1 | 231/1 | 231/1 | 333/0 | 333/0 | 333/0 | 296/1 | |
| MD30 | 252/6 | 131/8 | 285/7 | 249/6 | 249/6 | 248/6 | 249/6 | |
| S8(-) | 504/0 | 504/0 | 504/0 | 504/0 | 504/0 | 504/0 | 504/0 | |
| IP03 | 345/0 | 244/2 | 323/1 | 323/1 | 244/2 | 294/2 | 264/1 | |
| R2(-) | 161/2 | 384/0 | 362/1 | 384/0 | 384/0 | 238/1 | 384/0 | |
| R1(-) | 403/1 | 403/1 | 360/2 | 403/1 | 403/1 | 341/3 | 363/2 | |
| MD25 | 329/6 | 331/6 | 249/7 | 329/6 | 326/6 | 276/7 | 268/7 | |
| C8 | 260/1 | 260/1 | 474/0 | 260/1 | 260/1 | 474/0 | 260/1 | |
表1的结果说明文献报导的大多数引物只与少数或个别基因型完全或高度匹配，有些引物则与所有代表菌株有大量错配存在，在所选12个引物中仅S8(-〕与所有基因型代表株完全匹配。但是，用软件BLAST对S8(-〕作同源性分析表明它也与相当一部分变种顺序有严重错配。这些事实表明：即使在病毒基因的保守区也极难找到一对引物，能与所有已知顺序的变种完全匹配，何况基因库虽已存有大量变种的顺序但并非涵盖所有的变种。显然，在一个病毒基因的不同区域设计多对引物在一个反应管内作多重PCR，可以在不增加检测步骤的情况下有效地减少或消除由于变种顺序多样性导致的假阴性。假定设计的3对引物与20％，30％或40％的变种有严重错配，则应用标准PCR方法时分别有20％，30％或40％的假阴性，如果用三对引物作多重PCR假阴性必然有不同程度的降低。进一步假定变异是随机的，则假阴性可降低至2.4％。
本发明的多重PCR方法在每一对引物的设计上，将扩增产物的解链温度较低作为考量标准之一，每一对引物能在较低的后续变性温度下完成扩增，从而通过退火温度和变性温度双重筛选机制有效地控制每一对引物的非专一扩增。将这种超低变性温度的多重PCR用于扩增同一基因时可有效阻止非配对引物之间的扩增，使采用多重PCR来克服微生物检测的假阴性缺陷得以实现。应用同样的原理可以用一对或一对以上的共同引物来检测病毒，而同时用另外的分型引物对病毒进行分型，或者同时用另外的(耐药)序列特异性引物来鉴别某些有临床价值的突变菌株如耐药性菌株。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供一种多重引物的聚合酶链式反应方法及其反应液和在制备检测试剂中的应用，以突破现有多重PCR方法中多重引物设计的限制，克服单管内PCR反应不能独立地互不影响地同时扩增同一或不同DNA序列的多个片段的缺陷。
发明构思
本发明的多重引物PCR方法也使用二对以上的引物，但是在引物设计原理、产物特性和PCR反应过程上均与现有多重PCR大不相同。本发明的多重引物中的每一对引物都是根据目标模板的顺序，把扩增产物的变性温度特性作为主要考量标准而设计的，引物的数量比常规的多重PCR大大增加，目标模板之间可以相邻，且能使PCR在2或3个循环后使前期合成的非特异扩增产物因无法解链而在后续循环中失去其模板的功能，从而减少或消除多重PCR扩增过程中由于非配对引物相互作用而造成的PCR产物的复杂性，增加反应的特异性和灵敏度。
技术方案
本发明的聚合酶链式反应方法是由2对以上引物同时针对模板DNA链进行PCR反应，其中模板变性温度在前2或3个循环为92-97℃，在后续的循环中为65-87℃，优选75-83℃。反应中引物对为2-10对，设计于不同的DNA链，或者所有引物均设计于同一模板DNA链。
用于上述的的多重引物PCR的反应液，各条引物在反应液中的最适浓度为0.02-0.2μM。
上述的多重引物的聚合酶链式反应方法适用于制备各种病毒、细菌、衣原体、支原体等微生物的检测试剂，用于减少和消除检测的假阴性，所说的病毒可以是乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒等，所说的细菌可以是结核杆菌、淋病双球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、肺炎双球菌、大肠杆菌等，所说的衣原体可以是沙眼衣原体等，所说的支原体可以是解脲支原体等。
上述的多重引物的聚合酶链式反应方法适合用于制备以上病毒、细菌、衣原体、支原体等各种微生物的血清型、基因型及其亚型或耐药性的检测试剂，方法是将多重引物之一设计于血清型、基因型及其亚型或耐药性的特异性序列，同时满足扩增产物解链温度为65-87℃。
引物与产物设计方法是：首先，选定目标基因的一个典型株，在其顺序的不同区域包括保守区域和亚型特征区域和位点，用引物软件寻找，或借助引物软件根据扩增产物的解链温度等特性初步构划满足上述技术方案要求的多重PCR引物对的区域和长度；然后，在该典型株及2-5个或更多的具不同亚型特征或其他特征的变异株的某一个或若干区域，包括保守区域和亚型特征区域，初选一对或若干对引物。最后，考虑引物对与各种变异株的顺序的互补性，引物对之间的3’端互补特性等因素，选定多重PCR的引物对。
本发明的PCR反应均采用Clontech公司Advantage 2试剂盒。
有益效果(2与4重复较多)
1.本发明的多重PCR用于扩增不同模板时，根据每一模板顺序设计的扩增产物的解链温度均很低，通过严谨的退火温度和超低的变性温度双重机制来控制扩增的专一性，PCR的电泳条带数与引物对数一致，多重引物对的对数比现行多重PCR大大提高。
2.在上述情况下，如果使用比最高允许退火温度低3至12℃左右的温度退火，即使引物与模板顺序有1至4个左右的错配，仍能顺利完成扩增，这就减少或消除了因模板顺序变异而导致的假阴性。在非常低退火温度的情况下，通过控制变性温度可使PCR最初2至3个循环中形成的非专一产物在后续循环中流产，从而确保扩增产物的专一性。而在标准PCR和现行的多重PCR中，降低退火温度导致非专一产物和采取严谨的退火温度时造成的假阴性无法两全其美。
3.本发明多重PCR用于扩增同一模板时，如果每一对引物均与模板匹配，可以在严谨的退火温度和超低变性温度下有效地专一地扩增各个目标序列，获得来自同一目标基因的电泳条带。比较同一样品的不同条带，可以判断各对引物的扩增效率；比较不同样品间的各个条带，可以通过一个管次的试验同时得到几组数据，对不同样品的病毒数量或基因表达进行半定量比较。
4.在上述情况下，如使用比最高允许退火温度低3至12℃左右的温度退火，则每一对引物即使与模板顺序有1至4个左右的错配仍能完成扩增而且不出现非专一条带。因为在多重PCR的若干对引物中只要有一对能扩增得到一条目标扩增条带，就表明目标基因是存在的。所以，超低变性温度和低退火温度多重PCR为检测任一种病毒的各种变异株提供了十分广阔的空间。不难分析，如果在一个病毒基因的几个相对保守的区域选到3对左右的引物，使每一扩增产物解链温度都相当低，那么，不论病毒顺序的变异多复杂，因引物顺序与目标基因顺序错配而导致的假阴性可以完全克服和避免。换言之，设计良好的超低变性温度多重PCR可以检测各种变异株而毋需担心假阴性。
5.针对同一模板的超低变性温度的多重PCR也可用于同时检出目标基因并鉴别其等位基因突变。在这种情况下可以设计含二对或更多对引物的超低变性温度多重PCR，其中一对引物对二个等位基因来说是共同的，另一对引物的一个引物或二个引物的3’端碱基或邻近3’端的若干个碱基是野生(或突变)等位基因所特有的，在严谨的退火温度和超低变性温度下。野生(或突变)等位基因扩增得到二条带，而突变(或野生)等位基因只扩增得到一条带，这样，就简化掉了阳性对照的PCR反应。常规的PCR方法也能鉴别等位基因，但出现阴性结果时必须作一个阳对照试验以表明阴性结果不是由于PCR技术方面的原因造成的。
6.病毒和细菌往往可分成不同的基因型或血清型，在临床诊断和治疗上有较大意义，现有的多重PCR在基因组较小的同一病毒序列的检测中有所限制，设计引物检测病毒同时鉴别其亚型特异性基因也较困难。本发明解决了这一问题。如果对各种亚型能找出区别于其他亚型的特征性的顺序则用第5点的方法，可同时检测病毒并鉴别病毒的亚型。
具体实施方式
实施例1.
超低变性温度多重引物PCR与常规多重PCR的比较。
在人肌动球蛋白基因(基因库编号BC016045)上设计三对引物，其顺序和特性分别列于表2和3。
表2.实施例1的引物顺序
| 名称 | 位置 | 顺序(5’至3’) |
| A01 | 935-953 | TGG ACA TCC GCA AAG ACC T |
| 956-975 | AGA CAG CAC TGT GTT GGC GT | |
| A02 | 1192-1214 | AAA TGC TTC TAG GCG GAC TAT GA |
| 1272-1294 | AAA CAA ATA AAG CCA TGC CAA TC | |
| A03 | 1574-1598 | CTT TCG TGT AAA TTA TGT AAT GCAA |
| 1609-1635 | AAA ATA AAA AAG TAT TAA GGC GAA GAT |
表3.实施例1的引物特性
| 引物 | 扩增产物 | ||||||
| 名称 | 长度 | 解链温度 | 结合强度 | 自身3’互补 | 相互间3’互补 | 长度 | 解链温度 |
| A01 | 19 | 70.1 | 447 | 2/-1.6 | 2/-1.6 | 41 | 77.2 |
| 20 | 70.5 | 453 | 2/-1.3 | 2/-1.3 | |||
| A02 | 23 | 69.7 | 494 | 2/-1.6 | 2/-1.6 | 103 | 78.8 |
| 23 | 69.6 | 435 | ＜2 | 2/-1.6 | |||
| A03 | 25 | 65.8 | 395 | 2/-1.9 | 2/-1.9 | 62 | 67.9 |
| 27 | 66.0 | 460 | 2/-1.5 | 2/-1.5 |
由于三对基因针对同一目标基因而且相隔较近，常规多重PCR条件下会形成非配对扩增产物，其长度和解链温度测算示于表4。
表4.实施例1非配对引物扩增产物特性
| 非配对引物 | 扩增产物长度(bp) | 扩增产物解链温度(℃) |
| A01正引物与A02反引物 | 360 | 87.9 |
| A01正引物与A03反引物 | 701 | 85.8 |
| A02正引物与A03反引物 | 444 | 82.4 |
实施例1的PCR反应采用Clontech的Advantage-2试剂盒，每管反应体积为5微升，每一引物终浓度为0.1uM，每一反应管含cDNA1微升，cDNA由人组织总RNA以Poly(dT)18为引物用Clontech的反转录试剂盒按其规定合成。
PCR反应条件分二组，第一组为常规多重PCR方法，即首次变性95℃1分钟，循环变性95℃30秒钟，退火62℃30秒钟，延伸72℃1分钟，共28个循环，最后延伸72℃3分钟。第二组为超低变性温度多重PCR方法，首次变性，循环退火，循环延伸和最后延伸的条件与第一组相同，最初三个循环变性也为95℃30秒钟，但其后的25个循环的变性改为80℃30秒钟。试验结果见表5。
表5.实施例1对比试验结果
| 引物对 | 常规多重PCR | 超低变性温度多重PCR | ||||
| 目标扩增产物 | 非配对扩增产物 | 非专一扩增产物 | 目标扩增产物 | 非配对扩增产物 | 非专一扩增产物 | |
| A01和A02 | 2 | 1 | + | 2 | 0 | 0 |
| A01和A03 | 2 | 1 | + | 2 | 0 | 0 |
| A02和A03 | 2 | 1 | + | 2 | 0 | 0 |
| A01，A02和A03 | 3 | 3 | + | 3 | 0 | 0 |
+表示有一或若干条带，0表示无条带，数字代表条带数
实施例2.
6对引物的多重PCR。
引物设计见表6。
引物特性见表7。
非配对引物扩增产物特性见表8。
表6.实施例2引物顺序
| 名称 | 位置 | 顺序(5’至3’) |
| A04 | 310-327 | TGG GAC GAC ATG GAG AAA |
| 328-345 | AGA AGG TGT GGT GCC AGA T | |
| A05 | 887-903 | CCT GTG GCA TCC ACG A |
| 912-931 | GTC ACA CTT CAT GAT GGA GTT G | |
| A06 | 1223-1245 | CGT TAC ACC CTT TCT TGA CAAA |
| 1290-1311 | ACC AAA ACA AAA CAA AAA AAA CA | |
| A07 | 1412-1430 | CGA GGA CTT TGA TTG CAC A |
| 1469-1490 | CAA GGG ACT TCC TGTAAC AAT G | |
| A08 | 1552-1571 | CAC AGG GGA GGT GAT AGC AT |
| 1636-1659 | AAG GCT CAT CAT TCA AAA TAA AAC | |
| A09 | 1741-1761 | GCC AGG GCT TAC CTG TAC ACT |
| 1777-1803 | TTT TTT TTA AGG TGT GCA CTT TTA TTC |
表7.实施例2引物特性
| 引物 | 扩增产物 | ||||||
| 名称 | 长度 | 解链温度 | 结合强度 | 自身3’互补 | 相互3’互补 | 长度 | 解链温度 |
| A04 | 18 | 67.1 | 376 | ＜2 | ＜2 | 37 | 74.9 |
| 19 | 66.3 | 387 | 2/-1.5 | 2/-1.5 | |||
| A05 | 16 | 67.2 | 383 | 2/-1.6 | 2/-1.6 | 47 | 76.8 |
| 22 | 66.5 | 362 | 2/-1.9 | 2/-1.9 | |||
| A06 | 22 | 67.5 | 398 | 3/-3.8 | ＜2 | 90 | 76.4 |
| 23 | 66.1 | 384 | ＜2 | 2/-1.9 | |||
| A07 | 19 | 66.9 | 383 | 2/-1.9 | 3/-3.2 | 79 | 76.1 |
| 22 | 67.0 | 391 | 2/-1.9 | 2/-1.9 | |||
| A08 | 20 | 68.4 | 421 | 2/-1.5 | 2/-1.5 | 108 | 74.9 |
| 24 | 66.2 | 400 | ＜2 | 2/-1.3 | |||
| A09 | 21 | 69.0 | 418 | 2/-1.6 | 2/-1.6 | 63 | 76.3 |
| 27 | 68.4 | 408 | ＜2 | ＜2 |
人肌动球蛋白基长小于2000碱基，6对引物有15种非配对组合扩增的可能，测算的扩增产物长度和解链温度示于表8。
表8.实施例2非配对引物扩增产物特性
| 非配对引物 | 扩增产物长度 | 扩增产物解链温度 | 正反引物间3‘端硷基互补(硷基数/千卡/克分子) | |
| 正引物 | 反引物 | |||
| A04正引物与A05反引物 | 624 | 91.1 | 3/-3.1 | 2/-1.9 |
| A04正引物与A06反引物 | 1003 | 90.2 | ＜2 | 2/-1.9 |
| A04正引物与A07反引物 | 1181 | 90.3 | 2/-1.6， | ＜2 |
| A04正引物与A08反引物 | 1350 | 88.5 | ＜2 | ＜2 |
| A04正引物与A09反引物 | 1494 | 88.5 | ＜2 | 3/-3.5 |
| A05正引物与A06反引物 | 426 | 87.4 | ＜2 | 3/-3.2 |
| A05正引物与A07反引物 | 604 | 86.4 | 2/-1.6 | 3/-3.4 |
| A05正引物与A08反引物 | 773 | 85.7 | 2/-1.6 | 2/-1.3 |
| A05正引物与A09反引物 | 917 | 86.1 | 2/-1.6 | 2/-1.6 |
| A06正引物与A07反引物 | 268 | 81.4 | 2/-1.9 | 2/-1.9 |
| A06正引物与A08反引物 | 437 | 82.1 | 2/-1.9 | 3/-3.2 |
| A06正引物与A09反引物 | 581 | 83.6 | 3/-3.8 | 2/-1.6 |
| A07正引物与A08反引物 | 248 | 80.9 | ＜2 | ＜2 |
| A07正引物与A09反引物 | 392 | 83.5 | 5/-8.2 | 2/-1.6 |
| A08正引物与A09反引物 | 252 | 82.5 | 2/-1.5 | 2/-1.6 |
6个配对扩增产物的解链温度均低于76.8℃，而15个非配对扩增产物的解链温度均高于80.9℃。实施例2反应试剂和条件与实施例1相同，但后续循环变性为79℃30秒钟，结果以A04-A09引物对的任意组合包括6对引物的多重PC均得到扩增产物，而无非配对产物和非专一扩增产物。
实施例3.
含10对引物的超低变性温度多重PCR设计方案和实施条件。
用引物设计软件Oligo对Cyclin-D基因(基因库编号NC_053056)进行分析，搜寻到10对具有高严谨性而扩增产物的解链温度均低于81℃的引物。10对引物的位置、特性和45个非配对干扰扩增产物的特性列于表9和表10。
表10.对Cyclin D基因测试获得的10对引物
| 引物对序号 | 产物位置 | 长度 | 扩增产物Tm |
| 1 | 672-734 | 62 | 79.8 |
| 2 | 732-781 | 49 | 79.7 |
| 3 | 1397-1745 | 348 | 80.1 |
| 4 | 1901-2010 | 109 | 76.7 |
| 5 | 2065-2145 | 80 | 77.0 |
| 6 | 2327-2724 | 397 | 79.8 |
| 7 | 3061-3317 | 256 | 79.3 |
| 8 | 3635-3821 | 186 | 80.3 |
| 9 | 3824-3863 | 39 | 76.6 |
| 10 | 3988-4016 | 28 | 78.8 |
表11.各对引物之间相互干扰产物的测试结果
| 引物对序号 | 干扰引物对序号 | 干扰产物位置 | 干扰产物长度 | 干扰产物Tm |
| 1 | 2 | 672-781 | 109 | 84.6 |
| 1 | 3 | 672-1745 | 1073 | 87.1 |
| 1 | 4 | 672-2010 | 1338 | 87.1 |
| 1 | 5 | 672-2145 | 1473 | 87.0 |
| 1 | 6 | 672-2724 | 2052 | 85.9 |
| 1 | 7 | 672-3317 | 2645 | 85.7 |
| 1 | 8 | 672-3821 | 3149 | 86.0 |
| 1 | 9 | 672-3863 | 3191 | 86.1 |
| 1 | 10 | 672-4016 | 3344 | 86.5 |
| 2 | 3 | 732-1745 | 1013 | 87.0 |
| 2 | 4 | 732-2010 | 1288 | 87.0 |
| 2 | 5 | 732-2145 | 1413 | 87.0 |
| 2 | 6 | 732-2724 | 1992 | 85.9 |
| 2 | 7 | 732-3317 | 2585 | 85.7 |
| 2 | 8 | 732-3821 | 3089 | 86.0 |
| 2 | 9 | 732-3863 | 3131 | 86.0 |
| 2 | 10 | 732-4016 | 3284 | 86.5 |
| 3 | 4 | 1397-2010 | 613 | 83.1 |
| 3 | 5 | 1397-2145 | 748 | 83.7 |
| 3 | 6 | 1397-2724 | 1327 | 83.6 |
| 3 | 7 | 1397-3317 | 1920 | 83.9 |
| 3 | 8 | 1397-3821 | 2424 | 84.7 |
| 3 | 9 | 1397-3863 | 2466 | 84.8 |
| 3 | 10 | 1397-4016 | 2620 | 85.6 |
| 4 | 5 | 1901-2145 | 244 | 82.1 |
| 4 | 6 | 1901-2724 | 823 | 82.8 |
| 4 | 7 | 1901-3317 | 1416 | 83.7 |
| 4 | 8 | 1901-3821 | 1900 | 84.7 |
| 4 | 9 | 1901-3863 | 1962 | 84.9 |
| 4 | 10 | 1901-4016 | 2115 | 85.7 |
| 5 | 6 | 2065-2724 | 659 | 82.4 |
| 5 | 7 | 2065-3317 | 1252 | 83.6 |
| 5 | 8 | 2065-3821 | 1767 | 84.8 |
| 5 | 9 | 2065-3863 | 1798 | 84.9 |
| 5 | 10 | 2065-4016 | 1951 | 85.8 |
| 6 | 7 | 2327-3317 | 990 | 82.9 |
| 6 | 8 | 2327-3821 | 1494 | 84.6 |
| 6 | 9 | 2327-3863 | 1536 | 84.7 |
| 6 | 10 | 2327-4016 | 1689 | 85.7 |
| 7 | 8 | 3061-3821 | 760 | 84.6 |
| 7 | 9 | 3061-3863 | 802 | 85.5 |
| 7 | 10 | 3061-4016 | 955 | 85.7 |
| 8 | 9 | 3635-3863 | 228 | 82.1 |
| 8 | 10 | 3635-4016 | 381 | 87.7 |
| 9 | 10 | 3824-4016 | 192 | 92.1 |
结果表明干扰产物的Tm值介于82.1-92.1℃，且大部分介于83-87℃，显著与正常产物不在同一温度范围，也就是说，在该基因的4300碱基的序列中已可能获得10对引物，满足扩增产物和干扰产物的解链温度不在同一范围的设计要求。如后续循环变性温度为81℃可排除干扰产物变性仅得到目标扩增产物。
实施例4.
多重引物PCR减少或消除乙型肝炎病毒检测假阳性设计方案和实施条件。
将常用的检测HBV的引物(表1)，按本发明的设计思想对其长度和顺序进行修改，重新配合组成三对引物，其顺序和特性示于表12和13。粗黑体字母代表经改动的核苷酸，引物位置均以基因库编号为E00010的病毒变株顺序为准。
三对引物的三个非配对干扰产物的特性列于表14。
表12.实施例4引物序列
| 引物对名称 | 引物位置 | 引物顺序(5’至3’) |
| HBV01 | 416-436 | CTG CAG CTA TGC CTC ATC TTC |
| 461-479 | GAC AAA CGG GCA ACA TAC C | |
| HBV02 | 1902-1921 | GCA TGG ACA TTG ACC CGT ATAA |
| 1958-1979 | AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCAA | |
| HBV03 | 2271-2298 | GAG TGT GGA TTC CCA CTC |
| 2300-2315 | GGG CAT TTG GTG GTG T |
表13.实施例4引物序列特性
| 引物 | 扩增产物 | 引物3’端互补 | |||||
| 名称 | 长度 | 解链温度(℃) | 与模板结合强度 | 长度 | 解链温度(℃) | 碱基数 | 千卡/克分子 |
| HBV01 | 21 | 68.6 | 395 | 64 | 77.5 | 2 | -1.6 |
| 19 | 67.3 | 469 | ＜2 | ||||
| HBV02 | 22 | 67.2 | 393 | 78 | 77.8 | ＜2 | -3.8 |
| 22 | 67.9 | 422 | 3 | ||||
| HBV03 | 18 | 63.4 | 374 | 45 | 79 | ＜2 | -1.6 |
| 16 | 63.5 | 395 | 2 |
表14.实施例4非配对干扰扩增产物特性
| 非配对引物 | 扩增产物长度 | 扩增产物解链温度(℃) |
| HBV01正引物与HBV02反引物 | 1564 | 87.5 |
| HBV01正引物与HBV03反引物 | 1900 | 87.2 |
| HBV02正引物与HBV03反引物 | 414 | 84.6 |
由此可见，配对产物解链温度均小于79℃，而非配对干扰扩增产物解链温度均大于84℃。根据这些数据和实施例1和2的结果，将退火温度控制在50-63℃，后续变性温度控制在80-83℃，每一对引物均能以与其完全匹配或高度匹配的变种为模板专一地扩增出目标产物。
实施例5.
用多重引物方法检测乙肝病毒同时检测联合突变的设计方案和实施条件。
(背景说明：基因库储存的1000余个乙型肝炎病毒基因顺序和国内外的临床检测分析表明，约四分之一的乙型肝炎病毒在C基因启动子的1762位和1764位同时发生A转变为T和G转变为A的所谓联合突变，使HBV的mRNA的转录合成速度有所降低，因而与疾病的严重性和治疗有关有一定的临床关系。通常用PCR-RFLP，即PCR-限制性内切酶片段多态性方法来鉴别野生株和C基因启动子的联合突变株(见中华实验和临床病毒学杂志，2000，14(2)163p；中华学检验杂志1999，22(5))。这种方法需进行二次PCR，其中一次人为地在第1767位引进T至A突变，使突变株的PCR产物含有一个Bcl-I的酶切点顺序TGATCA，而野生株PCR产物顺序为AGTTCA，不被Bcl-I酶所切，对扩增产物进行酶解和然后电泳鉴能鉴别野生型和突变型。复杂的操作过程限制了它在临床诊断上的推广应用。另外，有些变种在第1763，1765和1766位也发生突变，使得在人为引进1767位的突变后，1762和1764位联合突变株仍得不到TGATCA顺序，因而不被酶所切而出现假阴性判断。)
本实施例设计一对共用引物，用以检查HBV病毒的存在。设计二组引物用于鉴别野生型和联合突变型，其中一组的正引物有二个，均以1764位作为其3’端。而另一组的反引物有二个，均以1762位作为其3’端，共有引物和用于检测联合突变的引物的顺序和特性列于表15和表16。
表15.实施例5的引物顺序
| 引物对名称 | 引物位置 | 序列(3’-5’) |
| HBV 04 | 708-724 | AGG GCT TTC CCC CAC TG |
| 802-826 | CCC AAA GAC AAA AGA AAA TTG GTA A | |
| HBV05正引物 | 1737-1755 | GAG TTG GGG GAG GAG GTT A |
| HBV05反引物检野生型 | 1782-1762 | ACA GCC CCC TAG TAC AAA GAC CT |
| HBV05反引物检突变型 | 1782-1762 | ACA GCC TCC TAA TAC AAA GAT CA |
| HBV06正引物检野生型 | 1743-1764 | GGG GAG GAG GTT AGG TTA AAG G |
| HBV06正引物检突变型 | 1743-1764 | GGG GAG GAG ATT AGG TTA ATG A |
| HBV06反引物 | 1789-1810 | GCT GGT GAA CAC ACC AAT TTA T |
注：HBV04引物位置以基因扩编号为E00010的变种顺序为准；HBV05和HBV06引物的位置以基因库编号为AF479684变种顺序为准。
表16.实施例5的引物的特性
| 引物 | 长度 | 与野生株结合强度 | 与突变株结合强度 | 与野生株近似解链温度 | 与突变株近似解链温度 | 扩增产物解链温度 | 扩增产物解链温度 |
| HBV 04 | 17 | 464 | 432 | 69.5 | 69.5 | 119 | 81.8 |
| 25 | 464 | 432 | 69.8 | 69.8 | |||
| HBV05正引物 | 19 | 456 | 456 | 63.3 | 63.3 | 46 | 77.9 |
| HBV05反引物检野生型 | 23 | 466 | 153 | 64.0 | 52.6 | ||
| HBV05反引物检突变型 | 23 | 157 | 454 | 51.8 | 63.2 | ||
| HBV06正引物检野生型 | 22 | 458 | 175 | 67.8 | 56.9 | 68 | 80.5 |
| HBV06正引物检突变型 | 22 | 180 | 435 | 56.9 | 67.8 | ||
| HBV06反引物 | 22 | 385 | 385 | 64.2 | 64.2 |
检测HBV的共用引物HBV04及检测联合突变引物HBV05和HBV06的目标扩增产物解链温度均低于82℃，后续变性温度为83℃时，均能完成变性步骤。HBV05的“野生型”反引物和HBV06的“野生型”正引物均能在65℃与野生型模板退火，而在同样温度下均不能与联合突变型模板退火完成扩增。同样，HBV05的“突变型”反引物和HBV06“突变型”正引物能在65℃与联合突变型模板退火，而在同样温度下不能与野生型模板退火。检测时每一个样品分二管，每一管都含HBV04引物对，HBV05正引物和HBV06反引物。其中甲管还含有二个“野生型”引物，而乙管还含有二个“突变型“引物。如甲管PCR结果出现119，46和68三个条带说明样品为野生型，如乙管出现三个条带说明样品为1762和1764位联合突变型。如甲乙二管均无条带说明样品为HBV阴性。
实施例6.
多重引物PCR减少或消除丙型肝炎病毒检测假阳性的设计方案和实施条件。
HCV基因上游的非编码区相当保守，文献报导的大量引物取自该区域，按本发明的设计思想从其中的4对引物中选取4条，并在引物长度等方面稍作调整后，重新配成2对引物，其顺序和特性列与表17和表18。
表17.实施例6引物顺序
| 引物名称 | 引物位置* | 引物顺序(5’至3’) |
| HCV01 | 18-32 | GGC GAC ACT CCA CCA |
| 69-97 | CAT GGC TAG ACG CTT TCT G | |
| HCV02 | 245-266 | GAC TGC TAG CCG AGT AGT GTT |
| 281-301 | CCC TAT CAG GCA GTA CCA CAA |
*以基因库编号为177039的HCV变种顺序为准
表18.实施例6引物特性
| 引物 | 扩增产物 | 引物3’端互补 | |||||
| 名称 | 长度 | 解链温度(℃) | 与模板结合强度 | 长度 | 解链温度(℃) | 碱基数 | 千卡/克分子 |
| HCV01 | 15 | 64.1 | 396 | 70 | 82.5 | ＜2 | -1.9 |
| 19 | 65.7 | 395 | 2 | ||||
| HCV02 | 22 | 67.6 | 434 | 57 | 82.3 | ＜2 | -4.7 |
| 21 | 68.4 | 396 | 3 | ||||
HCV01正引物和HCV02反引物之间的扩增产物长284碱基，扩增产物解链温度89.7℃。所以当控制退火温度55-64℃，后续变性温度84℃，能完成目标扩增产物的合成。在反应最初形成的非配对干扰扩增产物，在后续变性温度84℃时流产。
实施例7.
多重引物PCR减少和消除人免疫缺陷病毒检测假阴性的设计方案和实施条件。
分别在HIV病毒的保守区域gag和env基因各设计2对引物，其中，HIV01选自文献报导的引物对，仅对引物长度稍作修改。其他三对引物的正引物均选自文献报导引物，对其长度也稍作修改。4对引物的顺序和特性列于表19和20。
表19.实施例7引物顺序
| 引物名称 | 引物位置* | 引物顺序(5’至3’) |
| HIV01 | 1313-1334 | GAC ATC AAG CAG CTA TGC AAA |
| 1370-1394 | GCA TGT ACT GGA TGT AAT CTA TCC C | |
| HIV02 | 1495-1517 | CCA CCT ATC CCA GTA GGA GAA AT |
| 1577-1592 | CCT TGT CTT ATG TCC AGA ATG C | |
| HIV03 | 7309-7332 | TGG AGG GGA ATT TTT CTA CTG TAA |
| 7426-7454 | GCC ACA AAT TTA ATA TTT GTT TTA TTC TG | |
| HIV04 | 7805-7829 | GCC AGA CAA TTA TTG TCT GGT ATA G |
| 7847-7865 | CCT CAA TAG CCC TCA GCA G |
*顺序位置以基因库编号为U23487的HIV变种为准
表20.实施例7引物特性
| 引物 | 扩增产物 | 引物3’端互补 | |||||
| 名称 | 长度 | 解链温度(℃) | 与模板结合强度 | 长度 | 解链温度(℃) | 碱基数 | 千卡/克分子 |
| HIV01 | 22 | 67.8 | 401 | 82 | 77.8 | 2 | -1.5 |
| 25 | 68.3 | 414 | 2 | -3.1 | |||
| HIV02 | 23 | 68.1 | 407 | 104 | 77.1 | 2 | -1.5 |
| 22 | 67.1 | 389 | 2 | -3.1 | |||
| HIV03 | 24 | 68.5 | 433 | 146 | 77.1 | 2 | -1.9 |
| 29 | 68.7 | 424 | 2 | -1.9 | |||
| HIV04 | 25 | 66.5 | 392 | 61 | 78.0 | 2 | -1.6 |
| 19 | 67.0 | 423 | 2 | -1.6 | |||
4对引物的目标扩增产物的解链温度均低于78℃，当退火温度为55-68℃，后续变性温度为80℃时，能专一地完成扩增。gag基因和env基因相隔超过5000个碱基，所以，HIV01和HIV02的引物不会与HIV03和HIV04的引物发生非配对的干扰性扩增，而HIV01正引物与HIV02反引物及HIV03正引物与HIV04反引物的非配对干扰扩增产物的长度和解链温度经测算分别为280碱基、82.3℃和557碱基、83.3℃，当后续变性温度为80℃时，因在变性步骤受阻而不能完成扩增。
实施例8.
多重引物PCR同时检测不同型人乳头瘤病毒的设计方案和实施条件。
人乳头瘤病毒已鉴定的约有70种，每一种型内的顺序较保守，而型间的区别较大。其中，6型，11型和16型等比较常见或与恶性肿瘤有关。实施例8设计一对引物与16型匹配，它取自文献报导的引物仅在长度上作调整，命名为HPV16-01。另设计二对引物与11和6型匹配，命名为HPV11-01和HPV11-02。HPV11-01的正引物和HPV11-02的反引物根据文献报导引物在长度上稍作调整。HPV11-01的反引物和HPV11-02的正引物相接，该部位顺序在文献报导中被用作探针。三对引物的顺序和特性示于表21和表22。
表21.实施例8引物顺序
*HPV16引物顺序和位置以基因库编号为NC_001526的16型HPV为准，HPV11引物的顺序和位置以基因库编号为M14119的11型HPV为准
| 引物名称 | 引物位置* | 引物顺序(5’至3’) |
| HPV16-01 | 220-244 | ACG TGA GGT ATA TGA CTT TGC TTT T |
| 401-429 | GGC TTT TGA CAG TTA ATA CAC CTA ATT AA | |
| HPV11-01 | 117-133 | GCC TCC ACG TCT GCA AC |
| 139-159 | ACG TCT TGC ACA ACT GGT CTA | |
| HPV11-02 | 160-182 | TTA ATC TTT CTT TGC ACA CTC TG |
| 208-223 | GCG GTG GTC AGT GCA T |
表22.实施例8引物特性
| 引物 | 扩增产物 | 引物3’端互补 | |||||
| 名称 | 长度 | 解链温度(℃) | 与模板结合强度 | 长度 | 解链温度(℃) | 碱基数 | 千卡/克分子 |
| HPV16-01 | 25 | 67.8 | 400 | 210 | 77.7 | ＜2 | 2/-1.9 |
| 29 | 68.5 | 422 | 5/-6.3 | 2/-1.9 | |||
| HPV11-01 | 17 | 67.5 | 378 | 43 | 76.7 | 2/-1.3 | 2/-1.3 |
| 21 | 66.9 | 358 | 2/-1.0 | ＜2 | |||
| HPV11-02 | 23 | 64.8 | 372 | 64 | 78.1 | 2/-1.9 | 3/-3.5 |
| 16 | 66.1 | 395 | 2/-1.9 | 2/-1.5 | |||
上述3对引物目标扩增产物的解链温度均低于78.1℃，当控制退火温度为50-64℃，后续温度为80℃时，能专一地扩增目标产物。PCR反应液电泳染色后出现210bp条带，说明为HPV16型，出现43或/和64bp条带说明样品为HPV11或6型，若无条带说明不存在上述三型HPV。若提高后续变性温度至82℃，也会出现107bp条带，是HPV11-01正引物和HPV11-02反引物的扩增产物，也说明样品存在HPV11型或HPV6型病毒。
实施例9.
多重引物PCR同时检测乙型肝炎病毒HBV、丙型肝炎病毒HCV和人免疫缺陷病毒HIV设计方案和实施条件。
将上述表16的引物对HBV04，表17的引物对HCV01和表19的引物对HIV03作多重PCR，在退火温度为50-64℃，后续变性温度为84℃的条件下，三对引物均能专一地扩增目标产物。电泳染色后的119bp，70bp和146bp条带分别指示HBV，HCV和HIV的存在。
Claims (7)
1.一种多重引物的聚合酶链式反应方法，由2对以上引物同时针对模板DNA链进行如下反应：
(1)模板变性；
(2)引物退火；
(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；
(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；
其特征在于，模板变性温度在前2或3个循环为92-97℃，在后续的循环中为65-87℃。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于反应中引物对为2-10对。
3.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所有引物均设计于不同模板或同一模板DNA链。
4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于后续的循环中变性温度为75-83℃。
5.用于权利要求1所述的多重引物的聚合酶链式反应的反应液，其特征在于各条引物在反应液中的浓度为0.02-0.2μM。
6.权利要求1所述的多重引物的聚合酶链式反应方法在制备病毒、细菌、衣原体、支原体等各种微生物的变异株、血清型、基因型及其亚型或耐药菌株检测试剂中的应用，其特征在于多重引物设计于变异株、血清型、基因型及其亚型或耐药菌株的的特异性序列，且各产物解链温度均为65-87℃。
7.根据权利要求6所述的反应方法的应用，其特征在于所说的各种微生物包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、结核杆菌、淋病双球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、肺炎双球菌、大肠杆菌、沙眼衣原体和解脲支原体。
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