WO2017138484A1 - 標的核酸を検出する方法およびそれに用いる核酸プローブ - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、QProbeの設計の際に、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズする領域(以下、「プローブ結合領域」という)には、QProbeをハイブリダイズさせるのに適した領域、すなわち、高感度を保つために、蛍光色素が結合したシトシン塩基に対向するグアニン塩基から1~7塩基以内に、シトシン塩基が存在しない領域を選定せざるを得ない。
一方、本発明でいう「ミスマッチ」とは、標的核酸が有するプローブ結合領域の塩基配列に対して、プローブが有するオリゴヌクレオチドの塩基配列が、1塩基でも相補的でないため、標的核酸が有するプローブ結合領域とプローブが有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズできないこと、又は、「完全マッチ」と比較して、より低い融解温度を有することをいう。
ここでいう「融解温度」とは、二本鎖核酸の50%が変性して一本鎖となる温度をいう。
本実施形態における核酸は、DNA及びRNAの天然に存在する核酸であってもよく、Locked Nucleic Acid(LNA)及びPeptide Nucleic Acid(PNA)などの人工核酸であってもよい。
末端のシトシン塩基から1~7塩基以内に、グアニン塩基が2つ以上存在する場合、末端のシトシン塩基の最も近くに位置するグアニン塩基以外は、蛍光の消光作用を持たない塩基に置換してもよく、置換しなくともよい。第一の核酸プローブの感度をより高める観点からは、末端のシトシン塩基から1~7塩基以内に存在するグアニン塩基のうち、2塩基以上を蛍光の消光作用を持たない塩基に置換することが好ましい。
また、オリゴヌクレオチドの3’末端に蛍光色素を結合させる場合、例えば、リボース又はデオキシリボースの3’位の炭素原子に結合しているヒドロキシ基にアミノ基を導入し、このアミノ基に蛍光色素を共有結合させる方法が挙げられる。
一方、核酸がプローブ結合領域を有しない場合、第一の核酸プローブは核酸にハイブリダイズすることができず、蛍光色素にグアニン塩基が接近することがないため、蛍光色素の蛍光は消光しない。すなわち、このとき、蛍光色素の蛍光が観測される(図1(b))。
したがって、例えば、本実施形態における第一の核酸プローブと試料とを混合した際に、混合前に比べて、蛍光強度が減少するときは、試料中に標的核酸が存在すると判断できる。
融解曲線分析の一つとしては、例えば、次の方法が挙げられる。この方法では、まず、本実施形態における第一の核酸プローブと試料とを混合し、熱処理により試料中の二本鎖核酸を一本鎖核酸へと解離(変性)する。さらに、この方法では、第一の核酸プローブと標的核酸がハイブリダイズする温度(以下、場合により「ハイブリダイズ温度」という)まで、この混合液の温度を下降させながら、混合液の蛍光強度を測定する。
試料中の核酸がプローブ結合領域を有する場合、混合液の温度が所定の温度まで下降すると、第一の核酸プローブは試料中の核酸にハイブリダイズし、蛍光色素にグアニン塩基が接近するため、混合液の蛍光強度が減少する。以下、このときの温度を「消光開始温度」という。
一方、試料中の核酸がプローブ結合領域を有しない場合、消光開始温度まで下降したとしても、第一の核酸プローブは試料中の核酸にハイブリダイズできず、蛍光色素にグアニン塩基が接近しないため、混合液の蛍光強度は減少しない。
したがって、消光開始温度時に観測される蛍光強度に比べて、混合液の温度をハイブリダイズ温度まで下降させたときに観測される、混合液の蛍光強度が減少する場合には、試料中に標的核酸が存在すると判断できる。
核酸増幅反応の反復サイクル数が増えると、試料中の標的核酸(増幅産物)が増えるため、アニーリング段階において、標的核酸にハイブリダイズする第一の核酸プローブが増える。したがって、核酸増幅反応のアニーリング段階において、混合液の蛍光強度を測定すると、核酸増幅反応の反復サイクル数の増加に伴い、蛍光強度の減少量が増大する。
プローブが標的核酸にハイブリダイズしたときに、プローブが有する蛍光の消光作用を持たない塩基に対向する、プローブ結合領域の塩基の種類によって、消光開始温度は異なる。
したがって、例えば、以下のようにしてSNPの有無及びSNPを構成する塩基の種類を判断することができる。まず、プローブが有する蛍光の消光作用を持たない塩基に対向する、プローブ結合領域の塩基の種類を他の塩基に変更した場合の消光開始温度をあらかじめ測定しておく。次に、あらかじめ測定した消光開始温度と、別途、測定した試料中の標的核酸における消光開始温度とを照らし合わせることにより、SNPの有無及びSNPを構成する塩基の種類を判断することができる。
核酸プローブが有するオリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1塩基離れて存在するグアニン塩基を、ヒポキサンチン塩基に置換したQProbe(以下、「IQP1」という)を用いて融解曲線分析を行った。また、比較例として置換を行っていないQProbe(以下、「QP1」という)を用いて融解曲線分析を行った。
標的核酸:配列番号1の塩基配列を有する合成DNA(以下、「モデル1」ともいう) 10μM。
QProbe:配列番号2、3の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にTAMRAを結合させたプローブ(QP1及びIQP1) 2μM。
ハイブリダイズ用バッファー:KCl、Tris-HCl(pH8.0)及びTween-20を含むバッファー。
なお、標的核酸及びQProbeは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
モデル1 3.2μL、QP1又はIQP1 0.5μL及びハイブリダイズ用バッファー21.3μLを混合して、終濃度がそれぞれモデル1 1.28μM、QP1又はIQP1 0.04μM、KCl 50mM、Tris-HCl(pH8.0)10mM及びTween-20 0.1%である混合液を調製した。また、モデル1を混合せず、QP1又はIQP1 0.5μL及びハイブリダイズ用バッファー 24.5μLを混合して混合液を調製した。混合液の調製は8連チューブで行なった。混合液の温度を95℃から20℃まで下降させながら、蛍光強度を測定し、融解曲線分析を行った。降温速度は、-0.06℃/秒で行い、測定は、1℃あたり5回行った。なお、測定には、LightCycler(登録商標) 480 Instrument II(ロシュ社)を用い、533nmの波長で励起し、580nmにおける蛍光強度を測定した。
なお、同様の測定を二回行った。
IQP1は、QP1と同様、混合液中にモデル1が存在する場合には、一定温度以下になると消光し始めるのに対し、混合液中にモデル1が存在しない場合には、消光は観測されなかった(図2)。
また、IQP1は、QP1と比べて、消光開始時(以下、「ピーク時」ともいう)の蛍光強度が大きかった。すなわち、IQP1を用いた場合には、QP1を用いた場合と比べて、ピーク時の蛍光強度と、混合液の温度低下に伴う蛍光強度の減少が観測されなくなり蛍光強度が一定に達したときの蛍光強度との差(減少量)が大きくなった。
蛍光色素を結合されたシトシン塩基に隣接するグアニン塩基を、ヒポキサンチン、チミン、シトシン、アデニン、ネブラリン、2-ジメチルアミノメチレンアミノ-6-メトキシアミノプリン及び3-ニトロピロールから選ばれるいずれかの塩基に置換したQProbe(以下、それぞれ「IQP1」、「TQP」、「CQP」、「AQP」、「NQP」、「dKQP」及び「NitQP」という)を用いて融解曲線分析を行った。
標的核酸:モデル1 10μM。
QProbe:配列番号2~9の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にTAMRAを結合させたプローブ(QP1、IQP1、TQP、CQP、AQP、NQP、dKQP及びNitQP) 2μM。
ハイブリダイズ用バッファー:KCl、Tris-HCl(pH8.0)及びTween-20を含むバッファー。
なお、標的核酸及びQProbeは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
TQP、CQP、AQP、NQP、dKQP及びNitQPを用いたこと、並びに各QProbeとハイブリダイズ用バッファーとからなる混合液の調製を行わなかったことを除いて、実施例1と同様の方法により、融解曲線分析を行った。
IQP1、TQP、CQP、AQP及びNQPから選ばれるいずれかのQProbeを用いた場合、ピーク時の蛍光強度が、QP1を用いた場合と比べて、上昇した(図3(a)~(d))。すなわち、IQP1、TQP、CQP、AQP及びNQPから選ばれるいずれかのQProbeを用いた場合に、QP1を用いた場合に対して、ピーク時の蛍光強度と、混合液の温度低下に伴う蛍光強度の減少が観測されなくなり蛍光強度が一定に達したときの蛍光強度との差(減少量)が大きくなった。
ヒポキサンチン塩基に置換するグアニン塩基と、蛍光色素を結合させたシトシン塩基との距離を段階的に変えたQProbeを用いて、融解曲線分析を行った。具体的には、配列番号1、10~12の塩基配列を有する合成DNA(以下、それぞれ「モデル1」、「モデル2」、「モデル3」及び「モデル4」という)を標的核酸とし、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1、3、5又は7塩基離れて存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したQProbe(以下、それぞれ「IQP1」、「IQP3」、「IQP5」及び「IQP7」という)を用いて、融解曲線分析を行った。また、比較例として置換を行なっていないQProbe(以下、それぞれ「QP1」、「QP3」、「QP5」及び「QP7」という)を用いて融解曲線分析を行なった。
標的核酸:配列番号1、10~12の塩基配列を有するDNA(モデル1~4) 10μM。
QProbe:配列番号2、3、13~18の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にTAMRAを結合させたプローブ(QP1、QP3、QP5、QP7、IQP1、IQP3、IQP5及びIQP7) 2μM。
ハイブリダイズ用バッファー:KCl、Tris-HCl(pH8.0)及びTween-20を含むバッファー。
なお、標的核酸及びQProbeは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
モデル2~4、QP3、QP5、QP7、IQP3、IQP5及びIQP7を用いたことを除いて、実施例2と同様の方法により、融解曲線分析を行った。
IQP1、IQP3、IQP5及びIQP7から選ばれるいずれかの置換を行ったQProbeを用いた場合に、置換を行っていないQProbeを用いた場合と比べて、消光開始時の蛍光強度が上昇した(図4)。すなわち、IQP1、IQP3、IQP5及びIQP7から選ばれるいずれかの置換を行ったQProbeを用いた場合に、置換を行っていないQProbeを用いた場合に対して、ピーク時の蛍光強度と、混合液の温度低下に伴う蛍光強度の減少が観測されなくなり蛍光強度が一定に達したときの蛍光強度との差(減少量)が大きくなった。
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在する、複数のグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したQProbeを用いて融解曲線分析を行った。具体的には、配列番号19の塩基配列を有する合成DNA(以下、「モデル5」という)を標的核酸とし、ヒポキサンチン塩基に置換されたグアニン塩基の個数が1又は2塩基であるQProbe(以下、それぞれ「I1QP」及び「I2QP」という)を用いて、融解曲線分析を行った。なお、配列番号20の塩基配列を有するQProbeを、以下「2QP」という。
標的核酸:配列番号19の塩基配列を有する合成DNA(モデル5) 10μM。
QProbe:配列番号20~22を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にTAMRAを結合させたプローブ(2QP、I1QP及びI2QP) 2μM。
ハイブリダイズ用バッファー:KCl、Tris-HCl(pH8.0)及びTween-20を含むバッファー。
なお、標的核酸及びQProbeは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
2QP、I1QP及びI2QPを用いたことを除いて、実施例2と同様の方法により、融解曲線分析を行った。
I2QPを用いた場合に、I1QPを用いた場合と比べて、ピーク時の蛍光強度が上昇した(図5)。すなわち、I2QPを用いた場合に、I1QPを用いた場合に対して、ピーク時の蛍光強度と、混合液の温度低下に伴う蛍光強度の減少が観測されなくなり蛍光強度が一定に達したときの蛍光強度との差(減少量)が大きくなった。
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したQProbeを用い、LAMP法によってMycoplasmapneumoniaeを検出した。具体的には、配列番号23の塩基配列を有するMycoplasmapneumoniae FH株の精製ゲノムDNA(以下、「MycPゲノム」という)を標的核酸とし、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から2塩基離れて存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したQProbe(以下、「MycP-IQP」という)を用い、LAMP法によってリアルタイムにMycPゲノムを検出した。なお、比較例として置換を行なっていないQProbe(以下、「MycP-QP」という)を用いてMycPゲノムを検出した。
標的核酸:配列番号23の塩基配列を有するMycoplasmapneumoniae FH株の精製ゲノムDNA(MycPゲノム)。
QProbe:配列番号24~25を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にTAMRAを結合させたプローブ(MycP-QP及びMycP-IQP) 2μM。
Loopamp(登録商標) マイコプラズマP検出試薬キット(リアクションミックスMycP(RM MycP)、鎖置換型DNA合成酵素(Bst Pol))
なお、MycPゲノムとして、95℃で5分間熱処理し、急冷したものを測定に用いた。QProbeは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
RM MycP 20.00μLとBst Pol 1.00μLとを混合して混合溶液を得た。この混合溶液 20.00μL、MycP-QP又はMycP-IQP 0.50μL、及びMycPゲノム 4.50μLを混合して、MycP-QP又はMycP-IQPの終濃度が0.04μMである混合液25.00μLを得た。前記混合液を65℃、60分間インキュベートし、混合液中の蛍光強度をリアルタイムに測定した。また、MycPゲノムの代わりに精製水を混合して得た混合液についても、MycPゲノムを用いた場合と同様にして混合液中の蛍光強度をリアルタイムに測定した。なお、測定には、Mx3005P(アジレント・テクノロジー株式会社製)を用い、556nmの波長で励起し、580nmにおける蛍光強度を測定した。解析には、MxProソフトフェアを用いた。同様の測定を二回行った。
MycP-IQPを用いた場合とMycP-QPを用いた場合とを対比すると、混合液中にMycPゲノムが存在する場合の蛍光強度と混合液中にMycゲノムが存在しない場合の蛍光強度との差は、前者の方が後者より大きかった(図6)。
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したQProbeを用い、PCR法及び融解曲線分析によってヒト型結核菌Mycobacteriumtuberculosisを検出した。具体的には、配列番号26の塩基配列を有するMycobacteriumtuberculosis H37Rv株の精製ゲノムDNA(以下、「TBゲノム」という)を標的核酸とし、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1塩基又は2塩基離れて存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したQProbe(以下、それぞれ「TB-IQP1」及び「TB-IQP2」という)を用い、PCR法によって増幅したTBゲノムを融解曲線分析で検出した。なお、比較例として置換を行なっていないQProbe(以下、「TB-QP」という)を用いてTBゲノムを検出した。
標的核酸:配列番号26の塩基配列を有するMycobacteriumtuberculosis H37Rv株の精製ゲノムDNA(TBゲノム)。
PCR用プライマー:配列番号27~28の塩基配列を有するプライマー(TB-dnaJ1-PCR26及びTB-dnaJ1-PCR11) 10μM。
10×PCR用バッファー
dNTPs 2mM
MgSO4 25mM
KOD plus DNA polymerase 1U
QProbe:配列番号27~29を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にBODIPY(登録商標)-FLを結合させたプローブ(TB-QP、TB-IQP1及びTB-IQP2) 2μM。
以下の試薬を含むPCR反応液を調製した。
[PCR反応液(10.00μL)]
蒸留水 2.20μL
TB-dnaJ1-PCR26V2 0.250μM 0.25μL
TB-dnaJ1-PCR11 1.500μM 1.50μL
QProbe(TB-QP、TB-IQP1又はTB-IQP2) 0.250μM 1.25μL
緩衝液 1× 1.00μL
dNTPs 0.2mM 1.00μL
MgSO4 4.0mM 1.60μL
KOD plus DNA polymerase 0.2U 0.20μL
TBゲノム 20.0ng 1.00μL
[PCR反応及び融解曲線分析の条件]
1)94℃ 2分間
2)98℃ 1秒間
3)65℃ 5秒間
4)94℃ 1分間
5)40℃ 1分間
6)40℃~75℃
PCR反応では、2)~4)の工程を50サイクル繰り返した。
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブ(TB-IQP1又はTB-IQP2)を用いた場合、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在するグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換していないプローブ(TB-QP)を用いた場合に比べて、蛍光強度の変化量が増加した(図7)。すなわち、TB-IQP1又はTB-IQP2を用いた場合に、TB-QPを用いた場合に対して、標的核酸へのハイブリダイズによる蛍光強度の変化量が大きくなった。また、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在する複数のグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブ(TB-IQP2)を用いた場合、蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在する1つのグアニン塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブ(TB-IQP1)を用いた場合に比べて、蛍光強度の変化量が増加した(図7)。すなわち、TB-IQP2を用いた場合に、TB-IQP1を用いた場合に対して、標的核酸へのハイブリダイズによる蛍光強度の変化量がさらに大きくなった。
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1塩基離れて存在する、「一塩基多型」に対向するオリゴヌクレオチド上の塩基をヒポキサンチン、チミン、シトシン及びアデニンから選ばれるいずれかの塩基に置換したQProbeを用い、SNPを有する標的核酸を融解曲線分析により検出した。
標的核酸:配列番号32~35の塩基配列を有する合成DNA(以下、それぞれ「モデルA」、「モデルG」、「モデルT」及び「モデルC」ともいう)。
QProbe:配列番号36~40を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にTAMRAを結合させたプローブ(以下、それぞれ「SNP-GQP」、「SNP-IQP」、「SNP-AQP」、「SNP-TQP」及び「ANP-CQP」ともいう) 2μM。
ハイブリダイズ用バッファー:KCl、Tris-HCl(pH8.0)及びTween-20を含むバッファー。
なお、標的核酸及びQProbeは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
標的核酸(モデルA、モデルG、モデルT又はモデルC) 3.2μL、SNP-GQP 0.5μL及びハイブリダイズ用バッファー21.3μLを混合して、終濃度がそれぞれ標的核酸(モデルA、モデルG、モデルT又はモデルC) 1.28μM、SNP-GQP 0.04μM、KCl 50mM、Tris-HCl(pH8.0)10mM及びTween-20 0.1%である混合液を調製した。混合液の温度を95℃から20℃まで下降させながら、蛍光強度を測定し、融解曲線分析を行った。降温速度は、-0.06℃/秒であり、測定は、1℃あたり5回行った。測定した蛍光強度に基づいて、蛍光強度の変化量(-(d/dt)蛍光強度)を求めた。なお、測定には、LightCycler(登録商標) 480 Instrument II(ロシュ社)を用い、533nmの波長で励起し、580nmにおける蛍光強度を測定した。同様の測定を二回行った。SNP-GQPの代わりに、SNP-IQP、SNP-AQP、SNP-TQP及びSNP-CQPのいずれかを用いた以外は、SNP-GQPを用いた場合と同様にして、融解曲線分析を行った。
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在する、「一塩基多型」に対向するオリゴヌクレオチド上の塩基をヒポキサンチン塩基に置換したプローブ(SNP-IQP)を用いた場合、モデルC、モデルA、モデルG及びモデルTの順に消光開始温度が低くなった(図8(a))。したがって、モデルC、モデルA、モデルG及びモデルTにおける消光開始温度はそれぞれ異なっていることから、SNP-IQPを用いることにより、変異塩基の種類ごとにSNPを検出可能であることがわかった。蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在する、「一塩基多型」に対向するオリゴヌクレオチド上の塩基をチミン塩基に置換したプローブ(SNP-TQP)を用いた場合も、モデルC、モデルA、モデルG及びモデルTにおける消光開始温度はそれぞれ異なっていることから、SNP-TQPを用いることにより、変異塩基の種類ごとにSNPを検出可能であることがわかった(図8(b))。
蛍光色素を結合させたシトシン塩基から1~7塩基以内に存在する、「一塩基多型」に対向するオリゴヌクレオチド上の塩基をヒポキサンチン塩基に置換したQProbeを用い、SNPの位置を段階的に変えた標的核酸を融解曲線分析により検出した。
標的核酸:配列番号32~35、41~44及び46~49の塩基配列を有する合成DNA(41~44、46~49の塩基配列を有する合成DNAのことを、以下それぞれ「モデルA3」、「モデルG3」、「モデルT3」及び「モデルC3」、並びに「モデルA5」、「モデルG5」、「モデルT5」及び「モデルC5」ともいう)。
QProbe:配列番号37、45及び50を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にTAMRAを結合させたプローブ(配列番号45及び50を有するオリゴヌクレオチドを備え、オリゴヌクレオチドの末端シトシン塩基にTAMRAを結合させたプローブのことを、以下それぞれ「SNP-IQP3」及び「SNP-IQP5」ともいう) 2μM。
ハイブリダイズ用バッファー:KCl、Tris-HCl(pH8.0)及びTween-20を含むバッファー。
なお、標的核酸及びQProbeは、株式会社日本バイオサービスに合成を委託した。
実施例7においてSNP-IQPを用いた場合と同様にして、モデルA、モデルG、モデルT及びモデルCを標的核酸として融解曲線分析を行った。また、標的核酸としてモデルA、モデルG、モデルT及びモデルCの代わりに、モデルA3、モデルG3、モデルT3及びモデルC3を用いたこと、並びにQprobeとしてSNP-GQP、SNP-IQP、SNP-AQP、SNP-TQP及びANP-CQPの代わりに、SNP-IQP3を用いたこと以外は、実施例7と同様にして融解曲線分析を行った。また、標的核酸としてモデルA、モデルG、モデルT及びモデルCの代わりに、モデルA5、モデルG5、モデルT5及びモデルC5を用いたこと、並びにQprobeとしてSNP-GQP、SNP-IQP、SNP-AQP、SNP-TQP及びANP-CQPの代わりにSNP-IQP5を用いたこと以外は、実施例7と同様にして融解曲線分析を行った。
SNPの位置を段階的に変えた標的核酸についてSNP-IQP3を用いて検出した場合、モデルA3、モデルC3、及びモデルT3(又はモデルG3)における消光開始温度はそれぞれ異なっていることから、変異塩基の種類(A、C及びT(又はG))の判別は可能であることがわかった(図9(b))。具体的には、モデルA3、モデルG3、モデルT3及びモデルC3をSNP-IQP3を用いて検出した場合、モデルC3、モデルA3、及びモデルT3(又はモデルG3)の順に消光開始温度が低くなった(図9(b))。また、モデルA5、モデルG5、モデルT5及びモデルC5をSNP-IQP5を用いて検出した場合、モデルA5、モデルC5、及びモデルT5(又はモデルG5)における消光開始温度はそれぞれ異なっていることから、変異塩基の種類(A、C及びT(又はG))の判別は可能であることがわかった(図9(c))。具体的には、モデルC5、モデルA5、及びモデルG5(又はモデルT5)の順に消光開始温度が低くなった(図9(c))。
Claims (14)
- 標的核酸を検出する第一の核酸プローブであって、
前記標的核酸は、前記第一の核酸プローブがハイブリダイズするプローブ結合領域を備え、
前記プローブ結合領域の少なくとも一方の末端がグアニン塩基であり、かつ、前記グアニン塩基から1~7塩基以内の前記プローブ結合領域にシトシン塩基が1つ以上存在し、
前記第一の核酸プローブは、前記グアニン塩基に対向するシトシン塩基を末端に有するオリゴヌクレオチドと、該シトシン塩基に結合された蛍光色素と、を備え、
前記蛍光色素は、グアニン塩基との相互作用により消光する蛍光色素であり、
前記オリゴヌクレオチドは、前記末端グアニン塩基から1~7塩基以内に存在するシトシン塩基を除いて前記プローブ結合領域の核酸と相補的であり、該シトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基はグアニン塩基又は蛍光の消光作用を持たない塩基であり、ただし、該シトシン塩基のうち前記末端グアニン塩基に最も近接するシトシン塩基に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基は蛍光の消光作用を持たない塩基である、第一の核酸プローブ。 - 前記蛍光の消光作用を持たない塩基が、ヒポキサンチン、アデニン、チミン、シトシン及びネブラリンから選ばれるいずれかの塩基である、請求項1に記載の第一の核酸プローブ。
- 前記蛍光の消光作用を持たない塩基が、ヒポキサンチン塩基である、請求項1に記載の第一の核酸プローブ。
- 標的核酸を検出する方法であって、
請求項1~3のいずれか一項に記載の第一の核酸プローブと試料とを混合し、混合液を調製する工程と、
前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、
前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、
を備える方法。 - 前記検出が、融解曲線分析によって行われる、請求項4に記載の方法。
- 前記試料が、被検核酸を鋳型とした核酸増幅反応により得られる増幅産物を含む、請求項4~5のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸を検出する方法であって、
請求項1~3のいずれか一項に記載の第一の核酸プローブと被検核酸を含む試料とを混合し、混合液を調製する工程と、
前記混合液に含まれる被検核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程とを備え、
前記増幅反応が、変性段階、アニーリング段階及び伸長段階を反復するサイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応であり、
前記アニーリング段階において、前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、
前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、
を備える方法。 - 標的核酸を検出する第二の核酸プローブであって、
前記標的核酸は、前記第二の核酸プローブがハイブリダイズするプローブ結合領域を備え、
前記プローブ結合領域の少なくとも一方の末端がグアニン塩基であり、かつ、前記グアニン塩基から1~7塩基以内の前記プローブ結合領域に一塩基多型が1つ以上存在し、
前記第二の核酸プローブは、前記グアニン塩基に対向するシトシン塩基を末端に有するオリゴヌクレオチドと、該シトシン塩基に結合された蛍光色素と、を備え、
前記蛍光色素は、グアニン塩基との相互作用により消光する蛍光色素であり、
前記オリゴヌクレオチドは、前記末端グアニン塩基から1~7塩基以内に存在する一塩基多型を除いて前記プローブ結合領域の核酸と相補的であり、該一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基はグアニン塩基又は蛍光の消光作用を持たない塩基であり、ただし、該一塩基多型のうち前記末端グアニン塩基に最も近接する一塩基多型に対向する前記オリゴヌクレオチド上の塩基は蛍光の消光作用を持たない塩基である、第二の核酸プローブ。 - 前記蛍光の消光作用を持たない塩基が、ヒポキサンチン、アデニン、チミン、シトシン及びネブラリンから選ばれるいずれかの塩基である、請求項8に記載の第二の核酸プローブ。
- 前記蛍光の消光作用を持たない塩基が、ヒポキサンチン塩基である、請求項8に記載の第二の核酸プローブ。
- 標的核酸を検出する方法であって、
請求項8~10のいずれか一項に記載の第二の核酸プローブと試料とを混合し、混合液を調製する工程と、
前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、
前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸を検出する工程と、
を備える方法。 - 前記検出が、融解曲線分析によって行われる、請求項11に記載の方法。
- 前記融解曲線分析によって一塩基多型を検出する、請求項12に記載の方法。
- 前記試料が、被検核酸を鋳型とした核酸増幅反応により得られる増幅産物を含む、請求項11~13のいずれか一項に記載の方法。
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