JP7421625B2 - デジタルｐｃｒ計測装置及びｐｃｒ計測方法 - Google Patents
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Description
本発明は、デジタルＰＣＲ計測装置に関する。
デジタルＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）は、核酸を高
感度に検出する技術であり、従来のリアルタイム定量ＰＣＲと比較して、低頻度な遺伝子
変異を検出することができる。特許文献１には、デジタルＰＣＲを用いたＤＮＡ検出方法
として、ＤＮＡとＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブを含むドロップレットに
おいて、ＤＮＡと蛍光標識プローブとの融解温度を測定するＤＮＡ検出方法が開示されて
いる。
感度に検出する技術であり、従来のリアルタイム定量ＰＣＲと比較して、低頻度な遺伝子
変異を検出することができる。特許文献１には、デジタルＰＣＲを用いたＤＮＡ検出方法
として、ＤＮＡとＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブを含むドロップレットに
おいて、ＤＮＡと蛍光標識プローブとの融解温度を測定するＤＮＡ検出方法が開示されて
いる。
また、特許文献２には、各々が個別に温度制御可能である複数の単一容器サーマルサイ
クラーを有する多容器サーマルサイクラーアレイで、反応液の温度勾配を低下させるか、
又は、光学的検査を妨害し得る気泡をガス抜きするため、反応液を振動させることができ
る構成が開示されている。
クラーを有する多容器サーマルサイクラーアレイで、反応液の温度勾配を低下させるか、
又は、光学的検査を妨害し得る気泡をガス抜きするため、反応液を振動させることができ
る構成が開示されている。
デジタルＰＣＲでは、検出対象のＤＮＡを含む試料を多数の微小領域に分割し、各々の
微小領域に対してＰＣＲを行い、各微小領域内に存在するＤＮＡの種類の判別を行う。特
許文献１に示されているデジタルＰＣＲでは、試料中の対象遺伝子と対象遺伝子にハイブ
リダイゼーションする蛍光標識プローブを用い、その融解曲線を計測して解析することで
、対象遺伝子の種類を判別する。融解曲線を計測するため、蛍光標識プローブの蛍光強度
の温度依存性の計測を行う。
微小領域に対してＰＣＲを行い、各微小領域内に存在するＤＮＡの種類の判別を行う。特
許文献１に示されているデジタルＰＣＲでは、試料中の対象遺伝子と対象遺伝子にハイブ
リダイゼーションする蛍光標識プローブを用い、その融解曲線を計測して解析することで
、対象遺伝子の種類を判別する。融解曲線を計測するため、蛍光標識プローブの蛍光強度
の温度依存性の計測を行う。
計測対象の遺伝子の種類は複数あり、例えば、野生型とその変異型の遺伝子を含む。融
解曲線は対象遺伝子の種類と蛍光標識プローブにより異なるため、融解曲線を計測するこ
とで対象遺伝子の種類を判別することができる。しかし、変異型の遺伝子を計測する場合
などは、その塩基配列が野生型の塩基配列と１塩基のみの差の場合もある。このため、融
解曲線の差が小さく、高精度に遺伝子種類を判別するためには、高精度に蛍光強度や融解
曲線を計測する必要がある。また、多数の遺伝子を同時に計測する場合には、よりバラつ
きを小さく計測することが重要となる。
解曲線は対象遺伝子の種類と蛍光標識プローブにより異なるため、融解曲線を計測するこ
とで対象遺伝子の種類を判別することができる。しかし、変異型の遺伝子を計測する場合
などは、その塩基配列が野生型の塩基配列と１塩基のみの差の場合もある。このため、融
解曲線の差が小さく、高精度に遺伝子種類を判別するためには、高精度に蛍光強度や融解
曲線を計測する必要がある。また、多数の遺伝子を同時に計測する場合には、よりバラつ
きを小さく計測することが重要となる。
蛍光強度や誘拐曲線の計測精度を低下させる要因のひとつとして、気泡の存在が挙げら
れる。温度上昇時に試料付近に気泡が生じると、蛍光計測に影響を与え、融解曲線の計測
精度、及び遺伝子種類の判別精度が低下する。また、複数の遺伝子種類を判別するために
は、複数の波長の蛍光計測を行うが、蛍光標識プローブのスペクトルの拡がりにより、あ
る蛍光計測に別の波長の蛍光計測の光の漏れ込みが生じる。これらの状況においても、高
精度に蛍光強度や融解曲線を計測することが重要となる。
れる。温度上昇時に試料付近に気泡が生じると、蛍光計測に影響を与え、融解曲線の計測
精度、及び遺伝子種類の判別精度が低下する。また、複数の遺伝子種類を判別するために
は、複数の波長の蛍光計測を行うが、蛍光標識プローブのスペクトルの拡がりにより、あ
る蛍光計測に別の波長の蛍光計測の光の漏れ込みが生じる。これらの状況においても、高
精度に蛍光強度や融解曲線を計測することが重要となる。
本発明は、このようなことに鑑みてなされたものであり、その目的の一つは、気泡の影
響を除去し、高精度に融解曲線を計測可能なデジタルＰＣＲ装置を提供することにある。
本発明の前記並びにその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述及び添付図面から明ら
かになるであろう。
響を除去し、高精度に融解曲線を計測可能なデジタルＰＣＲ装置を提供することにある。
本発明の前記並びにその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述及び添付図面から明ら
かになるであろう。
本発明の一態様に係るデジタルＰＣＲ計測装置は、試料内に含まれるＤＮＡを検出する
デジタルＰＣＲ計測装置であって、蛍光標識プローブと検出対象のＤＮＡを含む試料が供
給される複数の微小領域を含む試料容器の温度を制御する温度調整器と、前記複数の微小
領域の蛍光強度を計測する蛍光計測部と、前記温度調整器及び前記蛍光計測部を制御する
制御部とを含む。前記制御部は、前記温度調整器を制御して前記試料容器の温度を上昇さ
せ、前記試料容器内に生じる気泡を除去した後、前記温度調整器を制御して前記試料容器
の温度を下降させながら前記複数の微小領域の蛍光強度を計測し、前記複数の微小領域の
融解曲線を計測することを特徴とする。
デジタルＰＣＲ計測装置であって、蛍光標識プローブと検出対象のＤＮＡを含む試料が供
給される複数の微小領域を含む試料容器の温度を制御する温度調整器と、前記複数の微小
領域の蛍光強度を計測する蛍光計測部と、前記温度調整器及び前記蛍光計測部を制御する
制御部とを含む。前記制御部は、前記温度調整器を制御して前記試料容器の温度を上昇さ
せ、前記試料容器内に生じる気泡を除去した後、前記温度調整器を制御して前記試料容器
の温度を下降させながら前記複数の微小領域の蛍光強度を計測し、前記複数の微小領域の
融解曲線を計測することを特徴とする。
本発明によれば、気泡の影響を除去して高精度に蛍光強度及び融解曲線計測ができ、高
精度に遺伝子の種類を判別可能なデジタルＰＣＲ計測装置を提供することができる。
精度に遺伝子の種類を判別可能なデジタルＰＣＲ計測装置を提供することができる。
以下、添付図面を参照して本実施形態について説明する。添付図面では、機能的に同じ
要素は同じ番号又は対応する番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本開示の原
理に則った実施形態と実装例を示しているが、これらは本開示の理解のためのものであり
、決して本開示を限定的に解釈するために用いられるものではない。本明細書の記述は典
型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味においても限定
するものではない。
要素は同じ番号又は対応する番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本開示の原
理に則った実施形態と実装例を示しているが、これらは本開示の理解のためのものであり
、決して本開示を限定的に解釈するために用いられるものではない。本明細書の記述は典
型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味においても限定
するものではない。
本実施形態では、当業者が本開示を実施するのに十分詳細にその説明がなされているが
、他の実装・形態も可能で、本開示の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・
構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。従って、以
降の記述をこれに限定して解釈してはならない。
、他の実装・形態も可能で、本開示の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・
構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。従って、以
降の記述をこれに限定して解釈してはならない。
以下の実施の形態においては、便宜上その必要があるときは、複数のセクション又は実
施の形態に分割して説明するが、特に明示した場合を除き、それらは互いに無関係なもの
ではなく、一方は他方の一部又は全部の変形例、詳細、補足説明等の関係にある。また、
以下の実施の形態において、要素の数等（個数、数値、量、範囲等を含む）に言及する場
合、特に明示した場合及び原理的に明らかに特定の数に限定される場合等を除き、その特
定の数に限定されるものではなく、特定の数以上でも以下でも良い。
施の形態に分割して説明するが、特に明示した場合を除き、それらは互いに無関係なもの
ではなく、一方は他方の一部又は全部の変形例、詳細、補足説明等の関係にある。また、
以下の実施の形態において、要素の数等（個数、数値、量、範囲等を含む）に言及する場
合、特に明示した場合及び原理的に明らかに特定の数に限定される場合等を除き、その特
定の数に限定されるものではなく、特定の数以上でも以下でも良い。
また、以下の実施の形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明
示した場合及び原理的に明らかに必須であると考えられる場合等を除き、必ずしも必須の
ものではないことは言うまでもない。同様に、以下の実施の形態の説明において、構成要
素等の形状、位置関係等に言及するときは、特に明示した場合及び原理的に明らかにそう
でないと考えられる場合等を除き、実質的にその形状等に近似又は類似するもの等を含む
ものとする。このことは、上記数値及び範囲についても同様である。なお、実施の形態を
説明するための全図において、同一の部材には原則として同一の符号を付し、その繰り返
しの説明は省略する。
示した場合及び原理的に明らかに必須であると考えられる場合等を除き、必ずしも必須の
ものではないことは言うまでもない。同様に、以下の実施の形態の説明において、構成要
素等の形状、位置関係等に言及するときは、特に明示した場合及び原理的に明らかにそう
でないと考えられる場合等を除き、実質的にその形状等に近似又は類似するもの等を含む
ものとする。このことは、上記数値及び範囲についても同様である。なお、実施の形態を
説明するための全図において、同一の部材には原則として同一の符号を付し、その繰り返
しの説明は省略する。
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態によるデジタルＰＣＲ計測装置の構成例を示す概略
図である。第１の実施の形態のデジタルＰＣＲ計測装置は、一例として、光源１０１、レ
ンズ１０２、１０３、１０４、ショートパスフィルタ１０５、ダイクロイックミラー１０
６、ロングパスフィルタ１０７、ＣＭＯＳセンサ１０８、温度調整器１０９、傾斜調整部
１１０（気泡除去部）、コントローラ１１１（制御部）、計測対象である試料が供給され
る試料容器１１２、及び表示部としてのディスプレイ１１３を含む。
図１は、本発明の第１の実施の形態によるデジタルＰＣＲ計測装置の構成例を示す概略
図である。第１の実施の形態のデジタルＰＣＲ計測装置は、一例として、光源１０１、レ
ンズ１０２、１０３、１０４、ショートパスフィルタ１０５、ダイクロイックミラー１０
６、ロングパスフィルタ１０７、ＣＭＯＳセンサ１０８、温度調整器１０９、傾斜調整部
１１０（気泡除去部）、コントローラ１１１（制御部）、計測対象である試料が供給され
る試料容器１１２、及び表示部としてのディスプレイ１１３を含む。
光源１０１から照射された光は、レンズ１０２によって平行光とされる。ショートパス
フィルタ１０５は、平行光とされた光のうち、所定の波長の光のみを選択的に透過させる
。ショートパスフィルタ１０５を通過した光は、ダイクロイックミラー１０６で反射され
た後、レンズ１０３を通過して試料容器１１２に照射される。試料からの蛍光は、レンズ
１０３、ダイクロイックミラー１０６、ロングパスフィルタ１０７、及びレンズ１０４か
らなる蛍光撮像系により導光されＣＭＯＳセンサ１０８の撮像面に入射する。これにより
、試料の画像がＣＭＯＳセンサ１０８において撮像される。ＣＭＯＳセンサ１０８が取得
した画像信号は、コントローラ１１１に出力される。
フィルタ１０５は、平行光とされた光のうち、所定の波長の光のみを選択的に透過させる
。ショートパスフィルタ１０５を通過した光は、ダイクロイックミラー１０６で反射され
た後、レンズ１０３を通過して試料容器１１２に照射される。試料からの蛍光は、レンズ
１０３、ダイクロイックミラー１０６、ロングパスフィルタ１０７、及びレンズ１０４か
らなる蛍光撮像系により導光されＣＭＯＳセンサ１０８の撮像面に入射する。これにより
、試料の画像がＣＭＯＳセンサ１０８において撮像される。ＣＭＯＳセンサ１０８が取得
した画像信号は、コントローラ１１１に出力される。
コントローラ１１１は、内蔵される画像解析用プログラムに従い画像を解析し、その結
果をディスプレイ１１３に出力する。上記の蛍光撮像系、及びＣＭＯＳセンサは、試料容
器１１２中の複数の微小領域の蛍光強度を計測する蛍光計測部を構成する。コントローラ
１１１は、温度調整器１０９及びＣＭＯＳセンサ１０８に対し、本実施の形態の計測動作
に必要な制御信号を出力し、またＣＭＯＳセンサ１０８からの撮像信号に対し所定の信号
処理を実行して撮像画像を解析する機能を有する。以下で詳細に説明するように、コント
ローラ１１１は、温度調整器１０９を制御して試料容器１１２の温度を昇温し、試料容器
１１２内に生じる気泡を除去した後、温度調整器１０９を制御して試料容器１１２の温度
を下降させながら複数の微小領域の蛍光強度を計測し、複数の微小領域の融解曲線を計測
する。ディスプレイ１１３は、コントローラ１１１において実行される計測の結果を、数
値又はグラフ等により表示する。
果をディスプレイ１１３に出力する。上記の蛍光撮像系、及びＣＭＯＳセンサは、試料容
器１１２中の複数の微小領域の蛍光強度を計測する蛍光計測部を構成する。コントローラ
１１１は、温度調整器１０９及びＣＭＯＳセンサ１０８に対し、本実施の形態の計測動作
に必要な制御信号を出力し、またＣＭＯＳセンサ１０８からの撮像信号に対し所定の信号
処理を実行して撮像画像を解析する機能を有する。以下で詳細に説明するように、コント
ローラ１１１は、温度調整器１０９を制御して試料容器１１２の温度を昇温し、試料容器
１１２内に生じる気泡を除去した後、温度調整器１０９を制御して試料容器１１２の温度
を下降させながら複数の微小領域の蛍光強度を計測し、複数の微小領域の融解曲線を計測
する。ディスプレイ１１３は、コントローラ１１１において実行される計測の結果を、数
値又はグラフ等により表示する。
試料容器１１２は温度調整器１０９上に設置される。温度調整器１０９は、コントロー
ラ１１１からの指令に従い試料容器１１２の温度を制御する。温度調整器１０９は、ヒー
タ、ペルチェ素子から構成されるが、これに限るものではない。また、温度調整器１０９
には、傾斜調整部１１０が設置されている。傾斜調整部１１０は、温度調整器１０９及び
試料容器１１２の水平面に対する傾斜角を調整可能に構成されている。傾斜角が調整され
ることにより、試料容器１１２内で発生した気泡が試料容器１１２から除去される。なお
、傾斜調整部１１０は、気泡除去のための構成の一例であり、これに限定されるものでは
ない。例えば、気泡除去部として、試料容器１１２に振動を与える振動子を設けてもよい
。試料容器１１２に振動が与えられることにより、気泡は試料容器１１２の外部に除去さ
れる。或いは、気泡除去部は、試料容器１１２内の液体に流動を与えて気泡を撮像範囲外
に移動させる流動発生手段であってもよい。
ラ１１１からの指令に従い試料容器１１２の温度を制御する。温度調整器１０９は、ヒー
タ、ペルチェ素子から構成されるが、これに限るものではない。また、温度調整器１０９
には、傾斜調整部１１０が設置されている。傾斜調整部１１０は、温度調整器１０９及び
試料容器１１２の水平面に対する傾斜角を調整可能に構成されている。傾斜角が調整され
ることにより、試料容器１１２内で発生した気泡が試料容器１１２から除去される。なお
、傾斜調整部１１０は、気泡除去のための構成の一例であり、これに限定されるものでは
ない。例えば、気泡除去部として、試料容器１１２に振動を与える振動子を設けてもよい
。試料容器１１２に振動が与えられることにより、気泡は試料容器１１２の外部に除去さ
れる。或いは、気泡除去部は、試料容器１１２内の液体に流動を与えて気泡を撮像範囲外
に移動させる流動発生手段であってもよい。
図２Ａ及び図２Ｂを参照して、第１の実施の形態の試料容器１１２（１１２ａ、１１２
ｂ）の構成例を説明する。図２Ａに示す試料容器１１２ａは、ドロップレット２０２、２
０３、…を平面配置する構成を有する試料容器である。試料容器１１２ａはドロップレッ
トをトラップする構造を持つ。あるいは、ドロップレットをドロップレットの直径と同程
度の高さを持つ空間に密に配置する構成でもよい。いずれの構成においても、試料容器の
いずれかの方向から蛍光計測が可能な材質によりドロップレットは配置される。また、容
器内でドロップレットの周囲はオイル２０４で満たされる。オイルはフッ素系オイル、ミ
ネラルオイルなどを含むが、これに限るものではない。この試料容器１１２ａでは、ドロ
ップレットにより試料が複数の微小領域に分割して配置される。
ｂ）の構成例を説明する。図２Ａに示す試料容器１１２ａは、ドロップレット２０２、２
０３、…を平面配置する構成を有する試料容器である。試料容器１１２ａはドロップレッ
トをトラップする構造を持つ。あるいは、ドロップレットをドロップレットの直径と同程
度の高さを持つ空間に密に配置する構成でもよい。いずれの構成においても、試料容器の
いずれかの方向から蛍光計測が可能な材質によりドロップレットは配置される。また、容
器内でドロップレットの周囲はオイル２０４で満たされる。オイルはフッ素系オイル、ミ
ネラルオイルなどを含むが、これに限るものではない。この試料容器１１２ａでは、ドロ
ップレットにより試料が複数の微小領域に分割して配置される。
また、図２Ｂに示す試料容器１１２ｂは、ドロップレットではなく、アレイ状に配列し
たウエルを用いて、試料を分割する構成を有する試料容器である。１０～１００μｍ程度
のサイズのウエル２０６、２０７、…を多数マトリクス状に配置し、それぞれのウエルに
計測対象である遺伝子を含む試料が投入される。試料が投入されたウエルは、図２Ａの試
料容器１１２ａと同様に、オイル２０４によって満たされる。ウエルの数は数万個から数
百万個であり、投入される検出対象のＤＮＡの数に対して十分多い数であることが望まし
い。試料を投入した際には、ＤＮＡが入っているウエル（２０６）と入っていないウエル
（２０７）が存在することになる。この試料容器１１２では、複数のウエルにより試料が
複数の微小領域に分割して配置される。
たウエルを用いて、試料を分割する構成を有する試料容器である。１０～１００μｍ程度
のサイズのウエル２０６、２０７、…を多数マトリクス状に配置し、それぞれのウエルに
計測対象である遺伝子を含む試料が投入される。試料が投入されたウエルは、図２Ａの試
料容器１１２ａと同様に、オイル２０４によって満たされる。ウエルの数は数万個から数
百万個であり、投入される検出対象のＤＮＡの数に対して十分多い数であることが望まし
い。試料を投入した際には、ＤＮＡが入っているウエル（２０６）と入っていないウエル
（２０７）が存在することになる。この試料容器１１２では、複数のウエルにより試料が
複数の微小領域に分割して配置される。
図３のフローチャートを参照して、第１の実施の形態のデジタルＰＣＲ計測装置を用い
てＤＮＡの種類を判別する際の計測手順を説明する。
最初に、検出対象の遺伝子を含む試料（サンプル）を試料容器１１２中において複数の
微小領域に分割して投入する（ステップ３０１）。その後、当該複数の微小領域の各々に
おいてＰＣＲによりＤＮＡを増幅する（ステップ３０２）。ＤＮＡを増幅した後、試料容
器１１２を搭載した温度調整器１０９を制御し、試料の温度を上昇させる（ステップ３０
３）。このとき、試料及び試料容器１１２の温度上昇に伴い、試料容器１１２内には気泡
が発生する。この気泡は、オイルに溶解していた気体が温度上昇に伴い発生する場合、試
料容器１１２中の材料が気化する場合、元々オイル２０４や試料中に含まれていた気泡が
温度上昇により膨張する場合などが含まれるが、これに限定されるものではない。このス
テップ３０３での温度上昇は、融解曲線を正確に計測する観点から、検出対象のＤＮＡと
蛍光標識プローブとの融解温度よりも、５℃以上高い温度に設定するのが好適である。
てＤＮＡの種類を判別する際の計測手順を説明する。
最初に、検出対象の遺伝子を含む試料（サンプル）を試料容器１１２中において複数の
微小領域に分割して投入する（ステップ３０１）。その後、当該複数の微小領域の各々に
おいてＰＣＲによりＤＮＡを増幅する（ステップ３０２）。ＤＮＡを増幅した後、試料容
器１１２を搭載した温度調整器１０９を制御し、試料の温度を上昇させる（ステップ３０
３）。このとき、試料及び試料容器１１２の温度上昇に伴い、試料容器１１２内には気泡
が発生する。この気泡は、オイルに溶解していた気体が温度上昇に伴い発生する場合、試
料容器１１２中の材料が気化する場合、元々オイル２０４や試料中に含まれていた気泡が
温度上昇により膨張する場合などが含まれるが、これに限定されるものではない。このス
テップ３０３での温度上昇は、融解曲線を正確に計測する観点から、検出対象のＤＮＡと
蛍光標識プローブとの融解温度よりも、５℃以上高い温度に設定するのが好適である。
ステップ３０３において温度上昇させた後、又は、ステップ３０３において温度を上昇
させながら、試料容器１１２内に生じた気泡を除去する（ステップ３０４）。気泡除去は
、前述のように、傾斜調整部１１０により試料容器１１２を傾けるか、または試料容器１
１２を振動させるなどの手段により実施する。
その後、温度調整器１０９により試料の温度を下降させながら、試料の蛍光画像を計測
する（ステップ３０５）。そして、蛍光画像から各微小領域の蛍光強度、及び、その温度
依存性である融解曲線を算出し（ステップ３０６）、各微小領域内のＤＮＡの種類を判別
する（ステップ３０７）。具体的には、ＣＭＯＳセンサ１０８において、試料の温度を下
降させながら所定の時間間隔で複数の蛍光画像を取得する。そして、その複数の画像の微
小領域毎に、蛍光強度の時間変化を特定することで、融解曲線を算出する。なお、ステッ
プ３０５での温度下降の早さ（傾き）は、ステップ３０３での温度上昇の早さよりも小さ
くするのが好適である（後述する図９Ａの符号８０１及び８０３を参照）。
させながら、試料容器１１２内に生じた気泡を除去する（ステップ３０４）。気泡除去は
、前述のように、傾斜調整部１１０により試料容器１１２を傾けるか、または試料容器１
１２を振動させるなどの手段により実施する。
その後、温度調整器１０９により試料の温度を下降させながら、試料の蛍光画像を計測
する（ステップ３０５）。そして、蛍光画像から各微小領域の蛍光強度、及び、その温度
依存性である融解曲線を算出し（ステップ３０６）、各微小領域内のＤＮＡの種類を判別
する（ステップ３０７）。具体的には、ＣＭＯＳセンサ１０８において、試料の温度を下
降させながら所定の時間間隔で複数の蛍光画像を取得する。そして、その複数の画像の微
小領域毎に、蛍光強度の時間変化を特定することで、融解曲線を算出する。なお、ステッ
プ３０５での温度下降の早さ（傾き）は、ステップ３０３での温度上昇の早さよりも小さ
くするのが好適である（後述する図９Ａの符号８０１及び８０３を参照）。
図４Ａは、本実施の形態のデジタルＰＣＲ計測装置に係る試料容器の蛍光画像の一例を
示す模式図である。試料容器１１２中の複数の微小領域に試料が分割されて投入された状
態で蛍光画像を撮像すると、蛍光標識プローブによる蛍光が撮像される。検出対象ＤＮＡ
が含まれる微小領域は、低温で蛍光強度が強く、高温では弱くなる。一方、検出対象ＤＮ
Ａが含まれない微小領域は、蛍光強度が相対的に低い。
示す模式図である。試料容器１１２中の複数の微小領域に試料が分割されて投入された状
態で蛍光画像を撮像すると、蛍光標識プローブによる蛍光が撮像される。検出対象ＤＮＡ
が含まれる微小領域は、低温で蛍光強度が強く、高温では弱くなる。一方、検出対象ＤＮ
Ａが含まれない微小領域は、蛍光強度が相対的に低い。
図４Ｂは、第１実施の形態に係るデジタルＰＣＲ計測装置を用いて計測した融解曲線の
一例を示す模式図である。試料の温度を下降させながら蛍光計測を実施することで蛍光強
度の温度依存性を示すグラフを取得することができる。蛍光標識プローブ４０５は、両端
又はその近傍に蛍光色素４０６とそのクエンチャ４０７を有し、両端周辺の配列が相補的
になっており、モレキュラービーコンのようなステムループ構造を形成する。また、ルー
プ部分の配列がテンプレートＤＮＡ４０４と相補的になっており、テンプレートＤＮＡ４
０４にハイブリダイズできるような構造を有するように設計される。蛍光標識プローブ４
０５は、単独で遊離して存在するとき、ステムループを形成し、蛍光色素４０６とクエン
チャ４０７が近接しているため、蛍光は発しない。テンプレートＤＮＡ４０４と蛍光標識
プローブ４０５のループ部分がハイブリダイズすると、蛍光色素４０６とクエンチャ４０
７が離れるため、蛍光標識プローブ４０５は蛍光を発する。試料の温度が高く、ＤＮＡ４
０４と蛍光標識プローブ４０５が解離すると、蛍光標識プローブ４０５内でステムループ
が形成されるため蛍光強度が低下する。このため、温度を下降させながら蛍光強度を計測
すると蛍光強度が上がる様子が取得できる。
一例を示す模式図である。試料の温度を下降させながら蛍光計測を実施することで蛍光強
度の温度依存性を示すグラフを取得することができる。蛍光標識プローブ４０５は、両端
又はその近傍に蛍光色素４０６とそのクエンチャ４０７を有し、両端周辺の配列が相補的
になっており、モレキュラービーコンのようなステムループ構造を形成する。また、ルー
プ部分の配列がテンプレートＤＮＡ４０４と相補的になっており、テンプレートＤＮＡ４
０４にハイブリダイズできるような構造を有するように設計される。蛍光標識プローブ４
０５は、単独で遊離して存在するとき、ステムループを形成し、蛍光色素４０６とクエン
チャ４０７が近接しているため、蛍光は発しない。テンプレートＤＮＡ４０４と蛍光標識
プローブ４０５のループ部分がハイブリダイズすると、蛍光色素４０６とクエンチャ４０
７が離れるため、蛍光標識プローブ４０５は蛍光を発する。試料の温度が高く、ＤＮＡ４
０４と蛍光標識プローブ４０５が解離すると、蛍光標識プローブ４０５内でステムループ
が形成されるため蛍光強度が低下する。このため、温度を下降させながら蛍光強度を計測
すると蛍光強度が上がる様子が取得できる。
融解曲線を計測する際には試料の温度が温度調整器１０９により変化するため、試料容
器１１２内に気泡が生じ得る。図４Ｃは、試料容器１１２内に気泡が生じた場合の蛍光画
像の模式図の一例を示す。気泡（４０３ａ～ｃ）がある場合には、その表面などでの光の
散乱などにより照射光の強度や、蛍光標識プローブからの蛍光の強度に影響が生じ、蛍光
画像が影響を受ける。デジタルＰＣＲでは、試料を試料容器中で多数の微小領域（ドロッ
プレット、又はウエル）に分割するため、各々の微小領域の大きさは小さく、その容量は
ピコリットルからナノリットルの単位である。気泡の大きさが各々の微小領域よりも大き
い場合もあり、気泡により覆われた領域や気泡の縁に位置する領域では、その微小領域か
ら発せられる蛍光強度が気泡の影響を受ける。図４Ｄは、ある領域が気泡の影響を受けた
場合の融解曲線４０９の一例である。この曲線では、気泡が生じた温度付近（図４Ｄの符
号４１０）において蛍光強度が低下し、融解曲線４０９がこの影響を受ける。このため、
蛍光強度を正確に計測することができない。このような場合は融解温度算出の誤差になり
、遺伝子種類の誤判別につながる場合もある。
器１１２内に気泡が生じ得る。図４Ｃは、試料容器１１２内に気泡が生じた場合の蛍光画
像の模式図の一例を示す。気泡（４０３ａ～ｃ）がある場合には、その表面などでの光の
散乱などにより照射光の強度や、蛍光標識プローブからの蛍光の強度に影響が生じ、蛍光
画像が影響を受ける。デジタルＰＣＲでは、試料を試料容器中で多数の微小領域（ドロッ
プレット、又はウエル）に分割するため、各々の微小領域の大きさは小さく、その容量は
ピコリットルからナノリットルの単位である。気泡の大きさが各々の微小領域よりも大き
い場合もあり、気泡により覆われた領域や気泡の縁に位置する領域では、その微小領域か
ら発せられる蛍光強度が気泡の影響を受ける。図４Ｄは、ある領域が気泡の影響を受けた
場合の融解曲線４０９の一例である。この曲線では、気泡が生じた温度付近（図４Ｄの符
号４１０）において蛍光強度が低下し、融解曲線４０９がこの影響を受ける。このため、
蛍光強度を正確に計測することができない。このような場合は融解温度算出の誤差になり
、遺伝子種類の誤判別につながる場合もある。
このため、第１の実施の形態に係るデジタルＰＣＲ計測装置では、試料を試料容器１１
２に投入した後、一旦試料の温度を温度調整器１０９等を用いて上昇させて気泡を生じさ
せ、その気泡を除去した後、温度調整器１０９等により温度を下降させながら蛍光画像を
計測する。これにより、蛍光画像計測中には試料容器１１２中での気泡の発生を抑制する
ことができ、融解曲線算出時に気泡の影響を低減することができる。このため、高精度に
融解曲線を算出することができる。また、融解温度を高精度に求めることができ、対象遺
伝子の種類を高精度の検出することができる。
２に投入した後、一旦試料の温度を温度調整器１０９等を用いて上昇させて気泡を生じさ
せ、その気泡を除去した後、温度調整器１０９等により温度を下降させながら蛍光画像を
計測する。これにより、蛍光画像計測中には試料容器１１２中での気泡の発生を抑制する
ことができ、融解曲線算出時に気泡の影響を低減することができる。このため、高精度に
融解曲線を算出することができる。また、融解温度を高精度に求めることができ、対象遺
伝子の種類を高精度の検出することができる。
具体的には、例えば、まず試料容器１１２中の試料の温度を例えば８５℃まで上昇させ
て気泡を生じさせ、その後傾斜調整部１１０を用いて気泡を除去する。気泡の除去は、所
定の時間経過をもって完了とさせてもよいし、試料の画像を撮像して気泡の除去が完了し
たかを計測してもよい。
て気泡を生じさせ、その後傾斜調整部１１０を用いて気泡を除去する。気泡の除去は、所
定の時間経過をもって完了とさせてもよいし、試料の画像を撮像して気泡の除去が完了し
たかを計測してもよい。
その後、試料の温度を下降させながら蛍光標識プローブを用いて蛍光画像を計測する。
具体的には、例えば、８５℃から５０℃まで試料の温度を下降させながら、約０．２℃に
一度蛍光画像を撮像する。この温度範囲は、対象となるＤＮＡと蛍光標識プローブの融解
温度により決定され得る。すなわち、計測すべき融解温度よりもマージンをもって高い温
度に試料の温度を一度上昇させ、計測すべき融解温度よりも低い温度まで計測を行う。
具体的には、例えば、８５℃から５０℃まで試料の温度を下降させながら、約０．２℃に
一度蛍光画像を撮像する。この温度範囲は、対象となるＤＮＡと蛍光標識プローブの融解
温度により決定され得る。すなわち、計測すべき融解温度よりもマージンをもって高い温
度に試料の温度を一度上昇させ、計測すべき融解温度よりも低い温度まで計測を行う。
なお、温度変化させるため試料容器１１２や温度調整器１０９の熱膨張などの影響によ
り、各温度で撮像した画像には位置ずれが生じる。本実施の形態のコントローラ１１１は
、図５に示すように、取得した複数の画像から各微小領域の位置を認識し、対応する微小
領域の間の位置ずれ（ΔＸ，ΔＹ）を検出する。コントローラ１１１は、この位置ずれを
補正して、複数の画像の間において各微小領域の位置を追跡し、融解曲線を算出する機能
を含むことができる。また、蛍光画像から得た融解曲線は計測ノイズ、位置ずれノイズ等
を含むため、デジタルフィルタを用いてノイズを除去し、融解温度を算出することもでき
る。
り、各温度で撮像した画像には位置ずれが生じる。本実施の形態のコントローラ１１１は
、図５に示すように、取得した複数の画像から各微小領域の位置を認識し、対応する微小
領域の間の位置ずれ（ΔＸ，ΔＹ）を検出する。コントローラ１１１は、この位置ずれを
補正して、複数の画像の間において各微小領域の位置を追跡し、融解曲線を算出する機能
を含むことができる。また、蛍光画像から得た融解曲線は計測ノイズ、位置ずれノイズ等
を含むため、デジタルフィルタを用いてノイズを除去し、融解温度を算出することもでき
る。
なお、蛍光標識プローブは、モレキュラービーコンに限られるものではなく、ＤＮＡイ
ンターカレーターであってもよい。また、光源としては、ハロゲンランプ、ＬＥＤ光源、
レーザー光源などを含み得るが、特定のものには限定されない。また、撮像素子はＣＭＯ
Ｓセンサ１０８に限らず、ＣＣＤを用いたカメラでもよい。また、２次元撮像素子に限ら
ず、１次元ラインセンサやフォトマルであってもよい。なお、図１に示した光学系の構成
は一例であって、これに限定されるものではない。光学系中のレンズやフィルタも、特定
の構造のものには限られず、試料に励起光を照射し、蛍光を計測可能であればよい。また
、ショートパスフィルタやロングパスフィルタが特定の波長の光を通すバンドパスフィル
タであってもよい。ダイクロイックフィルタはハーフミラーであってもよい。
ンターカレーターであってもよい。また、光源としては、ハロゲンランプ、ＬＥＤ光源、
レーザー光源などを含み得るが、特定のものには限定されない。また、撮像素子はＣＭＯ
Ｓセンサ１０８に限らず、ＣＣＤを用いたカメラでもよい。また、２次元撮像素子に限ら
ず、１次元ラインセンサやフォトマルであってもよい。なお、図１に示した光学系の構成
は一例であって、これに限定されるものではない。光学系中のレンズやフィルタも、特定
の構造のものには限られず、試料に励起光を照射し、蛍光を計測可能であればよい。また
、ショートパスフィルタやロングパスフィルタが特定の波長の光を通すバンドパスフィル
タであってもよい。ダイクロイックフィルタはハーフミラーであってもよい。
以上説明したように、この第１の実施の形態のデジタルＰＣＲ計測装置によれば、気泡
の影響を除去して高精度に蛍光強度及び融解曲線を計測することができ、高精度に遺伝子
の種類を判別することができる。
の影響を除去して高精度に蛍光強度及び融解曲線を計測することができ、高精度に遺伝子
の種類を判別することができる。
（第２の実施の形態）
本発明の第２の実施の形態に係るデジタルＰＣＲ計測装置について、図６を参照して説
明する。図６において、第１の実施の形態（図１）と同一の構成要素については同一の符
号を付しているので、重複する説明は省略する。この第２の実施の形態では、気泡除去部
として、試料容器１１２を水平面に対して傾けて保持可能に構成された傾斜台５０１が設
けられている。換言すれば、この傾斜台５０１は、定常的に試料容器１１２を水平面に対
し傾斜させた状態で保持するよう構成されている。この点、第１の実施の形態の傾斜調整
部１１０が、計測動作の途中において試料容器１１２の傾斜角を変化させるよう構成され
ているのと異なっている。この第２の実施の形態の気泡除去部においても、試料容器１１
２を水平面に対し傾けて配置可能とすることにより、試料容器１１２中で気泡が生じた際
に、気泡が重力方向の上方に移動し、蛍光撮像の範囲から気泡を除外することができる。
傾斜台５０１の傾斜角度が図示しない傾斜調整機構により更に調整可能になっていてもよ
いことは言うまでもない。なお、図６の例では、温度調整器１０９自体が傾斜した状態で
傾斜第５０１により保持され、その温度調整器１０９の上面に試料容器１１２が保持され
場合を示している。
本発明の第２の実施の形態に係るデジタルＰＣＲ計測装置について、図６を参照して説
明する。図６において、第１の実施の形態（図１）と同一の構成要素については同一の符
号を付しているので、重複する説明は省略する。この第２の実施の形態では、気泡除去部
として、試料容器１１２を水平面に対して傾けて保持可能に構成された傾斜台５０１が設
けられている。換言すれば、この傾斜台５０１は、定常的に試料容器１１２を水平面に対
し傾斜させた状態で保持するよう構成されている。この点、第１の実施の形態の傾斜調整
部１１０が、計測動作の途中において試料容器１１２の傾斜角を変化させるよう構成され
ているのと異なっている。この第２の実施の形態の気泡除去部においても、試料容器１１
２を水平面に対し傾けて配置可能とすることにより、試料容器１１２中で気泡が生じた際
に、気泡が重力方向の上方に移動し、蛍光撮像の範囲から気泡を除外することができる。
傾斜台５０１の傾斜角度が図示しない傾斜調整機構により更に調整可能になっていてもよ
いことは言うまでもない。なお、図６の例では、温度調整器１０９自体が傾斜した状態で
傾斜第５０１により保持され、その温度調整器１０９の上面に試料容器１１２が保持され
場合を示している。
また、この第２の実施の形態のデジタルＰＣＲ計測装置では、レンズ１０３、ダイクロ
イックミラー１０６、ロングパスフィルタ１０７、レンズ１０４からなる蛍光撮像系は、
傾斜した試料容器１１２に対しその光軸が垂直となるよう配置されている。すなわち、蛍
光撮像系は、試料容器１１２の水平面に対する傾きに合わせて、水平面に対して傾斜した
光軸を有する。そして、ＣＭＯＳセンサ１０８の撮像面も、この蛍光撮像系の傾斜方向に
合わせて傾斜して配置されている。また、光源１０１からの光を投影する投影光学系（レ
ンズ１０２、ショートパスフィルタ１０５）も、この蛍光撮像系の傾斜方向に合わせて傾
斜されている。
イックミラー１０６、ロングパスフィルタ１０７、レンズ１０４からなる蛍光撮像系は、
傾斜した試料容器１１２に対しその光軸が垂直となるよう配置されている。すなわち、蛍
光撮像系は、試料容器１１２の水平面に対する傾きに合わせて、水平面に対して傾斜した
光軸を有する。そして、ＣＭＯＳセンサ１０８の撮像面も、この蛍光撮像系の傾斜方向に
合わせて傾斜して配置されている。また、光源１０１からの光を投影する投影光学系（レ
ンズ１０２、ショートパスフィルタ１０５）も、この蛍光撮像系の傾斜方向に合わせて傾
斜されている。
この第２の実施の形態の構成によっても、試料の温度を上昇させた場合に試料容器１１
２内に気泡が発生した際に、気泡を試料容器１１２内の上方（重力方向に関し）に移動さ
せ、蛍光撮像範囲から気泡を除外することができ、高精度な撮像と融解曲線計測が可能と
なる。傾斜台５０１が試料容器１１２を傾ける角度は、気泡が試料容器１１２内を移動で
き、かつ試料の微小領域がオイルに満たされている状態を保てる角度が望ましい。具体的
には水平面に対して１０°～２０°程度の範囲で試料容器１１２を傾けることができる。
２内に気泡が発生した際に、気泡を試料容器１１２内の上方（重力方向に関し）に移動さ
せ、蛍光撮像範囲から気泡を除外することができ、高精度な撮像と融解曲線計測が可能と
なる。傾斜台５０１が試料容器１１２を傾ける角度は、気泡が試料容器１１２内を移動で
き、かつ試料の微小領域がオイルに満たされている状態を保てる角度が望ましい。具体的
には水平面に対して１０°～２０°程度の範囲で試料容器１１２を傾けることができる。
（第３の実施の形態）
本発明の第３の実施の形態に係るデジタルＰＣＲ計測装置について、図７乃至図１２Ｃ
を参照して説明する。図７は第３の実施の形態に係るデジタルＰＣＲ計測装置の構成図で
ある。図７において、第１の実施の形態（図１）と同一の構成要素については同一の符号
を付しているので、重複する説明は省略する。この第３の実施の形態のデジタルＰＣＲ計
測装置は、ショートパスフィルタ１０５、ダイクロイックミラー１０６、ロングパスフィ
ルタ１０７を含むフィルタセット（６０１、６０２）を複数有し、これらを選択的に蛍光
撮像系に挿入し、複数のフィルタを用いた傾向計測を実行し、複数種類の融解曲線を取得
可能に構成されている。図７では一例として、２種類のフィルタセット６０１及び６０２
が備えられているが、フィルタセットの数は２に限定されるものではなく、３以上であっ
てもよいことは言うまでもない。フィルタセット６０１は、ショートパスフィルタ１０５
ａ、ダイクロイックミラー１０６ａ、ロングパスフィルタ１０７ａを一体として１つの筐
体内に一体的に保持している。また、フィルタセット６０２は、ショートパスフィルタ１
０５ｂ、ダイクロイックミラー１０６ｂ、ロングパスフィルタ１０７ｂを一体として１つ
の筐体内に一体的に保持している。
本発明の第３の実施の形態に係るデジタルＰＣＲ計測装置について、図７乃至図１２Ｃ
を参照して説明する。図７は第３の実施の形態に係るデジタルＰＣＲ計測装置の構成図で
ある。図７において、第１の実施の形態（図１）と同一の構成要素については同一の符号
を付しているので、重複する説明は省略する。この第３の実施の形態のデジタルＰＣＲ計
測装置は、ショートパスフィルタ１０５、ダイクロイックミラー１０６、ロングパスフィ
ルタ１０７を含むフィルタセット（６０１、６０２）を複数有し、これらを選択的に蛍光
撮像系に挿入し、複数のフィルタを用いた傾向計測を実行し、複数種類の融解曲線を取得
可能に構成されている。図７では一例として、２種類のフィルタセット６０１及び６０２
が備えられているが、フィルタセットの数は２に限定されるものではなく、３以上であっ
てもよいことは言うまでもない。フィルタセット６０１は、ショートパスフィルタ１０５
ａ、ダイクロイックミラー１０６ａ、ロングパスフィルタ１０７ａを一体として１つの筐
体内に一体的に保持している。また、フィルタセット６０２は、ショートパスフィルタ１
０５ｂ、ダイクロイックミラー１０６ｂ、ロングパスフィルタ１０７ｂを一体として１つ
の筐体内に一体的に保持している。
フィルタセット６０１及び６０２は、図示しない移動機構により、矢印６０３に示され
るように光路に挿入又は離脱される。フィルタセット６０１と６０２はそれぞれ異なる蛍
光色素の蛍光計測に対応し、ショートパスフィルタ１０５ａと１０５ｂは透過波長が異な
る。具体的には、蛍光色素として、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５などに対応
した励起光、蛍光のフィルタセットを用いることができる。なお、図７では、気泡除去部
として傾斜調整部１１０を設けているが、これに替えて、傾斜台５０１、又は他の気泡除
去部を設けても良いことは言うまでもない。
るように光路に挿入又は離脱される。フィルタセット６０１と６０２はそれぞれ異なる蛍
光色素の蛍光計測に対応し、ショートパスフィルタ１０５ａと１０５ｂは透過波長が異な
る。具体的には、蛍光色素として、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５などに対応
した励起光、蛍光のフィルタセットを用いることができる。なお、図７では、気泡除去部
として傾斜調整部１１０を設けているが、これに替えて、傾斜台５０１、又は他の気泡除
去部を設けても良いことは言うまでもない。
図８のフローチャートを参照して、第３の実施の形態のデジタルＰＣＲ計測装置におけ
る計測の手順を示す。こでは２種のフィルタセット６０１、６０２を交互に切り替えて使
用し、1２種の蛍光計測（蛍光計測Ａ及び蛍光計測Ｂ）を実施する例を説明する。まず、
試料を試料容器１１２に複数の微小領域に分割して投入し（ステップ７０１）、当該複数
の領域の各々においてＰＣＲによりＤＮＡを増幅する（ステップ７０２）。ＤＮＡを増幅
させた後、試料容器１１２をデジタルＰＣＲ計測装置にセットし、温度調整器１０９によ
り温度を上昇させ（ステップ７０３）、傾斜調整部１１０により試料容器１１２内に発生
した気泡を除去する（ステップ７０４）。その後、温度調整器１０９により試料の温度を
下降させながら、複数のフィルタセット（６０１、６０２）を切り替えながら蛍光画像を
計測する（ステップ７０５）。撮像した蛍光画像から融解曲線を算出し、融解温度を計算
する（ステップ７０６）。各微小領域において、各々の蛍光色で、蛍光強度の情報を用い
て各微小領域内にＤＮＡが入っていたか（ポジティブ）、入っていなかったか（ネガティ
ブ）を判定する（ステップ７０７）。算出した融解温度と予め用意しておいた融解温度の
データベースとに基づいて、遺伝子の種類が判定される（ステップ７０８）。
る計測の手順を示す。こでは２種のフィルタセット６０１、６０２を交互に切り替えて使
用し、1２種の蛍光計測（蛍光計測Ａ及び蛍光計測Ｂ）を実施する例を説明する。まず、
試料を試料容器１１２に複数の微小領域に分割して投入し（ステップ７０１）、当該複数
の領域の各々においてＰＣＲによりＤＮＡを増幅する（ステップ７０２）。ＤＮＡを増幅
させた後、試料容器１１２をデジタルＰＣＲ計測装置にセットし、温度調整器１０９によ
り温度を上昇させ（ステップ７０３）、傾斜調整部１１０により試料容器１１２内に発生
した気泡を除去する（ステップ７０４）。その後、温度調整器１０９により試料の温度を
下降させながら、複数のフィルタセット（６０１、６０２）を切り替えながら蛍光画像を
計測する（ステップ７０５）。撮像した蛍光画像から融解曲線を算出し、融解温度を計算
する（ステップ７０６）。各微小領域において、各々の蛍光色で、蛍光強度の情報を用い
て各微小領域内にＤＮＡが入っていたか（ポジティブ）、入っていなかったか（ネガティ
ブ）を判定する（ステップ７０７）。算出した融解温度と予め用意しておいた融解温度の
データベースとに基づいて、遺伝子の種類が判定される（ステップ７０８）。
各領域のＤＮＡがポジティブかネガティブかの判定においては、蛍光強度の情報が利用
されるが、この際、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度と、融解温度よりも高温な温
度での蛍光強度との比を用いることにより、照射光強度の影響の除去が可能である。また
は、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度と、融解温度よりも高温な温度での蛍光強度
との差を用いることも可能である。具体的には、例えば、５０℃での蛍光強度から８５℃
での蛍光強度を減算すると、蛍光標識プローブ自体の蛍光の影響、すなわち、バックグラ
ウンドの影響を除去することができる。
されるが、この際、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度と、融解温度よりも高温な温
度での蛍光強度との比を用いることにより、照射光強度の影響の除去が可能である。また
は、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度と、融解温度よりも高温な温度での蛍光強度
との差を用いることも可能である。具体的には、例えば、５０℃での蛍光強度から８５℃
での蛍光強度を減算すると、蛍光標識プローブ自体の蛍光の影響、すなわち、バックグラ
ウンドの影響を除去することができる。
図９Ａ及び図９Ｂを参照して、図８のステップ７０５の動作を更に詳細に説明する。図
９Ａは、試料の温度の時間変化を示す曲線と、蛍光計測（Ａ又はＢ）の実施のタイミング
を説明するグラフである。また、図９Ｂは、動作の手順を示すフローチャートである。
まず、温度調整器１０９により試料の温度を上昇させる（図９Ａの曲線８０１）。試料
の温度が初期温度ｔｉｎｉまで上昇すると、試料容器１１２内に気泡が発生する。初期温
度ｔｉｎｉは、融解曲線計測を行う上限温度ｔｍａｘよりも大きい温度に設定される。こ
の気泡を、傾斜調整部１１０を用いて除去する。その後、気泡が除去されるまで所定時間
待機した後（図９Ａの符号８０２）、試料の温度を下降させながら（図９Ａの曲線８０３
）、蛍光計測を行う。このとき、蛍光計測は、フィルタセット６０１に対応する蛍光計測
Ａと、フィルタセット６０２に対応する蛍光計測Ｂとが交互に繰り返し行われる。実行の
タイミング及び回数は、図９Ａに示すものには限定されるものではない。
９Ａは、試料の温度の時間変化を示す曲線と、蛍光計測（Ａ又はＢ）の実施のタイミング
を説明するグラフである。また、図９Ｂは、動作の手順を示すフローチャートである。
まず、温度調整器１０９により試料の温度を上昇させる（図９Ａの曲線８０１）。試料
の温度が初期温度ｔｉｎｉまで上昇すると、試料容器１１２内に気泡が発生する。初期温
度ｔｉｎｉは、融解曲線計測を行う上限温度ｔｍａｘよりも大きい温度に設定される。こ
の気泡を、傾斜調整部１１０を用いて除去する。その後、気泡が除去されるまで所定時間
待機した後（図９Ａの符号８０２）、試料の温度を下降させながら（図９Ａの曲線８０３
）、蛍光計測を行う。このとき、蛍光計測は、フィルタセット６０１に対応する蛍光計測
Ａと、フィルタセット６０２に対応する蛍光計測Ｂとが交互に繰り返し行われる。実行の
タイミング及び回数は、図９Ａに示すものには限定されるものではない。
図９Ｂは、温度設定に関する手順を示したフローチャートである。初期温度を設定し（
ステップ８０４）、更に計測温度が設定されると（ステップ８０６）、蛍光計測Ａと蛍光
計測Ｂとが最終温度に達するまで繰り返される（ステップ８０７と８０８）。最終温度に
達すると、測定は終了する（ステップ８０５）。
ステップ８０４）、更に計測温度が設定されると（ステップ８０６）、蛍光計測Ａと蛍光
計測Ｂとが最終温度に達するまで繰り返される（ステップ８０７と８０８）。最終温度に
達すると、測定は終了する（ステップ８０５）。
上記の実施の形態では、フィルタセットを切り替えているが、フィルタセットを切り替
えることに替えて、又はこれに加えて、光源を切り替えてもよい。また、フィルタセット
すべてを切り替えるのではなく、フィルタセット中の一部のフィルタのみを切り替える構
成でもよい。具体的には、例えば、励起光は同じ波長の光を照射し、蛍光撮像時のロング
パスフィルタ１０７のみを切り替える構成も採用可能である。
えることに替えて、又はこれに加えて、光源を切り替えてもよい。また、フィルタセット
すべてを切り替えるのではなく、フィルタセット中の一部のフィルタのみを切り替える構
成でもよい。具体的には、例えば、励起光は同じ波長の光を照射し、蛍光撮像時のロング
パスフィルタ１０７のみを切り替える構成も採用可能である。
図１０Ａ～図１０Ｅに、各微小領域について得られた２つの融解曲線、及びその微分曲
線の例を示す。いずれも、蛍光色素Ａにより修飾された蛍光標識プローブにハイブリダイ
ゼーションするＤＮＡ Ａと、蛍光色素Ｂにより修飾された蛍光標識プローブにハイブリ
ダイゼーションするＤＮＡ Ｂとが存在し得る場合の例を示している。
線の例を示す。いずれも、蛍光色素Ａにより修飾された蛍光標識プローブにハイブリダイ
ゼーションするＤＮＡ Ａと、蛍光色素Ｂにより修飾された蛍光標識プローブにハイブリ
ダイゼーションするＤＮＡ Ｂとが存在し得る場合の例を示している。
図１０Ａは、ＤＮＡ Ａがポジティブである微小領域の融解曲線９０１、９０２及びそ
の微分曲線９０３、９０４の一例である。このような融解曲線及び微分曲線は、ディスプ
レイ１１３の表示画面に表示したり、又は図示しないプリンタ等によって出力することも
できる。
の微分曲線９０３、９０４の一例である。このような融解曲線及び微分曲線は、ディスプ
レイ１１３の表示画面に表示したり、又は図示しないプリンタ等によって出力することも
できる。
コントローラ１１１は、温度調整器１０９を制御して試料の温度を一旦上昇させ、その
後下降させながら蛍光計測部を用いて計測をすることにより、融解曲線９０１、９０２を
取得する。また、融解曲線９０１、９０２の微分曲線９０３、９０４を求めることで、そ
のピーク位置から融解温度を算出する。
後下降させながら蛍光計測部を用いて計測をすることにより、融解曲線９０１、９０２を
取得する。また、融解曲線９０１、９０２の微分曲線９０３、９０４を求めることで、そ
のピーク位置から融解温度を算出する。
ＤＮＡ Ａがポジティブであった場合の融解曲線から融解温度を算出し、ＤＮＡの種類
を算出することができる。一方、蛍光スペクトルには拡がりがあり、蛍光計測Ａと蛍光計
測Ｂの間には漏れ込みがあるため、ＤＮＡ Ｂがネガティブであるにもかかわらず、融解
曲線が計測できたかのように見える。このような場合、複数の融解曲線の比較、及び微分
曲線の性状（強度、ピーク位置、形状など）から、ある曲線は漏れ込み光によるものであ
り、当該ＤＮＡはネガティブと判定することができる。図１０Ａの場合、曲線９０１、９
０２のみを見る限り、ＤＮＡ Ａ、ＤＮＡ Ｂともポジティブのように見えるが、微分曲
線９０３、９０４に目を移すと、微分曲線９０３、９０４はいずれも略同一の温度にてピ
ークに達している。このため、ＤＮＡ Ａのみがポジティブであり、一方微分曲線９０４
に係るＤＮＡ Ｂはネガティブであると判断することができる。
を算出することができる。一方、蛍光スペクトルには拡がりがあり、蛍光計測Ａと蛍光計
測Ｂの間には漏れ込みがあるため、ＤＮＡ Ｂがネガティブであるにもかかわらず、融解
曲線が計測できたかのように見える。このような場合、複数の融解曲線の比較、及び微分
曲線の性状（強度、ピーク位置、形状など）から、ある曲線は漏れ込み光によるものであ
り、当該ＤＮＡはネガティブと判定することができる。図１０Ａの場合、曲線９０１、９
０２のみを見る限り、ＤＮＡ Ａ、ＤＮＡ Ｂともポジティブのように見えるが、微分曲
線９０３、９０４に目を移すと、微分曲線９０３、９０４はいずれも略同一の温度にてピ
ークに達している。このため、ＤＮＡ Ａのみがポジティブであり、一方微分曲線９０４
に係るＤＮＡ Ｂはネガティブであると判断することができる。
また、図１０Ｂは、ＤＮＡ Ｂがポジティブであった場合の融解曲線の例である。融解
曲線９０６から漏れ込んだ光が融解曲線９０５により観察されているため、ＤＮＡ Ａは
ネガティブであると判定することができる。
曲線９０６から漏れ込んだ光が融解曲線９０５により観察されているため、ＤＮＡ Ａは
ネガティブであると判定することができる。
図１０Ｃは、ＤＮＡ Ａがポジティブであり、ＤＮＡ Ｂはネガティブである場合の融
解曲線の別の例である。デジタルＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅効率に関し複数の微小領域の間
においてバラつきが生じ、蛍光強度が低い微小領域が生じることがある。例えば、図１０
Ｃの融解曲線９１０の蛍光強度は、別の微小領域の漏れ込みによる融解曲線９０５と同程
度の蛍光強度の曲線となっているが、融解曲線９０９との相対的な強度の比較、及び、融
解温度の共通性から、ＤＮＡ Ａがポジティブであると判定することができる。
解曲線の別の例である。デジタルＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅効率に関し複数の微小領域の間
においてバラつきが生じ、蛍光強度が低い微小領域が生じることがある。例えば、図１０
Ｃの融解曲線９１０の蛍光強度は、別の微小領域の漏れ込みによる融解曲線９０５と同程
度の蛍光強度の曲線となっているが、融解曲線９０９との相対的な強度の比較、及び、融
解温度の共通性から、ＤＮＡ Ａがポジティブであると判定することができる。
図１０Ｄは、ＤＮＡ Ａ及びＤＮＡ Ｂがともにポジティブである融解曲線の例である
。蛍光計測Ａ、Ｂにより、２種類の異なる融解曲線９１３、９１４が得られ、その微分曲
線９１５、９１６が得られる。微分曲線９１５、９１６のピーク位置から、ＤＮＡ Ａ及
びＤＮＡ Ｂの融解温度が得られる。微分曲線９１５、９１６のピーク位置が異なること
から、計測対象の１つの微小領域に２種類のＤＮＡ（ＤＮＡ Ａ、ＤＮＡ Ｂ）が入って
いたと判定することができる。一方、図１０Ｅは、ＤＮＡ Ａ、ＤＮＡ Ｂが共にネガテ
ィブである融解曲線の例である。
。蛍光計測Ａ、Ｂにより、２種類の異なる融解曲線９１３、９１４が得られ、その微分曲
線９１５、９１６が得られる。微分曲線９１５、９１６のピーク位置から、ＤＮＡ Ａ及
びＤＮＡ Ｂの融解温度が得られる。微分曲線９１５、９１６のピーク位置が異なること
から、計測対象の１つの微小領域に２種類のＤＮＡ（ＤＮＡ Ａ、ＤＮＡ Ｂ）が入って
いたと判定することができる。一方、図１０Ｅは、ＤＮＡ Ａ、ＤＮＡ Ｂが共にネガテ
ィブである融解曲線の例である。
図１１Ａ～図１１Ｃは、第３の実施の形態のデジタルＰＣＲ計測装置を用いて２種類の
遺伝子（野生型及びその変異型）を計測し、分類した結果のグラフの例である。このよう
なグラフは、ディスプレイ１１３の表示画面に表示したり、又は図示しないプリンタ等に
よって出力することもできる。
遺伝子（野生型及びその変異型）を計測し、分類した結果のグラフの例である。このよう
なグラフは、ディスプレイ１１３の表示画面に表示したり、又は図示しないプリンタ等に
よって出力することもできる。
図１１Ａ～図１１Ｃは、変異型遺伝子は蛍光色素Ａで修飾された蛍光標識プローブとハ
イブリダイゼーションし、野生型遺伝子は、蛍光色素Ｂで修飾された蛍光標識プローブと
ハイブリダイゼーションした場合を示している。また、野生型遺伝子と変異型遺伝子では
融解温度が異なる。
２種類のフィルタセットを切り替えて複数の微小領域について蛍光強度Ａ及び蛍光強度
Ｂを計測すると、各微小領域は、図１１Ａの如くプロットされる。プロットは、以下の（
１）～（４）の４つのプロット群に分かれ得る。
（１）ＤＮＡがネガティブであると判定される微小領域のプロット群１００１ａ
（２）野生型遺伝子を含むと判定される微小領域のプロット群１００２ａ
（３）変異型遺伝子を含むと判定される微小領域のプロット群１００３ａ
（４）野生型遺伝子及び変異型遺伝子の両方を含むと判定される微小領域のプロット群１
００４ａ
イブリダイゼーションし、野生型遺伝子は、蛍光色素Ｂで修飾された蛍光標識プローブと
ハイブリダイゼーションした場合を示している。また、野生型遺伝子と変異型遺伝子では
融解温度が異なる。
２種類のフィルタセットを切り替えて複数の微小領域について蛍光強度Ａ及び蛍光強度
Ｂを計測すると、各微小領域は、図１１Ａの如くプロットされる。プロットは、以下の（
１）～（４）の４つのプロット群に分かれ得る。
（１）ＤＮＡがネガティブであると判定される微小領域のプロット群１００１ａ
（２）野生型遺伝子を含むと判定される微小領域のプロット群１００２ａ
（３）変異型遺伝子を含むと判定される微小領域のプロット群１００３ａ
（４）野生型遺伝子及び変異型遺伝子の両方を含むと判定される微小領域のプロット群１
００４ａ
また、蛍光色素Ａ、蛍光色素Ｂに基づく２色の融解曲線から２つの融解温度（融解温度
Ａ及び融解温度Ｂ）を算出することができる。図１１Ｂは、各微小領域で計測された蛍光
強度Ａと融解温度Ａの関係を示すグラフである。また、図１１Ｃは、各微小領域で計測さ
れた蛍光強度Ｂと融解温度Ｂの関係を示すグラフである。
Ａ及び融解温度Ｂ）を算出することができる。図１１Ｂは、各微小領域で計測された蛍光
強度Ａと融解温度Ａの関係を示すグラフである。また、図１１Ｃは、各微小領域で計測さ
れた蛍光強度Ｂと融解温度Ｂの関係を示すグラフである。
図１１Ｂ及び図１１Ｃに示すように、ＤＮＡがネガティブと判定される微小領域は、プ
ロット群１００１ｂ、１００１ｃ付近にプロットされる。ＤＮＡがネガティブと判定され
る微小領域は、測定の結果得られる蛍光強度が低く、また融解曲線が殆ど温度依存性を持
たないため、融解温度は不定となる。このため、プロット群１００１ｂ、１００１ｃは、
縦軸方向に広範囲にばらついたプロットとなる。
ロット群１００１ｂ、１００１ｃ付近にプロットされる。ＤＮＡがネガティブと判定され
る微小領域は、測定の結果得られる蛍光強度が低く、また融解曲線が殆ど温度依存性を持
たないため、融解温度は不定となる。このため、プロット群１００１ｂ、１００１ｃは、
縦軸方向に広範囲にばらついたプロットとなる。
一方、変異型遺伝子を含む微小領域は、蛍光強度Ａについては高い値が検出され（１０
０３ｂ）、しかも特定の融解温度Ａを付近において多数のプロットが得られる。また、野
生型遺伝子を含む微小領域は、蛍光強度Ｂについては高い値が検出され（１００２ｃ）、
しかも特定の融解温度Ｂ付近において多数のプロットが得られる。
０３ｂ）、しかも特定の融解温度Ａを付近において多数のプロットが得られる。また、野
生型遺伝子を含む微小領域は、蛍光強度Ｂについては高い値が検出され（１００２ｃ）、
しかも特定の融解温度Ｂ付近において多数のプロットが得られる。
なお、野生型遺伝子を含む微小領域は、蛍光色素Ｂにより修飾されているので、蛍光強
度Ａについては低い値となる筈であるが、隣接する領域からの蛍光色素Ａに基づく漏れ込
み光により、蛍光強度Ａの値がプロット群１００１ｂと比較して大きくなるプロット群１
００２ｂが観察される。しかしながら、このプロット群１００２ｂの蛍光強度Ａは、前述
のプロット群１００２ｃの蛍光強度Ｂと比較して相対的に小さい。このため、プロット群
１００２ｂは、漏れ込み光の影響によるプロット群であると判別できる。
度Ａについては低い値となる筈であるが、隣接する領域からの蛍光色素Ａに基づく漏れ込
み光により、蛍光強度Ａの値がプロット群１００１ｂと比較して大きくなるプロット群１
００２ｂが観察される。しかしながら、このプロット群１００２ｂの蛍光強度Ａは、前述
のプロット群１００２ｃの蛍光強度Ｂと比較して相対的に小さい。このため、プロット群
１００２ｂは、漏れ込み光の影響によるプロット群であると判別できる。
さらに、変異型遺伝子及び野生型遺伝子の両方が含まれる微小領域は、蛍光温度Ａと溶
解温度Ａとのグラフにおいて、変異型遺伝子を含む微小領域についてのプロット群１００
３ｂと同様な個所１００４ｂにプロットされる。また、蛍光温度Ｂと溶解温度Ｂとのグラ
フにおいては、野生型遺伝子を含む微小領域についてのプロット群１００２ｃと同様な個
所１００４ｃにプロットされる。このように、第３の実施の形態によれば、複数の蛍光強
度と複数の融解温度を組み合わせることにより、遺伝子の種類を高精度に判別することが
できる。
解温度Ａとのグラフにおいて、変異型遺伝子を含む微小領域についてのプロット群１００
３ｂと同様な個所１００４ｂにプロットされる。また、蛍光温度Ｂと溶解温度Ｂとのグラ
フにおいては、野生型遺伝子を含む微小領域についてのプロット群１００２ｃと同様な個
所１００４ｃにプロットされる。このように、第３の実施の形態によれば、複数の蛍光強
度と複数の融解温度を組み合わせることにより、遺伝子の種類を高精度に判別することが
できる。
また、蛍光色と融解温度の組み合わせにより多数種類の遺伝子を同時に判別することが
できる。図１２Ａに、複数の種類の遺伝子をターゲットとし、本実施の形態に係るデジタ
ルＰＣＲ計測装置で遺伝子の種類を判別した結果のグラフの例を示す。このようなグラフ
は、ディスプレイ１１３の表示画面に表示したり、又は図示しないプリンタ等によって出
力することもできる。
できる。図１２Ａに、複数の種類の遺伝子をターゲットとし、本実施の形態に係るデジタ
ルＰＣＲ計測装置で遺伝子の種類を判別した結果のグラフの例を示す。このようなグラフ
は、ディスプレイ１１３の表示画面に表示したり、又は図示しないプリンタ等によって出
力することもできる。
図１２Ａのグラフは、蛍光強度Ａ、蛍光強度Ｂ、及び、融解温度を３次元座標の各軸と
している。蛍光色素Ａにより修飾されたプローブとハイブリダイゼーションし、融解温度
が異なる３種類の遺伝子（１１０１、１１０２、１１０３）と、蛍光色素Ｂにより修飾さ
れたプローブとハイブリダイゼーションする２種類の遺伝子（１１０１、１１０５）を分
類できていることが分かる。また、図１２Ｂに示すように、２次元座標において、蛍光強
度Ａと蛍光強度Ｂの比、及び融解温度をそれぞれ横軸と縦軸に与えた場合であっても、上
記と同様に多数の遺伝子を同時に判別することが可能である。
している。蛍光色素Ａにより修飾されたプローブとハイブリダイゼーションし、融解温度
が異なる３種類の遺伝子（１１０１、１１０２、１１０３）と、蛍光色素Ｂにより修飾さ
れたプローブとハイブリダイゼーションする２種類の遺伝子（１１０１、１１０５）を分
類できていることが分かる。また、図１２Ｂに示すように、２次元座標において、蛍光強
度Ａと蛍光強度Ｂの比、及び融解温度をそれぞれ横軸と縦軸に与えた場合であっても、上
記と同様に多数の遺伝子を同時に判別することが可能である。
なお、本実施の形態では２種類のフィルタセットを切り替え、２色で計測する例を説明
したがこれに限るものではない。３種類や４種類、それ以上のフィルタセットを切り替え
て計測を行ってもよい。図１２Ｃは、３種類の蛍光色素を用いた場合を示している。図１
２Ｃに示すように、蛍光強度、蛍光色、融解温度を３次元座標の各軸に与えることにより
、複数種類の遺伝子を、変異型か、野生型かも含めて判別することが可能となる。
したがこれに限るものではない。３種類や４種類、それ以上のフィルタセットを切り替え
て計測を行ってもよい。図１２Ｃは、３種類の蛍光色素を用いた場合を示している。図１
２Ｃに示すように、蛍光強度、蛍光色、融解温度を３次元座標の各軸に与えることにより
、複数種類の遺伝子を、変異型か、野生型かも含めて判別することが可能となる。
［その他］
本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば
、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必
ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の
構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成
に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、
他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば
、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必
ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の
構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成
に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、
他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１０１…光源
１０２、１０３、１０４…レンズ
１０５…ショートパスフィルタ
１０６…ダイクロイックミラー
１０７…ロングパスフィルタ
１０８…ＣＭＯＳセンサ
１０９…温度調整器
１１０…傾斜調整部
５０１…傾斜台
１１１…コントローラ
１１２…試料容器
１１３…ディスプレイ
２０２、２０３…ドロップレット
２０４…オイル
２０６、２０７…ウエル
４０３…気泡
６０１、６０２…フィルタセット
９０１、９０２、９０５、９０６、９０９、９１０、９１３、９１４、９１７、９１８
…融解曲線
９０３、９０４、９０７、９０８、９１１、９１２、９１５、９１６、９１９、９２０
…微分曲線
１００１ａ～ｃ、１００２ｂ～ｃ、１００３ａ～ｃ、１００４ａ～ｃ、１１０１～１１
０５…プロット群
１０２、１０３、１０４…レンズ
１０５…ショートパスフィルタ
１０６…ダイクロイックミラー
１０７…ロングパスフィルタ
１０８…ＣＭＯＳセンサ
１０９…温度調整器
１１０…傾斜調整部
５０１…傾斜台
１１１…コントローラ
１１２…試料容器
１１３…ディスプレイ
２０２、２０３…ドロップレット
２０４…オイル
２０６、２０７…ウエル
４０３…気泡
６０１、６０２…フィルタセット
９０１、９０２、９０５、９０６、９０９、９１０、９１３、９１４、９１７、９１８
…融解曲線
９０３、９０４、９０７、９０８、９１１、９１２、９１５、９１６、９１９、９２０
…微分曲線
１００１ａ～ｃ、１００２ｂ～ｃ、１００３ａ～ｃ、１００４ａ～ｃ、１１０１～１１
０５…プロット群
Claims (14)
- 試料内に含まれるＤＮＡを検出するデジタルＰＣＲ計測装置であって、
異なる蛍光色素で修飾された複数の蛍光標識プローブと検出対象のＤＮＡを含む試料が供給される複数の微小領域であって径が１０～１００μｍであるウエルを平面アレイ状に配置した試料容器の温度を制御する温度調整器と、
前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の蛍光強度を計測する蛍光計測部と、 前記温度調整器及び前記蛍光計測部を制御する制御部と、
前記試料容器の水平面に対する傾斜角を調整して気泡を除去する気泡除去部と、
を含み、
前記制御部は、
前記温度調整器を制御して前記試料容器の温度を上昇させた後、前記温度調整器を制御して前記試料容器の温度を下降させながら前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の蛍光強度を計測し、前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の融解曲線を計測し、
前記複数の蛍光色の融解曲線から前記複数の微小領域の各々に対して蛍光色毎の融解温度を算出し、
前記複数の微小領域の各々に対して、前記複数の蛍光色の蛍光強度の少なくとも一つ、および、前記蛍光色毎の融解温度の少なくとも一つを用いて前記検出対象のＤＮＡの種類を判別し、
判別結果を表示する
ことを特徴とするデジタルＰＣＲ計測装置。 - 試料内に含まれるＤＮＡを検出するデジタルＰＣＲ計測装置であって、
異なる蛍光色素で修飾された複数の蛍光標識プローブと検出対象のＤＮＡを含む試料が供給される複数の微小領域であって径が１０～１００μｍであるウエルを平面アレイ状に配置した試料容器の温度を制御する温度調整器と、
前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の蛍光強度を計測する蛍光計測部と、 前記温度調整器及び前記蛍光計測部を制御する制御部と、
前記試料容器を水平面に対して傾斜させて保持可能に構成された傾斜台と、
を含み、
前記制御部は、
前記温度調整器を制御して前記試料容器の温度を上昇させた後、前記温度調整器を制御して前記試料容器の温度を下降させながら前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の蛍光強度を計測し、前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の融解曲線を計測し、
前記複数の蛍光色の融解曲線から前記複数の微小領域の各々に対して蛍光色毎の融解温度を算出し、
前記複数の微小領域の各々に対して、前記複数の蛍光色の蛍光強度の少なくとも一つ、および、前記蛍光色毎の融解温度の少なくとも一つを用いて前記検出対象のＤＮＡの種類を判別し、
判別結果を表示する
ことを特徴とするデジタルＰＣＲ計測装置。 - 前記制御部は、
前記複数の蛍光色の蛍光強度のうちの二つの蛍光色の蛍光強度の比を用いて前記検出対象のＤＮＡの種類を判別する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のデジタルＰＣＲ計測装置。 - 前記判別結果は、前記蛍光色毎の融解温度の少なくとも一つを有する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のデジタルＰＣＲ計測装置。 - 前記判別結果は、前記複数の蛍光色の蛍光強度の少なくとも一つを示す軸と、前記融解温度を示す軸と、を含む
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のデジタルＰＣＲ計測装置。 - 前記判別結果は、前記複数の蛍光色の蛍光強度を示す複数の軸と、前記融解温度を示す軸と、を含む
ことを特徴とする請求項５に記載のデジタルＰＣＲ計測装置。 - 前記判別結果は、前記複数の蛍光色毎に識別可能に区別され、前記蛍光強度及び前記融解温度を示す軸を含む複数のグラフを含む
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のデジタルＰＣＲ計測装置。 - 試料内に含まれるＤＮＡを検出するＰＣＲ計測方法であって、
異なる蛍光色素で修飾された複数の蛍光標識プローブと検出対象のＤＮＡを含む試料が供給される複数の微小領域であって径が１０～１００μｍであるウエルを平面アレイ状に配置した試料容器において、ＰＣＲにより前記ＤＮＡを増幅させることと、
前記試料容器の温度を上昇させた後、前記試料容器の水平面に対する傾斜角を調整して気泡を除去し、前記試料容器の温度を下降させながら前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の蛍光強度を計測し、前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の融解曲線を計測すること、
前記複数の蛍光色の融解曲線から前記複数の微小領域の各々に対して蛍光色毎の融解温度を算出すること、
前記複数の微小領域の各々に対して、前記複数の蛍光色の蛍光強度の少なくとも一つ、および、前記蛍光色毎の融解温度の少なくとも一つを用いて前記検出対象のＤＮＡの種類を判別すること、および
判別結果を表示すること、を有する
ことを特徴とするＰＣＲ計測方法。 - 試料内に含まれるＤＮＡを検出するＰＣＲ計測方法であって、
異なる蛍光色素で修飾された複数の蛍光標識プローブと検出対象のＤＮＡを含む試料が供給される複数の微小領域であって径が１０～１００μｍであるウエルを平面アレイ状に配置した試料容器において、ＰＣＲにより前記ＤＮＡを増幅させることと、
前記試料容器の温度を上昇させた後、前記試料容器を水平面に対して傾斜させた状態で保持して気泡を除去し、前記試料容器の温度を下降させながら前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の蛍光強度を計測し、前記複数の微小領域の各々に対して複数の蛍光色の融解曲線を計測すること、
前記複数の蛍光色の融解曲線から前記複数の微小領域の各々に対して蛍光色毎の融解温度を算出すること、
前記複数の微小領域の各々に対して、前記複数の蛍光色の蛍光強度の少なくとも一つ、および、前記蛍光色毎の融解温度の少なくとも一つを用いて前記検出対象のＤＮＡの種類を判別すること、および
判別結果を表示すること、を有する
ことを特徴とするＰＣＲ計測方法。 - 前記検出対象のＤＮＡの種類を判別することは、
前記複数の蛍光色の蛍光強度のうちの二つの蛍光色の蛍光強度の比を用いて前記検出対象のＤＮＡの種類を判別すること、を含む
ことを特徴とする請求項８又は９に記載のＰＣＲ計測方法。 - 前記判別結果は、前記蛍光色毎の融解温度の少なくとも一つを有する
ことを特徴とする請求項８又は９に記載のＰＣＲ計測方法。 - 前記判別結果は、前記複数の蛍光色の蛍光強度の少なくとも一つを示す軸と、前記融解温度を示す軸と、を含む
ことを特徴とする請求項８又は９に記載のＰＣＲ計測方法。 - 前記判別結果は、前記複数の蛍光色の蛍光強度を示す複数の軸と、前記融解温度を示す軸と、を含む
ことを特徴とする請求項１２に記載のＰＣＲ計測方法。 - 前記判別結果は、前記複数の蛍光色毎に識別可能に区別され、前記蛍光強度及び前記融解温度を示す軸を含む複数のグラフを含む
ことを特徴とする請求項８又は９に記載のＰＣＲ計測方法。
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