CN117385011A - 数字pcr检测装置和pcr检测方法 - Google Patents

数字pcr检测装置和pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

提供一种可高精度检测溶解曲线的数字PCR检测装置和PCR检测方法。该数字PCR检测装置为检测试样内所含的DNA的数字PCR检测装置，包括：控制被供应试样的试样容器的温度的温度调节器，所述试样容器以平面阵列状配置了作为多个微小区域且直径为10～100μm的孔，所述试样含有由不同的荧光色素修饰的多个荧光标记探针和检测对象DNA；对于所述多个微小区域分别检测多个荧光色的荧光强度的荧光检测部；以及控制所述温度调节器和所述荧光检测部的控制部；所述控制部一边控制所述温度调节器来控制所述试样容器的温度，一边对于所述多个微小区域分别检测多个荧光色的荧光强度，对于所述多个微小区域分别检测多个荧光色的溶解曲线。

Description

数字PCR检测装置和PCR检测方法
本申请是原申请的申请日为2020年2月26日、申请号为202080007189.0、发明名称为《数字PCR检测装置》的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及数字PCR检测装置。
背景技术
数字PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶链反应)是高灵敏度检测核酸的技术，与以往的实时定量PCR相比，能够检测出现率低的基因变异。专利文献1中公开了一种DNA检测方法，作为使用数字PCR的DNA检测方法，在含有DNA和与DNA杂交的荧光标记探针的液滴中，测定DNA与荧光标记探针的溶解温度。
此外，专利文献2中公开了下述构成：利用具有能够各自单独进行温度控制的多个单一容器热循环仪的多容器热循环仪阵列，能够使反应液的温度梯度下降，或者为了对可妨碍光学检查的气泡进行脱气而使反应液振动。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2018-108063号公报
专利文献2：日本特表2010-508813号公报
发明内容
发明所要解决的课题
数字PCR中，将含有检测对象DNA的试样划分为大量的微小区域，对各个微小区域进行PCR，进行各微小区域内存在的DNA种类的辨别。专利文献1所示的数字PCR中，使用试样中的对象基因和与对象基因杂交的荧光标记探针，检测其溶解曲线并进行分析，从而辨别对象基因的种类。为了检测溶解曲线，进行荧光标记探针荧光强度的温度依赖性检测。
检测对象基因的种类有多个，例如包括野生型及其变异型的基因。溶解曲线因对象基因的种类和荧光标记探针而异，因此可以通过检测溶解曲线，辨别对象基因的种类。但检测变异型基因等情况下，也存在其碱基序列与野生型的碱基序列仅相差1个碱基的情况。因此，溶解曲线的差别小，为了高精度辨别基因种类，有必要高精度检测荧光强度、溶解曲线。此外，同时检测大量基因的情况下，使检测的波动更小变得重要。
作为使荧光强度、溶解曲线的检测精度下降的一个要因，可列举气泡的存在。如果温度上升时试样附近产生气泡，则对荧光检测产生影响，溶解曲线的检测精度和基因种类的辨别精度下降。此外，虽然为了辨别多个基因种类而进行多个波长的荧光检测，但是由于荧光标记探针的光谱的扩展，会在某一荧光检测中，产生另一波长的荧光检测的光的泄漏。这些情况下，高精度检测荧光强度、溶解曲线也变得重要。
本发明是鉴于这样的情况做出的，其目的之一在于，提供可去除气泡的影响而高精度检测溶解曲线的数字PCR装置。根据本说明书的记载和附图，本发明的前述以及其他目的和新的特征得以明确。
用于解决课题的方法
本发明一个方式涉及的数字PCR检测装置是检测试样内所含DNA的数字PCR检测装置，包括：控制包括多个微小区域的试样容器的温度的温度调节器，前述试样容器被供应有含有荧光标记探针和检测对象DNA的试样；检测前述多个微小区域的荧光强度的荧光检测部；以及控制前述温度调节器和前述荧光检测部的控制部。前述控制部的特征在于，控制前述温度调节器使前述试样容器的温度上升、将前述试样容器内产生的气泡除去后，一边控制前述温度调节器使前述试样容器的温度下降一边检测前述多个微小区域的荧光强度，检测前述多个微小区域的溶解曲线。
发明效果
根据本发明，可以提供可去除气泡的影响而高精度检测荧光强度和溶解曲线、可高精度辨别基因种类的数字PCR检测装置。
附图说明
[图1]为第1实施方式涉及的数字PCR检测装置的构成图。
[图2A]为第1实施方式涉及的试样容器的构成图的一例。
[图2B]为第1实施方式涉及的试样容器的构成图的一例。
[图3]为显示用第1实施方式涉及的数字PCR检测装置辨别DNA种类时的检测程序步骤的流程图。
[图4A]显示的是用第1实施方式涉及的数字PCR检测装置得到的试样容器的荧光检测图像的一例。
[图4B]为用第1实施方式涉及的数字PCR检测装置测定的溶解曲线的一例。
[图4C]为对试样容器112中产生了气泡的状态进行说明的概念图。
[图4D]为试样容器112中产生了气泡的情况下溶解曲线的一例。
[图5]为对进行荧光检测图像的位置偏移的校正方法进行说明的概念图。
[图6]为第2实施方式涉及的数字PCR检测装置的构成图。
[图7]为第3实施方式涉及的数字PCR检测装置的构成图。
[图8]为说明用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置辨别DNA种类时的检测程序步骤的流程图。
[图9A]为显示用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置检测时的温度变化和荧光检测的程序步骤的图表。
[图9B]为说明用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置检测时的操作程序步骤的流程图。
[图10A]为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置检测时的溶解曲线及其微分曲线的一例。
[图10B]为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置检测时的溶解曲线及其微分曲线的一例。
[图10C]为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置检测时的溶解曲线及其微分曲线的一例。
[图10D]为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置检测时的溶解曲线及其微分曲线的一例。
[图10E]为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置检测时的溶解曲线及其微分曲线的一例。
[图11A]为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置测得的结果的一例。
[图11B]为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置测得的结果的一例。
[图11C]为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置测得的结果的一例。
[图12A]为作为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置辨别检测对象基因的结果的图表的一例。
[图12B]为作为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置辨别检测对象基因的结果的图表的一例。
[图12C]为作为用第3实施方式涉及的数字PCR检测装置辨别检测对象基因的结果的图表的一例。
符号说明
101…光源
102、103、104…透镜
105…短波通滤光片
106…二向色镜
107…长波通滤光片
108…CMOS传感器
109…温度调节器
110…倾斜调整部
501…倾斜台
111…控制器
112…试样容器
113…显示器
202、203…液滴
204…油
206、207…孔
403…气泡
601、602…滤光片组合
901、902、905、906、909、910、913、914、917、918…溶解曲线
903、904、907、908、911、912、915、916、919、920…微分曲线
1001a～c、1002b～c、1003a～c、1004a～c、1101～1105…描点群
具体实施方式
以下，参照附图对本实施方式进行说明。附图中，功能上相同的要素有时也用相同的编号或者相应的编号表示。需说明的是，附图显示的是遵循本公开原理的实施方式和安装例，但它们是为了本公开的理解而使用的，绝不是为了对本公开进行限定性解释而使用的。本说明书的记载不过是典型的例示而已，在任何意义上都不是对本公开权利要求书或应用例的限定。
本实施方式中，对于本领域技术人员实施本公开而言充分详细地进行了其说明，但也可以有其他安装、形态，必须理解的是，可以不脱离本公开的技术构思的范围和精神而进行构成、结构的变更、多种要素的替换。因此，不能将以下的记载解释为仅限于此。
以下的实施方式中，为了方便而在有必要时，分为多个部分或实施方式进行说明，但除了特殊指明的情况以外，它们相互之间并非没有关系，处于一方为另一方的一部分或全部的变形例、详细信息、补充说明等的关系。此外，以下的实施方式中，在提及要素的数等(包括个数、数值、量、范围等)时，除了特殊指明的情况和原理上限定为明确特定的数的情况等以外，均不是限定为该特定的数，为特定的数以上、以下均可。
此外，当然，以下的实施方式中，关于其构成要素(也包括要素步骤等)，除了特殊指明的情况和原理上明确被认为是必需的情况等以外，都不一定是必需的。同样地，以下的实施方式的说明中，在提到构成要素等的形状、位置关系等时，除了特殊指明的情况和原理上明确认为并非如此的情况等以外，均设为包括实质上与该形状等近似或者类似的情形等。这对于上述数值和范围也是同样的。需说明的是，用于对实施方式进行说明的全部图中，原则上对同一构件标以相同符号，省略其重复的说明。
(第1实施方式)
图1为显示根据本发明第1实施方式的数字PCR检测装置的构成例的概要图。作为一例，第1实施方式的数字PCR检测装置包括光源101、透镜102、103、104、短波通滤光片105、二向色镜106、长波通滤光片107、CMOS传感器108、温度调节器109、倾斜调整部110(气泡除去部)、控制器111(控制部)、被供应有作为检测对象的试样的试样容器112、以及作为显示部的显示器113。
从光源101照射的光由于透镜102而变为平行光。短波通滤光片105仅使形成平行光的光中规定波长的光选择性透过。通过短波通滤光片105的光被二向色镜106反射后，通过透镜103，照射于试样容器112。来自试样的荧光被由透镜103、二向色镜106、长波通滤光片107和透镜104构成的荧光拍摄系统引导，入射于CMOS传感器108的拍摄面。由此，试样的图像在CMOS传感器108中被拍摄。CMOS传感器108获得的图像信号被输出至控制器111。
控制器111按照内置的图像分析用程序步骤对图像进行分析，将其结果向显示器113输出。上述荧光拍摄系统和CMOS传感器构成检测试样容器112中的多个微小区域的荧光强度的荧光检测部。控制器111具有下述功能：对于温度调节器109和CMOS传感器108，输出本实施方式的检测操作所必需的控制信号，此外，对来自CMOS传感器108的拍摄信号进行规定的信号处理，对拍摄图像进行分析。如以下详细说明的那样，控制器111控制温度调节器109使试样容器112的温度升温、将试样容器112内产生的气泡除去后，一边控制温度调节器109使试样容器112的温度下降一边检测多个微小区域的荧光强度，检测多个微小区域的溶解曲线。显示器113用数值或图表等来显示控制器111中实行的检测的结果。
试样容器112设置在温度调节器109上。温度调节器109按照来自控制器111的指令控制试样容器112的温度。温度调节器109由加热器、珀尔帖元件构成，但不限于此。此外，温度调节器109中设有倾斜调整部110。倾斜调整部110以可调整温度调节器109和试样容器112相对于水平面的倾角的方式构成。通过倾角的调整，试样容器112内产生的气泡从试样容器112被除去。需说明的是，倾斜调整部110是用于除去气泡的构成的一例，并不限定于此。例如，也可以设置对试样容器112施加振动的振荡器作为气泡除去部。通过对试样容器112施加振动，气泡被除去至试样容器112的外部。或者，气泡除去部也可以是使试样容器112内的液体产生流动而使气泡移动至拍摄范围外的产生流动的手段。
参照图2A和图2B，对第1实施方式的试样容器112(112a、112b)的构成例进行说明。图2A所示的试样容器112a是具有对液滴202、203、…进行平面配置的构成的试样容器。试样容器112a具有滴出液滴的结构。或者，也可以是使液滴在具有与液滴直径同等高度的空间中紧密配置的构成。任一构成中，液滴均用可从试样容器的任一方向进行荧光检测的材质配置。此外，在容器内，液滴周围充满油204。油包括氟系油、矿物油等，但不限于此。该试样容器112a中，试样被液滴分为多个微小区域而配置。
此外，图2B所示的试样容器112b是具有不使用液滴而是使用呈阵列状排列的孔来对试样进行分割的构成的试样容器。使大量10～100μm左右大小的孔206、207、…呈矩阵状配置，在各个孔中投入含有作为检测对象的基因的试样。与图2A的试样容器112a同样地，投入了试样的孔充满油204。优选孔的数量为数万个至数百万个，相对于投入的检测对象DNA的数量是足够多的数量。投入试样时，存在有DNA进入的孔(206)和没有DNA进入的孔(207)。该试样容器112中，试样被多个孔分为多个微小区域而配置。
参照图3的流程图，对用第1实施方式的数字PCR检测装置辨别DNA种类时的检测程序步骤进行说明。
最初，将含有检测对象基因的试样(样品)分为多个微小区域而投入试样容器112中(步骤301)。其后，在该多个微小区域中分别通过PCR对DNA进行扩增(步骤302)。对DNA进行扩增后，控制搭载试样容器112的温度调节器109，使试样的温度上升(步骤303)。此时，伴随试样和试样容器112的温度上升，试样容器112内产生气泡。该气泡包括油中溶解的气体随着温度上升而产生的情况、试样容器112中的材料气化的情况、原本在油204、试样中含有的气泡由于温度上升而膨胀的情况等，但不限于此。从准确检测溶解曲线的观点出发，该步骤303中的温度上升优选设定为比检测对象DNA与荧光标记探针的溶解温度高5℃以上的温度。
在步骤303中使温度上升后、或者在步骤303中使温度上升的同时，将试样容器112内产生的气泡除去(步骤304)。气泡除去通过如上述那样利用倾斜调整部110使试样容器112倾斜、或使试样容器112振动等方法来实施。
其后，一边用温度调节器109使试样的温度下降，一边检测试样的荧光图像(步骤305)。而且，由荧光图像计算各微小区域的荧光强度和作为其温度依赖性的溶解曲线(步骤306)，辨别各微小区域内的DNA种类(步骤307)。具体地，在CMOS传感器108中，一边使试样的温度下降一边以规定时间间隔获得多个荧光图像。而且，通过对该多个图像的微小区域中的每一个确定荧光强度的时间变化，计算溶解曲线。需说明的是，优选步骤305中温度下降的速度(斜率)比步骤303中温度上升的速度慢(参照后述图9A的符号801和803)。
图4A为显示本实施方式的数字PCR检测装置涉及的试样容器的荧光图像的一例的示意图。如果在试样被分割为试样容器112中的多个微小区域并被投入的状态下拍摄荧光图像，则荧光标记探针带来的荧光被拍摄。包含检测对象DNA的微小区域在低温下荧光强度强，在高温下变弱。另一方面，不含检测对象DNA的微小区域的荧光强度相对较弱。
图4B为显示用第1实施方式涉及的数字PCR检测装置测得的溶解曲线的一例的示意图。通过一边使试样的温度下降一边实施荧光检测，能够获得显示荧光强度的温度依赖性的图表。荧光标记探针405在两端或其附近具有荧光色素406及其淬灭基团407，两端周边的序列互补，形成分子信标那样的茎环结构。此外，以环部分的序列与模板DNA 404互补、具有能够与模板DNA 404杂交那样的结构的方式设计。荧光标记探针405单独游离存在时形成茎环，因为荧光色素406与淬灭基团407接近，所以不发出荧光。如果模板DNA 404与荧光标记探针405的环部分杂交，则荧光色素406与淬灭基团407分离，因此荧光标记探针405发出荧光。如果试样的温度高、DNA 404与荧光标记探针405解离，则在荧光标记探针405内形成茎环，因此荧光强度下降。因此，如果一边使温度下降一边检测荧光强度，则可以获得荧光强度增强的情形。
检测溶解曲线时，试样的温度是用温度调节器109改变的，因此试样容器112内会产生气泡。图4C显示的是试样容器112内产生了气泡时荧光图像的示意图的一例。在有气泡(403a～c)的情况下，由于光在其表面等的散射等而对照射光的强度、来自荧光标记探针的荧光的强度产生影响，荧光图像受到影响。数字PCR中，将试样在试样容器中分为大量的微小区域(液滴或孔)，因此各个微小区域的大小较小，其容量的单位为皮升至纳升。也存在气泡的大小比各个微小区域大的情况，在被气泡覆盖的区域、位于气泡边缘的区域，从该微小区域发出的荧光强度受到气泡的影响。图4D为某一区域受气泡的影响时的溶解曲线409的一例。该曲线中，在产生气泡的温度附近(图4D的符号410)，荧光强度下降，溶解曲线409受到其影响。因此无法准确检测荧光强度。这样的情况下，也存在成为溶解温度计算的误差、带来基因种类的错误辨别的情况。
因此，第1实施方式涉及的数字PCR检测装置中，在将试样投入试样容器112后，使用温度调节器109等暂时使试样的温度上升而产生气泡，将该气泡除去后，一边用温度调节器109等使温度下降一边检测荧光图像。由此，在荧光图像检测中，能够抑制试样容器112中气泡的产生，能够减少计算溶解曲线时气泡的影响。因此，能够高精度计算溶解曲线。此外，能够高精度求出溶解温度，能够高精度检测对象基因的种类。
具体地，例如，首先使试样容器112中的试样的温度例如上升至85℃而产生气泡，其后使用倾斜调整部110将气泡除去。气泡的除去可以设为在经过规定时间后结束，也可以拍摄试样的图像而检测气泡的除去是否已结束。
其后，一边使试样的温度下降一边用荧光标记探针检测荧光图像。具体地，例如，一边使试样的温度从85℃下降至50℃，一边约每0.2℃拍摄一次荧光图像。该温度范围可以由作为对象的DNA与荧光标记探针的溶解温度来确定。即，使试样的温度暂时上升至比应当检测的溶解温度高且留有余量的温度，进行检测直至比应当检测的溶解温度低的温度。
需说明的是，因为使温度变化，由于试样容器112、温度调节器109的热膨胀等的影响，在各温度下拍摄的图像中产生了位置偏移。本实施方式的控制器111如图5所示从获得的多个图像识别各微小区域的位置，检测对应的微小区域之间的位置偏移(ΔX，ΔY)。控制器111可以包括对该位置偏移进行校正、追踪多个图像间各微小区域的位置、计算溶解曲线的功能。此外，由荧光图像得到的溶解曲线包含检测噪声、位置偏移噪声等，因此也可以使用数字滤光片将噪声除去、计算溶解温度。
需说明的是，荧光标记探针不限定为分子信标，也可以是DNA嵌入剂。此外，作为光源，可以包括卤素灯、LED光源、激光光源等，但不限定为特定的光源。此外，拍摄元件不限定为CMOS传感器108，也可以是使用CCD的相机。此外，不限定为二维拍摄元件，也可以是一维线性传感器、光电倍增管。需说明的是，图1所示的光学系统的构成只是一个例子，并不限于此。光学系统中的透镜、滤光片也不限定为特定结构的部件，只要能够对试样照射激发光、检测荧光即可。此外，短波通滤光片、长波通滤光片也可以是使特定波长的光通过的带通滤光片。二向色滤光片也可以是半反射镜。
如上所说明的那样，根据该第1实施方式的数字PCR检测装置，能够去除气泡的影响而高精度检测荧光强度和溶解曲线，能够高精度辨别基因的种类。
(第2实施方式)
参照图6对本发明第2实施方式涉及的数字PCR检测装置进行说明。图6中，对于与第1实施方式(图1)相同的构成要素标以相同符号，因而省略了重复说明。该第2实施方式中，作为气泡除去部，设有以可保持试样容器112相对于水平面倾斜的方式构成的倾斜台501。换句话说，该倾斜台501以使试样容器112恒定地保持相对于水平面倾斜的状态的方式构成。这一点与第1实施方式的倾斜调整部110以在检测操作中途改变试样容器112的倾角的方式构成是不同的。该第2实施方式的气泡除去部中也设为可使试样容器112相对于水平面倾斜地配置，从而能够在试样容器112中产生了气泡时，气泡向重力方向的上方移动，将气泡从荧光拍摄的范围除去。当然，倾斜台501的倾斜角度也可以是可利用图中未显示的倾斜调整机构进一步调整。需说明的是，图6的例子中，显示的是在温度调节器109本身倾斜的状态下用倾斜台501保持、试样容器112保持在该温度调节器109的上表面的情况。
此外，该第2实施方式的数字PCR检测装置中，由透镜103、二向色镜106、长波通滤光片107、透镜104构成的荧光拍摄系统以其光轴相对于倾斜的试样容器112垂直的方式配置。即，荧光拍摄系统具有根据试样容器112相对于水平面的斜率而相对于水平面倾斜的光轴。而且，CMOS传感器108的拍摄面也根据该荧光拍摄系统的倾斜方向倾斜地配置。此外，使来自光源101的光投影的投影光学系统(透镜102、短波通滤光片105)也根据该荧光拍摄系统的倾斜方向而倾斜。
利用该第2实施方式的构成，也能够在使试样的温度上升的情况下试样容器112内产生了气泡时，使气泡向试样容器112内的上方(关于重力方向)移动，将气泡从荧光拍摄范围除去，能够实现高精度的拍摄和溶解曲线检测。倾斜台501使试样容器112倾斜的角度优选为保持如下状态的角度：气泡可在试样容器112内移动、且试样的微小区域充满油。具体地，可以在相对于水平面10°～20°左右的范围使试样容器112倾斜。
(第3实施方式)
参照图7至图12C对本发明第3实施方式涉及的数字PCR检测装置进行说明。图7为第3实施方式涉及的数字PCR检测装置的构成图。图7中，对于与第1实施方式(图1)相同的构成要素标以相同符号，因而省略了重复说明。该第3实施方式的数字PCR检测装置以下述方式构成：具有多个包括短波通滤光片105、二向色镜106、长波通滤光片107的滤光片组合(601、602)，选择性地将它们插入荧光拍摄系统，实行使用多个滤光片的倾向检测，可获得多个种类的溶解曲线。图7中，作为一例，具备两种滤光片组合601和602，但滤光片组合的数量不限定为两个，当然，也可以是3个以上。滤光片组合601将短波通滤光片105a、二向色镜106a、长波通滤光片107a作为一个整体，整体保持在一个壳体内。此外，滤光片组合602将短波通滤光片105b、二向色镜106b、长波通滤光片107b作为一个整体，整体保持在一个壳体内。
滤光片组合601和602利用图中未显示的移动机构如箭头603所示那样插入光路或脱离。滤光片组合601和602分别对应于不同荧光色素的荧光检测，短波通滤光片105a与105b的透过波长不同。具体地，作为荧光色素，可以使用对应于FAM、VIC、ROX、Cy3、Cy5等的激发光、荧光的滤光片组合。需说明的是，图7中设有倾斜调整部110作为气泡除去部，当然，也可以取而代之，设置倾斜台501或其他气泡除去部。
参照图8的流程图，其显示的是第3实施方式的数字PCR检测装置中的检测程序步骤。这里，对交替切换使用两种滤光片组合601、602、实施12种荧光检测(荧光检测A和荧光检测B)的例子进行说明。首先，将试样分为多个微小区域并投入试样容器112(步骤701)，在该多个区域中分别通过PCR对DNA进行扩增(步骤702)。对DNA进行扩增后，将试样容器112置于数字PCR检测装置中，用温度调节器109使温度上升(步骤703)，利用倾斜调整部110将试样容器112内产生的气泡除去(步骤704)。其后，一边用温度调节器109使试样的温度下降一边对多个滤光片组合(601、602)进行切换，同时，检测荧光图像(步骤705)。由拍摄的荧光图像计算溶解曲线，计算溶解温度(步骤706)。在各微小区域中，对于各个荧光颜色，使用荧光强度的信息判定各微小区域内有DNA进入(阳性)还是没有DNA进入(阴性)(步骤707)。基于计算的溶解温度和预先准备的溶解温度数据库，判定基因的种类(步骤708)。
各区域的DNA为阳性还是阴性的判定中利用了荧光强度的信息，此时，通过使用比溶解温度低的温度下的荧光强度与比溶解温度高的温度下的荧光强度之比，能够去除照射光强度的影响。或者，也可以使用比溶解温度低的温度下的荧光强度与比溶解温度高的温度下的荧光强度之差。具体地，例如，如果从50℃下的荧光强度减去85℃下的荧光强度，则能够去除荧光标记探针本身的荧光的影响、即背景的影响。
参照图9A和图9B，进一步详细地对图8的步骤705的操作进行说明。图9A为对显示试样温度的时间变化的曲线和荧光检测(A或B)的实施时机进行说明的图表。此外，图9B为显示操作的程序步骤的流程图。
首先，用温度调节器109使试样的温度上升(图9A的曲线801)。如果试样的温度上升至初始温度tini，则试样容器112内产生气泡。初始温度tini设定为比进行溶解曲线检测的上限温度tmax高的温度。使用倾斜调整部110将该气泡除去。其后，等待规定时间直至气泡被除去后(图9A的符号802)，一边使试样的温度下降(图9A的曲线803)一边进行荧光检测。此时，荧光检测是，交替重复进行对应于滤光片组合601的荧光检测A和对应于滤光片组合602的荧光检测B。进行的时机和次数不受图9A所示内容的限定。
图9B为显示关于温度设定的程序步骤的流程图。设定初始温度(步骤804)、进一步设定检测温度(步骤806)，则重复进行荧光检测A与荧光检测B直至达到最终温度(步骤807和808)。如果达到最终温度，则测定结束(步骤805)。
上述实施方式中，对滤光片组合进行切换，也可以代替对滤光片组合进行切换或者在对滤光片组合进行切换的基础上，对光源进行切换。此外，还可以不是对所有滤光片组合进行切换、而是仅对滤光片组合中的一部分滤光片进行切换的构成。具体地，例如，也可以是采用激发光照射同一波长的光、仅对荧光拍摄时的长波通滤光片107进行切换的构成。
图10A～图10E中显示的是针对各微小区域而得到的2个溶解曲线及其微分曲线的例子。均显示的是可存在与用荧光色素A修饰的荧光标记探针杂交的DNA A以及与用荧光色素B修饰的荧光标记探针杂交的DNA B时的例子。
图10A是DNA A为阳性的微小区域的溶解曲线901、902及其微分曲线903、904的一例。这样的溶解曲线和微分曲线也可以在显示器113的显示画面中显示或用图中未显示的打印机等进行输出。
控制器111一边控制温度调节器109使试样的温度暂时上升、其后下降，一边使用荧光检测部进行检测，从而获得溶解曲线901、902。此外，通过求出溶解曲线901、902的微分曲线903、904，由其峰值位置计算溶解温度。
可以由DNA A为阳性时的溶解曲线计算溶解温度，计算DNA种类。另一方面，在荧光光谱中有扩展，荧光检测A与荧光检测B之间存在泄漏，因此尽管DNA B为阴性，但溶解曲线看起来是可检测的。这样的情况下，根据多个溶解曲线的比较和微分曲线的性状(强度、峰值位置、形状等)，可以判定某一曲线是泄漏光导致的，该DNA为阴性。图10A中，仅观察到曲线901、902的情况下，则DNA A、DNA B看起来均为阳性，但如果将视线移至微分曲线903、904，则微分曲线903、904均大体在同一温度达到峰值。因此能够判断，仅DNA A为阳性、而微分曲线904涉及的DNA B为阴性。
此外，图10B是DNA B为阳性时的溶解曲线的例子。由溶解曲线905观察到了从溶解曲线906泄漏的光，因此可以判定DNA A为阴性。
图10C是DNA A为阳性、DNA B为阴性时的溶解曲线的另一例。数字PCR中，关于PCR扩增效率，有时在多个微小区域之间会发生波动，产生荧光强度低的微小区域。例如，图10C的溶解曲线910的荧光强度形成另一微小区域的泄漏导致的与溶解曲线905同等程度的荧光强度的曲线，但可以根据与溶解曲线909的相对强度的比较和溶解温度的共通性判定DNAA为阳性。
图10D是DNA A和DNA B均为阳性的溶解曲线的例子。通过荧光检测A、B得到两种不同的溶解曲线913、914，得到其微分曲线915、916。由微分曲线915、916的峰值位置得到DNAA和DNA B的溶解温度。根据微分曲线915、916的峰值位置不同，可以判定检测对象的一个微小区域中有两种DNA(DNA A、DNA B)进入。另一方面，图10E是DNA A、DNA B均为阴性的溶解曲线的例子。
图11A～图11C是用第3实施方式的数字PCR检测装置检测两种基因(野生型及其变异型)并分类而得的结果的图表的例子。这样的图表也可以在显示器113的显示画面中显示或用图中未显示的打印机等进行输出。
图11A～图11C显示的是变异型基因与用荧光色素A修饰的荧光标记探针杂交、野生型基因与用荧光色素B修饰的荧光标记探针杂交的情况。此外，野生型基因与变异型基因的溶解温度不同。
如果对两种滤光片组合进行切换，对多个微小区域检测荧光强度A和荧光强度B，则各微小区域如图11A那样描点。描点可以分为以下的(1)～(4)的4个描点群。
(1)判定DNA为阴性的微小区域的描点群1001a
(2)判定含有野生型基因的微小区域的描点群1002a
(3)判定含有变异型基因的微小区域的描点群1003a
(4)判定含有野生型基因和变异型基因双方的微小区域的描点群1004a
此外，可以由基于荧光色素A、荧光色素B的两种颜色的溶解曲线计算两个溶解温度(溶解温度A和溶解温度B)。图11B为显示在各微小区域测得的荧光强度A与溶解温度A的关系的图表。此外，图11C为显示在各微小区域测得的荧光强度B与溶解温度B的关系的图表。
如图11B和图11C所示，判定DNA为阴性的微小区域在描点群1001b、1001c附近描点。关于判定DNA为阴性的微小区域，测定的结果得到的荧光强度低，此外溶解曲线几乎没有温度依赖性，因此溶解温度是不确定的。因此，描点群1001b、1001c成为在纵轴方向上很宽的范围内分散的描点。
另一方面，关于含有变异型基因的微小区域，对于荧光强度A检测到高的值(1003b)，而且在特定的溶解温度A附近得到大量的描点。此外，关于含有野生型基因的微小区域，对于荧光强度B检测到高的值(1002c)，而且在特定的溶解温度B附近得到大量的描点。
需说明的是，关于含有野生型基因的微小区域，是用荧光色素B修饰的，因而对于荧光强度A应当为低的值，但由于来自相邻区域的荧光色素A的泄漏光，观察到了荧光强度A的值与描点群1001b相比变大的描点群1002b。但是，该描点群1002b的荧光强度A与前述描点群1002c的荧光强度B相比相对较小。因此，可以辨别描点群1002b是泄漏光的影响导致的描点群。
进一步，关于含有变异型基因和野生型基因双方的微小区域，在荧光温度A和溶解温度A的图表中，在与关于含有变异型基因的微小区域的描点群1003b同样的部分1004b描点。此外，荧光温度B和溶解温度B的图表中，在与关于含有野生型基因的微小区域的描点群1002c同样的部分1004c描点。以这种方式，根据第3实施方式，通过组合多个荧光强度和多个溶解温度，能够高精度辨别基因的种类。
此外，利用荧光色与溶解温度的组合，能够同时辨别多个种类的基因。图12A中显示的是以多个种类的基因为靶标、用本实施方式涉及的数字PCR检测装置辨别基因种类而得的结果的图表的例子。这样的图表也可以在显示器113的显示画面中显示或用图中未显示的打印机等进行输出。
图12A的图表将荧光强度A、荧光强度B和溶解温度作为三维坐标的各轴。可知，可以分类为与用荧光色素A修饰的探针杂交且溶解温度不同的3种基因(1101、1102、1103)、和与用荧光色素B修饰的探针杂交的两种基因(1101、1105)。此外，如图12B所示，二维坐标中，在将荧光强度A与荧光强度B之比和溶解温度分别表示在横轴和纵轴中的情况下，也能够与上述同样地同时辨别大量基因。
需说明的是，本实施方式中，说明了对两种滤光片的组合进行切换、用两种颜色进行检测的例子，但不限于此。也可以对3种、4种、4种以上滤光片组合进行切换并检测。图12C显示的是使用3种荧光色素的情况。如图12C所示，通过将荧光强度、荧光色、溶解温度表示在三维坐标的各轴中，能够辨别多个种类的基因，包括变异型、野生型。
[其他]
本发明不受上述实施例的限定，包括各种变形例。例如，上述实施例是为了容易理解地对本发明进行说明而详细地进行说明的内容，并不限定为必须具备所说明的全部构成。此外，可以将某一实施例的构成的一部分替换为其他实施例的构成，此外，也可以在某一实施例的构成中增加其他实施例的构成。此外，还可以对各实施例的构成的一部分进行其他构成的追加、删除、替换。

Claims (18)

1.一种数字PCR检测装置，其特征在于，为检测试样内所含的DNA的数字PCR检测装置，
包括：
控制被供应试样的试样容器的温度的温度调节器，所述试样容器以平面阵列状配置了作为多个微小区域且直径为10～100μm的孔，所述试样含有由不同的荧光色素修饰的多个荧光标记探针和检测对象DNA，
对于所述多个微小区域分别检测多个荧光色的荧光强度的荧光检测部，以及
控制所述温度调节器和所述荧光检测部的控制部；
所述控制部：
一边控制所述温度调节器来控制所述试样容器的温度，一边对于所述多个微小区域分别检测多个荧光色的荧光强度，对于所述多个微小区域分别检测多个荧光色的溶解曲线，
根据所述多个荧光色的溶解曲线，对于所述多个微小区域分别计算每个荧光色的溶解温度，
对于所述多个微小区域分别使用所述多个荧光色的荧光强度中的至少一个以及每个所述荧光色的溶解温度中的至少一个，辨别所述检测对象DNA的种类，并且
显示辨别结果。
2.根据权利要求1所述的数字PCR检测装置，其特征在于，进一步具备：
气泡除去部，其调整所述试样容器相对于水平面的倾角，将气泡除去。
3.根据权利要求1所述的数字PCR检测装置，其特征在于，进一步具备倾斜台，其构成为可保持所述试样容器相对于水平面倾斜。
4.根据权利要求1所述的数字PCR检测装置，其特征在于，所述控制部在控制所述温度调节器使所述试样容器的温度上升后，一边控制所述温度调节器使所述试样容器的温度下降一边对于所述多个微小区域分别检测所述多个荧光色的荧光强度。
5.根据权利要求1所述的数字PCR检测装置，其特征在于，所述控制部使用所述多个荧光色的荧光强度中的两个荧光色的荧光强度之比来辨别所述检测对象DNA的种类。
6.根据权利要求1所述的数字PCR检测装置，其特征在于，所述辨别结果包括每个所述荧光色的溶解温度中的至少一个。
7.根据权利要求1所述的数字PCR检测装置，其特征在于，所述辨别结果包括表示所述多个荧光色的荧光强度中的至少一个的轴和表示所述溶解温度的轴。
8.根据权利要求7所述的数字PCR检测装置，其特征在于，所述辨别结果包括表示所述多个荧光色的荧光强度的多个轴和表示所述溶解温度的轴。
9.根据权利要求1所述的数字PCR检测装置，其特征在于，所述辨别结果包括以能够识别所述多个荧光色中的每一个的方式而区分的、包含表示所述荧光强度和所述溶解温度的轴的多个图表。
10.一种PCR检测方法，其特征在于，为检测试样内所含的DNA的PCR检测方法，包括：
一边控制被供应试样的试样容器的温度一边对于多个微小区域分别检测多个荧光色的荧光强度，对于所述多个微小区域分别检测多个荧光色的溶解曲线，其中所述试样容器以平面阵列状配置了作为所述多个微小区域且直径为10～100μm的孔，所述试样含有由不同的荧光色素修饰的多个荧光标记探针和检测对象DNA，
根据所述多个荧光色的溶解曲线，对于所述多个微小区域分别计算每个荧光色的溶解温度，
对于所述多个微小区域，分别使用所述多个荧光色的荧光强度中的至少一个以及每个所述荧光色的溶解温度中的至少一个，辨别所述检测对象DNA的种类，以及
显示辨别结果。
11.根据权利要求10所述的PCR检测方法，其特征在于，进一步包括：调整所述试样容器相对于水平面的倾角，将气泡除去。
12.根据权利要求10所述的PCR检测方法，其特征在于，进一步包括：将所述试样容器保持为相对于水平面倾斜的状态，将气泡除去。
13.根据权利要求10所述的PCR检测方法，其特征在于，检测所述多个荧光色的荧光强度包括：
使所述试样容器的温度上升后，一边使所述试样容器的温度下降一边对于所述多个微小区域分别检测所述多个荧光色的荧光强度。
14.根据权利要求10所述的PCR检测方法，其特征在于，辨别所述检测对象DNA的种类包括：
使用所述多个荧光色的荧光强度中的两个荧光色的荧光强度之比来辨别所述检测对象DNA的种类。
15.根据权利要求10所述的PCR检测方法，其特征在于，所述辨别结果包括每个所述荧光色的溶解温度中的至少一个。
16.根据权利要求10所述的PCR检测方法，其特征在于，所述辨别结果包括表示所述多个荧光色的荧光强度中的至少一个的轴和表示所述溶解温度的轴。
17.根据权利要求16所述的PCR检测方法，其特征在于，所述辨别结果包括表示所述多个荧光色的荧光强度的多个轴和表示所述溶解温度的轴。
18.根据权利要求10所述的PCR检测方法，其特征在于，所述辨别结果包括以能够识别所述多个荧光色中的每一个的方式而区分的、包含表示所述荧光强度和所述溶解温度的轴的多个图表。
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