JP7066540B2 - デジタルpcrの測定方法および測定装置 - Google Patents
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Description
解析対象データから除去することは、測定再現性および測定精度を向上させる上で重要である。しかし、対象遺伝子を含まない空のドロップレットは蛍光標識プローブがハイブリダイゼーションする相手がいないため、融解温度による判別ができない。一方で、対象遺伝子を含まない空のドロップレットを従来のデジタルPCRのように蛍光強度で判別するのも、次のような理由から難しいことがわかってきた。まず、融解曲線分析を行うために用いているモレキュラービーコンという蛍光標識プローブは、従来のデジタルPCRで用いられていたTaqMan(登録商標)プローブのようにPCR中に自身が分解されて増感するような構造をもたないため、対象遺伝子を含み、ポジティブなドロップレットであっても、PCR後の蛍光強度が小さい。次に、各ドロップレットを広く平面配置して蛍光強度を測定するため、光照射時および蛍光取り込み時に面内ばらつきが生じる。これらのことから、ドロップレット内で対象遺伝子が増幅したドロップレットの蛍光強度が小さくなり、ドロップレット全体の蛍光強度ばらつきが大きくなった結果、シグナル(S)/ノイズ(N)比が低くなり、対象遺伝子を含まない空のドロップレットと対象遺伝子を含むドロップレットを蛍光強度で判別する精度が低くなる場合があった。
光強度に対する、第1の温度より低い第2の温度の蛍光強度の比を算出する計算部と、を備える、DNA検出装置である。このDNA検出装置は、前記検出対象のDNAを増幅するための増幅部をさらに備えてもよい。また、前記検出結果を表示するモニターをさらに備えてもよい。
示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
本発明に係るDNA検出方法は、蛍光標識プローブまたはDNAインターカレーターと検出対象のDNAを含有するDNA溶液を複数の画分に分割する工程と、前記画分の中で核酸増幅反応を行う工程と、温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、前記温度変化に伴う前記蛍光強度の変化に基づいて計測されるDNA二重鎖の融解温度を算出する工程と、を含む。
。あるいは、両方同じ蛍光色素を用いた場合であっても、各蛍光標識プローブの検出対象遺伝子に対する融解温度(Tm)が異なるように、蛍光標識プローブの配列を決めておき、融解曲線分析を行って、Tmを計算することによって、野生型アレルと変異型アレルのどちらが増幅したかを決定することが可能になる。
本発明のDNA検出装置は、DNA溶液中の検出対象のDNAを検出するためのDNA検出装置であって、DNA溶液を加温するための加温部と、DNA溶液から放出される蛍光の強度を測定するための蛍光測定部と、DNA溶液の温度変化に伴う前記蛍光の強度の変化からDNA二重鎖の融解温度融解温度を算出し、DNA溶液の第1の温度の蛍光強度に対する、第1の温度より低い第2の温度の蛍光強度の比を算出する計算部と、を備える。
ータは、計算部(図示せず)に送られ、そこで蛍光標識プローブとDNAとの融解温度またはDNAの二重鎖の融解温度が算出される。光源304、蛍光フィルター305、フォトマルチプルメーター306で構成される蛍光検出器は、蛍光色素の色ごとに別々に設けてもよいし、図3Aに示すように1つの光源の励起光で励起して2つの蛍光フィルターでそれぞれの蛍光を同時に検出する構成にしてもよい。
図4Aは、図2で述べたのと同様に、PCR増幅産物の融解温度(Tm)を用いて行うDNA検出方法を用いた場合で、検出した蛍光強度が重なり、検体溶液内の対象遺伝子の有無を判定できない場合がある測定結果の一例を示す模式図である。一方、図4Bは図1で述べたのと同様に、PCR増幅産物に対し、温度変化に伴う第1の温度の蛍光強度に対する、第1の温度より低い第2の温度の蛍光強度の比を用いて行うDNA検出方法を用いたデジタルPCR測定結果の一例で、検体溶液内の対象遺伝子の有無をより精度高く判定できた測定結果の一例を示す模式図である。図5および図6は、図4で検出対象遺伝子の有無を判定できなかった検体溶液に対し、溶液内で増幅したDNAの融解曲線分析を行った結果の一例を示す模式図である。
み、検体溶液b405が検出対象遺伝子の変異型遺伝子を含むと分かる。しかし、検体溶液c406や検体溶液d407の位置に蛍光強度が観察されると、それらの検体溶液が検出対象遺伝子を含むかどうかは測定結果から判断することができない。
に内で増幅したDNA601に蛍光標識プローブ602のループ部分がアニールし、蛍光色素603とクエンチャー604が離れるため、蛍光標識プローブ602は強い蛍光を発する。その後、検体溶液を加熱すると、DNA601と蛍光標識プローブ602が解離し、蛍光標識プローブ602内でステムループが形成するため蛍光標識プローブ602からの蛍光強度が低下する。さらに検体溶液を加熱すると、蛍光標識プローブ602のステムループも解離するため、蛍光強度が再度増加する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図6に示す。なお、この蛍光標識プローブは、PCRのための蛍光標識プローブと共用してもよいが、PCRのための蛍光標識プローブとは別のプローブを作製して用いてもよい。また、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応の中で行ってもよく、核酸増幅反応とは独立に(例えば、核酸増幅反応完了後に)、検体溶液を昇温させることによって行ってもよい。
Acid(PNA)やLocked Nucleic Acid(LNA)のような人工DNAを利用することで、融解温度を制御することができる。
本発明の一実施態様にかかるDNA検出装置は、検出対象のDNAを含有するDNA溶液をオイルに加えてドロップレットを作製するためのドロップレット作製部、及び/又はドロップレットに対してDNAを増幅するための増幅部を含んでもよい。
すドロップレット作製用カートリッジ705をセットして用いる。ドロップレット作製用カートリッジ705は、オイル供給口715、PCR反応液導入口716、ドロップレット排出口717をもつ。ドロップレット検出部703は、図7Cに示すドロップレット検出用カートリッジ707を温調装置722の上にセットして用いる。ドロップレット検出用カートリッジ707は、オイル供給口718、ドロップレット導入口719、液溜723、廃液排出口720をもつ。ドロップレット作製用カートリッジのオイル供給口715はデジタルPCR測定装置721と流体的に接続され、ポンプ709によってオイル713が供給される。ドロップレット作製用カートリッジのPCR反応液導入口716はデジタルPCR測定装置721と流体的に接続され、ポンプ708によって窒素ガスや空気などのガスまたはオイル712が供給される。ドロップレット作製用カートリッジのドロップレット排出口717はデジタルPCR測定装置721と流体的に接続され、サーマルサイクラー702にセットしたマイクロチューブ706へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ707のオイル供給口718はデジタルPCR測定装置721と流体的に接続され、ポンプ710によってオイル713が供給される。ドロップレット検出用カートリッジ707のドロップレット導入口719はデジタルPCR測定装置721と流体的に接続され、サーマルサイクラー702にセットしたマイクロチューブ706へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ707の廃液排出口720は、デジタルPCR測定装置721と流体的に接続され、ポンプ711によって廃液溜め714にドロップレット検出用カートリッジ707内の廃液が排出される。ポンプは、ペリスタポンプであっても、シリンジポンプであっても、ダイアフラムポンプであってもよい。モニター704は、測定結果やメッセージを表示するための表示部であり、ユーザーが操作を入力する入力部でもある。
図7の装置とカートリッジ、及びDNAインターカレーターまたはモレキュラービーコンを用いて融解温度測定を行う方法の一例を、図8のフローチャートを参考にしながら説明する。まず、DNAを含む生体試料由来の検体溶液を、DNAポリメラーゼ、プライマー、DNAインターカレーターまたはモレキュラービーコン、デオキシリボヌクレオチド類、緩衝液を含むPCR反応液に添加する(S801)。このPCR反応液をドロップレット作製用カートリッジ705のPCR反応液導入口716に添加する(S802)。ドロップレット作製用カートリッジ705をデジタルPCR測定装置721のドロップレット作製部701にセットする。オイル供給口715からオイル713を、PCR反応液導入口716からオイル712を添加する(S803)と、ドロップレット作製用カートリッジ705内のオイルとPCR反応液の流路が交わる部位において、ドロップレットが生成する。生成したドロップレットは、ドロップレット排出口717から排出され、サーマルサイクラー内にあらかじめ設置しておいたマイクロチューブ706に移動し、チューブ内に貯蔵される(S804)。所定数のドロップレットが得られたところで、マイクロチューブ706の蓋を閉め、サーマルサイクラーの温度制御によりPCRを行う(S805)。変性工程、伸長工程、アニーリング工程のサイクルを繰り返すことで、DNAが増幅するとともに、DNAインターカレーターの場合は増幅したDNAにインターカレートし、モレキュラービーコンの場合は増幅したDNAにハイブリダイズすることによって、蛍光強度が高くなる。各工程の温度や時間、サイクル数などの反応条件は、当業者が容易に設定することができる。PCR後、温度を室温へと下げると合成したDNAは2本鎖を形成する。PCR後、ドロップレット検出部703にあらかじめ設置しておいたドロップレット検出用カートリッジのドロップレット導入口719からドロップレットを、オイル供給口718からオイル713を添加する(S806)。ドロップレット検出部703にお
いて、ドロップレット検出用カートリッジの液溜723に溜めたドロップレットの蛍光標識プローブの蛍光強度を測定する(S807)。温調装置722によりドロップレット検出用カートリッジの液溜723を50℃から85℃まで昇温し、DNAインターカレーターまたはモレキュラービーコンからの蛍光強度を測定する(S808)。検出された蛍光データは、計算部(図示せず)に送られ、そこで、昇温による蛍光強度変化が温度変化で微分され、蛍光強度変化の変極点が融解温度として算出される(S809)。40℃と95℃における蛍光強度の比が閾値以下のドロップレットを空と判定する(S810)。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以上および融解温度が所定の範囲内のドロップレットをカウントする(S811)。対象遺伝子を含むドロップレットの数と空のドロップレットの数をモニターに表示する(S812)。なお、所定の蛍光強度の閾値および融解温度の所定の範囲はあらかじめ、パイロット実験などで作業者が決めておくことができる。
図9および図10は、モニターに表示される測定結果のイメージの一例である。図9に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の数が表示されてもよいし、図10に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の割合が表示されてもよい。モニターに表示される結果は、図9や図10のような検体溶液の数や割合だけでなく、図1のような低温時と高温時の蛍光強度比、融解温度の2軸で検体溶液の計測値をプロットしたグラフを含んでいてもよい。また、
蛍光標識プローブの蛍光強度または融解温度に対する検体溶液の数をプロットしたヒストグラムを含んでいてもよい。ユーザーがそのグラフやヒストグラムを見て、蛍光標識プローブの蛍光強度や蛍光強度比の閾値および/または融解温度の範囲の設定を変えて、蛍光強度の閾値内及び融解温度の範囲内にある検体溶液の数を再度カウントすることもできる。
本発明の一実施態様は、DNA検出装置に、DNA検出方法を行わせるためのプログラムである。ここでDNA検出装置は、(2)で詳述した装置を用い、DNA検出方法として、(1)で詳述した方法を実行する。
リバースプライマー:5'‐GCTGTATCGTCAAGGCACTCTT‐3' (配列番号2)
野生型に対応した蛍光標識プローブ:5'‐TTGGAGCTGGTGGCGT‐3' (配列番号3)
変異型に対応した蛍光標識プローブ:5'-TTGGAGCTGATGGCGT‐3' (配列番号4)
その後、各ウェルに対し、KRAS遺伝子の野生型またはG12D変異型のDNAのいずれかが1個入るか、どちらも入らないようにするため、15μLのPCR反応液を入れて、PCRによりDNAを増幅した。PCRの反応は,95℃、10分処理後、(95℃,15秒→60℃,75秒)を45サイクル行い、最後に98℃、2分処理をした。反応後、ウェルが設けられたチップを温調ステージ上で加熱しながら各ウェルの蛍光強度変化を観察し、融解曲線の測定および解析を行った。
る蛍光強度のヒストグラムを示したものである。85℃では、ハイブリダイズした増幅したDNAと蛍光標識プローブが解離するため、KRAS遺伝子の野生型を含むウェルの蛍光強度も低くなり、空のウェルの蛍光強度と変わらなくなるため、それぞれに対応するピークが重なり、1つのピークとなる。すなわち、空のウェルでは温度変化に伴う蛍光強度変化が小さく、KRAS遺伝子の野生型を含むウェルでは温度変化に伴う蛍光強度変化が大きいことが分かる。
102 変異型の遺伝子を含むドロップレット
103 空のドロップレット
201 野生型の遺伝子を含むドロップレット
202 変異型の遺伝子を含むドロップレット
203 空のドロップレット
301 対象遺伝子を含むドロップレット
302 対象遺伝子を含まないドロップレット
303 マイクロ流路
304 光源
305 フィルター
306 フォトマルチプルメーター
307 CCD
308 レンズ
309 ダイクロイックミラー
310 ドロップレット検出用カートリッジ
311 ドロップレット
312 温調装置
313 ウェル方式検出用カートリッジ
314 対象遺伝子を含むウェル
315 対象遺伝子を含まないウェル
401 野生型の遺伝子を含むドロップレット
402 変異型の遺伝子を含むドロップレット
403 空のドロップレット
404 ドロップレットa
405 ドロップレットb
406 ドロップレットc
407 ドロップレットd
501 DNA
502 DNAインターカレーター
503 融解温度
601 DNA
602 蛍光標識プローブ
603 蛍光色素
604 クエンチャー
605 融解温度
701 ドロップレット作製部
702 サーマルサイクラー
703 ドロップレット検出部
704 モニター
705 ドロップレット作製用カートリッジ
706 マイクロチューブ
707 ドロップレット検出用カートリッジ
708~711 ポンプ
712 オイル
713 オイル
714 廃液溜め
715 オイル供給口
716 PCR反応液導入口
717 ドロップレット排出口
718 オイル供給口
719 ドロップレット導入口
720 廃液排出口
721 デジタルPCR測定装置
722 温調装置
723 液溜
724 制御部
Claims (13)
- 融解曲線分析を用いたデジタルPCRにおけるDNA検出方法であって、
蛍光標識プローブまたはDNAインターカレーターと前記検出対象のDNAを含有するDNA溶液を限界希釈し、分割して、1分子の対象遺伝子が入っているか、入っていないかのいずれかであるような複数の画分を準備する工程と、
前記画分の中で核酸増幅反応を行う工程と、
温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、
前記温度変化に伴う前記蛍光強度の変化に基づいて計測されるDNA二重鎖の融解温度を算出する工程と、
前記温度変化に伴う第1の温度の蛍光強度に対する、第1の温度より低い第2の温度の蛍光強度の比を算出する工程と、
を含む、DNA検出方法。 - 算出した前記蛍光強度の比が所定の閾値以下の画分を、前記検出対象のDNAを含まない画分と特定する工程をさらに含む、請求項1に記載のDNA検出方法。
- 算出した前記蛍光強度の比が所定の範囲内にある画分を、前記検出対象のDNAを含む画分と特定する工程をさらに含む、請求項1または2に記載のDNA検出方法。
- 前記DNA溶液が蛍光標識プローブを含み、
前記融解温度が、前記蛍光標識プローブと前記検出対象のDNAとの間で形成される二重鎖の融解温度である、請求項1~3のいずれか1項に記載のDNA検出方法。 - 前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有する、請求項4に記載のDNA検出方法。
- 前記DNA溶液がDNAインターカレーターを含み、
前記融解温度が、前記検出対象のDNAの二重鎖の融解温度である、請求項1~3のいずれか1項に記載のDNA検出方法。 - 前記複数の画分が平面配置されていることを特徴とする、請求項1~6に記載のDNA検出方法。
- 前記DNA溶液を、ドロップレットまたはウェルによって前記複数の画分に分割する、請求項1~7に記載のDNA検出方法。
- 融解曲線分析を用いたデジタルPCRを用いて、DNA溶液中の検出対象のDNAを検出するためのDNA検出装置であって、
蛍光標識プローブまたはDNAインターカレーターと前記検出対象のDNAを含有するDNA溶液を限界希釈し、分割して、1分子の対象遺伝子が入っているか、入っていないかのいずれかであるような複数のドロップレットを作製するためのドロップレット作製部と、
前記検出対象のDNAを増幅するための増幅部と、
前記ドロップレットから放出される蛍光の強度を測定するための蛍光測定部と、
前記ドロップレットの温度変化に伴う前記蛍光の強度の変化からDNA二重鎖の融解温度を算出し、前期ドロップレットの第1の温度の蛍光強度に対する、第1の温度より低い第2の温度の蛍光強度の比を算出する計算部と、
を備えることを特徴とする、DNA検出装置。 - 前記検出結果を表示するモニターをさらに備えることを特徴とする、請求項9に記載のDNA検出装置。
- DNA検出装置に、請求項1~8のいずれか1項に記載のDNA検出方法を行わせるためのプログラム。
- 前記検出装置は、請求項9~10のいずれか1項に記載の検出装置である、請求項11に記載のプログラム。
- 請求項11または12に記載のプログラムを格納する、記録媒体。
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