WO2023248310A1 - プライマー、ｄｎａ検出方法およびｄｎａ検出キット - Google Patents

プライマー、ｄｎａ検出方法およびｄｎａ検出キット Download PDF

Info

Publication number
WO2023248310A1
WO2023248310A1 PCT/JP2022/024591 JP2022024591W WO2023248310A1 WO 2023248310 A1 WO2023248310 A1 WO 2023248310A1 JP 2022024591 W JP2022024591 W JP 2022024591W WO 2023248310 A1 WO2023248310 A1 WO 2023248310A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
primer
amplified
probe
mutation
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/024591
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
淳子 田中
Original Assignee
株式会社日立ハイテク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日立ハイテク filed Critical 株式会社日立ハイテク
Priority to PCT/JP2022/024591 priority Critical patent/WO2023248310A1/ja
Publication of WO2023248310A1 publication Critical patent/WO2023248310A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to primers, DNA detection methods, and DNA detection kits for nucleic acid amplification reactions, particularly asymmetric nucleic acid amplification reactions.
  • Genetic testing includes methods such as polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, and digital PCR.
  • Real-time PCR and digital PCR which enable more accurate quantification than PCR, detect DNA using intercalators and fluorescently labeled probes.
  • Two types of DNA detection methods using fluorescently labeled probes are often used: hydrolysis probes and molecular beacons.
  • hydrolysis probes in which a fluorescent dye is released from the probe and emits fluorescence when the probe is degraded using the nuclease activity of DNA polymerase, in its free state it forms a stem-loop and binds to the DNA to be detected at the loop portion.
  • the molecular beacon has the characteristic that it is not degraded during PCR, and it is possible to not only determine whether or not amplification is possible based on fluorescence intensity after PCR, but also to perform melting curve analysis.
  • Non-Patent Document 1 In order to increase the amount of binding between the molecular beacon and the amplified DNA to be detected and increase the fluorescence intensity, a strand complementary to the molecular beacon is amplified excessively.
  • a method has been reported in which DNA to be detected is asymmetrically amplified by making the concentrations of forward primer and reverse primer asymmetric (Non-Patent Document 1).
  • the present inventors applied an asymmetric nucleic acid amplification reaction using a molecular beacon to digital PCR and developed a technology to identify the genotype of a target gene with high sensitivity and high multiplexing by melting curve analysis after amplification (patented Literature 1, Non-Patent Literature 2).
  • DNA polymerase, primers, and fluorescently labeled probes required for PCR are added to a limiting diluted sample to prepare a PCR reaction solution.
  • the target gene within the microcompartment is amplified by PCR.
  • the target gene can be quantified by measuring the fluorescence intensity of each microcompartment after PCR and counting the number of microcompartments having fluorescence intensity exceeding a threshold value.
  • melting curve analysis of the target gene amplified in a microcompartment and the molecular beacon is performed after PCR, and different melting temperatures (Tm) are observed for each genotype of the target gene. , becomes distinguishable.
  • a molecular beacon designed in a region that forms a single-stranded structure binds to the amplified DNA to be detected.
  • the present inventors were the first to recognize that a molecular beacon designed in a region that forms a double-stranded structure has a problem in that the binding rate decreases and the fluorescence intensity decreases.
  • the purpose of the present invention is to reduce the rate at which the molecular beacon binding region of one strand of excessively amplified DNA forms a double-stranded structure and increase the rate at which it forms a single-stranded structure in an asymmetric nucleic acid amplification reaction.
  • novel primers, DNA detection methods, and DNA detection kits that suppress the decrease in the binding ratio between molecular beacons and amplified target DNA, detect target genes with high precision and high sensitivity, and identify genotypes. It is to provide.
  • the present inventors discovered that in asymmetric nucleic acid amplification reactions, the fluorescence intensity varies greatly depending on the binding region of the molecular beacon even if amplified with the same primer set, and that one of the amplified strands forms a double-stranded structure within the molecule. It was revealed that the fluorescence intensity of the molecular beacon designed in the area was low. Therefore, by intentionally introducing a mutation different from the sequence of the target gene into the primer used for the asymmetric nucleic acid amplification reaction and performing the asymmetric nucleic acid amplification reaction, the rate at which the binding region of the molecular beacon forms a double-stranded structure is reduced. They found that the fluorescence intensity increases, leading to the completion of the present invention.
  • Another embodiment of the present invention is a primer for amplifying a test nucleic acid by introducing a mutation therein, the primer is a primer for amplifying a test nucleic acid by introducing a mutation into the test nucleic acid.
  • the primer includes a mutation in its sequence for introducing a mutation into the test nucleic acid so as to increase the proportion of single-stranded bases in the probe binding region in the amplified nucleic acid.
  • kits for detecting a target nucleic acid comprising: a primer pair including a forward primer and a reverse primer; a probe that binds to a nucleic acid amplified using a forward primer and a reverse primer; Either or both of the forward primer and the reverse primer are configured to increase the proportion of single-stranded bases in the probe binding region in the nucleic acid to be amplified at the temperature at which the probe and the nucleic acid to be amplified are bound together.
  • the kit includes a mutation in its sequence for introducing a mutation into the nucleic acid to be amplified.
  • the present invention provides novel primers, a DNA detection method, and a DNA detection kit that can more accurately and sensitively detect or quantify a target gene in an asymmetric nucleic acid amplification reaction. Therefore, the present invention is useful in the fields of basic research, testing, drug discovery, etc. in which gene detection, genotype discrimination, etc. are performed.
  • FIG. 2 is a diagram showing the positional relationship between the secondary structure of the amplified single-stranded DNA to be detected and the binding region of a fluorescently labeled probe corresponding to the wild type, and the planned position where mutations are introduced with primers.
  • FIG. 3 is a diagram showing the positional relationship between the secondary structure of the single-stranded DNA of the amplified detection target and the binding region of the fluorescently labeled probe corresponding to the mutant type, and the position of the mutation introduced by the primer in an example of the present invention. .
  • FIG. 2 is a diagram showing the positional relationship between the secondary structure of the amplified single-stranded DNA to be detected and the binding region of a fluorescently labeled probe corresponding to the wild type, and the planned position where mutations are introduced with primers.
  • FIG. 3 is a diagram showing the positional relationship between the secondary structure of the single-stranded DNA of the amplified detection target and the binding region of the fluorescently labeled probe corresponding to the mutant type, and the position of the mutation introduced by the primer in an example of the present invention. .
  • the present invention provides a primer for amplifying a test nucleic acid by introducing a mutation therein, and the primer is heated at a temperature at which a probe is bonded to a nucleic acid amplified from the test nucleic acid.
  • the sequence contains a mutation for introducing a mutation into the test nucleic acid so as to increase the proportion of single-stranded bases in the binding region of the probe in the nucleic acid amplified from the test nucleic acid.
  • Such primers may be used as reagents for introducing mutations into and amplifying test nucleic acids.
  • the test nucleic acid is not particularly limited as long as it contains or may contain the target nucleic acid to be detected, and includes, for example, messenger RNA (mRNA), non-coding RNA (ncRNA), It includes microRNA, genomic DNA, fragments thereof, hybrid nucleic acids of DNA and RNA, and may be single-stranded or double-stranded.
  • mRNA messenger RNA
  • ncRNA non-coding RNA
  • the test nucleic acid may be DNA (such as cDNA) obtained by reverse transcription of the RNA.
  • Primers can be designed by conventional primer design methods, except for containing mutations as described above, and should be designed with a length, sequence composition, and melting temperature suitable for specifically binding to the target nucleic acid. Can be done.
  • One embodiment disclosed herein is a primer for an asymmetric nucleic acid amplification reaction, in which two fluorescently labeled probe binding regions of DNA to be detected are bonded at a temperature that binds a fluorescently labeled probe such as a molecular beacon.
  • This is a primer in which mutations have been introduced to reduce the proportion of stranded structures and increase the proportion of single-stranded structures. This primer will be specifically explained below with reference to the schematic diagrams of FIGS. 1 to 5.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the behavior of a fluorescently labeled probe when the temperature of the reaction solution is changed.
  • fluorescently labeled probes include molecular beacons and Taqman probes.
  • FIG. 1 will be explained using molecular beacons as an example.
  • a molecular beacon is constructed as an oligonucleotide and has a sequence complementary to the sequence between the primer pair used in the nucleic acid amplification reaction to amplify the target gene. Furthermore, the molecular beacon has mutually complementary arrays at both ends, with a fluorescent dye 103 provided at one end and a quencher 104 provided at the other end.
  • the molecular beacon 102 exists independently and freely, as shown in FIG. 1B. At that time, the molecular beacon 102 forms a stem loop, and the fluorescent dye 103 and quencher 104 are close to each other, so no fluorescence is emitted.
  • the sample solution When the sample solution is heated in the first denaturation step, it assumes a highly flexible structure as shown in Figure 1C, but since the fluorescent dye and quenching dye are never separated, the fluorescence remains quenched.
  • the annealing step when the temperature is lowered to about room temperature, the loop portion of the molecular beacon 102 anneals to the DNA 101 amplified in the sample solution as shown in FIG. 1A. As a result, the fluorescent dye 103 and the quencher 104 are always separated, and the fluorescent labeled probe 102 emits strong fluorescence.
  • the molecular beacon 102 In the next elongation step, the molecular beacon 102 is released and becomes as shown in FIG. 1B again, and the fluorescence is quenched.
  • the fluorescence remains quenched, as shown in Figure 1C again.
  • this process is repeated, so the fluorescence intensity may be measured at some stage during heating or cooling. Fluorescence intensity can be measured in the same manner when measuring the fluorescence intensity after the completion of the nucleic acid amplification reaction. After the completion of the nucleic acid amplification reaction, the fluorescence intensity may be measured by heating or cooling just to measure the fluorescence intensity.
  • the DNA intercalator when the sample DNA is double-stranded, the DNA intercalator intercalates between the double strands and emits fluorescence, but when the sample DNA is single-stranded, When the chain is formed, the DNA intercalator is released and the fluorescence is quenched. Therefore, in the nucleic acid amplification reaction, just like the molecular beacon 102, the fluorescence intensity may be measured at some stage during heating or cooling. After the completion of the nucleic acid amplification reaction, the fluorescence intensity may be measured by heating or cooling just to measure the fluorescence intensity.
  • the binding between the amplified nucleic acid and the probe is measured with a temperature change. Since the bond changes depending on the melting temperature, the melting temperature of the duplex between the amplified nucleic acid and the probe can be calculated from the change in the bond accompanying this temperature change.
  • the DNA detection method disclosed herein is such that at the temperature at which the fluorescent probe is bound, the fluorescent probe binding region of the DNA to be detected reduces the proportion of double-stranded structure and increases the proportion of single-stranded structure.
  • a primer that introduces a mutation a fluorescent probe that binds to the DNA to be detected, a primer that pairs with the primer to introduce the mutation to amplify the fluorescent probe binding region of the DNA to be detected, and a DNA that amplifies the DNA to be detected.
  • primers with mutations introduced are designed so that the double-stranded structure ratio of the fluorescent probe binding region in the amplified target DNA is reduced and the single-stranded structure ratio is increased (S601).
  • the mutagenesis primer may or may not have a tag sequence.
  • the DNA to be detected is amplified by an asymmetric nucleic acid amplification reaction using the mutation introduction primer (S602).
  • the detection target DNA subjected to the asymmetric nucleic acid amplification reaction forms a secondary structure in which the proportion of the probe binding region forming a double-stranded structure decreases and the proportion of forming a single-stranded structure increases (S603).
  • the change in fluorescence intensity accompanying the temperature change of the solution of the DNA to be detected subjected to the asymmetric nucleic acid amplification reaction is measured, a melting curve is created, and the melting temperature is calculated from the peak temperature of the differential curve of the melting curve (S604). Finally, the type of DNA to be detected contained in the solution is determined from the fluorescence color and melting temperature of the solution of DNA to be detected that has undergone an asymmetric nucleic acid amplification reaction (S605).
  • the target gene may include multiple types of wild-type alleles and mutant alleles, but the multiple types of target genes are not particularly limited to these.
  • the process of asymmetric nucleic acid amplification reaction using mutation-introducing primers can also be monitored in real time using fluorescently labeled probes.
  • the ratio of the initial concentrations of DNA to be detected in multiple solutions is calculated from the step of measuring the fluorescence intensity at each cycle of temperature change and the relationship between the number of cycles and the change in fluorescence intensity. can.
  • DNA to be detected with a known concentration is prepared as a control and measured at the same time, so that the process of measuring the fluorescence intensity for each cycle of temperature change and the relationship between the number of cycles and the change in fluorescence intensity can be performed. It is also possible to calculate the initial concentration of DNA to be detected in a sample of unknown concentration by comparing the change in fluorescence intensity of the sample.
  • Asymmetric nucleic acid amplification reactions using mutation-introducing primers can also be applied to digital PCR. It is also possible to divide the reaction solution containing the mutation-introducing primer into microcompartments, perform melting curve analysis after the amplification reaction, and detect (for example, genotype determination) the target gene contained in the microcompartments.
  • a fluorescently labeled probe corresponding to the target gene P hybridizes to the DNA amplified by PCR. and emit fluorescence.
  • the melting temperature corresponding to the fluorescently labeled probe of the target gene P can be calculated.
  • a fluorescently labeled probe corresponding to the target gene Q hybridizes to DNA amplified by PCR and emits fluorescence.
  • the melting temperature corresponding to the fluorescently labeled probe of the target gene Q can be calculated. In this way, the presence or absence of the target gene P and the presence or absence of the target gene Q can be determined based on the fluorescence intensity, the type of fluorescence (for example, color), and the melting temperature.
  • the melting temperature of DNA is not affected by PCR reaction efficiency or in-plane measurement variation during fluorescence measurement, so by using the melting temperature of DNA, the type of DNA (e.g. genotype) in a microcompartment can be determined with high precision. It can be determined by For example, the sequences of fluorescently labeled probes are determined so that the melting temperatures (Tm) of each fluorescently labeled probe for the gene of interest are different, and the changes in fluorescence intensity associated with temperature changes are measured for the DNA in a microcompartment, and the melting curve is Analysis and comparison of melting temperatures allows detection (eg, genotyping) of DNA within microcompartments.
  • target genes When detecting multiple types of target genes at the same time, they can be distinguished based on the reference melting temperature and the measured melting temperature, but it is preferable to distinguish them based on the reference melting temperature range. For example, if the measured melting temperature of a certain well is within a predetermined range that includes the standard melting temperature recorded in the database for a certain target gene (for example, within ⁇ 1°C of the standard melting temperature), that well contains the target gene. It is determined that it is placed. By using such a reference melting temperature range, more accurate determination can be made with appropriate consideration of the tolerance range.
  • the ratio or difference in fluorescence intensity at different temperatures may be used as information on fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity can be standardized by using the ratio or difference between the fluorescence intensity at a temperature lower than the reference melting temperature and the fluorescence intensity at a temperature higher than the reference melting temperature. For example, if the ratio or difference for a well is within a predetermined range, the well is determined to be positive; otherwise, the well is determined to be negative.
  • the influence of the fluorescence of the fluorescently labeled probe itself that is, the influence of the background, can be removed.
  • the method for determining the range of fluorescence intensity and the range of reference melting temperature can be arbitrarily selected. For example, an operator may perform a pilot experiment in advance and statistically decide based on the results, or the DNA detection system may automatically decide. Further, each time a digital PCR measurement is performed, the threshold value of fluorescence intensity and the predetermined range of the reference melting temperature may be statistically determined using the measurement data of each well in the cartridge.
  • Data for statistically determining DNA in a well may include any or all of the following items, or may include items other than these.
  • - Fluorescence intensity at a temperature lower than the reference melting temperature - Fluorescence intensity at a temperature higher than the reference melting temperature - Fluorescence intensity at a temperature higher than the reference melting temperature versus a temperature lower than the reference melting temperature -The difference between the fluorescence intensity at a temperature lower than the standard melting temperature and the fluorescence intensity at a temperature higher than the standard melting temperature -Feature value representing the standard melting temperature -Represents the shape of the melting curve Feature value
  • the amount of binding to the probe binding region in the amplified nucleic acid increases. , measurement sensitivity and measurement accuracy, such as genotype discrimination accuracy, are improved.
  • the present invention provides a kit for detecting a target nucleic acid, the kit comprising: a primer pair including a forward primer and a reverse primer; a probe that binds to a nucleic acid amplified using a forward primer and a reverse primer; Either or both of the forward primer and the reverse primer are configured to increase the proportion of single-stranded bases in the probe binding region in the nucleic acid to be amplified at the temperature at which the probe and the nucleic acid to be amplified are bound together.
  • the sequence contains a mutation for introducing a mutation into the nucleic acid to be amplified.
  • the forward primer and the reverse primer are as described in the previous section.
  • the concentration of the forward primer and the concentration of the reverse primer included in the kit of the present invention are different, and either one (preferably for introducing a mutation) is used. (primer) concentration is high.
  • the kit of the present invention may include a plurality of primer pairs each including a forward primer and a reverse primer for a plurality of target nucleic acids. In one embodiment, the kit of the present invention may contain multiple types of probes for each of multiple target nucleic acids.
  • the method further includes determining the percentage of single-stranded bases in the probe binding region in the nucleic acid amplified by the primer pair containing the mutated primer, the percentage of single-stranded bases being at least 50%. It may further include confirming whether or not.
  • Example 1 This example shows an example in which an asymmetric nucleic acid amplification reaction is performed using a mutation-introducing primer.
  • FIG. 7A shows the positional relationship between the secondary structure 701 (SEQ ID NO: 5) of the amplified single-stranded DNA of the G13D mutant type and the binding region 702 of the fluorescently labeled probe corresponding to the wild type.
  • FIG. 7B shows the positional relationship between the secondary structure 701 (SEQ ID NO: 5) of the amplified single-stranded DNA of the G13D mutant type and the binding region 703 of the fluorescently labeled probe corresponding to the mutant type.
  • the fluorescent labeled probe binding region 702 in FIG. 7A has a single strand formation rate of 69%
  • the fluorescent labeled probe binding region 703 in FIG. 7B has a single strand formation rate of 47%.
  • FIG. 7C is a differential curve of the melting curve obtained as a result of melting curve analysis after the asymmetric nucleic acid amplification reaction.
  • the melting of the amplified G13D mutant DNA 701 and the fluorescently labeled probe 703 corresponding to the mutant type compared to the peak 704 of the differential curve of the melting curve of the amplified G13D mutant DNA 701 and the fluorescently labeled probe 702 corresponding to the wild type.
  • the peak 705 of the differential curve of the curve was small. From this result, it was found that when the single strand formation rate of the binding region of the fluorescently labeled probe is low, the amount of binding between the amplified DNA and the fluorescently labeled probe decreases. In such cases, only a small amount of the mutant type may be present, which further reduces the amount of fluorescence and makes detection difficult.
  • Figures 9A and 9B show the results of an asymmetric nucleic acid amplification reaction using tagged mutation-introducing primers.
  • Figure 9A shows the secondary structure 901 (SEQ ID NO: 5) of the amplified single-stranded DNA of the G13D mutant type and the binding region of the fluorescently labeled probe corresponding to the mutant type when the mutation-introducing primer shown in Figure 7A is not used.
  • This diagram illustrates a position 903 where a mutation is to be introduced with a primer in the positional relationship of 902.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、核酸増幅反応、特に非対称核酸増幅反応におけるプライマー、ＤＮＡ検出方法およびＤＮＡ検出キットに関する。具体的には、被検核酸に変異を導入して増幅するためのプライマーであって、前記被検核酸から増幅された核酸とプローブとを結合させる温度において、前記被検核酸から増幅された核酸における前記プローブの結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記被検核酸に変異を導入するための変異をその配列に含む、前記プライマー、ならびにかかるプライマーを使用したＤＮＡ検出方法およびＤＮＡ検出キットに関する。

Description

プライマー、ＤＮＡ検出方法およびＤＮＡ検出キット
　本発明は、核酸増幅反応、特に非対称核酸増幅反応におけるプライマー、ＤＮＡ検出方法およびＤＮＡ検出キットに関する。
　遺伝子検査には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やリアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲなどの手法がある。ＰＣＲよりも精度の高い定量を可能とするリアルタイムＰＣＲやデジタルＰＣＲでは、インターカレーターや蛍光標識プローブを用いてＤＮＡを検出している。蛍光標識プローブを用いたＤＮＡの検出法には、加水分解プローブとモレキュラービーコンの２種類がよく用いられる。ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を利用してプローブが分解されると蛍光色素がプローブから遊離して蛍光を発する加水分解プローブと異なり、遊離状態ではステムループを形成し、検出対象のＤＮＡとループ部分で結合するモレキュラービーコンは、ＰＣＲ中に分解されない特徴をもち、ＰＣＲ後に蛍光強度による増幅可否判定を行うだけでなく融解曲線分析を行うことが可能である。
　ここで、モレキュラービーコンを用いたＤＮＡ検出では、モレキュラービーコンと増幅した検出対象のＤＮＡとの結合量を増やし蛍光強度を増加するために、モレキュラービーコンに相補的な鎖が過剰に増幅するように、フォワードプライマーとリバースプライマーの濃度を非対称にして検出対象のＤＮＡを非対称増幅する方法が報告されている（非特許文献１）。
　本発明者らは、デジタルＰＣＲにモレキュラービーコンを用いた非対称核酸増幅反応を適用し、増幅後、融解曲線分析により高感度かつ高マルチプレックスに対象遺伝子の遺伝子型を同定する技術を開発した（特許文献１、非特許文献２）。
　デジタルＰＣＲの検出方法の一例を以下に示す。まず、限界希釈した検体に、ＰＣＲに必要となるＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブを加え、ＰＣＲ反応液を調製する。ＰＣＲ反応液をウェルまたはドロップレットなどの微小区画に分割する。このとき、各区画にそれぞれ、１分子の対象遺伝子が入っているか、入っていないかのいずれかであるようにする。
　次に、微小区画内の対象遺伝子を、ＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ後に各微小区画の蛍光強度を測定し、閾値を超える蛍光強度をもつ微小区画の数をカウントすることにより、対象遺伝子を定量することができる。
　モレキュラービーコンを用いた非対称核酸増幅反応を適用すると、ＰＣＲ後、微小区画内で増幅した対象遺伝子とモレキュラービーコンの融解曲線分析を行い、対象遺伝子の遺伝子型ごとに異なる融解温度（Ｔｍ）が観察され、判別可能となる。
特開２０１８－１０８０６３号公報
ＢＭＣ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３，ｐｐ２９５，２０１３ Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．，９２，ｐｐ１１７０５－１１７１３，２０２０
　しかしながら、非対称核酸増幅反応では、過剰に増幅したＤＮＡの片方の鎖は分子内で二次構造を形成し、一本鎖構造となる領域に設計されたモレキュラービーコンは増幅した検出対象ＤＮＡに結合する一方、二本鎖構造となる領域に設計されたモレキュラービーコンは結合割合が低下し、蛍光強度が低下するという問題が生じることを本発明者が初めて認識した。特に、リアルタイムＰＣＲのようなチューブ内で行うＰＣＲでなく、デジタルＰＣＲのような微小区画内で行うＰＣＲでは、蛍光強度が低下すると、検出可能な強度以下になり検出できなかったり、融解曲線分析における温度変化に対する蛍光強度変化が小さく融解温度の算出ができなくなったり、容易に計測できなくなって計測感度および精度が低下する。
　そこで本発明の目的は、非対称核酸増幅反応において、過剰に増幅したＤＮＡの片方の鎖のモレキュラービーコン結合領域が二本鎖構造を形成する割合を低減し、一本鎖構造を形成する割合を増加することで、モレキュラービーコンと増幅した検出対象のＤＮＡの結合割合低下を抑制し、検出対象遺伝子を精度よく高感度に検出し、遺伝子型判別できる、新規なプライマー、ＤＮＡ検出方法およびＤＮＡ検出キットを提供することである。
　本発明者らは、非対称核酸増幅反応では同じプライマーセットで増幅してもモレキュラービーコンの結合領域によって蛍光強度が大きく違うこと、そして、増幅した片方の鎖が分子内で二本鎖構造を形成する領域に設計されたモレキュラービーコンの蛍光強度が小さいことをあきらかにした。そこで、非対称核酸増幅反応に用いるプライマーに故意に対象遺伝子の配列とは異なる変異を導入し、非対称核酸増幅反応を行うことで、モレキュラービーコンの結合領域が二本鎖構造を形成する割合が低下して蛍光強度が増加することを見出し、本発明の完成に至った。
　本発明の一実施態様は、
　フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対とプローブの存在下で被検核酸を増幅する工程と、
　前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーによって増幅された核酸と前記プローブとの結合を測定する工程と
を含む標的核酸の検出方法であって、
　前記フォワードプライマーもしくは前記リバースプライマーのいずれかまたは両方は、前記プローブと前記増幅された核酸とを結合させる温度において、前記増幅された核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記増幅された核酸に変異を導入するための変異をその配列に含むものである、前記方法である。
　本発明の他の実施態様は、被検核酸に変異を導入して増幅するためのプライマーであって、前記被検核酸から増幅された核酸とプローブとを結合させる温度において、前記被検核酸から増幅された核酸における前記プローブの結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記被検核酸に変異を導入するための変異をその配列に含む、前記プライマーである。
　本発明の他の実施態様は、標的核酸を検出するためのキットであって、
　フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対と、
　フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて増幅される核酸に結合するプローブと
を含み、
　前記フォワードプライマーもしくは前記リバースプライマーのいずれかまたは両方は、前記プローブと前記増幅される核酸とを結合させる温度において、前記増幅される核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記増幅される核酸に変異を導入するための変異をその配列に含むものである、前記キットである。
　本発明によって、非対称核酸増幅反応において、対象遺伝子をより精度よく高感度に検出または定量できる、新規なプライマー、ＤＮＡ検出方法およびＤＮＡ検出キットが提供される。したがって、本発明は、遺伝子検出、遺伝子型判別などを行う基礎研究、検査、創薬などの分野において有用である。
蛍光標識プローブを用いてＤＮＡの融解温度を測定する方法の一例を示す模式図である。 対称核酸増幅反応と非対称核酸増幅反応における蛍光標識プローブの挙動の一例を示す模式図である。 本発明の一実施形態における、変異を導入するプライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行ったときの増幅した検出対象のＤＮＡの二次構造と蛍光標識プローブの結合を示す模式図である。 本発明の一実施形態における、タグ付きの変異を導入するプライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行ったときの増幅した検出対象のＤＮＡの二次構造と蛍光標識プローブの結合を示す模式図である。 本発明の一実施形態における、変異導入プライマーを用いた場合の融解曲線の例を示す図である。 変異導入プライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行うＤＮＡ検出方法の一実施態様を示すフローチャートである。 本発明の実施例において、増幅した検出対象の一本鎖ＤＮＡの二次構造と野生型に対応した蛍光標識プローブの結合領域の位置関係を示す図である。 本発明の実施例において、増幅した検出対象の一本鎖ＤＮＡの二次構造と変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域の位置関係を示す図である。 本発明の実施例において、変異導入プライマーを用いない場合の測定結果（融解曲線の微分曲線）を示す図である。 増幅した検出対象の一本鎖ＤＮＡの二次構造と野生型に対応した蛍光標識プローブの結合領域の位置関係、およびプライマーで変異を導入する予定の位置を示す図である。 本発明の実施例において、増幅した検出対象の一本鎖ＤＮＡの二次構造と変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域の位置関係、およびプライマーで導入された変異の位置を示す図である。 増幅した検出対象の一本鎖ＤＮＡの二次構造と野生型に対応した蛍光標識プローブの結合領域の位置関係、およびプライマーで変異を導入する予定の位置を示す図である。 本発明の実施例において、増幅した検出対象の一本鎖ＤＮＡの二次構造と変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域の位置関係、およびプライマーで導入された変異の位置を示す図である。
　本発明の目的、特徴、利点、およびそれらに係るアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかである。本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
（１）プライマー
　一態様において、本発明は、被検核酸に変異を導入して増幅するためのプライマーを提供し、前記プライマーは、前記被検核酸から増幅された核酸とプローブとを結合させる温度において、前記被検核酸から増幅された核酸における前記プローブの結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記被検核酸に変異を導入するための変異をその配列に含む。かかるプライマーは、被検核酸に変異を導入して増幅するための試薬として使用されてもよい。
　本発明において、被検核酸は、検出対象となる標的核酸を含むまたは含む可能性のある核酸であれば特に限定されるものではなく、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびそれらの断片、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド核酸などが含まれ、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。検出対象となる標的核酸がｍＲＮＡなどのＲＮＡの場合には、被検核酸は、そのＲＮＡを逆転写して得られたＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）であってもよい。
　プライマーは、フォワードプライマーであってもリバースプライマーであってもよく、両方のプライマーが変異を含むものであってもよい。好ましくは、プライマーはリバースプライマーである。
　プライマーは、被検核酸に変異を導入して増幅するための変異を含む。この変異は、被検核酸から増幅された核酸とプローブとを結合させる温度において、被検核酸から増幅された核酸におけるプローブの結合領域の一本鎖形成塩基の割合（二本鎖形成塩基に対する一本鎖形成塩基の割合）を増大するように導入される。被検核酸から増幅された核酸は一本鎖構造を有するが、相補的な塩基の存在によって内部で二本鎖構造を形成することがある。増幅された核酸がどのような構造を形成するかは、その配列構成によって異なり、当該技術分野ではそのような構造を予測するためのプログラム（例えば、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ　Ｔｏｏｌ（ＩＤＴ）、ＲＮＡｆｏｌｄ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｉｅｎｎａ））が慣用的に使用されている。したがって、そのようなプログラムを使用して、増幅される核酸の構造を予測し、増幅される核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を求める。一本鎖形成塩基の割合が低い場合、例えば５０％未満の場合には、増幅される核酸に変異を導入し、一本鎖形成塩基の割合が増大する、例えば少なくとも５０％、好ましくは６０％以上に増大するようにする。
　プライマーは、上記のような変異を含む以外は、慣用的なプライマー設計方法により設計することができ、標的核酸に特異的に結合するために適した長さ、配列組成および融解温度で設計することができる。
　プライマーは、上述した一本鎖形成塩基の割合を増大させるために、さらにタグ配列を含むものであってもよい。そのようなタグ配列は、標的核酸の検出に影響を及ぼさない長さおよび組成とする。タグ配列は、フォワードプライマーもしくはリバースプライマーのいずれかに含まれてもよいし、または両方がさらにタグ配列を含んでもよい。このようなプライマーを使用して増幅された核酸はタグ配列を含むことになる。
　本明細書に開示される一実施形態は、非対称核酸増幅反応用のプライマーであって、モレキュラービーコンのような蛍光標識プローブを結合させる温度において、検出対象のＤＮＡの蛍光標識プローブ結合領域が二本鎖構造の割合を低減し一本鎖構造の割合を増加するように変異を導入したプライマーである。以下、このプライマーを図１～５の模式図を参考にして、具体的に説明する。
　図１は、反応液の温度を変化させたときの蛍光標識プローブの挙動を示す模式図である。蛍光標識プローブは、モレキュラービーコンやＴａｑｍａｎプローブが例示できるが、ここではモレキュラービーコンを例として、図１を説明する。
　モレキュラービーコンはオリゴヌクレオチドとして構成され、対象遺伝子を増幅させる核酸増幅反応に用いられるプライマーペアの間にある配列に相補的な配列を有する。また、モレキュラービーコンは、その両端に互いに相補的な配列を有し、一端には蛍光色素１０３が、他端には消光色素（クエンチャー）１０４が、それぞれ設けられている。核酸増幅反応では、初期状態において、図１Ｂのように、モレキュラービーコン１０２が単独で遊離して存在する。その時は、モレキュラービーコン１０２はステムループを形成し、蛍光色素１０３とクエンチャー１０４が近接しているため、蛍光は発しない。最初の変性工程で、検体溶液を加熱すると、図１Ｃのように自由度の高い構造をとるが、蛍光色素と消光色素が常時離れることはないので、蛍光が消光したままである。アニーリング工程で、温度を下げ、室温程度の温度になると、図１Ａのように検体溶液内で増幅したＤＮＡ１０１にモレキュラービーコン１０２のループ部分がアニールする。これによって、蛍光色素１０３とクエンチャー１０４が常に離れるため、蛍光標識プローブ１０２は強い蛍光を発する。次の伸長工程において、モレキュラービーコン１０２が遊離し、再度図１Ｂのようになり、蛍光が消光する。次の変性工程では、再度図１Ｃのようになり、蛍光が消光したままである。核酸増幅反応では、この工程が繰り返されるので、どこかの段階で、加温時または冷却時に蛍光強度を測定すればよい。核酸増幅反応完了後に蛍光強度を測定する場合も、同様にして測定できる。核酸増幅反応完了後に、蛍光強度を測定するためだけに、加温または冷却して、蛍光強度を測定してもよい。
　蛍光色素とクエンチャーの組み合わせの代わりにＤＮＡインターカレーターを用いる場合は、検体ＤＮＡが二重鎖の時にＤＮＡインターカレーターが二重鎖の間にインターカレートして蛍光を発するが、検体ＤＮＡが一重鎖の時にはＤＮＡインターカレーターが遊離して、蛍光が消光する。従って、核酸増幅反応では、モレキュラービーコン１０２と同様、どこかの段階で、加温時または冷却時に蛍光強度を測定すればよい。核酸増幅反応完了後に、蛍光強度を測定するためだけに、加温または冷却して、蛍光強度を測定してもよい。
　ここで用いるモレキュラービーコン１０２において、蛍光色素１０３およびクエンチャー１０４の組み合わせは、一般的にリアルタイムＰＣＲに用いられている組み合わせであれば特に限定されない。たとえば、蛍光色素１０３の例としてＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５など、クエンチャー１０４の例としてＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３などが挙げられる。いずれも慣用的に使用されており、市販品として入手可能である。
　対象遺伝子として、異なる配列を有する２種類のものが用いられているとき、モレキュラービーコン１０２の配列は、対象遺伝子のそれぞれに特異的に結合するものを用意し、異なる蛍光色素を結合させることで、一つの反応系で、２種類の対象遺伝子を区別して検出することができる。
　ＤＮＡインターカレーターとしては、２本鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光強度が増加し、２本鎖ＤＮＡの検出に用いることのできるものであれば、特に限定されない。具体的には、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ、ＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ（登録商標）　Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ　Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＴＯ　Ｒｅｄ、ＰＯＰＯ（登録商標）－１、ＢＯＢＯ（登録商標）－１、ＹＯＹＯ（登録商標）－１、ＴＯＴＯ（登録商標）－１、ＪＯＪＯ（登録商標）－１、ＰＯＰＯ－３、ＬＯＬＯ（登録商標）－１、ＢＯＢＯ－３、ＹＯＹＯ－３、ＴＯＴＯ－３、ＰＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＹＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＴＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＪＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＰＯ－Ｐｒｏ－３、ＹＯ－Ｐｒｏ－３、ＴＯ－Ｐｒｏ－３、ＴＯ－Ｐｒｏ－５、エチジウムブロマイド、等が適用可能であり、いずれも市販品として入手可能である。ＤＮＡインターカレーターが熱耐性である場合、核酸増幅反応を行う前から反応液に添加しておくことができる。
　図２は、対称核酸増幅反応と非対称核酸増幅反応における蛍光標識プローブの挙動を示す模式図である。図２Ａのように、フォワードプライマー２０１とリバースプライマー２０２の濃度が同じ場合、検出対象のＤＮＡ２０４は相補鎖の両方が等量増幅するため、それら相補鎖が二本鎖を形成した分子２０５が多く生成し、一本鎖形成分子に蛍光標識プローブ２０３が結合した分子２０６がわずかに生成する。図２Ｂのように、フォワードプライマー２０１とリバースプライマー２０２の濃度が非対称の場合（図２Ｂではリバースプライマー２０２を増加させている）、モレキュラービーコンの相補鎖となる検出対象のＤＮＡ２０４の片方の鎖２０７が過剰に増幅するため、その一本鎖形成分子に蛍光標識プローブ２０３が結合した分子２０６が多く生成する。このように非対称核酸増幅反応を行うことで、蛍光標識プローブと増幅した検出対象のＤＮＡの結合量が増加し、蛍光強度が増加する。
　図３は、変異を導入するプライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行ったときの増幅した検出対象のＤＮＡの二次構造と蛍光標識プローブの結合を示す模式図である。図３Ａのように、検出対象のＤＮＡ３０４に対してフォワードプライマー３０１と変異３０９を導入した変異導入リバースプライマー３０２、蛍光標識プローブ３０３を用意する。このときフォワードプライマー３０１の濃度に対してリバースプライマー３０２の濃度は過剰となっており、非対称核酸増幅反応を行う。図３Ｂは、変異３０９を導入しないリバースプライマーを使用して、非対称核酸増幅反応により増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造３０５と蛍光標識プローブ３０３の結合を示す模式図である（従来法）。変異３０９は導入しないため、増幅したＤＮＡの二次構造３０５上の位置３０６は検出対象のＤＮＡのオリジナルの塩基のままである。増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造３０５において、蛍光標識プローブ３０３の結合領域は二本鎖構造を形成しており、蛍光標識プローブ３０３の結合量が低下する。一方、図３Ｃは、変異導入リバースプライマー３０２を使用して、非対称核酸増幅反応により増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造３０７と蛍光標識プローブ３０３の結合を示す模式図である（本発明）。変異導入リバースプライマー３０２により導入された変異３０８により、増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造３０７は図３Ｂの増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造３０５と異なる二次構造を形成する。そのため、蛍光標識プローブ３０３の結合領域は図３Ｂと比べて図３Ｃでは二本鎖構造を形成する割合が低下し、一本鎖構造を形成する割合が増加することで、蛍光標識プローブ３０３の結合量が増加する。
　図４は、タグ付きの変異を導入するプライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行ったときの増幅した検出対象のＤＮＡの二次構造と蛍光標識プローブの結合を示す模式図である。図４Ａのように、検出対象のＤＮＡ４０４に対して、フォワードプライマー４０１、タグ配列４０５を付加し変異４１１を導入した変異導入リバースプライマー４０２、蛍光標識プローブ４０３を用意する。このときフォワードプライマー４０１の濃度に対してリバースプライマー４０２の濃度は過剰となっており、非対称核酸増幅反応を行う。図４Ｂは、タグ配列なしかつ変異４１１を導入しないリバースプライマー（図示せず）を使用して、非対称核酸増幅反応により増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造４０６と蛍光標識プローブ４０３の結合を示す模式図である（図３Ｂと同様である）。変異４１１は導入しないため、増幅したＤＮＡの二次構造４０６上の位置４０７は検出対象のＤＮＡのオリジナルの塩基のままである。増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造４０６において、蛍光標識プローブ４０３の結合領域は二本鎖構造を形成しており、蛍光標識プローブ４０３の結合量が低下する。一方、図４Ｃは、タグ付き変異導入リバースプライマー４０２を使用して、非対称核酸増幅反応により増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造４０８と蛍光標識プローブ４０３の結合を示す模式図である。タグ付き変異導入リバースプライマー４０２により導入された変異４０９とタグ配列付加４１０により、増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造４０８は図４Ｂの増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造４０６と異なる二次構造を形成する。そのため、蛍光標識プローブ４０３の結合領域は図４Ｂと比べて図４Ｃでは二本鎖構造を形成する割合が低下し、一本鎖構造を形成する割合が増加することで、蛍光標識プローブ４０３の結合量が増加する。
　図５に、変異導入プライマーを使用して非対称核酸増幅反応する場合と変異導入プライマーを使用しないで非対称核酸増幅反応する場合の融解曲線の例を示す。変異導入プライマーを使用して非対称核酸増幅反応した場合、温度変化に伴う溶液の蛍光強度変化を測定すると、図５Ａに示すように蛍光強度変化の大きい融解曲線となり、その微分曲線を求めると図５Ｂのように高いピークを示し、そのピークの温度が融解温度（Ｔｍ）５０１となる。しかし、変異導入プライマーを使用しないで非対称核酸増幅反応する場合、温度変化に伴う溶液の蛍光強度変化を測定すると、図５Ｃに示すように図５Ａに比べて蛍光強度が低下する。そのため、微分曲線を求めると図５Ｄのように低いピークをもち、ピーク形状がなだらかであるために溶液内の対象遺伝子の融解温度とは異なる誤った値となることがある。さらに蛍光強度の低下度合いが大きいと、対象遺伝子の増幅による蛍光強度が検出可能な強度より低くなり、検出できなくなる。
（２）ＤＮＡ検出方法
　別の態様において、本発明は、
　フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対とプローブの存在下で被検核酸を増幅する工程と、
　前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーによって増幅された核酸と前記プローブとの結合を測定する工程と
を含む標的核酸の検出方法を提供し、
　前記フォワードプライマーもしくは前記リバースプライマーのいずれかまたは両方は、前記プローブと前記増幅された核酸とを結合させる温度において、前記増幅された核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記増幅された核酸に変異を導入するための変異をその配列に含むものである。
　本明細書において、標的核酸の検出とは、検出対象の核酸の有無を調べること、検出対象の核酸の濃度もしくは存在比を測定すること、検出対象の核酸を同定すること、遺伝子型を判別することなどを意味する。
　フォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれかまたは両方は、前項において記載したプライマーである。
　プローブは、蛍光色素を含む、または蛍光色素および消光色素を含む。プローブが蛍光色素を含む場合には、この蛍光色素を利用して、増幅された核酸とプローブとの結合が測定される。一実施形態では、プローブの3’末端配列と5’末端配列とが相補的な配列を有し、増幅された核酸と結合しない場合にプローブの3’末端配列と5’末端配列とが結合してステム構造を形成する。プローブが蛍光色素を含まない場合、例えば、ＤＮＡインターカレーターを使用することも可能である。
　増幅工程は、当技術分野で公知の増幅反応であれば任意の増幅反応により行うことができる。好ましくは、増幅工程は非対称核酸増幅反応により行われる。この場合、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのいずれか（例えば、変異を含むプライマー）の添加量を増加させて増幅反応を行う。好ましい実施形態では、変異を含むリバースプライマーをフォワードプライマーよりも多く添加して増幅反応を行う。非対称核酸増幅反応については、例えばＡｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．，９２，ｐｐ１１７０５－１１７１３，２０２０（非特許文献２）の記載を参照されたい。
　一実施形態において、増幅された核酸とプローブとの結合は、温度変化を伴って測定される。結合は、融解温度によって変化することから、この温度変化に伴う結合の変化から、増幅された核酸とプローブとの二重鎖の融解温度を算出することができる。
　一実施形態において、増幅された核酸とプローブとの結合は、温度変化のサイクルごとに測定され、そのサイクルの数と結合の変化の関係から、標的核酸を検出することができる。
　上述した変異を含むプライマーを複数種類使用することにより、複数の標的核酸を検出することができる。この場合、増幅された核酸とプローブとの結合は、温度変化のサイクルごとに測定され、そのサイクルの数と結合の変化の関係から、被検核酸における複数の標的核酸の初期濃度の比を算出することができる。
　一実施形態において、増幅された核酸とプローブとの結合は、温度変化のサイクルごとに測定され、そのサイクルの数と結合の変化の関係を、既知濃度の標的核酸を含む試料の結合の変化と比較し、被検核酸における濃度未知の標的核酸の初期濃度を算出することができる。
　本明細書に開示のＤＮＡ検出方法は、蛍光プローブを結合させる温度において、検出対象のＤＮＡの蛍光プローブ結合領域が二本鎖構造の割合を低減し一本鎖構造の割合を増加するように、変異を導入するプライマーと、検出対象のＤＮＡに結合する蛍光プローブと、検出対象のＤＮＡの蛍光プローブ結合領域を増幅するために変異導入プライマーと対となるプライマーと、検出対象のＤＮＡを増幅するＤＮＡポリメラーゼとを用いて検出対象のＤＮＡを含有する溶液を非対称核酸増幅反応を行う工程と、ＤＮＡ溶液の温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、記ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う蛍光の強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、を含むＤＮＡ検出方法である。以下、このＤＮＡ検出方法を、図６の模式図を参考にして、具体的に説明する。
　まず、増幅されたターゲットＤＮＡにおける蛍光プローブ結合領域の二本鎖構造割合を減らし、一本鎖構造割合が増えるように、変異を導入したプライマーを設計する（Ｓ６０１）。このとき、変異導入プライマーはタグ配列付きであってもなくてもよい。次に、変異導入プライマーを用いて非対称核酸増幅反応により検出対象のＤＮＡを増幅する（Ｓ６０２）。非対称核酸増幅反応した検出対象のＤＮＡは、プローブ結合領域が二本鎖構造を形成する割合が低下し、一本鎖構造を形成する割合が増加した二次構造を形成する（Ｓ６０３）。非対称核酸増幅反応した検出対象のＤＮＡの溶液の温度変化に伴う蛍光強度の変化を計測し、融解曲線を作成し、融解曲線の微分曲線のピーク温度から融解温度を算出する（Ｓ６０４）。最後に、非対称核酸増幅反応した検出対象のＤＮＡの溶液の蛍光の色と融解温度から溶液に含まれていた検出対象のＤＮＡの種類を判別する（Ｓ６０５）。
　検出対象のＤＮＡが複数種類ある場合は、検出対象の配列に合わせて複数のプライマーや複数のプローブを準備し、同時に加えて、複数の検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液に対して非対称核酸増幅反応を行ってもよい。複数のプローブは、それぞれの検出対象のＤＮＡとの融解温度を変えたり、蛍光色素の種類を変えて設計することで、非対称核酸増幅反応後、溶液の蛍光の色と融解温度から溶液に含まれていた検出対象のＤＮＡの種類を判別することができる。例えば、対象遺伝子として、野生型アレルと変異型アレルの複数種類が含まれている場合が例示できるが、複数種類の対象遺伝子は、特にこれらに限定されない。
　変異導入プライマーを用いて非対称核酸増幅反応する過程を蛍光標識プローブでリアルタイムモニタリングすることもできる。例えば、非対称核酸増幅反応で、温度変化のサイクルごとに蛍光強度を測定する工程と、サイクル数と蛍光強度の変化の関係から、複数の溶液に含まれる検出対象のＤＮＡの初期濃度の比が算出できる。さらにこのとき、濃度既知の検出対象のＤＮＡをコントロールとして準備し、同時に計測することにより、温度変化のサイクルごとに蛍光強度を測定する工程と、サイクル数と蛍光強度の変化の関係を、濃度既知のサンプルの蛍光強度変化と比較して、濃度未知のサンプルの検出対象のＤＮＡの初期濃度を算出することも可能である。
　変異導入プライマーを用いた非対称核酸増幅反応をデジタルＰＣＲに適用することもできる。変異導入プライマーを含む反応液を微小区画に分割し、増幅反応後に融解曲線分析し、微小区画内に含まれる対象遺伝子の検出（例えば遺伝子型判定）を行うこともできる。
　例えば、検査対象のＤＮＡ溶液に対象遺伝子Ｐと対象遺伝子Ｑが含まれている場合、対象遺伝子Ｐを含む微小区画では、対象遺伝子Ｐに対応した蛍光標識プローブがＰＣＲにより増幅したＤＮＡにハイブリダイズして蛍光を発する。生じた蛍光を解析することによって、対象遺伝子Ｐの蛍光標識プローブに対応した融解温度を算出できる。また、対象遺伝子Ｑを含む微小区画では、対象遺伝子Ｑに対応した蛍光標識プローブがＰＣＲにより増幅したＤＮＡにハイブリダイズして蛍光を発する。生じた蛍光を解析することによって、対象遺伝子Ｑの蛍光標識プローブに対応した融解温度を算出できる。こうして、蛍光強度と、蛍光の種類（たとえば色）と、融解温度とに基づき、対象遺伝子Ｐの有無、対象遺伝子Ｑの有無が判断できる。
　ＤＮＡの融解温度は、ＰＣＲの反応効率や蛍光測定時の平面内測定ばらつき等に影響を受けないので、ＤＮＡの融解温度を用いることによって微小区画内のＤＮＡの種類（例えば遺伝子型）を高精度で判別することができる。たとえば、対象遺伝子に対する各蛍光標識プローブの融解温度（Ｔｍ）が異なるように蛍光標識プローブの配列を決めておき、微小区画内のＤＮＡに対し、温度変化に伴う蛍光強度変化を測定し、融解曲線分析を行い、融解温度を比較することにより、微小区画内のＤＮＡの検出（例えば遺伝子型判別）が可能になる。
　複数種類の対象遺伝子を同時に検出する場合、それらの区別は、基準融解温度および測定融解温度に基づいて行うことができるが、基準融解温度範囲に基づいて行われることが好ましい。たとえば、あるウェルに係る測定融解温度が、ある対象遺伝子についてデータベースに記録された基準融解温度を含む所定範囲内（たとえば基準融解温度±１℃以内）であれば、そのウェルにはその対象遺伝子が配置されていると判定する。このような基準融解温度範囲を用いると、許容範囲を適切に考慮した、より正確な判定を行うことができる。
　または、蛍光強度の情報として、異なる温度における蛍光強度の比または差を用いてもよい。たとえば、基準融解温度よりも低温の温度での蛍光強度と、基準融解温度よりも高温の温度での蛍光強度との比あるいは差を用いることで、蛍光強度を標準化することができる。たとえば、あるウェルについてこの比または差が所定範囲内であれば、そのウェルはポジティブであると判定され、そうでなければそのウェルはネガティブであると判定される。
　たとえば、５０℃での蛍光強度から８５℃での蛍光強度を減算することにより、蛍光標識プローブ自体の蛍光の影響、すなわち、バックグラウンドの影響を除去することができる。
　なお、蛍光強度の範囲、基準融解温度の範囲を決定する方法は任意に選択可能である。たとえば、あらかじめパイロット実験などを行い、その結果から統計的に作業者が決めてもよいし、ＤＮＡ検出システムが自動的に決定してもよい。また、デジタルＰＣＲ測定のたび、カートリッジ内の各ウェルの測定データを用いて、統計的に蛍光強度の閾値および基準融解温度の所定の範囲を決めてもよい。
　ウェル内のＤＮＡの判別を統計的に行うためのデータは、次の項目のいずれかまたはすべてを含んでもよく、これら以外の項目を含んでもよい。
　‐基準融解温度よりも低温の温度での蛍光強度
　‐基準融解温度よりも高温の温度での蛍光強度
　‐基準融解温度よりも高温の温度での蛍光強度に対する、基準融解温度よりも低温の温度での蛍光強度の比
　‐基準融解温度よりも低温の温度での蛍光強度と、基準融解温度よりも高温の温度での蛍光強度との差
　‐基準融解温度を表す特徴量
　‐融解曲線の形状を表す特徴量
　以上のようにして増幅される核酸の二次構造を変化させて、プローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を高めることにより、増幅された核酸におけるプローブ結合領域への結合量が増加するため、測定感度および測定精度、例えば遺伝子型の判別精度が向上する。
（３）ＤＮＡ検出キット
　上述した本発明の方法は、少なくとも変異を導入するためのプライマーを含むキットを使用することによって、より容易かつ簡便に行うことができる。すなわち、一態様において、本発明は、標的核酸を検出するためのキットを提供し、このキットは、
　フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対と、
　フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて増幅される核酸に結合するプローブと
を含み、
　前記フォワードプライマーもしくは前記リバースプライマーのいずれかまたは両方は、前記プローブと前記増幅される核酸とを結合させる温度において、前記増幅される核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記増幅される核酸に変異を導入するための変異をその配列に含むものである。
　フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、前項に記載の通りである、一実施形態において、本発明のキットに含まれるフォワードプライマーの濃度とリバースプライマーの濃度は異なり、いずれか一方（好ましくは変異を導入するためのプライマー）の濃度が高くなるようにする。
　一実施形態では、本発明のキットは、複数の標的核酸について、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対を複数種含み得る。また一実施形態において、本発明のキットは、複数の標的核酸について、それぞれプローブを複数種含み得る。
　本発明に係るキットは、増幅反応を実施するにあたって必要な他の構成要素、例えばＤＮＡポリメラーゼ、基質などをさらに含んでもよい。また、標的核酸の検出を行うための手順およびプロトコールを記載した説明書を含んでもよい。
　一実施形態において、本明細書に開示のＤＮＡ検出キットは、蛍光プローブを結合させる温度において、検出対象のＤＮＡの蛍光プローブ結合領域が二本鎖構造の割合を低減し一本鎖構造の割合を増加するように、第一の濃度の変異を導入する第一のプライマーと、検出対象のＤＮＡに結合する蛍光プローブと、検出対象のＤＮＡの前記蛍光プローブ結合領域を増幅するために第一のプライマーと対となる、第一の濃度とは異なる第二のプライマーと、検出対象のＤＮＡを増幅するＤＮＡポリメラーゼと、を含むＤＮＡ検出キットである。
　変異を導入する第一のプライマーとその対となる第二のプライマーは、非対称核酸増幅反応を行うために濃度が異なり、濃度が高いのが変異を導入する第一のプライマーと第二のプライマーのどちらであってもよい。また、変異を導入する第一のプライマーは変異を含むだけでなく、タグ配列を含んでもよい。
　検出対象のＤＮＡが複数ある場合は、検出対象の配列に合わせて複数のプライマーや複数のプローブを準備し、同時に加えて、複数の検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液を非対称核酸増幅反応を行ってもよい。複数のプローブは、それぞれの検出対象のＤＮＡとの融解温度を変えたり、蛍光色素の種類を変えて設計することで、非対称核酸増幅反応後、溶液の蛍光の色と融解温度から溶液に含まれていた検出対象のＤＮＡの種類を判別することができる。
（４）プライマーの設計方法
　本発明はまた、被検核酸の増幅および増幅産物とプローブとの結合の測定に基づいて標的核酸を検出するためのプライマーの設計方法を提供する。かかる方法は、被検核酸を増幅するためのプライマー対を設計すること、設計されたプライマー対によって増幅される核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を求めること、その一本鎖形成塩基の割合が少なくとも５０％となるように、上記設計したプライマー対の一方または両方のプライマーに変異を導入することを含む。かかる方法はさらに、変異を導入されたプライマーを含むプライマー対によって増幅される核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を求めること、その一本鎖形成塩基の割合が少なくとも５０％であるか否か確認すること、をさらに含んでもよい。
［実施例１］
　本実施例では、変異導入プライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行う例を示す。
　まず、変異導入プライマーを用いずに非対称核酸増幅反応を行い、融解曲線分析を行った結果を説明する。ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１３Ｄ変異型のゲノムＤＮＡ（最終濃度１３３分子／μＬ）を用意し、ＰＣＲに必要となるフォワードプライマー（最終濃度０．２５μＭ）、リバースプライマー（最終濃度２．０μＭ）、野生型に対応した蛍光標識プローブ（最終濃度０．５μＭ）、Ｇ１３Ｄ変異型に対応した蛍光標識プローブ（最終濃度０．５μＭ）、および１ｘマスターミックス（ＤＮＡポリメラーゼ，ｄＮＴＰを含む）を加え、ＰＣＲ反応液を調製した。このとき、蛍光標識プローブの相補ＤＮＡ鎖が過剰に増幅するようにプライマーペアの濃度は非対称になるように添加した。プライマーおよびプローブの配列は以下のとおりである。なお、蛍光標識プローブはいずれも、両端近くに相補的な配列を有し、それらが分子内で二重鎖を形成するように設計されている。また、野生型に対応した蛍光標識プローブは５’末端に蛍光色素としてＨＥＸ、３’末端にクエンチャーとしてＢＨＱ－１が結合しており、変異型に対応した蛍光標識プローブは５’末端に蛍光色素としてＦＡＭ、３’末端にクエンチャーとしてＢＨＱ－１が結合している。
　　フォワードプライマー：5'‐GTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGG‐3'　（配列番号１）
　　リバースプライマー：5'‐GTATCGTCAAGGCACTCTTGCC‐3'　（配列番号２）
　　野生型に対応した蛍光標識プローブ：5'‐TTGGAGCTGGTGGCGT‐3'　（配列番号３）
　　変異型に対応した蛍光標識プローブ：5'‐CTGGTGACGTAGGCA‐3'　（配列番号４）
　図７Ａは増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造７０１（配列番号５）と野生型に対応した蛍光標識プローブの結合領域７０２の位置関係を示している。図７Ｂは増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造７０１（配列番号５）と変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域７０３の位置関係を示している。図７Ａにおける蛍光標識プローブの結合領域７０２は一本鎖形成割合が６９％であり、図７Ｂにおける蛍光標識プローブの結合領域７０３は一本鎖形成割合が４７％である。
　図７Ｃは、非対称核酸増幅反応後、融解曲線分析を行った結果、得られた融解曲線の微分曲線である。増幅したＧ１３Ｄ変異型のＤＮＡ７０１と野生型に対応した蛍光標識プローブ７０２の融解曲線の微分曲線のピーク７０４に比較して、増幅したＧ１３Ｄ変異型のＤＮＡ７０１と変異型に対応した蛍光標識プローブ７０３の融解曲線の微分曲線のピーク７０５は小さかった。この結果から、蛍光標識プローブの結合領域の一本鎖形成割合が低いと、増幅したＤＮＡと蛍光標識プローブの結合量が低下することが分かった。このような場合、変異型はわずかにしか存在しないこともあるため、蛍光量がさらに低下して検出が困難となる。
　次に、図８ＡおよびＢに変異導入プライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行った結果を示す。図８Ａは図７Ａに示した変異導入プライマーを使わなかった場合の、増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造８０１（配列番号５）と変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域８０２の位置関係に、プライマーで変異を導入する予定の位置８０３を図示したものである。プライマーで変異を導入する予定の位置８０３のＣＣという塩基配列をＡＡに変える変異導入プライマーを設計し、それを用いて非対称核酸増幅反応を行った場合の、増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造８０４（配列番号６）と変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域８０２の位置関係に、プライマーで変異を導入した位置８０５を図８Ｂに示した。図８Ｂでは、変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域８０２の一本鎖形成割合が増大し、蛍光標識プローブの結合量が増加する。
　このように、変異導入プライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行うことで、増幅する対象遺伝子の二次構造を変化させ、一本鎖形成割合が高くなることで蛍光標識プローブの結合量が増加するため、測定感度や測定精度が向上する。
［実施例２］
　本実施例では、タグ付き変異導入プライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行う例を示す。
　図９ＡおよびＢにタグ付き変異導入プライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行った結果を示す。図９Ａは図７Ａに示した変異導入プライマーを使わなかった場合の、増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造９０１（配列番号５）と変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域９０２の位置関係に、プライマーで変異を導入する予定の位置９０３を図示したものである。プライマーで変異を導入する予定の位置９０３のＣＣという塩基配列をＡＡに変え、さらに３’末端にタグ配列を追加した変異導入プライマーを設計し、それを用いて非対称核酸増幅反応を行った場合の、増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造９０４（配列番号７）と変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域９０２の位置関係に、プライマーで変異を導入した位置９０５、プライマーで追加されたタグの位置９０６を図９Ｂに示した。図９Ｂでは、変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域９０２の一本鎖形成割合が増大し、蛍光標識プローブの結合量が増加する。なお、図９Ａおよび９Ｂに示したように、変異の導入の前後で一本鎖ＤＮＡの二次構造が大きく変化することもある。
　このように、タグ付き変異導入プライマーを用いて非対称核酸増幅反応を行うことで、増幅する対象遺伝子の二次構造を変化させ、一本鎖形成割合が高くなることで蛍光標識プローブの結合量が増加するため、測定感度や測定精度が向上する。
　１０１…ＤＮＡ
　１０２…蛍光標識プローブ
　１０３…蛍光色素
　１０４…クエンチャー
　２０１…フォワードプライマー
　２０２…リバースプライマー
　２０３…蛍光標識プローブ
　２０４…検出対象のＤＮＡ
　２０５…検出対象のＤＮＡの相補鎖同士が二本鎖構造を形成した分子
　２０６…検出対象のＤＮＡの一本鎖形成分子に蛍光標識プローブが結合した分子
　２０７…検出対象のＤＮＡの片方の鎖
　３０１…フォワードプライマー
　３０２…変異導入リバースプライマー
　３０３…蛍光標識プローブ
　３０４…検出対象のＤＮＡ
　３０５…変異なしリバースプライマーで増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造
　３０６…変異導入予定部位
　３０７…変異導入リバースプライマーで増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造
　３０８…導入された変異
　３０９…変異
　４０１…フォワードプライマー
　４０２…タグ付き変異導入リバースプライマー
　４０３…蛍光標識プローブ
　４０４…検出対象のＤＮＡ
　４０５…タグ配列
　４０６…変異なしリバースプライマーで増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造
　４０７…変異導入予定部位
　４０８…タグ付き変異導入リバースプライマーで増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造
　４０９…導入された変異
　４１０…付加されたタグ配列
　４１１…変異
　５０１…融解温度
　７０１…変異なしリバースプライマーで増幅した一本鎖の検出対象ＤＮＡの二次構造
　７０２…野生型に対応した蛍光標識プローブの結合領域
　７０３…変異型に対応した蛍光標識プローブの結合領域
　７０４…増幅したＧ１３Ｄ変異型のＤＮＡと野生型に対応した蛍光標識プローブのピーク
　７０５…増幅したＧ１３Ｄ変異型のＤＮＡと変異型に対応した蛍光標識プローブのピーク
　８０１…変異導入プライマーを用いずに増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造
　８０２…蛍光標識プローブの結合領域
　８０３…変異導入予定の位置
　８０４…変異導入プライマーを用いて増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造
　８０５…変異導入位置
　９０１…変異導入プライマーを用いずに増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造
　９０２…蛍光標識プローブの結合領域
　９０３…変異導入予定の位置
　９０４…変異導入プライマーを用いて増幅したＧ１３Ｄ変異型の一本鎖ＤＮＡの二次構造
　９０５…変異導入位置
　９０６…タグ配列
配列番号1～7：DNA（人工配列、合成ポリヌクレオチド）

Claims (24)

  1. 　フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対とプローブの存在下で被検核酸を増幅する工程と、
    　前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーによって増幅された核酸と前記プローブとの結合を測定する工程と
    を含む標的核酸の検出方法であって、
    　前記フォワードプライマーもしくは前記リバースプライマーのいずれかまたは両方は、前記プローブと前記増幅された核酸とを結合させる温度において、前記増幅された核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記増幅された核酸に変異を導入するための変異をその配列に含むものである、前記方法。
  2. 　前記リバースプライマーが前記変異を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記プローブが、蛍光色素を含むまたは蛍光色素および消光色素を含み、前記蛍光色素を用いて前記増幅された核酸と前記プローブとの結合が測定される、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記プローブの3’末端配列と5’末端配列とが相補的な配列を有する、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記増幅工程が、非対称核酸増幅反応により行われる、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記フォワードプライマーもしくは前記リバースプライマーのいずれかまたは両方がさらにタグ配列を含み、前記増幅された核酸が前記タグ配列を含むことになる、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記増幅された核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合が５０％以上である、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記増幅された核酸と前記プローブとの結合が、温度変化を伴って測定され、前記温度変化に伴う前記結合の変化から、前記増幅された核酸と前記プローブとの二重鎖の融解温度を算出する、請求項１に記載の方法。
  9. 　前記増幅された核酸と前記プローブとの結合が、温度変化のサイクルごとに測定され、前記サイクルの数と前記結合の変化の関係から、前記標的核酸を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 　前記変異を含むプライマーを複数種類使用して、複数の標的核酸を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 　前記増幅された核酸と前記プローブとの結合が、温度変化のサイクルごとに測定され、前記サイクルの数と前記結合の変化の関係から、前記被検核酸における前記複数の標的核酸の初期濃度の比を算出することを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記増幅された核酸と前記プローブとの結合が、温度変化のサイクルごとに測定され、前記サイクルの数と前記結合の変化の関係を、既知濃度の標的核酸を含む試料の前記結合の変化と比較し、前記被検核酸における濃度未知の前記標的核酸の初期濃度を算出することを含む、請求項１に記載の方法。
  13. 　前記標的核酸の検出が、前記標的核酸の遺伝子型の判別を含む、請求項１に記載の方法。
  14. 　被検核酸に変異を導入して増幅するためのプライマーであって、前記被検核酸から増幅された核酸とプローブとを結合させる温度において、前記被検核酸から増幅された核酸における前記プローブの結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記被検核酸に変異を導入するための変異をその配列に含む、前記プライマー。
  15. 　リバースプライマーである、請求項１４に記載のプライマー。
  16. 　さらにタグ配列を含む、請求項１４に記載のプライマー。
  17. 　標的核酸を検出するためのキットであって、
    　フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対と、
    　フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて増幅される核酸に結合するプローブと
    を含み、
    　前記フォワードプライマーもしくは前記リバースプライマーのいずれかまたは両方は、前記プローブと前記増幅される核酸とを結合させる温度において、前記増幅される核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合を増大するように前記増幅される核酸に変異を導入するための変異をその配列に含むものである、前記キット。
  18. 　前記フォワードプライマーもしくは前記リバースプライマーのいずれかまたは両方がさらにタグ配列を含む、請求項１７に記載のキット。
  19. 　前記フォワードプライマーの濃度と前記リバースプライマーの濃度が異なる、請求項１７に記載のキット。
  20. 　前記プローブが、蛍光色素を含む、または蛍光色素および消光色素を含む、請求項１７に記載のキット。
  21. 　前記プローブの3’末端配列と5’末端配列とが相補的な配列を有する、請求項１７に記載のキット。
  22. 　前記増幅される核酸におけるプローブ結合領域の一本鎖形成塩基の割合が５０％以上である、請求項１７に記載のキット。
  23. 　複数の標的核酸について、それぞれ前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーを含む前記プライマー対を複数種含む、および／または
    　複数の標的核酸について、それぞれ前記プローブを複数種含む、請求項１７に記載のキット。
  24. 　ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１７に記載のキット。
PCT/JP2022/024591 2022-06-20 2022-06-20 プライマー、ｄｎａ検出方法およびｄｎａ検出キット WO2023248310A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2022/024591 WO2023248310A1 (ja) 2022-06-20 2022-06-20 プライマー、ｄｎａ検出方法およびｄｎａ検出キット

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2022/024591 WO2023248310A1 (ja) 2022-06-20 2022-06-20 プライマー、ｄｎａ検出方法およびｄｎａ検出キット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023248310A1 true WO2023248310A1 (ja) 2023-12-28

Family

ID=89379537

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/024591 WO2023248310A1 (ja) 2022-06-20 2022-06-20 プライマー、ｄｎａ検出方法およびｄｎａ検出キット

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023248310A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001161377A (ja) * 1999-09-27 2001-06-19 Becton Dickinson & Co 核酸検出のための万能プローブおよび方法
JP2004113240A (ja) * 2002-09-20 2004-04-15 Bayer Healthcare Llc 二次構造形成の破壊による向上したハイブリダイゼーションアッセイを提供するための二目的プライマーおよびプローブ
JP2005301532A (ja) * 2004-04-09 2005-10-27 Hitachi High-Technologies Corp プライマー設計装置及びプログラム
JP2008516612A (ja) * 2004-10-18 2008-05-22 ブランデイズ ユニバーシティー 核酸増幅のためのプライマー、プローブおよび方法
JP2010162034A (ja) * 2002-04-26 2010-07-29 Univ Of Utah Research Foundation 二本鎖核酸−特異的色素を使用する二次構造の融解分析による一本鎖核酸の特徴付け
JP2019118294A (ja) * 2017-12-28 2019-07-22 株式会社ダナフォーム プローブを用いた核酸検出用プライマーセット

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001161377A (ja) * 1999-09-27 2001-06-19 Becton Dickinson & Co 核酸検出のための万能プローブおよび方法
JP2010162034A (ja) * 2002-04-26 2010-07-29 Univ Of Utah Research Foundation 二本鎖核酸−特異的色素を使用する二次構造の融解分析による一本鎖核酸の特徴付け
JP2004113240A (ja) * 2002-09-20 2004-04-15 Bayer Healthcare Llc 二次構造形成の破壊による向上したハイブリダイゼーションアッセイを提供するための二目的プライマーおよびプローブ
JP2005301532A (ja) * 2004-04-09 2005-10-27 Hitachi High-Technologies Corp プライマー設計装置及びプログラム
JP2008516612A (ja) * 2004-10-18 2008-05-22 ブランデイズ ユニバーシティー 核酸増幅のためのプライマー、プローブおよび方法
JP2019118294A (ja) * 2017-12-28 2019-07-22 株式会社ダナフォーム プローブを用いた核酸検出用プライマーセット

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4814479B2 (ja) リアルタイムで内部標準を用いて遺伝子を定量する方法
US20200199658A1 (en) Probes for improved melt discrimination and multiplexing in nucleic acid assays
JP2012235778A (ja) アセトアルデヒド脱水素酵素２及びアルコール脱水素酵素２の遺伝子変異を同時に検出する方法
JP6126381B2 (ja) 標的核酸の検出方法及びキット
JP7545511B2 (ja) デジタルｐｃｒの測定方法および測定装置
CN110358815B (zh) 一种同时检测多个靶标核酸的方法及其试剂盒
WO2005059548A1 (ja) 核酸測定用新規混合物、及びそれを用いる核酸の新規測定方法並びにそれらに用いる核酸プローブ
JP3752466B2 (ja) 遺伝子検査方法
KR102397357B1 (ko) 포스포로티오에이트 dna로 수식된 헤어핀 프로브 기반의 등온 핵산증폭기술을 이용한 표적핵산 검출방법
Wang et al. Sensitive detection of cancer gene based on a nicking-mediated RCA of circular DNA nanomachine
JP7045702B2 (ja) リアルタイムで核酸を検出するための一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法
US20220025434A1 (en) Composition for determining false positives using a unique artificial nucleotide sequence and method for determining false positives using the same
KR102265417B1 (ko) 단일염기다형성 다중 분석용 프라이머
JP6720161B2 (ja) 複数の標的核酸の検出キット及びそれを用いる検出方法
WO2023248310A1 (ja) プライマー、ｄｎａ検出方法およびｄｎａ検出キット
US20200407794A1 (en) Molecular targets for fetal nucleic acid analysis
Wang et al. Construction of a multiple ligation-driven exponentially symmetric T7-transcription machinery for single-molecule monitoring of diverse single-nucleotide polymorphisms in human cancers
US20220119882A1 (en) Single-stranded nucleic acid for real-time detection of genetic variation of single target gene and detection method using the same
CN114250286B (zh) 用于核酸检测的组合、试剂盒及其应用
KR102531590B1 (ko) 절단효소 인식부위의 미러링 결합에 의한 표적핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 조성물
KR20180033911A (ko) 표적 핵산 또는 유전적 변이를 다중 검출하는 방법
US20210180115A1 (en) Multiple analysis method for amplicon by using fluorescence-based multiple melting analysis
JP2018526009A (ja) ヌクレオチド１個の分解能を有する多価プローブ
JP2018088883A (ja) 上皮成長因子受容体遺伝子変異の検出方法
CN116024315A (zh) 一种基于链置换反应的多价双锁钥系统及其在核苷酸多态性检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22947071

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1