JP2019118294A - プローブを用いた核酸検出用プライマーセット - Google Patents
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Abstract
【課題】複雑なプライマー設計や、プライマー比率の調整を行うことなく、プローブが目的の配列にハイブリダイズできる増幅産物を生成する、新たなＰＣＲ用プライマーセットの提供。【解決手段】標的配列の標的部位よりも３’側の配列にハイブリダイズする第１プライマーと、標的配列の相補配列の標的部位よりも３’側の配列にハイブリダイズする第２プライマーとを含み、第１プライマーは、３’側の配列が、標的配列における標的部位よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列であり、５’側の配列が、標的配列における配列の３’側の配列に非相補的であり、且つ、第１プライマーからの伸長鎖において、標的部位の相補部位よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である、ＰＣＲ用プライマーセット。【選択図】図１
Description
本発明は、プライマーセットに関する。
医療等の様々な分野において、遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、およびメチル化等によるＤＮＡ修飾等についての分析が利用されている。前記分析方法としては、融解曲線解析が知られている。具体的には、まず、鋳型におけるＳＮＰの標的部位を含む領域を、ＰＣＲにより増幅させる。そして、得られた増幅産物に対して、前記標的部位（例えば、変異型）にパーフェクトマッチするプローブをハイブリダイズさせ、昇温による、前記プローブの解離を検出することによって、前記標的部位が変異型か否かが分析される。
前記ＰＣＲは、通常、鋳型のアンチセンス鎖にアニーリングして伸長するフォワード（Ｆ）プライマーと、鋳型のセンス鎖にアニーリングして伸長するリバース（Ｒ）プライマーとが、使用される。一方、前記プローブは、前記アンチセンス鎖のターゲット配列にハイブリダイズするプローブと、前記センス鎖のターゲット配列にハイブリダイズするプローブのうち、一方のみが使用される。前記ＰＣＲにおいては、使用される２本のプライマーに挟まれた鋳型配列が、センス鎖とアンチセンス鎖との二本鎖状態で増幅される。このため、前記方法による検出においては、前記二本鎖のＰＣＲ増幅産物を１本鎖にほどいた上で、前記プローブを、前記１本鎖のターゲット配列にハイブリダイズさせる必要がある。しかしながら、二本鎖のＰＣＲ増幅産物は、一般に、前記プローブの配列よりも長いため、自由エネルギー上、安定である場合が多い。このため、化学平衡論の観点から、前記プローブが前記ターゲット配列にハイブリダイズできる割合は、前記ＰＣＲ増幅産物の全体に対して非常に小さい。
そこで、このような問題を解消する方法として、前記Ｆプライマーと前記Ｒプライマーとの比率を変え、一方のプライマーからの増幅産物を、他方のプライマーからの増幅産物よりも多く生成させる方法である、「非対称ＰＣＲ法」が報告されている。前記非対称ＰＣＲ法においては、例えば、前記センス鎖にハイブリダイズするプローブを使用する場合には、前記Ｆプライマーの比率を高くする。これによって、前記センス鎖の増幅産物が、前記アンチセンス鎖の増幅産物よりも多くなり、前記プローブが、前記アンチセンス鎖と比較して化学平衡論的に不利な場合でも、余剰となった前記センス鎖にハイブリダイズできる。
GyllenstenおよびErlich, "Generation of Single-Stranded DNA by the polymerase chain reaction and its application to direct sequencing of the HLA-DQA Locus" Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:7652-7656 (1988)
J. Aquiles Sanchez, Kenneth E. Pierce, John E. Rice, and Lawrence J. Wangh, "Linear-After-The-Exponential (LATE)-PCR: An advanced method of asymmetric PCR and its uses in quantitative real-time analysis" PNAS 2004 101 (7) 1933-1938
しかしながら、前記非対称ＰＣＲ法によって一方の増幅産物を効率的に増やすには、単にプライマーの濃度比率を変えるだけではなく、プライマー配列の再設計、アニーリング温度等の処理条件の最適化も必要であり、開発は容易ではない。また、センス鎖およびアンチセンス鎖の一方の鋳型配列について、効率的な増幅に成功したとしても、その増幅産物が２次構造を形成し、前記プローブのハイブリダイズが困難となる場合や、増幅産物同士がプライミングを起こして伸長し、二本鎖を再形成する場合も起こり得る。このため、これらの複雑な制約を満たす、検出用試薬の開発には多大な時間を要する。また、試薬を使用するユーザ側においても、ターゲット毎に違う濃度調整を行う必要がある等の不便が生じている。
そこで、本発明は、例えば、複雑なプライマー設計や、プライマー比率の調整を行うことなく、前記プローブが目的の配列にハイブリダイズできる増幅産物を生成する、新たなＰＣＲ用プライマーセットを提供することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のＰＣＲ用プライマーセットは、
標的配列（Ｘ’）に対する第１プライマーと、標的配列（Ｘ’）に相補な標的相補配列（Ｘ）に対する第２プライマーとを含み、
前記第１プライマーは、
標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
前記第２プライマーは、
標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
下記条件（１）および条件（２）の少なくとも一方を満たすことを特徴とする。
標的配列（Ｘ’）に対する第１プライマーと、標的配列（Ｘ’）に相補な標的相補配列（Ｘ）に対する第２プライマーとを含み、
前記第１プライマーは、
標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
前記第２プライマーは、
標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
下記条件（１）および条件（２）の少なくとも一方を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記第１プライマーは、
３’側の配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第１プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ’）の相補部位（Ｓ）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。
条件（２）
前記第２プライマーは、
３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第２プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ）の相補部位（Ｓ’）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。
前記第１プライマーは、
３’側の配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第１プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ’）の相補部位（Ｓ）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。
条件（２）
前記第２プライマーは、
３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第２プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ）の相補部位（Ｓ’）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。
本発明の核酸増幅方法は、標的配列と、前記標的配列に相補的な標的相補配列とを含む鋳型の存在下、前記本発明のプライマーセットにより、ＰＣＲを行うことを特徴とする。
本発明の変異の分析方法は、標的配列と、前記標的配列に相補的な標的相補配列とを含む鋳型の存在下、前記本発明の核酸増幅方法により、核酸増幅を行う増幅工程と、前記増幅工程により得られた増幅産物と、プローブとを用いて、前記標的配列における標的部位の変異の有無を分析する分析工程とを含み、前記プローブは、前記標的配列における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズするプローブであることを特徴とする。
本発明のプライマーセットにより得られる増幅産物は、後述するように、自己アニーリングによりステムループ構造を形成する。しかしながら、ステムループ構造の中でも、一本鎖の状態であるループ領域に、前記標的配列における標的部位が位置するように、前記プライマーセットは設計されている。このため、前記ステムループ構造のループ領域に、前記プローブが効率良くハイブリダイズできる。また、前記ステムループ構造を構成するように、前記プライマーセットを設計することによって、例えば、得られる増幅産物が、意図しない２次構造を形成したり、前記増幅産物同士がプライミングをして、再び伸長反応を起こすといった反応を抑制できる。さらに、得られる増幅産物は、前記ループ領域以外、すなわちステム領域は二本鎖の状態であるため、前記プローブのハイブリダイズも抑制される。したがって、本発明によれば、前記プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制し、前記プローブを用いた分析の精度を向上することができる。
本発明において、前記標的配列と前記標的相補配列は、互いに相補的な関係にある配列である。前記標的配列と前記標的相補配列は、例えば、センス鎖とアンチセンス鎖との関係であり、前記標的配列および前記標的相補配列は、例えば、いずれがセンス鎖でもアンチセンス鎖でもよい。本発明の実施形態においては、便宜上、前記第１プライマーを、センス鎖の伸長用プライマー（Ｆプライマーともいう）とし、前記第１プライマーがハイブリダイズする前記標的配列を、アンチセンス鎖とし、前記第２プライマーを、アンチセンス鎖の伸長用プライマー（Ｒプライマーともいう）とし、前記第２プライマーがハイブリダイズする前記標的相補配列を、センス鎖、として説明する。なお、これは例示であって、本発明は、これには制限されない。
本発明において「プライマーまたはプローブがハイブリダイズする」とは、例えば、プライマーの一部またはプローブの一部が、ストリンジェントな条件下で標的配列にハイブリダイズし、前記標的配列以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、例えば、プライマーまたはプローブとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度等に依存して決定でき、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照できる。ハイブリダイズするプライマーおよびプローブの配列は、例えば、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead Institute for Biomedical Research社製）等を用いて設計できる。
＜ＰＣＲ用プライマーセット＞
本発明のＰＣＲ用プライマーセット（以下、プライマーセットともいう）は、前述のように、標的配列（Ｘ’）に対する第１プライマーと、標的配列（Ｘ’）に相補な標的相補配列（Ｘ）に対する第２プライマーとを含み、
前記第１プライマーは、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
前記第２プライマーは、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
下記条件（１）および条件（２）の少なくとも一方を満たすことを特徴とする。
本発明のＰＣＲ用プライマーセット（以下、プライマーセットともいう）は、前述のように、標的配列（Ｘ’）に対する第１プライマーと、標的配列（Ｘ’）に相補な標的相補配列（Ｘ）に対する第２プライマーとを含み、
前記第１プライマーは、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
前記第２プライマーは、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
下記条件（１）および条件（２）の少なくとも一方を満たすことを特徴とする。
条件（１）
前記第１プライマーは、
３’側の配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第１プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ’）の相補部位（Ｓ）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。
前記第１プライマーは、
３’側の配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第１プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ’）の相補部位（Ｓ）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。
条件（２）
前記第２プライマーは、
３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第２プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ）の相補部位（Ｓ’）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。
前記第２プライマーは、
３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第２プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ）の相補部位（Ｓ’）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。
本発明のプライマーセットは、例えば、前記条件（１）のみを満たしてもよいし、前記条件（２）のみを満たしてもよいし、前記条件（１）および前記条件（２）の両方を満たしてもよい。前記条件（１）を満たす第１プライマーおよび前記条件（２）を満たす第２プライマーの少なくとも一方を用いてＰＣＲを行うことにより、前述のような、ステムループ構造をとる増幅産物を得ることができる。
本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は、以下の実施形態には限定されない。各実施形態の説明は、特に言及がない限り、互いの説明を援用できる。
（実施形態１）
本発明の第１のプライマーセットは、前記条件（１）および前記条件（２）の両方を満たすプライマーセットである。図１に、前記第１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合における、増幅の作用機序を、模式的に示す。
本発明の第１のプライマーセットは、前記条件（１）および前記条件（２）の両方を満たすプライマーセットである。図１に、前記第１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合における、増幅の作用機序を、模式的に示す。
図１（ａ）に示すように、第１プライマーは、３’側の配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列であり、５’側の配列（Ｃ）が、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の３’側の配列に非相補的な配列である。第２プライマーは、３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、５’側の配列（Ｃ）が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的である。そして、第１プライマーの配列（Ｃ）と、第２プライマーの配列（Ｃ）とは、同じ配列である。
この第１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、まず、図１（ａ）に示すように、第１プライマーは、その配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）の配列（Ａｃ）にハイブリダイズし、第２プライマーは、その配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする。そして、図１（ｂ）に示すように、第１プライマーおよび第２プライマーから、それぞれ、伸長鎖が形成される。第１プライマーの伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）は、その５’側に、第１プライマーの５’末端に由来する配列（Ｃ）を有し、他方、第２プライマーの伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）も、その５’末端に、第２プライマーの５’末端に由来する配列（Ｃ）を有する。
さらに、伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）が、新たな鋳型となって、第１プライマーがハイブリダイズし、さらに伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）が形成され、伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）が、新たな鋳型となって、第２プライマーがハイブリダイズし、さらに伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）が形成される。ここで、図１（ｃ）に示すように、第１プライマーによる伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）は、５’末端に、第１プライマーに由来する配列（Ｃ）を有するとともに、３’末端に、伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）の配列（Ｃ）に対する相補配列（Ｃｃ）を有する。また、第２プライマーによる伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）も、５’末端に、第２プライマーに由来する配列（Ｃ）を有するとともに、３’末端に、伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）の配列（Ｃ）に対する相補配列（Ｃｃ）を有する。
そして、図１（ｄ）に示すように、第１プライマーから得られた伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）と、第２プライマーから得られた伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）とは、それぞれ、配列（Ｃ）と配列（Ｃｃ）とがハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）の前記ステムループ構造において、標的部位（Ｓ’）は、ループ領域に位置する。このため、第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）に対して、標的部位（Ｓ’）を含む領域にハイブリダイズするプローブを使用すれば、前記ループ領域に、前記プローブを特異的にハイブリダイズできる。前記ステムループ構造におけるステム領域は、二本鎖であるため、仮に、この領域に、前述のような前記プライマー、前記プローブ、もしくは得られる増幅産物と相補的な配列が存在しても、これらのハイブリダイズは阻害される。また、第１プライマー伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）も、一本鎖のループ領域を有するが、その配列は、前記プローブと同じ配列となるため、前記プローブはハイブリダイズしない。
なお、第１プライマー伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）および第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）は、互いにハイブリダイズした二本鎖構造の図１（ｃ）の状態と、それぞれが分子内アニーリングしたステムループ構造の図１（ｄ）の状態とを取り得るが、構造の安定性から、平衡は、図１（ｃ）に傾いていると考えられる。しかしながら、前記伸長鎖のうち大部分が、図１（ｃ）の状態をとっていても、二本鎖である限り、前記プローブはハイブリダイズできない。これに対して、少量（例えば、２０％程度）であっても、図１（ｄ）の状態であれば、前記プローブはハイブリダイズできる。このため、前記伸長鎖について、ステムループ構造の量にかかわらず、特異的なプローブのハイブリダイズによって、標的部位の分析が可能となる。
融解曲線解析によって前記標的部位の変異の有無を解析する場合、後述するような蛍光を発するプローブを使用し、反応溶液の温度を上昇させながら、前記プローブからの蛍光強度を測定する方法が一般的に行われる。この場合、温度上昇の変化の範囲は、特に制限されず、例えば、３０℃から９５℃の間で測定が行われる。そして、この温度上昇の間に、前記標的部位にハイブリダイズした前記プローブが、前記標的部位から解離する。このため、前記ステムループ構造におけるステム配列（Ｃ）は、前記プローブの融解温度以上の温度でステムを形成するように設計することが望ましい。一方、ＰＣＲにおける伸長反応は、典型的な例として、７２℃で行われる。このため、前記ステム配列（Ｃ）は、例えば、この温度以下でステムを形成するように設計しておけば、前記ステム構造による伸長反応の阻害を、十分に回避できる。
本実施形態における第１プライマーおよび第２プライマーの大きさは、特に制限されない。第１プライマーと第２プライマーは、それぞれ、同じ長さでも異なる長さでもよい。
第１プライマーは、全長が、例えば、１０〜１００塩基長、１９〜８０塩基長、３８〜６０塩基長、配列（Ａ）が、例えば、５〜５０塩基長、１２〜４０塩基長、１８〜３０塩基長、配列（Ｃ）が、例えば、５〜５０塩基長、７〜４０塩基長、２０〜３０塩基長である。配列（Ａ）と配列（Ｃ）の長さの比は、例えば、１：０．６〜１．７である。
第２プライマーは、全長が、例えば、１０〜１００塩基長、１９〜８０塩基長、３８〜６０塩基長、配列（Ｂ）が、例えば、５〜５０塩基長、１２〜４０塩基長、１８〜３０塩基長、配列（Ｃ）が、例えば、５〜５０塩基長、７〜４０塩基長、２０〜３０塩基長である。配列（Ｂ）と配列（Ｃ）の長さの比は、例えば、１：０．６〜１．７である。
第１プライマーおよび第２プライマーの設計において、配列（Ａｃ）と配列（Ｂ）との間の領域（Ｄ’）の長さ、および、配列（Ｂｃ）と配列（Ａ）との間の領域（Ｄ）の長さは、例えば、１５〜５０塩基長である。領域（Ｄ’）における標的部位（Ｓ’）の位置、および領域（Ｄ）における標的部位（Ｓ）の位置は、特に制限されず、例えば、第１プライマーおよび第２プライマーのハイブリダイズ領域（Ａｃ）および配列（Ｂ）、ならびにこれらの相補配列（Ａ）および配列（Ｂｃ）から、５塩基以上離れた位置である。
標的配列（Ｘ’）においては、例えば、配列（Ａｃ）、配列（Ｂ）、およびそれらに挟まれる標的部位（Ｓ’）を含む領域（Ｄ’）が、前記ステムループ構造におけるループ領域の長さとなる。同様に、標的相補配列（Ｘ）においては、例えば、配列（Ｂｃ）、配列（Ａ）、およびそれらに挟まれる標的部位（Ｓ）を含む領域（Ｄ）が、前記ステムループ構造におけるループ領域の長さとなる。前記ループ領域の長さは、特に制限されず、例えば、プローブがハイブリダイズするのに十分な長さであればよい。前記ループ領域の長さは、具体的には、例えば、５０塩基長以下、１５〜５０塩基長である。前記ループ領域の長さが、５０塩基以下であれば、例えば、前記ステムループ構造の形成効率の観点から、好ましい。また、第１プライマーおよび第２プライマーの配列（Ｃ）の長さが、例えば、前記ステムループ構造におけるステム領域の長さとなる。前記ステム領域の長さは、例えば、前記配列（Ｃ）の長さである。前記ステム領域の長さは、例えば、前記融解温度条件を満たすように設計できる。
（実施形態２）
本発明の第２のプライマーセットは、前記条件（２）を満たすプライマーセットである。図２に、前記第２のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合における、増幅の作用機序を、模式的に示す。
本発明の第２のプライマーセットは、前記条件（２）を満たすプライマーセットである。図２に、前記第２のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合における、増幅の作用機序を、模式的に示す。
図２（ａ）に示すように、第１プライマーは、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列（Ａ）からなる。第２プライマーは、３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、５’側の配列（Ａ）が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的である。そして、前記第１プライマーの配列（Ａ）と、前記第２プライマーの配列（Ａ）とが、同じ配列である。
この第２のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、まず、図２（ａ）に示すように、第１プライマーは、その配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）の配列（Ａｃ）にハイブリダイズし、第２プライマーは、その配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする。そして、図２（ｂ）に示すように、第１プライマーおよび第２プライマーから、それぞれ、伸長鎖が形成される。第１プライマーの伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）は、その５’側に、第１プライマーの５’末端に由来する配列（Ａ）を有し、他方、第２プライマーの伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）も、その５’末端に、第２プライマーの５’末端に由来する配列（Ａ）を有する。
さらに、伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）が、新たな鋳型となって、第１プライマーがハイブリダイズし、さらに伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）が形成され、伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）が、新たな鋳型となって、第２プライマーがハイブリダイズし、さらに伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）が形成される。ここで、図２（ｃ）に示すように、第１プライマーによる伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）は、５’末端に、第１プライマーに由来する配列（Ａ）を有するとともに、３’末端に、伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）の配列（Ａ）に対する相補配列（Ａｃ）を有する。また、第２プライマーによる伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）も、５’末端に、第２プライマーに由来する配列（Ａ）を有するとともに、３’末端に、伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）の配列（Ａ）に対する相補配列（Ａｃ）を有する。
そして、図２（ｄ）に示すように、第１プライマーから得られた伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）と、第２プライマーから得られた伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）とは、それぞれ、配列（Ａ）と配列（Ａｃ）とがハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）の前記ステムループ構造において、標的部位（Ｓ’）は、ループ領域に位置する。このため、第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）に対して、標的部位（Ｓ’）を含む領域にハイブリダイズするプローブを使用すれば、前記ループ領域に、前記プローブを特異的にハイブリダイズできる。前記ステムループ構造におけるステム領域は、二本鎖であるため、仮に、この領域に前記プライマー、プローブ、もしくは増幅産物と相補的な配列が存在しても、これらのハイブリダイズは阻害される。また、第１プライマー伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）も、一本鎖のループ領域を有するが、その配列は、前記プローブと同じ配列となるため、前記プローブはハイブリダイズしない。
本実施形態における第１プライマーおよび第２プライマーの大きさは、特に制限されない。第２プライマーは、例えば、実施形態１を援用できる。
第１プライマーは、全長、すなわち配列（Ａ）が、例えば、５〜５０塩基長、１２〜４０塩基長、１８〜３０塩基長である。
（実施形態３）
本発明の第３のプライマーセットは、前記条件（２）を満たすプライマーセットである。図３に、前記第３のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合における、増幅の作用機序を、模式的に示す。
本発明の第３のプライマーセットは、前記条件（２）を満たすプライマーセットである。図３に、前記第３のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合における、増幅の作用機序を、模式的に示す。
図３（ａ）に示すように、第１プライマーは、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列（Ａ）からなる。第２プライマーは、３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、５’側の配列（Ｃ）が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の５’側配列（Ｃｃ）の相補配列（Ｃ）である。
この第３のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、まず、図３（ａ）に示すように、第１プライマーは、その配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）の配列（Ａｃ）にハイブリダイズし、第２プライマーは、その配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする。そして、図３（ｂ）に示すように、第１プライマーおよび第２プライマーから、それぞれ、伸長鎖が形成される。第１プライマーの伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）は、その５’側に、第１プライマーの５’末端に由来する配列（Ａ）と、配列（Ａｃ）の５’側の配列（Ｃｃ）に対する相補配列（Ｃ）を有する。他方、第２プライマーの伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）は、その５’末端に、第２プライマーの５’末端に由来する配列（Ｃ）と配列（Ｂ）とを有する。
さらに、伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）が、新たな鋳型となって、第１プライマーがハイブリダイズし、さらに伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）が形成され、伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）が、新たな鋳型となって、第２プライマーがハイブリダイズし、さらに伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）が形成される。ここで、図３（ｃ）に示すように、第１プライマーによる伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）は、５’末端に、配列（Ａ）と配列（Ｃ）とを有するとともに、３’末端に、伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）に対する相補配列（Ｃｃ）および相補配列（Ｂｃ）を有する。また、第２プライマーによる伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）は、５’末端に、配列（Ｃ）および配列（Ｂ）を有するとともに、３’末端に、伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）に対する相補配列（Ａｃ）および相補配列（Ｃｃ）を有する。
そして、図３（ｄ）に示すように、第１プライマーから得られた伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）と、第２プライマーから得られた伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）とは、それぞれ、配列（Ｃ）と配列（Ｃｃ）とがハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）の前記ステムループ構造において、標的部位（Ｓ’）は、ループ領域に位置する。このため、第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）に対して、標的部位（Ｓ’）を含む領域にハイブリダイズするプローブを使用すれば、前記ループ領域に、前記プローブを特異的にハイブリダイズできる。前記ステムループ構造におけるステム領域は、二本鎖であるため、仮に、この領域に前記プライマー、プローブ、もしくは増幅産物と相補的な配列が存在しても、これらのハイブリダイズは阻害される。また、第１プライマー伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）も、一本鎖のループ領域を有するが、その配列は、前記プローブと同じ配列となるため、前記プローブはハイブリダイズしない。
さらに、本実施形態の第３のプライマーセットによると、図３（ｄ）に示すように、第１プライマー伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）は、その５’末端に、一本鎖の配列（Ａ）を有している。本実施形態によれば、第１プライマー伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）は、５’側の配列（Ａ）が一本鎖であるため、例えば、これを鋳型として、配列（Ｃｃ）から伸長が起きる場合がある。この伸長により、第１プライマー伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）における配列（Ａ）は、二本鎖を形成することになるため、さらに、前記プライマー、プローブ、もしくは増幅産物による非特異的なハイブリダイズを抑制することができる。
第１プライマーにおいて、配列（Ａ）の長さは、例えば、１８〜３０塩基長である。
（実施形態４）
本発明の第４のプライマーセットは、前記条件（１）を満たすプライマーセットである。図４に、前記第４のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合における、増幅の作用機序を、模式的に示す。なお、実施形態４は、前記実施形態３におけるプローブの標的部位を(Ｓ’)に代えて（Ｓ）に変更したものである。
本発明の第４のプライマーセットは、前記条件（１）を満たすプライマーセットである。図４に、前記第４のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合における、増幅の作用機序を、模式的に示す。なお、実施形態４は、前記実施形態３におけるプローブの標的部位を(Ｓ’)に代えて（Ｓ）に変更したものである。
図４（ａ）に示すように、第１プライマーは、３’側の配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列であり、５’側の配列（Ｃ）が、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の３’側の配列に非相補的な配列であり、且つ、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の５’側配列（Ｃｃ）の相補配列である。第２プライマーは、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ）からなる。
この第４のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、まず、図４（ａ）に示すように、第１プライマーは、その配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）の配列（Ａｃ）にハイブリダイズし、第２プライマーは、その配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする。そして、図４（ｂ）に示すように、第１プライマーおよび第２プライマーから、それぞれ、伸長鎖が形成される。第１プライマーの伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）は、その５’側に、第１プライマーの５’末端に由来する配列（Ｃ）を有し、他方、第２プライマーの伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）も、その５’末端に、第２プライマーの５’末端に由来する配列（Ｂ）と、配列（Ｃｃ）に対する相補配列（Ｃ）を有する。
さらに、伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）が、新たな鋳型となって、第１プライマーがハイブリダイズし、さらに伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）が形成され、伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）が、新たな鋳型となって、第２プライマーがハイブリダイズし、さらに伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）が形成される。ここで、図４（ｃ）に示すように、第１プライマーによる伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）は、５’末端に、配列（Ｃ）および配列（Ａ）を有するとともに、３’末端に、伸長鎖（Ｐ２Ｅ１）に対する相補配列（Ｂｃ）および相補配列（Ｃｃ）を有する。また、第２プライマーによる伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）も、５’末端に、配列（Ｂ）および配列（Ｃ）を有するとともに、３’末端に、伸長鎖（Ｐ１Ｅ１）に対する相補配列（Ｃｃ）および相補配列（Ａｃ）を有する。
そして、図４（ｄ）に示すように、第１プライマーから得られた伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）と、第２プライマーから得られた伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）とは、それぞれ、配列（Ｃ）と配列（Ｃｃ）とがハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）の前記ステムループ構造において、標的部位（Ｓ’）は、ループ領域に位置する。このため、第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）に対して、標的部位（Ｓ’）を含む領域にハイブリダイズするプローブを使用すれば、前記ループ領域に、前記プローブを特異的にハイブリダイズできる。前記ステムループ構造におけるステム領域は、二本鎖であるため、仮に、この領域に前記プライマー、プローブ、もしくは増幅産物と相補的な配列が存在しても、これらのハイブリダイズは阻害される。また、第１プライマー伸長鎖（Ｐ１Ｅ２）も、一本鎖のループ領域を有するが、その配列は、前記プローブと同じ配列となるため、前記プローブはハイブリダイズしない。
さらに、本実施形態の第４のプライマーセットによると、図４（ｄ）に示すように、第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）は、その５’末端に、一本鎖の配列（Ｂ）を有している。第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）のループ領域に前記プローブをハイブリダイズさせる場合、そのステムループ構造は、より安定であることが好ましい。本実施形態によれば、第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）は、５’側の配列（Ｂ）が一本鎖であるため、例えば、これを鋳型として、配列（Ｃｃ）から伸長が起きる場合がある。この伸長により、第２プライマー伸長鎖（Ｐ２Ｅ２）における配列（Ｂ）は、二本鎖を形成することになるため、さらに、構造が安定化する。
第２プライマーにおいて、配列（Ｂ）の長さは、例えば、１８〜３０塩基長である。
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオチド三リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。
また、前記プライマーには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
＜核酸増幅方法＞
本発明の核酸増幅方法は、前述のように、標的配列と、前記標的配列に相補的な標的相補配列とを含む鋳型の存在下、前記本発明のプライマーセットにより、ＰＣＲを行うことを特徴とする。本発明の核酸増幅方法は、前記本発明のプライマーセットを使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、何ら制限されない。
本発明の核酸増幅方法は、前述のように、標的配列と、前記標的配列に相補的な標的相補配列とを含む鋳型の存在下、前記本発明のプライマーセットにより、ＰＣＲを行うことを特徴とする。本発明の核酸増幅方法は、前記本発明のプライマーセットを使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、何ら制限されない。
＜変異検出方法＞
本発明の変異検出方法は、前述のように、標的配列と、前記標的配列に相補的な標的相補配列とを含む鋳型の存在下、前記本発明の核酸増幅方法により、核酸増幅を行う増幅工程と、前記増幅工程により得られた増幅産物と、プローブとを用いて、前記標的配列における標的部位の変異の有無を分析する分析工程とを含み、前記プローブは、前記標的配列における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズするプローブであることを特徴とする。本発明の変異検出方法は、前記本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅を利用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、何ら制限されない。
本発明の変異検出方法は、前述のように、標的配列と、前記標的配列に相補的な標的相補配列とを含む鋳型の存在下、前記本発明の核酸増幅方法により、核酸増幅を行う増幅工程と、前記増幅工程により得られた増幅産物と、プローブとを用いて、前記標的配列における標的部位の変異の有無を分析する分析工程とを含み、前記プローブは、前記標的配列における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズするプローブであることを特徴とする。本発明の変異検出方法は、前記本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅を利用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、何ら制限されない。
前記分析工程の方法は、特に制限されず、例えば、融解曲線解析があげられる。前記融解曲線解析は、例えば、まず、ＰＣＲによって得られた増幅産物と前記プローブとを含む反応液を加熱して、二本鎖を解離させ、つぎに、プローブがハイブリダイズする温度にまで降温させ、さらに、温度の上昇（例えば、３０℃〜９５℃）に伴う、前記プローブの解離を検出する方法である。本発明のプライマーセットを用いて得られた増幅産物は、その一部が、例えば、前記プローブがハイブリダイズする温度条件において、前述のようにステムループ構造をとり、そのループ領域に、前記プローブがハイブリダイズする。
本発明において、前記プローブの種類は、何ら制限されず、本発明のプライマーセットを用いて得られた増幅産物に対して、前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブであればよい。
前記プローブは、例えば、シグナル発生物質が結合した標識化プローブ（フルオロジェニックプローブともいう）があげられる。前記シグナル物質は、例えば、前記増幅産物へのハイブリダイズによって、シグナルを発するものでもよいし、前記増幅産物からの解離によって、シグナルを発するものでもよい。前記標識化プローブの種類は、特に制限されず、例えば、いわゆるＥＰｒｏｂｅ（登録商標）、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）等が使用できる。これらは蛍光を発することから、本発明のプライマーセットは、これらのプローブと組合せて使用する場合、蛍光プローブ用プライマーセットということもできる。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
［実施例１］
実施形態１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、標的配列の検出を行った。
実施形態１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、標的配列の検出を行った。
（１）鋳型
鋳型は、市販の人工合成遺伝子（野生型配列、ユーロフィンジェノミクス株式会社製）を使用した。また、コントロールは、前記鋳型に代えて、ヌクレアーゼフリー水使用した。
鋳型は、市販の人工合成遺伝子（野生型配列、ユーロフィンジェノミクス株式会社製）を使用した。また、コントロールは、前記鋳型に代えて、ヌクレアーゼフリー水使用した。
（２）プライマーセット
実施例１のプライマーセットとして、下記ＦプライマーおよびＲプライマーを使用した。前記Ｆプライマーおよび前記Ｒプライマーについて、図１（ａ）における配列（Ｃ）を、下記配列において下線部で示した。
実施例１のプライマーセットとして、下記ＦプライマーおよびＲプライマーを使用した。前記Ｆプライマーおよび前記Ｒプライマーについて、図１（ａ）における配列（Ｃ）を、下記配列において下線部で示した。
実施例１ プライマーセット
Ｆプライマー（配列番号１）
5'-CGAATGTCTCCGTGGTGGACTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTC-3'
Ｒプライマー（配列番号２）
5'-CGAATGTCTCCGTGGTGGACAAAGCCAGCTACCAAACTGTATACAGCAT-3'
Ｆプライマー（配列番号１）
5'-CGAATGTCTCCGTGGTGGACTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTC-3'
Ｒプライマー（配列番号２）
5'-CGAATGTCTCCGTGGTGGACAAAGCCAGCTACCAAACTGTATACAGCAT-3'
また、比較例１のプライマーセットとして、下記ＦプライマーおよびＲプライマーを使用した。比較例１のＦプライマーとＲプライマーは、実施例１のプライマーセットにおける下線部の配列を有さない以外は、同じ配列である。
比較例１ プライマーセット
Ｆプライマー（配列番号３）
5'-TGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTC-3'
Ｒプライマー（配列番号４）
5'-AAAGCCAGCTACCAAACTGTATACAGCAT-3'
Ｆプライマー（配列番号３）
5'-TGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTC-3'
Ｒプライマー（配列番号４）
5'-AAAGCCAGCTACCAAACTGTATACAGCAT-3'
（３）ＰＣＲ反応および融解曲線解析
下記組成の反応液を調製して、ＰＣＲおよび融解曲線解析を行った。ＰＣＲおよび融解曲線解析は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用し、添付のプロトコルに従って行った。前記プローブは、標的配列と結合して二本鎖を形成すると、蛍光を発するＥｐｒｏｂｅ（登録商標）を使用した。前記Ｅｐｒｏｂｅは、下記配列において、小文字で示したチミン塩基に２つの蛍光色素が結合している。前記反応液において、緩衝液は、Ｅ−Ｔａｑ ２ｘＰＣＲ Ｍｉｘ（株式会社ダナフォーム製）を使用した。
下記組成の反応液を調製して、ＰＣＲおよび融解曲線解析を行った。ＰＣＲおよび融解曲線解析は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用し、添付のプロトコルに従って行った。前記プローブは、標的配列と結合して二本鎖を形成すると、蛍光を発するＥｐｒｏｂｅ（登録商標）を使用した。前記Ｅｐｒｏｂｅは、下記配列において、小文字で示したチミン塩基に２つの蛍光色素が結合している。前記反応液において、緩衝液は、Ｅ−Ｔａｑ ２ｘＰＣＲ Ｍｉｘ（株式会社ダナフォーム製）を使用した。
（反応液の組成）
終濃度
Ｆプライマー ０．５ｍｏｌ／Ｌ
Ｒプライマー ０．５ｍｏｌ／Ｌ
プローブ ０．４ｍｏｌ／Ｌ
Ｅ−Ｔａｑ ２ｘＰＣＲ Ｍｉｘ １ｘ
ヌクレアーゼフリー水 残部
終濃度
Ｆプライマー ０．５ｍｏｌ／Ｌ
Ｒプライマー ０．５ｍｏｌ／Ｌ
プローブ ０．４ｍｏｌ／Ｌ
Ｅ−Ｔａｑ ２ｘＰＣＲ Ｍｉｘ １ｘ
ヌクレアーゼフリー水 残部
プローブ（配列番号５）
5'-AATTTGGGtGACATTGC-3'
5'-AATTTGGGtGACATTGC-3'
これらの結果を、図５に示す。図５において、（Ａ）は、ＰＣＲの最終サイクルにおける蛍光強度を示すグラフであり、（Ｂ）は、融解曲線の初期蛍光強度を示すグラフである。図５（Ａ）および（Ｂ）において、左のバーが、比較例１のプライマーセットを使用した結果であり、右のバーが、実施例１のプライマーセットを使用した結果である。
図５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、実施例１のプライマーセットを用いた結果、比較例１のプライマーセットを用いた場合と比較して、極めて高い蛍光強度が得られた。実施例１のプライマーセットおよび比較例１のプライマーセットは、いずれも、鋳型に対するハイブリダイズする領域が同じであり、また、融解曲線において使用しているプローブも同じものであり。これに対して、図５に示すように、実施例１においては、蛍光強度が著しく向上していることから、実施例１のプライマーセットによれば、前記プローブが特異的にハイブリダイズできる増幅産物が、より効率よく得られたと言える。
［実施例２］
実施形態４のプライマーセットを用いた以外は、前記実施例１と同様にして、標的配列の検出を行った。
実施形態４のプライマーセットを用いた以外は、前記実施例１と同様にして、標的配列の検出を行った。
実施例２のプライマーセットとして、下記ＦプライマーおよびＲプライマーを使用した。前記Ｆプライマーについて、図４（ａ）における配列（Ｃ）を、下記配列において下線部で示した。
実施例２ プライマーセット
Ｆプライマー（配列番号６）
5'-AGCTACCAAACTGTATACAGCATGTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTC-3'
Ｒプライマー（配列番号７）
5'-AGCTCTTGTCATTTGCCTTTACTATCC-3'
Ｆプライマー（配列番号６）
5'-AGCTACCAAACTGTATACAGCATGTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTC-3'
Ｒプライマー（配列番号７）
5'-AGCTCTTGTCATTTGCCTTTACTATCC-3'
また、比較例２のプライマーセットとして、下記ＦプライマーおよびＲプライマー１を使用した。比較例２のＦプライマーとＲプライマーは、実施例２のプライマーセットにおける下線部の配列を有さない以外は、同じ配列である。
比較例２ プライマーセット
Ｆプライマー（配列番号８）
5'-TGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTC-3'
Ｒプライマー（配列番号９）
5'-AGCTCTTGTCATTTGCCTTTACTATCC-3'
Ｆプライマー（配列番号８）
5'-TGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTC-3'
Ｒプライマー（配列番号９）
5'-AGCTCTTGTCATTTGCCTTTACTATCC-3'
これらの結果を図６に示す。図６において、（Ａ）は、ＰＣＲの最終サイクルにおける蛍光強度を示すグラフであり、（Ｂ）は、融解曲線の初期蛍光強度を示すグラフである。図６（Ａ）および（Ｂ）において、左のバーが、比較例２のプライマーセットを使用した結果であり、右のバーが、実施例２のプライマーセットを使用した結果である。
図６（Ａ）および（Ｂ）に示すように、実施例２のプライマーセットを用いた結果、比較例２のプライマーセットを用いた場合と比較して、極めて高い蛍光強度が得られた。実施例２のプライマーセットおよび比較例２のプライマーセットは、いずれも、鋳型に対するハイブリダイズする領域が同じであり、また、融解曲線において使用しているプローブも同じものである。これに対して、図６に示すように、実施例２においては、蛍光強度が著しく向上していることから、実施例２のプライマーセットによれば、前記プローブが特異的にハイブリダイズできる増幅産物が、より効率よく得られたと言える。
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
本発明のプライマーセットにより得られる増幅産物は、自己アニーリングによりステムループ構造を形成する。そして、ステムループ構造の中でも、一本鎖の状態であるループ領域に、前記標的配列が位置するように、前記プライマーセットは設計されている。このため、前記ステムループ構造のループ領域に、前記プローブが効率良くハイブリダイズできる。また、前記ステムループ構造をとることによって、ループ領域以外、すなわちステム領域は二本鎖の状態であるため、前記プライマー、プローブ、もしくは増幅産物によるハイブリダイズも抑制される。したがって、本発明によれば、前記プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制し、前記プローブを用いた分析の精度を向上することができる。
Claims (7)
- 標的配列（Ｘ’）に対する第１プライマーと、標的配列（Ｘ’）に相補な標的相補配列（Ｘ）に対する第２プライマーとを含み、
前記第１プライマーは、
標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
前記第２プライマーは、
標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするプライマーであり、
下記条件（１）および条件（２）の少なくとも一方を満たすことを特徴とするＰＣＲ用プライマーセット。
条件（１）
前記第１プライマーは、
３’側の配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第１プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ’）の相補部位（Ｓ）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。
条件（２）
前記第２プライマーは、
３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、前記第２プライマーからの伸長鎖において、標的部位（Ｓ）の相補部位（Ｓ’）よりも３’側の配列にハイブリダイズする配列である。 - 前記第１プライマーは、
３’側の配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列（Ｃ）が、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の３’側の配列に非相補的であり、
前記第２プライマーは、
３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列（Ｃ）が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的であり、
前記第１プライマーの配列（Ｃ）と、前記第２プライマーの配列（Ｃ）とが、同じ配列である、請求項１記載のＰＣＲ用プライマーセット。 - 前記第１プライマーは、
標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列（Ａ）からなり、
前記第２プライマーは、
３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列（Ａ）が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的であり、
前記第１プライマーの配列（Ａ）と、前記第２プライマーの配列（Ａ）とが、同じ配列である、請求項１記載のＰＣＲ用プライマーセット。 - 前記第１プライマーは、
標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列（Ａ）からなり、
前記第２プライマーは、
３’側の配列（Ｂ）が、標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列（Ｃ）が、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、標的配列（Ｘ’）における配列（Ａｃ）の５’側配列（Ｃｃ）の相補配列（Ｃ）である、または、
前記第１プライマーは、
３’側の配列（Ａ）が、標的配列（Ｘ’）における標的部位（Ｓ’）よりも３’側の配列（Ａｃ）にハイブリダイズする配列であり、
５’側の配列（Ｃ）が、標的配列（Ｘ’）における前記配列（Ａｃ）の３’側の配列に非相補的であり、且つ、標的相補配列（Ｘ）における配列（Ｂｃ）の５’側配列（Ｃｃ）の相補配列であり、
前記第２プライマーは、
標的相補配列（Ｘ）における標的部位（Ｓ）よりも３’側の配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ）からなる、請求項１記載のＰＣＲ用プライマーセット。 - 標的配列と、前記標的配列に相補的な標的相補配列とを含む鋳型の存在下、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーセットにより、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法。
- 標的配列と、前記標的配列に相補的な標的相補配列とを含む鋳型の存在下、請求項５記載の核酸増幅方法により、核酸増幅を行う増幅工程と、
前記増幅工程により得られた増幅産物と、プローブとを用いて、前記標的配列における標的部位の変異の有無を分析する分析工程とを含み、
前記プローブは、前記標的配列における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズするプローブであることを特徴とする変異の分析方法。 - 前記分析工程が、融解曲線解析による分析である、請求項６記載の分析方法。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023248310A1 (ja) * | 2022-06-20 | 2023-12-28 | 株式会社日立ハイテク | プライマー、ｄｎａ検出方法およびｄｎａ検出キット |
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2017
- 2017-12-28 JP JP2017254811A patent/JP2019118294A/ja active Pending
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