WO2004022743A1 - 多型配列部位を有する核酸の識別方法 - Google Patents

多型配列部位を有する核酸の識別方法 Download PDF

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WO2004022743A1
WO2004022743A1 PCT/JP2003/011377 JP0311377W WO2004022743A1 WO 2004022743 A1 WO2004022743 A1 WO 2004022743A1 JP 0311377 W JP0311377 W JP 0311377W WO 2004022743 A1 WO2004022743 A1 WO 2004022743A1
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nucleic acid
sequence
oligonucleotide
target nucleic
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PCT/JP2003/011377
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Inventor
Akio Yamane
Original Assignee
Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid identification method capable of detecting a difference in nucleic acid sequence, for example, a difference in one base in a nucleic acid sequence with high accuracy.
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • the most appropriate drug is selected and administered to the patient by analyzing the gene of the patient in advance.
  • the significance of genetic diagnosis is increasing rapidly not only for single-gene diseases but also for multifactorial diseases.
  • genetic diagnosis of pathogenic bacteria and viruses, which are foreign factors, will surely increase in the future. It is expected that.
  • the target gene fragment is scarcely contained in the sample. In this case, it is necessary to pre-amplify the target gene by some method.
  • An example of such a gene amplification method is a PCR (polymerase chain reaction) method.
  • detecting a single base difference in a target gene requires two steps: a gene amplification step and a step for examining the single base difference in the amplified gene (Ahmadian et. al., Biotechniques 32, 1122-1137 (2002)).
  • a method that requires a two-step process requires complicated processes because of the multiple steps.
  • the Taqtnan method using a fluorescent dye and a quencher probe Lik et. Al., PCR Methods Appl.
  • This method utilizes the fact that the extension reaction occurs or does not occur depending on whether or not the 3 'end of the primer is complementary to type III in the extension reaction of DNA polymerase.
  • a primer is designed so that a base for discriminating one base is located at the 3 'end of one of the primers in the PCR reaction, the elongation will occur if type ⁇ ⁇ is completely complementary to the primer.
  • a reaction occurs, causing an amplification reaction with the other primer.
  • this method is susceptible to the reaction depending on the reaction conditions, for example, the amount of type I, the temperature, the amount of the primer, or the concentration of the reaction substrate dNTP. For this reason, it is not easy to always obtain reproducible data.
  • the type of base to be identified that is, the type of base at or around the 3 'end of the primer, greatly affects the identification performance of this method (Ayyassia et. Al., Anal. Biochem. 284, 11 -18 (2000)), and it may be difficult to identify some sequences.
  • the present inventor has recently carried out an extension reaction of a strand displacement primer using a primer having a base sequence arranged so that a polymorphic sequence can be identified at a terminal end, and can identify one base in a target nucleic acid.
  • a primer having a base sequence arranged so that a polymorphic sequence can be identified at a terminal end and can identify one base in a target nucleic acid.
  • the ability to discriminate one base at the polymorphic site can be dramatically improved by using an oligonucleotide having no primer function in addition to the primer.
  • the present invention is based on such knowledge.
  • the present invention relates to a method for identifying a nucleic acid having a polymorphic sequence site, wherein even a small amount of a sample can quickly and easily detect a single nucleotide difference in the nucleic acid contained therein, and It is an object of the present invention to provide a method excellent in detection accuracy.
  • the method for identifying a nucleic acid having a polymorphic sequence site is a method for identifying whether or not a polymorphic sequence site has a desired base sequence in a nucleic acid having a polymorphic sequence site,
  • a method comprising: hybridizing the following (1) and (2) to a target nucleic acid having a polymorphic sequence site and placing them under reaction conditions under which a primer strand displacement extension reaction can proceed:
  • a discriminating primer (where the discriminating primer has a base sequence for discriminating a polymorphic sequence at its 3′-end), and.
  • the kit for identifying a nucleic acid having a polymorphic sequence site is a kit for identifying whether a polymorphic sequence site has a desired base sequence in a nucleic acid having the polymorphic sequence site.
  • a kit comprising the following (A) and (B):
  • a discriminating primer here, this discriminating primer has a base sequence for discriminating a polymorphic sequence at its 3 ′ terminal portion
  • oligonucleotide having no primer function (here, this oligonucleotide is entirely or partially complementary to the 5′-side region of the target nucleic acid, compared to the discriminating primer).
  • the method or kit of the present invention it is possible to quickly and easily identify whether or not a target nucleic acid is of any poly'type sequence.
  • This method or kit has much higher polymorphism discrimination accuracy than a conventional method using only primers having a base sequence for discriminating a polymorphic sequence at the 3 ′ end.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the positional relationship between a discriminating primer and an oligonucleotide having no primer function in the present invention.
  • (a), (d) and (e) show the case where the sequence of the discriminating primer and the oligonucleotide overlap, and (b) shows the case where the sequence of the discriminating primer and the oligonucleotide are continuous.
  • (C) is the case where the sequences of the discriminating primer and the oligonucleotide are arranged apart from each other.
  • FIG. 2 is a diagram showing a positional relationship between a discriminating primer and the oligonucleotide in Example.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of Example 1.
  • a and T in the column of type III represent the type of base at the polymorphic sequence site on the type III sequence.
  • the column of primers indicates the type of primer used, and the column of DEO indicates the type of oligonucleotides having no used primer function.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of Example 2.
  • a and T in the column of type III represent the type of base at the polymorphic sequence site on the type III sequence.
  • the column of primers indicates the type of primer used, and the column of DE ⁇ indicates the type of oligonucleotide having no used primer function.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of Example 3.
  • a and T in the ⁇ type column are ⁇ Indicates the type of base at the polymorphic sequence site on the type sequence.
  • the column of primers indicates the type of primer used, and the symbol of DEO indicates the type of oligonucleotide having no used primer function.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of Example 4.
  • a and T in the column of type III represent the type of base at the polymorphic sequence site on the type III sequence.
  • the column of primers indicates the type of primer used, and the column of DEO indicates the type of oligonucleotides having no used primer function.
  • the present invention is a method for identifying whether a polymorphic sequence site has a desired base sequence in a nucleic acid having the polymorphic sequence site.
  • nucleic acid may be either DNA or RNA, and may be single-stranded or double-stranded. Further, the nucleic acid that can be identified by the method of the present invention is not limited by its origin. Therefore, the present invention relates to nucleic acids derived from eukaryotes, prokaryotes, and viruses, as well as those synthesized. Is also applicable. .
  • target nucleic acid may be the target nucleic acid itself desired to be identified by the method of the present invention, or may be a complementary strand of the target nucleic acid.
  • polymorphic sequence site means a portion where a nucleotide sequence of a different portion on a sequence existing between nucleic acids or a nucleotide sequence of a mutated portion on a nucleic acid sequence caused by a point mutation can exist. I do. That is, the “polymorphic sequence site” means a site where substitution, deletion, or insertion of one or more bases has occurred with respect to a reference base sequence. Therefore, according to the identification method of the present invention, a nucleic acid having such a polymorphic site as a desired base sequence can be distinguished from a nucleic acid having a polymorphic site having no such base sequence. '
  • the “desired base sequence” refers to a base sequence corresponding to a polymorphic sequence site that may exist in a nucleic acid sequence, and is a target base sequence for identification by the identification method of the present invention. Means Such a base sequence may be used for identification purposes, for example, It can be appropriately selected according to the disease or the type of animal to be identified.
  • the method for identifying a nucleic acid having a polymorphic sequence site uses at least an identification primer and an oligonucleotide having no primer function, and hybridizes these with a target nucleic acid. And placing them under reaction conditions under which the primer strand displacement extension reaction can proceed.
  • the “identification primer” has a primer ability for a target nucleic acid and has at least a nucleotide sequence for identifying a polymorphic sequence at its 3 ′ terminal.
  • the “3′-end portion” in the identification primer does not necessarily mean only the 3′-most end of the primer, but only a few bases from the 3′-end and is located upstream of the primer. Is also good.
  • the number of bases from the 3 'most terminal is 1 to 5 bases, including the most terminal base, more preferably 1 to 3 bases, and most preferably 1 to 2 bases. .
  • base sequence for polymorphism sequence discrimination refers to a base sequence present in a discriminating primer capable of discriminating a polymorphism sequence site present in a target nucleic acid.
  • the “base sequence for identifying a polymorphic sequence” can be complementary or non-complementary to a polymorphic sequence site in a target nucleic acid when the site is a desired base sequence.
  • the number of polymorphic sequence discriminating bases present in the discriminating primer can be 2 to several, but may be one. In general, when the number of the bases is two or more, discrimination of the polymorphic sequence by the primer is extremely easy, but when the number of the bases is one, the discrimination is not easy. According to the present invention, even when the number of bases is one, it is possible to easily identify a polymorphic sequence.
  • the identification primer when the base for identifying the polymorphic sequence of the identification primer is complementary to the base sequence at the polymorphic sequence site of the target nucleic acid, primer extension occurs by the primer strand displacement extension reaction. If the nucleotide sequence for identifying the polymorphic sequence is not complementary to the nucleotide sequence at the polymorphic sequence site of the target nucleic acid, the primer is designed so that the primer strand displacement extension reaction does not occur. If the nucleotide sequence for polymorphism sequence identification is complementary to the nucleotide sequence at the polymorphic sequence site of the target nucleic acid, a primer strand displacement extension reaction by the identification primer occurs, and the primer is extended and extended.
  • a reaction product that is, a nucleic acid complementary to the target nucleic acid can be formed.
  • the nucleotide sequence for discriminating the polymorphic sequence is not complementary to the nucleotide sequence at the polymorphic sequence site of the target nucleic acid, the strand displacement extension reaction by this primer is inhibited, and the primer is hardly extended. For this reason, almost no elongation reaction product is generated.
  • the elongation reaction of the primer slightly progressed. For this reason, the accuracy of the conventional identification method was not always high.
  • the accuracy of the progress of the extension reaction has been drastically improved.
  • the primer extension reaction can proceed by displacing the oligonucleotide having no primer function bound downstream.
  • the primer extension reaction hardly occurs.
  • the present invention makes use of such a phenomenon, and makes it possible to identify a nucleic acid having a polymorphic sequence site with extremely high accuracy by detecting the obtained extension product.
  • the identification primer of the present invention may be complementary to the entire region in the direction of the 3 ′ end of the target nucleic acid from the polymorphic sequence site of the target nucleic acid. May also be complementary to a shorter region.
  • the chain length of the identification primer of the present invention can be appropriately selected according to the chain length of the target nucleic acid to be applied, but is typically 6 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases. 1377
  • the identification primer according to the present invention can be synthesized according to a conventional method.
  • the identification primer according to the present invention can be obtained by selecting so as to be complementary to a region 3 ′ of the target nucleic acid from the polymorphic sequence site in the target nucleic acid.
  • the nucleotide sequence for polymorphism sequence identification present in the identification primer can be appropriately selected according to the nucleotide sequence desired to be identified. Oligonucleotides without primer function
  • the “oligonucleotide having no primer function” needs to be more complementary to the region on the fifth side of the target nucleic acid than the discriminating primer.
  • the oligonucleotide is complementary to the target nucleic acid in a region downstream of the discriminating primer.
  • the position where the oligonucleotide having no primer function is complementary to the target nucleic acid is not particularly limited as long as it is downstream from the position where the discriminating primer is complementary to the target nucleic acid. For this reason,
  • the oligonucleotide has a sequence such that the 5 'end of the oligonucleotide can overlap with (or overlap with) the 3' end of the discriminating primer with respect to the target nucleic acid; (See Figure 1 (a)),
  • the oligonucleotide may have a sequence in which the five-terminal portion can be positioned with respect to the target nucleic acid such that the five-terminal portion is located continuously to the three-terminal portion of the discriminating primer (FIG. 1). (b)), and
  • the oligonucleotide may have a sequence in which the 5 ′ end portion can be located away from the 3 ′ end portion of the discriminating primer with respect to the target nucleic acid (see FIG. 1 ( c))).
  • the primer and the oligonucleotide having no primer function form a phase capture with the target nucleic acid
  • the 3 ′ end of the primer and the 5 ′ end of the oligonucleotide are located on the target nucleic acid.
  • the "overlapping" portion of the 5'-terminal portion of the oligonucleotide does not necessarily have to be completely complementary to the target nucleic acid. Shall be included. Therefore, according to another preferred embodiment of the present invention, the oligonucleotide having no primer function may have a base that is non-complementary to the target nucleic acid at the 5 ′ end. In this case, the number of bases that are non-complementary to the target nucleic acid that may be present at the 5′-terminal portion of the oligonucleotide having no primer function is, for example, 1 to 15, and preferably 1 to 5 . Similarly, the "overlapping" portion of the 3 'end of the discriminating primer need not be completely complementary to the target nucleic acid, and in such a situation,
  • the identification primer may have a base that is non-complementary to the target nucleic acid at the 3 ′ end.
  • the “overlapping” portion of the 3 ′ end portion of the identification primer may or may not contain a nucleotide sequence for identifying a polymorphic sequence.
  • the base sequence for identifying the polymorphic sequence may not be the most terminal base at the 3 ′ end.
  • the 5'-terminal portion of the oligonucleotide having no primer function may overlap only with the nucleotide sequence located at the 3'-terminal side of the nucleotide sequence for identifying the polymorphic sequence in the identification primer, It may overlap with a sequence containing a nucleotide sequence for discriminating a polymorphic sequence and a nucleotide sequence in a region further 5 ′ to the nucleotide sequence.
  • overlapping means that the 3 ′ end of the discriminating primer and the 5 ′ end of the oligonucleotide having no primer function are both complementary to the target nucleic acid. This includes both cases where one or both are not complementary to the target nucleic acid and a non-complementary base is present at a position where the originally complementary base exists. Examples of the "overlapping" case include, in addition to the case (a) described above, the following cases (d) and (e):
  • the 5'-end portion of the oligonucleotide having no primer function does not have to have a sequence that can be adopted for the target nucleic acid such that the 5'-end portion of the identification primer overlaps with the 3'-end portion of the identification primer.
  • the 5 ′ terminal portion of the oligonucleotide is complementary to the target nucleic acid (see FIG. 1 (e)).
  • the 3 ′ terminal portion of the discriminating primer need not be complementary to the target nucleic acid.
  • the 5′-terminal portion of the oligonucleotide is a sequence that can be arranged to overlap with (or overlap with) the 3′-terminal portion of the identification primer with respect to the target nucleic acid.
  • the oligonucleotide has a sequence such that the 5 ′ terminal portion of the oligonucleotide can be arranged with respect to the target nucleic acid so that the 5 ′ terminal portion of the identification primer is located continuously to the 3 ′ terminal portion of the identification primer.
  • the number of bases in the overlapping portion is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3. Individual.
  • the oligonucleotide having no primer function in the oligonucleotide having no primer function, all the bases constituting the oligonucleotide need not be completely complementary to the target nucleic acid, and some of the bases are not complementary. You may. In such a case, the proportion of bases that are not complementary to the target nucleic acid contained in the oligonucleotide is such that the oligonucleotide specifically binds to the target nucleic acid, and the binding to the target nucleic acid in the strand displacement extension reaction of the present invention. It is desirable that it can be maintained.
  • the “oligonucleotide having no primer function” is not particularly limited as long as it does not have a function as a primer, and may be a deoxyribooligonucleotide or a ribooligonucleotide. Well, also it These may be chimeras.
  • the oligonucleotide may contain a modified base or may contain a non-natural nucleic acid structure (for example, a non-natural modified base or a non-natural sugar moiety structure).
  • PNAs based on different backbones can also be used as the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide having no primer function has a melting temperature of the binding between the oligonucleotide having no primer function and the target nucleic acid between the discriminating primer and the target nucleic acid. It is higher than the melting temperature of the bond.
  • the melting temperature of the binding between the oligonucleotide having no primer function and the target nucleic acid can be about 1 to 15 ° C. higher than the melting temperature of the binding between the discriminating primer and the target nucleic acid.
  • the oligonucleotide has such a melting temperature, when an elongation reaction occurs with the discriminating primer, the oligonucleotide having no primer function is surely bound to the target nucleic acid. As a result, when there is a mismatch between the base sequence for discriminating the polymorphic sequence at the 3 'end of the discriminating primer and the polymorphic sequence site of the target nucleic acid, the extension reaction of the primer is more inhibited. It becomes.
  • the oligonucleotide having no primer function can be appropriately selected according to the sequence of the target nucleic acid whose identification is desired.
  • An oligonucleotide having no primer function may be synthesized, for example, according to a conventional method, or may be obtained by separately preparing a nucleic acid sequence desired to be identified and optionally cutting it.
  • a conventional method for example, a method described in US Pat. No. 5,849,497
  • a conventional method for example, a method described in US Pat. No. 5,849,497
  • the hydroxyl group of the nucleoside at the 3 ′ end of the oligonucleotide obtained by synthesis or the like may be modified with an arbitrary protecting group (for example, a phosphate group), or a base not complementary to the target nucleic acid at the 3 ′ end. Even if a DNA is introduced, it is possible to prevent the oligonucleotide from having a primer function.
  • the oligonucleotide having no primer function is obtained by modifying the hydroxyl group of the 3, terminal nucleoside with a phosphate group. 7
  • the oligonucleotide having no primer function may have a base that is non-complementary to the target nucleic acid at the 3 ′ end.
  • the number of bases non-complementary to the target nucleic acid that may be present at the 3'-terminal portion of the oligonucleotide having no primer function is, for example, 1 to 30, preferably 3 to 10 It is.
  • the chain length of the oligonucleotide having no primer function can be appropriately selected depending on the chain length of the target nucleic acid to be applied, but is preferably composed of at least 10 base groups or more, and is preferable.
  • the base is 15 to 50 bases, and more preferably 25 to 35 bases.
  • the amount of the oligonucleotide having no primer function used in the present invention can be appropriately selected according to the amount of the target nucleic acid, but when the discriminating primer is completely complementary to the target nucleic acid, It is desirable that the amount is such that it does not inhibit the elongation reaction and that it can bind to all target nucleic acids in the elongation reaction. In this case, the amount of the oligonucleotide is at least in excess of the amount of the target nucleic acid.
  • the amount of the oligonucleotide is 0.1 to 5 equivalents, more preferably 1 to 3 equivalents, and still more preferably 1 to 5 equivalents to the amount of the discriminating primer. ⁇ 1.5 equivalents.
  • the discriminating primer and the oligonucleotide having no primer function can be easily hybridized with the target nucleic acid by a conventional method, for example, by appropriately setting the temperature conditions by combining them. Can be performed.
  • the phrase "place under reaction conditions under which the primer strand displacement elongation reaction can proceed” refers to a reaction condition under which the primer strand displacement elongation reaction can proceed, for example, a temperature condition in the presence of a predetermined enzyme. This refers to placing a hybridized primer or the like in the presence of a substrate. Typical examples of such reaction conditions are: TJP2003 / 011377
  • suitable conditions can be appropriately changed depending on the target nucleic acid, primer, and the like.
  • temperature conditions and the like may be appropriately set according to the enzyme used.
  • the enzyme used here is preferably a complementary strand displacement type III-dependent nucleic acid synthase.
  • a reverse transcriptase can be used if the target nucleic acid is RNA
  • a DNA polymerase can be used if the target nucleic acid is DNA.
  • the DNA or RNA polymerase that can be used at this time has no 5, ⁇ 3 'exonuclease activity and does not have 3, ⁇ 5' exonuclease activity and has strand displacement activity. This is very important.
  • RNA polymerases include, for example, M-Mil V reverse transcriptase.
  • DNA polymerase from which such activity has been removed can be used as the DNA polymerase.
  • enzymes that can be used in the present invention include Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs), Stoffe fragment DNA polymerase (Applied Biosystems) and the like.
  • the method according to the present invention can be suitably applied to a method in which one base is identified by one extension reaction.
  • a method includes, for example, the single-base extension method (SBE method) (Syvanen, et. Al., Genomics, 8; 684-692 (1990)).
  • SBE method single-base extension method
  • a primer extension reaction is performed on DNA amplified by the PCR method.
  • whether the extension reaction proceeds depends on whether the three ends of the primer and the target nucleic acid obtained by PCR are completely complementary or not. Is used.
  • the SBE method is a widely used method, it is considered that a more excellent detection method can be constructed by combining it with the present invention.
  • the method according to the invention can be performed in combination with the SBE method.
  • the present invention is more effective when exponential amplification is performed in combination with a known gene amplification method, since the detection of an extension product becomes easy.
  • amplification methods include, for example, the PCR method (Polfs et. Al., PCR: Clinical Diagnostics and Research,
  • NASBA method Gabrielle et. Al., J. General. Microbiol. 139, 2423-2429 (1993)
  • TMA method Kacian et. Al., US Patent No. 5,399, No. 491
  • SDA method Walker et. Al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)
  • LAMP method Notomi et. Al., Ucleic Acids Res. 28, e63 (2000)
  • I CAN method Mukai et. Al., International Application WO00 / 56877.
  • the method according to the invention can be combined with any method that utilizes a primer extension reaction, whether non-isothermal or isothermal.
  • the method according to the present invention further comprises a step of amplifying an extension reaction product by a primer single-strand displacement extension reaction.
  • a nucleic acid amplification method selected from the PCR method, NASBA method, TMA method, SDA method, LAMP method, and ICAN method described above can be selected.
  • the method of the present invention further comprises a step of detecting the presence of an extension reaction product that can be generated by the primer strand displacement extension reaction. Therefore, for example, when an extension reaction product is detected, it can be determined that the polymorphic sequence site has a desired base sequence.
  • the presence of the extension reaction product can be detected by applying a general nucleic acid detection method.
  • the difference of one base is detected by identifying the incorporated mononucleotide using a fluorescently labeled mononucleotide triphosphate.
  • a fluorescently labeled mononucleotide triphosphate for example, by adding to a substance that emits fluorescence when an amplified product is obtained, a difference of one base can be easily detected depending on whether or not it emits fluorescence. can do.
  • a nucleic acid having a polymorphic sequence site which comprises the following (A) and (B), for identifying whether or not the polymorphic sequence site has a desired base sequence: Kit provided:
  • a discriminating primer here, this discriminating primer has a base sequence for discriminating a polymorphic sequence at its 3, terminal end
  • an oligonucleotide having no primer function (here, the oligonucleotide is entirely or partially complementary to the 5′-side region of the target nucleic acid compared to the discriminating primer).
  • the kit further comprises the following (C):
  • the kit further comprises a mononucleotide triphosphate which is a substrate for an extension reaction, and Z or a buffer suitable for an enzymatic reaction of the enzyme.
  • the mononucleotide triphosphates that are substrates of the extension reaction are usually amino acids.
  • dNTPs deoxynucleotide triphosphates
  • a buffer suitable for the enzyme reaction of the enzyme can be appropriately selected from known buffers depending on the enzyme used.
  • Oligonucleotides used in this example were synthesized using an ABI392 DNA automatic synthesizer (manufactured by Applied Biosystems). When phosphoric acid was introduced into the 3 ′ end of the oligonucleotide, 3′-phosphorylated CPG (Glenresearch) was used.
  • the primer extension reaction was performed by performing a PCR method.
  • Stoffel fragment DNA Polymerase (manufactured by Applied Biosystems) was used as a DNA polymerase
  • a thermal cycler 9700 manufactured by Roche Diagnostics was used as a reaction apparatus.
  • Amplification reaction product was 3 ° / reaction. Agarose electroswimming was performed, and this was confirmed by staining with a bromide chemist.
  • Oligonucleotides used ie, primers and oligonucleotides having no primer function, were as follows. In the following, the underlined part indicates the base corresponding to the position of A-aryl or T-aryl, and 3, the terminal p indicates phosphate.
  • Primer (identifying primer) (same chain as type II):
  • D EO— 1 A 5 'AGGAGAAGTCTGCCGTTACTGp (SEQ ID NO: 4)
  • D EO— 2 A 5 'AGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGp (SEQ ID NO: 5)
  • D EO-3 A 5 'GAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGp (SEQ ID NO: 6)
  • D EO-3 T 5 'GTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGp (SEQ ID NO: 9)
  • D EO-4 5 'GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCp (SEQ ID NO: 10) TJP2003 / 011377
  • Primer b GT (0.5 ⁇ ), primer ASP 6 (0.5 ⁇ ), and oligonucleotide without primer function (0. plus plasmid PBR322-] 3A (3 Ariru, 3 0 0 pg) or plasmid pBR322-
  • reaction solution containing each of the above components contains four types of deoxynucleotide triphosphates corresponding to A, G, T and C.
  • reaction buffer a buffer for Stoffel fragment DNA polymerase (manufactured by Applied Biosystems)
  • a DNA polymerase Stoffel fragment DNA polymerase (1.5 units) ( (Applied Biosystems) was added to adjust the total volume of the reaction solution to 50 L.
  • This reaction solution was subjected to a predetermined temperature condition to cause an amplification reaction.
  • One cycle of temperature conditions was 94 ° C (15 seconds), 55 ° C (15 seconds), and 72V (30 seconds), and 40 cycles of this cycle were performed during the reaction. .
  • the obtained reaction solution (10 L) was analyzed by performing 3% agarose electrophoresis.
  • the reaction was performed in the same manner as in Example 1 except that one cycle of the temperature conditions for conducting the width reaction was 94 ° C (15 seconds), 50 ° C (15 seconds), and 72 ° C (30 seconds). And analysis 3 ⁇ 4: Performed.
  • the annealing temperature was intentionally lowered so that the specificity of the primer was reduced.
  • Primer b GA was used instead of primer b GT, and one cycle of the temperature conditions when performing the amplification reaction was performed at 94 ° C (15 seconds), 50 ° C (15 seconds), and 72 ° C.
  • the reaction and analysis were performed in the same manner as in Example 1 except that C (30 seconds) was used.
  • the annealing temperature was intentionally lowered so that the specificity of the primer was reduced.

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Abstract

本発明は、多型配列部位を有する核酸において多型配列部位が所望の塩基配列を有するか否かを識別する方法であって、下記（１）および（２）を、多型配列部位を有する標的核酸にハイブリダイズさせ、これらをプライマー鎖置換伸長反応が進行し得る反応条件下に置くことを含んでなる、方法：　（１）識別プライマー（ここでこの識別プライマーは、その３’末端部分に多型配列識別用の塩基配列を有する）、および（２）プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド（ここでこのオリゴヌクレオチドは、前記識別プライマーよりも、標的核酸における５’側の領域に対して全部もしくは一部が相補的である）。本発明の方法によれば、核酸の１塩基の違いを迅速、簡便、かつ優れた精度で検出することができる。

Description

明 細 書 多型配列部位を有する核酸の識別方法 [発 明 の 背 景]
発明の分野
本発明は、 核酸配列の違い、 例えば核酸配列中の 1塩基の違い、 を高い精度で 検出可能な核酸の識別方法に関する。
関連技術
近時、 世界的なヒトゲノム解析により、 その約 3 1億個の塩基対の配列が明ら かにされる一方、 遺伝子の数も約 3〜 4万個であることが明らかとなった。
ヒ トには個体間で塩基配列の違いが存在し、 特定の集団人口の 1 %以上の頻度 で存在するものを遺伝子多型と呼んでいる。 その中でも遺伝子の塩基配列が 1塩 基だけ異なっている S N P (Single Nucleotide Polymorphism)は、 種々の疾患と 関連性があることが示唆されている。 例えば、 ヒ トの遺伝子病は、 一つの遺伝子 中の 1塩基の違いが病気の原因となると考えられている。 また、 生活習慣病ゃガ ンなどは、 複数の遺伝子のいくつかにおける 1塩基の違いが影響していると考え られている。 したがって、 S N Pの解析は、 創薬ターゲットの探索または副作用 の予見などのような医薬品の開発において、 極めて有効であると考えられる。 こ のため、 S N Pの解析は世界的な巨大プロジェク トとして押し進められている。 薬物の効果やその副作用についての個人差は、 個々人の薬物代謝に関わる酵素 群の違いによるものであって、 その違いも遺伝子上のわずかな違いによるもので あることが最近明らかにされつつある。 また、 病原細菌やウィルスへの薬物の効 き目や、 病原細菌やウィルスの薬物耐性は、 それらの個体毎に異なることがあり、 これらは個体毎の遺伝子の微細な違いによることが多い。
そこで、'あらかじめ患者の遺伝子を解析することによって、 最適な薬剤を選択 し患者に投与することが考えられている。 また、 単一遺伝子疾患のみならず多因 子疾患についても、 遺伝子診断の意義が急速に高まりつつある。 さらに、 外来因 子である病原細菌やウィルスの遺伝子診断も、 今後は検査対象が確実に増加する ことが予想される。
このようにポストゲノム時代の医療においては、 ヒ トゃ病原微生物の遺伝子の 微細な違い、 とりわけ 1塩基の違い、 を検出できることは、 重要であり、 今後も 重要性が増すと予想される。
これまでに、 塩基配列における微細な違い、 とりわけ 1塩基の違いを検出する 方、法力 S種々検寸されて ヽる (Landegren, Laboratory protocols for mutation d etection, Oxford university press, (1996)、 Ahmadian et. al. , Biotechniqu es 32, 1122-1137 (2002) ) 。
しかしながら、 実用レベルでの検出を行うためには、 低コス トであって、 方法 の簡便性、 検出時間の短さ、 検出結果の正確さなどの点がいずれも優れているこ とが要求される。 本発明者の知る限り、 現在までのところ、 実際の使用に耐えう る方法は知られていない。
遺伝子の微細な違い、 とりわけその 1塩基の違いを検出する場合、 一般的に、 目的とする遺伝子断片は試料中にわずかしか含まれていない。 この場合、 目的と する遺伝子を、 何らかの方法によって予め増幅させておくことが必要となる。 こ のような遺伝子増幅法としては、 例えば、 P C R (Po lymerase Chain React io n) 法が挙げられる。
一般的に、 目的の遺伝子の 1塩基の違いを検出するためには、 遺伝子増幅の段 階と、 増幅させた遺伝子の 1塩基の違いを調べる段階との 2段階の工程を必要と する (Ahmadian et. al.， Biotechniques 32, 1122-1137 (2002) ) 。 しかしなが ら、 2段階の工程を必要とする方法は、 工程が複数あるため、 処理が煩雑となる。 このような 2段階の工程の煩雑さを改善するため、 例えば、 蛍光色素とクェン チヤ一力 Sつレヽたプローブを用レヽる Taqtnan法 (Livak et. al.， PCR Methods Appl.
5, 357-362 (1995) ) 、 または、 質 分析計による D N Aの質量分析を利用した M ALDI- T0F/MS法 （Gri ffi n et. al. , Trends Biotechnol. 18， 77-84 (2000) ) など が報告されている。 また、 遺伝子の増幅を必要としない方法として、 D N Aの構 造を認識して切断する酵素を用いる Invader法 （Ryan et. al. , Molecular diagn osi s 4， 135-144 (1999) ) も報告されている。 しかしながら、 これらの方法は依 然として実施するコストが高く、 またプローブの設計も複雑である。 一方で、 遺伝子の増幅と 1塩基の識別とを同時に行う方法が考案されている (Newton et. al . , Nucleic Acids Res. 17, 2503-2516 (1989)、 Okayama et. a 1. , J. Lab. Clin. Med. 114, 1053-113 (1989) ) 。 この方法は、 D N Aポリメラ ーゼの伸長反応において、 プライマーの 3 ' 末端が錄型と相補的であるか否かに よって、 伸長反応が起こったり起こらなかったりすることを利用するものである。 すなわち、 P C R反応において一方のプライマーの 3 ' 末端に 1塩基の識別を行 う塩基が来るようにプライマーを設計しておく と、 铸型がプライマーと完全に相 補的である場合には、 伸長反応が起こり、 もう一方のプライマーとの間で増幅反 応が引き起こされる。 ところが、 プライマーの 3 ' 末端に铸型との間で 1塩基の ミスマッチがある場合には、 そのプライマーからの伸長反応は起こらず、 もう一 方のプライマーとの間での増幅反応も起こらない。 このようにして増幅反応が起 きたか起きなかったかによつて、 1塩基の識別を行うことができる。 この方法は、 増幅反応後にさらに操作を行って 1塩基を識別する必要がない。
しかしながら、 この方法は、 反応条件、 例えば、 铸型の量、 温度、 プライマー の量、 または反応基質である d N T Pの濃度などにより、 反応が影響を受けやす い。 このため、 常に再現性のあるデータを得ることは容易でない。 また、 識別す る塩基の種類、 すなわちプライマーの 3 ' 末端の塩基またはそのまわりの塩基の 種類によって、 この方法の識別性能が大きく影響を受け （Ayyadevara et. al. , Anal. Biochem. 284, 11-18 (2000) ) 、 配列によっては識別が困難となることも ある。
さらに別の方法として、 例えば、 プライマーの 3 ' 末端付近に人工的な変異 (铸型と相補的でない塩基） を導入する方法が検討されている （Newton et. al. , Nucleic Acids Res. 17, 2503 (1989) ) 。 しかしながら、 この方法でも、 プライ マーの最適化に一定の労力を必要とし、 識別精度も試料の品質によって影響を受 けることがある。
さらにこの問題を解決するために、 非天然型の核酸をプライマーに導入する方 法が考案されているが （米国特許第 6， 316， 198号明細書） 、 依然として改良の余 地のあるものであった。 また、 二つのァリルに特異的なプライマーを共存させ、 競合反応により 1塩基の識別を行う方法も開発されている （McClay， Anal. Bioc hera.， 301, 2000-2006 (2002) ) 。 しかしながら、 この方法も充分満足のできる ものではなかった。
したがって、 遺伝子の微細な違い、 とりわけ 1塩基の違い、 を迅速かつ簡便に 検出できる方法であって、 識別精度と汎用性の高い方法が、 依然として望まれて レヽる。
[発 明 の 概 要]
本発明者は、 今般、 3， 末端部分に多型配列を識別できるように塩基配列を配 置したプライマーを用いて鎖置換型プライマーの伸長反応を行って、 標的核酸中 の 1塩基の識別をする場合において、 該プライマーに加えてさらに、 プライマー 機能を有さないオリゴヌクレオチドを用いることによって、 多型部位の 1塩基を 識別する能力を飛躍的に高めることができることを見出した。 本発明はかかる知 見に基づくものである。
よって、 本発明は、 多型配列部位を有する核酸の識別方法であって、 検体が微 量であってもそこに含まれる核酸の 1塩基の違いを迅速かつ簡便に検出すること ができ、 かつ検出精度に優れた方法の提供をその目的とする。
そして本発明による多型配列部位を有する核酸の識別方法は、 多型配列部位を 有する核酸において多型配列部位が所望の塩基配列を有するか否かを識別する方 法であって、 、
下記 （1 ) および （2 ) を、 多型配列部位を有する標的核酸にハイブリダィズ させ、 これらをプライマー鎖置換伸長反応が進行し得る反応条件下に置くことを 含んでなる、 方法である ：
( 1 ) 識別プライマー （ここでこの識別プライマーは、 その 3 ' 末端部分に 多型配列識別用の塩基配列を有する） 、 および .
( 2 ) プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド （ここでこのオリゴヌ クレオチドは、 前記識別プライマーよりも、 標的核酸における 5 ' 側の領域に対 して全部もしくは一部が相補的である） 。
本発明による多型配列部位を有する核酸の識別用キットは、 多型配列部位を有 する核酸において多型配列部位が所望の塩基配列を有するか否かを識別するため のキットであって、 下記 （A) および （B ) を含んでなるものである ：
(A) 識別プライマー （ここでこの識別プライマーは、 その 3 ' 末端部分に 多型配列識別用の塩基配列を有する） 、 および
( B ) プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド （ここでこのオリゴヌ クレオチドは、 前記識別プライマーよりも、 標的核酸における 5 ' 側の領域に対 して全部もしくは一部が相補的である） 。
本発明の方法またはキットによれば、 目的とする核酸が、 ある多'型配列におい ていずれの型であるか否かを、 迅速かつ簡便に識別することができる。 この方法 またはキットは、 3 ' 末端に多型配列識別用の塩基配列を有するプライマーのみ を用いる従来の方法に比べて、 多型の識別精度が格段に優れている。
[図面の簡単な説明]
図 1は、 本発明における、 識別プライマーと、 プライマー機能を有さないオリ ゴヌクレオチドとの位置関係を模式的に示した図である。 図中、 （a ) 、 ( d ) および （e ) は識別プライマーと該オリゴヌクレオチドとの配列が重な p合う場 合であり、 （b ) は識別プライマーと該オリゴヌクレオチドとの配列が連続した 配置にある場合であり、 また （c ) は識別プライマーと該オリゴヌクレオチドと の配列が離れて配置されている場合である。
図 2は、 実施例における、 識別プライマーと該オリゴヌクレオチドとの互いの 位置関係を示した図である。
図 3は、 例 1の結果を示す図である。 図中、 铸型の欄にある Aおよび Tは、 铸 型配列上の多型配列部位の塩基の種類を表す。 またプライマーの欄は、 使用した プライマーの種類を表し、 D E Oの欄は使用したプライマー機能を有さないオリ. ゴヌクレオチドの種類を表す。
図 4は、 例 2の結果を示す図である。 図中、 鎵型の欄にある Aおよび Tは、 錄 型配列上の多型配列部位の塩基の種類を表す。 またプライマーの欄は、 使用した プライマーの種類を表し、 D E〇の欄は使用したプライマー機能を有さないオリ ゴヌクレオチドの種類を表す。
図 5は、 例 3の結果を示す図である。 図中、 鑤型の欄にある Aおよび Tは、 铸 型配列上の多型配列部位の塩基の種類を表す。 またプライマーの欄は、 使用した プライマーの種類を表し、 D E Oの檷は使用したプライマー機能を有さないオリ ゴヌクレオチドの種類を表す。
図 6は、 例 4の結果を示す図である。 図中、 铸型の欄にある Aおよび Tは、 铸 型配列上の多型配列部位の塩基の種類を表す。 またプライマーの欄は、 使用した プライマーの種類を表し、 D E Oの欄は使用したプライマー機能を有さないオリ ゴヌクレオチドの種類を表す。
[発明の具体的説明]
核酸の識別方法
本発明は、 多型配列部位を有する核酸において、 多型配列部位が所望の塩基配 列を有するか否かを識別する方法である。
本明細書において 「核酸」 は、 D N Aまたは R N Aのいずれであってもよく、 また一本鎖であっても 2本鎖であってもよい。 また本発明の方法により識別する ことができる核酸は、 その由来によって制限されるものではなく、 従って本発明 は、 真核生物、 原核生物、 ウィルス由来の核酸、 さらには合成されたものに対し ても適用可能である。 .
本明細書において 「標的核酸」 は、 本発明の方法による識別を希望する目的核 酸自体であっても、 その目的核酸の相補鎖であつてもよい。
本明細書において 「多型配列部位」 は、 核酸間に存在する配列上の相違部分の 塩基配列、 または点突然変異により生じた核酸配列上の変異部分の塩基配列、 が 存在し得る部分を意味する。 すなわち、 「多型配列部位」 は、 基準とする塩基配 列に対して 1塩基または複数の塩基の置換、 欠失、 または挿入が生じている部位 を意味する。 したがって、 本発明の識別方法によれば、 このような多型部位が所 望の塩基配列である核酸と、 多型部位がそのような塩基配列でない核酸とを識別 することができる。 '
ここで 「所望の塩基配列」 とは、 核酸配列に存在しうる多型配列部位に相当す る塩基配列のことをであって、 本発明の識別方法が識別するための標的とする塩 基配列のことをいう。 このような塩基配列は、 識別目的、 例えば識別を希望する 疾患、 または、 識別対象の動物種類等に応じて適宜選択することができる。
本発明による多型配列部位を有する核酸の識別方法は、 前記したように、 識別 プライマーと、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドとを少なくとも用 いるものであり、 これらを標的核酸とハイブリダィズさせ、 ハイブリダィズさせ たこれらのものをプライマー鎖置換伸長反応が進行し得る反応条件下に置くこと を含んでなる。 識別プライマー
本発明において 「識別プライマー」 は、 標的核酸に対するプライマー能を有す るものであって、 その 3 ' 末端部分に、 多型配列識別用の塩基配列を少なくとも 有するものである。 このとき、 識別プライマーにおける 「3 ' 末端部分」 とは、 必ずしもプライマーの 3 ' の最末端のみを意味するものではなく、 その 3 ' 最末 端から数塩基程度、 該プライマーの上流位置にあってもよい。 好ましくはその 3 ' 最末端から塩基の数は、 最末端塩基を含めて、 1〜 5塩基の範囲であり、 より 好ましくは 1〜 3塩基の範囲であり、 最も好ましくは 1 ~ 2塩基である。
ここで 「多型配列識別用の塩基配列」 とは、 標的とする核酸中に存在する多型 配列部位を識別することができる、 識別プライマー中に存在する塩基配列のこと をいう。 「多型配列識別用の塩基配列」 は、 標的核酸中の多型配列部位が所望の 塩基配列であるとき、 この部位と相補的または非相補的であることができる。 識別プライマー中に存在する多型配列識別用の塩基の数は、 2〜数個であるこ とができるが、 1個であってもよい。 一般的に、 該塩基の数が 2個以上の場合は、 プライマーによる多型配列の識別は極めて容易であるが、 該塩基の数が 1個の場 合は、 識別は容易でない。 本発明によれば、 該塩基の数が 1個の場合であっても、 多型配列の識別を容易に行うことができる。
本発明による識別プライマーは、 識別プライマーの多型配列識別用の塩基が標 的核酸の多型配列部位の塩基配列と相補的である場合には、 プライマー鎖置換伸 長反応によりプライマーの伸長が起こり、 かつ、 その多型配列識別用の塩基配列 が標的核酸の多型配列部位の塩基配列と相補的でない場合には、 プライマー鎖置 換伸長反応が起こらないように設計されてなるものである。 このように多型配列識別用の塩基配列が、 標的核酸の多型配列部位の塩基配列 と相捕的であると、 この識別プライマーによるプライマー鎖置換伸長反応が起こ つて、 プライマーが伸長し、 伸長反応生成物、 すなわち、 標的核酸に相補的な核 酸を形成することができる。
しかしながら、 多型配列識別用の塩基配列が、 標的核酸の多型配列部位の塩基 配列と相補的でないと、 このプライマーによる鎖置換伸長反応が阻害されて、 プ ライマーの伸長はほとんど起こらなくなる。 このため、 伸長反応生成物もほとん ど生じない。 ただし、 従来方法の場合には、 このような状況にあっても、 プライ マーの伸長反応が進行してしまうことがわずかにあった。 このため、 従来の識別 方法の精度は必ずしも高いものではなかった。 本発明においては、 この識別プラ イマ一の下流にさらに、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドを用いる ことにより、 伸長反応の進行の可否の精度を飛躍的に高めることに成功したので ある。
すなわち、 識別プライマーにおいて、 多型配列識別用の塩基配列と、 標的核酸 の多型配列部位の塩基配列とがマッチングして、 識別プライマーが標的核酸と完 全に相補的であると、 該プライマーの下流に結合しているプライマー機能を有さ ないオリゴヌクレオチドを押しのけて、 プライマー伸長反応を進行することがで きる。 これに対し、 識別プライマーにおいて、 多型配列識別用の塩基配列と、 標 的核酸の多型配列部位の塩基配列との間にミスマッチが.あると、 プライマー伸長 反応がほとんど起きなくなる。 このとき、 該プライマーの下流にプライマー機能 を有さないオリゴヌクレオチドがさらに存在すると、 プライマー伸長反応の進行 をほぼ完全に抑えることができる。 本発明は、 このような現象を利用するもので あり、 得られる伸長生成物を検出することによって、 極めて高い精度で多型配列 部位を有する核酸を識別することを可能にしている。
本発明の識別プライマーは、 標的核酸の多型配列部位から標的核酸の 3 ' 末端 方向の領域全体に対して相補的であってもよいが、 多型配列部位を含み、 かつ前 記領域全体よりも短い領域に対して相補的であってもよい。
本発明の識別プライマーの鎖長は、 適用する標的核酸の鎖長に応じて適宜選択 することができるが、 典型的は 6〜1 0 0塩基であり、 好ましくは 1 0〜5 0塩 1377
基であり、 さらに好ましくは 1 5〜 3 0塩基である。
本発明による識別プライマーは、 慣用の方法にしたがって合成することができ る。 例えば、 本発明による識別プライマーは、 標的核酸における多型配列部位よ りも標的核酸の 3 ' 側の領域に対して相補的であるように選択して得ることでき る。 また識別プライマー中に存在する多型配列識別用の塩基配列も、 識別を希望 する塩基配列に応じて適宜選択することができる。 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド
本発明において 「プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド」 は、 識別プ ライマーよりも、 標的核酸の 5， 側の領域に対して相補的であることが必要であ る。 換言すると、 該オリゴヌクレオチドは、 識別プライマーよりも下流の領域に おいて、 標的核酸と相補的である。
ここで 「プライマー機能を有さない」 とは、 このオリゴヌクレオチドを標的核 酸にハイブリダィズさせて、 これをプライマー伸長反応の反応条件に置いたとし てしても、 このオリゴヌクレオチドから伸長反応が起こらないような状態をいう。 本発明において、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドが標的核酸と 相補的である位置は、 識別プライマーが標的核酸に相補的である位置よりも下流 であれば特に制限はされない。 このため、
(a) 該オリゴヌクレオチドの 5， 末端部分が、 識別プライマーの 3 ' 末端部 分と重なりあう （または、 互いに重複する） 配置を、 標的核酸に対してと'り得る ような配列を有していてもよく （図 1 ( a )参照） 、
(b) 該オリゴヌクレオチドの 5， 末端部分が、 識別プライマーの 3， 末端部 分に連続して位置する配置を、 標的核酸に対してとり得るような配列を有してい てもよく （図 1 ( b )参照） 、 さらには、
(c) 該オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分が、 識別プライマーの 3 ' 末端部 分と離れて位置する配置を、 標的核酸に対してとり得るような配列を有していて もよい （図 1 ( c )参照） 。
ここでプライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分が、 識別 プライマーの 3 ' 末端部分と 「重なりあう」 （オーバーラップする） とは、 識別 P2003/011377
10 プライマーと、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドとが、 標的核酸と 相捕鎖を形成する場合において、 プライマーの 3 ' 末端部分と、 該オリゴヌクレ ォチドの 5 ' 末端部分とが、 標的核酸上の同一配列もしくは同一塩基に対して、 同時に相補的である配列もしくは塩基を有している状態をいう。
また、 この場合、 該オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分の 「重なりあう」 部分 は、 標的核酸に対して必ずしも完全に相補的でなくともよく、 このような状態に ある場合も、 「重なりあう」 に包含されるものとする。 よって本発明の別の好ま しい態様によれば、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドは、 その 5 ' 末端部分に標的核酸と非相補的な塩基を有していてもよい。 この場合、 該プライ マー機能を有さないオリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分に存在し得る標的核酸と 非相補的な塩基の塩基数は、 例えば 1 〜 1 5個、 好ましくは 1 〜 5個である。 同様に、 識別プライマーの 3 ' 末端部分の 「重なりあう」 部分は、 標的核酸に 対して必ずしも完全に相補的でなくともよく、 このような状態にある場合も、
「重なりあう」 に包含されるものとする。 よって本発明の別の好ましい態様によ れば、 識別プライマーは、 その 3 ' 末端部分に標的核酸と非相補的な塩基を有し ていてもよい。
また、 識別プライマーの 3 ' 末端部分の 「重なり合う」 部分は、 多型配列識別 用の塩基配列を含んでいてもよく、 また含んでいなくてもよい。 このとき、 識別 プライマーの 3 ' 末端部分の 「重なり合う」 部分において、 多型配列識別用の塩 基配列は、 該 3， 末端の最末端塩基でなくともよい。 したがって、 プライマー機 能を有さないオリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分は、 識別プライマーにおいて多 型配列識別用の塩基配列よりも 3 ' 末端側の領域にある塩基配列とのみ重複して もよいが、 多型配列識別用の塩基配列とさらにそれより 5 ' 側の領域の塩基配列 とを含む配列と重複してもよい。
このように 「重なり合う」 には、 識別プライマーの 3 ' 末端部分と、 プライマ 一機能を有さないオリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分とが、 標的核酸に対して両 方とも相補的である場合、 いずれか一方または両方が標的核酸に対して相補的で なく、 かつ本来相補的な塩基がある位置に非相補的な塩基が存在する場合のいず れの場合も包含される。 「重なり合う」 場合の例としては、 前記した（a)の場合の他に、 下記（d)および (e)のような場合も例示することができる ：
(d) プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分が、 識別 プライマーの 3 ' 末端部分と重なり合う配置を、 標的核酸に対してとり得るよう な配列を有している場合であって、 該オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分が標的 核酸に相補的である場合 （図 1 ( d )参照） 。 このとき、 識別プライマーの 3 ' 末 端部分は、 標的核酸に相補的でなくともよい。
(e) プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分が、 識別 プライマーの 3 ' 末端部分と重なり合う配置を、 標的核酸に対してとり得るよう な配列を有していなくてもよい場合であって、 該ォリゴヌクレオチドの 5 ' 末端 部分が標的核酸に相補的である場合 （図 1 ( e )参照） 。 このとき、 識別プライマ 一の 3 ' 末端部分は、 標的核酸に相補的でなくともよい。
本発明の好ましい態様によれば、 該オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分は、 識 別プライマーの 3 ' 末端部分と重なりあう （または、 互いに重複する） 配置を、 標的核酸に対してとり得るような配列を有するか、 または、 該オリゴヌクレオチ ドの 5 ' 末端部分が、 識別プライマーの 3 ' 末端部分に連続して位置する配置を、 標的核酸に対してとり得るような配列を有する。
プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドが、 識別プヲイマ一と 「重なり あう」 ような配列を有する場合、 重なりあう部分の塩基の数は、 1 〜 5個である ことが望ましく、 より好ましくは 1 〜 3個である。
本発明において、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドは、 それを構 成する塩基全てが、 標的核酸に対して完全に相補的である必要はなく、 一部の塩 基が相補的でないものであってもよい。 そのような場合、 該オリゴヌクレオチド に含まれる標的核酸と相補的でない塩基の割合は、 該オリゴヌクレオチドが標的 核酸に特異的に結合し、 本発明の鎖置換型伸長反応において標的核酸との結合を 維持できる程度であることが望ましい。
本発明において 「プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド」 は、 プライ マーとしての機能を有さないものであれば特に制限はなく、 デォキシリボオリゴ ヌクレオチドであっても、 リボオリゴヌクレオチドであってもよく、 また、 それ らのキメラ体であってもよい。 また、 このオリゴヌクレオチドは、 修飾塩基を含 むものであっても、 非天然型の核酸構造 （例えば、 非天然型の修飾塩基、 非天然 型の糖部構造） を含むものであってもよい。 さらには、 このオリゴヌクレオチド として、'異なるバックボーンをもづ P N Aなども使用することができる。
本発明の好ましい態様によれば、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチ ドは、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドと標的核酸との藺の結合の 融解温度が、 識別プライマーと標的核酸との間の結合の融解温度よりも高いもの である。 例えば、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドと標的核酸との 間の結合の融解温度は、 識別プライマーと標的核酸との間の結合の融解温度より 1〜1 5 °C程度高いことができる。 該オリゴヌクレオチドがこのような融解温度 を有するものであると、 識別プライマーによる伸長反応が起こるときには、 プラ ィマー機能を有さないォリゴヌクレオチドは確実に標的核酸と結合していること となる。 これにより、 識別プライマーの 3 ' 末端部分の多型配列識別用の塩基配 列と標的核酸の多型配列部位との間にミスマッチがある場合に、 プライマーの伸 長反応がより 実に阻害されることとなる。
本発明において、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドは、 識別を希 望する目的核酸の配列に応じて適宜選択することができる。 プライマー機能を有 さないオリゴヌクレオチドは、 例えば、 慣用の方法にしたがって合成してもよく、 また、 識別を希望する核酸配列を別途用意してこれを任意に切断することにより 得てもよい。
また、 該オリゴヌクレオチドがプライマー機能を持たないようにするには、 該 オリゴヌクレオチドに、 慣用の方法 （例えば、 米国特許第 5, 849， 497号明細書に 記載の方法） を適用することによって行うことができる。 また、 合成等により得 られたオリゴヌクレオチドの 3 ' 末端のヌクレオシドの水酸基を任意の保護基 (例えば、 リン酸基） で修飾したり、 または、 該 3 ' 末端部分に標的核酸と相補 的でない塩基を導入したり しても、 オリゴヌクレオチドがプライマー機能を持た ないようにすることができる。
よって、 本発明の別の好ましい態様によれば、 プライマー機能を有さないオリ ゴヌクレオチドが、 その 3， 末端のヌクレオシドの水酸基がリン酸基で修飾され 7
13. たものであってもよい。
また、 本発明のさらに別の好ましい態様によれば、 プライマー機能を有さない オリゴヌクレオチドは、 その 3 ' 末端部分に標的核酸と非相補的な塩基を有する ものであることができる。 この場合、 該プライマー機能を有さないオリゴヌクレ ォチドの.3 ' 末端部分に存在し得る標的核酸と非相補的な塩基の塩基数は、 例え ば 1〜 3 0個、 好ましくは 3〜 1 0個である。
本発明において、 プライマー機能を有さ いオリゴヌクレオチドの鎖長は、 適 用する標的核酸の鎖長に応じて適宜選択することができるが、 少なくとも 1 0塩 基以上からなることが望ましく、 好ましぐは 1 5〜5 0塩基であり、 さらに好ま しくは 2 5〜 3 5塩基である。
本発明において用いられるプライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドの量 は、 標的核酸の量に応じて適宜選択することができるが、 識別プライマーが標的 核酸に完全に相補的である場合には、 そのプライマーの伸長反応を阻害しない程 度の量であって、 かつ伸長反応における全ての標的核酸に結合することができる 程度の量であることが望ましい。 この場合、 該ォリゴヌクレオチドの量は、 標的 核酸の量よりも少なくとも過剰量存在する。
本発明のより好ましい態様によれば、 該オリゴヌクレオチドの量は、 識別ブラ イマ一の量に対して、 0 . 1〜 5当量であり、 さらに好ましくは 1〜3当量、 さ らにより好ましくは 1〜1 . 5当量である。 その他
本発明において、 識別プライマーと、 プライマー機能を有さないオリゴヌタレ ォチドとを、 標的核酸とハイブリダィズさせるには、 慣用の方法によって、 例え ば、 これらを一緒にして温度条件を適宜設定することによって、 容易に行うこと ができる。
本明細書において 「プライマー鎖置換伸長反応が進行し得る反応条件下に置 く」 とは、 プライマー鎖置換伸長反応を進行させることができる反応条件、 例え ば、 所定の酵素存在下、 温度条件下、 および または基質存在下に、 ハイブリダ ィズさせたプライマー等を置くことをいう。 このような反応条件の典型例は、 当 TJP2003/011377
14 業者に公知のものであるが、 本発明においては、 標的核酸、 プライマー等に応じ て、 好適な条件を適宜変更することができる。 例えば、 使用する酵素に応じて温 度条件等を適宜設定するしてもよい。
ここで使用される酵素としては、 相補鎖置換型の铸型依存性核酸合成酵素が好 ましい。 このような酵素としては、 標的核酸が RNAであれば逆転写酵素を使用 することができ、 また、 標的核酸が DNAであれば DNAポリメラーゼを使用す ることができる。 このとき使用可能な DNAまたは RNAポリメラーゼは、 5， → 3 ' ェキソヌクレアーゼ活性おょぴ 3， →5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を持た ないものであって、 かつ、 鎖置換活性は持つものであることが重要である。
そのような RNAポリメラーゼとしては、 例えば M— Mil V逆転写酵素などが '挙げられる。
また、 5 ' → 3 ' ェキソヌクレアーゼ活性および 3 ' → 5， ェキソヌクレアー ゼ活性をもつ天然の酵素から、 これらの活性を人工的に取り除くことができる。 したがって、 DN Aポリメラーゼとしては、 そのような活性を取り除いたものも 使用可能である。 本発明において使用可能な酵素としては、 例えば、 Bst DNA po lymerase large fragment (New England Biolabs社製) 、 Stoffe丄 fragment DNA polymerase (アプライ ドバイオシステムズ社製） などが挙げられる。
本発明による方法は、 1回の伸長反応によって 1塩基識別を行う方法に好適に 適用することができる。 そのような方法としては、 例えば 1塩基伸長法 （SBE 法） （Syvanen, et. al.， Genomics, 8； 684-692(1990)) が挙げられる。 この方 法は、 P CR法により増幅した DNAに対してプライマー伸長反応を行う方法で ある。 すなわち、 この方法は、 プライマーの 3， 末端と、 PCRによって増幅し て得られた標的核酸とが完全に相補的であるか、 または相補的でないかによって、 伸長反応が進行するか否かとなることを利用するものである。 本発明による方法 を用いることによって、 S B E法の識別能を向上させ、 また条件設定の手間を短 縮することができる。 S B E法は広く普及している方法であるが、 本発明と組み 合わせることによりさらに優れた検出方法を構築することができると考えられる。 本発明の一つの好ましい態様によれば、 本発明による方法は、 S BE法と組み 合わせて実施することができる。 本発明は公知の遺伝子増幅法と組みあわせて指数関数的な増幅を行うと、 伸長 生成物の検出が容易になるのでさらに効果的である。 そのような増幅法としては、 例えば、 P CR法 (Polfs et. al. , PCR: Clinical Diagnostics and Research,
Springer-Verlag (1992)) 、 NAS BA法 (Gabrielle et. al.， J. General. Microbiol. 139, 2423-2429(1993)) 、 TMA法 （Kacian et. al. , 米国特許第 5, 399, 491号） 、 SDA法 （Walker et. al. , Nucleic Acids Res. 20， 1691 - 1696 (1992)) 、 LAMP法 (Notomi et. al. , ucleic Acids Res. 28, e63 (200 0)) 、 または I CAN法 （Mukai et. al.， 国際出願 WO00/56877号） が挙げられ る。 本発明による方法は、 非等温、 等温にかかわらずあらゆるプライマー伸長反 応を利用する方法と組み合わせることができる。
したがって、 本発明の好ましい態様によれば、 本発明による方法は、 プライマ 一鎖置換伸長反応による伸長反応生成物を増幅させる工程をさらに含んでなる。 この増幅法としては、 上記したような P C R法、 NAS BA法、 TMA法、 SD A法、 LAMP法、 または I CAN法から選択される核酸増幅法を選択すること できる。
本発明の好ましい態様によれば、 本発明の方法は、 プライマー鎖置換伸長反応 により生じ得る伸長反応生成物の存在を検出する工程をさらに含んでなる。 した がって、 例えば、 伸長反応生成物が検出されると、 多型配列部位が所望の塩基配 列であつたと判断することができる。
伸長反応生成物の存在は、 一般的な核酸の検出法を適用することにより検出す ることができる。
したがって、 例えば、 本発明を前記した S B E法と組み合わせる場合には、 蛍 光標識したモノヌクレオチド三リン酸を使用して、 取り込まれたモノヌクレオチ ドを特定することによって、 1塩基の違いを検出することができる （Syvanen, e t. al. , Genomics, 8, 684-692(1990)) 。 また、 本発明を P C R法と組み合わせ る場合には、 例えば、 増幅物が得られると蛍光を発するような物質に加えておく ことにより、 蛍光を発するか否かによって 1塩基の違いを容易に検出することが できる。 これらの検出方法は、 その他の場合においても適用することが可能であ り （Foy et. al. , Clinical Chera. 47， 990-1000 (2002)) 、 これにより、 試料 P2003/011377
16 中の核酸配列の微細な違い （例えば数塩基の違い） 、 または 1塩基の違いを非常 に容易に検出することが可能になる。
本発明の別の態様によれば、 下記 （A) および （B) を含んでなる、 多型配列 部位を有する核酸において多型配列部位が所望の塩基配列を有するか否かを識別 するためのキットが提供される ：
(A) 識別プライマー （ここでこの識別プライマーは、 その 3， 末端部分に 多型配列識別用の塩基配列を有する） 、 および
(B) プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド （ここでこのオリゴヌ クレオチドは、 前記識別プライマーよりも、 標的核酸における 5' 側の領域に対 して全部もしくは一部が相補的である） 。
本発明の好ましい態様によれば、 このキットは、 下記 （C) をさらに含んでな る ：
(C) 相補鎖置換型の錶型依存性核酸合成酵素。
本発明の別の好ましい態様によれば、 前記キットは、 伸長反応の基質であるモ ノヌクレオチド三リン酸類、 および Zまたは、 前記酵素の酵素反応に適する緩衝 液をさらに含んでなる。
ここで、 伸長反応の基質であるモノヌクレオチド三リン酸類としては、 通常、
4種のデォキシヌクレオチド三リン酸 （dNTP) であり、 また、 前記酵素の酵 素反応に適する緩衝液としては、 使用する酵素に応じて公知の緩衝液から適宜選 択することができる。
[実 施 例]
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 これらは本発明を限定する ものではない。 ·
本実施例において用いられるオリゴヌクレオチドは、 AB I 39 2 DNA自 動合成機 （アプライ ドバイオシステムズ社製） を用いて合成した。 オリゴヌタレ ォチドの 3 ' 末端へリン酸を導入する場合は、 3 ' リン酸化 CP G (グレンリサ ーチ社製） を使用した。
合成したオリゴヌクレオチドは、 脱保護後、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 P T/JP2003/011377
17 により精製し、 これを使用した。
増幅の铸型としては、 それぞれ Aァリルまたは Tァリルをもつ ]3—グロビン遺 伝子の Pst I断片を含むプラスミド （それぞれ pBR322- |3 A、 pBR322- β s (Ikuta e t. al. , Nucleic Acids Res. 15, 797-811) ) を使用した。
プライマー伸長反応は、 PCR法を実施することにより行った。 ここでは DN Aポリメラーゼとして、 Stoffel fragment DNA Polymerase (アプライドバイオ システムズ社製） を使用し、 反応装置は Thermal Cycler 9700 (Roche Diagnosti cs社製） を使用した。 増幅反応生成物は、 反応液について 3°/。ァガロース電気泳 動を実施し、 これを臭化工チヂゥムに り染色することによって確認した。
使用したオリゴヌクレオチド、 すなわちプライマーおよびプライマー機能を有 さないオリゴヌクレオチドは以下に示す通りであった。 下記において、 下線部分 は A—ァリルまたは Tーァリルの位置に対応する塩基を表し、 また、 3， 末端の pはリン酸を表す。 プライマー （識別プライマー） （鎵型と同一鎖） ：
b GT ： 5' ATGGTGCACCTGACTCCTGT (配列番号 1)
b GA ： 5' ATGGTGCACCTGACTCCTGA (配列番号 2) プライマー （铸型と相補的） ：
AS P 6 : 5， TGTCTTGTAACCTTGATACC (配列番号 3) プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド：
D EO— 1 A： 5' AGGAGAAGTCTGCCGTTACTGp (配列番号 4)
D EO— 2 A： 5' AGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGp (配列番号 5)
D EO- 3 A： 5' GAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGp (配列番号 6)
DEO- 1 T ： 5' TGGAGAAGTCTGCCGTTACTGp (配列番号 7)
D EO— 2 T ： 5' TGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGp (配列番号 8)
D EO- 3 T ： 5' GTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGp (配列番号 9)
D EO- 4 ： 5' GGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCp (配列番号 10) TJP2003/011377
18
D E O— 5 ： 5， TGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACp (配列番号 1 1 ) これらプライマーと、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドとの互い の位置関係は図 2に示した通りである。 ' 例 1
プライマー b GT (0. 5 μ Μ) と、 プライマー A S P 6 (0. 5 μ Μ) と、 プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド （0. と、 鎵型としての プラスミ ド PBR322- ]3 A (Αァリル、 3 0 0 p g ) またはプラスミ ド pBR322- |3 s
(Tァリル、 3 0 0 p g) とを用いて増幅反応を行った。 前記各成分を含む反応 液には、 A、 G、 Tおよび Cに対応する 4種のデォキシヌクレオチド三リン酸
(各 2 0 0 M) と、 反応バッファー （Stoffel fragment DN Aポリメラーゼ 用緩衝液 （アプライドバイオシステムズ社製） ） とを加え、 さらに、 DNAポリ メラーゼ (Stoffel fragment DNA polymerase) ( 1. 5ユニット) （アプライ ドバイオシステムズ社製） を加えて、 反応液の総量を 5 0 Lとした。 この反応 液を所定の温度条件に付し、 増幅反応させた。 温度条件の 1サイクルは順に 9 4 °C ( 1 5秒） 、 5 5°C ( 1 5秒） 、 7 2V ( 3 0秒） とし、 反応の際にはこのサ ィクルを 4 0サイクル行った。
得られた反応液 1 0 Lは、 3 %ァガロース電気泳動を実施することにより分 析した。
結果は図 3に示される通りであった。
' プライマー b GTの多型配列識別部位と、 錡型中の多型配列部位とがマツチン グする場合には、 核酸が特異的に増幅した。 一方で、 プライマー b GTの多型配 列識別部位と、 鏺型中の多型配列部位とがミスマッチする場合には、 核酸の増幅 はほとんど見られなかった。 これにより、 所望する多型配列部位を有する核酸を 識別することが可能であることが明らかとなった。
D E O— 3 Aまたは D E〇一 3 Tを使用した場合は、 識別能が特に優れていた。 例 2
增幅反応を実施する際の温度条件の 1サイクルを、 94°C (15秒） 、 50°C (1 5秒） 、 72°C (30秒） とした以外は、 例 1と同様にして反応および分析 ¾：行った。
なおこの例は、 プライマーの特異性が低下するようにアニーリング温度を意図 的に下げたものである。
結果は図 4に示される通りで,あつ-た。
ァニーリング温度を下げたため、 全体的にプライマーの特異性は低下したもの の、 0£0— 3八または13£0— 3丁を使用した場合は、 所望する核酸の識別能 が特に優れていた。 例 3
プライマー b GTの代わりにプライマー b G Aを使用した以外は、 例 1と同.様 にして反応および分析を行った。
結果は図 5に示される通りであった。
いずれのプライマー機能を有さなオリゴヌクレオチドを使用した場合について も優れた識別効果が見られた。 ， 例 4
プライマー b GTの代わりにプライマー b GAを使用し、 かつ、 増幅反応を実 施する際の温度条件の 1サイクルを、 94°C (1 5秒） 、 50°C (15秒） 、 7 2°C (30秒） とした以外は、 例 1と同様にして反応および分析を行った。 なおこの例は、 プライマーの特異性が低下するようにアニーリング温度を意図 的に下げたものである。
結果は図 6に示される通りであった。
いずれのプライマー機能を有さなオリゴヌクレオチドを使用した場合について も優れた識別効果が見られた。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 多型配列部位を有する核酸において多型配列部位が所望の塩基配列を有 するか否かを識別する方法であって、
下記 （ 1 ) および （ 2 ) を、 多型配列部位を有する標的核酸にハイプリダイズ させ、 これらをプライマー鎖置換伸長反応が進行し得る反応条件下に置くことを 含んでなる、 方法：
(1) 識別プライマー （ここでこの識別プライマーは、 その 3 ' 末端部分に 多型配列識別用の塩基配列を有する） 、 および
(2) プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチド （ここでこのオリゴヌ クレオチドは、 前記識別プライマーよりも、 標的核酸における 5， 側の領域に対 して全部もしくは一部が相補的である） 。
2. 識別プライマーの多型配列識別用の塩基配列が標的核酸の多型配列部位 の塩基配列と相補的である場合には、 プライマー鎖置換伸長反応によりプライマ 一の伸長が起こり、 かつ、 その多型配列識別用の塩基配列が標的核酸の多型配列 部位の塩基配列と相補的でない場合には、 プライマー鎖置換伸長反応が起こらな いように、 識別プライマーが設計されている、 請求項 1に記載の方法。
3. 識別プライマーにおける多型配列識別用の塩基配列の塩基数が 1個であ る、 '請求項 1または 2に記載の方法。
4. 前記標的核酸が、 目的核酸の相補鎖である、 請求項 1〜 3のいずれか一 項に記載の方法。
5. プライマー鎖置換伸長反応により生じる伸長反応生成物を増幅させるェ 程をさらに含んでなる、 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の方法。
6. 伸長反応生成物の増幅を、 P CR法、 NASBA法、 TMA法、 SDA 法、 LAMP法、 または I CAN法から選択される核酸増幅方法により行う、 請 求項 5に記載の方法。
7. プラ マー鎖置換伸長反応により生ずる伸長反応生成物の存在を検出す る工程をさらに含んでなる、 請求項 1〜6のいずれか一項に記載の方法。
8. プライマー鎖置換伸長反応により生じ得る伸長反応生成物を増幅させる 工程の後に、 該伸長反応生成物の存在を検出する工程をさらに含んでなる、 請求 項 5に記載の方法。
9. プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドの 5， 末端部分が、 識別 プライマーの 3 ' 末端部分と重なりあう配置を、 標的核酸に対してとり得るよう な配列を有する、 請求項 1〜 8のいずれか一項に記載の方法。
10. プライマー機能を有さないオリ ゴヌクレオチドの 5 ' 末端部分と、 識 別プライマーの 3 ' 末端部分とが重なりあう部分の塩基数が、 1〜5個である、 請求項 9に記載の方法。
1 1. · プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドの 5， 末端部分が、 識 別プライマーの 3' 末端部分に連続して位置する配置を、 標的核酸に対してとり 得るような配列を有する、 請求項 1〜 8のいずれか一項に記載の方法。
1 2. プライマー機能を有さないオリ ゴヌクレオチドが、 その 5 ' 末端部分 に標的核酸と非相補的な塩基を有する、 請求項 1〜1 1のいずれか一項に記載の 方法。
1 3. プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドの 3 ' 末端のヌクレオ シドの水酸基が、 リン酸基により修飾されてなる、 請求項 1〜 1 1のいずれか一 項に記載の方法。
14. プライマ^ "機能を有さないオリゴヌクレオチドが、 その 3' 末端部分 に標的核酸と非相補性の塩基を有する、 請求項 1〜1 1のいずれか一項に記載の 方法。
1 5. プライマー機能を有さないオリゴヌクレオチドが、 その配列中に、 修 飾塩基または非天然型の核酸構造を含んでなる、 請求項 1〜14のいずれか一項 に記載の方法。
1 6. ブライマ一機能を有さないォリゴヌクレオチドと標的核酸との間の結 合の融解温度が、 識別プライマーと標的核酸との間の結合の融解温度よりも高い、 請求項 1〜 1 5のいずれか一項に記載の方 ¾。
1 7. プライマー鎮置換伸長反応が、 相補鎖置換型の錶型依存性核酸合成酵 素による反応である、 請求項 1~ 1 6のいずれか一項に記載の方法。
1 8. 踌型依存性核酸合成酵素が DN Aポリメラーゼである、 請求項 1 7に 記載の方法。
1 9. 鍩型依存性核酸合成酵素が逆転写酵素である、 請求項 1 7に記載の方 法。
20. 下記 （A) および （B) を含んでなる、 多型配列部位を有する核酸に おいて多型配列部位が所望の塩基配列を有するか否かを識別するためのキット ：
(A) 識別プライマー （ここでこの識別プライマーは、 その 3 ' 末端部分に 多型配列識別用の塩基配列を有する） 、 および
(B) プライマ^"機能を有さないオリゴヌクレオチド （ここでこのオリゴヌ クレオチドは、 前記識別プライマーよりも、 標的核酸における 5' 側の領域に対 して全部もしくは一部が相補的である） 。 '
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