JP5112592B2 - ハイブリダイゼーション・ビーコン、並びに迅速に配列を検出および判別する方法 - Google Patents
ハイブリダイゼーション・ビーコン、並びに迅速に配列を検出および判別する方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【従来技術】
導入
特定のDNA配列を検出して、既知の単一ヌクレオチド多型をスコアするための多くの技術が記載されている。これら検査法のいくつかでは、蛍光ラベルされたプローブのハイブリダイゼーションを利用し、ドナー部分およびアクセプター部分間のエネルギー移転に基づいている。本発明は、プローブの二次構造または酵素作用に依存しない、新規かつ簡便な蛍光ハイブリダイゼーション・プローブ検出系を包含する。これらハイブリダイゼーション・プローブとその標的配列間の相互作用により、蛍光発光に有意な変化が生じる。ハイブリダイゼーション能が変化することにより、蛍光発光量およびプローブ/標的二本鎖の融解温度によって多型標的を判別することができる。単一ヌクレオチド多型（SNPs）は、ヒトゲノムの配列の変異において最も多い形態であり、平均して千ヌクレオチドごとに生じている。SNPは、ヒトからヒトで一塩基（置換、挿入または欠失）が変化するDNA配列内の部位である。これらSNPsは、一般に、特定疾患などの表現型形質に直接影響を及ぼし、したがって薬剤負荷に対する反応性（薬理遺伝学）などの、複雑な形質を同定するための遺伝的マーカーとして使用することができる。SNPsは、進化が遅く、かつ多くの方法によって容易にスコアされるため、遺伝子マーカーとして極めて有用である。一般的な遺伝子疾患に寄与する遺伝子を同定できる可能性のある関連研究において使用するために、新規SNPsを発見するための大規模な試みが進行中である。さらに、既知のSNPsを比較的高処理量で効率的にスクリーニングするための多数の技術が開発されている。SNPの遺伝子型を決定するための現在の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応産物の制限断片長多型性（RFLP）解析（制限断片を検出するためにゲル電気泳動を使用する）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）のハイブリダイゼーション、増幅低抗性変異系（ARMS）、オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（OLA）、一本鎖コンホメーション多型（SSCP）解析、化学開裂、ヘテロ二重鎖解析、ミニ−シーケンシング、および種々のプローブに基づいた系が含まれる。プローブに基づいた技術例には、分子ビーコン、5'-エキソヌクレアーゼ・アッセイ、ハイブリダイゼーション・プローブおよびスコーピオン・プライマーが含まれる。これらプローブ系のいくつかは、ドナー（たとえば蛍光団）部分とアクセプター（たとえばクエンチャー）部分間のエネルギー移転に基づいている。蛍光プローブは、典型的には一本鎖オリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしたときよりも分離時の蛍光発光が、低い量を示す。これらのプローブの構造は、高い特異性をもち、わずか単一ヌクレオチドだけが異なる標的を同定することが可能となる。
【０００２】
蛍光団によって吸収されるエネルギーは、クエンチャーへ移転され、熱として放出されるであろう。蛍光シグナルのクエンチングは、蛍光共鳴エネルギー移転（FRET）または非FRET機構によって生じてもよい。FRETクエンチングでは、ドナーとアクセプター間のスペクトルが重なることが必要であり、このクエンチングの効率は、2つの部分間の距離に関連がある。非FRETクエンチングは、蛍光団とクエンチャー間の短距離の「接触」により生じ、部分間でスペクトルが重なる必要はない。
【０００３】
5'-エキソヌクレアーゼ（TaqManTM）アッセイでは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅された標的DNAを分析するために、FRETクエンチングを使用する。TaqManプローブは、蛍光団部分およびクエンチャー部分（好ましくは5'および3'末端に位置する）を含むオリゴヌクレオチドである。効率的に分子内クエンチングすることにより、ほんのわずかの蛍光のみが、無処置プローブから発光される。しかし、PCR増幅の間に、前記プローブはその標的配列に特異的にハイブリダイズして、Taq ポリメラーゼの5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性によって蛍光団部分とクエンチャー部分間でプローブが切断される。TaqManTMプローブが酵素切断されることによって、蛍光団とクエンチャー成分が空間的に分離し、標的の増幅に相関して蛍光発光の有意な増加を生じる。TaqManプローブを慎重にデザインすることによって、完全マッチのプローブのみが分解されて蛍光シグナルの増加を生じ、多型標的の判別が可能となる。TaqManTMプローブは、リアルタイムPCR増幅の間に消化されるため、増幅後融解曲線解析(post-amplification melting curve analysis)においてプローブを利用することはできない。
【０００４】
分子ビーコンは、分離時は非蛍光性であるが、標的配列にハイブリダイゼーションすると蛍光性となる一本鎖オリゴヌクレオチドプローブである。ハイブリダイズしていない分子ビーコンは、ステム-ループ構造を形成し、前記ビーコンのヘアピンにより、前記蛍光団部分が前記クエンチャーのかなり近くに配置されるように、該分子の一端に共有結合で結合された蛍光団と、もう一端に結合されたクエンチャーをもつ。分子ビーコンが標的配列にハイブリダイズすると、蛍光団およびクエンチャー部分が空間的に分離され、その結果前記蛍光団はもはやクエンチされず、分子ビーコンが蛍光を発光する。分子ビーコンは、配列の検出およびSNPの判別のために、終了点および「リアルタイム」アッセイにおいて使用しもよい。分子ビーコンの二次構造は、ハイブリダイゼーション・プローブに対して高い特異性をもち、単一ヌクレオチドが異なる標的を同定することができる。しかし、前記分子ビーコンの分子内相互作用は、分子間標的ハイブリダイゼーションにおいて競合原因を生じる可能性を秘めており、かつ前記分子ビーコンは内因性のプローブであるため、前記標的配列に結合するためのアンプリコン（単位複製配列）の反対鎖と競合するに違いない。両競合形態が組合わさることにより、いくつかの標的分子に対する分子ビーコンのハイブリダイゼーション効率は、減少されるかもしれない。
【０００５】
ハイブリダイゼーション・プローブは、蛍光団成分で一箇所ラベルされたオリゴヌクレオチドである。各ハイブリダイゼーション・プローブ・アッセイにおいて、このようなオリゴヌクレオチドが二つ必要であり、一つはドナー蛍光団でラベルされ、もう一つはアクセプター蛍光団でラベルされる。フルオレセインは、通常ドナーとして使用され、通常Cy5、LC-RED 640およびLC-RED 705がアクセプターとして使用される。ドナー蛍光団が励起されることにより、アクセプター蛍光団の吸収スペクトルと重複する発光スペクトルを生じる。ハイブリダイゼーション・プローブ対は、標的分子内で隣接したヌクレオチド配列を認識するようにデザインされる。前記アクセプター・オリゴヌクレオチドは、分離時には励起されず、蛍光シグナルを発生しない。しかし、ポリヌクレオチド標的配列にハイブリダイゼーションしている間は、前記ドナーとアクセプター・プローブがかなり近接し、前記ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移転が可能となる。前記アクセプター蛍光団からの蛍光シグナルは、両プローブが標的分子にハイブリダイズした場合にのみ生じる。PCR反応に組み込んだ場合、前記アクセプターによって発光される蛍光量は、合成される標的量に比例し、前記アクセプター・プローブからの蛍光を増幅サイクル毎に一度モニターすると、蓄積産物のリアルタイム計測が容易になる。プローブおよびアッセイ条件を慎重にデザインすることにより、リアルタイムPCRによって密接に関連した標的を判別することが可能になる。さらに、ハイブリダイゼーション・プローブ対は、融解ピーク解析およびTm測定によって対立遺伝子を判別するために使用することもできる。ホモ接合性サンプルは、融解曲線解析の際に特定の融解ピークを生じることによって同定され、ヘテロ接合性サンプルは、一回の融解トレースにおいて2つのピークが存在することにより同定されるであろう。
【０００６】
5'-エキソヌクレアーゼ、分子ビーコンおよびハイブリダイゼーション・プローブ・アッセイは、別々のDNA鎖に位置するプローブおよび標的配列を有する二分子の系である。スコーピオン・プローブは、単分子の結合イベントを介して作動し、プローブおよび増幅された標的配列が、同じDNA鎖に位置する。単分子の結合イベントは、動態学的に二分子ハイブリダイゼーションより好まれる。スコーピオン・プローブには、プローブ末端配列が付着されたプライマーを含み、該プローブ配列は、分子ビーコンのものと同様のステム-ループ二次構造内に含まれている。伸長されていない形態において、スコーピオン・プライマーは、蛍光団とクエンチャー部分がかなり近接しているため、蛍光がない。PCRの際に、前記スコーピオンのプライマー成分は、その3'が伸長され、プローブ・ハイブリダイゼーションに必要とされる相同的標的配列が産生される。前記スコーピオン・プローブ配列が、増幅された標的にハイブリダイズすると、前記蛍光団およびクエンチャー部分が空間的に分離されて、標的が増幅されると同時に蛍光シグナルに有意な増加を生じる。プローブおよびアッセイ条件を慎重にデザインすることにより、リアルタイムPCR解析の際に完全マッチの標的のみが蛍光シグナルの増加を生じ、多型標的を判別することができる。
【０００７】
TaqManプローブ、分子ビーコン、ハイブリダイゼーション・プローブおよびスコーピオン・プライマーでは、ポリヌクレオチド配列を検出および判別するためにFRETを利用する。しかし、他のライトアップ・プローブ系では、DNA配列を検出および判別するために、ドナーとアクセプター部分間のFRET移転を必要としない。これらのライトアップ・プローブは、オリゴヌクレオチド認識配列および単一の蛍光性レポーター基を含み、このようなレポーターは、典型的には不斉シアニン色素チアゾールオレンジの誘導体である。前記ライトアップ・プローブの蛍光色素成分は、オリゴヌクレオチド分子の末端に付着される。一本鎖のときに、相補的な核酸配列にハイブリダイズしたときよりも、プローブは有意に低い量の蛍光を発光する。蛍光発光量を測定することにより、ライト−アップ・プローブを、核酸配列の検出および単一部位が異なった標的間の判別のために使用してもよい。
【０００８】
単一チューブ内で標的DNAを増幅し、配列の検出/判別を行うアッセイである均一(homogenous)アッセイが、分子ビーコン、TaqManプローブ（5'エキソヌクレアーゼアッセイ）、FRETプローブおよびスコーピオン・プライマーにおいて記載されている。均一解析法により、結果を生じるための下流の解析（たとえば、PCR産物の精製、酵素消化、ゲル解析その他）を行う必要がなくなり、反応間の相互汚染の可能性が減少される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明
一つの側面において、本発明は、ハイブリダイゼーション・ビーコン（HyBeacon）であって、実質的に二次構造をもたず、かつヌクレオチド残基の一つがレポーターでラベルされ、およびもう一つが任意にクエンチャーでラベルされており、好ましくは前記レポーターでラベルされたヌクレオチド残基と前記クエンチャーでラベルされたヌクレオチド残基間のヌクレオチド残基が1〜15の間であるヌクレオチド残基で形成されたオリゴヌクレオチドであるハイブリダイゼーション・ビーコンを提供する。蛍光団部分とクエンチャー部分を両方もつハイブリダイゼーション・ビーコンをF-Q HyBeaconと命名し、一方、蛍光団などのレポーター成分をもつが、クエンチャー部分を欠いたプローブをF HyBeaconと命名する。
【００１０】
本発明のハイブリダイゼーション・ビーコンは、実質的に二次構造をもたない直鎖状の一本鎖オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの一領域が、もう一方とハイブリダイズすると二次構造を生じ、たとえばループを形成して（従来の分子ビーコンと同様に）、該オリゴヌクレオチドがその相補的標的とハイブリダイズする効率を減少させる。本発明のHyBeaconは、該オリゴヌクレオチドの一領域がもう一方にハイブリダイズする傾向が、実質的に全く存在しない。
【００１１】
前記HyBeaconの長さは、相補的ポリヌクレオチド標的とハイブリダイズして、その融解温度が標的の正確な配列に依存する安定なハイブリッドを提供するのに適した長さである。15残基未満のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである場合、特に前記ハイブリダイズする2つの配列が正確に相補的でない場合は、十分に安定なハイブリッドを形成しない。約30ヌクレオチド残基より長いオリゴヌクレオチドである場合は、単一ヌクレオチドミスマッチが存在する可能性に対して、ハイブリッドの融解温度が比較的感受性が低いハイブリッドを形成する。ヌクレオシド残基は、通常天然に存在するA、C、GおよびTに由来する。しかし、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンの一以上の位置でヌクレオチド類似体を使用してもよく、このようなヌクレオチド類似体は、たとえば塩基部分、および／または糖部分、および／または三リン酸の結合に修飾がなされていてもよい。プロピニルdU（dT-アナログ）および2-アミノdA（dA類似体）などの塩基修飾は、一般にハイブリダイゼーション特性を変化させ、および15未満または30より多いヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオチドを使用することも魅力的であろう。あるいは、ペプチド核酸（PNA）、ロック核酸（locked nucleic acid）（LNA）、2'-O-メチルRNA、ホスホルアミダートDNA、ホスホロチオエートDNA、メチルホスホナートDNA、ホスホトリエステルDNAまたはDNA塩基類似体からなるか、またはこれらを含むオリゴヌクレオチドを、より安定して標的配列と相互作用を形成するために使用してもよい。
【００１２】
FおよびF-Q HyBeaconsは、相補的な核酸配列がハイブリダイズしたときに、一本鎖のコンフォメーションのときよりも有意に多量の蛍光を発光した。F HyBeaconsにはクエンチャー成分が存在しないにもかかわらず、一本鎖状態のときよりも二本鎖のときに有意に蛍光シグナルを発光したことは、予想外の所見であった。
【００１３】
関連するアクセプター・プローブを、またはプローブ間のエネルギー移転を必要とせず（既知のハイブリダイゼーション・プローブにおいて必要とされる）、プローブ・アッセイをデザインできる点において、これは有利な所見である。本明細書の目的として、このようなアッセイを「単一プローブ・アッセイ」と命名する。
【００１４】
蛍光団−クエンチャー系は、文献に詳しく記載されており、本明細書でさらに記載することはしない。蛍光団でラベルされたヌクレオチド残基、およびクエンチャーでラベルされたヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドの調製も、文献に詳しく記載されている。
【００１５】
前記シグナル比とは、ハイブリダイゼーション・ビーコンを含む二本鎖ハイブリッドのシグナル強度と、一本鎖プローブのシグナル強度の比であり、好ましくは可能な限り大きく、たとえば3以上である。このシグナル比は、多数の因子に依存する。F-Q HyBeaconにおいて、励起されたドナー分子（蛍光団）から近くのアクセプター分子（クエンチャー）へのエネルギー移転の比は、前記二分子間の距離だけでなく、それらの相対的な角配置にも依存する。わずか1または3ヌクレオチド残基によって分離された蛍光団およびクエンチャー部分を有するHyBeaconsでは、有意にかつ有効に1より大きい蛍光シグナル比を有する。3ヌクレオチド以上離れて蛍光団およびクエンチャーを有するHyBeaconsでは、より大きなシグナル比を示す。F-Q HyBeaconにおいて、蛍光団およびクエンチャー成分は、二部分が5ヌクレオチド残基以上離れるように位置することが好ましい。5ヌクレオチド未満によって分離されたドナーおよびアクセプター分子では、「接触」を生じて、非FRET相互作用が可能になるかもしれない。
【００１６】
F HyBeaconは、5ヌクレオチドより離れたドナーおよびアクセプター成分を有するF-Q HyBeaconsに匹敵するシグナル比を示すことが立証されている。F HyBeaconのシグナル比は、クエンチャー部分が存在しないにも関わらず有意かつ有効に1よりも大きい。クエンチャー部分が存在しないことにより、F HyBeaconは角配置の影響を受けず、その結果、蛍光団とクエンチャー分子間の相対距離では、二本鎖および一本鎖状態において発光される蛍光シグナル量を決定できない。蛍光団部分は、HyBeaconプローブが標的分子にハイブリダイズしたときに、該プローブが一本鎖形態のときよりも有意に強い蛍光シグナルを発光すると考えられている。これは、おそらくいくつかが二重鎖DNAと相互作用した形態であるためである。
【００１７】
一定の場合には、前記オリゴヌクレオチド内に一以上のレポーターを含むことが適切であろう。
【００１８】
本発明にしたがったハイブリダイゼーション・ビーコンにおいて、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、既知の多型を有する既知のポリヌクレオチド標的の対立遺伝子の一つに完全に相補的な配列を有する。たとえば、点変異、または一塩基挿入もしくは欠失（SNP）である。F-Q HyBeaconでは、前記標的におけるこのようなSNPは、たとえ本質的でないとしても、好ましくは蛍光団ラベルされたヌクレオチド残基とクエンチャーラベルされたヌクレオチド残基間のハイブリダイゼーション・ビーコンの中間ヌクレオチド残基に相補的である。F HyBeaconにおいて、前記多型部位は、たとえ本質的でないとしても、好ましくは前記オリゴヌクレオチドプローブ内の中心に位置している。
【００１９】
あるいは、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、既知の非多型ポリヌクレオチド標的に相補的であってもよく、単にその標的を検出するために使用してもよい。また、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、未知のおよび特徴づけられていない多型を有する潜在的な多型標的を研究するために使用してもよい。ディファレンシャル・ビーコン・ハイブリダイゼーションおよび融解ピークTmの相違によって、未知の多型の位置および／または特質をマップできる可能性が考えられる。
【００２０】
前記蛍光団ラベルされたヌクレオチド残基および／またはクエンチャーラベルされたヌクレオチド残基は、好ましくは、5’末端または3’末端よりもむしろオリゴヌクレオチド配列の内部に位置する。前記ハイブリダイゼーション・ビーコンが、ポリヌクレオチド標的とハイブリダイズを生じると、これらの特徴のすべてが、最適な融解温度を有し、かつ完全マッチの鎖と単一または多数の部位にミスマッチを有する鎖の間の融解温度（ΔTm）に実質的な相違を有する安定なハイブリッドの形成に寄与する。
【００２１】
二以上のハイブリダイゼーション・ビーコンであって、検査条件下においてSNPの各対立遺伝子に完全に相補的なものが提供されることによって便利になるであろう。それぞれのハイブリダイゼーション・ビーコンが異なった蛍光団を有する場合、ホモ接合性およびヘテロ接合性の標的を解析するための溶液にプローブを混合すれば便利になるであろう。同様の方法において、種々の対立遺伝子におけるいくつかの異なったSNPsに相補的なハイブリダイゼーション・ビーコンの混合物を、多重解析のための溶液中で一緒に使用してもよい。ただし、それぞれが、スペクトルの異なった蛍光団でラベルされている。
【００２２】
あるいは、本発明のハイブリダイゼーション・ビーコンは、支持体上または支持体内に固定化されて提供されてもよい。溶液中で相補的な標的と自由にハイブリダイズするような形態で、支持体を使用してオリゴヌクレオチドを固定化するための技術およびリンカーが、文献に詳細に記載されている。また、支持体を使用して、間隔を置いた位置に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、異なったオリゴヌクレオチドプローブが本発明による異なったハイブリダイゼーション・ビーコンであるアレイが、本発明の範囲に含まれる。さらに、HyBeaconプローブは、支持体上または内に固定されたDNA標的を解析するために使用しもよく、このような解析では、異なった標的をアレイ型フォーマットで間隔を空けた位置に置いてもよい。
【００２３】
もう一つの側面において、本発明は、既知のまたは疑わしい多型を任意に有するポリヌクレオチド標的を調査するための方法であって、該方法は、蛍光団ラベルされたヌクレオチド残基および任意にクエンチャーラベルされたヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供することを含む方法を提供する。前記ポリヌクレオチド標的は、前記オリゴヌクレオチドプローブとインキュベートすることによってハイブリッドを形成し、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記ハイブリッドが形成されたときに、一本鎖形態のときよりも蛍光レベルの増加を示す。前記オリゴヌクレオチドプローブによって発光された蛍光レベルは、所定の温度で観測されるか、または温度範囲以上でモニターされる。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書において定義されたハイブリダイゼーション・ビーコンである。本発明の好ましい態様において、前記方法は、関連するクエンチャーを伴わず、かつアクセプター部分を保有するさらなるプローブを伴わない、本発明にしたがったハイブリダイゼーション・ビーコンの単一型を利用する。
【００２４】
前記ポリヌクレオチド標的は、DNA、RNAまたはcDNAであってもよく、一本鎖形態で使用され、またはDNA二本鎖を三本鎖形成の調査のために使用してもよい。前記ポリヌクレオチド標的は、既知の多型、好ましくはSNPｓを有する。前記標的を、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする。このプローブは、本明細書において記載したハイブリダイゼーション・ビーコンであってもよい。前記ハイブリッドは、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブよりも強い蛍光シグナルを発生することが必要である。前記ハイブリッドの融解温度は、数ある中で、ポリヌクレオチド標的とオリゴヌクレオチドプローブが完全に相補的であるかどうか、あるいは前記SNPの位置または近くで生じている単一またはさらには二重のミスマッチが存在するかどうかに依存する。前記方法は、前記オリゴヌクレオチドプローブによって発光される蛍光シグナルレベルを、前記ハイブリッドの融解温度近くの所定の温度、または温度範囲以上で観測することを含む。二つの選択肢を記載する。ただし、その他も可能である：−
a）前記ハイブリッドを含む溶液の温度をゆっくりと上昇し、一方、温度（-dF/dT）対温度に関して蛍光シグナル強度のネガティブ誘導体のグラフを構築するために、連続して蛍光シグナルを観測する。前記ハイブリッドの融解温度は、ピークとして現れ、前記ポリヌクレオチド標的配列についての情報を提供する。HyBeacon融解解析を介して生じたTmsを、多型標的を区別するために使用することもできる。選択される温度範囲は、一般に前記ハイブリッドの融解温度を包含する。
【００２５】
b）前記ハイブリッド溶液を所定の温度に保持して、蛍光レベルを観測した。一般に、前記所定の温度は、完全マッチのハイブリッドの融解温度と、一または二のミスマッチを有するハイブリッドの融解温度間の中間が選択される。観測された蛍光シグナルのレベルは、前記ハイブリッドが融解したかどうかの指標を提供し、そしてポリヌクレオチド標的の配列についの情報を提供する。多型標的は、終了点およびリアルタイム、または動態学的フォーマットで判別されてもよい。
【００２６】
典型的には、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、前記標的ポリヌクレオチドの対立遺伝子の1つに相補的な配列、典型的には完全に相補的な配列を有する。完全に相補的なビーコンを使用することにより、マッチしたハイブリダイゼーションとミスマッチしたハイブリダイゼーション間の区別が可能になる。適宜に、二以上の異なったハイブリダイゼーション・ビーコンは、標的ポリヌクレオチドの別々の対立遺伝子に相補的な配列、理想的には完全に相補的な配列を有する。
【００２７】
都合の良いことに、前記ポリヌクレオチド標的は、適切なプライマーを使用してゲノムDNAの所望の部位を増幅することによって形成されたPCR アンプリマー（amplimer）であってもよい。均一モードによって、たとえば増幅サイクル手順の前、間、または後に、前記オリゴヌクレオチドプローブを単一の反応容器に添加することによって増幅し、かつ標的調査を行うことによって簡便になるであろう。また、唾液などのサンプルから、DNA、RNAまたはcDNAを前もって抽出せずに、直接標的の増幅および配列調査を行うことによって簡便になるであろう。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプローブは、PCR増幅の際に連鎖伸長を妨げるように、その3’末端が修飾される。
【００２８】
前記ハイブリダイゼーション・ビーコンの融解温度を、多型標的ポリヌクレオチドを同定するために使用してもよい。また、本発明のハイブリダイゼーション・ビーコンは、単一のプローブを使用してホモ接合性およびヘテロ接合性DNAを同定するために使用してもよい。
【００２９】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、いかなる方法においても限定を意図するものではない。
【００３０】
【実施例】
材料および方法
（i）ハイブリダイゼーション・ビーコンのデザイン
HyBeaconプローブを、ヒトN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）遺伝子（表1参照）およびシトクロムP450をコードする（CYP）遺伝子（表2および3を参照）内にある十個のSNPsに対してハイブリダイズするようにデザインした。プローブは、多型ヌクレオチドがHyBeacon配列の中心近くに位置するようにデザインした。すべてのHyBeaconプローブは、約20ヌクレオチドの長さであり、内部のウラシル残基（DNA配列においてはチミンに置換する）に結合された蛍光団部分をもつ。蛍光色素である6-カルボキシフルオレッセイン（FAM）、テトラクロロフルオレッセイン（TET）およびヘキサクロロフルオレッセインを、新規ケミストリー（novel chemistry）によってU残基に吸着し（Oswel DNA services, Southampton, UKから入手可能）、六蛍光団結合ケミストリー（FAM propo dU、FAM propargyl dU、dU C6 FAM、dU FAM、FAM cap prop dUおよびFMOC dU)を評価した。dU C6 FAMおよびFMOC dU蛍光団が、わずかに優れたデータを生じることがわかり、優先的に使用した。また、F-Q HyBeaconsでは、クエンチャー部分（メチルレッド）を内部のU残基に配置し、そのHyBeaconsにおいて、蛍光団とクエンチャー分子が1、3、5、6、7、8および9ヌクレオチド残基離れたHyBeaconsを試験した。蛍光団とクエンチャー分子が側面に位置する多型ヌクレオチド、および側面に位置しない多型ヌクレオチドをもつF-Q HyBeaconsを調査した。前記プローブをリアルタイムPCRアッセイに組み込んだときに、Taqを介したHyBeaconsからの伸長を防ぐために、合成した大多数のHyBeaconsでは、3'リン酸またはオクタンジオール成分をもつ。FおよびF-Q HyBeaconsは、NAT2およびCYP多型配列の対立遺伝子の1つと完全にマッチするようにデザインされており、その結果SNPの他のバリアントでは、プローブ・ハイブリダイゼーションの際にミスマッチ部位が作製される。両方の対立遺伝子に完全に相補的なHyBeaconプローブを、両対立遺伝子それぞれのSNPについて合成した。
【００３１】
【表１】
NAT2多型配列。アリールアミンN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）のヒト遺伝子配列。単一ヌクレオチド多型（SNPs）を含む位置は、太字で示してある。制限断片長多型は、481（*5A）、590（*6）、803（*5C）および857（*7A）に存在する。
【００３２】
（ii）NAT2およびCYP2D6多型PCR産物の増幅
多型標的は、唾液（水で50％稀釈）、参照血液サンプル（Dundee大学）、ヒト胎盤ゲノムＤＮＡ(Sigma-Aldrich)、増幅されたNAT2およびCYP産物を含むpGEM-Tプラスミド(Promega)から分離したゲノムDNAのいずれかから増幅した。多型部位に関連して、大きさおよび位置が異なったNAT2並びにCYPアンプリコンを生じる種々のプライマー対を評価した。たとえば、NAT2*5A、NAT2*5C、NAT2*6、NAT2*7A、CYP2D6*3およびCYP2D6*4多型配列を増幅するために使用した最適なプライマー対は、それぞれ195991/195993、DdeF2/DdeR、TaqF2/TaqR2、BamF2/BamR、2D63F/2D63Rおよび2D64F2/2D64R2である（表4）。多型ヌクレオチドを含む約80-150BpのDNA断片を増幅するために、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。標的の検出およびSNPの判定アッセイは、均一および不均一なフォーマットにおいて行った。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
【表４】
（iii）SNPsの不均一融解解析
PCR量は、典型的には30μlであり、約200ngのDNAテンプレート、1×PCRバッファー（Pharmacia）、0.5μの各プライマー、1unitのTaqポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)および1mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech)が含まれる。変性反応工程（94℃、5分）の後、変性（94℃、30秒）、プライマーのアニーリング（50℃、1分）および産物の伸長（72℃、1分）からなる40サイクルを使用してPCR標的を増幅した。増幅後、PCR産物を0.1体積の3M酢酸ナトリウムおよび2体積のエタノールで沈殿した。-20℃で10分間インキュベーションした後、13000r.p.m.で30分間遠心して70％エタノールによる洗浄工程を二回おこない、ペレットを1×ハイブリダイゼーションバッファー／プローブ混合物（50mM Tris pH7.4、3mM MgCI2、適切なHyBeacon）に再懸濁した。この懸濁では、最初のPCR反応ごとに、5μlのバッファー／プローブ混合物を添加した。F-Q HyBeaconsは、典型的には500nM〜1μＭ間の濃度で使用し、F HyBeaconsは、100nM〜300nMの濃度の間で使用した。5μlの反応量を、融解曲線解析プログラムを使用してLightCyclerTM(Roche)によって解析した。ハイブリダイゼーション解析には、初期蛍光読みとり（30℃において30秒）、ハイブリダイゼーション（94℃において1分間の後、30℃において2分）、規準化（65℃において1秒、85℃において1秒、30℃において1秒）および融解解析（0.1℃／秒の移行速度で30℃〜95℃まで）を含む。規準化に単一蛍光獲得を使用したことを除き、蛍光は連続してモニターした。融解曲線は、LightCyclerソフトウェアを使用して、温度（ｙ軸に対する-dF/dt）対温度（x軸）についてネガティブ誘導体蛍光をプロットすることによって構築した。
【００３６】
（iv）均一「リアルタイム」PCR増幅アッセイ
PCR体積は20μlとし、これには2μlの50%唾液または約200ngのゲノムDNA、1xZ-TaqTバッファー（TaKaRa）または1xHyBeacon PCRバッファー（10mmTris. Cl pH 8.8、25mm KCI、3.5mM MgCI2、5ng/pl BSA）、0.5μMプライマー、1unit Taq ポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）、および1mmのdNTPsが含まれる。増幅された標的の蓄積をモニターするために蛍光プローブを利用する「リアルタイム」PCRアッセイにおいても、適切なF-QおよびF HyBeaconsがそれぞれ500-1000nMまたは100-300nM含まれる。多型標的配列は、LightCyclerTM（Roche）およびABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems）で増幅した。LightCyclerキャピラリーで行った反応液を、95℃において1分間（ゲノム、およびプラスミドDNA）または5-10分間（唾液サンプル）インキュベーションすることによって変性させた後、変性（95℃において10秒）、プライマーのアニーリング（Faqにおいて10秒間）、および産物の伸長（72℃において10秒間）を含む40-50サイクルを使用して多型標的を増幅した。蛍光穫得は、各アニーリング工程の終わりに行った。蛍光穫得温度（Faq）は、アンプリコンおよびHyBeacons間で変更し、このFaqは、マッチおよびミスマッチプローブのTms（表5を参照）間のおよそ中間である。たとえば、2D64C* HyBeaconアッセイでは、リアルタイム増幅によってCYP2D6 *1および*4 SNPsを判別するために、57℃のFaqを使用する。増幅後、反応液を変性（95℃において10秒）させて、冷却（35℃において2分間）した後、蛍光を連続的に得て、融解解析（0.1℃／秒の移行速度で30℃〜95℃まで）を行った。融解ピークは、LightCyclerソフトウェアを使用して、温度（ｙ軸に-dF/dt）対温度（x軸）についてネガティブ誘導体蛍光をプロットすることによって構築した。
【００３７】
(v)HyBeacon標的の非対称増幅
プローブ・ハイブリダイゼーションのための一本鎖DNA標的分子を作製するために、非対称PCRを使用した。増幅は、LightCyclerキャピラリーで行った。HyBeaconハイブリダイゼーションに必要な、相同DNA配列を含む一本鎖産物を増幅するために、アンチセンスプライマーを使用した。プローブ-結合部位を含まない鎖を作製するために、センスプライマーを二本鎖DNAの初期増幅に含めた。アンチセンスおよびセンスプライマーは、典型的には50：1の比で使用した。多型NAT2およびCYP2D6標的を含むpGEM-Tプラスミドを、PCRテンプレートとして使用した。PCR反応体積は、典型的には20μlであり、およそ200ngのプラスミドDNA、1xZ-Taq PCRバッファー（TaKaRa）、0.5μMのアンチセンスプライマー、10nMのセンスプライマー、1unit Taq ポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）、1mM dNTPs（Amersham Pharmacia Biotech）および適切なハイブリダイゼーション・ビーコンが含まれている。均一増幅および融解ピークの解析は、上述の通りに行った。
【００３８】
(vi)多型標的の固相解析
PCR増幅は、アンチセンスプライマーの5'末端がビオチン化されていることを除いて、均一アッセイにおいて前述した通りに行った。増幅に続いて、10-15μlのビオチン化されたPCR産物を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Hybaid）の個々のウェルに添加した。1x DASH buffer gold（Hybaid）を各ウェルに添加して、最終体積を50μlとした。室温で1時間インキュベーションした後、該溶液をそれぞれのウェルから除去した。50μlの0.1M NaOHをウェルに添加して、二本鎖DNAを変性させた。5分間インキュベーションした後、ウェルを50μlの0.1M NaOHで一回および1x DASH バッファーで二回洗浄して、ビオチン化されていないDNA鎖を除去した。1x DASHバッファー中の過剰のHyBeacon（>1pM）（2μlプローブ+48μlバッファー）を各ウェルに添加した。95℃において1分間反応液を加熱して、次いで25℃まで概算速度0.08℃/秒で冷却することによって、固定化された一本鎖DNAにプローブをハイブリダイズさせた。溶液およびハイブリダイズしていないプローブをウェルから除去して、50μlのフレッシュ1xDASHバッファーに置換した。ハイブリダイズしたプローブの融解解析は、DASH(Dynamic Allele Specific Hybridisation)装置(Hybaid)で、0.02-0.07℃/秒間の移行速度を使用して行った。
【００３９】
(vii)多重HyBeacon標的検出
多数のプライマー対およびHyBeaconプローブを含む反応は、ABI PRISM（R）7700Sequence Detectorを使用して行った。NAT2*4（*7A遺伝子座）、NAT2*4（*5C遺伝子座）およびCYP2D6*1多型標的を増幅して、それぞれFAM、TETおよびHEXラベルされたHyBeaconプローブを使用して検出した（表4）。変性反応工程（95℃において5分）の後、変性（95℃において15秒）、プライマーアニーリング（50℃において30秒）および産物の伸長（72℃において30秒）を含む40サイクルを使用して、多型標的をゲノムDNAから増幅した。蛍光穫得は、それぞれの増幅工程においてプライマーアニーリングの際に行った。
【００４０】
結果および考察
(i)多型標的配列
ヒトN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）遺伝子座は、多型であることが示されている。NAT2遺伝子の欠失コピーでは、いくつかのアリールアミン薬剤および毒物のアセチル化を遅くすることが知られている。疫学調査では、この緩徐アセチル化表現型を、膀胱および結直腸癌に対するリスクと関連づけている。多型NAT2遺伝子座の解析により、ヌクレオチド置換を含む多くの緩徐アレルが確認されている（表1を参照）。これらの置換には、部位481（TからCに）、590（GからAに）、803（AからGに）および857（GからAに）の点変異を含み、この変異が、それぞれ*5A、*6、*5Cおよび*7Aの制限断片長多型性（RFLPs）を生み出す。これら多型遺伝子座のそれぞれにおいて、*1はヒトゲノムにおいて最も頻繁に生じる対立遺伝子変異である。
【００４１】
CYP2D6、CYP2C9およびCYP2C19などのヒト遺伝子によってコードされるチトクロームP450酵素（デブリソキン4-ヒドロキシラーゼ）は、抗降下剤、抗不整脈剤および血圧降下剤を含む30以上の一般的に処方される薬剤の代謝に応答性である。コーカサス人のおよそ5-10%は、チトクロームP450酵素活性が欠損しているため、不十分な代謝表現型を示す。多くの対立遺伝子変異が、CYP2D6遺伝子座において同定されており、最も多くは、CYP2D6*3（別名CYP2D6A）およびCYP2D6*4（別名CYP2D6B）単一ヌクレオチド多型である。*3および*4遺伝子型をもつ個体では、不十分な酵素活性表現型をもつことが示されている。
【００４２】
ハイブリダイゼーション・ビーコンが、特異的に増幅されたDNA配列を検出し、および単一ヌクレオチド多型を含む標的を判別する可能性を試験するために、NAT2およびCYPの多型を使用した。
【００４３】
(ii)オリゴヌクレオチド標的に対するディファレンシャル・プローブ・ハイブリダイゼーション
HyBeaconプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、その相互作用は、完全にマッチまたはミスマッチのいずれでもよい。図1には、マッチ、ミスマッチ、および二重ミスマッチの二本鎖間における相違を例示し、それぞれの相互作用の型を分類している。HyBeaconプローブは、完全マッチおよびミスマッチのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしており、LightCyclerで分析した。一本鎖および二本鎖状態のHyBeaconから発光された蛍光量を比較した場合、プローブが標的分子にハイブリダイズしたときに、溶液中でフリーなときよりも多くの蛍光量が発光されることが観測された。一本鎖および二本鎖HyBeaconsプローブから生じたこのような蛍光発光の相違は、統計学的に有意であり（p<0.01単一-因子ANOVA）、標的DNAの存在を蛍光の定量により検出し得る方法が提供された（図2）。
【００４４】
温度およびプローブ・ハイブリダイゼーション状態の変化によって引き起こされる蛍光発光の変化をモニターすることにより、HyBeacon/相同体対の融解ピークを作製することができる。オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたHyBeaconプローブは、完全に相補的な標的分子にハイブリダイズしたプローブと比較して、低いTmsの融解曲線を生じる。図2は、マッチおよびミスマッチのオリゴヌクレオチド標的に対するNAT2 *4 HyBeacon（*5A SNP）のディファレンシャル・ハイブリダイゼーションを示す。ミスマッチ領域では、プローブTmが低下しており、融解ピーク解析を介して多型標的を判別することができる。マッチ、単一ミスマッチおよび複数ミスマッチの標的も、融解ピークTmによって確実に判別することができるであろう。さらに、マッチおよびミスマッチのTms間の中間温度で蛍光穫得を行うことよって、蛍光の定量に基づいて多型標的を判別することができるようになる。蛍光穫得温度では、マッチするHyBeaconがその標的にハイブリダイズして、その標的から溶解して離れてしまったミスマッチのプローブよりも多くの蛍光を発光する（図2）。
【００４５】
溶液中では、HyBeaconsは、少量のバックグラウンド蛍光のみを発光する。しかし、標的配列に結合すると、ハイブリダイゼーションの直接の結果として、有意により蛍光が発光される。わずか単一ヌクレオチドが異なった配列を、(i)ハイブリダイゼーション・ビーコン分子がその標的配列にハイブリダイズするときに生じる蛍光量および（ii）前記プローブ/標的二本鎖の融解温度（Tm）によって判別することができるであろう。
【００４６】
蛍光定量化および融解分析法を、F-QおよびF HyBeaconプローブで行うと、同等な質の結果を生じた。図3は、オリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズしたFおよびF-Q NAT2*4 HyBeaconsに由来する融解曲線を例示する。F-Q HyBeaconsは、蛍光団とクエンチャーの間隔および角配置効果（データは示さず）に対して若干の依存性を有するかもしれない。しかし、F HyBeaconsでは、クエンチャー部分が存在しないにもかかわらず、標的ハイブリダイゼーションに対して高いレベルの蛍光発光を示す。FおよびF-Q HyBeaconプローブの蛍光団部分は、二本鎖の状態のときに、一本鎖コンホメーションの場合よりも有意に蛍光を発光する（下記参照）。
【００４７】
(iii)単一ヌクレオチド多型の多様性
HyBeaconプローブを使用して、NAT2およびCYP2D6対立遺伝子に存在する一塩基置換多型が判別されることが示されている。ハイブリダイゼーション・ビーコン分子が、挿入および欠失（InDel）多型を判別する能力を試験するために、一連のオリゴヌクレオチド標的をTB0993 NAT2 *4プローブにハイブリダイズさせた。多型の型および位置を変えて、3種の挿入および3種の欠失オリゴヌクレオチドを解析した。それぞれのInDel標的は、完全マッチのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたHyBeaconと比較して、かなりのTm低下を生じた（図4）。置換多型と同様に、InDelsでも、HyBeacon/標的二本鎖のTms、並びにマッチとミスマッチプローブのTms間の温度で発光される蛍光量によって判別できるであろう。
【００４８】
(iv)PCR産物におけるSNPsの判別（不均一アッセイ）
別々のチューブで標的増幅およびSNP判別を行う不均一アッセイを、NAT2 *5A、*5Cおよび*6多型について、並びにCYP2D6 *3および*4 SNPsについて行った。融解ピーク解析を介して確実にSNP判別可能な好結果の不均一アッセイが、試験した全ての多型において展開された。多型ヌクレオチドを含むPCR産物は、NAT2およびCYP2D6テンプレートDNAから増幅した。アンプリコンの大きさは、80bp〜282bpの範囲の長さである。PCR産物を単離して、HyBeaconプローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁した。プローブをPCR標的にハイブリダイズさせて、LightCyclerキャピラリーにおいて融解解析を行い、PCR標的の同一性に依存したTmsの融解ピークを生じた。HyBeaconsは、マッチおよびミスマッチのPCR標的を、プローブ/標的二本鎖の融解温度によって容易に判別する。F-QおよびF HyBeacon変異型では、どちらも不均一SNP判別アッセイが適切に実行される。
【００４９】
CYP2D6*3多型について行ったアッセイは、FおよびF-Q HyBeaconsが、不均一解析においてどのくらいSNPを判別することができるかを示している。119bpのPCR産物をCYP2D6*3多型DNAから増幅した。PCR産物を単離して、2D63A（F-Q）または2D63B(F)HyBeaconプローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁した。2D64 F HyBeaconは、クエンチャーを欠いていることにより大きな蛍光バックグラウンドを生じるため、F-Qプローブより5倍低い濃度で使用した。図5は、HyBeaconが*1および*3 CYP2D6対立遺伝子を含むPCR標的にハイブリダイゼーションすることによって誘導された融解曲線を示す。2D63Aおよび2D63Bプローブは、同一のヌクレオチド配列を有し、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子に完全に相補的あり、したがって*3対立遺伝子にハイブリダイズするときは、単一塩基ミスマッチを含むことになる。2D63A F-Q HyBeaconは、*3および*1対立遺伝子の配列にそれぞれハイブリダイズしたときに、約56℃および65℃のTmsを有する融解ピークを生じた。2D63B F HyBeaconは、ミスマッチおよびマッチPCR産物にそれぞれハイブリダイズしたときに、同様の約58℃および65℃のTmsを有する融解ピークを生じた。HyBeaconが前記SNPの2種の対立遺伝子にハイブリダイゼーションすることによって生じた融解温度は、非常によく再現することができ、統計学的にも有意である（単一因子ANOVAがp<0.01）。したがって、CYP2D6 *1および*3遺伝子型（それぞれ、正常および欠損型の酵素代謝表現型に関連する）は、不均一HyBeaconアッセイで確実に判別される。
【００５０】
(v)核酸配列のリアルタイム検出
HyBeaconプローブから発光される蛍光量は、オリゴヌクレオチドが相補的な核酸配列にハイブリダイズしたときに、一本鎖コンホメーションのときよりも有意に大きい。したがって、PCR増幅の経過全体にわたって、特定のDNA標的の蓄積をリアルタイムでモニターするのに、HyBeaconsが反応液に含まれていてもよい。図6は、増幅の各サイクルにおいて産物の蓄積をモニターするために2D64C* HyBeaconを使用した、ゲノムおよび唾液DNAに存在するCYP2D6*1配列の検出を示す。
【００５１】
(vi)SNPsの「リアルタイム」判別（均一アッセイ）
HyBeaconプローブが多型標的配列にハイブリダイズするときに、相互作用は、完全にマッチするか、またはミスマッチするかいずれであってもよい。ヌクレオチドがミスマッチする部位では、完全に相補的な配列と比較してハイブリダイゼーションTmが低下するため、プローブ/標的二本鎖が不安定になる。ハイブリダイズしたHyBeaconから発光される蛍光量は、一本鎖プローブより有意に多いので、ハイブリダイゼーションTmに基づいて多型標的配列を判別することができるだろう。PCRにおけるアニーリング（および蛍光穫得）温度を最適化して、HyBeaconプローブに完全に相補的な標的配列のみが増幅時に蛍光シグナルを増加するような選択的ハイブリダイゼーションによって、密接に関連したDNA配列をリアルタイム判別することもできるだろう。SNPsを含む多型配列を、リアルタイム増幅の際に得られる蛍光データを使用して同定してもよい。たとえば、HyBeaconプローブが、変異を含むDNA配列に完全に相補的に設計されている場合、変異対立遺伝子が存在する場合にのみ蛍光発光の増加が生じる。
【００５２】
HyBeaconプローブを、NAT2およびCYP多型配列を増幅するようにデザインしたポリメラーゼ連鎖反応に組み込んだ。増幅の各サイクルのプライマーアニーリング段階において、マッチおよびミスマッチHyBeaconのTmsの中間温度で単一蛍光読み込みを獲得した。蛍光穫得温度において、前記HyBeaconは完全マッチの標的にハイブリダイズすると予測されるが、ミスマッチ配列のハイブリダイズは予測されない。ディファレンシャル・プローブ・ハイブリダイゼーションでは、蛍光穫得温度において完全マッチのテンプレートを含む反応液は、増幅の際に蛍光を増加する結果となるが、一方ミスマッチのテンプレートを含む反応液では、蛍光の増加をもたらさない。NAT2*4および*5A多型を判別するために使用したF HyBeacon 0203002を用いた均一SNP解析を、ここに示す。前記HyBeaconは、NAT2の*4対立遺伝子に完全にマッチし、*5A配列にハイブリダイズした場合は、単一塩基ミスマッチを有する。図7aは、SNPsの「リアルタイム」判別を示しており、*4対立遺伝子を含む反応液のみが、PCRサイクル時の蛍光発光に有意な増加を生じる。ミスマッチする*5A対立遺伝子のみを含む反応液では、増幅の際に蛍光発光の増加を生じない。
【００５３】
図8は、多型CYP2D6 *1および*4配列の検出および判別を示すリアルタイムHyBeacon解析のもう一つの例であり、テンプレート供与源としてプラスミドDNAを使用する。また、ゲノムDNAおよび唾液サンプル中に存在する多型配列の判別は、リアルタイムHyBeacon PCR解析によって行ってもよい。図8に示した2D64C* HyBeaconは、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子と完全にマッチし、したがって蛍光発光がリアルタイム増加することによって、*1配列の増幅が特異的に検出される。CYP2D6*1配列のみを含む反応では、比較的多量の発光の増加を生じるが、*4対立遺伝子のみを含むサンプルでは、有意な蛍光増加を示さない。*1および*4対立遺伝子を含む反応では、中程度の蛍光発光量の増加を示す。CYP2D6*4対立遺伝子に完全に相補的な2D64C HyBeaconを使用することにより、2D64C*の遺伝子型の決定結果を確認することができる。リアルタイムPCRによってホモ接合性およびヘテロ接合性DNAの正確な同定を確実にするためには、TaqManTMプローブ、分子的ビーコン、ハイブリダイゼーション・プローブおよびスコーピオン・プライマーと同様に、両対立遺伝子のSNPsに関してサンプルの遺伝子型を決定するために、2種のHyBeaconプローブが必要とされる。
【００５４】
(vii)融解曲線解析によるSNPsの判別
また、多型DNA配列は、HyBeaconプローブを使用して融解解析およびTm測定を行うことによって、「終了点」フォーマットで検出および判別してもよい。HyBeacon/標的二本鎖のホモ接合性融解曲線解析では、増幅直後にLightCycler反応を行ってもよい。融解曲線解析に由来する融解温度は、完全に相補的なHyBeaconsに由来するTmsではミスマッチするプローブが相互作用したものよりも有意に大きく、標的DNA配列を同定することができる。0203002 HyBeacon並びに*4および*5A多型標的について行った増幅後融解解析では、マッチおよびミスマッチ配列について、それぞれ約62℃および54℃のTmsを有する融解ピークが生じた（図7b）。マッチおよびミスマッチ標的配列とハイブリダイゼーションすることによって生じた融解ピークのTmsは、所与のSNPにおいて非常に再現性があり、かつSNPs間で有意に異なっている。したがって、HyBeacon融解温度を解析することによって、SNPsの確実な判別が達成される。増幅後融解解析により、「リアルタイム」蛍光データを確認することができ、PCRにおける蛍光増加の有無が、それぞれマッチまたはミスマッチ標的の存在と実際に相関していることを確認できる。したがって、増幅後融解によって、ミスマッチ標的が存在するために蛍光増加を生じない反応と、標的が存在しないか、またはPCRによる増幅が全くないために蛍光増加を生じない反応間を判別することができる。F-QおよびF HyBeaconの変異型はどちらも、適切に「リアルタイム」増幅アッセイがなされ、かつ均一アッセイにおいて増幅後融解曲線を生じることが示されている。しかし、F HyBeaconsでは、同一のDNA配列のF-Qプローブと比較して、概して優れた質の増幅後融解物を生じることが見出されている。
【００５５】
F HyBeaconプローブにおいて、ホモ接合性サンプルでは、標的配列の同一性に依存してマッチまたはミスマッチの単一の融解ピークを生じるが、一方ヘテロ接合性のDNAでは、マッチおよびミスマッチのピークのどちらも持った融解トレースを生じる。図9は、ゲノムDNAサンプルから増幅した多型CYP2D6 *1および*4配列の、融解ピーク解析による検出および判別を示す。2D64C* HyBeaconは、完全に相補的な*1対立遺伝子を含むホモ接合性DNAにハイブリダイズするときに、約60℃のTmをもつ単一の融解ピークを生じる。ホモ接合性の*4サンプルにハイブリダイゼーションするミスマッチプローブでは、約49℃のTmを有する単一の融解ピークを生じる。*1および*4対立遺伝子をどちらも含むヘテロ接合性のサンプルは、60℃および49℃の融解ピークをどちらも備えたトレースを生じる。
【００５６】
(viii)ホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルの同定
SNPsをスコアする技術により、サンプルが特定の対立遺伝子に対しホモ接合性か、またはヘテロ接合性であるかを同定できることを考慮することが重要である。F-Q HyBeaconsを利用するヘテロ接合性解析では、ヘテロ接合性サンプルを同定するために、SNPの2つの対立遺伝子に完全にマッチする2種の異なったプローブが必要なことが見出されている。F-Qプローブは、完全に相補的な標的およびミスマッチ標的の混合液を含む反応において、マッチ融解ピークだけを典型的に生じることが見出されたので、2種のHyBeaconsが必須であると考えられる。ミスマッチ融解ピークは、ヘテロ接合性の反応においては観測されない。これは、完全に相補的な標的に対する結合が、いずれも熱力学的に有利であるか、または融解解析ではマッチした曲線を示すと同時に、ミスマッチのピークをマスキングしているかのいずれかによる。2種のHyBeaconsが、同時に励起され、かつ検出できる異なったスペクトルの蛍光団をもつ場合、F-Qプローブを使用して、均一ヘテロ接合体判別アッセイを単一のチューブで行うことができるであろう。しかし、現在、LightCyclerは、フルオレセインを励起できるだけである。したがって、同じLightCyclerキャピラリーにおいて2種の異なったHyBeaconsを使用したディファレンシャル・ビーコン・ハイブリダイゼーション解析を、有意に異なったTmsをもつプローブを使用して行った。ホモ接合性およびヘテロ接合性のNAT2 *4および*5Aサンプルを判別するために、異なった長さおよびTmの2種のF Q HyBeaconプローブ（F17834およびF17835）を単離して、および併用して使用した（図10）。F17834およびF17835プローブは、それぞれホモ接合性*4および*5A DNAにハイブリダイズしたときに、約60℃および52℃のTmsをもつマッチ融解曲線を生じる。*4および*5A配列（ヘテロ接合体）を含む混合DNAに対して、F17834およびF17835 HyBeaconsを併用して使用したときに、約59℃および52℃のTmsをもつ2種の融解ピークが、同じ融解トレース中に生じる。単一の融解トレースに2種のピークが存在することを、ヘテロ接合性の指標として使用することができる。
【００５７】
F HyBeacon技術の重要な特徴は、F-Qプローブおよび以前に報告した蛍光性プローブとは異なり、単一のF HyBeacon蛍光プローブを使用してホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルを確実に同定し得ることである。TaqManTMプローブなどの蛍光プローブ、分子ビーコンおよびスコーピオン・プライマーでは、リアルタイムPCR方法によって両対立遺伝子配列を確実に検出および判別するために、典型的には2種のプローブを必要とする。さらに、ハイブリダイゼーション・プローブでは、融解曲線解析によってホモ接合性およびヘテロ接合性のDNAを同定するために、一対の蛍光性オリゴヌクレオチドを必要とする。HyBeaconプローブにより、Tm測定および生じた融解ピークの数による融解曲線解析を介して確実にホモ接合性およびヘテロ接合性のサンプルを判別することができる。図9および図11は、融解ピーク解析によるホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルの同定を示す。ここでホモ接合性サンプルは特定のTmsによって同定され、ヘテロ接合体は単一融解トレースに2種のピークが存在することによって同定される。図11には、ホモ接合性およびヘテロ接合性のDNA標的にハイブリダイズしたNAT2 *5C F HyBeacon（DdeFL1）に由来する融解曲線を例示する。均一および不均一アッセイにおいて、DdeFL1は、ホモ接合性のマッチ（*5C）およびミスマッチ（*4）標的に対して、それぞれ約54℃および47℃のTmsを有する単一の融解ピークを生じる。*4および*5C対立遺伝子に対してヘテロ接合性のサンプルでは、単一の融解トレースにおいて、マッチおよびミスマッチするピークの両方を生じることが見出された。したがって、HyBeacon融解トレースに2種のピークが存在することにより、ヘテロ接合性のサンプルを確実に同定することができる。
【００５８】
HyBeaconプローブを使用してヘテロ接合性DNAを検出する能力は、ΔTm（完全に相補的なものと、ミスマッチのハイブリダイゼーションのTm間の差異）の大きさに依存する。表5は、NAT2およびCYP多型性遺伝子にハイブリダイゼーションさせた際の、HyBeaconプローブによって示されるTmおよびΔTm値を例示する。融解ピーク解析によってホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルを確実に同定することができるプローブを、本明細書において調査した9つのSNPsのそれぞれについて開発した。融解曲線解析によってヘテロ接合性DNAの存在を確実に検出するためには、約5.2℃を上回るΔTm値が必要であることが明らかである。ハイブリダイゼーションのΔTmは、プローブの長さ、ヌクレオチド・ミスマッチの位置およびミスマッチの同一性に依存する。HyBeaconオリゴヌクレオチドの長さは、ハイブリダイゼーションの特異性を保証するのに十分足りるべきであるが、過剰となってミスマッチに非感受性とならないようにすべきである。中心部位のミスマッチは、オリゴヌクレオチド末端に位置するミスマッチよりも、Tmに対して大きな影響を有するので、HyBeaconsは、多型ヌクレオチドがプローブの中心近くに位置するように設計されるべきである。すべてのヌクレオチド・ミスマッチは、ハイブリダイゼーションTmを不安定化する傾向を示すが、不安定化の程度は、ミスマッチ相互作用の型に依存する。Gを含む相互作用（すなわちG/T、G/AおよびG/G）は、室温において最も安定しており、Cを含むミスマッチ（すなわち、C/T、C/AおよびC/C）は、最も安定していない。したがって、ΔTmに対するミスマッチの及ぼす影響を最大にするために、Gを含むミスマッチを避けて、Cを含むミスマッチで行われる。
【００５９】
表5
NAT2およびCYP配列に対するHyBeaconのハイブリダイゼーションに由来するTmおよびΔTm。多型部位において生じるマッチおよびミスマッチヌクレオチドの相互作用を含む。Tm値は、実験的変動を説明するために数回の独立した解析から得られたものであり、平均および標準誤差値が含まれる。イタリックの値は、オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションに由来したものである。ヘテロ接合性DNAを同定する能力は、ΔTmに依存し、単一の融解トレースにマッチおよびミスマッチ融解ピークの両方が存在することによって同定される。
【００６０】
【表５】
（ix）SNPsの多重解析
HyBeaconプローブを使用した多重解析の可能性を、特異的および非特異的PCR標的の混合液を使用して検討した。HyBeaconsは、PCRを通して増幅された特異的DNA標的にハイブリダイズして、蛍光発光の増加を生じる。HyBeacon蛍光発光の増加は、プローブの標的配列を欠いた非特異的DNA標的では生じない。2D64B HyBeaconプローブが特異的標的の増幅を検出する機能を試験するために、種々の比率の特異的および非特異的PCRテンプレート（非特異的DNAにおける特異的配列が100、80、60、40、20、10および5%）を、均一アッセイにおいて分析した。特異的標的のみを増幅した反応、すなわち非特異的増幅がない反応では、すべての開始濃度の特異的標的が、蛍光発光を同等に増加して容易に検出された（図12a）。しかし、特異的および非特異的標的が共に同じ反応において増幅されたときは、特異的PCRテンプレートの比率が減少するにつれて（図12b）、プローブが特異的増幅を検出する機能が低下した。本実験に由来する結果は、最高で4つまたは5つの異なった標的を含むHyBeacon多重アッセイが可能であろうことを示唆する。しかし、シグナル蛍光団を増加し、かつより高い感度の検出機器を使用することによって、5つ以上の標的に多重解析を拡大することができるであろう。
【００６１】
HyBeaconプローブの機能は、今までに、FAM、HEXおよびTET蛍光色素を使用して示されており、ハイブリダイズしたプローブはそれぞれ、一本鎖のHyBeaconsよりも有意に多量の蛍光を発光する。これらのスペクトルが異なったHyBeaconsにより、リアルタイムPCRおよび融解ピーク解析を使用して多数の多型配列を同時に増幅、検出および判別することもできる。図13aは、単一のABI PRISM 7700 マイクロタイタ-プレートにおいて、FAMおよびHEXラベルされたHyBeaconプローブをそれぞれ使用した、NAT2*4およびCYP2D6*1対立遺伝子の同時増幅、および特異的検出を示している。また、多型配列の同一性を、FAM、HEXおよびTETプローブを使用して、融解温度測定によって決定してもよい。ABI PRISM 7700から得られた融解物曲線データを融解ピークに転換するために、Excelマクロを作製した。図13bには、FAM、HEXおよびTET色素でそれぞれラベルされた2D64C*、2D64EおよびDdeFL1*4Tプローブから得られたピークを示す。融解ピークは、相補的なオリゴヌクレオチドおよびPCR増幅された標的に対するHyBeaconのハイブリダイゼーションから得られた。
【００６２】
(x)HyBeaconアッセイの最適化
標的検出およびSNP判別の効率を強力に改善するために、種々のHyBeaconアッセイにおけるパラメータを修飾してもよい。アッセイ最適化のために分析した反応条件の例をここに示す：
a)バッファー最適化：下記の少量バッファーの最適化は、1.25mM Tris.Cl pH8. 0、250nM MgCl2、25nM DTTにおける不均一融解解析実験により行った。このハイブリダイゼーション・バッファーは、現在までに合成された大多数のHyBeaconsにおいて、高品質の融解曲線を生じることが示された。しかし、F17836プローブでは、オリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズした場合でも、このバッファー中で融解曲線を生じなかった。その後、HyBeacon融解温度対MgCl2濃度の研究を行った。上記バッファー中では、F17836に対する融解ピークが得られないが、50mM Tris、3mM MgCl2中では、非常に良質の融解曲線が得られることが示された。さらに、MgCl2濃度と融解ピークTmの間に、非常に強い相関があることが示された。この関係をF17831、TB0993、F17834、F17835およびB9414 HyBeaconsについて研究し、0.1mm〜10mmの濃度間で行った回帰分析にでは、それぞれ、98.9%, 97.9%, 99.4%, 99.3%および98.8%のR2値を生じた（図14を参照）。MgCl2濃度を変更することにより、HyBeaconsのTmを10℃以上変化することができる。バッファー組成に基づいて特定のHyBeacon Tmsを選択し、ディファレンシャル・ビーコン・ハイブリダイゼーション・アッセイをデザインすることができるであろう。
【００６３】
均一増幅アッセイで試験した市販のPCRバッファーの中で、TaKaRaのバッファーが優れていることが見出された。Pharmacia, Taq Gold、並びにTaKaRa PCR buffers、並びに対応するTaq、Taq Gold、Z-Taqポリメラーゼについて、HyBeaconアッセイにおけるその効率を比較した。Taq Goldバッファーおよびポリメラーゼで行ったアッセイでは、まったく機能せず、したがってリアルタイム増幅曲線または融解ピークを生じなかった。PharmaciaおよびTaKaRaのバッファーはどちらも、TaqおよびZ-Taqポリメラーゼによって増幅曲線および融解ピークを生じる。しかし、さらなるMgCl2がPharmaciaのバッファーに含まれているときでさえも、TaKaRaのバッファーが典型的に優れた結果を生じる。PharmaciaのPCRバッファーを使用して、一連のMgCl2濃度における増幅および検出の効率を分析すると、最適の濃度は、3.0〜3.5mMの間であることが見出された。TaKaRaのバッファーは、3.0mMのMgCl2を含むことが知られているが、他の成分は知られていない。
【００６４】
StratageneのOptiprimeキットを使用して、HyBeacon PCRアッセイの最適化に必要とされる成分および条件の指標を得た。Optiprimeキットは、種々のpH（8.3、8.8および9.2）の12種の個別のバッファーから成り、種々の濃度のMgCl2（1.5mMおよび3.5mM）およびKCl（25mMおよび75mM）を含む。標的を増幅および検出する効率は、pHによって顕著な影響は受けないが、MgCl2およびKCl濃度によってかなりの影響を受けた（それぞれ（1×バッファー中に）3.5mMおよび25mMが最適であった）。Optiprimeキットから得られた情報を使用して、10×HyBeacon PCRバッファー（100mM Tris.HCl pH8.8、250mM KCl、35mM MgCl2）を作製した。このバッファーは、HyBeaconアッセイにおいて比較的十分に機能して、増幅後解析において高品質な融解ピークを生じることが見出された。しかし、リアルタイム解析によって生じる蛍光増加の大きさは、TaKaRaのPCRバッファーで行った解析と比較して減少していた。したがって、リアルタイム標的検出効率を改善するために、一連のPCR補助剤をHyBeacon PCRバッファーに添加した。HyBeacon PCRバッファーにおいて検討した推定のPCRエンハンサーのうち、BSAのみがリアルタイム増幅の効率に顕著な陽性の影響を有することが見出された。0μg/μl〜1μg/μlの間で、BSAのワーキング濃度を研究した。BSAの濃度を0μg/μl〜100ng/μlに増加すると、リアルタイム標的検出の効率を亢進した。しかし、BSA濃度を増加した結果、増幅後融解ピークの質が低下していた。したがって、リアルタイム増幅の亢進するが、融解ピークの質を低下させない最適なBSA濃度を捜した。この最適なワーキング濃度は、2.5ng/μl〜5ng/μlの間であることが見出され（図15を参照）、したがって50ng/μlのBSAを10×HyBeacon PCRバッファーに含ませた。このバッファーは、TaKaRaPCRバッファーに匹敵する効率を有する機能を示した。
【００６５】
b）アンプリコンの選択：2種のプローブF18140およびF18141を除いては、試験したHyBeaconsのすべてが、オリゴヌクレオチド相同体に対して非常に高い質の融解曲線を生じる。しかし、これらプローブのすべてが、大きなPCR標的に対して高い質の融解物を生じるというわけではない。多型部位に関連するアンプリコンの大きさおよびプライマーの位置を変化することにより、より効率的なプローブ・ハイブリダイゼーションおよび優れた融解曲線の生成が可能となる。22bpだけ異なた2種のアンプリコンを使用すると、NAT2*6プローブのうちの1つにおいて、「リアルタイム」増幅検出および融解ピーク判別の効率に有意な差異が観察された（図16）。
【００６６】
c)プローブ融解温度：ハイブリダイゼーション・ビーコンのTmは、増幅後融解曲線の質に影響を及ぼすかもしれない。合成および試験がなされた初期HyBeaconsの多くでは、約60-65℃においてバックグラウンド蛍光効果を生じることが見出された。約58℃より高いマッチTmsをもつ多数のHyBeaconsでは、このバックグラウンド蛍光によって、それらマッチの融解ピークが不明瞭になったが、より低いTmsを有するミスマッチのピークでは、融解トレースにおいて明瞭に認識されることが見出された。58℃未満のマッチTmsをもつプローブでは、増幅後融解解析実験が、もっと能率的に行われるであろう。CYP2D6 *3および*4多型のために、F-QおよびF HyBeaconプローブをデザインした。オリジナルのCYP2D6 F HyBeaconsは、F-Qプローブに勝る多くの利点を備えており、高品質なリアルタイムPCR増幅データを生じて、*3および*4 SNPsを確実に判別することが可能となった。しかし、これらF HyBeaconプローブ（2D63Bおよび2D64B）では、バックグラウンド蛍光の影響と有意に重なってしまうため、高品質の融解ピークを生じなかった。したがって、これらの高いTmのプローブでは、SNPs並びにホモ接合性およびヘテロ接合性のサンプルを融解解析よって同定することはできなかった。Tmsが有意に低下するように、*3および*4 HyBeaconsを、それぞれ2（2D63C）および3（2D64C）ヌクレオチド短くして再びデザインした。これらのTmを低下したプローブでは、どちらも高品質なリアルタイム増幅曲線および増幅後融解ピークを生じ、極めて信頼性のあるSNP判別およびヘテロ接合体解析が可能となる。2D63Bおよび2D64Bプローブとは対照的に、2D63Cおよび2D64Cでは、増幅後解析の際にマッチおよびミスマッチ融解ピークを生じ、バックグラウンド蛍光の影響とほとんど重なりを示さない。
【００６７】
d)HyBeacon濃度：アッセイに含まれるHyBeaconの量は、シグナル：バックグラウンドの蛍光比を変化することによって、生じた結果の質に影響を及ぼすことが見出されている。過剰なプローブがアッセイに含まれる場合、バックグラウンド蛍光が、ハイブリダイゼーションを介した変化をマスキングする。多くの場合、HyBeacon濃度を低くして使用したときに、優れた質の融解曲線が観察される。高品質のリアルタイム増幅データおよび増幅後融解ピークの生成を可能にするF HyBeaconプローブの最適濃度は、典型的には100〜300nMの間である。HyBeacon濃度を減少することによって、上記したバックグラウンド蛍光の影響が除去されるようである。
【００６８】
e)非対称PCR：今まで記載したすべてのHyBeaconアッセイでは、対称的PCRプロトコールを使用して二本鎖DNA標的を増幅した。二本鎖DNAにハイブリダイズしたプローブは、標的の相同鎖と競合しなければならず、その結果この競合的結合が、HyBeaconハイブリダイゼーションの効率を低下するであろう。非対称PCRは、一本鎖のPCR産物を作製するために使用される技術である。一本鎖の標的では競合するDNA鎖が共存しないので、HyBeaconsが二本鎖の分子よりも高い効率でハイブリダイズするのであろう。非対称PCRが、対称的増幅よりも優れているかどうかを検討するために、該技術を八つのHyBeacon SNPアッセイに適用した。八つのHyBeaconのうち四つでは、対称および非対称増幅において蛍光発光が同様に増加され、同等の検出効率をもっていた。一つのHyBeaconアッセイでは、対称増幅と比較して非対称アッセイにおける効率の低下を示したが（図17a）、他の三つのアッセイでは、非対称増幅において対称的PCRよりも蛍光発光の増加を示した（図17b）。さらに、これらのHyBeaconアッセイの多くは、対称的反応と比較して、非対称増幅された標的において優れた増幅後融解曲線を生じた（示されないデータ）。したがって、いくつかの場合には、潜在的により高感受性のSNP判別アッセイのために、非対称標的増幅を採用することが有益であろう。しかし、非対称一本鎖DNAを生じる機構は、対数的ではなく直線的であり、したがって増幅の検出およびSNPsの判別は、対称的増幅よりもかなり多いサイクル数で達成される（図17b）。許容限界サイクルにおいてこのように増加することは、アッセイ持続時間を延長するであろうし、かつ低濃度のゲノムDNAを含む反応に影響を及ぼすかもしれない。
【００６９】
(xi)固相におけるSNPsの判別
NAT2 *4および*5A多型標的を、195993'または195991と同じ配列のビオチン化されたプライマーを使用して、ゲノムDNAから増幅した。ビオチン化されたPCR産物を、96ウェルのストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに固定した。DNA標的をNaOHで変性させて、ビオチン化されていないPCR鎖を除去し、ウェルの表面に結合した一本鎖DNA標的を残した。HyBeaconプローブ（典型的にはF17832および0203002）を、固定化された一本鎖標的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除去して、DASH（Dynamic Allele Specific Hybridisation-Hybaid）装置を使用して融解解析を行った。マッチおよびミスマッチの固定化された標的からHyBeacon融解曲線が得られ、SNPsを確実に判別することができた（図18）。F17832 HyBeaconでは、不均一LightCyclerアッセイにおいて不十分な質の融解曲線を生じた。しかし、DASH 装置でこのプローブを用いることにより、良質な融解解析および確実なSNP判別が達成された。LightCyclerおよびDASH融解解析には、それぞれ二本鎖および一本鎖の標的を利用する。標的ハイブリダイゼーションに対してHyBeaconと競合するPCR相同体がないので、一本鎖標的からかなり優れた質の融解曲線が得られる。均一および固相フォーマットのどちらにおいても、HyBeaconsを適切に使用することにより、場合によるとアレイ系形態のいくつかにおいて、大量のアッセイを行うことができる多用途な系が提供される。
【００７０】
(xii)Taqポリメラーゼの5-3'-エキソヌクレアーゼ活性
HyBeaconアッセイが、TaqMan systemと異なることを確認するために、5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性を欠いた二種のDNAポリメラーゼ、Deep Vent(New England Biolabs)およびStoffel断片(Pharmacia)を、「リアルタイム」増幅アッセイにおいて試験した。5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性は、TaqManアッセイに必須であり、このTaqポリメラーゼ活性は、蛍光団とクエンチャー部分間でTaqManプローブを特異的に消化するために必要とされ、完全にマッチする標的が存在する場合に蛍光発光の増加を引き起こす。Deep VentおよびStoffel断片ポリメラーゼを均一増幅アッセイにおいて使用して、NAT2 *4F HyBeaconプローブが、5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性の非存在下において標的の増幅を検出する能力を試験した（図19）。両タイプのポリメラーゼを含む反応では、増幅過程の全体にわたって、マッチするテンプレートによる蛍光発光の増幅を示したが、ミスマッチするテンプレートを含む反応では、蛍光の増加を生じなかった。Deep VentおよびStoffel断片ポリメラーゼによって、「リアルタイム」および増幅後フォーマットにおけるSNP判別がなされてもよい。したがって、これらの結果は、F HyBeaconsがリアルタイムPCRによってDNA配列を検出する機構が、5'-3'-エキソヌクレアーゼアッセイの機構と異なっており、蛍光団とクエンチャー部分が酵素的に分離されるためではなく、むしろプローブ・ハイブリダイゼーションによって直接生じる蛍光発光の増加に依存していることを示している。
【００７１】
(xiii)HyBeaconプローブを利用した定量的PCR
PCR増幅の進行を「リアルタイム」でモニターする能力は、PCRに基づいてDNAおよびRNAの定量化を行うことができるアプローチに完全な革命を起こす。「リアルタイム」定量PCR実験では、一定数のサイクル後に蓄積されたPCR産物量よりも、むしろPCR産物の増幅が最初に検出されたときの（CT-閾値サイクル）サイクリング時点によって反応が特徴づけられる。核酸標的の開始コピー数を多くするほど、蛍光の有意な増加が速やかに観察される。「リアルタイム」増幅におけるHyBeaconプローブによる標的DNAの定量化の可能性を、2D64B、2D64C*およびDdeFL1 F HyBeaconsを使用して検討した。定量的HyBeacon PCR解析は、LightCyclerおよびABI 7700 instrumentで行った。均一PCR増幅におけるテンプレートとして、DNA標準（PCR産物またはゲノムDNAの既知濃度）の範囲を使用した。各DNA標準における閾値サイクルを測定して、ログDNA濃度をCTに対してプロットし、「直線」標準曲線を作製した。「未知」の濃度のゲノムDNAを含むサンプルから得られた閾値サイクルを、標準曲線にプロットして、これら反応液に存在するDNA濃度を算出した。HyBeacon定量的PCRに由来する標準曲線は、LightCyclerおよびABI 7700 instrumentのどちらにおいても非常に高い質であり、0.93〜0.99の間の相関係数をもっていた（図20）。試験した「未知」の反応液において、これらの標準曲線から計算されたDNA濃度は、正しいオーダーの算出濃度であり、適度に正確だった。たとえば、5.4×104ng/μl、700ng/μlおよび90ng/μlの「未知」のサンプルでは、それぞれ6.9×104ng/μl、1406ng/μlおよび115ng/μlのLightCycler標準曲線から算出された濃度を有した。ところが、285ng/μl、163ng/μlおよび53ng/μlのゲノムサンプルでは、ABI 7700に由来する標準曲線において、256ng/μl、137ng/μlおよび44ng/μlであるとして算出された。
【００７２】
(xiv)従来のDNA抽出を伴わない標的配列の検出および判別
血液または頬スワブなどの患者サンプルから遺伝子型を得るためには、典型的にはPCR増幅および下流解析の前にそのゲノムDNAを抽出することが必要である。DNA抽出プロトコールは、時間がかかり、面倒で、かつ高価であろう。したがって、HyBeacon解析における期間および費用を減らすために、唾液DNAから直接PCR増幅を行い、ゲノムDNAを抽出する必要をなくした。LightCyclerによる迅速な温熱サイクリング条件と合わせて、唾液から直接標的を増幅することにより、35-40分以内で多型配列の遺伝子型を決定することができる。
【００７３】
多型NAT2 *4および*5C配列を10の唾液サンプルから増幅して、*5Cおよび*4対立遺伝子にそれぞれ完全に相補的なDdeFL1およびDdeFL1*4 HyBeaconsによって分析した。図21および22は、リアルタイムPCRデータ、並びに*5C/*5C（サンプル1）、*4/*4（サンプル2）および*4/*5C（サンプル3）遺伝子型から増幅されたDNA配列とDdeFL1およびDdeFL1*4のハイブリダイゼーションに由来する融解ピークを例示する。表6は、多型NAT2配列HyBeaconとDdeFL1およびDdeFL1*4のハイブリダイゼーションに由来する融解温度を示す。リアルタイムPCRおよびTmデータから、*5C多型に関して個々の遺伝子型を決定することが可能となる。分析した10の唾液サンプルのうち、3つが*5C対立遺伝子に対してホモ接合性であると分類され、1つが*4対立遺伝子に対してホモ接合性であると特徴づけられ、および6つがヘテロ接合性であることが見出された。NAT2 *5C遺伝子座のこれらの遺伝子型は、それぞれ緩徐、速い、および中間のアセチル化表現型と関連がある。唾液サンプルをHyBeacon解析することによって得られた遺伝子型および表現型を確かめるために、唾液サンプル1-3についてRFLP解析を行った（図23）。*4/*4 DNAから増幅された179bp PCR産物は、単一のDdel制限部位を含み、その部位を消化することにより、121bpおよび58bp断片が生じる。*5C多型は、さらなるDdel制限部位を生じ、その結果、*5C/*5C DNAから増幅された179bp産物の消化により、98bp、58bpおよび23bp断片が生じる。ヘテロ接合性の唾液サンプルから増幅された産物を消化することにより、121bp、98bp、58bpおよび23bp断片を生じる。RFLPおよびHyBeacon方法論のどちらによっても、唾液サンプル1-3は、それぞれホモ接合性*5C、ホモ接合性*4およびヘテロ接合性であるとタイプされる。したがって、ここに示されたデータは、高品質のDNA精製を必要とせず、多型配列の確実な増幅、検出および判別を行ことができることを示している。
【００７４】
表6
Tm値は、増幅されたNAT2 *4および*5C配列の融解曲線解析に由来した。DdeFL1およびDdeFL1*4 HyBeaconsは、*5Cおよび*4対立遺伝子にそれぞれ完全にマッチする。マッチおよびミスマッチの融解ピークの平均および標準誤差は、各唾液サンプルにおいて、および全てのサンプルにおいてひとまとめにして詳述する。Npは、所与の融解トレースにおいて特定のピークが存在しないことを示し、「−」は、deFL1*4アッセイが特定の唾液サンプルにおいて行われなかったことを示す。
【００７５】
【表６】
（xv）RNA配列の検出
RNA標的を検出する可能性を評価した。最初に、NASBA（核酸配列ベース増幅（Nucleic Acid Sequence Based Amplification））RNA産物を検出するためのHyBeaconプローブをデザインした。この産物は、融解曲線解析におけるHyBeacon融解ピークの生成によって検出されなかった。これは、おそらくRNA産物が減少するためである。したがって、DNAまたはRNAからなるオリゴヌクレオチド相同体を合成して、HyBeaconプローブのハイブリダイゼーションを分析した。最初に、融解ピークはDNA標的から得られたが、RNAオリゴヌクレオチドからは得られなかった。RNA標的濃度が2μMに増加されるまで、プローブ・ハイブリダイゼーションに特徴的な融解ピークは得られなかった（データ示さず）。HyBeacon/RNA二本鎖の融解温度は、HyBeacon/DNA二本鎖と比較して有意に低下していることが示され、RNAに対するハイブリダイゼーションは、DNAに対するハイブリダイゼーションより、かなり不安定であることが示唆される。したがって、解析の際に高濃度のRNA標的を産生することができない限り、HyBeaconプローブは、確実にそれらを検出することができないだろう。
【００７６】
(xvi)配列検出の機構
プローブ・クエンチャー部分が存在しないにも関わらず、相補的標的DNA配列に対してHyBeaconプローブがハイブリダイゼーションすることによって、蛍光発光量に有意な変化が生じる。ヌクレオチド残基（特にグアニン）は、静的および動的なクエンチング機構を介して、蛍光発光に効果を及ぼすことが示されている。したがって、HyBeacon蛍光のクエンチングは、塩基−色素のスタッキングおよび電子移転イベントを介して、プローブのオリゴヌクレオチド成分から生じる可能性もある。標的配列に対するHyBeaconのハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチド成分に関して蛍光団部分の指向を変え、色素と塩基間の電子移転量に影響を及ぼしている可能性がある。あるいは、二本鎖形成によって生じる塩基−色素のスタッキング、たとえば蛍光団の塩基スタック内へのインターカレーションによって蛍光クエンチング量を変化するのかもしれない。HyBeaconプローブが標的DNA配列にハイブリダイズすると、HyBeaconオリゴヌクレオチドによって課せられていた蛍光クエンチングは、コンホメーション変化によって少量ではあるが検出可能な量が軽減されるであろう。クエンチングが減少することにより、蛍光発光量の増加を生じ、配列検出および対立遺伝子判別が可能となる。HyBeaconが機能する機序を調査するために、蛍光およびu.v.分光技術を使用して、量子収率、蛍光寿命および一本鎖と二体鎖状態間で生じる放射波長の変化の可能性を分析してもよい。
【００７７】
【発明の効果】
結論
ハイブリダイゼーション・ビーコン（HyBeacons）は、相補的標的配列とプローブがハイブリダイゼーションする直接的結果として生じる蛍光発光の増加を介して、特定のDNA配列を検出することが示された。蛍光放射の量およびプローブ/標的二本鎖のTmにより、オリゴヌクレオチドおよび増幅PCR配列のSNPsの判別が可能となる。ここで報告した結果は、HyBeaconアッセイにより、単一のプローブを使用してホモ接合性およびヘテロ接合性のサンプルを同定することができること、並びに単一チューブ/ウェル・アッセイにおける多数のHyBeaconプローブの使用により、多重解析の可能性を有することを示す。さらに、HyBeaconsにより、「リアルタイム」PCRアッセイにおいてDNA標的が定量化されることが示された。
【００７８】
HyBeaconプローブは、配列検出、SNP判別およびDNA定量化のための現在利用できる市販の系（分子ビーコン、Scorpions、FRETプローブおよびTaqManプローブ）に代わるものである。HyBeaconsを使用した検出アッセイは、それらが単純な作用機序であって二次構造を欠き、かつ酵素の必要性を欠くこと、並びに単一プローブを使用してヘテロ接合性DNAを同定するというその能力のために、魅力的である。
【００７９】
標的の増幅および検出を単一のチューブで行う、均一HyBeacon法（上記の通りの）によって、分子診断アッセイを行ってもよい。あるいは、増幅された標的のロボット単離、またはロボット固相固定により、バッファーの置換およびHyBeacon添加に続いて、ハイスループットな検出系を形成することもできる。ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション・アッセイは、マイクロアレーまたはマクロアレーフォーマットで行うこともでき、このフォーマットでは、プローブまたはより好ましくは標的のいずれかを、HyBeacon融解解析前に固定させる。
【００８０】
HyBeaconプローブの2種の変異型を評価した。プローブには、内部ヌクレオチド残基に蛍光団およびクエンチャー部分の両方が連結されたもの（F-Q HyBeacon）を含んでもよく、または蛍光団成分のみ（F HyBeacon）を含んでもよい。変異型はどちらも、均一および不均一フォーマットにおいて確実にSNPsを判別することが示されている。しかし、F HyBeaconsは、F-Qデザインに勝る明らかな効果を有する：
・現在、蛍光団およびクエンチャー部分は、T残基のみに配置され得る。したがって、蛍光団とクエンチャー部分を分離する残基数および角素因の効果の可能性を考慮する必要がないため、F HyBeaconsは、かなり簡単に束縛が少なくデザインされる。
【００８１】
・クエンチャーが存在しないため、F HyBeaconsは、合成が高価ではなく、アッセイには、F-Qと比較して反応あたり約5分の一のプローブ（200nM未満）が必要なだけである。
【００８２】
・F HyBeaconsは、「リアルタイム」均一アッセイにおいて、優れた質の増幅後融解曲線を生じる可能性を有することが示されている。
【００８３】
・ヘテロ接合体解析において2種のF-Qプローブが必要なこととは対照的に、F HyBeaconsでは、単一のプローブを使用してヘテロ接合性サンプルが同定されることが示された。
【００８４】
本発明は、先に記載された態様に限定されず、本発明の精神から逸脱することなく、構成および詳細が変更されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 種々のHyBeaconのハイブリダイゼーション。マッチ、ミスマッチ、二重ミスマッチ間における相互作用の差異を図示する。図中、星は単一のヌクレオチド多型（SNPs）を示す。タイプAの相互作用は、野生型標的またはSNPの一対立遺伝子と完全にマッチするようにデザインされたHyBeacon分子を含む。タイプBの相互作用は、変異型標的またはSNPのもう一つの対立遺伝子と完全にマッチするようにデザインされたHyBeacon分子を含む。二つの独立したSNPsを考慮した場合、標的分子にハイブリダイズするビーコンは、（i）完全マッチ、（ii）一塩基ミスマッチをもつ、または（iii）多塩基ミスマッチをもつのいずれかであろう。
【図２】 蛍光量を使用したSNPの判別。B9414HyBeaconは、完全マッチ（i）および一塩基ミスマッチ（ii）にハイブリダイズし、標的が存在しない場合の実験（iii）も行った。a）融解プロフィールは、B94141HyBeaconに由来する。42℃以下および52℃以上の温度では、マッチおよびミスマッチ標的にハイブリダイズしたプローブによって発光される蛍光量が非常に小さい。しかし、これらの温度間では、完全に相補的なプローブによって発光される蛍光量は、ミスマッチHyBeaconの蛍光発光よりも有意に増加する。b)蛍光穫得のために、反応液を変性して46℃まで急冷した。処理範囲内では有意なクラスター形成、および処理間では統計学的な相違が観測され、その結果マッチ標的にハイブリダイズしたプローブは、ミスマッチ標的にハイブリダイズしたHyBeaconよりも有意に多くの蛍光を発光し、標的が存在しない場合のハイブリダイゼーション・ビーコンよりも多くの蛍光を発光する。c）HyBeaconは、標的の非存在下において融解ピークを生じない。B9414は、マッチまたはミスマッチ標的の存在下において、それぞれ約52℃および44℃のTmsを有する融解曲線を生じ、確実なSNPsの判別が可能となる。
【図３】 FおよびF-Q HyBeaconプローブの比較。NAT2ハイブリダイゼーション・ビーコンF17834（F-Q）および0203002(F)は、完全マッチのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。FおよびF-Q HyBeaconsは、同一のヌクレオチド配列を有し、かつ融解解析において約60℃のTmsの高品質なピークを生じる。F HyBeaconsは、クエンチャー部分が欠失しているため、F-Qプローブと比較してより大量のバックグラウンド蛍光を発する。
【図４】 InDel多型の融解解析。ハイブリダイゼーション・ビーコンが、挿入および欠失多型を判別する能力を有するかどうかを決定するために、TB0993 NAT2 *4プローブを一連のオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズさせた。マッチ標的（M）、単一ヌクレオチドの挿入を含む3種のオリゴヌクレオチド（1-3）、および単一ヌクレオチドの欠失を含む3種のオリゴヌクレオチド（4-6）を比較した。それぞれのHyBeacon/標的二本鎖において融解解析を行った。すべての場合において、マッチプローブは、ミスマッチInDelの反応より高いTmsおよび融解曲線を生じ、その結果融解ピークTmに基づいて、SNPsが判別されるであろう。a)挿入オリゴヌクレオチド。b)欠失オリゴヌクレオチド。c)マッチするビーコンでは、全てのInDelミスマッチに対するハイブリダイゼーションよりも多くの蛍光を発光し、SNPsを蛍光発光量に基づいて判別してもよいことを示す。
【図５】 不均一フォーマットにおけるSNPsの判別。CYP2D6 *3多型を含む標的を判別するために、FおよびF-Q HyBeaconプローブを使用し、そのうち、使用したDNA標的は、単離された119bpのPCR産物であった。F（2D63B）およびF-Q（2D63A）プローブは、同一のヌクレオチド配列であり、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子に完全にマッチし、および*3アレルにハイブリダイズしたときは、一塩基ミスマッチをもつ。a)2D63A F-Qプローブは、マッチおよびミスマッチ標的にそれぞれハイブリダイズしたときに、およそ65℃および56℃のTmsの融解ピークを生じる。b)2D63B F HyBeaconは、*1および*3 PCR標的にそれぞれハイブリダイズしたときに、およそ65℃および58℃のTms有する溶解ピークを生じる。
【図６】 DNA配列の均一検出。PCR産物の蓄積をリアルタイムでモニターするために、2D64C* HyBeaconプローブを使用してゲノムDNA(1)および唾液(2)サンプルにおけるCYP2D6*1配列の検出する。HyBeaconプローブから発光される蛍光量は、特異的標的配列の増幅と相関している。テンプレートDNAまたは増幅産物を含まないコントロール反応（3）では、PCRの間に蛍光発光レベルの上昇を示さない。
【図７】 均一フォーマットにおけるSNPsの判別。NAT2 *4配列に完全マッチのF HyBeaconプローブ0203002を、*4および*5A SNPsを識別するために均一LightCyclerアッセイにおいて使用した。a)SNPsは、リアルタイムPCRによって確実に識別され、マッチの*4テンプレートを含む反応のみが、蛍光発光に有意な増加を生じた。b)SNPsは、増幅後融解解析によっても識別された。この解析では、マッチの*4アレルでは、ミスマッチの5A標的配列よりも有意に高いTmsの融解ピークを生じた。増幅された産物の終了点分析によって、リアルタイムデータの確証が可能となる。
【図８】 CY2D6*4多型のリアルタイム判別：CYP2D6遺伝子の*1および*4対立遺伝子を検出および識別するために、2D64C* HyBeaconを使用した。多型配列は、*1対立遺伝子(1)および*4対立遺伝子(2)を含むpGEM-Tプラスミドから増幅した。ヘテロ接合性DNA(3)をシミュレーションするために、*1および*4プラスミドの混合液を使用した。また、テンプレートコントロール反応(C)は、解析に含まなかった。*1対立遺伝子を含むこれらの反応（すなわちサンプル1および3）のみが、リアルタイムPCR増幅の間に蛍光発光の増加を生じる。ホモ接合性*4サンプルおよびテンプレート・コントロール以外では、蛍光シグナルの上昇を生じない。*1および*4対立遺伝子に対するヘテロ接合性サンプルでは、増幅の間に発生すべき蛍光の中間量を生じさせる。
【図９】 融解ピーク解析によるCYP2D6 *1および*4対立遺伝子の判別。多型標的は、ゲノムDNAサンプルから増幅され、かつここで示した融解ピークは、サンプル1（ホモ接合*4）、2（ホモ接合*1）、および3（ヘテロ接合性のDNA）の増幅後解析に由来した。2D64C* HyBeaconは、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子に完全に相補的であり、ホモ接合性*4/*4および*1/*1サンプルに対しそれぞれ49℃および60℃のTmsをもつ単一の融解ピークを生じる。*4および*1対立遺伝子をもつヘテロ接合性サンプルでは、49℃および60℃融解ピークをもつトレースを生じる。
【図１０】 F-Q HyBeaconsを使用したヘテロ接合性の同定。ホモ接合サンプル（多型の一方の対立遺伝子のみを含む）をヘテロ接合性のサンプル（両方の対立遺伝子を含む）と区別するためには、SNPの両方の対立遺伝子に完全マッチの2種のF-QHyBeaconsを必要とした。F17834およびF17835 HyBeaconsは、それぞれNAT2遺伝子の*4および*5A対立遺伝子に完全にマッチする。F17834およびF17835は、有意に異なったTmsを有し、2種のFAMラベルされたプローブは区別される。a)F17834では、ホモ接合性の*4および*5A対立遺伝子が存在する場合に、それぞれ約60℃および54℃のTmsをもつ融解ピークを生じる。b)F17835では、ホモ接合性の*5Aおよび*4対立遺伝子が存在する場合に、それぞれ約52℃および49℃のTmsをもつ融解ピークを生じる。c)F17834またはF17835 HyBeaconsを含む反応では、ヘテロ接合性のDNAが存在する場合に、マッチする融解ピークのみを生じる。両プローブを含む反応では、*4および*5A対立遺伝子混合物が存在する場合に、約59℃および52℃のTmsをもつ融解トレースを生じる。単一の融解トレースに2つのピークが存在することにより、ヘテロ接合性のサンプルを同定することができる。
【図１１】 F HyBeaconを使用したヘテロ接合性の解析。F HyBeaconsがヘテロ接合性サンプルを判別する能力を試験するために、HyBeacon DdeFL1（これはNAT2 *5C多型配列に完全マッチ）を使用した。a)ホモ接合サンプルをDdeFL1で分析すると、単一のピークをもつ融解トレースを生じる。DdeFL1プローブは、不均一アッセイにおいてホモ接合性の*5Cおよび*4 PCR標的にハイブリダイズして、それぞれ54℃および47℃の融解曲線を生じた。b)DdeFL1 HyBeaconとマッチおよびミスマッチ標的の混合液を含む反応では、同様の融解トレースにおいて54℃および47℃のピークをもつ曲線を生じた。融解トレースに2種のピークが存在することにより、ヘテロ接合性サンプルを同定することができる。
【図１２】 HyBeacon多重解析の限界。HyBeacon多重解析における能力を検討するために、2D64B HyBeaconプローブを、特異的および非特異的PCRテンプレートを含む反応に含めた。PCRテンプレートは、特異的テンプレートの比率が100%〜5%の間で変化するような、特異的（CYP2D6）および非特異的（NAT2）DNAの混合液からなる。a)特異的標的だけが生じるように、反応にはCYP2D6プライマーを含むが、NAT2プライマーを欠いた。横断点において特異的標的の濃度が減少するという、小さな変化が観測された。しかし、反応間で増幅および検出の効率を比較可能であった。b)特異的および非特異的標的が生じるように、反応には、CYP2D6およびNAT2プライマーを含ませた。増幅および検出の効率の有意な減少は、特異的標的の比率の減少として観測された。しかし、この結果は、最高で4または5個の標的を含む多重反応が可能であろうことを示唆する。
【図１３】 多重HyBeacon解析。a)NAT2*4およびCYP2D6 *1標的は、それぞれFAM（BamFL1）およびHEX（2D64E）ラベルされたプローブを使用して、単一のマイクロタイタープレートにおいて同時に増幅および検出した。ゲノムDNAおよび完全にHyBeaconプローブに相補的な配列を含む反応のみが、増幅によって蛍光発光レベルの上昇を示した。ネガティブコントロール反応では、蛍光発光の増加を生じなかった。b)融解物ピークは、ABI PRISM 7700 instrumentおよびExcel macroを使用したFAM、HEXおよびTETラベルされたプローブに由来する。ここで示した融解ピークは、相補的なオリゴヌクレオチドへのプローブ・ハイブリダイゼーションに由来した。
【図１４】 HyBeacon Tmに対するMgCI2濃度の効果。一連のMgCI2濃度において0mM〜50mMまで変化させて、ハイブリダイゼーション・ビーコンF17834を完全に相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション・ビーコンのTmは、MgCl2濃度の上昇につれて増加を示した。a)以下のものを含む反応に由来するハイブリダイゼーション・ビーコン融解曲線を例示する：0mM、0.001mM、0.005mM、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、7mm、10mmおよび50mmのMgCl2（それぞれ左から右へ）。b)MgCI2濃度およびHyBeacon Tmの間に存在するポジティブな相関を示す。ハイブリダイゼーション・ビーコンのTmをMgCl2濃度の対数に対してプロットしたときに、定義した濃度範囲において、比例関係が観測される（0.1mMと10mM間の場合）。このデータセットに対して行った線形回帰分析では、99.4％のR2値を生じた。
【図１５】 HyBeacon PCR bufferの作製-BSAの影響。標的増幅をモニターするためにNAT2 *5A HyBeacon（NAT2*5）を使用した一連のPCRバッファーに由来するリアルタイムPCRデータおよび増幅後融解の結果を示す。以下のBSA濃度の範囲で、HyBeacon解析のためにデザインしたPCRバッファーに添加した：1）Ong/μl、2）1ng/μl、3）2.5ng/μl、4）5ng/μl、5）7.5ng/μlおよび6）10ng/μl。また、TaKaRa Z-Taq PCRバッファー(7)を比較にして分析した。2.5ng/μlより高濃度のBSAによって、リアルタイム解析における標的の増幅および検出の効率が増強され、その結果、この場合では蛍光増加の大きさがTaKaRa bufferより優れている。HyBeacon解析に由来する融解ピークの質は、低濃度のBSAよりも優れている。より高濃度のBSAでは、ピークに「肩部」を生じて、ピーク幅を増加し、融解の質を減少させる。リアルタイム解析および増幅後解析における最適なBSA濃度は、2.5ng/μl〜5ng/μlの間のようである。
【図１６】 SNP判別の効率およびアンプリコン大きさ。標的アンプリコンの大きさおよび位置は、均一および不均一HyBeaconSNPアッセイの効率に対し有意な影響を及ぼすことが示されている。大きさが22bp異なるNAT2 *4産物（*6 SNPの側面に位置する）を増幅する2種のプライマーセットを、不均一融解曲線解析実験において比較した。a)TaqFおよびTaqRプライマーから増幅された103bpのNAT2産物は、F17836 HyBeaconを含む不均一アッセイにおいて融解ピークを生じない。b)しかし、TaqF2およびTaqR2プライマーから増幅された81bpのNAT2 *4産物では、F17836プローブにマッチおよびミスマッチの融解曲線を生じる。103bpおよび81bpサンプルがどちらもアガロースゲルにおいて検出されたことから、アンプリコン間の相違は、プローブ・ハイブリダイゼーションの差異によるためであり、増幅効率が相違するためではないことが確認された。
【図１７】 非対称標的増幅を使用したSNP判別。HyBeaconを介した標的検出およびSNP判別の効率を、対称および非対称PCRアッセイ・フォーマットにおいて比較した。
両タイプのPCR増幅では、マッチ標的の存在下においてのみ蛍光シグナルの増加を生じる。8つのHyBeaconsを比較し;そのうちの4つは、対称および非対称増幅法（示されないデータ）間で同等の効率を示した（データは示さず）。a)F17836 HyBeaconプローブは、非対称アッセイにおいて使用したときに検出効率が有意に減少した。b)一方、その他の三つのHyBeaconsでは、対称増幅（2D64Bプローブによって示したもの）と比較して、非対称増幅によってより大量の蛍光の増加を示した。
【図１８】 ハイブリダイゼーション・ビーコンおよびDASH instrumentを使用したSNP判別。NAT2 *4対立遺伝子の*5A多型に完全に相補的なハイブリダイゼーション・ビーコンF17832を、固相に固定化された*4および*5A多型標的の判別に使用した。該ハイブリダイゼーション・ビーコンは、*4および*5A配列にハイブリダイズしたときに、それぞれ完全に相補的およびミスマッチである。マッチおよびミスマッチのハイブリダイゼーションは、それぞれ約66℃および60℃のTmsをもつ融解曲線を生じる。ハイブリダイゼーション・ビーコンのマッチおよびミスマッチの領域を確立することにより、DASHソフトウェアを使用してサンプルを自動分類することが可能になる。
【図１９】 5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性を欠いたDNAポリメラーゼを使用したSNP判別。NAT2 *4および*5A対立遺伝子を、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性をもつ（Taq）、および欠いている（Deep VentおよびStoffel fragment）DNAポリメラーゼで増幅して、蛍光発光の増加を生じるためにF HyBeaconプローブの消化が必要とされるかどうかを調査した。F HyBeacon 0203002を、増幅を検出してSNPsを識別するために使用した。a)Taq(1)とDeep Vent(2)ポリメラーゼによる完全に相補的な*4配列の増幅の比較。どちらのポリメラーゼも、マッチテンプレートの場合に「リアルタイム」に蛍光発光の増加を生じるが、一方ミスマッチ*5Aテンプレートを含む反応では、蛍光発光の増加を生じない(3)。b)Taq(1)とStoffel fragment(2)ポリメラーゼによる完全に相補的な*4対立遺伝子増幅の比較。どちらのポリメラーゼも、マッチする*4テンプレートの存在下で「リアルタイム」に蛍光発光の増加を生じるが、ミスマッチする*5A対立遺伝子を含む反応では蛍光発光の増加を生じない(3)。
【図２０】 HyBeaconプローブを使用した「リアルタイム」定量的PCR。a)「リアルタイム」均一アッセイを、CYP2D6配列の増幅をモニターするために2D64B HyBeaconを使用して行った。既知のDNA濃度範囲：1)41.5×109 アトグラム／マイクロリットル（ag/μl）2）41.5×108ag/μl、3）41.5×107ag/μl、4）41.5×106ag/μl、5）41.5×1085ag/μl、6）41.5×104ag/μl、7）41.5×103ag/μl、8）41.5×102ag/μlおよび9）415ag/μlを分析した。各DNA濃度において横断点を測定した。b)横断点に対して対数DNA濃度をプロットすることによって標準曲線を構築した。「未知」の反応サンプルに存在するDNA濃度を定量するために標準曲線を使用した。
【図２１】 均一リアルタイム唾液解析。NAT2 *4および*5C多型標的の検出並びに判別は、リアルタイムPCRおよび融解解析方法によって行った。NAT2遺伝子の*5C対立遺伝子に完全に相補的なDdeFL1 HyBeaconを、3つの唾液サンプル（1、2および5）の遺伝子型決定に使用した。また、テンプレート・コントロール反応(C)は、本解析には含まなかった。a)蛍光性シグナルの増加は、均一PCR反応において*5C対立遺伝子が存在する場合にのみ生じる。したがって、*5C対立遺伝子に対してホモ接合性およびヘテロ接合性である反応（すなわちそれぞれサンプル1および5）では、蛍光性シグナルの有意な増加を生じるが、一方、*4対立遺伝子に対してホモ接合性の反応（サンプル2）では、蛍光性シグナルに増加を生じない。*5Cおよび*4対立遺伝子をもつヘテロ接合性のサンプルでは、増幅の間に発光されるべき蛍光の中間量が生じる。b)DdeFL1プローブでは、ホモ接合性*4および*5C DNAにそれぞれハイブリダイズしたときに、47.6℃および54.1℃のTmsをもつ単一の融解ピークを生じる。ヘテロ接合性サンプルでは、どちらも47.6℃および54.1℃の融解ピークをもつトレースを生じる一方、標的DNAを欠いた反応では、いずれのピークも生じない。
【図２２】 増幅した唾液DNAのHyBeacon融解ピーク解析。NAT2遺伝子の*4対立遺伝子に完全に相補的なDdeFL1*4 HyBeaconを、*5C多型に関する唾液サンプルの遺伝子型の決定に使用した。a)HyBeaconのハイブリダイゼーションによって、42.6℃のTmをもつ単一のミスマッチ融解ピークを生じるため、唾液サンプル1は、*5C対立遺伝子に対してホモ接合性である。b)融解解析の際に2つのピークが生じるので、唾液サンプル3は、*5Cおよび*4対立遺伝子に対してヘテロ接合性である。c)プローブ・ハイブリダイゼーションによって、52.6℃のTmをもつ単一のマッチする融解ピークが生じるので、唾液サンプル2は、*4対立遺伝子に対してホモ接合性である。
【図２３】 RFLP唾液解析。制限断片長多型性解析を、唾液サンプルから増幅したNAT2 *4および*5C PCR産物に対して行った。レーンMは、1Obpラダー（GIBCO BRL）である。限定酵素消化により、サンプル1-3はそれぞれ*5C/*5C、*4/*4および*4/*5Cとして分類することができる。
【従来技術】
導入
特定のDNA配列を検出して、既知の単一ヌクレオチド多型をスコアするための多くの技術が記載されている。これら検査法のいくつかでは、蛍光ラベルされたプローブのハイブリダイゼーションを利用し、ドナー部分およびアクセプター部分間のエネルギー移転に基づいている。本発明は、プローブの二次構造または酵素作用に依存しない、新規かつ簡便な蛍光ハイブリダイゼーション・プローブ検出系を包含する。これらハイブリダイゼーション・プローブとその標的配列間の相互作用により、蛍光発光に有意な変化が生じる。ハイブリダイゼーション能が変化することにより、蛍光発光量およびプローブ/標的二本鎖の融解温度によって多型標的を判別することができる。単一ヌクレオチド多型（SNPs）は、ヒトゲノムの配列の変異において最も多い形態であり、平均して千ヌクレオチドごとに生じている。SNPは、ヒトからヒトで一塩基（置換、挿入または欠失）が変化するDNA配列内の部位である。これらSNPsは、一般に、特定疾患などの表現型形質に直接影響を及ぼし、したがって薬剤負荷に対する反応性（薬理遺伝学）などの、複雑な形質を同定するための遺伝的マーカーとして使用することができる。SNPsは、進化が遅く、かつ多くの方法によって容易にスコアされるため、遺伝子マーカーとして極めて有用である。一般的な遺伝子疾患に寄与する遺伝子を同定できる可能性のある関連研究において使用するために、新規SNPsを発見するための大規模な試みが進行中である。さらに、既知のSNPsを比較的高処理量で効率的にスクリーニングするための多数の技術が開発されている。SNPの遺伝子型を決定するための現在の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応産物の制限断片長多型性（RFLP）解析（制限断片を検出するためにゲル電気泳動を使用する）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）のハイブリダイゼーション、増幅低抗性変異系（ARMS）、オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（OLA）、一本鎖コンホメーション多型（SSCP）解析、化学開裂、ヘテロ二重鎖解析、ミニ−シーケンシング、および種々のプローブに基づいた系が含まれる。プローブに基づいた技術例には、分子ビーコン、5'-エキソヌクレアーゼ・アッセイ、ハイブリダイゼーション・プローブおよびスコーピオン・プライマーが含まれる。これらプローブ系のいくつかは、ドナー（たとえば蛍光団）部分とアクセプター（たとえばクエンチャー）部分間のエネルギー移転に基づいている。蛍光プローブは、典型的には一本鎖オリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしたときよりも分離時の蛍光発光が、低い量を示す。これらのプローブの構造は、高い特異性をもち、わずか単一ヌクレオチドだけが異なる標的を同定することが可能となる。
【０００２】
蛍光団によって吸収されるエネルギーは、クエンチャーへ移転され、熱として放出されるであろう。蛍光シグナルのクエンチングは、蛍光共鳴エネルギー移転（FRET）または非FRET機構によって生じてもよい。FRETクエンチングでは、ドナーとアクセプター間のスペクトルが重なることが必要であり、このクエンチングの効率は、2つの部分間の距離に関連がある。非FRETクエンチングは、蛍光団とクエンチャー間の短距離の「接触」により生じ、部分間でスペクトルが重なる必要はない。
【０００３】
5'-エキソヌクレアーゼ（TaqManTM）アッセイでは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅された標的DNAを分析するために、FRETクエンチングを使用する。TaqManプローブは、蛍光団部分およびクエンチャー部分（好ましくは5'および3'末端に位置する）を含むオリゴヌクレオチドである。効率的に分子内クエンチングすることにより、ほんのわずかの蛍光のみが、無処置プローブから発光される。しかし、PCR増幅の間に、前記プローブはその標的配列に特異的にハイブリダイズして、Taq ポリメラーゼの5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性によって蛍光団部分とクエンチャー部分間でプローブが切断される。TaqManTMプローブが酵素切断されることによって、蛍光団とクエンチャー成分が空間的に分離し、標的の増幅に相関して蛍光発光の有意な増加を生じる。TaqManプローブを慎重にデザインすることによって、完全マッチのプローブのみが分解されて蛍光シグナルの増加を生じ、多型標的の判別が可能となる。TaqManTMプローブは、リアルタイムPCR増幅の間に消化されるため、増幅後融解曲線解析(post-amplification melting curve analysis)においてプローブを利用することはできない。
【０００４】
分子ビーコンは、分離時は非蛍光性であるが、標的配列にハイブリダイゼーションすると蛍光性となる一本鎖オリゴヌクレオチドプローブである。ハイブリダイズしていない分子ビーコンは、ステム-ループ構造を形成し、前記ビーコンのヘアピンにより、前記蛍光団部分が前記クエンチャーのかなり近くに配置されるように、該分子の一端に共有結合で結合された蛍光団と、もう一端に結合されたクエンチャーをもつ。分子ビーコンが標的配列にハイブリダイズすると、蛍光団およびクエンチャー部分が空間的に分離され、その結果前記蛍光団はもはやクエンチされず、分子ビーコンが蛍光を発光する。分子ビーコンは、配列の検出およびSNPの判別のために、終了点および「リアルタイム」アッセイにおいて使用しもよい。分子ビーコンの二次構造は、ハイブリダイゼーション・プローブに対して高い特異性をもち、単一ヌクレオチドが異なる標的を同定することができる。しかし、前記分子ビーコンの分子内相互作用は、分子間標的ハイブリダイゼーションにおいて競合原因を生じる可能性を秘めており、かつ前記分子ビーコンは内因性のプローブであるため、前記標的配列に結合するためのアンプリコン（単位複製配列）の反対鎖と競合するに違いない。両競合形態が組合わさることにより、いくつかの標的分子に対する分子ビーコンのハイブリダイゼーション効率は、減少されるかもしれない。
【０００５】
ハイブリダイゼーション・プローブは、蛍光団成分で一箇所ラベルされたオリゴヌクレオチドである。各ハイブリダイゼーション・プローブ・アッセイにおいて、このようなオリゴヌクレオチドが二つ必要であり、一つはドナー蛍光団でラベルされ、もう一つはアクセプター蛍光団でラベルされる。フルオレセインは、通常ドナーとして使用され、通常Cy5、LC-RED 640およびLC-RED 705がアクセプターとして使用される。ドナー蛍光団が励起されることにより、アクセプター蛍光団の吸収スペクトルと重複する発光スペクトルを生じる。ハイブリダイゼーション・プローブ対は、標的分子内で隣接したヌクレオチド配列を認識するようにデザインされる。前記アクセプター・オリゴヌクレオチドは、分離時には励起されず、蛍光シグナルを発生しない。しかし、ポリヌクレオチド標的配列にハイブリダイゼーションしている間は、前記ドナーとアクセプター・プローブがかなり近接し、前記ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移転が可能となる。前記アクセプター蛍光団からの蛍光シグナルは、両プローブが標的分子にハイブリダイズした場合にのみ生じる。PCR反応に組み込んだ場合、前記アクセプターによって発光される蛍光量は、合成される標的量に比例し、前記アクセプター・プローブからの蛍光を増幅サイクル毎に一度モニターすると、蓄積産物のリアルタイム計測が容易になる。プローブおよびアッセイ条件を慎重にデザインすることにより、リアルタイムPCRによって密接に関連した標的を判別することが可能になる。さらに、ハイブリダイゼーション・プローブ対は、融解ピーク解析およびTm測定によって対立遺伝子を判別するために使用することもできる。ホモ接合性サンプルは、融解曲線解析の際に特定の融解ピークを生じることによって同定され、ヘテロ接合性サンプルは、一回の融解トレースにおいて2つのピークが存在することにより同定されるであろう。
【０００６】
5'-エキソヌクレアーゼ、分子ビーコンおよびハイブリダイゼーション・プローブ・アッセイは、別々のDNA鎖に位置するプローブおよび標的配列を有する二分子の系である。スコーピオン・プローブは、単分子の結合イベントを介して作動し、プローブおよび増幅された標的配列が、同じDNA鎖に位置する。単分子の結合イベントは、動態学的に二分子ハイブリダイゼーションより好まれる。スコーピオン・プローブには、プローブ末端配列が付着されたプライマーを含み、該プローブ配列は、分子ビーコンのものと同様のステム-ループ二次構造内に含まれている。伸長されていない形態において、スコーピオン・プライマーは、蛍光団とクエンチャー部分がかなり近接しているため、蛍光がない。PCRの際に、前記スコーピオンのプライマー成分は、その3'が伸長され、プローブ・ハイブリダイゼーションに必要とされる相同的標的配列が産生される。前記スコーピオン・プローブ配列が、増幅された標的にハイブリダイズすると、前記蛍光団およびクエンチャー部分が空間的に分離されて、標的が増幅されると同時に蛍光シグナルに有意な増加を生じる。プローブおよびアッセイ条件を慎重にデザインすることにより、リアルタイムPCR解析の際に完全マッチの標的のみが蛍光シグナルの増加を生じ、多型標的を判別することができる。
【０００７】
TaqManプローブ、分子ビーコン、ハイブリダイゼーション・プローブおよびスコーピオン・プライマーでは、ポリヌクレオチド配列を検出および判別するためにFRETを利用する。しかし、他のライトアップ・プローブ系では、DNA配列を検出および判別するために、ドナーとアクセプター部分間のFRET移転を必要としない。これらのライトアップ・プローブは、オリゴヌクレオチド認識配列および単一の蛍光性レポーター基を含み、このようなレポーターは、典型的には不斉シアニン色素チアゾールオレンジの誘導体である。前記ライトアップ・プローブの蛍光色素成分は、オリゴヌクレオチド分子の末端に付着される。一本鎖のときに、相補的な核酸配列にハイブリダイズしたときよりも、プローブは有意に低い量の蛍光を発光する。蛍光発光量を測定することにより、ライト−アップ・プローブを、核酸配列の検出および単一部位が異なった標的間の判別のために使用してもよい。
【０００８】
単一チューブ内で標的DNAを増幅し、配列の検出/判別を行うアッセイである均一(homogenous)アッセイが、分子ビーコン、TaqManプローブ（5'エキソヌクレアーゼアッセイ）、FRETプローブおよびスコーピオン・プライマーにおいて記載されている。均一解析法により、結果を生じるための下流の解析（たとえば、PCR産物の精製、酵素消化、ゲル解析その他）を行う必要がなくなり、反応間の相互汚染の可能性が減少される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明
一つの側面において、本発明は、ハイブリダイゼーション・ビーコン（HyBeacon）であって、実質的に二次構造をもたず、かつヌクレオチド残基の一つがレポーターでラベルされ、およびもう一つが任意にクエンチャーでラベルされており、好ましくは前記レポーターでラベルされたヌクレオチド残基と前記クエンチャーでラベルされたヌクレオチド残基間のヌクレオチド残基が1〜15の間であるヌクレオチド残基で形成されたオリゴヌクレオチドであるハイブリダイゼーション・ビーコンを提供する。蛍光団部分とクエンチャー部分を両方もつハイブリダイゼーション・ビーコンをF-Q HyBeaconと命名し、一方、蛍光団などのレポーター成分をもつが、クエンチャー部分を欠いたプローブをF HyBeaconと命名する。
【００１０】
本発明のハイブリダイゼーション・ビーコンは、実質的に二次構造をもたない直鎖状の一本鎖オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの一領域が、もう一方とハイブリダイズすると二次構造を生じ、たとえばループを形成して（従来の分子ビーコンと同様に）、該オリゴヌクレオチドがその相補的標的とハイブリダイズする効率を減少させる。本発明のHyBeaconは、該オリゴヌクレオチドの一領域がもう一方にハイブリダイズする傾向が、実質的に全く存在しない。
【００１１】
前記HyBeaconの長さは、相補的ポリヌクレオチド標的とハイブリダイズして、その融解温度が標的の正確な配列に依存する安定なハイブリッドを提供するのに適した長さである。15残基未満のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである場合、特に前記ハイブリダイズする2つの配列が正確に相補的でない場合は、十分に安定なハイブリッドを形成しない。約30ヌクレオチド残基より長いオリゴヌクレオチドである場合は、単一ヌクレオチドミスマッチが存在する可能性に対して、ハイブリッドの融解温度が比較的感受性が低いハイブリッドを形成する。ヌクレオシド残基は、通常天然に存在するA、C、GおよびTに由来する。しかし、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンの一以上の位置でヌクレオチド類似体を使用してもよく、このようなヌクレオチド類似体は、たとえば塩基部分、および／または糖部分、および／または三リン酸の結合に修飾がなされていてもよい。プロピニルdU（dT-アナログ）および2-アミノdA（dA類似体）などの塩基修飾は、一般にハイブリダイゼーション特性を変化させ、および15未満または30より多いヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオチドを使用することも魅力的であろう。あるいは、ペプチド核酸（PNA）、ロック核酸（locked nucleic acid）（LNA）、2'-O-メチルRNA、ホスホルアミダートDNA、ホスホロチオエートDNA、メチルホスホナートDNA、ホスホトリエステルDNAまたはDNA塩基類似体からなるか、またはこれらを含むオリゴヌクレオチドを、より安定して標的配列と相互作用を形成するために使用してもよい。
【００１２】
FおよびF-Q HyBeaconsは、相補的な核酸配列がハイブリダイズしたときに、一本鎖のコンフォメーションのときよりも有意に多量の蛍光を発光した。F HyBeaconsにはクエンチャー成分が存在しないにもかかわらず、一本鎖状態のときよりも二本鎖のときに有意に蛍光シグナルを発光したことは、予想外の所見であった。
【００１３】
関連するアクセプター・プローブを、またはプローブ間のエネルギー移転を必要とせず（既知のハイブリダイゼーション・プローブにおいて必要とされる）、プローブ・アッセイをデザインできる点において、これは有利な所見である。本明細書の目的として、このようなアッセイを「単一プローブ・アッセイ」と命名する。
【００１４】
蛍光団−クエンチャー系は、文献に詳しく記載されており、本明細書でさらに記載することはしない。蛍光団でラベルされたヌクレオチド残基、およびクエンチャーでラベルされたヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドの調製も、文献に詳しく記載されている。
【００１５】
前記シグナル比とは、ハイブリダイゼーション・ビーコンを含む二本鎖ハイブリッドのシグナル強度と、一本鎖プローブのシグナル強度の比であり、好ましくは可能な限り大きく、たとえば3以上である。このシグナル比は、多数の因子に依存する。F-Q HyBeaconにおいて、励起されたドナー分子（蛍光団）から近くのアクセプター分子（クエンチャー）へのエネルギー移転の比は、前記二分子間の距離だけでなく、それらの相対的な角配置にも依存する。わずか1または3ヌクレオチド残基によって分離された蛍光団およびクエンチャー部分を有するHyBeaconsでは、有意にかつ有効に1より大きい蛍光シグナル比を有する。3ヌクレオチド以上離れて蛍光団およびクエンチャーを有するHyBeaconsでは、より大きなシグナル比を示す。F-Q HyBeaconにおいて、蛍光団およびクエンチャー成分は、二部分が5ヌクレオチド残基以上離れるように位置することが好ましい。5ヌクレオチド未満によって分離されたドナーおよびアクセプター分子では、「接触」を生じて、非FRET相互作用が可能になるかもしれない。
【００１６】
F HyBeaconは、5ヌクレオチドより離れたドナーおよびアクセプター成分を有するF-Q HyBeaconsに匹敵するシグナル比を示すことが立証されている。F HyBeaconのシグナル比は、クエンチャー部分が存在しないにも関わらず有意かつ有効に1よりも大きい。クエンチャー部分が存在しないことにより、F HyBeaconは角配置の影響を受けず、その結果、蛍光団とクエンチャー分子間の相対距離では、二本鎖および一本鎖状態において発光される蛍光シグナル量を決定できない。蛍光団部分は、HyBeaconプローブが標的分子にハイブリダイズしたときに、該プローブが一本鎖形態のときよりも有意に強い蛍光シグナルを発光すると考えられている。これは、おそらくいくつかが二重鎖DNAと相互作用した形態であるためである。
【００１７】
一定の場合には、前記オリゴヌクレオチド内に一以上のレポーターを含むことが適切であろう。
【００１８】
本発明にしたがったハイブリダイゼーション・ビーコンにおいて、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、既知の多型を有する既知のポリヌクレオチド標的の対立遺伝子の一つに完全に相補的な配列を有する。たとえば、点変異、または一塩基挿入もしくは欠失（SNP）である。F-Q HyBeaconでは、前記標的におけるこのようなSNPは、たとえ本質的でないとしても、好ましくは蛍光団ラベルされたヌクレオチド残基とクエンチャーラベルされたヌクレオチド残基間のハイブリダイゼーション・ビーコンの中間ヌクレオチド残基に相補的である。F HyBeaconにおいて、前記多型部位は、たとえ本質的でないとしても、好ましくは前記オリゴヌクレオチドプローブ内の中心に位置している。
【００１９】
あるいは、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、既知の非多型ポリヌクレオチド標的に相補的であってもよく、単にその標的を検出するために使用してもよい。また、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、未知のおよび特徴づけられていない多型を有する潜在的な多型標的を研究するために使用してもよい。ディファレンシャル・ビーコン・ハイブリダイゼーションおよび融解ピークTmの相違によって、未知の多型の位置および／または特質をマップできる可能性が考えられる。
【００２０】
前記蛍光団ラベルされたヌクレオチド残基および／またはクエンチャーラベルされたヌクレオチド残基は、好ましくは、5’末端または3’末端よりもむしろオリゴヌクレオチド配列の内部に位置する。前記ハイブリダイゼーション・ビーコンが、ポリヌクレオチド標的とハイブリダイズを生じると、これらの特徴のすべてが、最適な融解温度を有し、かつ完全マッチの鎖と単一または多数の部位にミスマッチを有する鎖の間の融解温度（ΔTm）に実質的な相違を有する安定なハイブリッドの形成に寄与する。
【００２１】
二以上のハイブリダイゼーション・ビーコンであって、検査条件下においてSNPの各対立遺伝子に完全に相補的なものが提供されることによって便利になるであろう。それぞれのハイブリダイゼーション・ビーコンが異なった蛍光団を有する場合、ホモ接合性およびヘテロ接合性の標的を解析するための溶液にプローブを混合すれば便利になるであろう。同様の方法において、種々の対立遺伝子におけるいくつかの異なったSNPsに相補的なハイブリダイゼーション・ビーコンの混合物を、多重解析のための溶液中で一緒に使用してもよい。ただし、それぞれが、スペクトルの異なった蛍光団でラベルされている。
【００２２】
あるいは、本発明のハイブリダイゼーション・ビーコンは、支持体上または支持体内に固定化されて提供されてもよい。溶液中で相補的な標的と自由にハイブリダイズするような形態で、支持体を使用してオリゴヌクレオチドを固定化するための技術およびリンカーが、文献に詳細に記載されている。また、支持体を使用して、間隔を置いた位置に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、異なったオリゴヌクレオチドプローブが本発明による異なったハイブリダイゼーション・ビーコンであるアレイが、本発明の範囲に含まれる。さらに、HyBeaconプローブは、支持体上または内に固定されたDNA標的を解析するために使用しもよく、このような解析では、異なった標的をアレイ型フォーマットで間隔を空けた位置に置いてもよい。
【００２３】
もう一つの側面において、本発明は、既知のまたは疑わしい多型を任意に有するポリヌクレオチド標的を調査するための方法であって、該方法は、蛍光団ラベルされたヌクレオチド残基および任意にクエンチャーラベルされたヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供することを含む方法を提供する。前記ポリヌクレオチド標的は、前記オリゴヌクレオチドプローブとインキュベートすることによってハイブリッドを形成し、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記ハイブリッドが形成されたときに、一本鎖形態のときよりも蛍光レベルの増加を示す。前記オリゴヌクレオチドプローブによって発光された蛍光レベルは、所定の温度で観測されるか、または温度範囲以上でモニターされる。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書において定義されたハイブリダイゼーション・ビーコンである。本発明の好ましい態様において、前記方法は、関連するクエンチャーを伴わず、かつアクセプター部分を保有するさらなるプローブを伴わない、本発明にしたがったハイブリダイゼーション・ビーコンの単一型を利用する。
【００２４】
前記ポリヌクレオチド標的は、DNA、RNAまたはcDNAであってもよく、一本鎖形態で使用され、またはDNA二本鎖を三本鎖形成の調査のために使用してもよい。前記ポリヌクレオチド標的は、既知の多型、好ましくはSNPｓを有する。前記標的を、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする。このプローブは、本明細書において記載したハイブリダイゼーション・ビーコンであってもよい。前記ハイブリッドは、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブよりも強い蛍光シグナルを発生することが必要である。前記ハイブリッドの融解温度は、数ある中で、ポリヌクレオチド標的とオリゴヌクレオチドプローブが完全に相補的であるかどうか、あるいは前記SNPの位置または近くで生じている単一またはさらには二重のミスマッチが存在するかどうかに依存する。前記方法は、前記オリゴヌクレオチドプローブによって発光される蛍光シグナルレベルを、前記ハイブリッドの融解温度近くの所定の温度、または温度範囲以上で観測することを含む。二つの選択肢を記載する。ただし、その他も可能である：−
a）前記ハイブリッドを含む溶液の温度をゆっくりと上昇し、一方、温度（-dF/dT）対温度に関して蛍光シグナル強度のネガティブ誘導体のグラフを構築するために、連続して蛍光シグナルを観測する。前記ハイブリッドの融解温度は、ピークとして現れ、前記ポリヌクレオチド標的配列についての情報を提供する。HyBeacon融解解析を介して生じたTmsを、多型標的を区別するために使用することもできる。選択される温度範囲は、一般に前記ハイブリッドの融解温度を包含する。
【００２５】
b）前記ハイブリッド溶液を所定の温度に保持して、蛍光レベルを観測した。一般に、前記所定の温度は、完全マッチのハイブリッドの融解温度と、一または二のミスマッチを有するハイブリッドの融解温度間の中間が選択される。観測された蛍光シグナルのレベルは、前記ハイブリッドが融解したかどうかの指標を提供し、そしてポリヌクレオチド標的の配列についの情報を提供する。多型標的は、終了点およびリアルタイム、または動態学的フォーマットで判別されてもよい。
【００２６】
典型的には、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、前記標的ポリヌクレオチドの対立遺伝子の1つに相補的な配列、典型的には完全に相補的な配列を有する。完全に相補的なビーコンを使用することにより、マッチしたハイブリダイゼーションとミスマッチしたハイブリダイゼーション間の区別が可能になる。適宜に、二以上の異なったハイブリダイゼーション・ビーコンは、標的ポリヌクレオチドの別々の対立遺伝子に相補的な配列、理想的には完全に相補的な配列を有する。
【００２７】
都合の良いことに、前記ポリヌクレオチド標的は、適切なプライマーを使用してゲノムDNAの所望の部位を増幅することによって形成されたPCR アンプリマー（amplimer）であってもよい。均一モードによって、たとえば増幅サイクル手順の前、間、または後に、前記オリゴヌクレオチドプローブを単一の反応容器に添加することによって増幅し、かつ標的調査を行うことによって簡便になるであろう。また、唾液などのサンプルから、DNA、RNAまたはcDNAを前もって抽出せずに、直接標的の増幅および配列調査を行うことによって簡便になるであろう。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプローブは、PCR増幅の際に連鎖伸長を妨げるように、その3’末端が修飾される。
【００２８】
前記ハイブリダイゼーション・ビーコンの融解温度を、多型標的ポリヌクレオチドを同定するために使用してもよい。また、本発明のハイブリダイゼーション・ビーコンは、単一のプローブを使用してホモ接合性およびヘテロ接合性DNAを同定するために使用してもよい。
【００２９】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、いかなる方法においても限定を意図するものではない。
【００３０】
【実施例】
材料および方法
（i）ハイブリダイゼーション・ビーコンのデザイン
HyBeaconプローブを、ヒトN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）遺伝子（表1参照）およびシトクロムP450をコードする（CYP）遺伝子（表2および3を参照）内にある十個のSNPsに対してハイブリダイズするようにデザインした。プローブは、多型ヌクレオチドがHyBeacon配列の中心近くに位置するようにデザインした。すべてのHyBeaconプローブは、約20ヌクレオチドの長さであり、内部のウラシル残基（DNA配列においてはチミンに置換する）に結合された蛍光団部分をもつ。蛍光色素である6-カルボキシフルオレッセイン（FAM）、テトラクロロフルオレッセイン（TET）およびヘキサクロロフルオレッセインを、新規ケミストリー（novel chemistry）によってU残基に吸着し（Oswel DNA services, Southampton, UKから入手可能）、六蛍光団結合ケミストリー（FAM propo dU、FAM propargyl dU、dU C6 FAM、dU FAM、FAM cap prop dUおよびFMOC dU)を評価した。dU C6 FAMおよびFMOC dU蛍光団が、わずかに優れたデータを生じることがわかり、優先的に使用した。また、F-Q HyBeaconsでは、クエンチャー部分（メチルレッド）を内部のU残基に配置し、そのHyBeaconsにおいて、蛍光団とクエンチャー分子が1、3、5、6、7、8および9ヌクレオチド残基離れたHyBeaconsを試験した。蛍光団とクエンチャー分子が側面に位置する多型ヌクレオチド、および側面に位置しない多型ヌクレオチドをもつF-Q HyBeaconsを調査した。前記プローブをリアルタイムPCRアッセイに組み込んだときに、Taqを介したHyBeaconsからの伸長を防ぐために、合成した大多数のHyBeaconsでは、3'リン酸またはオクタンジオール成分をもつ。FおよびF-Q HyBeaconsは、NAT2およびCYP多型配列の対立遺伝子の1つと完全にマッチするようにデザインされており、その結果SNPの他のバリアントでは、プローブ・ハイブリダイゼーションの際にミスマッチ部位が作製される。両方の対立遺伝子に完全に相補的なHyBeaconプローブを、両対立遺伝子それぞれのSNPについて合成した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
（ii）NAT2およびCYP2D6多型PCR産物の増幅
多型標的は、唾液（水で50％稀釈）、参照血液サンプル（Dundee大学）、ヒト胎盤ゲノムＤＮＡ(Sigma-Aldrich)、増幅されたNAT2およびCYP産物を含むpGEM-Tプラスミド(Promega)から分離したゲノムDNAのいずれかから増幅した。多型部位に関連して、大きさおよび位置が異なったNAT2並びにCYPアンプリコンを生じる種々のプライマー対を評価した。たとえば、NAT2*5A、NAT2*5C、NAT2*6、NAT2*7A、CYP2D6*3およびCYP2D6*4多型配列を増幅するために使用した最適なプライマー対は、それぞれ195991/195993、DdeF2/DdeR、TaqF2/TaqR2、BamF2/BamR、2D63F/2D63Rおよび2D64F2/2D64R2である（表4）。多型ヌクレオチドを含む約80-150BpのDNA断片を増幅するために、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。標的の検出およびSNPの判定アッセイは、均一および不均一なフォーマットにおいて行った。
【００３３】
【表２】
【表３】
【表４】
PCR量は、典型的には30μlであり、約200ngのDNAテンプレート、1×PCRバッファー（Pharmacia）、0.5μの各プライマー、1unitのTaqポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)および1mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech)が含まれる。変性反応工程（94℃、5分）の後、変性（94℃、30秒）、プライマーのアニーリング（50℃、1分）および産物の伸長（72℃、1分）からなる40サイクルを使用してPCR標的を増幅した。増幅後、PCR産物を0.1体積の3M酢酸ナトリウムおよび2体積のエタノールで沈殿した。-20℃で10分間インキュベーションした後、13000r.p.m.で30分間遠心して70％エタノールによる洗浄工程を二回おこない、ペレットを1×ハイブリダイゼーションバッファー／プローブ混合物（50mM Tris pH7.4、3mM MgCI2、適切なHyBeacon）に再懸濁した。この懸濁では、最初のPCR反応ごとに、5μlのバッファー／プローブ混合物を添加した。F-Q HyBeaconsは、典型的には500nM〜1μＭ間の濃度で使用し、F HyBeaconsは、100nM〜300nMの濃度の間で使用した。5μlの反応量を、融解曲線解析プログラムを使用してLightCyclerTM(Roche)によって解析した。ハイブリダイゼーション解析には、初期蛍光読みとり（30℃において30秒）、ハイブリダイゼーション（94℃において1分間の後、30℃において2分）、規準化（65℃において1秒、85℃において1秒、30℃において1秒）および融解解析（0.1℃／秒の移行速度で30℃〜95℃まで）を含む。規準化に単一蛍光獲得を使用したことを除き、蛍光は連続してモニターした。融解曲線は、LightCyclerソフトウェアを使用して、温度（ｙ軸に対する-dF/dt）対温度（x軸）についてネガティブ誘導体蛍光をプロットすることによって構築した。
【００３６】
（iv）均一「リアルタイム」PCR増幅アッセイ
PCR体積は20μlとし、これには2μlの50%唾液または約200ngのゲノムDNA、1xZ-TaqTバッファー（TaKaRa）または1xHyBeacon PCRバッファー（10mmTris. Cl pH 8.8、25mm KCI、3.5mM MgCI2、5ng/pl BSA）、0.5μMプライマー、1unit Taq ポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）、および1mmのdNTPsが含まれる。増幅された標的の蓄積をモニターするために蛍光プローブを利用する「リアルタイム」PCRアッセイにおいても、適切なF-QおよびF HyBeaconsがそれぞれ500-1000nMまたは100-300nM含まれる。多型標的配列は、LightCyclerTM（Roche）およびABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems）で増幅した。LightCyclerキャピラリーで行った反応液を、95℃において1分間（ゲノム、およびプラスミドDNA）または5-10分間（唾液サンプル）インキュベーションすることによって変性させた後、変性（95℃において10秒）、プライマーのアニーリング（Faqにおいて10秒間）、および産物の伸長（72℃において10秒間）を含む40-50サイクルを使用して多型標的を増幅した。蛍光穫得は、各アニーリング工程の終わりに行った。蛍光穫得温度（Faq）は、アンプリコンおよびHyBeacons間で変更し、このFaqは、マッチおよびミスマッチプローブのTms（表5を参照）間のおよそ中間である。たとえば、2D64C* HyBeaconアッセイでは、リアルタイム増幅によってCYP2D6 *1および*4 SNPsを判別するために、57℃のFaqを使用する。増幅後、反応液を変性（95℃において10秒）させて、冷却（35℃において2分間）した後、蛍光を連続的に得て、融解解析（0.1℃／秒の移行速度で30℃〜95℃まで）を行った。融解ピークは、LightCyclerソフトウェアを使用して、温度（ｙ軸に-dF/dt）対温度（x軸）についてネガティブ誘導体蛍光をプロットすることによって構築した。
【００３７】
(v)HyBeacon標的の非対称増幅
プローブ・ハイブリダイゼーションのための一本鎖DNA標的分子を作製するために、非対称PCRを使用した。増幅は、LightCyclerキャピラリーで行った。HyBeaconハイブリダイゼーションに必要な、相同DNA配列を含む一本鎖産物を増幅するために、アンチセンスプライマーを使用した。プローブ-結合部位を含まない鎖を作製するために、センスプライマーを二本鎖DNAの初期増幅に含めた。アンチセンスおよびセンスプライマーは、典型的には50：1の比で使用した。多型NAT2およびCYP2D6標的を含むpGEM-Tプラスミドを、PCRテンプレートとして使用した。PCR反応体積は、典型的には20μlであり、およそ200ngのプラスミドDNA、1xZ-Taq PCRバッファー（TaKaRa）、0.5μMのアンチセンスプライマー、10nMのセンスプライマー、1unit Taq ポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）、1mM dNTPs（Amersham Pharmacia Biotech）および適切なハイブリダイゼーション・ビーコンが含まれている。均一増幅および融解ピークの解析は、上述の通りに行った。
【００３８】
(vi)多型標的の固相解析
PCR増幅は、アンチセンスプライマーの5'末端がビオチン化されていることを除いて、均一アッセイにおいて前述した通りに行った。増幅に続いて、10-15μlのビオチン化されたPCR産物を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Hybaid）の個々のウェルに添加した。1x DASH buffer gold（Hybaid）を各ウェルに添加して、最終体積を50μlとした。室温で1時間インキュベーションした後、該溶液をそれぞれのウェルから除去した。50μlの0.1M NaOHをウェルに添加して、二本鎖DNAを変性させた。5分間インキュベーションした後、ウェルを50μlの0.1M NaOHで一回および1x DASH バッファーで二回洗浄して、ビオチン化されていないDNA鎖を除去した。1x DASHバッファー中の過剰のHyBeacon（>1pM）（2μlプローブ+48μlバッファー）を各ウェルに添加した。95℃において1分間反応液を加熱して、次いで25℃まで概算速度0.08℃/秒で冷却することによって、固定化された一本鎖DNAにプローブをハイブリダイズさせた。溶液およびハイブリダイズしていないプローブをウェルから除去して、50μlのフレッシュ1xDASHバッファーに置換した。ハイブリダイズしたプローブの融解解析は、DASH(Dynamic Allele Specific Hybridisation)装置(Hybaid)で、0.02-0.07℃/秒間の移行速度を使用して行った。
【００３９】
(vii)多重HyBeacon標的検出
多数のプライマー対およびHyBeaconプローブを含む反応は、ABI PRISM（R）7700Sequence Detectorを使用して行った。NAT2*4（*7A遺伝子座）、NAT2*4（*5C遺伝子座）およびCYP2D6*1多型標的を増幅して、それぞれFAM、TETおよびHEXラベルされたHyBeaconプローブを使用して検出した（表4）。変性反応工程（95℃において5分）の後、変性（95℃において15秒）、プライマーアニーリング（50℃において30秒）および産物の伸長（72℃において30秒）を含む40サイクルを使用して、多型標的をゲノムDNAから増幅した。蛍光穫得は、それぞれの増幅工程においてプライマーアニーリングの際に行った。
【００４０】
結果および考察
(i)多型標的配列
ヒトN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）遺伝子座は、多型であることが示されている。NAT2遺伝子の欠失コピーでは、いくつかのアリールアミン薬剤および毒物のアセチル化を遅くすることが知られている。疫学調査では、この緩徐アセチル化表現型を、膀胱および結直腸癌に対するリスクと関連づけている。多型NAT2遺伝子座の解析により、ヌクレオチド置換を含む多くの緩徐アレルが確認されている（表1を参照）。これらの置換には、部位481（TからCに）、590（GからAに）、803（AからGに）および857（GからAに）の点変異を含み、この変異が、それぞれ*5A、*6、*5Cおよび*7Aの制限断片長多型性（RFLPs）を生み出す。これら多型遺伝子座のそれぞれにおいて、*1はヒトゲノムにおいて最も頻繁に生じる対立遺伝子変異である。
【００４１】
CYP2D6、CYP2C9およびCYP2C19などのヒト遺伝子によってコードされるチトクロームP450酵素（デブリソキン4-ヒドロキシラーゼ）は、抗降下剤、抗不整脈剤および血圧降下剤を含む30以上の一般的に処方される薬剤の代謝に応答性である。コーカサス人のおよそ5-10%は、チトクロームP450酵素活性が欠損しているため、不十分な代謝表現型を示す。多くの対立遺伝子変異が、CYP2D6遺伝子座において同定されており、最も多くは、CYP2D6*3（別名CYP2D6A）およびCYP2D6*4（別名CYP2D6B）単一ヌクレオチド多型である。*3および*4遺伝子型をもつ個体では、不十分な酵素活性表現型をもつことが示されている。
【００４２】
ハイブリダイゼーション・ビーコンが、特異的に増幅されたDNA配列を検出し、および単一ヌクレオチド多型を含む標的を判別する可能性を試験するために、NAT2およびCYPの多型を使用した。
【００４３】
(ii)オリゴヌクレオチド標的に対するディファレンシャル・プローブ・ハイブリダイゼーション
HyBeaconプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、その相互作用は、完全にマッチまたはミスマッチのいずれでもよい。図1には、マッチ、ミスマッチ、および二重ミスマッチの二本鎖間における相違を例示し、それぞれの相互作用の型を分類している。HyBeaconプローブは、完全マッチおよびミスマッチのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしており、LightCyclerで分析した。一本鎖および二本鎖状態のHyBeaconから発光された蛍光量を比較した場合、プローブが標的分子にハイブリダイズしたときに、溶液中でフリーなときよりも多くの蛍光量が発光されることが観測された。一本鎖および二本鎖HyBeaconsプローブから生じたこのような蛍光発光の相違は、統計学的に有意であり（p<0.01単一-因子ANOVA）、標的DNAの存在を蛍光の定量により検出し得る方法が提供された（図2）。
【００４４】
温度およびプローブ・ハイブリダイゼーション状態の変化によって引き起こされる蛍光発光の変化をモニターすることにより、HyBeacon/相同体対の融解ピークを作製することができる。オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたHyBeaconプローブは、完全に相補的な標的分子にハイブリダイズしたプローブと比較して、低いTmsの融解曲線を生じる。図2は、マッチおよびミスマッチのオリゴヌクレオチド標的に対するNAT2 *4 HyBeacon（*5A SNP）のディファレンシャル・ハイブリダイゼーションを示す。ミスマッチ領域では、プローブTmが低下しており、融解ピーク解析を介して多型標的を判別することができる。マッチ、単一ミスマッチおよび複数ミスマッチの標的も、融解ピークTmによって確実に判別することができるであろう。さらに、マッチおよびミスマッチのTms間の中間温度で蛍光穫得を行うことよって、蛍光の定量に基づいて多型標的を判別することができるようになる。蛍光穫得温度では、マッチするHyBeaconがその標的にハイブリダイズして、その標的から溶解して離れてしまったミスマッチのプローブよりも多くの蛍光を発光する（図2）。
【００４５】
溶液中では、HyBeaconsは、少量のバックグラウンド蛍光のみを発光する。しかし、標的配列に結合すると、ハイブリダイゼーションの直接の結果として、有意により蛍光が発光される。わずか単一ヌクレオチドが異なった配列を、(i)ハイブリダイゼーション・ビーコン分子がその標的配列にハイブリダイズするときに生じる蛍光量および（ii）前記プローブ/標的二本鎖の融解温度（Tm）によって判別することができるであろう。
【００４６】
蛍光定量化および融解分析法を、F-QおよびF HyBeaconプローブで行うと、同等な質の結果を生じた。図3は、オリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズしたFおよびF-Q NAT2*4 HyBeaconsに由来する融解曲線を例示する。F-Q HyBeaconsは、蛍光団とクエンチャーの間隔および角配置効果（データは示さず）に対して若干の依存性を有するかもしれない。しかし、F HyBeaconsでは、クエンチャー部分が存在しないにもかかわらず、標的ハイブリダイゼーションに対して高いレベルの蛍光発光を示す。FおよびF-Q HyBeaconプローブの蛍光団部分は、二本鎖の状態のときに、一本鎖コンホメーションの場合よりも有意に蛍光を発光する（下記参照）。
【００４７】
(iii)単一ヌクレオチド多型の多様性
HyBeaconプローブを使用して、NAT2およびCYP2D6対立遺伝子に存在する一塩基置換多型が判別されることが示されている。ハイブリダイゼーション・ビーコン分子が、挿入および欠失（InDel）多型を判別する能力を試験するために、一連のオリゴヌクレオチド標的をTB0993 NAT2 *4プローブにハイブリダイズさせた。多型の型および位置を変えて、3種の挿入および3種の欠失オリゴヌクレオチドを解析した。それぞれのInDel標的は、完全マッチのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたHyBeaconと比較して、かなりのTm低下を生じた（図4）。置換多型と同様に、InDelsでも、HyBeacon/標的二本鎖のTms、並びにマッチとミスマッチプローブのTms間の温度で発光される蛍光量によって判別できるであろう。
【００４８】
(iv)PCR産物におけるSNPsの判別（不均一アッセイ）
別々のチューブで標的増幅およびSNP判別を行う不均一アッセイを、NAT2 *5A、*5Cおよび*6多型について、並びにCYP2D6 *3および*4 SNPsについて行った。融解ピーク解析を介して確実にSNP判別可能な好結果の不均一アッセイが、試験した全ての多型において展開された。多型ヌクレオチドを含むPCR産物は、NAT2およびCYP2D6テンプレートDNAから増幅した。アンプリコンの大きさは、80bp〜282bpの範囲の長さである。PCR産物を単離して、HyBeaconプローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁した。プローブをPCR標的にハイブリダイズさせて、LightCyclerキャピラリーにおいて融解解析を行い、PCR標的の同一性に依存したTmsの融解ピークを生じた。HyBeaconsは、マッチおよびミスマッチのPCR標的を、プローブ/標的二本鎖の融解温度によって容易に判別する。F-QおよびF HyBeacon変異型では、どちらも不均一SNP判別アッセイが適切に実行される。
【００４９】
CYP2D6*3多型について行ったアッセイは、FおよびF-Q HyBeaconsが、不均一解析においてどのくらいSNPを判別することができるかを示している。119bpのPCR産物をCYP2D6*3多型DNAから増幅した。PCR産物を単離して、2D63A（F-Q）または2D63B(F)HyBeaconプローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁した。2D64 F HyBeaconは、クエンチャーを欠いていることにより大きな蛍光バックグラウンドを生じるため、F-Qプローブより5倍低い濃度で使用した。図5は、HyBeaconが*1および*3 CYP2D6対立遺伝子を含むPCR標的にハイブリダイゼーションすることによって誘導された融解曲線を示す。2D63Aおよび2D63Bプローブは、同一のヌクレオチド配列を有し、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子に完全に相補的あり、したがって*3対立遺伝子にハイブリダイズするときは、単一塩基ミスマッチを含むことになる。2D63A F-Q HyBeaconは、*3および*1対立遺伝子の配列にそれぞれハイブリダイズしたときに、約56℃および65℃のTmsを有する融解ピークを生じた。2D63B F HyBeaconは、ミスマッチおよびマッチPCR産物にそれぞれハイブリダイズしたときに、同様の約58℃および65℃のTmsを有する融解ピークを生じた。HyBeaconが前記SNPの2種の対立遺伝子にハイブリダイゼーションすることによって生じた融解温度は、非常によく再現することができ、統計学的にも有意である（単一因子ANOVAがp<0.01）。したがって、CYP2D6 *1および*3遺伝子型（それぞれ、正常および欠損型の酵素代謝表現型に関連する）は、不均一HyBeaconアッセイで確実に判別される。
【００５０】
(v)核酸配列のリアルタイム検出
HyBeaconプローブから発光される蛍光量は、オリゴヌクレオチドが相補的な核酸配列にハイブリダイズしたときに、一本鎖コンホメーションのときよりも有意に大きい。したがって、PCR増幅の経過全体にわたって、特定のDNA標的の蓄積をリアルタイムでモニターするのに、HyBeaconsが反応液に含まれていてもよい。図6は、増幅の各サイクルにおいて産物の蓄積をモニターするために2D64C* HyBeaconを使用した、ゲノムおよび唾液DNAに存在するCYP2D6*1配列の検出を示す。
【００５１】
(vi)SNPsの「リアルタイム」判別（均一アッセイ）
HyBeaconプローブが多型標的配列にハイブリダイズするときに、相互作用は、完全にマッチするか、またはミスマッチするかいずれであってもよい。ヌクレオチドがミスマッチする部位では、完全に相補的な配列と比較してハイブリダイゼーションTmが低下するため、プローブ/標的二本鎖が不安定になる。ハイブリダイズしたHyBeaconから発光される蛍光量は、一本鎖プローブより有意に多いので、ハイブリダイゼーションTmに基づいて多型標的配列を判別することができるだろう。PCRにおけるアニーリング（および蛍光穫得）温度を最適化して、HyBeaconプローブに完全に相補的な標的配列のみが増幅時に蛍光シグナルを増加するような選択的ハイブリダイゼーションによって、密接に関連したDNA配列をリアルタイム判別することもできるだろう。SNPsを含む多型配列を、リアルタイム増幅の際に得られる蛍光データを使用して同定してもよい。たとえば、HyBeaconプローブが、変異を含むDNA配列に完全に相補的に設計されている場合、変異対立遺伝子が存在する場合にのみ蛍光発光の増加が生じる。
【００５２】
HyBeaconプローブを、NAT2およびCYP多型配列を増幅するようにデザインしたポリメラーゼ連鎖反応に組み込んだ。増幅の各サイクルのプライマーアニーリング段階において、マッチおよびミスマッチHyBeaconのTmsの中間温度で単一蛍光読み込みを獲得した。蛍光穫得温度において、前記HyBeaconは完全マッチの標的にハイブリダイズすると予測されるが、ミスマッチ配列のハイブリダイズは予測されない。ディファレンシャル・プローブ・ハイブリダイゼーションでは、蛍光穫得温度において完全マッチのテンプレートを含む反応液は、増幅の際に蛍光を増加する結果となるが、一方ミスマッチのテンプレートを含む反応液では、蛍光の増加をもたらさない。NAT2*4および*5A多型を判別するために使用したF HyBeacon 0203002を用いた均一SNP解析を、ここに示す。前記HyBeaconは、NAT2の*4対立遺伝子に完全にマッチし、*5A配列にハイブリダイズした場合は、単一塩基ミスマッチを有する。図7aは、SNPsの「リアルタイム」判別を示しており、*4対立遺伝子を含む反応液のみが、PCRサイクル時の蛍光発光に有意な増加を生じる。ミスマッチする*5A対立遺伝子のみを含む反応液では、増幅の際に蛍光発光の増加を生じない。
【００５３】
図8は、多型CYP2D6 *1および*4配列の検出および判別を示すリアルタイムHyBeacon解析のもう一つの例であり、テンプレート供与源としてプラスミドDNAを使用する。また、ゲノムDNAおよび唾液サンプル中に存在する多型配列の判別は、リアルタイムHyBeacon PCR解析によって行ってもよい。図8に示した2D64C* HyBeaconは、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子と完全にマッチし、したがって蛍光発光がリアルタイム増加することによって、*1配列の増幅が特異的に検出される。CYP2D6*1配列のみを含む反応では、比較的多量の発光の増加を生じるが、*4対立遺伝子のみを含むサンプルでは、有意な蛍光増加を示さない。*1および*4対立遺伝子を含む反応では、中程度の蛍光発光量の増加を示す。CYP2D6*4対立遺伝子に完全に相補的な2D64C HyBeaconを使用することにより、2D64C*の遺伝子型の決定結果を確認することができる。リアルタイムPCRによってホモ接合性およびヘテロ接合性DNAの正確な同定を確実にするためには、TaqManTMプローブ、分子的ビーコン、ハイブリダイゼーション・プローブおよびスコーピオン・プライマーと同様に、両対立遺伝子のSNPsに関してサンプルの遺伝子型を決定するために、2種のHyBeaconプローブが必要とされる。
【００５４】
(vii)融解曲線解析によるSNPsの判別
また、多型DNA配列は、HyBeaconプローブを使用して融解解析およびTm測定を行うことによって、「終了点」フォーマットで検出および判別してもよい。HyBeacon/標的二本鎖のホモ接合性融解曲線解析では、増幅直後にLightCycler反応を行ってもよい。融解曲線解析に由来する融解温度は、完全に相補的なHyBeaconsに由来するTmsではミスマッチするプローブが相互作用したものよりも有意に大きく、標的DNA配列を同定することができる。0203002 HyBeacon並びに*4および*5A多型標的について行った増幅後融解解析では、マッチおよびミスマッチ配列について、それぞれ約62℃および54℃のTmsを有する融解ピークが生じた（図7b）。マッチおよびミスマッチ標的配列とハイブリダイゼーションすることによって生じた融解ピークのTmsは、所与のSNPにおいて非常に再現性があり、かつSNPs間で有意に異なっている。したがって、HyBeacon融解温度を解析することによって、SNPsの確実な判別が達成される。増幅後融解解析により、「リアルタイム」蛍光データを確認することができ、PCRにおける蛍光増加の有無が、それぞれマッチまたはミスマッチ標的の存在と実際に相関していることを確認できる。したがって、増幅後融解によって、ミスマッチ標的が存在するために蛍光増加を生じない反応と、標的が存在しないか、またはPCRによる増幅が全くないために蛍光増加を生じない反応間を判別することができる。F-QおよびF HyBeaconの変異型はどちらも、適切に「リアルタイム」増幅アッセイがなされ、かつ均一アッセイにおいて増幅後融解曲線を生じることが示されている。しかし、F HyBeaconsでは、同一のDNA配列のF-Qプローブと比較して、概して優れた質の増幅後融解物を生じることが見出されている。
【００５５】
F HyBeaconプローブにおいて、ホモ接合性サンプルでは、標的配列の同一性に依存してマッチまたはミスマッチの単一の融解ピークを生じるが、一方ヘテロ接合性のDNAでは、マッチおよびミスマッチのピークのどちらも持った融解トレースを生じる。図9は、ゲノムDNAサンプルから増幅した多型CYP2D6 *1および*4配列の、融解ピーク解析による検出および判別を示す。2D64C* HyBeaconは、完全に相補的な*1対立遺伝子を含むホモ接合性DNAにハイブリダイズするときに、約60℃のTmをもつ単一の融解ピークを生じる。ホモ接合性の*4サンプルにハイブリダイゼーションするミスマッチプローブでは、約49℃のTmを有する単一の融解ピークを生じる。*1および*4対立遺伝子をどちらも含むヘテロ接合性のサンプルは、60℃および49℃の融解ピークをどちらも備えたトレースを生じる。
【００５６】
(viii)ホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルの同定
SNPsをスコアする技術により、サンプルが特定の対立遺伝子に対しホモ接合性か、またはヘテロ接合性であるかを同定できることを考慮することが重要である。F-Q HyBeaconsを利用するヘテロ接合性解析では、ヘテロ接合性サンプルを同定するために、SNPの2つの対立遺伝子に完全にマッチする2種の異なったプローブが必要なことが見出されている。F-Qプローブは、完全に相補的な標的およびミスマッチ標的の混合液を含む反応において、マッチ融解ピークだけを典型的に生じることが見出されたので、2種のHyBeaconsが必須であると考えられる。ミスマッチ融解ピークは、ヘテロ接合性の反応においては観測されない。これは、完全に相補的な標的に対する結合が、いずれも熱力学的に有利であるか、または融解解析ではマッチした曲線を示すと同時に、ミスマッチのピークをマスキングしているかのいずれかによる。2種のHyBeaconsが、同時に励起され、かつ検出できる異なったスペクトルの蛍光団をもつ場合、F-Qプローブを使用して、均一ヘテロ接合体判別アッセイを単一のチューブで行うことができるであろう。しかし、現在、LightCyclerは、フルオレセインを励起できるだけである。したがって、同じLightCyclerキャピラリーにおいて2種の異なったHyBeaconsを使用したディファレンシャル・ビーコン・ハイブリダイゼーション解析を、有意に異なったTmsをもつプローブを使用して行った。ホモ接合性およびヘテロ接合性のNAT2 *4および*5Aサンプルを判別するために、異なった長さおよびTmの2種のF Q HyBeaconプローブ（F17834およびF17835）を単離して、および併用して使用した（図10）。F17834およびF17835プローブは、それぞれホモ接合性*4および*5A DNAにハイブリダイズしたときに、約60℃および52℃のTmsをもつマッチ融解曲線を生じる。*4および*5A配列（ヘテロ接合体）を含む混合DNAに対して、F17834およびF17835 HyBeaconsを併用して使用したときに、約59℃および52℃のTmsをもつ2種の融解ピークが、同じ融解トレース中に生じる。単一の融解トレースに2種のピークが存在することを、ヘテロ接合性の指標として使用することができる。
【００５７】
F HyBeacon技術の重要な特徴は、F-Qプローブおよび以前に報告した蛍光性プローブとは異なり、単一のF HyBeacon蛍光プローブを使用してホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルを確実に同定し得ることである。TaqManTMプローブなどの蛍光プローブ、分子ビーコンおよびスコーピオン・プライマーでは、リアルタイムPCR方法によって両対立遺伝子配列を確実に検出および判別するために、典型的には2種のプローブを必要とする。さらに、ハイブリダイゼーション・プローブでは、融解曲線解析によってホモ接合性およびヘテロ接合性のDNAを同定するために、一対の蛍光性オリゴヌクレオチドを必要とする。HyBeaconプローブにより、Tm測定および生じた融解ピークの数による融解曲線解析を介して確実にホモ接合性およびヘテロ接合性のサンプルを判別することができる。図9および図11は、融解ピーク解析によるホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルの同定を示す。ここでホモ接合性サンプルは特定のTmsによって同定され、ヘテロ接合体は単一融解トレースに2種のピークが存在することによって同定される。図11には、ホモ接合性およびヘテロ接合性のDNA標的にハイブリダイズしたNAT2 *5C F HyBeacon（DdeFL1）に由来する融解曲線を例示する。均一および不均一アッセイにおいて、DdeFL1は、ホモ接合性のマッチ（*5C）およびミスマッチ（*4）標的に対して、それぞれ約54℃および47℃のTmsを有する単一の融解ピークを生じる。*4および*5C対立遺伝子に対してヘテロ接合性のサンプルでは、単一の融解トレースにおいて、マッチおよびミスマッチするピークの両方を生じることが見出された。したがって、HyBeacon融解トレースに2種のピークが存在することにより、ヘテロ接合性のサンプルを確実に同定することができる。
【００５８】
HyBeaconプローブを使用してヘテロ接合性DNAを検出する能力は、ΔTm（完全に相補的なものと、ミスマッチのハイブリダイゼーションのTm間の差異）の大きさに依存する。表5は、NAT2およびCYP多型性遺伝子にハイブリダイゼーションさせた際の、HyBeaconプローブによって示されるTmおよびΔTm値を例示する。融解ピーク解析によってホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルを確実に同定することができるプローブを、本明細書において調査した9つのSNPsのそれぞれについて開発した。融解曲線解析によってヘテロ接合性DNAの存在を確実に検出するためには、約5.2℃を上回るΔTm値が必要であることが明らかである。ハイブリダイゼーションのΔTmは、プローブの長さ、ヌクレオチド・ミスマッチの位置およびミスマッチの同一性に依存する。HyBeaconオリゴヌクレオチドの長さは、ハイブリダイゼーションの特異性を保証するのに十分足りるべきであるが、過剰となってミスマッチに非感受性とならないようにすべきである。中心部位のミスマッチは、オリゴヌクレオチド末端に位置するミスマッチよりも、Tmに対して大きな影響を有するので、HyBeaconsは、多型ヌクレオチドがプローブの中心近くに位置するように設計されるべきである。すべてのヌクレオチド・ミスマッチは、ハイブリダイゼーションTmを不安定化する傾向を示すが、不安定化の程度は、ミスマッチ相互作用の型に依存する。Gを含む相互作用（すなわちG/T、G/AおよびG/G）は、室温において最も安定しており、Cを含むミスマッチ（すなわち、C/T、C/AおよびC/C）は、最も安定していない。したがって、ΔTmに対するミスマッチの及ぼす影響を最大にするために、Gを含むミスマッチを避けて、Cを含むミスマッチで行われる。
【００５９】
表5
NAT2およびCYP配列に対するHyBeaconのハイブリダイゼーションに由来するTmおよびΔTm。多型部位において生じるマッチおよびミスマッチヌクレオチドの相互作用を含む。Tm値は、実験的変動を説明するために数回の独立した解析から得られたものであり、平均および標準誤差値が含まれる。イタリックの値は、オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションに由来したものである。ヘテロ接合性DNAを同定する能力は、ΔTmに依存し、単一の融解トレースにマッチおよびミスマッチ融解ピークの両方が存在することによって同定される。
【００６０】
【表５】
HyBeaconプローブを使用した多重解析の可能性を、特異的および非特異的PCR標的の混合液を使用して検討した。HyBeaconsは、PCRを通して増幅された特異的DNA標的にハイブリダイズして、蛍光発光の増加を生じる。HyBeacon蛍光発光の増加は、プローブの標的配列を欠いた非特異的DNA標的では生じない。2D64B HyBeaconプローブが特異的標的の増幅を検出する機能を試験するために、種々の比率の特異的および非特異的PCRテンプレート（非特異的DNAにおける特異的配列が100、80、60、40、20、10および5%）を、均一アッセイにおいて分析した。特異的標的のみを増幅した反応、すなわち非特異的増幅がない反応では、すべての開始濃度の特異的標的が、蛍光発光を同等に増加して容易に検出された（図12a）。しかし、特異的および非特異的標的が共に同じ反応において増幅されたときは、特異的PCRテンプレートの比率が減少するにつれて（図12b）、プローブが特異的増幅を検出する機能が低下した。本実験に由来する結果は、最高で4つまたは5つの異なった標的を含むHyBeacon多重アッセイが可能であろうことを示唆する。しかし、シグナル蛍光団を増加し、かつより高い感度の検出機器を使用することによって、5つ以上の標的に多重解析を拡大することができるであろう。
【００６１】
HyBeaconプローブの機能は、今までに、FAM、HEXおよびTET蛍光色素を使用して示されており、ハイブリダイズしたプローブはそれぞれ、一本鎖のHyBeaconsよりも有意に多量の蛍光を発光する。これらのスペクトルが異なったHyBeaconsにより、リアルタイムPCRおよび融解ピーク解析を使用して多数の多型配列を同時に増幅、検出および判別することもできる。図13aは、単一のABI PRISM 7700 マイクロタイタ-プレートにおいて、FAMおよびHEXラベルされたHyBeaconプローブをそれぞれ使用した、NAT2*4およびCYP2D6*1対立遺伝子の同時増幅、および特異的検出を示している。また、多型配列の同一性を、FAM、HEXおよびTETプローブを使用して、融解温度測定によって決定してもよい。ABI PRISM 7700から得られた融解物曲線データを融解ピークに転換するために、Excelマクロを作製した。図13bには、FAM、HEXおよびTET色素でそれぞれラベルされた2D64C*、2D64EおよびDdeFL1*4Tプローブから得られたピークを示す。融解ピークは、相補的なオリゴヌクレオチドおよびPCR増幅された標的に対するHyBeaconのハイブリダイゼーションから得られた。
【００６２】
(x)HyBeaconアッセイの最適化
標的検出およびSNP判別の効率を強力に改善するために、種々のHyBeaconアッセイにおけるパラメータを修飾してもよい。アッセイ最適化のために分析した反応条件の例をここに示す：
a)バッファー最適化：下記の少量バッファーの最適化は、1.25mM Tris.Cl pH8. 0、250nM MgCl2、25nM DTTにおける不均一融解解析実験により行った。このハイブリダイゼーション・バッファーは、現在までに合成された大多数のHyBeaconsにおいて、高品質の融解曲線を生じることが示された。しかし、F17836プローブでは、オリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズした場合でも、このバッファー中で融解曲線を生じなかった。その後、HyBeacon融解温度対MgCl2濃度の研究を行った。上記バッファー中では、F17836に対する融解ピークが得られないが、50mM Tris、3mM MgCl2中では、非常に良質の融解曲線が得られることが示された。さらに、MgCl2濃度と融解ピークTmの間に、非常に強い相関があることが示された。この関係をF17831、TB0993、F17834、F17835およびB9414 HyBeaconsについて研究し、0.1mm〜10mmの濃度間で行った回帰分析にでは、それぞれ、98.9%, 97.9%, 99.4%, 99.3%および98.8%のR2値を生じた（図14を参照）。MgCl2濃度を変更することにより、HyBeaconsのTmを10℃以上変化することができる。バッファー組成に基づいて特定のHyBeacon Tmsを選択し、ディファレンシャル・ビーコン・ハイブリダイゼーション・アッセイをデザインすることができるであろう。
【００６３】
均一増幅アッセイで試験した市販のPCRバッファーの中で、TaKaRaのバッファーが優れていることが見出された。Pharmacia, Taq Gold、並びにTaKaRa PCR buffers、並びに対応するTaq、Taq Gold、Z-Taqポリメラーゼについて、HyBeaconアッセイにおけるその効率を比較した。Taq Goldバッファーおよびポリメラーゼで行ったアッセイでは、まったく機能せず、したがってリアルタイム増幅曲線または融解ピークを生じなかった。PharmaciaおよびTaKaRaのバッファーはどちらも、TaqおよびZ-Taqポリメラーゼによって増幅曲線および融解ピークを生じる。しかし、さらなるMgCl2がPharmaciaのバッファーに含まれているときでさえも、TaKaRaのバッファーが典型的に優れた結果を生じる。PharmaciaのPCRバッファーを使用して、一連のMgCl2濃度における増幅および検出の効率を分析すると、最適の濃度は、3.0〜3.5mMの間であることが見出された。TaKaRaのバッファーは、3.0mMのMgCl2を含むことが知られているが、他の成分は知られていない。
【００６４】
StratageneのOptiprimeキットを使用して、HyBeacon PCRアッセイの最適化に必要とされる成分および条件の指標を得た。Optiprimeキットは、種々のpH（8.3、8.8および9.2）の12種の個別のバッファーから成り、種々の濃度のMgCl2（1.5mMおよび3.5mM）およびKCl（25mMおよび75mM）を含む。標的を増幅および検出する効率は、pHによって顕著な影響は受けないが、MgCl2およびKCl濃度によってかなりの影響を受けた（それぞれ（1×バッファー中に）3.5mMおよび25mMが最適であった）。Optiprimeキットから得られた情報を使用して、10×HyBeacon PCRバッファー（100mM Tris.HCl pH8.8、250mM KCl、35mM MgCl2）を作製した。このバッファーは、HyBeaconアッセイにおいて比較的十分に機能して、増幅後解析において高品質な融解ピークを生じることが見出された。しかし、リアルタイム解析によって生じる蛍光増加の大きさは、TaKaRaのPCRバッファーで行った解析と比較して減少していた。したがって、リアルタイム標的検出効率を改善するために、一連のPCR補助剤をHyBeacon PCRバッファーに添加した。HyBeacon PCRバッファーにおいて検討した推定のPCRエンハンサーのうち、BSAのみがリアルタイム増幅の効率に顕著な陽性の影響を有することが見出された。0μg/μl〜1μg/μlの間で、BSAのワーキング濃度を研究した。BSAの濃度を0μg/μl〜100ng/μlに増加すると、リアルタイム標的検出の効率を亢進した。しかし、BSA濃度を増加した結果、増幅後融解ピークの質が低下していた。したがって、リアルタイム増幅の亢進するが、融解ピークの質を低下させない最適なBSA濃度を捜した。この最適なワーキング濃度は、2.5ng/μl〜5ng/μlの間であることが見出され（図15を参照）、したがって50ng/μlのBSAを10×HyBeacon PCRバッファーに含ませた。このバッファーは、TaKaRaPCRバッファーに匹敵する効率を有する機能を示した。
【００６５】
b）アンプリコンの選択：2種のプローブF18140およびF18141を除いては、試験したHyBeaconsのすべてが、オリゴヌクレオチド相同体に対して非常に高い質の融解曲線を生じる。しかし、これらプローブのすべてが、大きなPCR標的に対して高い質の融解物を生じるというわけではない。多型部位に関連するアンプリコンの大きさおよびプライマーの位置を変化することにより、より効率的なプローブ・ハイブリダイゼーションおよび優れた融解曲線の生成が可能となる。22bpだけ異なた2種のアンプリコンを使用すると、NAT2*6プローブのうちの1つにおいて、「リアルタイム」増幅検出および融解ピーク判別の効率に有意な差異が観察された（図16）。
【００６６】
c)プローブ融解温度：ハイブリダイゼーション・ビーコンのTmは、増幅後融解曲線の質に影響を及ぼすかもしれない。合成および試験がなされた初期HyBeaconsの多くでは、約60-65℃においてバックグラウンド蛍光効果を生じることが見出された。約58℃より高いマッチTmsをもつ多数のHyBeaconsでは、このバックグラウンド蛍光によって、それらマッチの融解ピークが不明瞭になったが、より低いTmsを有するミスマッチのピークでは、融解トレースにおいて明瞭に認識されることが見出された。58℃未満のマッチTmsをもつプローブでは、増幅後融解解析実験が、もっと能率的に行われるであろう。CYP2D6 *3および*4多型のために、F-QおよびF HyBeaconプローブをデザインした。オリジナルのCYP2D6 F HyBeaconsは、F-Qプローブに勝る多くの利点を備えており、高品質なリアルタイムPCR増幅データを生じて、*3および*4 SNPsを確実に判別することが可能となった。しかし、これらF HyBeaconプローブ（2D63Bおよび2D64B）では、バックグラウンド蛍光の影響と有意に重なってしまうため、高品質の融解ピークを生じなかった。したがって、これらの高いTmのプローブでは、SNPs並びにホモ接合性およびヘテロ接合性のサンプルを融解解析よって同定することはできなかった。Tmsが有意に低下するように、*3および*4 HyBeaconsを、それぞれ2（2D63C）および3（2D64C）ヌクレオチド短くして再びデザインした。これらのTmを低下したプローブでは、どちらも高品質なリアルタイム増幅曲線および増幅後融解ピークを生じ、極めて信頼性のあるSNP判別およびヘテロ接合体解析が可能となる。2D63Bおよび2D64Bプローブとは対照的に、2D63Cおよび2D64Cでは、増幅後解析の際にマッチおよびミスマッチ融解ピークを生じ、バックグラウンド蛍光の影響とほとんど重なりを示さない。
【００６７】
d)HyBeacon濃度：アッセイに含まれるHyBeaconの量は、シグナル：バックグラウンドの蛍光比を変化することによって、生じた結果の質に影響を及ぼすことが見出されている。過剰なプローブがアッセイに含まれる場合、バックグラウンド蛍光が、ハイブリダイゼーションを介した変化をマスキングする。多くの場合、HyBeacon濃度を低くして使用したときに、優れた質の融解曲線が観察される。高品質のリアルタイム増幅データおよび増幅後融解ピークの生成を可能にするF HyBeaconプローブの最適濃度は、典型的には100〜300nMの間である。HyBeacon濃度を減少することによって、上記したバックグラウンド蛍光の影響が除去されるようである。
【００６８】
e)非対称PCR：今まで記載したすべてのHyBeaconアッセイでは、対称的PCRプロトコールを使用して二本鎖DNA標的を増幅した。二本鎖DNAにハイブリダイズしたプローブは、標的の相同鎖と競合しなければならず、その結果この競合的結合が、HyBeaconハイブリダイゼーションの効率を低下するであろう。非対称PCRは、一本鎖のPCR産物を作製するために使用される技術である。一本鎖の標的では競合するDNA鎖が共存しないので、HyBeaconsが二本鎖の分子よりも高い効率でハイブリダイズするのであろう。非対称PCRが、対称的増幅よりも優れているかどうかを検討するために、該技術を八つのHyBeacon SNPアッセイに適用した。八つのHyBeaconのうち四つでは、対称および非対称増幅において蛍光発光が同様に増加され、同等の検出効率をもっていた。一つのHyBeaconアッセイでは、対称増幅と比較して非対称アッセイにおける効率の低下を示したが（図17a）、他の三つのアッセイでは、非対称増幅において対称的PCRよりも蛍光発光の増加を示した（図17b）。さらに、これらのHyBeaconアッセイの多くは、対称的反応と比較して、非対称増幅された標的において優れた増幅後融解曲線を生じた（示されないデータ）。したがって、いくつかの場合には、潜在的により高感受性のSNP判別アッセイのために、非対称標的増幅を採用することが有益であろう。しかし、非対称一本鎖DNAを生じる機構は、対数的ではなく直線的であり、したがって増幅の検出およびSNPsの判別は、対称的増幅よりもかなり多いサイクル数で達成される（図17b）。許容限界サイクルにおいてこのように増加することは、アッセイ持続時間を延長するであろうし、かつ低濃度のゲノムDNAを含む反応に影響を及ぼすかもしれない。
【００６９】
(xi)固相におけるSNPsの判別
NAT2 *4および*5A多型標的を、195993'または195991と同じ配列のビオチン化されたプライマーを使用して、ゲノムDNAから増幅した。ビオチン化されたPCR産物を、96ウェルのストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに固定した。DNA標的をNaOHで変性させて、ビオチン化されていないPCR鎖を除去し、ウェルの表面に結合した一本鎖DNA標的を残した。HyBeaconプローブ（典型的にはF17832および0203002）を、固定化された一本鎖標的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除去して、DASH（Dynamic Allele Specific Hybridisation-Hybaid）装置を使用して融解解析を行った。マッチおよびミスマッチの固定化された標的からHyBeacon融解曲線が得られ、SNPsを確実に判別することができた（図18）。F17832 HyBeaconでは、不均一LightCyclerアッセイにおいて不十分な質の融解曲線を生じた。しかし、DASH 装置でこのプローブを用いることにより、良質な融解解析および確実なSNP判別が達成された。LightCyclerおよびDASH融解解析には、それぞれ二本鎖および一本鎖の標的を利用する。標的ハイブリダイゼーションに対してHyBeaconと競合するPCR相同体がないので、一本鎖標的からかなり優れた質の融解曲線が得られる。均一および固相フォーマットのどちらにおいても、HyBeaconsを適切に使用することにより、場合によるとアレイ系形態のいくつかにおいて、大量のアッセイを行うことができる多用途な系が提供される。
【００７０】
(xii)Taqポリメラーゼの5-3'-エキソヌクレアーゼ活性
HyBeaconアッセイが、TaqMan systemと異なることを確認するために、5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性を欠いた二種のDNAポリメラーゼ、Deep Vent(New England Biolabs)およびStoffel断片(Pharmacia)を、「リアルタイム」増幅アッセイにおいて試験した。5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性は、TaqManアッセイに必須であり、このTaqポリメラーゼ活性は、蛍光団とクエンチャー部分間でTaqManプローブを特異的に消化するために必要とされ、完全にマッチする標的が存在する場合に蛍光発光の増加を引き起こす。Deep VentおよびStoffel断片ポリメラーゼを均一増幅アッセイにおいて使用して、NAT2 *4F HyBeaconプローブが、5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性の非存在下において標的の増幅を検出する能力を試験した（図19）。両タイプのポリメラーゼを含む反応では、増幅過程の全体にわたって、マッチするテンプレートによる蛍光発光の増幅を示したが、ミスマッチするテンプレートを含む反応では、蛍光の増加を生じなかった。Deep VentおよびStoffel断片ポリメラーゼによって、「リアルタイム」および増幅後フォーマットにおけるSNP判別がなされてもよい。したがって、これらの結果は、F HyBeaconsがリアルタイムPCRによってDNA配列を検出する機構が、5'-3'-エキソヌクレアーゼアッセイの機構と異なっており、蛍光団とクエンチャー部分が酵素的に分離されるためではなく、むしろプローブ・ハイブリダイゼーションによって直接生じる蛍光発光の増加に依存していることを示している。
【００７１】
(xiii)HyBeaconプローブを利用した定量的PCR
PCR増幅の進行を「リアルタイム」でモニターする能力は、PCRに基づいてDNAおよびRNAの定量化を行うことができるアプローチに完全な革命を起こす。「リアルタイム」定量PCR実験では、一定数のサイクル後に蓄積されたPCR産物量よりも、むしろPCR産物の増幅が最初に検出されたときの（CT-閾値サイクル）サイクリング時点によって反応が特徴づけられる。核酸標的の開始コピー数を多くするほど、蛍光の有意な増加が速やかに観察される。「リアルタイム」増幅におけるHyBeaconプローブによる標的DNAの定量化の可能性を、2D64B、2D64C*およびDdeFL1 F HyBeaconsを使用して検討した。定量的HyBeacon PCR解析は、LightCyclerおよびABI 7700 instrumentで行った。均一PCR増幅におけるテンプレートとして、DNA標準（PCR産物またはゲノムDNAの既知濃度）の範囲を使用した。各DNA標準における閾値サイクルを測定して、ログDNA濃度をCTに対してプロットし、「直線」標準曲線を作製した。「未知」の濃度のゲノムDNAを含むサンプルから得られた閾値サイクルを、標準曲線にプロットして、これら反応液に存在するDNA濃度を算出した。HyBeacon定量的PCRに由来する標準曲線は、LightCyclerおよびABI 7700 instrumentのどちらにおいても非常に高い質であり、0.93〜0.99の間の相関係数をもっていた（図20）。試験した「未知」の反応液において、これらの標準曲線から計算されたDNA濃度は、正しいオーダーの算出濃度であり、適度に正確だった。たとえば、5.4×104ng/μl、700ng/μlおよび90ng/μlの「未知」のサンプルでは、それぞれ6.9×104ng/μl、1406ng/μlおよび115ng/μlのLightCycler標準曲線から算出された濃度を有した。ところが、285ng/μl、163ng/μlおよび53ng/μlのゲノムサンプルでは、ABI 7700に由来する標準曲線において、256ng/μl、137ng/μlおよび44ng/μlであるとして算出された。
【００７２】
(xiv)従来のDNA抽出を伴わない標的配列の検出および判別
血液または頬スワブなどの患者サンプルから遺伝子型を得るためには、典型的にはPCR増幅および下流解析の前にそのゲノムDNAを抽出することが必要である。DNA抽出プロトコールは、時間がかかり、面倒で、かつ高価であろう。したがって、HyBeacon解析における期間および費用を減らすために、唾液DNAから直接PCR増幅を行い、ゲノムDNAを抽出する必要をなくした。LightCyclerによる迅速な温熱サイクリング条件と合わせて、唾液から直接標的を増幅することにより、35-40分以内で多型配列の遺伝子型を決定することができる。
【００７３】
多型NAT2 *4および*5C配列を10の唾液サンプルから増幅して、*5Cおよび*4対立遺伝子にそれぞれ完全に相補的なDdeFL1およびDdeFL1*4 HyBeaconsによって分析した。図21および22は、リアルタイムPCRデータ、並びに*5C/*5C（サンプル1）、*4/*4（サンプル2）および*4/*5C（サンプル3）遺伝子型から増幅されたDNA配列とDdeFL1およびDdeFL1*4のハイブリダイゼーションに由来する融解ピークを例示する。表6は、多型NAT2配列HyBeaconとDdeFL1およびDdeFL1*4のハイブリダイゼーションに由来する融解温度を示す。リアルタイムPCRおよびTmデータから、*5C多型に関して個々の遺伝子型を決定することが可能となる。分析した10の唾液サンプルのうち、3つが*5C対立遺伝子に対してホモ接合性であると分類され、1つが*4対立遺伝子に対してホモ接合性であると特徴づけられ、および6つがヘテロ接合性であることが見出された。NAT2 *5C遺伝子座のこれらの遺伝子型は、それぞれ緩徐、速い、および中間のアセチル化表現型と関連がある。唾液サンプルをHyBeacon解析することによって得られた遺伝子型および表現型を確かめるために、唾液サンプル1-3についてRFLP解析を行った（図23）。*4/*4 DNAから増幅された179bp PCR産物は、単一のDdel制限部位を含み、その部位を消化することにより、121bpおよび58bp断片が生じる。*5C多型は、さらなるDdel制限部位を生じ、その結果、*5C/*5C DNAから増幅された179bp産物の消化により、98bp、58bpおよび23bp断片が生じる。ヘテロ接合性の唾液サンプルから増幅された産物を消化することにより、121bp、98bp、58bpおよび23bp断片を生じる。RFLPおよびHyBeacon方法論のどちらによっても、唾液サンプル1-3は、それぞれホモ接合性*5C、ホモ接合性*4およびヘテロ接合性であるとタイプされる。したがって、ここに示されたデータは、高品質のDNA精製を必要とせず、多型配列の確実な増幅、検出および判別を行ことができることを示している。
【００７４】
表6
Tm値は、増幅されたNAT2 *4および*5C配列の融解曲線解析に由来した。DdeFL1およびDdeFL1*4 HyBeaconsは、*5Cおよび*4対立遺伝子にそれぞれ完全にマッチする。マッチおよびミスマッチの融解ピークの平均および標準誤差は、各唾液サンプルにおいて、および全てのサンプルにおいてひとまとめにして詳述する。Npは、所与の融解トレースにおいて特定のピークが存在しないことを示し、「−」は、deFL1*4アッセイが特定の唾液サンプルにおいて行われなかったことを示す。
【００７５】
【表６】
RNA標的を検出する可能性を評価した。最初に、NASBA（核酸配列ベース増幅（Nucleic Acid Sequence Based Amplification））RNA産物を検出するためのHyBeaconプローブをデザインした。この産物は、融解曲線解析におけるHyBeacon融解ピークの生成によって検出されなかった。これは、おそらくRNA産物が減少するためである。したがって、DNAまたはRNAからなるオリゴヌクレオチド相同体を合成して、HyBeaconプローブのハイブリダイゼーションを分析した。最初に、融解ピークはDNA標的から得られたが、RNAオリゴヌクレオチドからは得られなかった。RNA標的濃度が2μMに増加されるまで、プローブ・ハイブリダイゼーションに特徴的な融解ピークは得られなかった（データ示さず）。HyBeacon/RNA二本鎖の融解温度は、HyBeacon/DNA二本鎖と比較して有意に低下していることが示され、RNAに対するハイブリダイゼーションは、DNAに対するハイブリダイゼーションより、かなり不安定であることが示唆される。したがって、解析の際に高濃度のRNA標的を産生することができない限り、HyBeaconプローブは、確実にそれらを検出することができないだろう。
【００７６】
(xvi)配列検出の機構
プローブ・クエンチャー部分が存在しないにも関わらず、相補的標的DNA配列に対してHyBeaconプローブがハイブリダイゼーションすることによって、蛍光発光量に有意な変化が生じる。ヌクレオチド残基（特にグアニン）は、静的および動的なクエンチング機構を介して、蛍光発光に効果を及ぼすことが示されている。したがって、HyBeacon蛍光のクエンチングは、塩基−色素のスタッキングおよび電子移転イベントを介して、プローブのオリゴヌクレオチド成分から生じる可能性もある。標的配列に対するHyBeaconのハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチド成分に関して蛍光団部分の指向を変え、色素と塩基間の電子移転量に影響を及ぼしている可能性がある。あるいは、二本鎖形成によって生じる塩基−色素のスタッキング、たとえば蛍光団の塩基スタック内へのインターカレーションによって蛍光クエンチング量を変化するのかもしれない。HyBeaconプローブが標的DNA配列にハイブリダイズすると、HyBeaconオリゴヌクレオチドによって課せられていた蛍光クエンチングは、コンホメーション変化によって少量ではあるが検出可能な量が軽減されるであろう。クエンチングが減少することにより、蛍光発光量の増加を生じ、配列検出および対立遺伝子判別が可能となる。HyBeaconが機能する機序を調査するために、蛍光およびu.v.分光技術を使用して、量子収率、蛍光寿命および一本鎖と二体鎖状態間で生じる放射波長の変化の可能性を分析してもよい。
【００７７】
【発明の効果】
結論
ハイブリダイゼーション・ビーコン（HyBeacons）は、相補的標的配列とプローブがハイブリダイゼーションする直接的結果として生じる蛍光発光の増加を介して、特定のDNA配列を検出することが示された。蛍光放射の量およびプローブ/標的二本鎖のTmにより、オリゴヌクレオチドおよび増幅PCR配列のSNPsの判別が可能となる。ここで報告した結果は、HyBeaconアッセイにより、単一のプローブを使用してホモ接合性およびヘテロ接合性のサンプルを同定することができること、並びに単一チューブ/ウェル・アッセイにおける多数のHyBeaconプローブの使用により、多重解析の可能性を有することを示す。さらに、HyBeaconsにより、「リアルタイム」PCRアッセイにおいてDNA標的が定量化されることが示された。
【００７８】
HyBeaconプローブは、配列検出、SNP判別およびDNA定量化のための現在利用できる市販の系（分子ビーコン、Scorpions、FRETプローブおよびTaqManプローブ）に代わるものである。HyBeaconsを使用した検出アッセイは、それらが単純な作用機序であって二次構造を欠き、かつ酵素の必要性を欠くこと、並びに単一プローブを使用してヘテロ接合性DNAを同定するというその能力のために、魅力的である。
【００７９】
標的の増幅および検出を単一のチューブで行う、均一HyBeacon法（上記の通りの）によって、分子診断アッセイを行ってもよい。あるいは、増幅された標的のロボット単離、またはロボット固相固定により、バッファーの置換およびHyBeacon添加に続いて、ハイスループットな検出系を形成することもできる。ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション・アッセイは、マイクロアレーまたはマクロアレーフォーマットで行うこともでき、このフォーマットでは、プローブまたはより好ましくは標的のいずれかを、HyBeacon融解解析前に固定させる。
【００８０】
HyBeaconプローブの2種の変異型を評価した。プローブには、内部ヌクレオチド残基に蛍光団およびクエンチャー部分の両方が連結されたもの（F-Q HyBeacon）を含んでもよく、または蛍光団成分のみ（F HyBeacon）を含んでもよい。変異型はどちらも、均一および不均一フォーマットにおいて確実にSNPsを判別することが示されている。しかし、F HyBeaconsは、F-Qデザインに勝る明らかな効果を有する：
・現在、蛍光団およびクエンチャー部分は、T残基のみに配置され得る。したがって、蛍光団とクエンチャー部分を分離する残基数および角素因の効果の可能性を考慮する必要がないため、F HyBeaconsは、かなり簡単に束縛が少なくデザインされる。
【００８１】
・クエンチャーが存在しないため、F HyBeaconsは、合成が高価ではなく、アッセイには、F-Qと比較して反応あたり約5分の一のプローブ（200nM未満）が必要なだけである。
【００８２】
・F HyBeaconsは、「リアルタイム」均一アッセイにおいて、優れた質の増幅後融解曲線を生じる可能性を有することが示されている。
【００８３】
・ヘテロ接合体解析において2種のF-Qプローブが必要なこととは対照的に、F HyBeaconsでは、単一のプローブを使用してヘテロ接合性サンプルが同定されることが示された。
【００８４】
本発明は、先に記載された態様に限定されず、本発明の精神から逸脱することなく、構成および詳細が変更されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 種々のHyBeaconのハイブリダイゼーション。マッチ、ミスマッチ、二重ミスマッチ間における相互作用の差異を図示する。図中、星は単一のヌクレオチド多型（SNPs）を示す。タイプAの相互作用は、野生型標的またはSNPの一対立遺伝子と完全にマッチするようにデザインされたHyBeacon分子を含む。タイプBの相互作用は、変異型標的またはSNPのもう一つの対立遺伝子と完全にマッチするようにデザインされたHyBeacon分子を含む。二つの独立したSNPsを考慮した場合、標的分子にハイブリダイズするビーコンは、（i）完全マッチ、（ii）一塩基ミスマッチをもつ、または（iii）多塩基ミスマッチをもつのいずれかであろう。
【図２】 蛍光量を使用したSNPの判別。B9414HyBeaconは、完全マッチ（i）および一塩基ミスマッチ（ii）にハイブリダイズし、標的が存在しない場合の実験（iii）も行った。a）融解プロフィールは、B94141HyBeaconに由来する。42℃以下および52℃以上の温度では、マッチおよびミスマッチ標的にハイブリダイズしたプローブによって発光される蛍光量が非常に小さい。しかし、これらの温度間では、完全に相補的なプローブによって発光される蛍光量は、ミスマッチHyBeaconの蛍光発光よりも有意に増加する。b)蛍光穫得のために、反応液を変性して46℃まで急冷した。処理範囲内では有意なクラスター形成、および処理間では統計学的な相違が観測され、その結果マッチ標的にハイブリダイズしたプローブは、ミスマッチ標的にハイブリダイズしたHyBeaconよりも有意に多くの蛍光を発光し、標的が存在しない場合のハイブリダイゼーション・ビーコンよりも多くの蛍光を発光する。c）HyBeaconは、標的の非存在下において融解ピークを生じない。B9414は、マッチまたはミスマッチ標的の存在下において、それぞれ約52℃および44℃のTmsを有する融解曲線を生じ、確実なSNPsの判別が可能となる。
【図３】 FおよびF-Q HyBeaconプローブの比較。NAT2ハイブリダイゼーション・ビーコンF17834（F-Q）および0203002(F)は、完全マッチのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。FおよびF-Q HyBeaconsは、同一のヌクレオチド配列を有し、かつ融解解析において約60℃のTmsの高品質なピークを生じる。F HyBeaconsは、クエンチャー部分が欠失しているため、F-Qプローブと比較してより大量のバックグラウンド蛍光を発する。
【図４】 InDel多型の融解解析。ハイブリダイゼーション・ビーコンが、挿入および欠失多型を判別する能力を有するかどうかを決定するために、TB0993 NAT2 *4プローブを一連のオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズさせた。マッチ標的（M）、単一ヌクレオチドの挿入を含む3種のオリゴヌクレオチド（1-3）、および単一ヌクレオチドの欠失を含む3種のオリゴヌクレオチド（4-6）を比較した。それぞれのHyBeacon/標的二本鎖において融解解析を行った。すべての場合において、マッチプローブは、ミスマッチInDelの反応より高いTmsおよび融解曲線を生じ、その結果融解ピークTmに基づいて、SNPsが判別されるであろう。a)挿入オリゴヌクレオチド。b)欠失オリゴヌクレオチド。c)マッチするビーコンでは、全てのInDelミスマッチに対するハイブリダイゼーションよりも多くの蛍光を発光し、SNPsを蛍光発光量に基づいて判別してもよいことを示す。
【図５】 不均一フォーマットにおけるSNPsの判別。CYP2D6 *3多型を含む標的を判別するために、FおよびF-Q HyBeaconプローブを使用し、そのうち、使用したDNA標的は、単離された119bpのPCR産物であった。F（2D63B）およびF-Q（2D63A）プローブは、同一のヌクレオチド配列であり、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子に完全にマッチし、および*3アレルにハイブリダイズしたときは、一塩基ミスマッチをもつ。a)2D63A F-Qプローブは、マッチおよびミスマッチ標的にそれぞれハイブリダイズしたときに、およそ65℃および56℃のTmsの融解ピークを生じる。b)2D63B F HyBeaconは、*1および*3 PCR標的にそれぞれハイブリダイズしたときに、およそ65℃および58℃のTms有する溶解ピークを生じる。
【図６】 DNA配列の均一検出。PCR産物の蓄積をリアルタイムでモニターするために、2D64C* HyBeaconプローブを使用してゲノムDNA(1)および唾液(2)サンプルにおけるCYP2D6*1配列の検出する。HyBeaconプローブから発光される蛍光量は、特異的標的配列の増幅と相関している。テンプレートDNAまたは増幅産物を含まないコントロール反応（3）では、PCRの間に蛍光発光レベルの上昇を示さない。
【図７】 均一フォーマットにおけるSNPsの判別。NAT2 *4配列に完全マッチのF HyBeaconプローブ0203002を、*4および*5A SNPsを識別するために均一LightCyclerアッセイにおいて使用した。a)SNPsは、リアルタイムPCRによって確実に識別され、マッチの*4テンプレートを含む反応のみが、蛍光発光に有意な増加を生じた。b)SNPsは、増幅後融解解析によっても識別された。この解析では、マッチの*4アレルでは、ミスマッチの5A標的配列よりも有意に高いTmsの融解ピークを生じた。増幅された産物の終了点分析によって、リアルタイムデータの確証が可能となる。
【図８】 CY2D6*4多型のリアルタイム判別：CYP2D6遺伝子の*1および*4対立遺伝子を検出および識別するために、2D64C* HyBeaconを使用した。多型配列は、*1対立遺伝子(1)および*4対立遺伝子(2)を含むpGEM-Tプラスミドから増幅した。ヘテロ接合性DNA(3)をシミュレーションするために、*1および*4プラスミドの混合液を使用した。また、テンプレートコントロール反応(C)は、解析に含まなかった。*1対立遺伝子を含むこれらの反応（すなわちサンプル1および3）のみが、リアルタイムPCR増幅の間に蛍光発光の増加を生じる。ホモ接合性*4サンプルおよびテンプレート・コントロール以外では、蛍光シグナルの上昇を生じない。*1および*4対立遺伝子に対するヘテロ接合性サンプルでは、増幅の間に発生すべき蛍光の中間量を生じさせる。
【図９】 融解ピーク解析によるCYP2D6 *1および*4対立遺伝子の判別。多型標的は、ゲノムDNAサンプルから増幅され、かつここで示した融解ピークは、サンプル1（ホモ接合*4）、2（ホモ接合*1）、および3（ヘテロ接合性のDNA）の増幅後解析に由来した。2D64C* HyBeaconは、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子に完全に相補的であり、ホモ接合性*4/*4および*1/*1サンプルに対しそれぞれ49℃および60℃のTmsをもつ単一の融解ピークを生じる。*4および*1対立遺伝子をもつヘテロ接合性サンプルでは、49℃および60℃融解ピークをもつトレースを生じる。
【図１０】 F-Q HyBeaconsを使用したヘテロ接合性の同定。ホモ接合サンプル（多型の一方の対立遺伝子のみを含む）をヘテロ接合性のサンプル（両方の対立遺伝子を含む）と区別するためには、SNPの両方の対立遺伝子に完全マッチの2種のF-QHyBeaconsを必要とした。F17834およびF17835 HyBeaconsは、それぞれNAT2遺伝子の*4および*5A対立遺伝子に完全にマッチする。F17834およびF17835は、有意に異なったTmsを有し、2種のFAMラベルされたプローブは区別される。a)F17834では、ホモ接合性の*4および*5A対立遺伝子が存在する場合に、それぞれ約60℃および54℃のTmsをもつ融解ピークを生じる。b)F17835では、ホモ接合性の*5Aおよび*4対立遺伝子が存在する場合に、それぞれ約52℃および49℃のTmsをもつ融解ピークを生じる。c)F17834またはF17835 HyBeaconsを含む反応では、ヘテロ接合性のDNAが存在する場合に、マッチする融解ピークのみを生じる。両プローブを含む反応では、*4および*5A対立遺伝子混合物が存在する場合に、約59℃および52℃のTmsをもつ融解トレースを生じる。単一の融解トレースに2つのピークが存在することにより、ヘテロ接合性のサンプルを同定することができる。
【図１１】 F HyBeaconを使用したヘテロ接合性の解析。F HyBeaconsがヘテロ接合性サンプルを判別する能力を試験するために、HyBeacon DdeFL1（これはNAT2 *5C多型配列に完全マッチ）を使用した。a)ホモ接合サンプルをDdeFL1で分析すると、単一のピークをもつ融解トレースを生じる。DdeFL1プローブは、不均一アッセイにおいてホモ接合性の*5Cおよび*4 PCR標的にハイブリダイズして、それぞれ54℃および47℃の融解曲線を生じた。b)DdeFL1 HyBeaconとマッチおよびミスマッチ標的の混合液を含む反応では、同様の融解トレースにおいて54℃および47℃のピークをもつ曲線を生じた。融解トレースに2種のピークが存在することにより、ヘテロ接合性サンプルを同定することができる。
【図１２】 HyBeacon多重解析の限界。HyBeacon多重解析における能力を検討するために、2D64B HyBeaconプローブを、特異的および非特異的PCRテンプレートを含む反応に含めた。PCRテンプレートは、特異的テンプレートの比率が100%〜5%の間で変化するような、特異的（CYP2D6）および非特異的（NAT2）DNAの混合液からなる。a)特異的標的だけが生じるように、反応にはCYP2D6プライマーを含むが、NAT2プライマーを欠いた。横断点において特異的標的の濃度が減少するという、小さな変化が観測された。しかし、反応間で増幅および検出の効率を比較可能であった。b)特異的および非特異的標的が生じるように、反応には、CYP2D6およびNAT2プライマーを含ませた。増幅および検出の効率の有意な減少は、特異的標的の比率の減少として観測された。しかし、この結果は、最高で4または5個の標的を含む多重反応が可能であろうことを示唆する。
【図１３】 多重HyBeacon解析。a)NAT2*4およびCYP2D6 *1標的は、それぞれFAM（BamFL1）およびHEX（2D64E）ラベルされたプローブを使用して、単一のマイクロタイタープレートにおいて同時に増幅および検出した。ゲノムDNAおよび完全にHyBeaconプローブに相補的な配列を含む反応のみが、増幅によって蛍光発光レベルの上昇を示した。ネガティブコントロール反応では、蛍光発光の増加を生じなかった。b)融解物ピークは、ABI PRISM 7700 instrumentおよびExcel macroを使用したFAM、HEXおよびTETラベルされたプローブに由来する。ここで示した融解ピークは、相補的なオリゴヌクレオチドへのプローブ・ハイブリダイゼーションに由来した。
【図１４】 HyBeacon Tmに対するMgCI2濃度の効果。一連のMgCI2濃度において0mM〜50mMまで変化させて、ハイブリダイゼーション・ビーコンF17834を完全に相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション・ビーコンのTmは、MgCl2濃度の上昇につれて増加を示した。a)以下のものを含む反応に由来するハイブリダイゼーション・ビーコン融解曲線を例示する：0mM、0.001mM、0.005mM、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、7mm、10mmおよび50mmのMgCl2（それぞれ左から右へ）。b)MgCI2濃度およびHyBeacon Tmの間に存在するポジティブな相関を示す。ハイブリダイゼーション・ビーコンのTmをMgCl2濃度の対数に対してプロットしたときに、定義した濃度範囲において、比例関係が観測される（0.1mMと10mM間の場合）。このデータセットに対して行った線形回帰分析では、99.4％のR2値を生じた。
【図１５】 HyBeacon PCR bufferの作製-BSAの影響。標的増幅をモニターするためにNAT2 *5A HyBeacon（NAT2*5）を使用した一連のPCRバッファーに由来するリアルタイムPCRデータおよび増幅後融解の結果を示す。以下のBSA濃度の範囲で、HyBeacon解析のためにデザインしたPCRバッファーに添加した：1）Ong/μl、2）1ng/μl、3）2.5ng/μl、4）5ng/μl、5）7.5ng/μlおよび6）10ng/μl。また、TaKaRa Z-Taq PCRバッファー(7)を比較にして分析した。2.5ng/μlより高濃度のBSAによって、リアルタイム解析における標的の増幅および検出の効率が増強され、その結果、この場合では蛍光増加の大きさがTaKaRa bufferより優れている。HyBeacon解析に由来する融解ピークの質は、低濃度のBSAよりも優れている。より高濃度のBSAでは、ピークに「肩部」を生じて、ピーク幅を増加し、融解の質を減少させる。リアルタイム解析および増幅後解析における最適なBSA濃度は、2.5ng/μl〜5ng/μlの間のようである。
【図１６】 SNP判別の効率およびアンプリコン大きさ。標的アンプリコンの大きさおよび位置は、均一および不均一HyBeaconSNPアッセイの効率に対し有意な影響を及ぼすことが示されている。大きさが22bp異なるNAT2 *4産物（*6 SNPの側面に位置する）を増幅する2種のプライマーセットを、不均一融解曲線解析実験において比較した。a)TaqFおよびTaqRプライマーから増幅された103bpのNAT2産物は、F17836 HyBeaconを含む不均一アッセイにおいて融解ピークを生じない。b)しかし、TaqF2およびTaqR2プライマーから増幅された81bpのNAT2 *4産物では、F17836プローブにマッチおよびミスマッチの融解曲線を生じる。103bpおよび81bpサンプルがどちらもアガロースゲルにおいて検出されたことから、アンプリコン間の相違は、プローブ・ハイブリダイゼーションの差異によるためであり、増幅効率が相違するためではないことが確認された。
【図１７】 非対称標的増幅を使用したSNP判別。HyBeaconを介した標的検出およびSNP判別の効率を、対称および非対称PCRアッセイ・フォーマットにおいて比較した。
両タイプのPCR増幅では、マッチ標的の存在下においてのみ蛍光シグナルの増加を生じる。8つのHyBeaconsを比較し;そのうちの4つは、対称および非対称増幅法（示されないデータ）間で同等の効率を示した（データは示さず）。a)F17836 HyBeaconプローブは、非対称アッセイにおいて使用したときに検出効率が有意に減少した。b)一方、その他の三つのHyBeaconsでは、対称増幅（2D64Bプローブによって示したもの）と比較して、非対称増幅によってより大量の蛍光の増加を示した。
【図１８】 ハイブリダイゼーション・ビーコンおよびDASH instrumentを使用したSNP判別。NAT2 *4対立遺伝子の*5A多型に完全に相補的なハイブリダイゼーション・ビーコンF17832を、固相に固定化された*4および*5A多型標的の判別に使用した。該ハイブリダイゼーション・ビーコンは、*4および*5A配列にハイブリダイズしたときに、それぞれ完全に相補的およびミスマッチである。マッチおよびミスマッチのハイブリダイゼーションは、それぞれ約66℃および60℃のTmsをもつ融解曲線を生じる。ハイブリダイゼーション・ビーコンのマッチおよびミスマッチの領域を確立することにより、DASHソフトウェアを使用してサンプルを自動分類することが可能になる。
【図１９】 5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性を欠いたDNAポリメラーゼを使用したSNP判別。NAT2 *4および*5A対立遺伝子を、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性をもつ（Taq）、および欠いている（Deep VentおよびStoffel fragment）DNAポリメラーゼで増幅して、蛍光発光の増加を生じるためにF HyBeaconプローブの消化が必要とされるかどうかを調査した。F HyBeacon 0203002を、増幅を検出してSNPsを識別するために使用した。a)Taq(1)とDeep Vent(2)ポリメラーゼによる完全に相補的な*4配列の増幅の比較。どちらのポリメラーゼも、マッチテンプレートの場合に「リアルタイム」に蛍光発光の増加を生じるが、一方ミスマッチ*5Aテンプレートを含む反応では、蛍光発光の増加を生じない(3)。b)Taq(1)とStoffel fragment(2)ポリメラーゼによる完全に相補的な*4対立遺伝子増幅の比較。どちらのポリメラーゼも、マッチする*4テンプレートの存在下で「リアルタイム」に蛍光発光の増加を生じるが、ミスマッチする*5A対立遺伝子を含む反応では蛍光発光の増加を生じない(3)。
【図２０】 HyBeaconプローブを使用した「リアルタイム」定量的PCR。a)「リアルタイム」均一アッセイを、CYP2D6配列の増幅をモニターするために2D64B HyBeaconを使用して行った。既知のDNA濃度範囲：1)41.5×109 アトグラム／マイクロリットル（ag/μl）2）41.5×108ag/μl、3）41.5×107ag/μl、4）41.5×106ag/μl、5）41.5×1085ag/μl、6）41.5×104ag/μl、7）41.5×103ag/μl、8）41.5×102ag/μlおよび9）415ag/μlを分析した。各DNA濃度において横断点を測定した。b)横断点に対して対数DNA濃度をプロットすることによって標準曲線を構築した。「未知」の反応サンプルに存在するDNA濃度を定量するために標準曲線を使用した。
【図２１】 均一リアルタイム唾液解析。NAT2 *4および*5C多型標的の検出並びに判別は、リアルタイムPCRおよび融解解析方法によって行った。NAT2遺伝子の*5C対立遺伝子に完全に相補的なDdeFL1 HyBeaconを、3つの唾液サンプル（1、2および5）の遺伝子型決定に使用した。また、テンプレート・コントロール反応(C)は、本解析には含まなかった。a)蛍光性シグナルの増加は、均一PCR反応において*5C対立遺伝子が存在する場合にのみ生じる。したがって、*5C対立遺伝子に対してホモ接合性およびヘテロ接合性である反応（すなわちそれぞれサンプル1および5）では、蛍光性シグナルの有意な増加を生じるが、一方、*4対立遺伝子に対してホモ接合性の反応（サンプル2）では、蛍光性シグナルに増加を生じない。*5Cおよび*4対立遺伝子をもつヘテロ接合性のサンプルでは、増幅の間に発光されるべき蛍光の中間量が生じる。b)DdeFL1プローブでは、ホモ接合性*4および*5C DNAにそれぞれハイブリダイズしたときに、47.6℃および54.1℃のTmsをもつ単一の融解ピークを生じる。ヘテロ接合性サンプルでは、どちらも47.6℃および54.1℃の融解ピークをもつトレースを生じる一方、標的DNAを欠いた反応では、いずれのピークも生じない。
【図２２】 増幅した唾液DNAのHyBeacon融解ピーク解析。NAT2遺伝子の*4対立遺伝子に完全に相補的なDdeFL1*4 HyBeaconを、*5C多型に関する唾液サンプルの遺伝子型の決定に使用した。a)HyBeaconのハイブリダイゼーションによって、42.6℃のTmをもつ単一のミスマッチ融解ピークを生じるため、唾液サンプル1は、*5C対立遺伝子に対してホモ接合性である。b)融解解析の際に2つのピークが生じるので、唾液サンプル3は、*5Cおよび*4対立遺伝子に対してヘテロ接合性である。c)プローブ・ハイブリダイゼーションによって、52.6℃のTmをもつ単一のマッチする融解ピークが生じるので、唾液サンプル2は、*4対立遺伝子に対してホモ接合性である。
【図２３】 RFLP唾液解析。制限断片長多型性解析を、唾液サンプルから増幅したNAT2 *4および*5C PCR産物に対して行った。レーンMは、1Obpラダー（GIBCO BRL）である。限定酵素消化により、サンプル1-3はそれぞれ*5C/*5C、*4/*4および*4/*5Cとして分類することができる。
Claims (17)
- ヒトＤＮＡにおける多型を検出するためのハイブリダイゼーション・ビーコンの使用であって、
ハイブリダイゼーション・ビーコンがオリゴヌクレオチドであり、
（ａ）前記オリゴヌクレオチドは、もう１つのものとハイブリダイズする当該オリゴヌクレオチドの１つの領域から生じる二次構造をもたず、（ｂ）前記オリゴヌクレオチドは、その少なくとも１つがフルオレッセインに基づくレポーターでラベルされたヌクレオチド残基で形成され、ここにおいて、当該ビーコンは結合されたクエンチャーを含まず、（ｃ）前記各レポーターでラベルされたヌクレオチド残基は、前記オリゴヌクレオチド配列の内部に位置し、（ｄ）前記オリゴヌクレオチドは、既知の標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的であり、および（ｅ）当該オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＣＲ増幅中の鎖伸長を妨げるようにその３’末端が修飾されている
ハイブリダイゼーション・ビーコンの使用。 - 請求項1に記載のハイブリダイゼーション・ビーコンの使用であって、前記標的ポリヌクレオチドが、既知の多型または変異を含むハイブリダイゼーション・ビーコンの使用。
- 請求項2に記載のハイブリダイゼーション・ビーコンの使用であって、前記多型が、点変異または一塩基挿入もしくは欠失であるハイブリダイゼーション・ビーコンの使用。
- 請求項2または3に記載のハイブリダイゼーション・ビーコンの使用であって、前記既知の多型が、前記ハイブリダイゼーション・ビーコン分子の中心近くに位置するヌクレオチド残基に対して相補的であるハイブリダイゼーション・ビーコンの使用。
- 既知のまたは疑わしい多型を任意に含むポリヌクレオチド標的を調査する方法であって、
（i）（ａ）前記オリゴヌクレオチドは、もう一つのものとハイブリダイズする当該オリゴヌクレオチドの１つの領域から生じる二次構造をもたず、（ｂ）前記ヌクレオチドが、その少なくとも１つがフルオレッセインに基づくレポーターでラベルされたヌクレオチド残基で形成されたオリゴヌクレオチドであり、ここにおいて、当該ビーコンは結合されたクエンチャーを含まず、（ｃ）前記各レポーターでラベルされたヌクレオチド残基は、前記オリゴヌクレオチド配列の内部に位置し、（ｄ）前記オリゴヌクレオチドは、当該標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的であり、および（ｅ）当該オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＣＲ増幅中の鎖伸長を妨げるようにその３’末端が修飾されているオリゴヌクレオチドであるハイブリダイゼーション・ビーコンを提供すること；
（ii）前記標的ポリヌクレオチドを前記ハイブリダイゼーション・ビーコンとインキュベートして、ハイブリッドを形成すること、ここで、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、前記ハイブリッドが形成されたときに、一本鎖形態のときよりも高レベルのシグナルを示す；および
（iii）当該ハイブリッドの融解温度を包含する温度の範囲に亘り、または当該標的ポリヌクレオチドの異なる各対立遺伝子と形成された当該ハイブリッドの融解温度の中間の温度である予め決定された温度で、ハイブリダイゼーション・ビーコンのシグナルのレベルを観測すること；
を含む方法。 - 請求項5に記載の方法であって、前記方法は、サンプル中に存在する標的配列の存在または量を、検出、同定または定量化するために使用される方法。
- 請求項5または6に記載の方法であって、前記標的ポリヌクレオチドが多型であり、および前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、前記標的ポリヌクレオチドの１つの対立遺伝子に相補的な配列を有する方法。
- 請求項7に記載の方法であって、2以上の異なるハイブリダイゼーション・ビーコンのそれぞれが、前記標的ポリヌクレオチドの異なる対立遺伝子に相補的な配列を有して提供される方法。
- 請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法であって、前記観測は、温度変化とシグナルレベルの変化の割合からなされる方法。
- 請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法であって、前記標的ポリヌクレオチドは、PCRアンプリマーである方法。
- 請求項10に記載の方法であって、前記標的ポリヌクレオチドの増幅が、当該ハイブリダイゼーション・ビーコンの存在において行われる方法。
- 請求項11に記載の方法であって、ポリヌクレオチドの増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換増幅（SDA）、転写媒介増幅（TMA）、ローリングサークル増幅（RCA）または核酸配列塩基増幅（NASBA）によって行われる方法。
- 請求項11または12に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンの前記シグナルの観測は、前記標的ポリヌクレオチドの増幅中になされる方法。
- 請求項5〜13のいずれか一項に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンが、事前にDNA抽出をせずに、サンプルから増幅された標的を検出および判別するために使用される方法。
- 請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法であって、前記PCR反応は、非対称増幅である方法。
- 請求項5〜15のいずれか一項に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション・ビーコン、前記標的配列または両方が、支持体に固定化されている方法。
- ホモ接合性およびヘテロ接合性標的ポリヌクレオチド間を区別することにおいて使用される請求項5〜16のいずれか一項に記載の方法。
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