PT1715063E - Farol de hibridização e método para a detecção e discriminação rápida de sequência - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

FAROL DE HIBRIDIZAÇÃO E MÉTODO PARA A DETECÇÃO E DISCRIMINAÇÃO RÁPIDA DE SEQUÊNCIA

Introdução

Foram descritas imensas técnicas para a detecção de sequências de ADN especificas e identificação de polimorfismos nucleotidicos singulares. Vários destes métodos de detecção utilizam a hibridação de sondas com marcadores fluorescentes e têm base na transferência de energia entre porções dadora e aceitadora. Esta invenção realiza um sistema de detecção por sonda de hibridação fluorescente novo e simples que não depende na estrutura secundária da sonda ou de acção enzimática. A interacção entre estas sondas de hibridação e as suas sequências alvo gera alterações significativas na emissão de fluorescência. As variações no potencial de hibridação permitem a discriminação de alvos polimórficos através da quantidade da emissão fluorescente e da temperatura de fusão dos complexos sonda/alvo.

Os Polimorfismos Nucleotidicos Singulares (SNPs) são a forma mais abundante de variação de sequência no genoma humano, ocorrendo em média a cada mil nucleótidos. Um SNP é um local na sequência de ADN que varia numa única base (substituição, inserção ou deleção) de pessoa para pessoa. Estes SNPs podem afectar directamente caracteristicas fenotipicas, tais como certas doenças, e são correntemente utilizados como marcadores genéticos para identificar particularidades complexas, tais como a resposta a medicação (Farmacogenética). Os SNPs são extremamente úteis como 1 marcadores genéticos uma vez que evoluem lentamente e são facilmente classificados através de diversos métodos. Estão em curso esforços em larga escala no sentido de descobrir novos SNPs, para utilização em estudos de associação que possam permitir a identificação de genes que contribuem para distúrbios genéticos comuns. Além disso, foram desenvolvidas várias técnicas para fazer o rastreio eficiente de SNPs conhecidos com um débito relativamente elevado. Os métodos actuais para a genotipagem de SNPs incluem a análise de polimorfismos em padrões de restrição de produtos da reacção em cadeia da polimerase (utilizando electroforese em gel para a detecção dos fragmentos de restrição), hibridação de oligonucleótidos específicos para um alelo (ASO), sistema de amplificação de mutação refractaria (ARMS), teste de ligação de oligonucleótido (OLA), análise de polimorfismo conformacional do DNA em cadeia simples (SSCP), clivagem química, análise de heterocomplexos, mini-sequenciação e uma variedade de sistemas com base em sondas. Exemplos de tecnologias baseadas em sondas incluem, faróis moleculares, o ensaio de 5'-exonuclease, sondas de hibridação e iniciadores Scorpion. Muitos destes sistemas de sonda baseia-se na transferência de energia entre uma porção dadora (por exemplo um fluoróforo) e uma aceitadora (por exemplo, quencher) . As sondas fluorescentes são tipicamente oligonucleótidos de cadeia simples que apresentam menores quantidades de emissão de fluorescência isolados do que quando hibridados com sequências alço. As estruturas destas sondas conferem uma elevada especificidade, permitindo a identificação de alvos com diferenças tão pequenas como um único nucleótido. A energia absorvida por um fluoróforo pode ser transferida para um quencher e libertada na forma de calor. 0 decaimento 2 do sinal de fluorescência pode ocorrer por mecanismos de Transferência de Energia de Ressonância Electrónica (FRET) ou não-FRET. 0 decaimento da fluorescência por FRET requer uma sobreposição espectral entre o dador e o receptor, em que a eficiência do decaimento está relacionada com a distância entre as duas porções. 0 decaimento não-FRET ocorre através de "contactos" de curto alcance entre fluoróforo e o quencher, não carecendo de sobreposição espectral entre porções. 0 ensaio da 5'-exonuclease (TaqMan™) utiliza o decaimento da fluorescência por FRET para analisar o ADN alvo amplificado pela Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR). As sondas TaqMan são oligonucleótidos que contêm porções fluoróforo e quencher preferentemente localizadas nas terminações 5' e 3'. É emitida muito pouco fluorescência de uma sonda intacta devido a um decaimento de fluorescência intramolecular eficiente. No entanto, durante a amplificação por PCR, a sonda híbrida especificamente com a sua sequência alvo e a actividade exonuclease-5'-3' da polimerase Taq quebra a sonda entre as porções fluoróforo e quencher. A clivagem enzimática das sondas TaqMan™ separa espacialmente os componentes fluoróforo e quencher, causando um aumento significativo na emissão de fluorescência que está correlacionado com a amplificação do alvo. 0 desenho cuidado das sondas TaqMan™ permite a discriminação de alvos polimórficos, nos quais apenas sondas com uma complementaridade perfeita são degradadas de modo a originar aumentos no sinal de fluorescência. Uma vez que as sondas TaqMan™ são digeridas durante a amplificação por PCR em tempo real, as sondas não estão disponíveis para a análise da curva de fusão pós-amplificação. 3

Faróis moleculares são sondas oligonucleotidicas de cadeia simples que não são fluorescentes quando isoladas, mas que se tornam fluorescentes aquando da sua hibridação com sequências alvo. Os faróis moleculares não hibridados formam estruturas semicirculares, possuindo um fluoróforo covalentemente ligado a uma ponta da molécula e um quencher ligado à outra ponta, de modo que a estrutura semicircular do farol coloca a porção do fluoróforo em posição próxima do quencher. Quando os faróis moleculares hibridam com as sequências alvo, as porções fluoróforo e quencher se tornam espacialmente separadas, de modo que o fluoróforo já não está sujeito ao decaimento de fluorescência e o farol molecular fluoresce. Os faróis moleculares podem ser empregues em ensaios de valor final ou de "tempo real" para a detecção de sequência e discriminação de SNPs. A estrutura secundária do farol molecular confere uma elevada especificidade à sonda de hibridação, permitindo a identificação de alvos que diferem de um único nucleótido. No entanto, a interacção intramolecular do farol molecular produz potencialmente uma fonte de competição para a hibridação intermolecular do alvo e, uma vez que o farol molecular é uma sonda interna, deve competir com a cadeia oposta do amplicão para ligação à sequência alvo. A combinação de ambas as formas de competição pode reduzir a eficiência da hibridação do farol molecular a algumas moléculas alvo.

As sondas de hibridação são oligonucleótidos que têm uma única marcação com uma porção fluoróforo. São necessários dois destes oligonucleótidos para cada ensaio de sonda de hibridação, um marcado com um fluoróforo dador e o outro com um fluoróforo receptor. A fluoresceina é geralmente utilizada como dador e Cy5, LC-RED 640 e LC-RED 705 são geralmente 4 utilizados como aceitadores. A excitação do fluoróforo dador produz um espectro de emissão que se sobrepõe com o espectro de absorção do fluoróforo aceitador. Os pares da sonda de hibridação são designados de modo a reconhecer sequências nucleotidicas adjacentes em moléculas alvo. Isoladamente, o oligonucleótido aceitador não é excitado e não gera qualquer sinal de fluorescência. No entanto, durante a hibridação com sequências alvo polinucleotidicas, as sondas dadora e aceitadora aproximam-se significativamente, permitindo a transferência de energia de ressonância de fluorescência do dador para o aceitador. 0 sinal de fluorescência do fluoróforo aceitador é apenas emitido quando ambas as sondas são hibridadas com a molécula alvo. Quando incorporadas em reacções de PCR, a fluorescência da sonda aceitadora é monitorizada uma vez por ciclo de amplificação, de modo a facilitar a medição em tempo real da acumulação do produto, em que a quantidade de fluorescência emitida pelo aceitador é proporcional à quantidade de alvo sintetizada. 0 desenho cuidadoso das sondas e das condições dos ensaios permite a discriminação de alvos proximamente relacionados por PCR em tempo real. Além disso, os pares de sondas de hibridação podem ser empregues para discriminar alelos por análise de picos de fusão e determinação de Tm. As amostras homozigóticas podem ser identificadas através da geração de picos de fusão específicos durante a análise de curvas de fusão e as amostras heterozigóticas podem ser identificadas através da presença de dois picos num único traçado de fusão.

Os ensaios com a 5'-exonuclease, com o farol molecular e com a sonda de hibridação são sistemas bimoleculares que têm sequências da sonda e do alvo localizadas em cadeias de ADN separadas. As sondas Scorpion operam através de ligações 5 unimoleculares, em que as sequências da sonda e do alvo amplificado se localizam na mesma cadeia de ADN. As ligações unimoleculares são cineticamente favorecidas em relação à hibridação bimolecular. As sondas Scorpion compreendem um iniciador ligado a cauda de uma sequência sonda, em que esta está contida numa estrutura secundária semicircular similar à de um farol molecular. De uma forma resumida, os iniciadores Scorpion são não fluorescentes uma vez que as porções fluoróforo e quencher estão próximas. Durante a reacção de PCR, o componente iniciador de Scorpion é prolongada e a sua terminação 3' produz a sequência alvo homóloga necessária à hibridação da sonda. Quando a sequência da sonda Scorpion híbrida com o alvo amplificado as porções fluoróforo e quencher tornam-se espacialmente separadas gerando aumentos significativos no sinal de fluorescência em simultâneo com a amplificação do alvo. 0 desenho cuidado de sondas e de condições de ensaio permite a discriminação de alvos polimórficos, nos quais apenas alvos perfeitamente complementares produzem aumentos no sinal de fluorescência durante a análise por PCR em tempo real.

As sondas TaqMan, os faróis moleculares, as sondas de hibridação e os iniciadores Scorpion utilizam FRET para detectar e discriminar entre sequências polinucleotídicas. No entanto, o sistema alternativo de sonda light-up não necessita de transferência FRET entre as porções dador e aceitador para detectar e discriminar entre sequências de ADN. Estas sondas light-up compreendem um oligonucleótido que reconhece uma dada sequência e um único grupo repórter fluorescente, no qual o repórter é tipicamente um derivado do corante cianina assimétrica laranja de tiazolo. 0 componente corante fluorescente das sondas light-up está ligado à 6 terminação da molécula oligonucleotidica. Quando sondas de cadeia simples emitem quantidades de fluorescência significativamente inferiores do que quando hibridadas com sequências de ácidos nucleicos complementares. Medindo a quantidade de emissão de fluorescência, as sondas light-up podem ser empregues para detectar sequências de ácidos nucleicos e diferenciar entre alvos que diferem de uma única posição.

Foram descritos testes homogéneos, que realizam a amplificação do ADN alvo e a detecção/discriminação de sequência num único tubo, para faróis moleculares, sondas TaqMan (teste da 5' exonuclease), sondas FRET e iniciadores Scorpion. Os métodos homogéneos de análise eliminam a necessidade de se realizar análises a jusante (por exemplo, purificação dos produtos de PCR, digestão enzimática, análise de gel, etc.) para gerar resultados e reduzir o potencial de contaminação cruzada entre reacções. WO 98/26093 (US HEALTH; HAWKIS, MARY) descreve sondas oligonucleotidicas que incorporam um análogo nucleotidico fluorescente na sequência interna do oligonucleótido, sem um quencher associado. No entanto, uma caracteristica essencial das sondas descritas é que o nucleótido fluorescente se encontra localizado na sonda de tal modo que, quando a sonda híbrida ao ácido nucleico alvo, o nucleótido fluorescente está numa estrutura semicircular que não participa em emparelhamento de bases complementares com um nucleótido de um ácido nucleico alvo (ver reivindicação 1 e fórmulas I - V nas páginas 16 - 18=. Preferentemente, a estrutura semicircular é uma inserção na sonda do ácido nucleico que é 7 de outro modo complementar ao ácido nucleico alvo (página 4, linhas 2-5). EP-A-0 710 668 (BECTON DICKINSON CO) refere-se a métodos químicos para a ligação de corantes cianina, tais como o laranja de tiazolo a oligonucleótidos. Nos exemplos apresentados, o corante está exclusivamente ligado ao resíduo da extremidade 5' do oligonucleótido (ver página 3, linhas 23-25; Exemplo 1; página 5, linha 23). É mencionado na linha 25-26 da página 3 que o corante pode também estar ligado a um oligonucleótido na extremidade 3' ou internamente. MURAKAMI A ET AL. (Nucleic Acids Research, vol. 19, no. 15, páginas 4097-4102, 1991) apresenta um método para a detecção de sequências de ácido nucleico utilizando sondas oligonucleotídicas marcadas com fluoresceína e a detecção de alterações na anisotropia da fluorescência devido à formação de híbridos. Em todas as sondas neste estudo, o marcador foi posicionado num grupo fosfato em ponte entre o nucleótido 5' e o nucleótido imediatamente a jusante. BERNARD ET AL. ('Analytical Biochemistry, vol. 255, páginas 101-107, 1998) e NAUCK ET AL. (Clinicai Chemistry, vol. 45, no. 8, 1141-1147, 1999) descrevem sondas de hibridação e transferência de energia de ressonância de fluorescência em que dois fluoróforos são justapostos de tal modo que o fluoróforo dador é então capaz de excitar um fluoróforo aceitador. As sondas de hibridação são descritas acima. A Invenção

Num aspecto, a invenção proporciona um farol de hibridação (HyBeacon) que é um oligonucleótido em que (a) o oligonucleótido não tem estrutura secundária proveniente de uma região do oligonucleótido que híbrida com outra, (b) o oligonucleótido é formado por resíduos nucleotídicos dos quais mais do que um é marcado com um repórter fluorescente em que o farol não inclui um quencher associado e o repórter é seleccionado do grupo de β-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína e hexaclorofluoresceína, (c) os resíduos nucleotídico marcados com o repórter estão posicionados internamente no interior da sequência oligonucleotídica, (d) o oligonucleótido é totalmente complementar a um alelo da ADN genómico humano com um polimorfismo conhecido no local de ligação do oligonucleótido, e (e) a sonda oligonucleotídica é modificada na sua terminação 3' de modo a prevenir a extensão da cadeia durante a amplificação por PCR. Os faróis de hibridação da invenção, que possuem um repórter baseado em fluoresceína sem um quencher associado, são denominados HyBeacons F. Na descrição que se segue, são descritas as propriedades dos F HyBeacons em comparação com as propriedades de faróis de hibridação que possuem tanto uma porção de fluoróforo como uma porção de quencher, denominados HyBeacons F-Q. Os HyBeacons F-Q não fazem parte da invenção presentemente reivindicada. 0 farol de hibridação da invenção é um oligonucleótido linear de cadeia simples que não possui estrutura secundária substancial. A estrutura secundária surge quando uma região de um oligonucleótido híbrida com outra, por exemplo, formando uma estrutura semicircular (tal como em faróis moleculares convencionais) que diminui a eficiência do oligonucleótido que hibrida com o seu alvo complementar. Nos 9

HyBeacons desta invenção não existe qualquer tendência substancial para uma região do oligonucleótido hibridar com outra. 0 comprimento do HyBeacon é tal que é adequado para a hibridação com um alvo polinucleotidico complementar, de modo a proporcionar um hibrido estável cuja temperatura de fusão depende da sequência exacta do alvo. Os oligonucleótidos contendo menos de 15 residuos nucleotidicos não formam em certos casos híbridos suficientemente estáveis, particularmente quando as duas sequências que hibridam não são exactamente complementares. Os oligonucleótidos que têm um comprimento superior a cerca de 30 residuos nucleotidicos formam em certos casos híbridos cuja temperatura de fusão é relativamente insensível à possível presença de uma disparidade de um único nucleótido. Os resíduos nucleotidicos são geralmente derivados dos nucleósidos que ocorrem naturalmente, A, C, G e T. No entanto, podem ser utilizados análogos de nucleótidos em um ou mais locais do farol de hibridação, sendo estes análogos de nucleótidos modificados, por exemplo na porção de base e/ou na porção de açúcar e/ou na ligação trifosfato. Modificações nas bases, tais como propinil dU (análogo dT) e 2-amino da (análogo dA), geralmente alteram as propriedades de hibridação e podem tornar a utilização de oligonucleótidos com menos de 15 ou mais de 30 resíduos nucleotidicos atractiva. Alternativamente, podem ser utilizados os oligonucleótidos compostos por ou compreendendo ácidos nucleicos sintéticos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos fechados (LNA), 2'-0-metil ARN, fosforamidato de ADN, fosforotioato de ADN, metil fosfonato de ADN, fosfotriéster de ADN ou análogos de base de 10 ADN, de modo a formar interacções mais estáveis com as sequências alvo.

Demonstrou-se que tanto os HyBeacons F como os HyBeacons F-Q emitiam quantidades de fluorescência significativamente superiores quando hibridados com sequências de ácido nucleico complementares do que quando na conformação de cadeia simples. Uma descoberta inesperada foi que os HyBeacons F emitem significativamente mais sinal de fluorescência quando em cadeia dupla do que quando no estado de cadeia simples apesar da ausência de um componente quencher.

Trata-se de uma descoberta significativa pois permite o desenho de testes com sondas que não necessitam da associação de sondas aceitadoras ou de transferência de energia entre as sondas tal como necessário com as sondas de hibridação conhecidas. Para os efeitos desta especificação, tais testes são denominados "testes de sonda única".

Os sistemas fluoróforo-quencher estão bem descritos na literatura e não serão mais descritos aqui. A preparação de oligonucleótidos contendo resíduos nucleotídicos marcados com um fluoróforo e resíduos nucleotídicos marcados com um quencher está também bem descrita na literatura. A razão de sinal é a razão entre a intensidade do sinal de um híbrido de cadeia dupla compreendendo um farol de hibridação em relação à intensidade de sinal da sonda de cadeia simples e é preferencialmente o maior possível, por exemplo 3 ou mais. Esta razão de sinal depende de diversos factores. Para HyBeacons F-Q, a taxa de transferência de energia de uma molécula dadora excitada (fluoróforo) para uma molécula 11 aceitadora próxima (quencher) depende, não só a distância entre as duas porções, mas também da sua disposição angular relativa. Os HyBeacons com as porções fluoróforo e quencher separadas por tão poucos como 1 ou 3 resíduos nucleotídicos possuem razões de sinais de fluorescência que são significativamente e utilmente superiores a 1. Os HyBeacons que possuem mais do que 3 nucleótidos a separar o fluoróforo e o quencher apresentem razões de sinal superiores. Para os HyBeacons F-Q, os componentes fluoróforo e quencher estão preferentemente posicionados de tal modo que 5 ou mais resíduos nucleotídicos separam as duas porções. Moléculas dadora e aceitadora separadas por menos o que 5 nucleótidos estabelecem "contacto", permitindo interacções não FRET.

Mostrou-se que os HyBeacons F apresentam razões de sinal comparáveis aos dos HyBeacons F-Q que possuem mais do que 5 nucleótidos a separar os componentes dador e aceitador. As razões de sinal em HyBeacons F são significativamente e utilmente superiores a 1, apesar da ausência de porções quencher. A ausência de moléculas aceitadoras faz como que os HyBeacons F não sejam influenciados por efeitos disposição angular, tais como a distância relativa entre as moléculas fluoróforo e quencher não podem determinar a quantidade de sinal de fluorescência emitido nos estados de cadeia dupla e cadeia simples. Crê-se que as porções de fluoróforo emitem significativamente mais sinal de fluorescência quando as sondas HyBeacon são hibridadas com moléculas alvo do que quando as sondas estão na forma de cadeia simples possivelmente devido a alguma forma de interacção com ADN duplo. 12

Num farol de hibridação de acordo com a invenção, o oligonucleótido tem uma sequência totalmente complementar a um alelo de um alvo polinucleotídico com um polimorfismo conhecido, por exemplo, uma mutação num ponto ou uma inserção ou deleção de uma única base (SNP) . Em HyBeacons F-Q, este SNP do alvo é geralmente complementar ao resíduo nucleotidico do farol de hibridação intermédio entre o resíduo nucleotidico marcado com um fluoróforo e o resíduo marcado como quencher. Para HyBeacons F, o local do polimorfismo está preferentemente, apesar de não essencialmente, localizado em posição central na sonda oligonucleotídica.

Alternativamente, o farol de hibridação pode ser complementar a um alvo polinucleotídico não-polimórfico conhecido e pode simplesmente ser utilizado para detectar esse alvo. Ainda, os faróis de hibridação podem ser utilizados para estudar alvos potencialmente polimórficos com polimorfismos desconhecidos e não caracterizados. A possibilidade é considerada de mapear a posição e/ou natureza de polimorfismos desconhecidos por hibridação diferencial dos faróis e diferenças no pico de fusão a Tm.

Os resíduos nucleotídicos marcados com o fluoróforo são posicionados internamente na sequência oligonucleotídica, em vez de na terminação 5' ou de na terminação 3'. Quando se faz com que o farol de hibridação hibride com um alvo polinucleotídico, todas estas características contribuem para a formação de um híbrido estável com uma temperatura de fusão óptima e uma diferença substancial nas temperaturas de fusão entre cadeias que são perfeitamente complementares e aquelas que têm uma ou várias posições de disparidade (ATm). 13

Pode ser conveniente proporcionar dois ou mais faróis de hibridação, um totalmente complementar a cada alelo do SNP em estudo. Quando cada farol de hibridação tem um fluoróforo diferente, pode ser conveniente misturar as sondas em solução para análise dos alvos homozigóticos e heterozigóticos. Do mesmo modo, uma mistura de faróis de hibridação complementares aos vários alelos de vários SNPs diferentes pode ser utilizada em conjunto numa solução para análise múltipla, desde que cada um esteja marcado com um fluoróforo espectralmente distinto.

Alternativamente, um farol de hibridação desta invenção pode ser apresentado imobilizado ou num suporte. Estão bem descritas na literatura técnicas e agentes de ligação para a imobilização de oligonucleótidos utilizando suportes em formas que os deixam livres para hibridar com alvos complementares em solução. É também incluído no âmbito da invenção uma matriz de sondas de oligonucleótidos imobilizadas em locais espaçados utilizando um suporte, em que as diferentes sondas de oligonucleótidos são diferentes faróis de hibridação de acordo com esta invenção. Além disso, as sondas HyBeacon podem ser empregues para analisar alvos de ADN imobilizados ou num suporte, em que alvos distintos podem ser posicionados em localizações espaçadas em formato do tipo matriz.

Noutro aspecto, esta invenção proporciona um método para investigar um alvo polinucleotídico, o qual compreende: (i) proporcionar um farol de hibridação que é um oligonucleótido no qual (a) o oligonucleótido não tem estrutura secundária proveniente da hibridação de uma 14 região do oligonucleótido com outra, (b) o oligonucleótido é formado por resíduos nucleotídicos dos quais um está marcado com um repórter fluorescente no qual o farol não inclui um quencher associado, e o repórter é escolhido do grupo 6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína e hexaclorofluoresceína, (c) o resíduo nucleotídico repórter marcado está posicionado internamente no interior da sequência oligonucleotídica, (d) o oligonucleótido é totalmente complementar ao alvo polinucleotídico, e (e) a sonda oligonucleotídica é modificada na sua terminação 3' de modo a prevenir a extensão da cadeia durante a amplificação por PCR; (ii) a incubação do alvo polinucleotídico com o farol de hibridação de modo a formar um híbrido, exibindo o farol de hibridação um nível de sinal mais elevado quando na forma de híbrido do que na forma de cadeia simples; e (iii) observação do nível de sinal do farol de hibridação a uma temperatura predeterminada, ou ao longo de uma gama de temperaturas, próxima da temperatura de fusão do híbrido. 0 alvo polinucleotídico pode se AND, ARN ou cADN, e é utilizado na forma de cadeia simples, ou uma cadeia dupla de ADN pode ser sondado de modo a formar um conjunto de três cadeias. 0 alvo polinucleotídico tem um polimorfismo conhecido, preferentemente um SNP. 0 alvo é incubado em condições de hibridação com uma sonda nucleotídica, que pode ser um farol de hibridação tal como aqui descrito. É necessário que o híbrido gere um sinal de fluorescência mais forte do que a sonda oligonucleotídica de cadeia simples. A temperatura de fusão do híbrido dependerá, entre outros factores, em se o alvo polinucleotídico e a sonda 15 oligonucleotídica são totalmente complementares ou se existe uma disparidade ou mesmo disparidade dupla resultante do ou em proximidade em relação ao SNP. 0 método envolve a observação do nível do sinal de fluorescência, emitido pela sonda oligonucleotídica, a uma temperatura predeterminada próxima da temperatura de fusão do híbrido, ou ao longo de uma gama de temperaturas. São descritas duas alternativas, apesar de outras serem possíveis. a) A temperatura de uma solução contendo o híbrido é lentamente aumentada, com observação contínua do sinal de fluorescência, de modo a construir um gráfico da derivada negativa da intensidade de sinal de fluorescência em relação à temperatura (-dF/dT) ao longo da temperatura. A temperatura de fusão (Tm) do híbrido surge como um pico, e proporciona informação acerca da sequência do alvo polinucleotídico. As Tms geradas através da análise de fusão de HyBeacon podem ser utilizados para distinguir entre alvos polimórficos. A gama de temperaturas escolhida abrange geralmente a temperatura de fusão do híbrido. b) Uma solução do híbrido é mantida a uma temperatura predeterminada e o nível de fluorescência é observado. Geralmente, a temperatura predeterminada é escolhida de modo a ser intermédia entre a temperatura de fusão de um híbrido com correspondência perfeita e a temperatura de fusão de um híbrido com uma ou duas disparidades. 0 nível do sinal de fluorescência observado proporciona uma indicação de se ocorreu a fusão do híbrido ou não, e como tal proporciona informação sobre a sequência do alvo polinucleotídico. Os alvos polinucleotídicos podem 16 ser distinguidos nos formatos de valor final e em tempo real ou cinético.

Tipicamente, o farol de hibridação tem uma sequência complementar, tipicamente totalmente complementar, a um alelo do polinucleótido alvo. A utilização de faróis totalmente complementares permite a diferenciação entre a hibridação em que houve correspondência daquela em que há discrepância. Adequadamente, cada um de dois ou mais faróis de hibridação diferentes tem uma sequência complementar, idealmente totalmente complementar, a alelos diferentes do polinucleótido alvo.

Convenientemente, o alvo polinucleotidico pode ser um amplimer de PCR, formado utilizando iniciadores adequados para amplificar uma porção desejada de ADN genómico. Pode ser conveniente realizar a amplificação e a investigação do alvo de um modo homogéneo, por exemplo, num único vaso reaccional através da adição da sonda oligonucleotidica antes, durante, ou depois do procedimento ciclico de amplificação. Pode ser também conveniente realizar amplificação do alvo e investigação da sequência directamente a partir de amostras, tais como saliva, sem extracção prévia de ADN, ARN ou cADN. A sonda oligonucleotidica é modificada na sua terminação 3' de modo a prevenir a extensão da cadeia durante a amplificação por PCR.

As temperaturas de fusão dos faróis de hibridação podem ser utilizadas para identificar polinucleótidos alvo polimórficos. Os faróis de hibridação da invenção podem também ser utilizados para identificar ADN homozigótico ou heterozigótico utilizando uma única sonda. 17

Os seguintes exemplos descrevem faróis de hibridação que incluem um único residuo nucleotidico marcado com um repórter, no entanto, a presente invenção refere-se a faróis de hibridação em que mais do que um residuo nucleotidico é marcado com um repórter. FIGURA 1: Hibridação HyBeacon Diferencial. Ilustra a diferença entre interacções totalmente correspondentes, com uma discrepância ou com duas discrepâncias, em que as estrelas representam polimorfismos nucleotidicos singulares (SNPs). As interacções do Tipo A envolvem uma molécula HyBeacon desenhada de modo a corresponder exactamente ao alvo original ou um alelo de um SNP. As interacções do Tipo B envolvem uma molécula HyBeacon desenhada para ser perfeitamente correspondente a um alvo mutante ou o alelo alternado do SNP. Quando se consideram dois SNPs independentes, os faróis hibridados com a molécula alvo podem ter ou (i) uma correspondência perfeita, (ii) possuir uma discrepância de uma única base ou (iii) possuir discrepâncias de múltiplas bases. FIGURA 2: Discriminação de SNPs utilizando a quantidade de fluorescência. 0 HyBeacon B9414 foi hibridado a oligonucleótidos com correspondência perfeita (i) e oligonucleótidos com uma discrepância de uma única base (ii) e foi também estudado na ausência de alvo (iii) . a) Perfis de fusão derivados do HyBeacon B94141. A temperaturas abaixo de 42°C e acima de 52°C, a quantidade de fluorescência emitida pela sonda hibridada a alvos com ou sem correspondência total é muito semelhante. No entanto, entre estas temperaturas, a quantidade de fluorescência emitida por uma sonda totalmente complementar é significativamente superior do que a emissão 18 de fluorescência do HyBeacon com discrepâncias, b) As misturas reaccionais foram desnaturadas e rapidamente arrefecias a 46°C para aquisição de fluorescência. Observa-se a formação significativa de agrupamentos entre tratamentos e diferenças estatísticas entre tratamentos, tais como uma sonda que hibride com um alvo correspondente emite significativamente mais fluorescência do que um HyBeacon que hibride com um alvo com discrepância, o qual por seu turno emite mais fluorescência do que um farol e hibridação na ausência de alvo. c) HyBeacon na ausência de alvo não gera picos de fusão. 0 B91414 produz curvas de fusão possuindo Tms de aproximadamente 52 °C e 44°C na presença de alvos com correspondência total ou com discrepâncias, respectivamente, permitindo a discriminação fiável de SNPs. FIGURA 3: Comparação de sondas Hybeacon F e FQ. As sondas de hibridação NÃT2 F17834 (F—Q) e 0203002 (F) foram hibridadas a um oligonucleótido com correspondência perfeita. Os HyBeacon F e F-Q possuem uma sequência oligonucleotídica idêntica e geram picos de elevada qualidade com Tms de aproximadamente 60°C nas análises de fusão. Devido à ausência de uma porção quencher, os HyBeacons F emitem uma fluorescência ruído superior à das sondas F-Q. FIGRA 4: Análise de fusão de polimorfismos InDel. A sonda TB0993 NAT2 *4 foi hibridada com uma série de alvos oligonucleotídicos de modo a determinar se os faróis de hibridação têm o potencial de discriminar polimorfismos de inserção e de deleção. Foram comparados um alvo com correspondência total (M), 3 oligonucleótidos contendo inserções de um único oligonucleótido (1-3) e 3 oligonucleótidos contendo deleções de um único 19 oligonucleótido (4-6). Realizou-se análise de fusão para cada conjunto HyBeacon/alvo. Em todos os casos, a sonda com correspondência total gerou curvas de fusão com Tms superiores do que as reacções InDel com discrepâncias, de tal modo que os SNPs podem ser discriminados com base no pico de fusão Tm. a) Oligonucleótidos com Inserção. b) Oligonucleótidos com deleção. c) Demonstra que os SNPs podem também ser discriminados na base da quantidade de emissão de fluorescência, em que o farol com correspondência total emite mais fluorescência do que a hibridação com todas as discrepâncias InDel. FIGURA 5: Discriminação de SNPs num formato heterogéneo.

Utilizaram-se sondas HyBeacon F e F-Q para discriminar entre alvos contendo o polimorfismo CYP2D6 *3, em que os alvos de ADN empregues foram produtos de PCR de 119 pb isolados. As sondas F (2D63B) e F-Q (2D63A) têm sequências nucleotidicas idênticas, tendo uma correspondência perfeita com o alelo *1 do gene CYP2D6 e possuem uma discrepância de uma única base quando hibridadas com o alelo 3*. a) A sonda F-Q 2D63A gera picos de fusão com Tms de aproximadamente 65°C e 56°C quando hibridados a alvos com correspondência total ou com discrepâncias, respectivamente. b) 0 HyBeacon F 2D63B produz picos de fusão com Tms de aproximadamente 65°C e 58°C quando hibridados aos alvos de PCR *1 e *3, respectivamente. FIGURA 6: Detecção homogénea de sequências de ADN. A detecção da sequência CYP2D6*1 em amostras de ADN genómico (1) e de saliva (2) utilizando a sonda HyBeacon 2D64C* para monitorizar a acumulação em tempo real do produto do PCR. A quantidade de fluorescência emitida das sondas HyBeacon correlaciona-se com a amplificação de sequências alvo 20 específicas. As reacções controlo (3) que não contêm cadeias molde de ADN ou produto amplificado também não apresentam níveis elevados de emissão de fluorescência durante o PCR.

FIGURA 7: Discriminação de SNPs num formato homogéneo. A sonda HyBeacon F 0203002, que corresponde perfeitamente com a sequência NAT2 *4, foi utilizada para discriminar SNPs *4 e *5A em testes homogéneos LightCycler. a) fez-se a discriminação fiável de SNPs através de amplificação por PCR em "tempo-real", na qual apenas as reacções contendo o molde totalmente correspondente *4 produziram aumentos significativos na emissão de fluorescência, b) os SNPs foram também discriminados pós-amplificação através de análise de fusão, na qual os alelos *4 com total correspondência geraram picos de fusão com Tms significativamente mais elevadas do que as sequências alvo com discrepâncias *5a. A análise final dos produtos amplificados permite a validação dos dados em "tempo-real". FIGURA 8: Discriminação em tempo real do polimorfismo CY2D6*4: 0 HyBeacon 2D64C* foi utilizado para detectar e discriminar os alelos *1 e *4 do gene CYP2D6. As sequências polimórficas foram amplificadas de plasmídeos pGEM-T contendo o alelo *1 (1), e o alelo *4 (2). Uma mistura dos dois plasmídeos *1 e *4 foi empregue para simular ADN heterozigótico (3) . Foram também incluídas na análise reacções de controlo sem cadeia molde (C) . Apenas as reacções que contêm o alelo *1 (ou seja, amostras 1 & 3) geram aumentos na emissão de fluorescência durante a amplificação por PCR em tempo real. As amostras *4 homozigóticas e os controlos sem cadeia molde não produzem sinais de fluorescência elevados. Amostras que são heterozigóticas para 21 os alelos *1 e *4 causam quantidades intermédias de fluorescência geradas durante a amplificação. FIGURA 9: Discriminação de alelos CYP2D6 *1 e *4 por análise do pico de fusão: Amplificaram-se alvos polimórficos a partir de amostras de ADN genómico e os picos de fusão aqui apresentados foram derivados de análise pós-amplificação das amostras 1 (homozigótico *4), 2 (homozigótico *1) e 3 (ADN heterozigótico). 0 HyBeacon 2D64C* é totalmente complementar ao alelo *1 do gene CYP2D6 e gera picos de fusão únicos que possuem Tms de 49°C e 60°C com amostras homozigóticas *4/*4 e *1/*1, respectivamente. As amostras heterozigóticas que possuem ambos os alelos *4 e *1, geram vestígios possuindo picos de fusão a 49°C e a 60°C. FIGURA 10: Identificação de heterozigocidade utilizando HyBeacons F-Q. Foram necessários dois HyBeacons F-Q, perfeitamente correspondentes a ambos os alelos de um SNP para distinguir amostras homozigóticas (contendo apenas um alelo de um polimorfismo) de amostras heterozigóticas (contendo ambos os alelos). Os HyBeacons F17834 e F17835 têm uma correspondência perfeita com os alelos *4 e *5A do gene NAT2, respectivamente. F17834 e F17835 possuem Tms suficientemente diferentes para distinguir as duas sondas marcadas com FAM. a) F17834 origina picos de fusão possuindo Tms de aproximadamente 60°C e 54°C na presença de alelos homozigóticos *4 e *5A, respectivamente. b) F17835 gera picos de fusão que possuem Tms de aproximadamente 52°C e 49°C na presença de alelos homozigóticos *5A e *4, respectivamente. c) Reacções contendo HyBeacons F17834 ou F17835 produzem apenas picos de fusão de correspondência na presença de ADN heterozigótico. As reacções que contêm ambas as sondas 22 produzem traçados de fusão possuindo Tms de aproximadamente 59°C e 52°C na presença de uma mistura de alelos *4 e *5A. A presença de dois picos no interior de um único traçado de fusão permite a identificação de amostras heterozigóticas. FIGURA 11: Análise de heterozigocidade utilizando um HyBeacon F: 0 HyBeacon DdeFLl, que tem uma correspondência perfeita com a sequência polimórfica NAT2 *5C, foi utilizado para testar o potencial dos HyBeacons na discriminação de amostras heterozigóticas. a) Amostras homozigóticas analisadas com DdeFLl geram traçados de fusão que possuem um único pico. A sonda DdeFLl foi hibridada com alvos de PCR homozigóticos *5C e *4, em testes heterogéneos, gerando curvas de fusão de 54°C e 47°C, respectivamente. b) Reacções contendo o HyBeacon DdeFLl e uma mistura de alvos com correspondência perfeita ou com discrepâncias originam curvas possuindo ambas os picos a 54°C e a 47°C no mesmo traçado de fusão. A presença de dois picos no traçado de fusão permite a identificação de amostras heterozigóticas. FIGURA 12: As limitações da análise múltipla por HyBeacon. De modo a se examinar o potencial de HyBeacon para análise múltipla, a sonda HyBeacon 2D64B foi incluida em reacções contendo tanto cadeias molde de PCR especificas como não especificas. As cadeias molde de PCR compreendiam uma mistura de ADN especifico (CYP2D6) e não especifico {NAT2), de tal modo que a proporção de molde especifico foi variada entre 100% e 5%. a) As reacções continham iniciadores CYP2D6 mas não tinham iniciadores NAT2, de modo que apenas foram produzidos alvos específicos. Foi observada uma pequena variação no ponto de cruzamento à medida que a concentração do alvo específico era reduzida. No entanto, as eficiências 23 de amplificação e de detecção foram comparáveis entre reacções. b) As reacções continham iniciadores CYP2D6 e NAT2, de modo que fossem produzidos alvos específicos e não-específicos. Observaram-se reduções significativas nas eficiências de amplificação e de detecção à medida que a proporção de alvo específico foi reduzida. No entanto, os resultados sugerem que podem ser possíveis reacções múltiplas contendo até 4 ou 5 alvos.

FIGURE 13: Análise múltipla por HyBeacon. a) Alvos NAT2 *4 e CYP2D6 *1 foram simultaneamente amplificados e detectados numa única placa de microtitulação utilizando sondas marcadas, respectivamente, com FAM (BamFLl) e HEX (2D64E) . Apenas as reacções contendo ADN genómico e sequências totalmente complementares às sondas HyBeacon apresentaram níveis elevados de emissão de fluorescência ao longo da amplificação. Reacções de controlo negativo não geraram aumentos na emissão de fluorescência. b) Os picos de fusão foram produzidos com sondas marcadas com FAM, HEX e TET utilizando o instrumento ABI PRISM 7700 e um macro de Excel. Os picos de fusão aqui apresentados foram obtidos a partir da hibridação da sonda a oligonucleótidos complementares. FIGURA 14: O efeito da concentração de MgCl2 na Tm de

HyBeacon. O farol de hibridação F17834 foi hibridado a um oligonucleótido totalmente complementar numa série de concentrações de MgCl2, variando desde 0 mM a 50 mM. Demonstrou-se que a Tm do farol de hibridação aumenta à medida que aumenta a concentração de MgCl2. a) ilustra as curvas de fusão do farol de hibridação originadas durante as reacções contendo: 0 mM, 0,001 mM, 0, 005 mM, 0,01 mM, 0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 24 0,8 mM, 0,9 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM e 50 mM MgCl2 (respectivamente, da esquerda para a direita). b) Demonstra a correlação positiva que existe entre a concentração de MgCl2 e a Tm de HyBeacon. Quando a Tm do farol de hibridação é representada como função do logaritmo da concentração de MgCl2, observa-se uma relação linear no interior de uma gama de concentrações definida (neste caso, entre 0,1 mM e 10 mM) . A análise de regressão linear realizada neste conjunto de dados gerou um valor de R2 de 99,4%.

Figura 15: Produção de um tampão para PCR com HyBeacon - O efeito da BSA. Apresenta os dados de PCR em tempo real e os resultados de fusão pós-amplificação de uma série de tampões para PCR, utilizando o HyBeacon NAT2 *5A (NAT2*5) para monitorizar a amplificação do alvo. Adicionou-se uma gama de concentrações de BSA a um tampão para PCR desenhado para análise por HyBeacon: 1) 0 ng/pL, 2) 1 ng/pL, 3) 2,5 ng/pL, 4) 5 ng/pL, 5) 7,5 ng/pL e 6) 10 ng/pl. Também foi analisado o tampão de PCR TaKaRa Z-Taq (7) para comparação. As concentrações de BSA superiores a 2,5 ng/pL aumentam a eficiência da amplificação do alvo e a detecção em análise em tempo real, de tal modo que a magnitude do aumento da fluorescência é neste caso superior ao tampão TaKaRa. A qualidade dos picos de fusão derivados da análise por HyBeacon é superior a baixas concentrações de BSA. As concentrações mais elevadas de BSA diminuem a qualidade de fusão através da produção de "cotovelos" nos picos e do aumento da largura dos picos. A concentração óptima de BSA em análises em tempo real e pós-amplificação parece ser entre 2,5 ng/pL e 5 ng/pL. 25 FIGURA 16: Eficiência da discriminação de SNP e dimensão do amplicon. Demonstrou-se que a dimensão e a posição dos amplicons alvo têm efeitos significativos na eficiência de testes de SNP homogéneos e heterogéneos com HyBeacon. Compararam-se dois conjuntos de iniciadores, produtos de amplificação de NAT2 *4 (que flanqueiam o SNP *6) com uma diferença de tamanho de 22 pb, em experiências heterogéneas de análise de curvas de fusão, a) 0 produto NAT2 de 103 pb, amplificado dos iniciadores TqF e TaqR, não gera quaisquer picos de fusão em ensaios heterogéneos contendo o HyBeacon F17836. b) No entanto, o produto NAT2 *4 de 81 pb, amplificado dos iniciadores TaqF2 e TaqR2, gera curvas de fusão com correspondência total ou com discrepâncias com a sonda F17836. As amostras de 103 pb e de 81 pb foram ambas detectadas em geles de agarose, confirmando que a diferença entre os amplicons é devida a variações na hibridação da sonda e não em diferenças na eficiência de amplificação. FIGURA 17: Discriminação de SNP utilizando amplificação assimétrica do alvo. As eficiências da detecção de alvos mediada por HyBeacon e da discriminação de SNP foram comparadas em testes de PCR com formato simétrico e assimétrico. Ambos os tipos de amplificação de PCR apenas provocam aumentos no sinal de fluorescência na presença de um alvo com total correspondência. Foram comparados oito HyBeacons; quatro dos quais apresentavam eficiências equivalentes entre métodos de amplificação simétricos e assimétricos (dados não ilustrados), a) A sonda HyBeacon F17836 apresentou uma eficiência de detecção significativamente reduzida quando utilizada em testes assimétricos, b) Enquanto três outros HyBeacons apresentaram quantidades superiores de aumento de fluorescência por 26 amplificação assimétrica quando comparados com aquelas geradas por amplificação simétrica (tal como demonstrado pela sonda 2D64B). FIGURA 18: Discriminação de SNP utilizando faróis de amplificação e o instrumento DASH. 0 farol de amplificação F17832, o qual é totalmente complementar ao alelo NAT2 *4 do polimorfismo *5A, foi utilizado para discriminar alvos polimórficos *4 e *5A imobilizados numa fase sólida. 0 farol de hibridação é, respectivamente, totalmente complementar e tem discrepâncias quando hibridado com as sequências *4 e *5A. A hibridação com correspondência total e com discrepâncias gera curvas de fusão possuindo Tms, respectivamente, de aproximadamente 66°C e 60°C. 0 estabelecimento de zonas de correspondência total e de discrepância para o farol de hibridação permite a classificação automática das amostras utilizando o programa informático DASH. FIGURA 19: Discriminação de SNP utilizando polimerases de ADN sem actividade de exonuclease 5'-3'. Amplificaram-se alelos NAT2 *4 e *5A com ADN polimerases que possuem (Taq) actividade de exonuclease 5'-3' ou não (fragmento Deep Vent e Stoffel), de modo a examinar se é necessária a digestão da sonda HyBeacon F para provocar aumentos na emissão de fluorescência. 0 HyBeacon F 0203002 foi utilizado para detectar a amplificação e discriminar SNPs. a) Comparação das polimerases Taq (1) e Deep Vent (2) na amplificação da sequência *4 totalmente complementar. Ambas as polimerases originam aumentos da emissão de fluorescência em "tempo-real" com a cadeia molde complementar enquanto que as reacções contendo a cadeia molde *5A com discrepâncias não produzem 27 aumentos na emissão de fluorescência (3) . b) Comparação das polimerases Taq (1) e fragmento Stoffel (2) na amplificação do alelo *4 totalmente complementar. Ambas as polimerases originam aumentos da emissão de fluorescência em "tempo-real" com a cadeia molde complementar *4, mas as reacções contendo apenas o alelo *5A com discrepâncias não produz aumentos na emissão de fluorescência (3). FIGURA 20: PCR quantitativo em "tempo real" utilizando uma sonda HyBeacon. a) Foram realizados testes homogéneos em "tempo real" utilizando o HyBeacon 2D64B para monitorizar a amplificação de uma sequência CYP2D6. Foi analisada uma gama de concentrações de ADN conhecidas: 1) 41,5 x 109 atogramas por microlitro (ag/pL), 2) 41,5 x 108 ag/pL, 3) 41,5 x 107 ag/pL, 4) 41,5 x 106 ag/pL, 5) 41,5 x 105 ag/pL, 6) 41,5 x 104 ag/pL, 7) 41,5 x 103 ag/pL, 8) 41,5 x 102 ag/pL e 9) 415 ag/pL). Foram medidos os pontos de cruzamento para cada concentração de ADN. b) Foram construídas curvas padrão através da representação do logaritmo da concentração de ADN em relação ao ponto de cruzamento. As curvas padrão foram utilizadas para quantificar as concentrações de ADN presentes em amostras reaccionais "desconhecidas". FIGURA 21: Análise à saliva em teste em tempo real homogéneo:

Realizou-se a detecção e a discriminação dos alvos polimórficos NAT2 *4 e *5C por PCR em tempo real e através de metodologias de análise de fusão. O HyBeacon DdeFLl, que é totalmente complementar ao alelo *5C do gene NAT2, foi utilizado para genotipar três amostras de saliva (1, 2 & 5) . Foi também incluída uma reacção controlo sem cadeia molde (C) na análise, a) São apenas gerados aumentos no sinal de fluorescência em reacções de PCR homogéneas na presença do 28 alelo *5C. Deste modo, reacções que são homozigóticas e heterozigóticas para o alelo *5C (ou seja, respectivamente, amostras 1 e 5) geram aumentos significativos no sinal de fluorescência, enquanto que reacções homozigóticas para o alelo *4 (amostra 2) não produzem aumentos no sinal de fluorescência. Amostras heterozigóticas, possuindo tanto os alelos *5C e *4, causam a produção de quantidades intermediárias de fluorescência durante a amplificação, b) A sonda DdeFLl origina picos de fusão isolados, possuindo Tms de 47,6°C e 54,1°C, respectivamente quando hibridadas com ADN *4 e *5C homozigótico. As amostras heterozigóticas originam traçados possuindo ambos os picos de fusão a 47,6°C e a 54,1°C, enquanto que reacções que não possuem ADN alvo não geram qualquer dos picos. FIGURA 22: Análise de picos de fusão com HyBeacon de ADN de saliva amplificado. 0 HyBeacon DdeFLl*4, que é totalmente complementar ao alelo *4 do gene NAT2, foi utilizado para genotipar amostras de saliva respeitantes ao polimorfismo *5C. a) A amostra de saliva 1 é homozigótica para o alelo *5C uma vez que a hibridação HyBeacon resulta num único pico de fusão com discrepância possuindo uma Tm de 42,6°C. b) A amostra de saliva 3 é heterozigótica para os alelos *5C e *4 uma vez que são gerados dois picos durante a análise de fusão, c) A amostra de saliva 2 é homozigótica para o alelo *4 uma vez que a sonda de hibridação produz um único pico de fusão com correspondência total possuindo uma Tm de 52,6°C.

FIGURA 23: Análise à saliva por RFLP. Realizou-se uma análise de Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição para produtos de PCR NAT2 *4 e *5C amplificados a partir de amostras de saliva. A pista M é uma escala de 10 pb (GIBCO 29 BRL) . A digestão por enzimas de restrição permite a tipagem das amostras 1-3 como, respectivamente, *5C/*5C, *4/*4 e *4/*5C.

Materiais e Métodos (i) Desenho do farol de hibridação

Foram desenhadas sondas HyBeacon para hibridar a dez SNPs localizados no gene da N-acetiltransferase 2 (NAT2) humana (ver tabela 1) e nos genes que codificam para o citocromo P450 (CYP) (ver tabelas 2 e 3). As sondas foram desenhadas de modo que os nucleótidos polimórficos se posicionem em direcção ao centro das sequências HyBeacon. Todas as sondas HyBeacon têm aproximadamente um comprimento de 20 nucleótidos e possuem porções de fluoróforo ligadas a residuos uracilo interno (em substituição da timina em sequências de ADN). Os corantes fluorescentes 6-carboxifluoresceína (FAM), tetraclorofluoresceina (TET) e hexaclorofluoresceína, foram ligados aos residuos U através de novos reagentes químicos (disponíveis através de Oswel DNA Services, Southampton, Reino Unido) e foram avaliados seis modos de ligação a fluoróforos (FAM propo dU, FAM propargil dU, dU C6 FAM, dU FAM, FAM cap prop dU e FMOC dU) . Verificou-se que os fluoróforos dU C6 FAM e FMOC dU geravam dados ligeiramente superiores e foram preferencialmente utilizados. Nos HyBeacons F-Q, as porções quencher (Vermelho de Metilo) foram também posicionadas em resíduos U internos, tendo sido testados HyBeacons com 1, 3, 5, 6, 7, 8 e 9 resíduos nucleotídicos a separar as moléculas fluoróforo e quencher. Foram investigados HyBeacons F-Q possuindo moléculas de fluoróforo e de quencher flanqueando e não flanqueando o 30 nucleótido polimórfico. A maioria dos HyBeacons sintetizados possuem um componente fosfato 3' ou octanodiol 3' de modo a evitar a extensão dos HyBeacons mediada pela Taq quando as sondas são incorporadas em ensaios de PCR em tempo real. Os HyBeacons F e F-Q foram desenhados de modo a corresponderem na perfeição a um alelo das sequências polimórficas de NAT2 e CYP, de tal modo que a outra variante de um SNP crie uma posição de discrepância aquando da hibridação da sonda. Foram sintetizadas sondas HyBeacon, totalmente complementares a ambos os alelos, para cada SNP com dois alelos.

Tabela 1

1 ATGGACATTG AAGCATATTT TGAAAGAATT GGCTATAAGA ACTCTAGGAA CAAATTGGAC 61 TTGGAAACAT TAACTGACAT TCTTGAGCAC CAGATCCGGG CTGTTCCCTT TGAGAACCTT 121 AACATGCATT GTGGGCAAGC CATGGAGTTG GGCTTAGAGG CTATTTTTGA TCACATTGTA 181 AGAAGAAACC GGGGTGGGTG GTGTCTCCAG GTCAATCAAC TTCTGTACTG GGCTCTGACC 241 ACAATCGGTT TTCAGACCAC AATGTTAGGA GGGTATTTTT ACATCCCTCC AGTTAACAAA 301 TACAGCACTG GCATGGTTCA CCTTCTCCTG CAGGTGACCA TTGACGGCAG GAATTACATT 361 GTCGATGÇTG GGTCTGGAAG CTCCTCCCAG ATGTGGCAGC CTCTAGAATT AA7TTCTGGG 421 AAGGATCAGC CTCAGGTGCC TTGCATTTTC TGCTTGACAG AAGAGAGAGG AATCTGGTAC 481 CTGGACCAAA TCAGGAGAGA GCAGTATATT ACAAACAAAG AATTTCTTAA TTCTCATCTC 541 CTGCCAAAGA AGAAACACCA AAAAATATAC TTATTTACGC TTGAACCTCG AACAATTGAA 601 GATTTTGAGT CTATGAATAC ATACCTGCAG ACGTCTCCAA CATCTTCATT TATAACCACA 661 TCATTTTGTT CCTTGCAGAC CCCAGAAGGG GTTTACTGTT TGGTGGGCTT CATCCTCACC 721 TATAGAAAAT TCAATTATAA AGACAATACA GATCTGGTCG AGTTTAAAAC TCTCACTGAG 781 GAAGAGGTTG AAGAAGTGCT GAAAAATATA TTTAAGATTT CCTTGGGGAG AAATCTCGTG 841 CCCAAACCTG GTGATGGATC CCTTACTATT TAGAATAAGG AACAAAATAA ACCCTTGTGT 901 ATGTATCACC CAACTCACTA ATTATCAACT A sequência polimórfica NAT2 (Sequência No. ID 60). Sequência do gene humano para a arilamina N-acetiltransferase 2 (NAT2). As posições contendo polimorfismos nucleotídicos singulares (SNPs) são apresentadas em letra a negro. Existem polimorfismos do comprimento dos fragmentos de restrição nas posições 481 (*5A), 590 (*6), 803 (*5C) e 857 (*7A). (ii) Amplificação de produtos de PCR polimórficos NAT2 e CYP2D6 31

Foram amplificados alvos polimórficos quer de saliva (diluída a 50% com água), ADN genómico isolado de amostras de sangue de referência (Universidade de Dundee), ADN genómico de placenta humana (Sigma-Aldrich) ou plasmídeos pGEM-T (Promega) contendo produtos NAT2 e CYP amplificados. Foram avaliados vários pares de iniciadores, gerando amplicons NAT2 e CYP diferindo em tamanho e em posição em relação aos locais polimórficos. Por exemplo, os pares de iniciadores óptimos utilizados para amplificar as sequências polimórficas NAT2*5A, NAT2*5C, NAT2*6, NAT2*lh, CYP2D6*3 e CYP2D6*4 foram, respectivamente 195991/195993, DdeF2/DdeR, TaqF2/TaqR2, BamF2/BamR, 2D63F/2D63R e 2D64F2/2D64R2 (tabela 4). Foi realizada a reacção em cadeia da polimerase (PCR) de modo a amplificar fragmentos de ADN de aproximadamente 80-150 pb que continham os nucleótidos polimórficos. Foram realizados testes de detecção de alvo e de discriminação de SNP nos formatos heterogéneo e homogéneo. TABELA 2. As sequências nucleotídicas das sondas HyBeacon F-Q desenhadas para polimorfismos Nat2 (*5A, *5C, *6 e *7A) e CYP2D6 (*3 e *4). As porções fluoróforo FAM (5) e quencher (6) foram ligadas a residuos uracilo internos através de novos reagentes químicos. A maioria das sondas oligonucleotídicas foram bloqueadas na sua terminação utilizando um fosfato 3' (3P). 32

HyBeacon Descrição Sequência (5' ^3')

HyBeacon Descrição Sequência (5' ^3') B9412 B9413 B9414 TB0993 TB0994 F17830 F17831 F17832 F17833 F17834 F17835 F17836 F17837 F17838 F17839 FAM propo dU, NAT2*5A FAM propo dU, NAT2*5A FAM propo dU, NAT2*5A FAM propargil dU, NAT2*5A FAM propargil dU, NAT2*5A dU C6 FAM, NAT2 *5A dU FAM, NAT2 *5A dU C6 FAM, NAT2 *5A dU FAM, NAT2 *5A dU C6 FAM, NAT2 *5A dU C6 FAM, NAT2*5A dU C6 FAM, NAT2*5A dU C6 FAM, NAT2*5A dU C6 FAM, NAT2*6 dU C6 FAM, NAT2*6

GAATCTGGTA5C6GGACCAA

Sequência No. ID 1

GAATCTGG5ATC6GGACCAA

Sequência No. ID 2

GAATC5GGTATC6GGACCAA

Sequência No. ID 3

GAATC5GGTACC6GGACCAA3P

Sequência No. ID 4

GAATC5GCTACC6GGACCAA3P

Sequência No. ID 5

GATTTGGTCCAGG5ACCAGA6 TC3P

Sequência No. ID 6

GATTTGGTCCAGG5ACCAGA6TC3P

Sequência No. ID 7

GAT 5 T GGTC CAGG 6ACCAGAT TC 3 P

Sequência No. ID 8

GAT5TGGTCCAGG6ACCAGATTC3P

Sequência No. ID 9

GAGAG GAATC5GGTACC6GGACC3P

Sequência No. ID 10

GAATC5GGTACT6GGACCAA3P

Sequência No. ID 11

C5TGAACC6CGAACAATTGAAG3P

Sequência No. ID 12

CTTGAACC5CGAACAA6TGAAG3P

Sequência No. ID 13

CTTGAACC5CGAACAAT6GAAG3P

Sequência No. ID 14

CTTCAATTG5TCGAGG6TCAAG3P

Sequência No. ID 15 33 (continuação)

HyBeacon Descrição Sequência (5' ^3') F17840 dU C6 FAM, NAT2*6 CTTCAA5TGTTCGAGG6TCAAG3P Sequência No. ID 16 TaqFLA dU C6 FAM, NAT2*6 CTTCAA5TGTTTGAGG6 TCAAG3P Sequência No. ID 17 F17847 dU C6 FAM, NAT2*5C GAAGTGC5GAGAAA6ATATTTAAG3P Sequência No. ID 18 F18140 dU propargil NAT2*5A FAM, GATTTGGTCCAGG5ACCAGA6TC3P Sequência No. ID 19 F18141 dU propargil NAT2*5A FAM, GAT5TGGTCCAGG6ACCAGATTC3P Sequência No. ID 20 F34324 FAM cap prop dU, NAT2*5A GAATC5GGTACC6GGACCAA3P Sequência No. ID 21 F34325 FAM cap prop dU, *5A NAT 2 GAATC5GGTACT6GGACCAA3P Sequência No. ID 22 2D63A dU C6 FAM, CYP2D6 *3 CCCAGG5CATCCTG6GCTCAG3P Sequência No. ID 23 2D64A dU C6 FAM, CYP2D6*4 GGGGCGTCC5GGGGG6GG3P Sequência No. ID 24 Tabela 3. Utilizaram-se genes codificantes para N- acetiltransferase (NAT2) e Citocromo P450 (CYP2D6, CYP2C9 e CYP2C19)) para ajudar no desenho de testes com HyBeacon. São incluídos os tipos de polimorfismo, o nome dos alelos e as sequências das sondas HyBeacon F utilizadas nos ensaios de discriminação de SNP. Os caracteres a negro e sublinhados nas sequências de HyBeacon representam, respectivamente, o nucleótido polimórfico e o uracilo marcado com o fluoróforo (F = FAM dU, E = TET dU e Η = HEX dU) . 3P e 30 representam, respectivamente, fosfato 3' e octanodiol 3'. 34

Gene Poli- Alelo HyBeacon Sequência (5' -> 3') morfismo ΝΆΤ2 C481 ^ T * 4 2303002 GAGAGGAATCFGGTACCTGGACC3P (Fl) Sequência No. ID 25 * 5a NAT2 *5 GAGAGGAATCFGGTACTTGGACC3P (Slk) Sequência No. ID 26 NAT2 A-803 ^ G * 4 DdeFLl*4 GAAGT GCF GAAAAATATATTTAAG3 P (Fl) Sequência No. ID 27 O LO * DdeFLl GAAG T G C F GAGAAATATAT TTAAG 3 P (Sld) Sequência No. ID 28 Ά· 4 DdeFLl*4T GAAGTGCEGAAAAATATATTTAAG30 (Fl) Sequência No. ID 29 NAT2 G59O ^ A * 4 TaqFL2 CTTCAAFTGTTCGAGGTTCAAG3P (Fl) Sequência No. ID 30 NAT2 G847 ^ A * 4 BamFLl CCTGGTGAFGGATCCCTTAC3P (Fl) Sequência No. ID 31 *7A BamFLl* 7 CCTGGTGAFGAATCCCTTAC3P (S3) Sequência No. ID 32 CYP2D6 Deleção *1 2D63C* CCCAGGFCATCCTGTGCTC3P A-2637 Sequência No. ID 33 *1 2D63B CCCAGGFCATCCTGTGCTCAG3P Sequência No. ID 34 *3 2D63C CCCAGGFCATCCGTGCTC3P Sequência No. ID 35 CYP2D6 Gl934 ^ A *1 2D64C* GGGCGFCCTGGGGGTG3P Sequência No. ID 36 *1 2D64B GGGGCGFCCTGGGGGTGGG3P Sequência No. ID 37 4 2D64C GGGCGTCTFGGGGGTG3P Sequência No. ID 38 *1 2D64E GGGCGHCCTGGGGGTG30

Sequência No. ID 39 35 (continuação)

Gene Poli morfismo Alelo HyBeacon Sequência (5' -> 3') CYP2C9 C430 -► T *1 C9*2C CATTGAGGACCGFGTTCAAG3P Sequência No. ID 40 *2 C9*2T C AT T GAGG AC TGF GT T C AAG 3 P Sequência No. ID 41 CYP2C9 A1075 -> c *1 C9*3A GAAGGFCAATGTATCTCTGG3P Sequência No. ID 42 *3 C9*3C GAAGGF CAAGGTAT CTCTGG3P Sequência No. ID 43 CYP2C19 G681 -> A *1 C19mlG GATTATTFCCCGGGAACCC3P Sequência No. ID 44 *2 C19mlA GATTATTFCCCAGGAACCC3P Sequência No. ID 45 CYP2C19 G636 -> A *1 C19m2G TACCFGGATCCAGGGGGTG3P Sequência No. ID 46 *3 C19mlA TACCFGGATTCAGGGGGTG3P Sequência No. ID 47

Tabela 4. Oligonucleótidos iniciadores utilizados para amplificar a sequência alvo polimórfica.

Polimorfismo Iniciador Sequência NAT2'"5A 195991 5'(CTGCTCTCTCCTGATTTGGTCC)3'

Sequência No. ID 48 NAT2*5A 195993 5' (CCTCTAGAATTAATTTCTGGG)3'

Sequência No. ID 49 NAT2*5C DdeF2 5'(CCTATAGAAAATTCAATTATAAAG)3'

Sequência No. ID 50 36 (continuação)

Polimorfismo Iniciador Sequência NAT2*5C DdeR 5(CACGAGATTTCTCCCCAAGG)3' Sequência No. ID 51 NAT 2*6 TaqF2 5' (C C T G C CAAAGAAGAAACAC C)3' Sequência No. ID 52 NAT 2*6 TaqR2 5'(GTATTCATAGACTCAAAATCTTC)3' Sequência No. ID 53 NAT 2 * 7A BamF2 5'(GAAGAGGTTGAAGAAGTGCTG)3' Sequência No. ID 54 NAT 2 * 7A BamR 5'(CAAGGGTTTATTTTGTTCCTTATTC)3' Sequência No. ID 55 CYP2D6*3 2D63F 5'(CCACCGTGGCAGCCACTCTC)3' Sequência No. ID 56 CYP2D6*3 2D63R 5'(CCAGCTGGATGAGCTGCTAAC)3' Sequência No. ID 57 CYP2D6*4 2D64F2 5'(CGAAGCGGCGCCCGCAGG)3' Sequência No. ID 58 CYP2D6*4 2D64R2 5'(GGGACGGGGAAGGCGACC)3' Sequência No. ID 59 (ίίί) Análise heterogénea de fusão de SNPs.

Os volumes de PCR foram tipicamente 30 yL, contendo aproximadamente 200 ng de cadeia molde de ADN, lx tampão de PCR (Pharmacia), 0,5 μΜ de cada iniciador, 1 unidade de Taq polimerase (Amersham Pharmacia Biotech) e 1 mM de dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech). Após um passo de desnaturação (94°C, 5 min), os alvos de PCR foram amplificados utilizando 40 ciclos compreendendo desnaturação (94°C 30 s), emparelhamento do iniciador (50°C 1 min) e extensão dos 37 produtos (72°C 1 min). A seguir à amplificação, os produtos de PCR foram precipitados com 0,1 volumes de acetato de sódio a 3M e 2 volumes de etanol. Após 10 minutos de incubação a -20°C, 30 minutos de centrifugação a 13000 rpm e dois passos de lavagem com 70% de etanol, os sedimentos foram ressuspendidos em lx de mistura tampão de hibridação / sonda (50 mM Tris a pH 7,4, 3 mM MgCÍ2, HyBeacon apropriado), em que foram adicionados 5 pL de mistura tampão/sonda por reacção de PCR inicial. Os HyBeacons F-Q- foram tipicamente utilizados a concentrações entre 500 nM - 1 μΜ, enquanto que os HyBeacons F foram utilizados entre concentrações de 100 nM e 300 nM. Os volumes de reacção de 5 pL foram analisados com um LightCycler™ (Roche) utilizando um programa informático de análise de curvas de fusão. A análise de hibridação compreendeu uma leitura inicial de fluorescência (30°C durante 30 s), a hibridação (94°C durante 1 min seguido de 30°C durante 2 min), normalização (65°C durante 1 s, 85°C durante 1 s, 30°C durante 1 s) e análise de fusão (30°C a 95°C, com uma velocidade de transição de 0,l°C/s). Com a excepção da normalização, que utiliza aquisições de fluorescência únicas, a fluorescência foi continuamente monitorizada. Foram traçadas curvas de fusão utilizando o programa informático LightCycler, desenhando a derivada negativa da fluorescência com a temperatura (-dF/dT no eixo dos yy) em relação à temperatura (eixo dos xx). (iv) Ensaios de amplificação por PCR em "tempo real" homogéneos.

Os volumes de PCR foram de 20 pL, contendo 2 pL de saliva a 50% ou aproximadamente 200 ng de ADN genómico, lx tampão Z-Taq™ (TaKaRa) ou lx tampão de PCR HyBeacon (10 mM Tris.Cl a 38 ρΗ 8,8, 25 mM de KC1, 3,5 roM MgCl2, 5 ng/yL de BSA) , 0,5 pM iniciadores, 1 unidade de Taq polimerase (Amersham Pharmacia Biotech) e 1 mM de dNTPs. Os ensaios de PCR em "tempo real", que utilizaram sondas fluorescentes para monitorizar a acumulação do alvo amplificado, também continham uma quantidade adicional de 500-1000 nM ou 100-300 nM, respectivamente, dos HyBeacon F-Q e F apropriados. As sequências, alvo polimórficas, foram amplificadas com instrumentos LightCycler™ (Roche) e ABI PRISM® 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). As reacções, realizadas em capilares LightCycler, foram desnaturadas a 95°C durante 1 min (ADN genómico e plasmídico) ou 5-10 minutos (amostras de saliva), antes da amplificação dos alvos polimórficos utilizando 40-50 ciclos, compreendendo desnaturação (95°C 0 s), emparelhamento do iniciador (Faq 10 s) e extensão dos produtos (72°C 10 s). A aquisição da fluorescência foi realizada no final de cada passo de emparelhamento do iniciador. A temperatura da aquisição de fluorescência (Faq) varia entre amplicons e HyBeacons, em que Faq é aproximadamente a meio entre as Tms de sondas com correspondência total e sondas com discrepâncias (ver tabela 5). Por exemplo os testes com o HyBeacon 2D64C* empregam uma Faq de 57°C para discriminar entre os SNPs CYP2D6 *1 e *4 por amplificação em tempo real. A seguir à amplificação, as reacções foram desnaturadas (95°C 0 s) e arrefecidas (35°C 2 min) antes da análise de fusão (35°C a 95°C, com uma velocidade de transição de 0,l°C/s), na qual a fluorescência foi adquirida continuamente. Foram traçadas curvas de fusão utilizando o programa informático LightCycler, desenhando a derivada negativa da fluorescência com a temperatura (-dF/dT no eixo dos yy) em relação à temperatura (eixo dos xx). (v) Amplificação assimétrica de alvos HyBeacon. 39

Utilizou-se PCR assimétrico para gerar moléculas alvo de ADN de cadeia simples para hibridação da sonda. As amplificações foram levadas a cabo em capilares LightCycler. Foram utilizados iniciadores em sentido inverso para amplificar o produto de cadeia simples contendo a sequência de ADN homóloga necessária para hibridação HyBeacon. Os iniciadores em sentido directo foram envolvidos com a amplificação inicial de ADN de cadeia dupla para gerar a cadeia que não continha local de ligação da sonda. Os iniciadores de sentido directo e de sentido inverso foram tipicamente utilizados numa razão de 50:1. Os plasmideos pGEM-T contendo alvos polimórficos NAT2 e CYP2D6 foram utilizados como moldes para PCR. Os volumes de reacção de PCR foram tipicamente de 20 pL, contendo aproximadamente 200 ng de ADN plasmidico, lx tampão Z-Taq™ (TaKaRa) 0,5 μΜ iniciador de sentido inverso, 10 nM de iniciador de sentido directo, 1 unidade de Taq polimerase (Amersham Pharmacia Biotech) e 1 mM de dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech) e o farol de hibridação apropriado. A amplificação homogénea e a análise de pico de fusão foram realizadas tal como descrito acima. (vi) Análise em fase sólida dos alvos polimórficos. A amplificação por PCR foi levada a cabo tal como descrito acima para os ensaios heterogéneos, com a excepção que o iniciador em sentido inverso foi biotinilado na sua terminação 5'. Após a amplificação, adicionou-se 10-15 pL de produto de PCR biotinilado a poços individuais de placas de microtitulação revestidas com estreptavidina (Hybaid). Adicionou-se a cada poço lx tampão DASH gold (Hybaid) de modo a resultar num volume final de 50 pL. Após uma incubação à temperatura ambiente durante 1 hora, a solução foi removida 40 de cada poço. Adicionou-se 50 μL de NaOH a 0,1 M aos poços de modo a desnaturar o ADN de cadeia dupla. Após 5 minutos de incubação, os poços foram lavados uma vez com 50 pL de NaOH a 0,1 Me duas vezes com 50 pL de lx tampão DASH de modo a remover a cadeia de ADN não biotinilada. Adicionou-se a cada poço um excesso de HyBeacon (> 1 pM) em lx tampão DASH (2 pL de sonda + 48 pL de tampão). As sondas foram hibridadas para imobilizar o ADN de cadeia simples através de reacções a 95°C durante 1 minuto e depois arrefecimento a 25°C a uma velocidade aproximada de 0,08°C/s. A solução e a sonda não hibridada foram removidas dos poços e substituídas por 50 pL de lx tampão DASH fresco. A análise de fusão da sonda hibridada foi levada a cabo num instrumento DASH (Dynamic Allele Specific Hybridization, Hybaid) utilizando velocidades de transição de temperatura entre 0, 02-0, 07°C/s. (vii) Detecção múltipla de alvos por HyBeacon

Realizaram-se reacções contendo múltiplos pares de iniciadores e sondas HyBeacon utilizando o detector de sequências ABI PRISM® 7700. Foram amplificados alvos polimórficos NAT2*4 (local *7A), NAT2*4 (local *5C) e CYP2D6*1 e detectados utilizando sondas HyBeacon marcadas, respectivamente, com FAM, TET e HEX (tabela 4). Após um passo de reacção de desnaturação (95°C 5 min), os alvos polimórficos foram amplificados a partir de ADN genómico utilizando 40 ciclos, compreendendo desnaturação (95°C 15 s), emparelhamento de iniciadores (50°C 30 s) e extensão dos produtos (72°C 30 s). A aquisição da fluorescência foi realizada durante cada passo de emparelhamento de iniciador da amplificação. 41

Resultados e Discussão (i) As sequências do alvo polimórfico.

Demonstrou-se que o local da N-acetiltransferase 2 (NAT2) humana é polimórfico. Sabe-se que cópias defeituosas do gene NAT2 resultam na acetilação lenta de vários fármacos arilamina e de tóxicos. Estudos epidemiológicos associaram este fenótipo de acetilação lenta com um risco de cancros da bexiga e colo-rectais. A análise dos locais NAT2 polimórficos identificou um número de alelos lentos, contendo substituições nucleotidicas (ver Tabela 1) . Estas substituições incluem mutações pontuais nas posições 481 (C para T), 590 (G para A), 803 (A para G) e 857 (G para A), que produzem, respectivamente polimorfismos de comprimentos de fragmentos de restrição (RFLPs) *5A, *6. *5C e *7A. Em cada um destes locais polimórficos, *1 é a variante alélica que ocorre mais frequentemente nos genomas humanos. 0 enzima citocromo P450 (debrisoquina 4-hidroxilase), codificado pelos genes tais como CYP2D6, CYPDC9 e CYP2C19 em humanos, é responsável pelo metabolismo de mais do que 30 fármacos comummente prescritos, incluindo agentes antidepressivos, antiarritmicos e anti-hipertensores. Aproximadamente 5-10% dos caucasianos apresentam um fenótipo de fraco metabolismo devido a um défice de actividade do enzima citocromo P450. Foram identificadas muitas variantes alélicas no local do gene CYP2D6, os mais comuns dos quais são os polimorfismos nucleotidicos singulares CYP2D6*3 (também conhecido como CYP2D6A) e CYP2D6*4 (também conhecido como CYP2D6B) . Verificou-se que os indivíduos que possuem os genótipos *3 e *4 possuem fenótipos de baixa actividade enzimática. 42

Os polimorfismos NAT2 e CYP foram utilizados para testar o potencial de faróis de hibridação para detectar sequências de ADN especificamente amplificadas e para discriminar alvos contendo polimorfismos nucleotidicos singulares. (ii) Hibridação de sonda diferencial para alvos oligonucleotidicos.

Quando uma sonda HyBeacon híbrida com uma sequência alvo, a interacção pode ser ou perfeitamente correspondente ou ter discrepâncias. A Figura 1 ilustra as diferenças entre complexos de duas cadeias correspondentes, com uma discrepância ou com duas discrepâncias, classificando cada tipo de interacção. As sondas HyBeacon foram hibridadas com oligonucleótidos perfeitamente correspondentes e com oligonucleótidos com discrepância e analisadas num LightCycler. Quando se compararam as quantidades de fluorescência emitidas de HyBeacons em estados de cadeia simples e de cadeia dupla, observou-se que foi emitida significativamente mais fluorescência quando as sondas eram hibridadas a moléculas alvo do que quando livres em solução. Estas diferenças na emissão de fluorescência, geradas por sondas HyBeacon de cadeia simples e de cadeia dupla, foram estatisticamente significativas (p<0,01 em análise de variância a um factor) e proporcionaram um método através do qual a presença de ADN alvo pode ser detectada através de quantificação de fluorescência (figura 2). A monitorização das alterações na emissão de fluorescência causada por alterações na temperatura e no estado de hibridação da sonda permite gerar picos de fusão com pares HyBeacon/homólogo. As sondas HyBeacon hibridadas com 43 oligonucleótidos com discrepâncias produzem curvas de fusão com Tms reduzidas quando comparadas com as das sondas hibridadas com moléculas alvo totalmente complementares. A Figura 2 demonstra a hibridação diferencial de um HyBeacon NAT2 *4 (no SNP *5A) a alvos nucleotídicos com correspondência total ou com discrepância. As regiões de discrepância reduzem a Tm da sonda e permitem a discriminação de alvos polimórficos através da análise dos picos de fusão. Alvos totalmente correspondentes, com uma discrepância ou com duas discrepâncias podem ser discriminados de modo fiável através da Tm dos picos de fusão. Além disso, a aquisição de fluorescência realizada a uma temperatura intermédia entre as Tms de alvos com correspondência total e as de alvos com discrepâncias permite a discriminação de alvos polimórficos na base da quantificação de fluorescência. À temperatura de aquisição de fluorescência, o HyBeacon com correspondência total é hibridado ao seu alvo e emite mais fluorescência do que uma sonda com discrepâncias que fundiu fora do seu alvo (figura 2).

Em solução, os HyBeacons emitem apenas pequenas quantidades de fluorescência basal. No entanto, após a ligação a sequências alvo, é emitida significativamente mais fluorescência como resultado directo da hibridação. Demonstrou-se que sequências que diferem de apenas um único nucleótido podem ser distinguidas pela (i) quantidade de fluorescência produzida quando a molécula do farol de hibridação híbrida com a sua sequência alvo e (ii) a temperatura de fusão (Tm) do complexo sonda/alvo.

Os métodos de quantificação de fluorescência e a análise de fusão foram realizados com sondas HyBeacon F-Q e F, 44 originando resultados de qualidade comparável. A Figura 3 apresenta curvas de fusão originadas por HyBeacons NAT2 *4 F e F-Q hibridados com os alvos oligonucleotidicos. Os HyBeacons F-Q podem ter alguma dependência em relação ao espaçamento entre o fluoróforo e o quencher e em efeitos de disposição angular (dados não mostrados). No entanto, os HyBeacons F apresentam elevados niveis de emissão de fluorescência aquando da hibridação com o alvo apesar da ausência de uma porção quencher. As porções fluoróforo nas sondas HyBeacon F e F-Q emitem significativamente mais fluorescência quando em estado de cadeia dupla do que na conformação de cadeia simples (ver abaixo). (iii) Variedades de polimorfismos nucleotídicos singulares A discriminação de polimorfismos de substituição de uma única base presentes nos alelos NAT2 e CYP2D6 foi demonstrada utilizando sondas HyProbe. Hibridou-se uma série de alvos oligonucleotidicos à sonda TB0993 NAT2 *4 para testar a capacidade das moléculas de farol de hibridação em discriminar polimorfismos de inserção e deleção (InDel). Foram analisados três oligonucleótidos de inserção e três de deleção, variando em tipo e em posição do polimorfismo. Cada alvo InDel gerou uma Tm significativamente reduzida quando comparada com HyBeacon que hibridou a um oligonucleótido com correspondência total (figura 4). De modo semelhante aos polimorfismos de substituição, os InDels podem ser distinguidos pelas Tms dos complexos HyBeacon/alvo e a quantidade e fluorescência emitida a uma temperatura intermédia entre as Tms da sonda com correspondência total e da sonda com discrepância. 45 (iv) Discriminação de SNPs em produtos de PCR (testes heterogéneos).

Foram realizados testes heterogéneos, que realizam amplificação do alvo e discriminação de SNP em tubos separados, com polimorfismos NAT2 *5A, *5C e *6 e com SNPs CYP2D6 *3 e *4. Desenvolveu-se uma análise heterogénea com sucesso, permitindo a discriminação fiável de SNP através da análise de pico de fusão, para todos os polimorfismos testados. Os produtos de PCR contendo nucleótidos polimórficos foram amplificados a partir de cadeia molde de ADN NAT2 e CYP2D6. As dimensões dos amplicon situavam-se entre 80 pb e 282 pb de comprimento. Os produtos de PCR foram isolados e ressuspendidos em tampão de hibridação contendo a sonda HyBeacon. As sondas foram hibridadas aos alvos de PCR e realizou-se análise de fusão em capilares LightCycler, gerando picos de fusão com Tms dependentes da identidade do alvo de PCR. Os HyBeacons discriminam facilmente alvos de PCR com correspondência total e com discrepâncias através da temperatura de fusão dos complexos sonda/alvo. Ambas as variantes HyBeacon F-Q e F têm bons desempenhos em testes heterogéneos de discriminação de SNP.

Os ensaios realizados com o polimorfismo CYP2D6*3 mostram como os HyBeacons F e F-Q permitem a discriminação de SNP em análises heterogéneas (figura 5). Um produto de PCR de 119 pb foi amplificado a partir de ADN polimórfico CYP2D6 *3. Os produtos de PCR foram isolados e ressuspendidos em tampão de hibridação contendo ou as sondas HyBeacon 2D63A (F-Q) ou 2D63B (F). O HyBeacon F 2D64 foi utilizada a uma concentração 5 vezes inferior que a sonda F-Q dada a maior fluorescência ruído devido à ausência de quencher. A figura 5 apresenta curvas de fusão derivadas da hibridação de HyBeacon a alvos de PCR contendo os alelos CYP2D6 *1 e *3. As sondas 2D63A e 2D63B possuem sequências nucleotidicas idênticas, sendo totalmente complementares ao alelo *1 do gene CYP2D6 e, por isso, contêm uma única discrepância quando hibridadas com o alelo *3. 0 HyBeacon F-Q 2D63A gerou picos de fusão com Tms de aproximadamente 56°C e 65°C quando hibridados, respectivamente, a sequências alélicas *3 e *1. 0 HyBeacon F 2D63B gerou picos de fusão com Tms similares de aproximadamente 58°C e 65°C quando hibridados a produtos de PCR, respectivamente, com discrepância ou com correspondência total. As temperaturas de fusão, geradas por hibridação HyBeacon com os dois alelos do SNP, são bastante reprodutíveis e estatisticamente significativas (p<0,01 em análise de variância a um factor). Deste modo, os genótipos CYP2D6 *1 e *3, correlacionados respectivamente com fenótipos de metabolismo enzimático normal e deficiente, são discriminados de modo fiável em testes heterogéneos de HyBeacon. (v) Detecção em tempo real de sequências de ácidos nucleícos. A quantidade de fluorescência emitida pelas sondas HyBeacon é significativamente maior quando os oligonucleótidos são hibridados a sequências de ácidos nucleicos complementares do que na conformação de cadeia simples. Deste modo, os HyBeacons podem ser incluídos em reacções de modo a monitorizar a acumulação em tempo real de alvos específicos de ADN ao longo da amplificação por PCR. A Figura 6 demonstra a detecção da sequência CYP2D6*1 presente em ADN genómico e de saliva, utilizando o HyBeacon 2D64C* para monitorizar a acumulação de produto em cada ciclo de amplificação. 47 (vi) Discriminação em "tempo real" de SNPs (testes homogéneos)

Quando as sondas HyBeacon hibridam a sequências alvo polimórficas, as interacções podem ser ou de correspondência perfeita ou com discrepâncias. As posições da discrepância de nucleótido destabilizam os complexos sonda/alvo de tal modo que a Tm da hibridação é reduzida em comparação com as sequências totalmente complementares. Uma vez que a quantidade de fluorescência emitida do HyBeacon hibridado é significativamente superior do que a sonda em cadeia simples, as sequências alvo polimórficas podem ser discriminadas com base na Tm de hibridação. A temperatura de emparelhamento (e de aquisição de fluorescência) do PCR pode ser optimizada para se conseguir a discriminação em tempo real de sequências de ADN proximamente relacionadas, através de hibridação selectiva da sonda, de tal modo que apenas sequências alvo que são totalmente complementares às sondas HyBeacon instigam um aumento nos sinais de fluorescência durante a amplificação. Por exemplo, se uma sonda HyBeacon é desenhada de modo a ser totalmente complementar a uma sequência de ADN contendo uma mutação, só são gerados aumentos na emissão de fluorescência na presença do alelo mutado.

Incorporaram-se sondas HyBeacon em reacções em cadeia da polimerase desenhadas para amplificar as sequências polimórficas NAT2 e CYP. Em cada ciclo de amplificação, adquiriram-se leituras únicas de fluorescência na fase de emparelhamento dos iniciadores, a uma temperatura intermédia entre as Tms de HyBeacon com correspondência total e com discrepâncias. À temperatura de aquisição de fluorescência, espera-se que o HyBeacon tenha hibridado com o alvo com 48 correspondência total mas que não tenha hibridado com a sequência com discrepâncias. A hibridação diferencial da sonda, à temperatura de aquisição de fluorescência, faz com que reacções contendo uma cadeia molde com correspondência total resulte em aumentos de fluorescência durante a amplificação, enquanto que reacções contendo uma cadeia molde com discrepâncias não resultam em aumentos de fluorescência. A análise homogénea de SNP é aqui demonstrada utilizando o HyBeacon F 0203002, que foi utilizado para discriminar os polimorfismos NAT2 *4 e *5A. O HyBeacon tem correspondência perfeita com o alelo *4 de NAT2 e tem uma discrepância numa única base quando hibridado com a sequência *5A. A Figura 7a mostra a discriminação em "tempo real" de SNPs, em que apenas reacções contendo o alelo *4 geram aumentos significativos na emissão de fluorescência durante os ciclos de PCR. As reacções contendo apenas alelos *5A com discrepância não produzem aumentos na emissão de fluorescência durante a amplificação. A Figura 8 é outro exemplo de análise com HyBeacon em tempo real que demonstra a detecção e discriminação de sequências polimórficas CYP2D6 *1 e *4, utilizando ADNs plasmidicos como fonte de cadeia molde. A discriminação de sequências polimórficas presentes em ADN genómico ou em amostras de saliva pode também ser conseguida por análise de PCR com HyBeacon. O HyBeacon 2D64C*, apresentado na figura 8, tem uma correspondência perfeita com o alelo *1 do gene CYP2D6 e, como tal, detecta especificamente a amplificação da sequência *1 através de aumentos em tempo real da emissão de fluorescência. As reacções contendo apenas sequências CYP2D6 *1 geram aumentos de emissão relativamente elevados enquanto que as amostras contendo apenas alelos *4 não apresentam 49 aumentos de fluorescência significativos. As reacções que contêm tanto alelos *1 como alelos *4 apresentem aumentos intermédios na quantidade de emissão de fluorescência. As reacções que contêm ambos os alelos *1 e *4 apresentam aumentos intermédios na quantidade de emissão de fluorescência. A utilização de HyBeacon 2D64C, que é totalmente complementar ao alelo CYP2D6*4, permite a confirmação dos resultados de genotipagem de 2D64C* (dados não publicados). Tal como com sondas TaqMan™, faróis moleculares, sondas de hibridação e iniciadores Scorpion, são necessárias duas sondas HyBeacon para genotipar amostras, em relação a SNPs bialélicos, por PCR em tempo real de modo a assegurar a identificação precisa de ADN homozigótico e heterozigótico. (vii) Discriminação de SNPs por análise de curva de fusão

As sequências polimórficas de ADN podem também ser detectadas e discriminadas num formato de "ponto final" utilizando sondas HyBeacon através de análise de curvas de fusão e determinação de Tm. A análise homogénea de curvas de fusão de complexos HyBeacon/alvo pode ser levada a cabo em reacções LightCycler imediatamente após a amplificação. As temperaturas de fusão derivadas da análise de curvas de fusão permite a identificação de sequências de ADN alvo, em que as Tms derivadas de HyBeacons totalmente complementares são significativamente superiores à das interacções de sondas com discrepâncias. A análise de fusão realizada pós-amplificação com o HyBeacon 0203002 e os alvos polimórficos *4 e *5A geraram picos de fusão possuindo Tms de aproximadamente 62°C e 54°C, respectivamente, com sequências complementares e com discrepâncias (figura 7b). As Tms dos picos de fusão, 50 produzidas por hibridação com sequências alvo complementares e com discrepâncias, são extremamente reprodutíveis para um dado SNP e diferem significativamente entre SNPs. Deste modo, consegue-se a discriminação fiável de SNPs por análise das temperaturas de fusão HyBeacon. A análise de fusão pós-amplificação permite a validação dos dados de fluorescência em "tempo real", confirmando que a presença ou ausência de aumentos de fluorescência em PCR está de facto correlacionada com a presença de alvos, respectivamente, com correspondência total ou com discrepâncias. Deste modo, as fusões pós-amplificação permitem a diferenciação entre reacções que não produzem aumentos de fluorescência devido à presença de um alvo com discrepância e aquelas reacções que não geram aumentos de fluorescência devido à ausência total de alvo ou falha da amplificação por PCR. Demonstrou-se que tento as variantes HyBeacon F-Q e F têm bons desempenhos em ensaios de amplificação em "tempo real" e geram curvas de fusão pós-amplificação em ensaios homogéneos. No entanto, verificou-se que os HyBeacons F produzem tipicamente fusões de pós-amplificação de qualidade superior quando comparados com as sondas F-Q com as mesmas sequências de ADN.

Com as sondas HyBeacon F, amostras homozigóticas geram picos de fusão únicos, que têm correspondência total ou discrepâncias dependendo da identidade da sequência alvo, enquanto que ADN heterozigótico produz traçados de fusão que possuem tanto picos de correspondência total como picos de discrepância. A Figura 9 mostra a detecção e a discriminação de sequências polimórficas CYP2D6 *1 e *4, amplificadas a partir de amostras de ADN genómico, por análise de picos de fusão. 0 HyBeacon 2D64C* gera um pico de fusão único possuindo uma Tm de aproximadamente 60°C quando hibridado a 51 ADN homozigótico contendo alelos *1 totalmente complementares. A hibridação de sonda com discrepância a amostras homozigóticas *4 resulta num único pico de fusão com uma Tm de aproximadamente 49°C. As amostras heterozigóticas, contendo ambos os alelos *1 e *4, geram traçados possuindo ambos os picos de fusão a 60°C e 49°C. (viii) Identificação de amostras homozigóticas e heterozigóticas.

Considera-se importante que uma tecnologia para a identificação de SNPs seja capaz de identificar se uma amostra é homozigótica ou heterozigótica para um alelo particular. Verificou-se que a análise heterozigótica utilizando HyBeacons F-Q necessita de duas sondas distintas, que correspondem perfeitamente aos dois alelos de um SNP, para a identificação de amostras heterozigóticas. Pensa-se que são necessários dois HyBeacons uma vez que se verificou que as sondas geram tipicamente apenas picos de fusão com correspondência total em reacções contendo uma mistura de alvos totalmente complementares e com discrepâncias. Os picos de fusão com discrepâncias não são observados em reacções heterozigóticas, nas quais ou a ligação a um alvo totalmente complementar é favorecida termodinamicamente ou a análise de fusão revela a curva com correspondência total enquanto o pico com discrepância é mascarado. Se os dois HyBeacons possuem fluoróforos espectralmente distintos que pudessem ser excitados e detectados em simultâneo, poderiam ser realizados ensaios homogéneos de discriminação de heterozigóticos num único tubo utilizando sondas F-Q. No entanto, actualmente o LightCycler consegue apenas excitar a fluoresceína. Por isso, a análise de hibridação diferencial utilizando dois HyBeacons 52 distintos no mesmo capilar do LightCycler foi realizada utilizando sondas que possuem Tms significativamente diferentes. Foram utilizadas duas sondas HyBeacon F-Q, F17834 e F17835, de diferente comprimento e Tm isoladamente e em combinação para discriminar entre amostras NAT2 *4 e *5A homozigóticas e heterozigóticas (figura 10). As sondas F17834 e F17835 geram curvas de fusão com correspondência total possuindo Tms de aproximadamente 60°C e 52°C quando hibridadas, respectivamente com ADN *4 e *5A homozigótico. Quando se utilizam os Hybeacons F17834 e F17835 em combinação com um ADN misto, contendo sequências *4 e *5A (heterozigótico), formam-se dois picos de fusão possuindo Tms de aproximadamente 59°C e 52°C no mesmo traçado de fusão. A presença de dois picos num único traçado de fusão pode ser empregue como um indicador de heterozigosidade.

Uma caracteristica importante da tecnologia HyBeacon F é que, ao invés das sondas F-Q e sondas fluorescentes anteriormente apresentadas, as amostras homozigóticas e heterozigóticas podem ser identificadas com fiabilidade utilizando um único HyBeacon F. Sondas de fluorescência tais como sondas TaqMan™, faróis moleculares e iniciadores Scorpion, requerem tipicamente duas sondas para detectar e discriminar com fiabilidade sequências bialélicas por métodos de PCR em tempo real. Além disso, as sondas de hibridação requerem um par de oligonucleótidos fluorescentes para identificar ADN homozigótico e heterozigótico através de análise de curvas de fusão. As sondas HyBeacon podem distinguir com fiabilidade amostras homozigóticas e heterozigóticas através de análise de curva de fusão por determinação de Tm e pelo número de picos de fusão gerados. As Figuras 9 e 11 demonstram a identificação de amostras homozigóticas e heterozigóticas 53 através da análise de picos de fusão, na qual as amostras homozigóticas são identificadas por Tms especificos e as amostras heterozigóticas pela presença de dois picos com um único traçado de fusão. A Figura 11 ilustra as curvas de fusão derivadas de um HyBeacon F NAT2 *5C (DdeFLl) hibridado com alvos de ADN homozigóticos e heterozigóticos. Em testes homogéneos e heterogéneos, DdeFLl gera picos de fusão únicos com Tms de aproximadamente 54 °C e 47 °C com alvos homozigóticos, respectivamente, com correspondência total (*5C) e com discrepância (*4). Verificou-se que amostras heterozigóticas para os alelos *4 e *5C geram ambos os picos com correspondência total e com discrepância num único traçado de fusão. Deste modo, a presença de dois picos num traçado de fusão com HyBeacon permite a identificação fiável de amostras heterozigóticas. A capacidade de detectar ADN heterozigótico utilizando sondas HyBeacon depende da magnitude de ATm (a diferença em Tm entre hibridação com correspondência total e com discrepância). A Tabela 5 ilustra os valores de Tm e de ATm apresentados por sondas HyBeacon durante hibridação a genes polimórficos NAT2 e CYP. Foi desenvolvida uma sonda que permite a identificação fiável de amostras homozigóticas e heterozigóticas por análise de pico de fusão para cada um dos nove SNPs aqui investigados. É evidente que são necessários valores de ATm que excedem aproximadamente 5,2°C para detectar com fiabilidade a presença de ADN heterozigótico através de análise por curva de fusão. A ATm de hibridação depende do comprimento da sonda, da posição da discrepância nucleotidica e da identidade desta discrepância. 0 comprimento dos oligonucleótidos HyBeacon deverá ser suficiente para assegurar a especificidade da hibridação, mas não deverá ser 54 excessivo de modo a causar insensibilidade à discrepância. Deverão ser desenhados HyBeacons tais que nucleótidos polimórficos estejam localizados em direcção ao centro das sondas dado que discrepâncias em posições centrais originam efeitos maiores em Tm do que discrepâncias localizadas na terminação do oligonucleótido. Todas as discrepâncias nucleotidicas exibem efeitos de destabilização na Tm de hibridação, mas a magnitude da destabilização depende do tipo de interacção com discrepância. Interacções com discrepância envolvendo G (ou seja, G/T, G/A e G/G) são as mais estáveis à temperatura ambiente e discrepâncias contendo C (ou seja, C/T, C/A e C/C) são as menos estáveis. Deste modo, de modo a maximizar o efeito da discrepância em ATm, evitam-se discrepâncias envolvendo G e preferem-se discrepâncias envolvendo C.

Tabela 5. Valores de Tm e ATm derivados da hibridação de HyBeacon com sequências NAT2 e CYP, incluindo as interacções nucleotidicas com correspondência total e com discrepâncias que ocorrem na posição do polimorfismo. Os valores de Tm foram obtidos a partir de diferentes análises independentes para englobar variações experimentais e são incluídos os valores da média e do erro padrão. Os valores em itálico foram obtidos de hibridação a oligonucleótidos. A capacidade de identificar ADN heterozigótico é dependente do ATm e é identificada pela presença de ambos os picos de fusão de correspondência total e de discrepância num único traçado de fusão. 55

HyBeacon Inter-acções nucleo-tídicas Tm com correspondência total (média ± EP) Tm com discrepâncias (média ± EP) ATm Identificação de ADN heterozi- gótico? 2303002 C/G, C/A 63,1°C ± 0,1 55,2°C ± 0,1 7,9 Sim NAT2 *5 T/A, T/G 61,3°C ± 0,2 57,1°C ± 0,2 4,2 Não DdeFLl*4 A/T, A/C 53,2°C ± 0,2 42,4°C ± 0,1 10, 8 Sim DdeFLl G/A, G/T 54,1°C ± 0,1 47,6°C ± 0,1 6,5 Sim BamFLl G/C, G/T 57,6°C ± 0,6 (52,4°C) (5r 2) (Não) BamFLl*7 A/T, A/C (56, 7°c; 48,9°C ± 0,4 (7, 8) (Sim) 2D63C* T/A, T/Del 59,2°C ± 0,1 53,2°C ± 0,1 6, 0 Sim 2D63C G/C, G/Ins 59,3 °C ± 0,1 52,8°C ± 0,1 6,5 Sim 2D64C* C/G, C/A 60,4°C ± 0,1 49,3°C ±0,1 11, 1 Sim 2D64C T/A, T/G 56,8°C ±0,6 53,2°C ±0,4 3,6 Não C9*2C C/G, C/A 57,8°C ± 0,1 48,2°C ± 0,2 9,6 Sim 56 (continuação)

HyBeacon Inter-acções nucleo-tídicas Tm com correspondência total (média ± EP) Tm com discrepâncias (média ± EP) ATm Identificação de ADN heterozi- gótico? C9*2T T/A, T/G 54, 8°C ± 0,1 52,1°C ± 0,1 2,7 Não C9*3A T/A, T/C 54,5°C ± 0,1 45,5°C ± 0,2 9, 0 Sim C9*3C G/C, G/A 56,3°C ± 0, 2 50,9°C ± 0,1 5,4 Sim C19mlG G/C, G/T 54,4°C ± 0,1 48,7°C ± 0,2 5,7 Sim C19mlA A/T, A/C 52,9°C ± 0, 3 45,0°C ± 0,1 7,9 Sim C19m2G C/G, C/A 57,5°C ± 0,2 47,0°C ± 0,2 10, 5 Sim C19m2A T/A, T/G (56, 6°C) 51,5°C ± 0,3 5,1 (Não) (ix) Análise múltipla de SNPs. 0 potencial para a análise múltipla utilizando sondas HyBeacon foi examinado utilizando misturas de alvos de PCR específicos e não específicos. Os HyBeacons hibridam a alvos de ADN específicos amplificados ao longo do PCR, resultando em aumentos da emissão de fluorescência. Não ocorrem aumentos na emissão de fluorescência de HyBeacon com alvos de ADN não específicos que não possuem a sequência alvo da sonda. Analisaram-se diferentes proporções de cadeias moldes de PCR específicas e não específicas (100, 80, 60, 40, 20, 10 e 5% de sequência específica em ADN não específico) em testes 57 homogéneos para se testar a capacidade da sonda HyBeacon 2D64B detectar a amplificação do alvo especifico. Em reacções que amplificaram apenas o alvo especifico, ou seja, sem qualquer amplificação não especifica, todas as concentrações iniciais do alvo especifico foram rapidamente detectadas, com aumentos equivalentes na emissão de fluorescência (figura 12a) . No entanto, quando tanto alvos específicos como não específicos foram amplificados na mesma reacção, a capacidade da sonda detectar a amplificação específica diminuiu com a redução da proporção da cadeia molde de PCR específica (figura 12b). Os resultados retirados desta experiência sugerem que testes múltiplos com HyBeacon contendo até quatro ou cinco alvos distintos pode ser possível. No entanto, a utilização de fluoróforos com um sinal aumentado e instrumentos de detecção de maior sensibilidade podem permitir extensão até mais de cinco alvos na análise múltipla. A funcionalidade das sondas HyBeacon foi demonstrada até à data utilizando como corantes fluorescentes FAM, HEX e TET, em que cada sonda hibridada emite quantidades de fluorescência significativamente maiores do que HyBeacons de cadeia simples. Podem ser amplificadas, detectadas e discriminadas em simultâneo múltiplas sequências polimórficas com estes HyBeacons espectralmente distintos utilizando PCR em tempo real e análise de picos de fusão em tempo real. A Fig. 13a demonstra a amplificação simultânea e detecção específica dos alelos NAT2 *4 eCYP2D6 *1, num único poço de uma placa de microtitulação ABI PRISM 7700, utilizando, respectivamente, sondas HyBeacon marcadas com FAM e HEX. A identidade das sequências polimórficas pode também ser determinada utilizando sondas FAM, HEX e TET através da 58 determinação da temperatura de fusão. Um macro de Excel foi criado para converter os dados da curva de fusão obtidos do instrumento ABI PRISM 7700 em picos de fusão. A Fig. 13b apresenta os picos obtidos a partir das sondas 2D64C*, 2D64E e DdeFLl*4T marcadas, respectivamente, com os corantes FAM, HEX e TET. Os picos de fusão foram obtidos a partir de hibridação HyBeacon em oligonucleótidos complementares e alvos amplificados por PCR. (x) Optimização dos testes HyBeacon.

Podem ser modificados vários parâmetros do teste com HyBeacon para potencialmente melhorar a eficiência da detecção do alvo e discriminação de SNP. São aqui apresentados exemplos de condições de reacção que foram analisadas para a optimização do teste: a) Optimização do tampão: Após uma pequena quantidade de optimização de tampão, realizaram-se experiências heterogéneas de análise de fusão em 1,25 mM de Tris.Cl a pH 8,0, 250 nM de MgCl2, 25 nM de DTT. Mostrou-se que este tampão de hibridação gerava curvas de fusão de elevada qualidade com a maioria dos HyBeacons sintetizados até à data. No entanto, a sonda F17836 não originou curvas de fusão com este tampão, mesmo quando hibridada com alvos nucleotidicos. Mostrou-se que apesar de não serem obtidos picos de fusão com F17836 no tampão acima, foram obtidas curvas de fusão com muito boa qualidade em 50 mM de Tris, 3 mM de MgCÍ2. Além disso, demonstrou-se que existe uma correlação muito forte entre a concentração de MgCÍ2 e o pico de fusão. Esta relação foi estudada para os HyBeacons F17831, TB0993, F17834, F17835 e B9414, com os quais foram obtidos 59 valores R2 de, respectivamente, 98,9%, 97,9%, 99,4%, 99,3% e 98,8% em análises de regressão realizadas entre as concentrações de 0,1 mM e 10 mM (ver figura 14). Pode ser conseguido um desvio de mais de 10°C na Tm de HyBeacon através da alteração da concentração de MgCl2. Pode ser possível desenhar ensaios de hibridação de faróis diferenciais em que são seleccionadas Tms de HyBeacon específicas com base na composição do tampão.

Entre os tampões para PCR comercialmente disponíveis testados em testes de amplificação homogéneos, verificou-se que o tampão TaKaRa era o melhor. Os tampões de PCR Pharmacia, Taq Gold e TaKaRa e as correspondentes polimerases Taq, Taq Gol de Z-Taq foram comparados em relação às suas eficiências em testes com HyBeacon. Os testes realizados com o tampão e polimerase Taq Gold não funcionaram de todo, dado que não foram obtidas curvas de amplificação em tempo real nem picos de fusão. Ambos os tampões Pharmacia e TaKaRa produziram curvas de amplificação e picos de fusão com as polimerases Taq e Z-Taq. No entanto, o tampão TaKaRa produz tipicamente resultados superiores mesmo se for incluído MgCl2 adicional no tampão da Pharmacia. Quando se analisaram as eficiências de amplificação e de detecção utilizando o tampão de PCR Pharmacia com uma série de concentrações de MgCl2, observou-se a concentração óptima entre 3,0 mM e 3,5 mM. Sabe-se que o tampão TaKaRa contém 3,0 mM de MgCl2, mas os outros constituintes são desconhecidos. O kit Optiprime da Stratagene foi utilizado para obter uma indicação de quais os componentes e condições que são necessários para a optimização de testes PCR com HyBeacon. 0 kit Optiprime consiste em 12 tampões individuais de vários pHs (8,3, 8,8 e 9,2), contendo diferentes concentrações de MgCl2 (1,5 mM e 3,5 mM) e KC1 (25 mM e 75 mM) . A eficiência 60 de amplificação e detecção do alvo não foi significativamente afectada pelo pH, mas foi significativamente afectada pela concentração de MgCl2 e KC1, em que as concentrações óptimas foram, respectivamente, 3,5 mM e 25 mM (em lx tampão). Utilizando a informação obtida do kit Optiprime, foi construído um tampão PCR para HyBeacon lOx (100 mM de Tris.HCl a pH 8, 8, 250 mM de KC1 e 35 mM de MgCl2) . Verificou-se que este tampão funciona relativamente bem em ensaios HyBeacon, produzindo picos de fusão de elevada qualidade em análise pós-amplificação. No entanto, a magnitude dos aumentos de fluorescência resultando da análise em tempo real foi reduzida em comparação com as análises realizadas em tampão de PCR TaKaRa. Deste modo, foi adicionada uma série de adjuvantes de PCR ao tampão PCR para HyBeacon na tentativa de melhorar a eficiência de detecção do alvo em tempo real. Dos potenciadores putativos de PCR que foram examinados no tampão PCR para HyBeacon, apenas a BSA mostrou ter um profundo efeito positivo na eficiência da amplificação em tempo-real. Estudaram-se concentrações de trabalho de BSA entre 0 pg/pL e 1 pg/pL. O aumento da concentração de BSA de 0 yg/yL para 100 ng/yL aumentou significativamente a eficiência da detecção do alvo em tempo real. No entanto, como resultado do aumento das concentrações de BSA, a qualidade dos picos de fuso pós-amplif icação foi reduzida. Deste modo, procurou-se uma concentração óptima de BSA que permitisse uma melhor amplificação em tempo real mas que não diminuísse significativamente a qualidade do pico de fusão. Observou-se esta concentração de trabalho óptima entre 2,5 ng/pL e 5 ng/pL (ver figura 15) e, por isso, incluiu-se 50 ng/pL de BSA no tampão PCR para HyBeacon lOx. Demonstrou-se que este tampão funcionava com uma eficiência comparável à do tampão PCR TaKaRa. 61 b) Escolha do amplicon: Com a excepção de duas sondas F18140 e F18141, todos os HyBeacons testados geram curvas de fusão de muito elevada qualidade com homólogos oligonucleótidos. No entanto, nem todas estas sondas produzem fusões de elevada qualidade com alvos de PCR grandes. Alterações na dimensão do amplicon e na posição do iniciador em relação ao local do polimorfismo permite uma hibridação da sonda mais eficiente e a geração de melhores curvas de fusão. Foram observadas variações significativas na detecção da amplificação em "tempo real" e na eficiência da discriminação do pico de fusão para uma das sondas NAT2 *6 quando se utilizaram dois amplicons que diferiam apenas de 22 pb (figura 16). c) Temperatura de fusão da sonda: A Tm de um farol de hibridação pode afectar a qualidade das curvas de fusão pós-amplificação. Verificou-se que muitos dos HyBeacons iniciais que foram sintetizados e testados produziam um efeito de fluorescência ruído a aproximadamente 60-65°C. Verificou-se que diversos HyBeacon possuindo Tms com correspondência total superiores que aproximadamente 58°C tinham o seu pico de fusão de correspondência total mascarado por este efeito de fluorescência ruído, enquanto que os picos com discrepâncias com Tms mais baixas eram claramente visíveis no traçado de fusão. As sondas possuindo Tms com correspondência total de menos de 58°C têm um desempenho mais eficiente nas experiências de análise de fuso pós-amplificação. Foram desenhadas sondas HyBeacon F-Q e F para os polimorfismos CYP2D6 *3 e *4. 0 HyBeacon F CYP3D6 possuiu diversas vantagens em relação às sondas F-Q e gerou dados de amplificação por PCR em tempo real de elevada qualidade que permitiram a discriminação fiável de SNPs *3 e *4. No entanto, estas sondas HyBeacon F (2D63B e 2D64B) não geraram 62 picos de fusão de elevada qualidade devido a uma sobreposição significativa com um efeito fluorescência ruido. Deste modo, SNPs e amostras homozigóticas e heterozigóticas não puderam ser identificadas por análise de fusão com estas sondas de elevada Tm. Os HyBeacons *3 e *4 foram desenhados de novo de modo a serem mais curtos em, respectivamente, 2 (2D63C) e 3 (2D64C) nucleótidos, de modo que as Tms fossem significativamente reduzidas. Ambas estas sondas de Tm reduzidas geram curvas de amplificação em tempo real e picos de fusão pós-amplificação de elevada qualidade, permitindo a discriminação de SNPs e a análise heterozigótica extremamente fiáveis. Ao contrário das sondas 2D63B e 2D64B, as sondas 2D63C e 2D64C originam picos de fusão tanto com correspondência total como com discrepâncias durante a análise pós-amplificação, apresentando pouca ou nenhuma sobreposição com o efeito de fluorescência ruido. d) Concentração de HyBeacon: Verificou-se que a quantidade de HyBeacon incluída num teste afecta a qualidade dos resultados obtidos, através de variações nas razões sinal:ruído de fluorescência. Se for incluído um excesso de sonda num ensaio, a fluorescência ruído mascara as alterações de fluorescência mediadas pela hibridação. Foram várias vezes observadas curvas de fusão de qualidade superior quando se utilizaram concentrações reduzidas de HyBeacon. A concentração óptima de sonda HyBeacon F, que permite a obtenção de dados de amplificação em tempo real e picos de fusão pós-amplificação de elevada qualidade, está tipicamente entre 100 e 300 nM. As concentrações reduzidas de HyBeacon parecem eliminar o efeito de fluorescência ruído descrito acima. 63 e) PCR assimétrico: Todos os ensaios HyBeacon até agora descritos utilizaram protocolos de PCR simétrico para amplificar alvos de ADN de cadeia dupla. As sondas que hibridam com ADNs de cadeia dupla devem competir com a cadeia homóloga do alvo, de tal modo que esta ligação competitiva pode reduzir a eficiência de hibridação do HyBeacon. 0 PCR assimétrico é uma técnica que é utilizada para gerar produtos de PCR de cadeia simples. Os HyBeacons podem hibridar com alvos de cadeia simples com maior eficiência do que a moléculas de cadeia dupla devido à ausência da cadeia de ADN competidora. Utilizou-se PCR assimétrico a oito testes de SNP com HyBeacon, de modo a examinar se a técnica é superior a da amplificação simétrica. Quatro dos oito testes HyBeacon possuiam eficiências de detecção equivalentes em amplificações simétricas e assimétricas, com aumentos de emissão de fluorescência similares. Um teste HyBeacon demonstrou uma eficiência reduzida em testes assimétricos em comparação com amplificações simétricas (figura 17a), enquanto nos outros três testes verificou-se um maior aumento da emissão de fluorescência com uma amplificação assimétrica do que com PCR simétrico (figura 17b). Além disso, muitos destes testes HyBeacon produziram curvas de fusão pós-amplificação superiores com alvos amplificados de forma assimétrica em comparação com as reacções simétricas (dados não mostrados). Deste modo, nalguns casos pode ser benéfico adoptar uma amplificação assimétrica do alvo para potencialmente obter testes de discriminação de SNP com maior sensibilidade No entanto, o mecanismo que gera ADNs de cadeia simples é linear em vez de logarítmico, pelo que a detecção da amplificação e discriminação de SNPs é conseguida a um número de ciclos significativamente superior (figura 17b) do que para as amplificações simétricas. Este aumento no limite 64 inferior de ciclos poderá aumentar a duração do teste e pode afectar reacções contendo baixas concentrações de ADN genómico. (xi) Discriminação de SNPs numa fase sólida.

Amplificaram-se alvos polimórficos ΝΆΤ *2 e *5A a partir de ADN genómico utilizando um indicador biotinilado com a mesma sequência que 195993' ou 195991. Os produtos de PCR biotinilados foram imobilizados em placas de microtitulação de 96 poços revestidos com estreptavidina. Os alvos de ADN foram desnaturados com NaOH e a cadeia de PCR não biotinilada foi removida, deixando um alvo de ADN de cadeia simples ligado à superfície do poço. As sondas HyBeacon, tipicamente F17832 e 0203002, foram hibridadas com os alvos de cadeia simples imobilizados. Após a hibridação, removeu-se o excesso de sonda e realizou-se uma análise de fusão utilizando um instrumento DASH (Dynamic Allele Specific Hybridisation -Hybaid). As curvas de fusão de HyBeacon foram obtidas a partir de alvos imobilizados com correspondência ou com discrepância, permitindo a discriminação fiável de SNPs (figura 18). O HyBeacon F17832 produziu curvas de fusão de fraca qualidade em ensaios heterogéneos em LightCycler. No entanto, conseguiu-se uma boa análise de fusão e discriminação de SNP com esta sonda no instrumento DASH. As análises de fusão em LightCycler e DASH utilizam, respectivamente, alvos de cadeia dupla e de cadeia simples. São obtidas curvas de fusão de qualidade significativamente superior a partir de alvos de cadeia simples devido à ausência de homólogo de PCR que compita como HyBeacon para a hibridação do alvo. A utilização com sucesso de HyBeacon em ambos os formatos homogéneo e em fase sólida proporciona um 65 sistema versátil no qual podem ser realizados elevadas quantidades de testes, potencialmente numa forma de sistema em matriz. (xii) A actividade exonuclease 5'-3' da Taq polimerase.

De modo a assegurar que os ensaios HyBeacon são distintos do sistema TaqMan, foram testadas duas ADN polimerases, Deep Vent (New England Biolabs) e fragmento Stoffel (Pharmacia), que não têm actividade de exonuclease 5'-3', em ensaios de amplificação em tempo real. A actividade de exonuclease 5'-3' é essencial nos testes TaqMan, nos quais é necessária a Taq polimerase para digerir especificamente as sondas TaqMan entre as porções fluoróforo e quencher, causando aumentos na emissão de fluorescência na presença de alvos com correspondência perfeita. As polimerases Deep Vent e fragmento Stoffel foram utilizadas em ensaios de amplificação homogénea para testar a capacidade de uma sonda HyBeacon F NAT2 *4 detectar a amplificação do alvo na ausência de actividade de 5'-3' exonuclease (figura 19). As reacções que continham ambos os tipos de polimerase apresentaram aumentos na emissão de fluorescência com cadeias molde com correspondência total ao longo da amplificação, enquanto que reacções contendo uma cadeia molde com discrepâncias não geraram aumentos de fluorescência. A discriminação de SNP pode ser conseguida nos formatos "tempo real" e de pós-amplificação com polimerases Deep Vent e fragmento Stoffel. Deste modo, estes resultados indicam que o mecanismo pelo qual os HyBeacons F detectam as sequências de ADN por PCR em tempo real é distinto daquele do teste com exonuclease 5'-3', baseando-se nos aumentos da emissão de fluorescência causados directamente pela hibridação da sonda em vez da separação enzimática das porções fluoróforo e quencher. (xiii) PCR quantitativo utilizando sondas HyBeacon.

A capacidade de monitorizar o andamento em "tempo real" da amplificação por PCR revoluciona por completo as abordagens pelas quais a quantificação de ADN e ARN com base em PCR pode ser realizada. Nas experiências de PCR quantitativas em "tempo real", as reacções são caracterizadas por um determinado ponto no tempo durante os ciclos no qual a amplificação de um produto de PCR é detectada pela primeira vez (CT - ciclo limite) em vez do que a quantidade de produto de PCR acumulado após um número fixo de ciclos. Quanto maior for o número de cópias inicial do ácido nucleico alvo, mais cedo se observa um aumento significativo na fluorescência. 0 potencial das sondas HyBeacon para quantificar ADN alvo em amplificações em "tempo real" foi examinado utilizando os HyBeacon F 2D64B, 2D64C* e DdeFLl. As análises de PCR quantitativo com os HyBeacon foram conduzidas com os instrumentos LightCycler e ABI 7700. Foram utilizadas como moldes para a amplificação por PCR homogénea gamas de padrões de ADN (concentrações conhecidas de produto de PCR ou de ADN genómico). 0 ciclo limite para cada padrão de ADN foi medido e o logaritmo das concentrações de ADN foi representado em função de CT de modo a gerar curvas padrão "rectas". Os ciclos limite obtidos de amostras contendo concentrações desconhecidas de ADN genómico foram representadas na curva padrão para calcular a concentração de ADN presente nestas reacções. As curvas padrão derivadas de PCRs quantitativos HyBeacon foram de qualidade muito elevada com ambos os instrumentos LightCycler e ABI 7700, possuindo coeficientes de correlação entre 0,93 e 0,99 (figura 20). O cálculo da 67 concentração de ADN a partir destas curvas padrão foi moderadamente preciso para as reacções "desconhecidas" testadas, para as quais as concentrações calculadas estavam na ordem de grandeza correcta. Por exemplo, amostras "desconhecidas" 5,4 x 104 ng/pL, 700 ng/pL e 90 ng/pL tinham concentrações, respectivamente, de 6,9 x 104 ng/pL, 1406 ng/pL e 115 ng/pL, calculadas a partir das curvas padrão do LightCycler. Enquanto que amostras genómicas de 285 ng/pL, 163 ng/pL e 53 ng/pL foram calculadas como sendo 256 ng/pL, 137 ng/pL e 44 ng/pL, com curvas padrão derivadas do ABI 7700. (xiv) Detecção e discriminação de sequências alvo sem extracção prévia de ADN. A obtenção de um fenótipo a partir de uma amostra de um paciente, tal como sangue ou uma zaragatoa bucal, tipicamente requer que o ADN genómico seja extraído antes da amplificação por PCR e análise a jusante. Os protocolos de extracção de ADN podem ser morosos, laboriosos e caros. Deste modo, para reduzir a duração e o custo das análises por HyBeacon, realizou-se a amplificação directa a partir de ADN de saliva, removendo a necessidade de se realizar extracção de ADN. Combinada com as condições rápidas de ciclos térmicos do LightCycler, a amplificação directa do alvo a partir da saliva permite a genotipagem de sequências polimórficas em 35-40 minutos

As sequências polimórficas NAT2 *4 e *5C foram amplificadas de 10 amostras de saliva e analisadas com HyBeacons DdeFLl e DdeFLl*4, que são totalmente complementares, respectivamente, aos alelos *5C e *4. As figuras 21 e 22 ilustram os dados de 68 PCR em tempo real e os picos de fusão derivados da hibridação de DdeFLl e DdeFLl*4 a sequências de ADN amplificadas a partir dos genótipos *5C/*5C (amostra 1), *4/*4 (amostra 2) e *4/*5C (amostra 3) . A Tabela 6 apresenta as temperaturas de fusão de HyBeacon derivadas da hibridação de DdeFLl e DdeFLl*4 a sequências polimórficas NAT2. Os dados de PCR em tempo real e de Tm permitem a determinação de um genótipo de um indivíduo, em relação ao polimorfismo *5C. Das 10 amostras de saliva analisadas, 3 foram classificadas como sendo homozigóticas para o alelo *5C, 1 foi caracterizada como sendo homozigótica para o alelo *4 e verificou-se que 6 eram heterozigóticas. Estes genótipos, no local do gene NAT2 *5C, correlacionam-se, respectivamente, com fenótipos de acetilação lenta, rápida e intermédia. De modo a se confirmar estes genótipos e fenótipos obtidos através da análise por HyBeacon de amostras de saliva, foi realizada análise por RFLP para as amostras 1-3 (figura 23) . Um produto de PCR de 179 pb amplificado de ADN *4/*4 contém um único local de restrição Ddel, o qual após digestão resulta em fragmentos de 121 pb e 58 pb. O polimorfismo *5 origina um local de restrição Ddel adicional, de tal modo que a digestão do produto de 179 pb amplificado a partir do ADN *5C/*5C resulta em fragmentos de 98 pb, 58 pb e 23 pb. A digestão do produto amplificado a partir de amostras heterozigóticas de saliva resulta em fragmentos de 121 pb, 98 pb, 58 pb e 23 pb. As amostras de saliva 1-3 são tipadas como, respectivamente, como sendo homozigóticas *5C, homozigóticas *4 e heterozigóticas tanto por RFLP como através das metodologias HyBeacon. Deste modo, os dados aqui apresentados demonstram que a amplificação, detecção e discriminação fiável de sequências polimórficas podem ser realizadas sem necessidade de purificação de ADN de elevada qualidade. 69

Tabela 6. Valores de Tm derivados análise de curva de fusão das sequências NAT2 *4 e *5C. Os HyBeacons DdeFLl e DdeFLl*4 correspondem totalmente, respectivamente, aos alelos *5C e *4. As médias e os erros padrão de picos de fusão com correspondência total e discrepâncias são detalhados para cada amostra de saliva e para todas as amostras colectivamente. NP indica a ausência de um pico particular num dado traçado de fusão e indica que o teste com

DdeFLl*4 não foi realizado para uma amostra de saliva particular.

Amostra de saliva DdeFLl (media SC ± EP) DdeFLl*4 (media SC ± EP) Genótipo Fenótipo de aceti-lação associado Tml Tm2 Tml Tm2 1 NP 53,8 ± 42,0 ± NP Sld/Sld Lento 0.1 0,3 2 47,5 NP NP 52,1 Fl/Fl Rápido ± ± 0,1 0,1 3 47, 4 54,1 ± 42.6 ± 52.4 Sld/Fl Intermédio ± 0.1 0.1 ±0.5 0,1 4 47, 9 54,2 ± - Sld/Fl Intermédio ± 0,1 0,1 5 47, 7 54,1 ± - Sld/Fl Intermédio ± 0,2 0,1 70 (continuação)

Amostra de saliva DdeFLl (media 2C ± EP) DdeFLl*4 (media 2C ± EP) Genótipo Fenótipo de aceti-lação Tml Tm2 Tml Tm2 associado 6 NP 53,8 ± 0.2 42,3 ± 0,3 Sld/Sld Lento 7 47,9 ± 0,3 54,1 ± 0,2 Sld/Fl Intermédio 8 47,9 + 0,2 54,2 ± 0,1 Sld/Fl Intermédio 9 47, 7 + 0,0 54,1 ± 0,1 Sld/Fl Intermédio 10 NP 54,2 ± 0,1 — — Sld/Sld Lento Total 47.6 ± 0,1 54,1 ± 0,1 42,4 ± 52,3 0,1 ± 0,2 (xv) Detecçao de sequências de ARN.

Foi aferido o potencial para a detecção de alvos de ARN. Inicialmente, uma sonda HyBeacon foi desenhada para detectar um produto de RNA NASBA (método de amplificação isotérmica de ácidos nucleicos). Este produto não foi detectado pela geração de picos de fusão HyBeacon em análises de curva de fusão, possivelmente devido à degradação do produto ARN. Deste modo, os homólogos oligonucleotidicos consistindo em 71 ADN ou ARN foram sintetizados para analisar a hibridação da sonda HyBeacon. Inicialmente, derivaram-se picos de fusão do alvo ADN mas não do oligonucleótido ARN. Apenas quando a concentração do alvo ARN foi aumentada para 2 μΜ se originaram picos de fusão caracteristicos da hibridação da sonda (dados não apresentados). Demonstrou-se que a temperatura de fusão dos complexos HyBeacon/ARN é significativamente reduzida quando comparada com os complexos HyBeacon/ADN, sugerindo que a hibridação com ARN é significativamente menos estável do que a hibridação com ADN. Por isso, a não ser que se possam gerar elevadas concentrações de alvos ARN, as sondas HyBeacon podem não ser capazes de os detectar com fiabilidade. (xvi) Mecanismo de detecção da sequência A hibridação de sondas HyBeacon a sequências alvo de ADN complementares resulta em alterações significativas na quantidade de emissão de fluorescência apesar da ausência de porções quencher na sonda. Mostrou-se que os resíduos nucleotídicos, especialmente a guanina, afectam a emissão de fluorescência através de mecanismos de decaimento estáticos e dinâmicos. Por isso, o decaimento da fluorescência de HyBeacon poderia potencialmente ser originado da componente oligonucleótido a sonda através de eventos de empilhamento base-corante e transferência de electrões. A hibridação de HyBeacon com sequências alvo pode alterar a orientação da porção fluoróforo em relação à componente oligonucleótido, afectando a quantidade de transferência de electrões entre o corante e a base. Alternativamente, alterações no empilhamento base-corante resultante da formação de complexos de duas cadeias, por exemplo, intercalação do fluoróforo na 72 pilha de bases, pode alterar a quantidade de quenching de fluorescência. Quando as sondas HyBeacon hibridam as sequências de ADN alvo, um desvio de conformação pode aliviar uma quantidade pequena mas detectável de decaimento de fluorescência imposto pelo oligonucleótido HyBeacon. 0 decaimento reduzido resulta num aumento da quantidade de emissão de fluorescência, permitindo a detecção de sequência e a discriminação de alelos. De modo a se investigar o mecanismo molecular através do qual funcionam as sondas HyBeacon, podem ser utilizadas técnicas espectroscópicas de fluorescência e u.v. para analisar possíveis alterações de rendimento quântico, tempo de vida de fluorescência e comprimento de onda de fluorescência que ocorre entre os estados em cadeia simples e em complexo e duas cadeias.

Conclusões

Demonstrou-se que os faróis de hibridação (HyBeacons) detectam sequências de ADN específicas através de aumentos na emissão de fluorescência que são gerados como resultado directo da hibridação da sonda com sequências alvo complementares. A quantidade de emissão de fluorescência e o Tm de complexos sonda/alvo permite a discriminação de SNPs em oligonucleótidos e sequências de PCR amplificadas. Os resultados aqui apresentados mostram que os testes HyBeacon permitem a identificação de amostras homozigóticas e heterozigóticas utilizando uma única sonda e que a utilização de múltiplas sondas HyBeacon num teste de um único tubo/poço tem o potencial para análise múltipla. Além disso, mostrou-se que os HyBeacons quantificam alvos de ADN em ensaios de PCR em "tempo real". 73

As sondas HyBeacon são uma alternativa aos sistemas comerciais actualmente disponíveis (faróis moleculares, Scorpions, sondas FRET e sondas TaqMan™) para a detecção de sequências, discriminação de SNP e quantificação de ADN. Os ensaios de detecção utilizando HyBeacon são atractivos devido ao seu modo de acção simples, ausência de estrutura secundária e de necessidade de um enzima bem como da capacidade que têm em identificar ADN heterozigótico utilizando uma única sonda.

Podem ser realizados testes de diagnóstico molecular através de um método HyBeacon homogéneo (tal como descrito acima), no qual a amplificação e a detecção do alvo são realizadas num único tubo. Alternativamente, o isolamento robotizado do alvo amplificado ou a imobilização em fase sólida, seguido de substituição do tampão e adição de HyBeacon, pode formar um sistema de detecção de elevado débito. Puderam ser realizados testes de hibridação diferencial nos formatos microarray e macro array, nos quais ou as sondas ou, preferentemente, os alvos são imobilizados antes da análise de fusão com HyBeacon.

As sondas da invenção contêm um fluoróforo com base em fluoresceína sem um quencher associado (HyBeacons F) e foram avaliados em comparação com sondas contendo tanto porções fluoróforo como porções quencher (HyBeacons F-Q). Os HyBeacons F-Q não fazem parte da invenção aqui reivindicada. Mostrou-se que ambos os tipos de sonda discriminam com fiabilidade SNPs em formatos homogéneos ou heterogéneos. No entanto, os HyBeacons F têm vantagens óbvias em relação ao desenho F-Q: 74 * Actualmente, as porções fluoróforo e quencher podem apenas ser posicionadas nos resíduos T. Deste modo, os HyBeacons F são significativamente mais directos de se desenhar com constrangimentos reduzidos, de tal modo que o número de resíduos que separa as porções fluoróforo e quencher e possíveis efeitos de disposição angular não necessitam de ser considerados. * Devido à ausência de um quencher, os HyBeacons são mais baratos de sintetizar e os testes necessitam aproximadamente cinco vezes menos sonda por reacção (menos de 200 nM) em comparação com as sondas F-Q. * Os HyBeacons F demonstraram ter o potencial para gerar curvas de fusão pós-amplificação de qualidade superior em ensaios homogéneos em "tempo real". * Ao contrário com as duas sondas F-Q necessárias para a análise heterozigótica, os HyBeacons mostraram poder identificar amostras heterozigóticas utilizando uma única sonda.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> LGC (Teddington) Limited <120> Farol de hibridação e método de detecção e discriminação rápida de sequência <130> 2658wo <140> PCT/GB/01430 <141> 2001-02-28 <150> GB0007622.4 75 <151> 2000-03-29 <160> 60 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 1 gaatctggta ucuggaccaa 20

<210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 2 gaatctggua tcuggaccaa 20

<210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA 76 < 4 Ο Ο > 3 gaatcuggta tcuggaccaa 20

<210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 4 gaatcuggta ccuggaccaa 20

<210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial:SONDA <400> 5 gaatcugcta ccuggaccaa 20

<210> 6 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220>

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<210> 7 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 7 gatttggtcc agguaccaga utc 23

<210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 8 gatutggtcc agguaccaga ttc 23

<210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 9 78 gatutggtcc agguaccaga ttc 23

<210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 10 gagaggaatc uggtaccugg acc 23

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

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<211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 12 79 cutgaaccuc gaacaattga ag 22 <210> <211> 13 22

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial:SONDA <400> 13 cttgaaccuc gaacaautga ag 22 <210> <211> 14 22

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 14 <210> 15 <211> 22 cttgaaccuc gaacaatuga ag 22

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 15 80 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <223> cttcaattgu tcgaggutca ag 22 16 22

ADN

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Descrição de Sequência Artificial: SONDA 16 cttcaautgt tcgaggutca ag 22 17 22

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Descrição de Sequência Artificial: SONDA 17 cttcaautgt ttgaggutca ag 22

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Descrição de Sequência Artificial: SONDA 18 81 <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <223> <400> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <223> gaagtgcuga gaaauatatt taag 24 19 23

ADN

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Descrição de Sequência Artificial: SONDA 19 gatttggtcc agguaccaga utc 23 20 23

ADN

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Descrição de Sequência Artificial: SONDA 20 gatutggtcc agguaccaga ttc 23 21 20

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Descrição de Sequência Artificial: SONDA 21 82 <400> gaatcuggta ccuggaccaa 20

<210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 22 gaatcuggta ctuggaccaa 20 <210> 23 <211> 21 <212> ADN <213>Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial:SONDA <400> 23 cccaggucat cctgugctca g 21

<210> 24 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 24 83 ggggcgtccu gggggugg 18

<210> 25 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 25 gagaggaatc uggtacctgg acc 23

<210> 26 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 26 gagaggaatc uggtacttgg acc 23

<210> 27 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 27 gaagtgcuga aaaatatatt taag 24 84 < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > < 210 > < 211 > <212> <213> < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> <400 < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > < 2 2 0 > <223> < 2 2 0 > <223> < 4 0 0 > 28 24

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Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: 28

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 28 gaagtgcuga gaaatatatt taag 24 29 24

ADN

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Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial:SONDA 29 gaagtgcuga aaaatatatt taag 24 30 22

ADN

Sequência Artificial

Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 30 cttcaautgt tcgaggttca ag 22 31 85 < 210 >

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 31 cctggtgaug gatcccttac 20

<210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 32 cctggtgaug aatcccttac 20

<210> 33 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 33 cccaggucat cctgtgctc 19 86 < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > < 210 > < 211 > <212> <213> < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > 34 21

ADN

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Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 34 cccaggucat cctgtgctca g 21

35 18 ADN

Sequência Artificial

Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 35

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Sequência Artificial

Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 36 gggcgucctg ggggtg 16 37 87 < 210 >

<211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 37 ggggcgucct gggggtggg 19

<210> 38 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 38 gggcgtctug ggggtg 16

<210> 39 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <210> 39 gggcgucctg ggggtg 16 88 < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > < 210 > < 211 > <212> <213> < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > 40 20

ADN

Sequência Artificial

Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 40 cattgaggac cgugttcaag 20

41 20 ADN

Sequência Artificial

Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 41 cattgaggac tgugttcaag 20

42 20 ADN

Sequência Artificial

Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial:SONDA 42 gaaggucaat gtatctctgg 20 89 < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > < 210 > < 211 > <212> <213> < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > < 2 2 Ο > <223> < 2 2 Ο > <223> < 4 Ο Ο > 43 20

ADN

Sequência Artificial

Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 43 gaaggucaag gtatctctgg 20

44 19 ADN

Sequência Artificial

Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 44 gattattucc cgggaaccc 19

45 19 ADN

Sequência Artificial

Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA

Descrição de Sequência Artificial: SONDA 45 gattattucc caggaaccc 19 90

<210> 46 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 46 taccuggatc cagggggtg 19 <210> 47 <211> 19

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Molécula Combinada ADN/ARN: SONDA <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: SONDA <400> 47 taccuggatt cagggggtg 19

<210> 48 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR <400> 48 ctgctctctc ctgatttggt cc 22 <210> 49 <211> 21 91 <212> <213> ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR < 4 0 0 > 49 cctctagaat taatttctgg g 21 <210> <211> <212> <213> 50 24 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR < 4 0 0 > 50 cctatagaaa attcaattat aaag 24 < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > 51 20 ADN Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR < 4 0 0 > 51 cacgagattt ctccccaagg 20 < 210 > < 211 > < 212 > < 213 > 52 20 ADN Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR < 4 0 0 > 52 92 cctgccaaaq aaqaaacacc 20

<210> 53 <211> 23 <212> ADN <213, Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR <400> 53 gtattcatag actcaaaatc ttc 23

<210> 54 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR <400> 54 gaagaggttg aagaagtgct g 21

<210> 55 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR <400> 55 caagggttta ttttgttcct tattc 25

<210> 56 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 93 <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR <400> 56 ccaccgtggc agccactctc 20

<210> 57 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR <400> 57 ccagctggat gagctgctaa c 21

<210> 58 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR <400> 58 cgaagcggcg cccgcagg 18

<210> 59 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: INICIADOR <400> 59 gggacgggga aggcgacc 18 <210> 60 94

<211> 930 <212> ADN <213> GENE ΝΑΤ 2 HUMANO CONTENDO SNP's <400> 60 atggaoattg caaattggaç aagcatattt 60 tgaaagaatt ggctataaga actctaggaa ttggaaaçat tgagaacctt taactçacat 120 tcttgagçae cagatççqgg ctgttccctt aacatgcatt tcacattgta gtgggcaagc 180 ca tggagttg ggcttagagg ctatttttga agaagaaaec ggctctgacc ggggfcgggtg 240 qtqtctocao gtcaatcaac ttctgtactg acaatcggtt agttaacaaa ttcagaccac 300 aatgttagga gggtattttt acatccctcc tacagcactg gaattacatt gcatggttca 360 ccttctcctg caggtgacca ttgacggcag gtcgatgct.g aatttctggg ggtctggaag 420 ctectcccag atgtggcagc ctctagaatt aaggatcagc aatctggtac ctcaggtgcc 480 ttgcattttc tgcttgacag aagsgagagg ct.ggaccaaa ttctcatctc tcággagaga 540 gcagtatatt acaâãcaãag aatttcfctaa ctgccaaaga aaèáat.tgaa agaaacacca 600 3. ca ci α Bi tl â 13 C ttatttacgc ttgaacctcg gattttgagt tataaccaca ctatgâatae 660 atacctgcág acgtctccaa catcttcatfc tcattttgtt. catcctcacc cottgcagac 720 cccagaaggg gtt tactgtt tggtgggctt tãtagââaat tcteactgag gaagaggttg aaatctcgtg cccaaacctg acccttgtgt atgçatcacc 930 tcaattataa agacaataoa gatctggtcg agtttaaaac 780 aagaagtgct gaaaaatata tttaagattt ccttgggoag 840 gtgatggatc ccttactatt tagaataagg aacaaaataa 900 caac teacta a t tatcaael 18-04-2011 95

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um farol de hibridação que é um oligonucleótido em que (a) o oligonucleótido não tem estrutura secundária proveniente de uma região do oligonucleótido que híbrida com outra, (b) o oligonucleótido é formado por resíduos nucleotídicos dos quais mais do que um é marcado com um repórter fluorescente em que o farol não inclui um quencher associado e o repórter é seleccionado do grupo de 6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína e hexaclorofluoresceína, (c) os resíduos nucleotídicos marcados com o repórter estão posicionados internamente no interior da sequência oligonucleotídica, (d) o oligonucleótido é totalmente complementar a um alelo da ADN genómico humano com um polimorfismo conhecido no local de ligação do oligonucleótido, e (e) a sonda oligonucleotídica é modificada na sua terminação 3' de modo a prevenir a extensão da cadeia durante a amplificação por PCR. 2. 0 farol de hibridação da reivindicação 1, caracterizado pelo polimorfismo ser uma mutação pontual ou uma inserção ou deleção de uma única base. 3. 0 farol de hibridação da reivindicação 1 ou da reivindicação 2, caracterizado pelo polimorfismo conhecido ser complementar a um resíduo nucleotídico localizado centralmente no interior da molécula do farol de hibridação. 4. 0 farol de hibridação de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por estar imobilizado num suporte.
2. 5. Uma matriz de sondas oligonucleotídicas imobilizadas em localizações espaçadas sobre ou no interior de um suporte, 1 caracterizada por diferentes sondas oligonucleotídicas são diferentes faróis de hibridação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
3. 6. Utilização de um farol de hibridação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para detectar polimorfismos em ADN humano.
4. 7. Um método para preparar um farol de hibridação que é um oligonucleótido, compreendendo o método: (i) a selecção de um alvo polinucleotídico; (ii) o desenho de um oligonucleótido que é totalmente complementar ao alvo polinucleotídico e em que (a) o oligonucleótido não tem estrutura secundária proveniente de uma região do oligonucleótido que hibrida com outra, (b) o oligonucleótido é formado por resíduos nucleotídicos dos quais mais do que um é marcado com um repórter fluorescente em que o farol não inclui um quencher associado e o repórter é seleccionado do grupo de 6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína e hexaclorofluoresceína, (c) os resíduos nucleotídicos marcados com o repórter estão posicionados internamente no interior da sequência oligonucleotídica, e (d) a sonda oligonucleotídica é modificada na sua terminação 3' de modo a prevenir a extensão da cadeia durante a amplificação por PCR; e (iii) a síntese do referido farol e hibridação.
5. 8. Método de investigação de um alvo polinucleotídico, compreendendo: (i) proporcionar um farol de hibridação que é um oligonucleótido em que (a) o oligonucleótido não tem estrutura secundária proveniente de uma região do 2 oligonucleótido que híbrida com outra, (b) o oligonucleótido é formado por resíduos nucleotídicos dos quais mais do que um é marcado com um repórter fluorescente em que o farol não inclui um quencher associado e o repórter é seleccionado do grupo de 6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína e hexaclorofluoresceína, (c) os resíduos nucleotídicos marcados com o repórter estão posicionados internamente no interior da sequência oligonucleotídica, e (d) o oligonucleótido é totalmente complementar ao alvo polinucleotídico, e (e) a sonda oligonucleotídica é modificada na sua terminação 3' de modo a prevenir a extensão da cadeia durante a amplificação por PCR; (ii) incubação do alvo polinucleotídico com o farol de hibridação para formar um híbrido, apresentando o farol de hibridação um nível mais elevado de sinal quando na forma do híbrido do que quando em forma de cadeia simples; e (iii) observação do nível do sinal do farol de hibridação a uma temperatura predeterminada, ou ao longo de uma gama de temperaturas, próximas da temperatura de fusão do híbrido.
6. 9. Um método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo alvo polinucleotídico ter um polimorfismo conhecido ou suspeitado.
7. 10. O método das reivindicações 8 ou 9, caracterizado por ser usado para detectar, identificar ou quantificar a presença ou a quantidade de sequência alvo presente numa amostra. 3 11. 0 método de qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo farol de hibridação ter uma sequência complementar a um alelo do polinucleótido alvo.
8. 12. O método da reivindicação 11, caracterizado por se proporcionarem dois ou mais faróis de hibridação diferentes, cada um com uma sequência complementar a diferentes alelos do polinucleótido alvo.
9. 13. O método de qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pela temperatura predeterminada, à qual o nível do sinal do farol de hibridação é observado, ser intermédia em relação à temperaturas de fusão dos híbridos formados com os diferentes alelos do alvo polinucleotídico. 14. 0 método de qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pela gama de temperaturas, ao longo da qual o nível do sinal do farol de hibridação é observado, abranger a temperatura de fusão do híbrido. 15. 0 método de qualquer uma das reivindicações 8 a 12 e 14, caracterizado por se realizar a observação da velocidade de alteração do nível de sinal com alteração da temperatura. 16. 0 método de qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizado pelo alvo polinucleotídico ser um amplimer de PCR.
10. 17. O método de qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pela amplificação do alvo polinucleotídico ser realizada na presença do farol de hibridação. 4 18. 0 método da reivindicação 17, caracterizado pela amplificação do polinucleótido ser realizada por reacção da polimerase em cadeia (PCR), reacção da ligase em cadeia (LCR), amplificação com remoção de cadeia (SDA), amplificação mediada por transcrição (TMA), amplificação por circulo rolante (RCA) ou amplificação baseada na sequência de ácidos nucleicos (NASBA). 19. 0 método das reivindicações 17 ou 18, caracterizado pro se realizar a observação do sinal do farol de hibridação durante a amplificação do alvo polinucleotidico.
11. 20. O método de qualquer uma das reivindicações 8 a 19, caracterizado pelos faróis de hibridação são utilizados para detectar e discriminar alvos amplificados de amostras, tais como saliva, sem extracção prévia de ADN. 21. 0 método de qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pela reacção de PCR ser uma amplificação assimétrica.
12. 22. O método de qualquer uma das reivindicações 8 a 21, caracterizado pelo farol de hibridação, a sequência alvo, ou ambos estarem imobilizados num suporte.
13. 23. O método de qualquer uma das reivindicações 8 a 22, caracterizado pelo método ser usado na diferenciação entre alvos polinucleotidicos homozigóticos e heterozigóticos. 18-04-2011 5