ES2934982T3 - Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios - Google Patents

Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios Download PDF

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Abstract

La presente divulgación proporciona composiciones, métodos y kits para generar un conjunto de códigos de barras combinatorios, y usos de los mismos para codificar con barras muestras tales como células individuales o fragmentos de ADN genómico. Algunas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan composiciones que comprenden un conjunto de códigos de barras de componentes para producir un conjunto de códigos de barras combinatorios. El conjunto de códigos de barras de componentes puede comprender, por ejemplo, nxm códigos de barras de componentes únicos, en los que nym son números enteros, cada uno de los códigos de barras de componentes comprende: una de n secuencias de subunidades de código de barras únicas; y una o dos secuencias enlazadoras o sus complementos, en el que los códigos de barras componentes están configurados para conectarse entre sí a través de una o dos secuencias enlazadoras o sus complementos para producir un conjunto de códigos de barras combinatorios. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 62/140,360, presentada el 30 de marzo de 2015, y la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 62/152,644, presentada el 24 de abril de 2015
REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado BDCRI-013WO_SEQLISTING.TXT, creado el 28 de marzo de 2016, que tiene un tamaño de 695 bytes. La información en el formato electrónico del listado de secuencias se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
ANTECEDENTES
La miniaturización y el procesamiento paralelo de reacciones individuales han llevado a dramáticas reducciones de costes y aumentos de rendimiento en experimentos y mediciones científicas modernas. La codificación con códigos de barras de ácidos nucleicos puede comprender métodos en los que los ácidos nucleicos de cada muestra se marcan de manera distintiva usando una cadena de secuencias (también conocida como secuencia de código de barras) para añadir contenido de información a una secuencia. La codificación con códigos de barras puede comprender la separación en el espacio químico (código de barras) y puede depender o no del aislamiento físico. La codificación con códigos de barras de ADN puede permitir que se agrupen diferentes secuencias. La codificación con códigos de barras de ADN puede ser difícil de llevar a cabo debido al bajo rendimiento del marcado individual con un código de barras específico de la muestra antes de que pueda combinarse con otras muestras con código de barras. La WO2012048341 se refiere a la codificación con códigos de barras de células individuales de alto rendimiento. Se necesitan nuevos métodos para producir un repertorio masivo de códigos de barras para el marcado de muestras.
SUMARIO
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Algunas realizaciones divulgadas en la presente, pero que no forman parte de la invención reivindicada, proporcionan composiciones que comprenden un conjunto de códigos de barras de componentes para producir un conjunto de códigos de barras combinatorios, que comprenden: n x m códigos de barras de componentes únicos, en donde n y m son números enteros positivos, cada uno de los códigos de barras de componentes comprende: una de n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas; y una o dos secuencias conectoras o los complementos de las mismas, en donde los códigos de barras de componentes están configurados para conectarse entre sí a través de una o dos secuencias conectoras o los complementos de las mismas para producir un conjunto de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, cada una del conjunto de n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas comprende un marcador molecular, un marcador celular, un marcador dimensional, un marcador universal o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el número total de secuencias conectoras diferentes es m-1 o m-2. En algunas realizaciones, cada uno de los códigos de barras de componentes comprende: conector de secuencias de subunidades de códigos de barras; complemento de conector-secuencia de subunidad de código de barrasconector; o complemento de conector-secuencia de subunidad de código de barras. En algunas realizaciones, cada uno del conjunto de códigos de barras combinatorios comprende un oligonucleótido que comprende la fórmula: secuencia de la subunidad del código de barrasa-conecton-secuencia de subunidad de código de barrasb-conector2-... secuencia de subunidad de código de barrasc-conectorm-1-secuencia de subunidad de código de barrasd. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende una región específica del objetivo. En algunas realizaciones, la región específica del objetivo es oligo-dT. En algunas realizaciones, cada uno del conjunto de códigos de barras combinatorios comprende: un primer oligonucleótido que comprende la fórmula secuencia de subunidad de código de barrasa-conector1 -secuencia de subunidad de código de barrasb-conector2-... -secuencia de subunidad de código de barrasc; y un segundo oligonucleótido que comprende la secuencia de subunidad de código de barrasa-...-conector3-secuencia de subunidad de código de barrase-conectorm-2 -secuencia de subunidad de código de barrasf. En algunas realizaciones, cada uno del primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido comprende una región específica del objetivo. En algunas realizaciones, una de las regiones específicas del objetivo es oligo-dT. En algunas realizaciones, cada una de las una o dos secuencias conectoras es diferente. En algunas realizaciones, m es un número entero de 2 a 10. En algunas realizaciones, m es un número entero de 2 a 4. En algunas realizaciones, n es un número entero de 4 a 100. En algunas realizaciones, n = 24. En algunas realizaciones, las n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas tienen la misma longitud. En algunas realizaciones, por lo menos dos de las n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas tienen longitudes diferentes. En algunas realizaciones, las secuencias conectoras tienen la misma longitud. En algunas realizaciones, las secuencias conectoras tienen diferentes longitudes. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene igual o menos que nm códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 100.000 códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 200.000 códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 300.000 códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 400.000 códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 1.000.000 de códigos de barras combinatorios únicos.
Algunas realizaciones divulgadas en la presente, pero que no forman parte de la invención reivindicada, proporcionan métodos de codificación con códigos de barras de una pluralidad de particiones que comprenden: introducir m códigos de barras de componentes en cada una de la pluralidad de particiones, en donde los m códigos de barras de componentes se seleccionan de un conjunto de n x m códigos de barras de componentes diferentes, en donde n y m son números enteros positivos, cada uno de los códigos de barras de componentes comprende: una de n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas; y una o dos secuencias conectoras o los complementos de las mismas; y conectar los m códigos de barras de componentes para generar un código de barras combinatorio, por lo que cada una de la pluralidad de particiones se asocia con un único código de barras combinatorio que comprende los m códigos de barras de componentes. En algunas realizaciones, cada una de la pluralidad de particiones comprende una muestra. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de ADN. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de ARN. En algunas realizaciones, la muestra es una célula individual. En algunas realizaciones, el número total de secuencias conectoras diferentes es m-1 o m-2. En algunas realizaciones, los métodos comprenden hibridar uno o dos de los códigos de barras de m componentes con un objetivo de la muestra. En algunas realizaciones, los métodos comprenden extender el uno o dos de los m códigos de barras de componentes hibridados al objetivo, por lo que el objetivo se marca con el código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, los códigos de barras de componentes se introducen en cada una de la pluralidad de particiones usando una impresora de inyección de tinta.
Algunas realizaciones divulgadas en la presente, pero que no forman parte de la invención reivindicada, proporcionan métodos de codificación con códigos de barras de una pluralidad de objetivos de ADN en una pluralidad de particiones que comprenden: depositar códigos de barras de m componentes en cada una de la pluralidad de particiones que comprenden un objetivo de ADN, en donde los códigos de barras de m componentes se seleccionan de un conjunto de n x m componentes diferentes códigos de barras, en donde n y m son números enteros positivos, cada uno de los códigos de barras de componentes comprende: una de n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas; y una o dos secuencias conectoras o los complementos de las mismas; y conectar los códigos de barras de m componentes para generar un código de barras combinatorio, por lo que el objetivo de ADN en cada una de la pluralidad de particiones se asocia con un código de barras combinatorio único que comprende los códigos de barras de m componentes. En algunas realizaciones, el número total de secuencias conectoras diferentes es m-1 o m-2. En algunas realizaciones, los métodos comprenden hibridar uno o dos de los códigos de barras del componente m con el objetivo de ADN. En algunas realizaciones, los métodos comprenden extender el uno o dos de los códigos de barras de m componentes hibridados con el objetivo de ADN para producir un producto de extensión que comprende el código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, los métodos comprenden amplificar el producto de extensión. En algunas realizaciones, la amplificación del producto de extensión comprende la amplificación isotérmica por desplazamiento de múltiples cadenas. En algunas realizaciones, los métodos comprenden agrupar los productos de amplificación de la pluralidad de particiones. En algunas realizaciones, los métodos comprenden la secuenciación de los productos de amplificación agrupados. En algunas realizaciones, los métodos comprenden ensamblar las secuencias usando los códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, los métodos comprenden generar haplotipos usando las secuencias ensambladas. En algunas realizaciones, los haplotipos se generan usando lecturas de secuencias superpuestas que cubren por lo menos 100 kb.
Algunas realizaciones divulgadas en la presente, pero que no forman parte de la invención reivindicada, proporcionan métodos de secuenciación de células individuales que comprenden: depositar códigos de barras de m componentes en cada una de una pluralidad de particiones que comprenden una células individual, en donde los códigos de barras de m componentes se seleccionan de un conjunto de n x m códigos de barras de componentes diferentes, donde n y m son números enteros positivos, cada uno de los códigos de barras de componentes comprende: una de n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas; y una o dos secuencias conectoras o los complementos de las mismas; y conectar los códigos de barras de m componentes para generar un código de barras combinatorio, por lo que un objetivo de la células individual en cada una de la pluralidad de particiones se asocia con un código de barras combinatorio único que comprende los códigos de barras de m componentes. En algunas realizaciones, el número total de secuencias conectoras diferentes es m-1 o m-2. En algunas realizaciones, el objetivo es un ADN. En algunas realizaciones, el objetivo es un ARN. En algunas realizaciones, los métodos comprenden hibridar uno o dos de los códigos de barras de m componentes con el objetivo. En algunas realizaciones, los métodos comprenden extender el uno o dos de los códigos de barras de m componentes hibridados con el objetivo para producir un producto de extensión que comprende el código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, los métodos comprenden la amplificación del producto de extensión. En algunas realizaciones, los métodos comprenden agrupar los productos de la amplificación de la pluralidad de particiones. En algunas realizaciones, los métodos comprenden secuenciar los productos de amplificación agrupados. En algunas realizaciones, los métodos comprenden ensamblar las secuencias de una célula individual usando los códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, los métodos comprenden caracterización paralela masiva de células individuales.
Algunas realizaciones divulgadas en la presente, pero que no forman parte de la invención reivindicada, proporcionan métodos de codificación con códigos de barras espacialmente de un objetivo en una muestra, que comprenden: proporcionar una pluralidad de oligonucleótidos inmovilizados en un sustrato; poner en contacto una muestra con la pluralidad de oligonucleótidos inmovilizados en el sustrato; hibridar el objetivo con una sonda que se une específicamente al objetivo; capturar una imagen que muestra las localizaciones del objetivo; capturar una imagen de la muestra; y correlacionar la imagen que muestra las localizaciones del objetivo y la imagen de la muestra para codificar con barras espacialmente el objetivo en la muestra. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmovilizados en el sustrato son cebadores oligo-dT. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmovilizados en el sustrato son cebadores aleatorios. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inmovilizados en el sustrato son cebadores específicos del objetivo. En algunas realizaciones, los métodos comprenden la transcripción inversa del objetivo para generar un ADNc. En algunas realizaciones, los métodos comprenden añadir homopolímeros de dATP al ADNc. En algunas realizaciones, los métodos comprenden la amplificación del ADNc usando la amplificación de puente. En algunas realizaciones, el sustrato es parte de una célula de flujo. En algunas realizaciones, los métodos comprenden lisar la muestra antes o después de ponerla en contacto con la pluralidad de oligonucleótidos inmovilizados en el sustrato. En algunas realizaciones, lisar la muestra comprende calentar la muestra, poner la muestra en contacto con un detergente, cambiar el pH de la muestra o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra comprende un corte de tejido, una monocapa de células, células fijadas, una sección de tejido o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra comprende una pluralidad de células. En algunas realizaciones, la pluralidad de células comprende uno o más tipos de células. En algunas realizaciones, por lo menos uno del uno o más tipos de células es una célula cerebral, una célula cardíaca, una célula cancerosa, una célula tumoral circulante, una célula orgánica, una célula epitelial, una célula metastásica, una célula benigna, una célula primaria, una célula circulatoria o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, los métodos comprenden amplificar el objetivo para generar una pluralidad de amplicones inmovilizados en el sustrato. En algunas realizaciones, el objetivo comprende ácidos ribonucleicos (ARN), ARN mensajeros (ARNm), microARN, ARN interferente pequeño (ARNip), productos de degradación de ARN, ARN que comprenden cada uno una cola de poli(A), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los métodos comprenden codificar con códigos de barras espacialmente una pluralidad de objetivos. En algunas realizaciones, la sonda tiene una longitud de 18-100 nt. En algunas realizaciones, la sonda comprende un marcador fluorescente. En algunas realizaciones, la imagen que muestra las localizaciones del objetivo es una imagen fluorescente. En algunas realizaciones, la muestra comprende una tinción inmunohistoquímica, una tinción progresiva, una tinción con hematoxilina-eosina o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un polímero, una matriz, un hidrogel, un dispositivo de matriz de agujas, un anticuerpo o cualquier combinación de los mismos.
Algunas realizaciones divulgadas en la presente, pero que no forman parte de la invención reivindicada, proporcionan métodos de secuenciación de células individuales que comprenden: depositar un primer oligonucleótido que comprende un primer código de barras seleccionado de un primer conjunto de 40 códigos de barras únicos y un primer cebador en una pluralidad de particiones que comprenden una célula individual; depositar un segundo oligonucleótido que comprende un segundo código de barras seleccionado de un segundo conjunto de 40 códigos de barras únicos y un segundo cebador en la pluralidad de particiones que comprenden la célula individual; poner en contacto el primer oligonucleótido con un objetivo de la célula individual; extender el primer oligonucleótido para generar una primera cadena que comprende el primer código de barras; poner en contacto el segundo oligonucleótido con la primera cadena; y extender el segundo oligonucleótido para generar una segunda cadena que comprende el primer código de barras y el segundo código de barras, por lo que el objetivo de la célula individual se marca con el primer código de barras y el segundo código de barras. En algunas realizaciones, los métodos comprenden amplificar la segunda cadena para producir productos de amplificación. En algunas realizaciones, los métodos comprenden agrupar los productos de amplificación de la pluralidad de particiones. En algunas realizaciones, los métodos comprenden la secuenciación de los productos de amplificación agrupados. En algunas realizaciones, los métodos comprenden ensamblar las secuencias de una células individual usando el primer código de barras y el segundo código de barras. En algunas realizaciones, los métodos comprenden caracterización paralela masiva de células individuales. En algunas realizaciones, la pluralidad de particiones está compuesta por una placa de 1536 micropocillos. En algunas realizaciones, el objetivo es un ARNm. En algunas realizaciones, el primer cebador es un cebador oligo-dT. En algunas realizaciones, el objetivo es un ADN.
Algunas realizaciones divulgadas en la presente, pero que no forman parte de la invención reivindicada, proporcionan composiciones que comprenden un conjunto de códigos de barras combinatorios, en donde cada código de barras combinatorio del conjunto de códigos de barras combinatorios comprende: m secuencias de subunidades de códigos de barras, cada una seleccionada de un conjunto de n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas, donde n y m son números enteros positivos; y m-1 o m-2 secuencias conectoras, en donde las m secuencias de subunidades de códigos de barras están conectadas entre sí a través de las secuencias conectoras m-1 o m-2, y el número total de códigos de barras combinatorios únicos en el conjunto de códigos de barras combinatorios es más de 384. En algunas realizaciones, cada uno del conjunto de n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas comprende un marcador molecular, un marcador celular, un marcador dimensional, un marcador universal o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el número total de códigos de barras combinatorios únicos in el conjunto de códigos de barras combinatorios es igual o menor que nm. En algunas realizaciones, cada uno del conjunto de códigos de barras combinatorios comprende un oligonucleótido que comprende la fórmula: secuencia de subunidad de código de barrasa-conector1-secuencia de subunidad de código de barrasb-conector2-... secuencia de subunidad de código de barrasc-conectorm-1-secuencia de subunidad de código de barrasd. En algunas realizaciones, cada uno del conjunto de códigos de barras combinatorios comprende: un primer oligonucleótido que comprende la fórmula secuencia de subunidad de código de barrasa-conecton-secuencia de subunidad de código de barrasb-conector2-...-secuencia de subunidad de código de barrasc; y un segundo oligonucleótido que comprende la secuencia de subunidad de código de barrasd-...-conector3-secuencia de subunidad de código de barrase-conectorm-2-secuencia de subunidad de código de barrasf.
En algunas realizaciones, cada uno del conjunto de códigos de barras combinatorios comprende una o dos regiones específicas del objetivo. En algunas realizaciones, una de la una o dos regiones específicas del objetivo es oligo-dT.
En algunas realizaciones, cada una de las secuencias conectoras m-1 o m-2 es diferente. En algunas realizaciones, m es un número entero de 2 a 10. En algunas realizaciones, m es un número entero de 2 a 4. En algunas realizaciones, n es un número entero de 4 a 100. En algunas realizaciones, n = 24. En algunas realizaciones, las n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas tienen la misma longitud. En algunas realizaciones, las n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas tienen diferentes longitudes. En algunas realizaciones, las secuencias conectoras m-1 o m-2 tienen la misma longitud. En algunas realizaciones, las secuencias conectoras m-1 o m-2 tienen diferentes longitudes. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 100.000 códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 200.000 códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 300.000 códigos de barras combinatorios únicos.
En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 400.000 códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, el conjunto de códigos de barras combinatorios tiene por lo menos 1.000.000 de códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, cada uno del conjunto de códigos de barras combinatorios está unido a un soporte sólido. En algunas realizaciones, cada uno del conjunto de códigos de barras combinatorios se usa para marcar una partición. En algunas realizaciones, la partición es parte de una matriz de micropocillos que tiene más de 10.000 micropocillos. En algunas realizaciones, cada micropocillo de la matriz de micropocillos comprende un código de barras combinatorio diferente del conjunto de códigos de barras combinatorios.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición, pero que no forma parte de la invención reivindicada, que comprende: un conjunto de códigos de barras de reactivos, en donde cada código de barras de reactivo m tiene una longitud de n, en donde el número de códigos de barras de reactivos diferentes es n x m, y en donde el número posible de códigos de barras combinatorios diferentes es nm. En algunas realizaciones, los diferentes códigos de barras combinatorios son combinaciones de los códigos de barras de los reactivos. En algunas realizaciones, los diferentes códigos de barras combinatorios difieren en por lo menos 1 nucleótido. En algunas realizaciones, los diferentes códigos de barras combinatorios difieren en por lo menos 2 nucleótidos. En algunas realizaciones, nm/(n x m) es por lo menos 1:2000. En algunas realizaciones, nm/(n x m) es por lo menos 1:3000. En algunas realizaciones, nm/(n x m) es por lo menos 1:4000. En algunas realizaciones, en las que el número de códigos de barras combinatorios diferentes es de por lo menos 100.000. En algunas realizaciones, el número de diferentes códigos de barras combinatorios es de por lo menos 200.000. En algunas realizaciones, el número de diferentes códigos de barras combinatorios es de por lo menos 300.000. En algunas realizaciones, el número de diferentes códigos de barras combinatorios es de por lo menos 400.000. En algunas realizaciones, el número de los diferentes códigos de barras combinatorios es 331.776. En algunas realizaciones, m es por lo menos 2. En algunas realizaciones, m es por lo menos 3. En algunas realizaciones, m es por lo menos 4. En algunas realizaciones, m es 4. En algunas realizaciones, n es de 5-50. En algunas realizaciones, n es 24. En algunas realizaciones, los códigos de barras de reactivos del conjunto de códigos de barras de reactivos comprenden diferentes longitudes. En algunas realizaciones, un primer código de barras está enlazado a un segundo código de barras del conjunto de códigos de barras a través de un conector. En algunas realizaciones, el primer código de barras comprende una región específica del objetivo. En algunas realizaciones, la región específica del objetivo hibrida con una cadena de sentido de un polinucleótido objetivo. En algunas realizaciones, el código de barras combinatorio es bipartito. En algunas realizaciones, el código de barras combinatorio es tripartito. En algunas realizaciones, el código combinatorio está parcialmente en el extremo 3' de un polinucleótido objetivo y parcialmente en el extremo 5' del polinucleótido objetivo. En algunas realizaciones, la región específica del objetivo hibrida con una cadena antisentido de un polinucleótido objetivo. En algunas realizaciones, la composición comprende además un polinucleótido objetivo.
En un aspecto, la divulgación proporciona: un método que no es parte de la invención para crear muestras de códigos de barras que comprende: poner en contacto con un conjunto de códigos de barras de reactivos, en donde cada código de barras de reactivo m tiene una longitud de n, en donde el número de códigos de barras de reactivos diferentes es n x m, y en donde el número posible de códigos de barras de reactivos diferentes combinatorios es nm para una pluralidad de particiones; asociar los reactivos de códigos de barras con polinucleótidos objetivo; marcar los polinucleótidos objetivo con los reactivos de código de barras, en donde cada uno de los polinucleótidos objetivo comprende un código de barras combinatorio diferente. En algunas realizaciones, los polinucleótidos objetivo son ADN. En algunas realizaciones, los polinucleótidos objetivo son ADN genómico. En algunas realizaciones, los polinucleótidos objetivo son ARN. En algunas realizaciones, los polinucleótidos objetivo son fragmentos de cromosomas. En algunas realizaciones, los polinucleótidos objetivo tienen una longitud de por lo menos 100 kilobases. En algunas realizaciones, los polinucleótidos objetivo son de una célula individual.
En un aspecto, la descripción proporciona un método, pero que no es parte de la invención reivindicada, para aislar una pluralidad de células que comprende: aislar una célula individual de la pluralidad de células en un solo pocillo un sustrato de una manera no Poisson, en donde el pocillo comprende dos o más reactivos de códigos de barras combinatorios; y marcar un ácido nucleico de la célula con los reactivos de códigos de barras combinatorios, generando de este modo un ácido nucleico con código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, el aislamiento comprende distribuir la pluralidad de células de tal manera que por lo menos el 20% de los pocillos del sustrato tengan una sola célula. En algunas realizaciones, el aislamiento comprende distribuir la pluralidad de células de tal manera que por lo menos el 40% de los pocillos del sustrato tengan una sola célula. En algunas realizaciones, el aislamiento comprende distribuir la pluralidad de células de tal manera que por lo menos el 60% de los pocillos del sustrato tengan una única célula. En algunas realizaciones, el aislamiento comprende distribuir la pluralidad de células de tal manera que por lo menos el 80% de los pocillos del sustrato tengan una sola célula. En algunas realizaciones, el aislamiento comprende distribuir la pluralidad de células de tal manera que el 100% de los pocillos del sustrato tengan una sola célula. En algunas realizaciones, el aislamiento no es aleatorio. En algunas realizaciones, el aislamiento se realiza mediante un dispositivo de aislamiento. En algunas realizaciones, el dispositivo de aislamiento comprende un dispositivo seleccionado del grupo que consta de: un citómetro de flujo, una matriz de agujas y un microinyector, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el sustrato comprende por lo menos 500 pocillos. En algunas realizaciones, el sustrato comprende por lo menos 1.000 pocillos. En algunas realizaciones, el sustrato comprende por lo menos 10.000 pocillos. En algunas realizaciones, el sustrato comprende 96, 384 o 1536 pocillos. En algunas realizaciones, un reactivo de códigos de barras combinatorios de los reactivos de códigos de barras combinatorios comprende una sección de código de subunidad. En algunas realizaciones, el reactivo de códigos de barras combinatorios comprende además un conector adyacente a la sección de código de subunidad. En algunas realizaciones, el conector está localizado 5', 3' o tanto 5' como 3' con respecto a la sección de código de subunidad. En algunas realizaciones, los conectores de diferentes reactivos de códigos de barras combinatorios están configurados para hibridar entre sí, generando de este modo reactivos de códigos de barras combinatorios concatenados. En algunas realizaciones, los reactivos de códigos de barras concatenados corresponden a un código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, el código de barras combinatorio es bipartito. En algunas realizaciones, el código de barras combinatorio está parcialmente en el extremo 3' del ácido nucleico con código de barras combinatorio y parcialmente con el extremo 5' del ácido nucleico con código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, la sección de código de la subunidad tiene una longitud de 4 a 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la sección de código de la subunidad tiene una longitud de 6 nucleótidos. En algunas realizaciones, cada sección de código de subunidad de un reactivo de códigos de barras combinatorios comprende una secuencia de código de la subunidad única. En algunas realizaciones, un reactivo de códigos de barras combinatorios de los reactivos de códigos de barras combinatorios comprende una región específica del objetivo. En algunas realizaciones, solo uno de los reactivos de códigos de barras combinatorios comprende una región específica del objetivo. En algunas realizaciones, solo dos de los reactivos de códigos de barras combinatorios comprenden una región específica del objetivo. En algunas realizaciones, la región específica de objetivo se selecciona del grupo que consiste en: un multímero aleatorio, oligo dT o una secuencia específica de gen. En algunas realizaciones, la región específica del objetivo está adaptada para hibridar con la cadena sentido de un ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, la región específica del objetivo está adaptada para hibridar con la cadena antisentido de un ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, el marcado comprende hibridar los reactivos de códigos de barras combinatorios con los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la hibridación comprende además hibridar reactivos de códigos de barras combinatorios entre sí a través de sus conectores afines. En algunas realizaciones, el método comprende además extender los reactivos de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, la extensión comprende la extensión del cebador de los reactivos de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, la extensión comprende generar un transcrito que comprende la secuencia de los reactivos de códigos de barras combinatorios y el ácido nucleico. En algunas realizaciones, los pocillos del sustrato comprenden diferentes combinaciones de los reactivos de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, las diferentes combinaciones de los reactivos de códigos de barras combinatorios corresponden a diferentes códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, el método comprende además agrupar los ácidos nucleicos combinados con código de barras después del marcado. En algunas realizaciones, el método comprende además amplificar los ácidos nucleicos con código de barras combinatorios, generando de este modo un amplicón con código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, la amplificación comprende el desplazamiento de múltiples cadenas. En algunas realizaciones, la amplificación comprende PCR. En algunas realizaciones, la amplificación se realiza con cebadores que hibridan con secuencias los reactivos de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, la amplificación se realiza con un cebador específico de gen y un cebador que hibrida con una secuencia de un reactivo de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar la secuencia del amplicón con código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, la determinación comprende determinar una parte de la secuencia del código de barras combinatorio del amplicón con código de barras combinatorio y una parte de la secuencia del ácido nucleico del amplicón con código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, el método comprende además lisar las células antes del marcado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ARN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ARNm. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADN genómico. En algunas realizaciones, las células comprenden una célula seleccionada del grupo que consiste en: una célula humana, una célula de mamífero, una célula de rata, una célula de cerdo, una célula de ratón, una célula de mosca, una célula de gusano, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de hongo, una célula bacteriana y una célula vegetal, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, las células comprenden una célula tumoral. En algunas realizaciones, las células comprenden una célula enferma. En algunas realizaciones, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en el pocillo es de por lo menos 2. En algunas realizaciones, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en el pocillo es de por lo menos 3. En algunas realizaciones, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en el pocillo es de por lo menos 4. En algunas realizaciones, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en el pocillo es 4.
En un aspecto, la divulgación proporciona un kit, pero que forma parte de la invención reivindicada, que comprende: un conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios, en donde solo uno de los reactivos de códigos de barras combinatorios comprende una secuencia específica de objetivo, en donde los códigos de barras del conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios comprenden conectores de tal manera que los reactivos de códigos de barras combinatorios se superponen a través de los conectores, generando de este modo códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, el código de barras combinatorio comprende una combinación de los reactivos de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, las secuencias de los códigos de barras combinatorios difieren en por lo menos 1 nucleótido. En algunas realizaciones, las secuencias de los códigos de barras combinatorios difieren en por lo menos 2 nucleótidos. En algunas realizaciones, el número de códigos de barras combinatorios generados a partir del conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios es de por lo menos 100.000. En algunas realizaciones, el número de códigos de barras combinatorios generados a partir del conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios es de por lo menos 200.000. En algunas realizaciones, el número de códigos de barras combinatorios generados a partir del conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios es de por lo menos 300.000. En algunas realizaciones, el número de códigos de barras combinatorios generados a partir del conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios es de por lo menos 400.000. En algunas realizaciones, el número de códigos de barras combinatorios generados a partir del conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios es 331.776. En algunas realizaciones, un reactivo de códigos de barras combinatorios de los reactivos de códigos de barras combinatorios comprende una sección de código de subunidad. En algunas realizaciones, el reactivo de códigos de barras combinatorios comprende además un conector adyacente a la sección de código de subunidad. En algunas realizaciones, el conector está localizado 5', 3' o tanto 5 como 3' de la sección de código de subunidad. En algunas realizaciones, los conectores de diferentes reactivos de códigos de barras combinatorios están configurados para hibridar entre sí, generando de este modo reactivos de códigos de barras combinatorios concatenados. En algunas realizaciones, los reactivos de códigos de barras concatenados comprenden un código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, la sección de código de la subunidad tiene una longitud de 5 a 35 nucleótidos. En algunas realizaciones, la sección de código de la subunidad tiene una longitud de 6 nucleótidos. En algunas realizaciones, cada sección de código de subunidad de un código de barras combinatorio comprende una secuencia de código de subunidad única. En algunas realizaciones, cada código de barras de reactivo m tiene una longitud de código de subunidad de n, y en donde nm(n x m) es por lo menos 2000. En algunas realizaciones, nm(n x m) es por lo menos 3000. En algunas realizaciones, nm(n x m) es por lo menos 4.000. En algunas realizaciones, n x m es el número de códigos de barras de reactivos diferentes. En algunas realizaciones, nm es el número posible de diferentes códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, un reactivo de códigos de barras combinatorios de los reactivos de códigos de barras combinatorios comprende una región específica del objetivo. En algunas realizaciones, la región específica del objetivo se selecciona del grupo que consiste en: un multímero aleatorio, oligo dT o una secuencia específica de gen. En algunas realizaciones, la región específica del objetivo está adaptada para hibridar con la cadena sentido de un ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, la región específica del objetivo está adaptada para hibridar con la cadena antisentido de un ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, el código de barras combinatorio es bipartito. En algunas realizaciones, una parte del código de barras combinatorio está parcialmente en el extremo 3' de un polinucleótido objetivo y parcialmente en el extremo 5' del polinucleótido objetivo. En algunas realizaciones, en las que el kit comprende además un sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato comprende por lo menos 1.000 micropocillos. En algunas realizaciones, los micropocillos comprenden por lo menos dos códigos de barras de reactivos del conjunto de códigos de barras de reactivos. En algunas realizaciones, el kit comprende además instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el kit comprende además un tampón. En algunas realizaciones, el kit comprende además un cebador específico de gen. En algunas realizaciones, el kit comprende además cebadores de amplificación.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método, pero que no forma parte de la invención reivindicada, para la secuenciación del genoma completo que comprende: fragmentar un cromosoma de ácido nucleico en uno o más fragmentos cromosómicos; aislar el uno o más fragmentos cromosómicos en un pocillo de un sustrato que comprende dos o más códigos de barras de reactivos; amplificar los fragmentos cromosómicos con los códigos de barras de reactivos, generando de este modo fragmentos con códigos de barras combinatorios; y determinar la secuencia de los fragmentos con código de barras combinatorios, realizando de este modo la secuenciación del genoma completo. En algunas realizaciones, los fragmentos cromosómicos tienen una longitud de por lo menos 100 kilobases. En algunas realizaciones, los fragmentos cromosómicos tienen una longitud de 50 a 300 kilobases. En algunas realizaciones, la fragmentación produce de 1x106 a 1x107 fragmentos. En algunas realizaciones, el aislamiento comprende aislar de 1 a 5 fragmentos en el pocillo. En algunas realizaciones, los 1-5 fragmentos no se superponen. En algunas realizaciones, la amplificación comprende el desplazamiento de múltiples cadenas. En algunas realizaciones, la amplificación es isotérmica. En algunas realizaciones, el método comprende además agrupar los fragmentos con código de barras combinatorios antes de la determinación. En algunas realizaciones, la determinación comprende secuenciar por lo menos una parte del código de barras combinatorio y por lo menos una parte del fragmento cromosómico. En algunas realizaciones, la determinación comprende agrupar lecturas de secuencias en grupos en base a su secuencia de código de barras combinatoria. En algunas realizaciones, los grupos corresponden a pocillos del sustrato. En algunas realizaciones, el método comprende además ensamblar cóntigos de los fragmentos cromosómicos. En algunas realizaciones, el método comprende además mapear los cóntigos a un cromosoma materno o paterno. En algunas realizaciones, el mapeo determina la fase haplotípica de los fragmentos cromosómicos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las características novedosas de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención con referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos acompañantes en los que:
La Figura 1 ilustra una realización ejemplar de los reactivos de códigos de barras combinatorios de la divulgación.
La Figura 2 ilustra realizaciones ejemplares de concatenación de reactivos de códigos de barras combinatorios de la divulgación
La Figura 3 ilustra una realización ejemplar de los métodos de la divulgación para la codificación con códigos de barras combinatorios de ácidos nucleicos.
La Figura 4 representa una realización ejemplar del método para generar cóntigos usando reactivos de códigos de barras combinatorios de la divulgación.
La Figura 5 representa una realización ejemplar del método de genotipado de células individuales usando reactivos de códigos de barras combinatorios de la divulgación.
La Figura 6 ilustra una realización ejemplar del método de combinar códigos de barras combinatorios y métodos de códigos de barras estocásticos de la divulgación.
La Figura 7 ilustra una realización ejemplar de un método de códigos de barras combinatorios bipartitos de la divulgación.
La Figura 8 ilustra una realización ejemplar de un código de barras combinatorio inmovilizado sobre un soporte sólido.
La Figura 9 ilustra una realización ejemplar de los métodos de la divulgación para codificar espacialmente con código de barras el objetivo en una muestra.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REALIZACIÓN PREFERIDA
La divulgación proporciona composiciones y métodos para la producción de un repertorio de diversos reactivos de códigos de barras usando solo un pequeño conjunto de reactivos de códigos de barras de componentes. El método de la divulgación proporciona pasos de biología molecular simples para llevar a cabo el emparejamiento combinatorio de los reactivos de código de barras de componentes. En algunos casos, pueden procesarse en paralelo cientos de miles o más de millones de muestras. Por ejemplo, el número de muestras que pueden procesarse en paralelo puede ser por lo menos 100, 1000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 200.000, 300.000; 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000 o 900.000. En algunas realizaciones, el número de muestras que pueden procesarse en paralelo puede ser como máximo 100, 1.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 200.000, 300.000; 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000 o 900.000. En algunas realizaciones, pueden procesarse por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más millones de muestras en paralelo. En algunas realizaciones, pueden procesarse en paralelo como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más millones de muestras.
La divulgación proporciona métodos, composiciones, kits y sistemas para la codificación con códigos de barras combinatorios de ácidos nucleicos usando reactivos de código de barras combinatorios. Como se muestra en la Figura 1, un reactivo de códigos de barras combinatorios de la divulgación 105/110/115/120 puede comprender una región específica del objetivo, una sección de código de subunidad y una región conectora, o cualquier combinación de los mismos. La sección de código de subunidad XXXXXX puede tener una secuencia de código de subunidad. Diferentes secciones de códigos de subunidades pueden tener diferentes secuencias de códigos de subunidades. Como se muestra en la Figura 1, los reactivos de códigos de barras combinatorios 105, 110, 115 y 120 pueden concatenarse juntos a través de regiones conectoras. Los reactivos de códigos de barras combinatorios concatenados pueden extenderse (por ejemplo, con extensión de cebador) para generar un transcrito 125 que comprende las secuencias de los reactivos de códigos de barras combinatorios y el polinucleótido objetivo. Los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden reducir el número de reactivos necesarios para generar un repertorio masivo de códigos de barras.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica en el campo al que pertenece esta divulgación. Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se pretende que cualquier referencia a "o" en la presente abarque "y/o" a menos que se indique lo contrario.
Como se usa en la presente, el término "asociado" o "asociado con" puede significar que dos o más especies son identificables como colocalizadas en un punto temporal. Una asociación puede significar que dos o más especies están o estuvieron dentro de un recipiente similar. Una asociación puede ser una asociación informática en donde, por ejemplo, se almacena información digital referente a dos o más especies y puede usarse para determinar que una o más de las especies se colocalizaron en un momento dado. Una asociación también puede ser una asociación física. En algunos casos, dos o más especies asociadas están "ancladas", "unidas" o "inmovilizadas" entre sí o a una superficie sólida o semisólida común. Una asociación puede referirse a medios covalentes o no covalentes para unir marcadores a soportes sólidos o semisólidos, como perlas. Una asociación puede comprender hibridación entre un objetivo y un marcador.
Los términos "código de barras de componente", "código de barras de reactivo" y "reactivo de códigos de barras combinatorios" se usan indistintamente para referirse a una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia de código de subunidad, y puede usarse con uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios para generar códigos de barras combinatorios. Por ejemplo, los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden concatenarse a través de conectores, generando de este modo un código de barras combinatorio.
Como se usa en la presente, el término "código de barras combinatorio" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios.
Como se usa en la presente, el término "complementario" se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una posición dada de un ácido nucleico es capaz de formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido de otro ácido nucleico, entonces los dos ácidos nucleicos se consideran complementarios entre sí en esa posición. La complementariedad entre dos moléculas de ácidos nucleicos de cadena sencilla puede ser "parcial", en la que solo se unen algunos de los nucleótidos, o puede ser completa cuando existe una complementariedad total entre las moléculas de cadena sencilla. Puede decirse que una primera secuencia de nucleótidos es el "complemento" de una segunda secuencia si la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a la segunda secuencia de nucleótidos. Puede decirse que una primera secuencia de nucleótidos es el "complemento inverso" de una segunda secuencia, si la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a una secuencia que es la inversa (es decir, el orden de los nucleótidos está invertido) de la segunda secuencia. Como se usa en la presente, los términos "complemento", "complementario" y "complemento inverso" pueden usarse indistintamente. Se entiende a partir de la divulgación que si una molécula puede hibridar con otra molécula, puede ser el complemento de la molécula que está hibridando.
Como se usa en la presente, el término "recuento digital" se refiere a un método para estimar un número de moléculas objetivo en una muestra. El recuento digital puede incluir el paso de determinar una cantidad de marcadores únicos que se han asociado con objetivos en una muestra. Esta metodología estocástica transforma el problema de contar moléculas de uno de localizar e identificar moléculas idénticas a una serie de preguntas digitales de sí/no relacionadas con la detección de un conjunto de marcadores predefinidos.
Como se usa en la presente, el término "primer marcador universal" se refiere a un marcador que es universal para los códigos de barras de la divulgación. Un primer marcador universal puede ser un sitio de unión del cebador de secuenciación (por ejemplo, un sitio de unión del cebador de lectura, es decir, para un secuenciador Illumina).
Como se usa en la presente, el término "marcador" o "marcadores" se refiere a códigos de ácidos nucleicos asociados con un objetivo dentro de una muestra. Un marcador puede ser, por ejemplo, un marcador de ácidos nucleicos. Un marcador puede ser un marcador total o parcialmente amplificable. Un marcador puede ser un marcador total o parcialmente secuenciable. Un marcador puede ser una porción de un ácido nucleico nativo que es identificable como distinto. Un marcador puede ser una secuencia conocida. Un marcador puede comprender una unión de secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, una unión de una secuencia nativa y no nativa. Como se usa en la presente, el término "marcador" puede usarse indistintamente con los términos "índice", "etiqueta" o "marcadoretiqueta". Los marcadores pueden transmitir información. Por ejemplo, en varias realizaciones, los marcadore pueden usarse para determinar la identidad de una muestra, una fuente de una muestra, una identidad de una célula, y/o un objetivo.
Como se usa en la presente, el término "depósitos que no se agotan" se refiere a un grupo de códigos de barras estocásticos compuesto por muchos marcadores diferentes. Un depósito que no se agota puede comprender un gran número de códigos de barras estocásticos diferentes, de tal manera que cuando el depósito que no se agota está asociado con un conjunto de objetivos, es probable que cada objetivo esté asociado con un código de barras estocástico único. La singularidad de cada molécula objetivo marcada puede determinarse mediante las estadísticas de elección aleatoria y depende del número de copias de moléculas objetivo idénticas en la colección en comparación con la diversidad de marcadores. El tamaño del conjunto resultante de moléculas objetivo marcadas puede determinarse por la naturaleza estocástica del proceso de codificación de barras, y el análisis del número de códigos de barras estocásticos detectados permite calcular el número de moléculas objetivo presentes en la colección o muestra original. Cuando la relación entre el número de copias de una molécula objetivo presente y el número de códigos de barras estocásticos únicos es baja, las moléculas objetivo marcadas son altamente únicas (es decir, hay una probabilidad muy baja de que más de una molécula objetivo haya sido marcada con un marcador dado).
Como se usa en la presente, un "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de polinucleótidos, o a un fragmento de la misma. Un ácido nucleico puede comprender nucleótidos. Un ácido nucleico puede ser exógeno o endógeno a una célula. Un ácido nucleico puede existir en un entorno libre de células. Un ácido nucleico puede ser un gen o un fragmento del mismo. Un ácido nucleico puede ser ADN. Un ácido nucleico puede ser ARN. Un ácido nucleico puede comprender uno o más análogos (por ejemplo, estructura principal, azúcar o nucleobase alteradas). Algunos ejemplos no limitativos de análogos incluyen: 5-bromouracilo, ácido nucleico peptídico, ácido xenonucleico, morfolinos, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos de glicol, ácidos nucleicos de treosa, didesoxinucleótidos, cordicepina, 7-deaza-GTP, floróforos (por ejemplo, rodamina o fluresceína enlazada al azúcar), nucleótidos que contienen tiol, nucleótidos enlazados a biotina, análogos de bases fluorescentes, islas de CpG, metil-7-guanosina, nucleótidos metilados, inosina, tiouridina, pseudourdina, dihidrouridina, queuosina y wyosina. "Ácido nucleico", "polinucleótido", "polinucleótido objetivo" y "ácido nucleico objetivo" pueden usarse indistintamente.
Un ácido nucleico puede comprender una o más modificaciones (por ejemplo, una modificación de bases, una modificación de la estructura principal), para proporcionar al ácido nucleico una característica nueva o potenciada (por ejemplo, una estabilidad mejorada). Un ácido nucleico puede comprender una etiqueta de afinidad de ácido nucleico. Un nucleósido puede ser una combinación de base-azúcar. La porción de base del nucleósido puede ser una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos pueden ser nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede enlazarse a la fracción hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. En la formación de ácidos nucleicos, los grupos fosfato pueden enlazar covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal pueden unirse para formar un compuesto circular; sin embargo, los compuestos lineales son generalmente adecuados. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad interna de bases de nucleótidos y, por lo tanto, pueden plegarse de manera que produzcan un compuesto total o parcialmente de cadena doble. Dentro de los ácidos nucleicos, los grupos fosfato pueden denominarse comúnmente como formadores de la estructura principal internucleosídica del ácido nucleico. El enlace o la estructura principal del ácido nucleico puede ser un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
Un ácido nucleico puede comprender una estructura principal modificada y/o enlaces internucleosídicos modificados. Las estructuras principales modificadas pueden incluir aquellas que retienen un átomo de fósforo en la estructura principal y aquellas que no tienen un átomo de fósforo en la estructura principal. Las estructuras principales de ácidos nucleicos modificados adecuadas que contienen un átomo de fósforo pueden incluir, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfontatos de metilo y otros alquilos como fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno, fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, fosforodiamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos 2'-5' enlazados, y aquellos que tienen polaridad invertida en donde uno o más enlaces internucleotídicos es un enlace 3' a 5', 5' a 5' o 2' a 2'.
Un ácido nucleico puede comprender estructuras principales de polinucleótidos que están formadas por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos mixtos de heteroátomos y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Éstos pueden incluir aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de riboacetilo; estructuras principales que contienen alquenos; estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenoimino y metilenohidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otros que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
Un ácido nucleico puede comprender un mimético de ácido nucleico. El término "mimético" incluye, por ejemplo, polinucleótidos en los que solo el anillo de furanosa o tanto el anillo de furanosa como el enlace internucleotídico se reemplazan con grupos que no son furanosa, el reemplazo de solo el anillo de furanosa también puede denominarse un sustituto de azúcar. La fracción de base heterocíclica o una fracción de base heterocíclica modificada puede mantenerse para la hibridación con un ácido nucleico objetivo apropiado. Uno de tales ácidos nucleicos puede ser un ácido nucleico peptídico (PNA). En un PNA, el estructura principal de azúcar de un polinucleótido puede reemplazarse con un estructura principal que contiene amida, en particular, un estructura principal de aminoetilglicina. Los nucleótidos pueden retenerse y se unen directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la porción de amida de la estructura principal. La estructura principal en los compuestos de PNA puede comprender dos o más unidades de aminoetilglicina enlazadas que dan al PNA una estructura principal que contiene amida. Las fracciones de base heterocíclicas pueden unirse directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la estructura principal.
Un ácido nucleico puede comprender una estructura de estructura principal de morfolino. Por ejemplo, un ácido nucleico puede comprender un anillo de morfolino de 6 miembros en lugar de un anillo de ribosa. En algunas de estas realizaciones, un enlace internucleosídico fosforodiamidato u otro no fosfodiéster puede reemplazar un enlace fosfodiéster.
Un ácido nucleico puede comprender unidades de morfolino enlazadas (es decir, ácido nucleico de morfolino) que tienen bases heterocíclicas unidas al anillo de morfolino. Los grupos de enlace pueden enlazar las unidades monoméricas de morfolino en un ácido nucleico de morfolino. Los compuestos oligoméricos a base de morfolino no iónicos pueden tener menos interacciones no deseadas con las proteínas celulares. Los polinucleótidos a base de morfolino pueden ser imitadores no iónicos de ácidos nucleicos. Una variedad de compuestos dentro de la clase de morfolino pueden unirse usando diferentes grupos de enlace. Una clase adicional de miméticos de polinucleótidos puede denominarse ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA). El anillo de furanosa normalmente presente en una molécula de ácido nucleico puede reemplazarse con un anillo de ciclohexenilo. Pueden prepararse monómeros de fosforamidita protegidos con DMT de CeNA y usarse para la síntesis de compuestos oligoméricos usando química de fosforamidita. La incorporación de monómeros de CeNA en una cadena de ácido nucleico puede aumentar la estabilidad de un híbrido de ADN/ARN. Los oligoadenilatos de CeNA pueden formar complejos con complementos de ácidos nucleicos con una estabilidad similar a la de los complejos nativos. Una modificación adicional puede incluir ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los que el grupo 2'-hidroxilo está enlazado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar formando de este modo un enlace 2'-C,4'-C-oximetileno formando de este modo una fracción de azúcar bicíclica. El enlace puede ser un grupo metileno (-CH2-), que une el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 o 2. LNA y los análogos de LNA pueden mostrar estabilidades térmicas dúplex muy altas con ácido nucleico complementario (Tm= de 3 a 10° C), estabilidad frente a la degradación 3'-exonucleolítica y buenas propiedades de solubilidad.
Un ácido nucleico también puede, en algunas realizaciones, incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo referidas simplemente como "bases"). Como se usa en la presente, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" pueden incluir las bases de purina (por ejemplo, adenina (A) y guanina (G)) y las bases de pirimidina (por ejemplo, timina (T), citosina (C) y uracilo (U)). Las nucleobases modificadas pueden incluir otras nucleobases sintéticas y naturales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Las nucleobases modificadas pueden incluir pirimidinas tricíclicas como fenoxazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazina-2(3H)-ona), abrazaderas G como una citidina de fenoxazina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoxazina -2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido(4,5-b)indol-2-ona), piridoindol citidina (Hpirido(3',':4,5)pirrolo[2,3-d ]pirimidin-2-ona).
Como se usa en la presente, el término "muestra" se refiere a una composición que comprende objetivos. Las muestras adecuadas para el análisis mediante los métodos, dispositivos y sistemas divulgados incluyen células, células individuales, tejidos, órganos u organismos.
Como se usa en la presente, el término "dispositivo de muestreo" o "dispositivo" se refiere a un dispositivo que puede tomar una sección de una muestra y/o colocar la sección sobre un sustrato. Un dispositivo de muestra puede referirse, por ejemplo, a una máquina de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), una máquina de clasificación de células, una aguja de biopsia, un dispositivo de biopsia, un dispositivo de corte de tejido, un dispositivo microfluídico, una rejilla de hojas y/o un micrótomo.
Como se usa en la presente, el término "soporte sólido" se refiere a superficies discretas sólidas o semisólidas a las que pueden unirse una pluralidad de códigos de barras estocásticos. Un soporte sólido puede abarcar cualquier tipo de esfera, bola, cojinete, cilindro u otra configuración similar sólida, porosa o hueca compuesta de material plástico, cerámico, metálico o polimérico (por ejemplo, hidrogel) sobre el que puede inmovilizarse un ácido nucleico (por ejemplo, covalentemente o no covalentemente). Un soporte sólido puede comprender una partícula discreta que puede ser esférica (por ejemplo, microesferas) o tener una forma no esférica o irregular, como cúbica, cuboide, piramidal, cilíndrica, cónica, oblonga o con forma de disco, y similares. Una pluralidad de soportes sólidos espaciados en una matriz pueden no comprender un sustrato. Un soporte sólido puede usar seindistintamente con el término "perla".
Un soporte sólido puede referirse a un "sustrato". Un sustrato puede ser un tipo de soporte sólido. Un sustrato puede referirse a una superficie continua sólida o semisólida sobre la cual pueden realizarse los métodos de la divulgación. Un sustrato puede referirse a una matriz, un cartucho, un chip, un dispositivo y un portaobjetos, por ejemplo. Como se usa en la presente, "soporte sólido" y "sustrato" pueden usarse indistintamente.
Como se usa en la presente, el término "código de barras estocástico" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende marcadores de la presente divulgación. Un código de barras estocástico puede ser una secuencia de polinucleótidos que puede usarse para la codificación con códigos de barras estocásticos. Los códigos de barras estocásticos pueden usarse para cuantificar objetivos dentro de una muestra. Los códigos de barras estocásticos pueden usarse para controlar los errores que pueden producirse después de que se haya asociado un marcador con un objetivo. Por ejemplo, puede usarse un código de barras estocástico para evaluar los errores de amplificación o secuenciación. Un código de barras estocástico asociado con un objetivo puede denominarse código de barras estocástico-objetivo o código de barras estocástico-etiqueta-objetivo.
Como se usa en la presente, el término "codificación con códigos de barras estocásticos" se refiere al marcado aleatorio (por ejemplo, codificación con códigos de barras) de ácidos nucleicos. La codificación con códigos de barras estocásticos puede utilizar una estrategia de Poisson recursiva para asociar y cuantificar marcadores asociados con los objetivos. Como se usa en la presente, el término "codificación con códigos de barras estocásticos" puede usarse indistintamente con "marcado estocástico".
Como se usa en la presente, el término "objetivo" se refiere a una composición que puede asociarse con un código de barras estocástico. Los objetivos adecuados ejemplares para el análisis mediante los métodos, dispositivos y sistemas descritos incluyen oligonucleótidos, ADN, ARN, ARNm, microARN, ARNt y similares. Los objetivos pueden ser de cadena sencilla o bicatenarios. En algunas realizaciones, los objetivos pueden ser proteínas. En algunas realizaciones, los objetivos son lípidos.
El término "transcriptasas inversas" se refiere a un grupo de enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa (es decir, que catalizan la síntesis de ADN a partir de una plantilla de ARN). En general, tales enzimas incluyen, pero no se limitan a, transcriptasa inversa retroviral, transcriptasa inversa de retrotransposón, transcriptasas inversas de retroplásmido, transcriptasas inversas de retrón, transcriptasas inversas bacterianas, transcriptasa inversa derivada de intrones del grupo II y mutantes, variantes o derivados de las mismas. Las transcriptasas inversas no retrovirales incluyen transcriptasas inversas de retrotransposones no LTR, transcriptasas inversas de retroplásmidos, transcriptasas inversas de retrones y transcriptasas inversas de intrones del grupo II. Los ejemplos de transcriptasas inversas del intrones del grupo II incluyen la transcriptasa inversa del intrón L1.LtrB de Lactococc s lactis, la transcriptasa inversa del intrón TeI4c de Thermosynechococcus elongatus, o la transcriptasa inversa del intrón GsI-IIC de Geobacillus stearothermophilus. Otras clases de transcriptasas inversas pueden incluir muchas clases de transcriptasas inversas no retrovirales (es decir, retrones, intrones del grupo II y retroelementos generadores de diversidad, entre otros).
El término "cambio de plantilla" se refiere a la capacidad de una transcriptasa inversa para cambiar de una plantilla de secuencia de ácidos nucleicos inicial al extremo 3' de una nueva plantilla de secuencia de ácidos nucleicos que tiene poca o ninguna complementariedad con el extremo 3' del ácido nucleico sintetizado de la plantilla inicial. Las copias de ácidos nucleicos de un polinucleótido objetivo pueden hacerse usando el cambio de plantilla. El cambio de plantilla permite, por ejemplo, preparar una copia de ADN usando una transcriptasa inversa que cambia de una plantilla de secuencia de ácidos nucleicos inicial al extremo 3' de una nueva plantilla de secuencia de ácidos nucleicos que tiene poca o ninguna complementariedad con el extremo 3' del ADN sintetizado a partir de la plantilla inicial, permitiendo de este modo la síntesis de un producto de ADN continuo que enlaza directamente una secuencia adaptadora a una secuencia de oligonucleótidos objetivo sin ligación. El cambio de plantilla puede comprender la ligadura del adaptador, cola de homopolímero (por ejemplo, poliadenilación), cebador aleatorio o un oligonucleótido con el que se puede asociar la polimerasa.
Códigos de barras estocásticos
Como se divulga en la presente, un código de barras estocástico puede ser una secuencia de polinucleótidos que puede usarse para marcar estocásticamente (por ejemplo, código de barras, etiqueta) un objetivo. Un código de barras estocástico puede comprender uno o más marcadores. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, marcadores universales, marcadores celulares, marcadores moleculares, marcadores de muestra, marcadores de placas, marcadores espaciales, marcadores preespaciales y cualquier combinación de los mismas. Un código de barras estocástico puede comprender una amina 5' que puede enlazar el código de barras estocástico a un soporte sólido. El código de barras estocástico puede comprender uno o más de un marcador universal, un marcador de dimensión, un marcador espacial, un marcador celular y un marcador molecular. El marcador universal puede ser el marcador más 5'. El marcador molecular puede ser el marcador más 3'. El marcador espacial, el marcador de dimensión y el marcador celular pueden estar en cualquier orden. En ciertas ocasiones, el marcador universal, el marcador espacial, el marcador de dimensión, el marcador celular y el marcador molecular están en cualquier orden. El código de barras estocástico puede comprender una región de unión al objetivo. La región de unión al objetivo puede interactuar con un objetivo (por ejemplo, ácido nucleico objetivo, ARN, ARNm, ADN) en una muestra. Por ejemplo, una región de unión al objetivo puede comprender una secuencia oligo dT que puede interactuar con las colas poli-A de los ARNm. En algunos casos, los marcadores del códigos de barras estocásticos (por ejemplo, marcador universal, marcador de dimensión, marcador espacial, marcador celular y marcador molecular) pueden estar separados por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos.
Un código de barras estocástico puede comprender uno o más marcadores universales. El uno o más marcadores universales pueden ser los mismos para todos los códigos de barras estocásticos en el conjunto de códigos de barras estocásticos (por ejemplo, unidos a un soporte sólido dado). En algunas realizaciones, el uno o más marcadores universales pueden ser los mismos para todos los códigos de barras estocásticos unidos a una pluralidad de perlas. En algunas realizaciones, un marcador universal comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridar con un cebador de secuenciación. Los cebadores de secuenciación pueden usarse para secuenciar códigos de barras estocásticos que comprenden un marcador universal. Los cebadores de secuenciación (por ejemplo, cebadores de secuenciación universales) pueden comprender cebadores de secuenciación asociados con plataformas de secuenciación de alto rendimiento. En algunas realizaciones, un marcador universal puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridar con un cebador de PCR. En algunas realizaciones, el marcador universal comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridar con un cebador de secuenciación y un cebador de PCR. A la secuencia de ácidos nucleicos del marcador universal que es capaz de hibridar con un cebador de secuenciación o de PCR puede hacerse referencia como sitio de unión del cebador. Un marcador universal puede comprender una secuencia que puede usarse para iniciar la transcripción del código de barras estocástico. Un marcador universal puede comprender una secuencia que puede usarse para la extensión del código de barras estocástico o una región dentro del código de barras estocástico. Un marcador universal puede tener, o tener por lo menos aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Un marcador universal puede comprender por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos. Un marcador universal puede tener como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un conector escindible o un nucleótido modificado es parte de la secuencia del marcador universal para permitir que el código de barras estocástico se escinda del soporte. Como se usa en la presente, un marcador universal puede usarse de manera intercambiable con "cebador de PCR universal".
Un código de barras estocástico puede comprender un marcador de dimensión. Un marcador de dimensión puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que proporciona información sobre una dimensión en la que se produjo el marcado estocástico. Por ejemplo, un marcador de dimensión puede proporcionar información sobre el momento en que se codificó estocásticamente un objetivo. Un marcador de dimensión puede asociarse con un tiempo de creación de código de barras estocástico en una muestra. Un marcador de dimensión puede activarse en el momento del marcado estocástico. Pueden activarse diferentes marcadores de dimensión en diferentes momentos. El marcador de dimensión proporciona información sobre el orden en el que los objetivos, grupos de objetivos y/o muestras se codificaron con barras estocásticamente. Por ejemplo, puede codificarse con códigos de barras estocásticamente una población de células en la fase G0 del ciclo celular. Las células pueden pulsarse de nuevo con códigos de barras estocásticos en la fase G1 del ciclo celular. Las células pueden pulsarse de nuevo con códigos de barras estocásticos en la fase S del ciclo celular, y así sucesivamente. Los códigos de barras estocásticos en cada pulso (por ejemplo, cada fase del ciclo celular) pueden comprender diferentes marcadores de dimensión. De esta forma, el marcador de dimensión proporciona información sobre qué objetivos se marcaron en qué fase del ciclo celular. Los marcadores de dimensión pueden interrogar muchos tiempos biológicos diferentes. Los tiempos biológicos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, el ciclo celular, la transcripción (por ejemplo, el inicio de la transcripción) y la degradación de la transcripción. En otro ejemplo, una muestra (por ejemplo, una célula, una población de células) puede marcarse estocásticamente antes y/o después del tratamiento con un fármaco y/o terapia. Los cambios en el número de copias de distintos objetivos pueden ser indicativos de la respuesta de la muestra al fármaco y/o a la terapia.
En algunas realizaciones, un marcador de dimensión es activable. Un marcador de dimensión activable puede activarse, por ejemplo, en un punto temporal específico. El marcador de dimensión activable puede activarse constitutivamente (por ejemplo, no apagarse). El marcador de dimensión activable puede activarse de manera reversible (por ejemplo, el marcador de dimensión activable puede encenderse y apagarse). El marcador de dimensión puede activarse de manera reversible por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces. El marcador de dimensión puede activarse de manera reversible 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces. Por ejemplo, el marcador de dimensión puede activarse con fluorescencia, luz, un evento químico (por ejemplo, escisión, ligamiento de otra molécula, adición de modificaciones (por ejemplo, pegilado, sumoilado, acetilado, metilado, desacetilado, desmetilado), un evento fotoquímico (por ejemplo, fotoenvejecimiento), e introducción de un nucleótido no natural.
El marcador de dimensión puede ser idéntico para todos los códigos de barras estocásticos unidos a un soporte sólido determinado (por ejemplo, perlas), pero diferente para diferentes soportes sólidos (por ejemplo, perlas). En algunas realizaciones, por lo menos el 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido comprenden el mismo marcador de dimensión. En algunas realizaciones, por lo menos el 60% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido comprenden el mismo marcador de dimensión. En algunas realizaciones, por lo menos el 95% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido comprenden el mismo marcador de dimensión.
Puede haber tantas como 106 o más secuencias de marcadores de dimensión únicas representadas en una pluralidad de soportes sólidos (por ejemplo, perlas). Un marcador de dimensión puede, por ejemplo, tener o tener por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Un marcador de dimensión puede tener como máximo 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos o más nucleótidos de longitud. Un marcador de dimensión puede, por ejemplo, tener una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 nucleótidos, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 nucleótidos. En algunas realizaciones, un marcador de dimensión tiene de aproximadamente 20 a aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.
Un código de barras estocástico puede comprender un marcador espacial. Un marcador espacial puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que proporciona información sobre la orientación espacial de una molécula objetivo que está asociada con el código de barras estocástico. Un marcador espacial puede asociarse con una coordenada en una muestra. La coordenada puede ser una coordenada fija. Por ejemplo, una coordenada puede fijarse con referencia a un sustrato. Un marcador espacial puede ser con referencia a una cuadrícula de dos o tres dimensiones. Una coordenada puede fijarse con referencia a un punto de referencia. El punto de referencia puede ser identificable en el espacio. Un punto de referencia puede ser una estructura de la que puede obtenerse una imagen. Un punto de referencia puede ser una estructura biológica, por ejemplo, un punto de referencia anatómico. Un punto de referencia puede ser un punto de referencia celular, por ejemplo, un orgánulo. Un punto de referencia puede ser un punto de referencia no natural, como una estructura con un identificador identificable, como un código de color, un código de barras, una propiedad magnética, fluorescentes, radiactividad o un tamaño o forma únicos. Un marcador espacial puede asociarse con una partición física (por ejemplo, un pocillo, un recipiente o una gota). En algunos casos, se usan varios marcadores espaciales juntos para codificar una o más posiciones en el espacio.
El marcador espacial puede ser idéntico para todos los códigos de barras estocásticos unidos a un soporte sólido determinado (por ejemplo, una perla), pero diferente para diferentes soportes sólidos (por ejemplo, perlas). En algunas realizaciones, por lo menos el 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido comprenden el mismo marcador espacial. En algunas realizaciones, por lo menos el 60% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido comprenden el mismo marcador espacial. En algunas realizaciones, por lo menos el 95% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido comprenden el mismo marcador espacial.
Puede haber tantas como 106 o más secuencias de marcadores espaciales únicos representadas en una pluralidad de soportes sólidos (por ejemplo, perla). Un marcador espacial puede tener, o tener por lo menos aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un marcador espacial tiene aproximadamente 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 nucleótidos de longitud. Un marcador espacial puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 nucleótidos. Un marcador espacial puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 nucleótidos. Un marcador espacial puede tener una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 125 nucleótidos.
Los códigos de barras estocásticos pueden comprender un marcador celular. Un marcador celular puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que proporciona información para determinar qué ácido nucleico objetivo se originó a partir de qué célula. En algunas realizaciones, el marcador celular es idéntico para todos los códigos de barras estocásticos unidos a un soporte sólido dado (por ejemplo, perla), pero diferente para diferentes soportes sólidos (por ejemplo, perlas). En algunas realizaciones, por lo menos el 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido comprenden el mismo marcador celular. En algunas realizaciones, por lo menos el 60% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido comprenden el mismo marcador celular. En alguna realización, por lo menos el 95% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido comprenden el mismo marcador celular.
Puede haber hasta 106 o más secuencias de marcadores celulares únicas representadas en una pluralidad de soportes sólidos (por ejemplo, perlas). Un marcador celular puede tener por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Un marcador celular puede tener, o tener como máximo, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos o más nucleótidos de longitud. Un marcador celular puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 nucleótidos. Un marcador celular puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 nucleótidos. Un marcador celular puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 125 nucleótidos.
Los códigos de barras estocásticos pueden comprender un marcador molecular. Un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que proporciona información de identificación para el tipo específico de especie de ácido nucleico objetivo hibridada con el código de barras estocástico. Un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que proporciona un contador para la aparición específica de la especie de ácido nucleico objetivo hibridada con el código de barras estocástico (por ejemplo, región de unión al objetivo). En algunas realizaciones, se une un conjunto diverso de marcadores moleculares a un soporte sólido dado (por ejemplo, perla). En algunas realizaciones, puede haber tantas como 106 o más secuencias de marcadores moleculares únicas unidas a un soporte sólido dado (por ejemplo, perla). En algunas realizaciones, puede haber hasta 105 o más secuencias de marcadores moleculares únicas unidas a un soporte sólido dado (por ejemplo, perla). En algunas realizaciones, puede haber hasta 104 o más secuencias de marcadores moleculares únicas unidas a un soporte sólido dado (por ejemplo, perla). En algunas realizaciones, puede haber hasta 103 o más secuencias de marcadores moleculares únicas unidas a un soporte sólido dado (por ejemplo, perla). En algunas realizaciones, puede haber hasta 102 o más secuencias de marcadores moleculares únicas unidas a un soporte sólido dado (por ejemplo, perla). Un marcador molecular puede tener por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Un marcador molecular puede tener como máximo 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos nucleótidos en longitud.
Los códigos de barras estocásticos pueden comprender una región de unión al objetivo. En algunas realizaciones, las regiones de unión al objetivo comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida específicamente con un objetivo (por ejemplo, ácido nucleico objetivo, molécula objetivo, por ejemplo, un ácido nucleico celular a analizar), por ejemplo, con una secuencia génica específica. En algunas realizaciones, una región de unión al objetivo comprende una secuencia de ácidos nucleicos que puede unirse (por ejemplo, hibridar) a una localización específica de un ácido nucleico objetivo específico. En algunas realizaciones, la región de unión al objetivo comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es capaz de hibridación específica con un saliente del sitio de restricción (por ejemplo, un saliente del extremo pegajoso de EcoRI). Luego, el código de barras estocástico puede ligarse a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia complementaria al saliente del sitio de restricción.
Un código de barras estocástico puede comprender una región de unión al objetivo. Una región de unión al objetivo puede hibridar con un objetivo de interés. Por ejemplo, una región de unión a la objetivo puede comprender un oligo dT que puede hibridar con ARNm que comprenden extremos poliadenilados. Una región de unión al objetivo puede ser específica de un gen. Por ejemplo, una región de unión al objetivo puede configurarse para hibridar con una región específica de un objetivo. Una región de unión al objetivo puede tener, o tener por lo menos, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud. Una región de unión al objetivo puede tener como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 2627, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud. Una región de unión a la objetivo puede tener una longitud de 5 a 30 nucleótidos. Cuando un código de barras estocástico comprende una región de unión al objetivo específica del gen, el código de barras estocástico pude denominarse como código de barras estocástico específico del gen.
Una región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos objetivo no específica. Una secuencia de ácidos nucleicos objetivo no específica puede referirse a una secuencia que puede unirse a múltiples ácidos nucleicos objetivo, independientemente de la secuencia específica del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, la región de unión al objetivo puede comprender una secuencia multimérica aleatoria o una secuencia de oligo-dT que hibrida con la cola poli-A en moléculas de ARNm. Una secuencia de multímeros aleatoria puede ser, por ejemplo, una secuencia aleatoria de dímero, trímero, cuátramero, pentámero, hexámero, septámero, octámero, nonámero, decámero o multímero superior de cualquier longitud. En algunas realizaciones, la región de unión al objetivo es la misma para todos los códigos de barras estocásticos unidos a una perla dada. En algunas realizaciones, las regiones de unión al objetivo para la pluralidad de códigos de barras estocásticos unidos a una perla dada comprenden dos o más secuencias de unión al objetivo diferentes. Una región de unión al objetivo puede tener, o tener por lo menos aproximadamente, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una región de unión al objetivo tiene como máximo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud.
Un código de barras estocástico puede comprender una propiedad de orientación que puede usarse para orientar (por ejemplo, alinear) los códigos de barras estocásticos. Un código de barras estocástico puede comprender una fracción para el enfoque isoeléctrico. Diferentes códigos de barras estocásticos pueden comprender diferentes puntos de enfoque isoeléctrico. Cuando estos códigos de barras estocásticos se introducen en una muestra, la muestra puede someterse a un enfoque isoeléctrico para orientar los códigos de barras estocásticos de una manera conocida. De esta manera, puede usarse la propiedad de orientación para desarrollar un mapa conocido de códigos de barras estocásticos en una muestra. Las propiedades de orientación ejemplares incluyen, pero no se limitan a, movilidad electroforética (por ejemplo, en base al tamaño del código de barras estocástico), punto isoeléctrico, espín, conductividad y/o autoensamblaje. Por ejemplo, los códigos de barras estocásticos pueden comprender una propiedad de orientación de autoensamblaje, pueden autoensamblarse en una orientación específica (por ejemplo, nanoestructura de ácidos nucleicos) tras la activación.
Un código de barras estocástico puede comprender una propiedad de afinidad. Un marcador espacial puede comprender una propiedad de afinidad. Puede incluirse una propiedad de afinidad en una fracción química y/o biológica que puede facilitar la unión del código de barras estocástico a otra entidad (por ejemplo, receptor celular). Por ejemplo, una propiedad de afinidad puede comprender un anticuerpo. Un anticuerpo puede ser específico para una fracción específica (por ejemplo, receptor) en una muestra. Un anticuerpo puede guiar el código de barras estocástico a un tipo de célula o molécula específica. Los objetivos en y/o cerca del tipo de célula o molécula específicos pueden marcarse estocásticamente. Una propiedad de afinidad también puede proporcionar información espacial además de la secuencia de nucleótidos del marcador espacial porque el anticuerpo puede guiar el código de barras estocástico a una localización específica. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. Un anticuerpo puede humanizarse. Un anticuerpo puede ser quimérico. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo desnudo. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo de fusión.
Un anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, de origen natural o formada por procesos de recombinación de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales) (por ejemplo, un anticuerpo de IgG) o una porción inmunológicamente activa (es decir, que se une específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo.
Un anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo puede ser una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv y similares. Un fragmento de anticuerpo puede unirse con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo completo. Un fragmento de anticuerpo puede incluir fragmentos aislados que consisten en las regiones variables de los anticuerpos, como los fragmentos "Fv" que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y moléculas de polipéptidos de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un conector peptídico ("proteínas scFv"). Los anticuerpos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos para anticuerpos para células cancerígenas, anticuerpos para virus, anticuerpos que se unen a receptores de la superficie celular (CD8, CD34, CD45) y anticuerpos terapéuticos.
El marcador celular y/o cualquier marcador de la divulgación pueden comprender además un conjunto único de subsecuencias de ácidos nucleicos de longitud definida, por ejemplo, 7 nucleótidos cada una (equivalente a la cantidad de bits usados en algunos códigos de corrección de errores de Hamming), que están diseñados para proporcionar la capacidad de corrección de errores. Los códigos de Hamming, al igual que otros códigos de corrección de errores, se basan en el principio de redundancia y pueden construirse añadiendo bits de paridad redundantes a los datos que se transmitirán a través de un medio ruidoso. Dichos códigos de corrección de errores pueden codificar identificadores de muestra con bits de paridad redundantes y "transmitir" estos identificadores de muestra como palabras de código. Un código Hamming puede hacer referencia a un proceso aritmético que identifica códigos binarios únicos basados en la redundancia inherente que son capaces de corregir errores de un solo bit. Por ejemplo, un código de Hamming puede emparejarse con un código de barras de ácido nucleico para detectar errores de nucleótidos individuales que se producen durante la amplificación de ácidos nucleicos. La identificación de un error de un solo nucleótido mediante el uso de un código Hamming puede permitir, por lo tanto, la corrección del código de barras del ácido nucleico.
Los códigos de Hamming pueden representarse mediante un subconjunto de posibles palabras de código que se eligen del centro de esferas multidimensionales (es decir, por ejemplo, hiperesferas) en un subespacio binario. Los errores de un solo bit pueden caer dentro de las hiperesferas asociadas con una palabra de código específica y, por lo tanto, pueden corregirse. Por otro lado, los errores de doble bit que no están asociados con una palabra de código específica pueden detectarse, pero no corregirse. Considerar una primera hiperesfera centrada en las coordenadas (0, 0, 0) (es decir, por ejemplo, usando un sistema de coordenadas x-y-z), en donde cualquier error de un solo bit puede corregirse al caer dentro de un radio de 1 desde las coordenadas del centro; es decir, por ejemplo, errores de un solo bit que tienen las coordenadas de (0, 0, 0); (0, 1, 0); (0, 0, 1); (1, 0, 0), o (1, 1, 0). De igual manera, puede construirse una segunda hiperesfera en donde los errores de un solo bit pueden corregirse al caer dentro de un radio de 1 de sus coordenadas centrales (1, 1, 1) (es decir, por ejemplo, (1, 1, 1); (1, 0, 1); (0, 1, 0); o (0, 1, 1).
En algunas realizaciones, la longitud de las subsecuencias de ácidos nucleicos usadas para crear códigos de corrección de errores puede variar, por ejemplo, pueden tener una longitud de por lo menos 3 nucleótidos, por lo menos 7 nucleótidos, por lo menos 15 nucleótidos o por lo menos 31 nucleótidos. En algunas realizaciones, pueden usarse subsecuencias de ácidos nucleicos de otras longitudes para crear códigos de corrección de errores.
Cuando un código de barras estocástico comprende más de un tipo de marcador (por ejemplo, más de un marcador celular o más de un marcador molecular), los marcadores pueden intercalarse con una secuencia de marcador conector. Una secuencia de marcador conector puede tener por lo menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Una secuencia de marcador conector puede tener como máximo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunos casos, una secuencia de marcador conector tiene una longitud de 12 nucleótidos. Puede usarse una secuencia de marcador conector para facilitar la síntesis del código de barras estocástico. El marcador conector puede comprender un código de corrección de errores (por ejemplo, Hamming).
Códigos de barras combinatorios
Puede usarse una gran cantidad de códigos de barras combinatorios diferentes para marcar una gran cantidad de muestras, como células individuales o fragmentos de ácidos nucleicos, para análisis en paralelo, como la secuenciación. Como se divulga en la presente, puede generarse un conjunto de un gran número de códigos de barras combinatorios a partir de un número relativamente pequeño de secuencias de subunidades de códigos de barras en donde las secuencias de subunidades de códigos de barras están conectadas entre sí mediante varias combinaciones. De esta manera, el número de códigos de barras combinatorios diferentes generados puede incrementarse significativamente a través de aumentos relativamente pequeños en el número de secuencias de subunidades de códigos de barras diferentes, el número de secuencias de subunidades de códigos de barras conectadas entre sí en un código de barras combinatorio, o ambos.
Algunas realizaciones divulgadas en la presente proporcionan composiciones que comprenden un conjunto de códigos de barras combinatorios. Un código de barras combinatorio puede comprender dos o más secuencias de subunidades de códigos de barras que están conectadas entre sí a través de una secuencia conectora, una secuencia de nucleótidos objetivo o ambas. Dos o más secuencias de subunidades de códigos de barras pueden, por ejemplo, formar un código de barras combinatorio conectándose entre sí a través de la hibridación de una o más secuencias conectoras seguido de extensión. Por ejemplo, una secuencia conectora enlazada a una secuencia de subunidades de códigos de barras puede hibridar con una secuencia conectora enlazada a otra secuencia de subunidades de códigos de barras y usar la otra secuencia de subunidades de códigos de barras como plantilla en una reacción de extensión para incorporar la otra secuencia de subunidades de códigos de barras, y así sucesivamente. En algunas realizaciones, dos secuencias de subunidades de códigos de barras pueden hibridar ambas con una secuencia de nucleótidos objetivo, seguido de dos reacciones de extensión para incorporar las dos secuencias de subunidades de códigos de barras en la secuencia de nucleótidos objetivo.
En algunas realizaciones, el número de secuencias de subunidades de códigos de barras en un código de barras combinatorio y, por lo tanto, la longitud del código de barras combinatorio, pueden verse afectados por el diseño de las secuencias conectoras. Por ejemplo, para generar un código de barras combinatorio que tenga m secuencias de subunidades de códigos de barras, pueden usarse m-1 o m-2 secuencias conectoras, en donde m es un número entero > 2. Si se usan n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas para generar un código de barras combinatorio que tenga m secuencias de subunidades de códigos de barras, puede generarse un número máximo de nm códigos de barras combinatorios únicos. En algunas realizaciones, el código de barras combinatorio puede comprender un oligonucleótido que comprende la fórmula: secuencia de subunidad de código de barrasaconector1-secuencia de subunidad de código de barrasb-conector2-...secuencia de subunidad de código de barrascconectorm-1-secuencia de subunidad de código de barrasd. En algunas realizaciones, el código de barras combinatorio puede comprender un primer oligonucleótido que comprende la fórmula secuencia de subunidad de código de barrasa-conecton-secuencia de subunidad de código de barrasb-conector2-...-secuencia de subunidad de código de barrasc; y un segundo oligonucleótido que comprende la secuencia de subunidad de código de barrasd-...-conector3-secuencia de subunidad de código de barrase-conectorm-2 -secuencia de subunidad de código de barrasf. El primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido pueden estar conectados entre sí por una secuencia de nucleótidos objetivo. En algunas realizaciones, cada una de la secuencia de subunidades de códigos de barrasa, la secuencia de subunidades de códigos de barrasb, la secuencia de subunidades de códigos de barrasc,... en un código de barras combinatorio se selecciona de un conjunto de n secuencias de subunidades de códigos de barras únicas. En algunas realizaciones, algunas o todas de la secuencia de subunidades de códigos de barrasa, secuencia de subunidades de códigos de barrasb, secuencia de subunidades de códigos de barrasc,... en un código de barras combinatorio pueden ser iguales. En algunas realizaciones, parte o la totalidad de la secuencia de la subunidades de códigos de barrasa, la secuencia de subunidades de códigos de barrasb, la secuencia de subunidades de códigos de barrasc,... en un código de barras combinatorio puede ser diferente.
En algunas realizaciones, un conjunto de códigos de barras combinatorios comprende por lo menos 1.000, por lo menos 10.000, por lo menos 100.000, por lo menos 200.000, por lo menos 300.000, por lo menos 400.000, por lo menos 500.000, por lo menos 1.000.000, por lo menos 10.000.000, por lo menos 100.000.000 por lo menos 1.000.000.000 o más códigos de barras combinatorios únicos.
Un código de barras combinatorio puede comprender uno o más códigos de barras estocásticos divulgados en la presente. Por ejemplo, un código de barras combinatorio puede comprender uno o más marcadores universales, marcadores celulares, marcadores moleculares, marcadores de muestras, marcadores de placas, marcadores espaciales, marcadores preespaciales o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un código de barras estocástico, como un marcador celular, un marcador de muestra, un marcador espacial, etc., puede comprender dos o más secuencias de subunidades de códigos de barras, por ejemplo, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, o más secuencias de subunidades de códigos de barras.
En algunas realizaciones, los códigos de barras combinatorios pueden inmovilizarse en un soporte sólido, como una perla o un micropocillo en una matriz de micropocillos. Como se muestra en la Figura 8, un soporte sólido, como una perla o una micropartícula, puede recubrirse con una primera pluralidad de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, los códigos de barras combinatorios pueden comprender uno o más de una secuencia universal (US), un marcador celular, un conector, un marcador molecular, una región específica del objetivo como una secuencia de oligo(dT). En algunas realizaciones, el soporte sólido puede comprender una segunda pluralidad de códigos de barras combinatorios que tiene la misma estructura (pero no necesariamente la misma secuencia) que la primera pluralidad de códigos de barras combinatorios, excepto por tener un cebador espacial en lugar de una región específica del objetivo. En algunas realizaciones, la segunda pluralidad de códigos de barras combinatorios es menor en número, por ejemplo, 1/10, 1/100, 1/1000 del número de la primera pluralidad de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, la segunda pluralidad de códigos de barras combinatorios se usa para introducir un marcador espacial a través de PCR universal. La segunda pluralidad de códigos de barras combinatorios puede añadirse imprimiendo o dispensando en cada pocillo. En algunas realizaciones, la segunda pluralidad de código de barras combinatorio puede administrarse mediante una segunda perla en el mismo pocillo con una primera perla.
Códigos de barras de componentes
Como se divulga en la presente, dos o más códigos de barras de componentes, cada uno de los cuales comprende una secuencia de subunidad de código de barras, pueden conectarse entre sí a través de una o más secuencias conectoras para generar un código de barras combinatorio. Por ejemplo, cada uno de los códigos de barras de componentes puede comprender una secuencia de subunidades de códigos de barras y una o más secuencias conectoras o el complemento de la misma, y dos o más códigos de barras de componentes están configurados para conectarse entre sí a través de una o dos secuencias conectoras o los complementos de las mismas para producir un conjunto de códigos de barras combinatorios. Un código de barras de componente puede comprender una secuencia de subunidades de códigos de barras, una secuencia conectora, una región específica del objetivo o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, un código de barras de componente puede comprender una de las siguientes configuraciones: a) secuencia de subunidad de código de barras-secuencia conectora (es decir, el código de barras del componente comprende tanto una secuencia de unidades de código de barras como una secuencia conectora, donde la secuencia de la subunidad del código de barras está localizada en la parte 5' del código de barras del componente con respecto a la secuencia conectora); b) complemento de secuencia conectora-secuencia de subunidad de código de barras-secuencia conectora; c) complemento de secuencia conectora-secuencia de subunidad de código de barras; d) secuencia de la subunidad del código de barras-complemento de la secuencia conectora; e) secuencia conectora-secuencia de subunidad de código de barras-complemento de la secuencia conectora; o f) secuencia conectora-secuencia de subunidad de código de barras. En algunas realizaciones, una secuencia de subunidades de códigos de barras y una secuencia conectora pueden estar enlazadas no directamente por un enlace químico. Por ejemplo, una secuencia de subunidades de códigos de barras y una secuencia conectora pueden enlazarse a través de una fracción química o biológica.
Un código de barras de componente, o reactivo de códigos de barras combinatorios, puede comprender una sección de código de subunidad que comprende una secuencia de subunidad de código de barras. Un reactivo de códigos de barras combinatorios puede comprender 1, 2, 3, 4 o 5 o más secciones de código de subunidades. Un reactivo de códigos de barras combinatorios puede comprender por lo menos, o como máximo, 1, 2, 3, 4 o 5 secciones de código de subunidades. En algunos casos, un reactivo de códigos de barras combinatorios tiene 1 sección de código de subunidad. Una sección de código de subunidad puede comprender una secuencia de código de subunidad. Una secuencia de código de subunidad, o una secuencia de subunidad de código de barras, que se usan indistintamente, pueden referirse a una secuencia única de nucleótidos en el reactivo de códigos de barras combinatorios. Una sección de código de subunidad puede tener, o tener por lo menos, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 o más nucleótidos de longitud. Una sección de código de subunidad puede tener como máximo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 nucleótidos de longitud. En algunos casos, una sección de código de subunidad es 6 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, cada posición de la sección de código de la subunidad tiene una opción de 4 nucleótidos (por ejemplo, A, T, C y G). Si cada sección de código de subunidad tiene una longitud de n nucleótidos, donde n es un número entero positivo, el número de secuencias de códigos de subunidades únicas posibles para una sección de código de subunidad puede ser 4n. Por ejemplo, si una sección de código de subunidad tiene una longitud de 6 nucleótidos y cada posición tiene una opción de 4 nucleótidos, el número total de secuencias de códigos de subunidades únicas posibles puede ser de 4.096 códigos.
Puede usarse un subconjunto de posibles secuencias de códigos de subunidades como reactivos de códigos de barras combinatorios de la divulgación. El subconjunto de posibles secuencias de códigos de subunidades puede seleccionarse en base a sus propiedades de corrección de errores. Por ejemplo, el subconjunto de posibles secuencias de códigos de subunidades puede tener secuencias que estén lo suficientemente separadas (por ejemplo, tener secuencias suficientemente diferentes, distancia) de tal manera que las secuencias de códigos de subunidades puedan corregir los errores de base (por ejemplo, 1 o 2 errores de base). En otro ejemplo, el subconjunto de secuencias de códigos de subunidades puede tener una longitud y un número que incorpore códigos de barras de corrección de errores de la divulgación (por ejemplo, códigos de Hamming) en las secuencias.
El número de secuencias de códigos de subunidades en un subconjunto puede ser, o ser por lo menos, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 o más. En algunas realizaciones, el número de secuencias de códigos de subunidades en un subconjunto es como máximo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45. En algunas realizaciones, el número de secuencias de códigos de subunidades en un subconjunto es 24. Las secuencias de códigos de subunidades pueden ser diferentes entre sí. Las secuencias de códigos de subunidades pueden diferir en, o por lo menos, en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, las secuencias de códigos de subunidades pueden diferir en como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos. Las secuencias de códigos de subunidades pueden ser un conjunto de secuencias sin hibridación cruzada. Las secuencias de códigos de subunidades pueden corregir errores.
Un reactivo de códigos de barras combinatorios puede comprender uno o más conectores. Un conector puede usarse para unir reactivos de códigos de barras combinatorios (por ejemplo, concatenar reactivos de códigos de barras combinatorios entre sí). Un conector puede configurarse para hibridar con un conector de otro reactivo de códigos de barras combinatorios (por ejemplo, concatenando de este modo los reactivos de códigos de barras combinatorios). Un conector puede ser 3' del código de subunidad del reactivo de códigos de barras combinatorios. Un conector puede ser 5' del código de subunidad del reactivo de códigos de barras combinatorios. Un conector puede ser tanto 3' como 5' del código de subunidad del reactivo de códigos de barras combinatorios. Un conector puede tener, o tener por lo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un conector puede tener como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia conectora de un primer reactivo de códigos de barras combinatorios puede hibridar con una secuencia conectora de un segundo reactivo de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, una secuencia conectora de un primer reactivo de códigos de barras combinatorios puede ser el complemento de una secuencia conectora de un segundo reactivo de códigos de barras combinatorios. En algunas realizaciones, una secuencia conectora de un primer reactivo de códigos de barras combinatorios puede hibridar con una secuencia conectora de un segundo reactivo de códigos de barras combinatorios con, o con por lo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más malapareamientos. En algunas realizaciones, una secuencia conectora de un primer reactivo de códigos de barras combinatorios puede hibridar con una secuencia conectora de un segundo reactivo de códigos de barras combinatorios con como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más malapareamientos
En algunas realizaciones, un reactivo de códigos de barras combinatorios comprende una región específica del objetivo. Una región específica del objetivo puede asociarse (por ejemplo, hibridar) con un polinucleótido objetivo de la divulgación (por ejemplo, de una única célula). Una región específica de objetivo puede comprender un oligodT, una secuencia específica de gen o una secuencia multimérica aleatoria. Una región específica del objetivo puede hibridar con una cadena sentido de un polinucleótido objetivo de cadena doble de la divulgación. Una región específica del objetivo puede hibridar con una cadena antisentido de un polinucleótido objetivo de cadena doble de la divulgación. Una región específica de objetivo puede tener, o tener por lo menos, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una región específica de objetivo puede tener como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, un reactivo de códigos de barras combinatorios comprende uno o más marcadores celulares, marcadores moleculares, marcadores universales, regiones de unión al objetivo o cualquier marcador de la divulgación, o cualquier combinación de los mismos.
Los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden estar compuestos por cualquier tipo de ácido nucleico (por ejemplo, PNA, LNA). Los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden unirse a un sólido o semisoporte (por ejemplo, una perla, una partícula de gel, un anticuerpo, un hidrogel, agarosa). Los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden inmovilizarse en un sustrato de la divulgación (por ejemplo, una matriz). Los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden incorporarse en un paquete biológico, como un virus, un liposoma, una microesfera, etc. Los reactivos combinatorios pueden comprender fracciones. Las fracciones pueden actuar como identificadores (por ejemplo, fracción fluorescente, fracción radiactiva).
Conjuntos de códigos de barras de componentes
Algunas realizaciones divulgadas en la presente proporcionan composiciones que comprenden un conjunto de códigos de barras de componentes para producir un conjunto de códigos de barras combinatorios. El número de reactivos de códigos de barras combinatorios únicos en un conjunto puede ser n x m, donde n es el número de secuencias de códigos de subunidades (n) y m es el número de secciones de códigos de subunidades en un código de barras combinatorio (m), y donde n y m son números enteros positivos. Por ejemplo, cuando el subconjunto de secuencias de códigos de subunidades es 24 y hay 4 secciones de códigos de subunidades en un código de barras combinatorio, puede haber 96 reactivos de códigos de barras combinatorios únicos en total. El número máximo del conjunto de códigos de barras combinatorios únicos que pueden generarse usando el código de barras de componente único de n x m es nm, donde n es el número de secuencias de códigos de subunidades y m es el número de secciones de códigos de subunidades en un código de barras combinatorio. Por ejemplo, si hay 24 secuencias de códigos de subunidades y 4 secciones de códigos de subunidades en un código de barras combinatorio, puede generarse un conjunto máximo de 331.776 códigos de barras combinatorios únicos a partir del conjunto de 96 reactivos de códigos de barras combinatorios únicos.
El número de secciones de código de subunidades en un código de barras combinatorio puede ser, o ser por lo menos, de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más. El número de secciones de código de subunidad en un código de barras combinatorio puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas realizaciones, el número de secciones de código de subunidad en un código de barras combinatorio es 4 (como se muestra en la Figura 1).
Algunos reactivos de códigos de barras combinatorios del conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios pueden comprender una región específica del objetivo. El número de reactivos de códigos de barras combinatorios en un conjunto que comprende una región específica de objetivo puede ser, o ser por lo menos, de 1, 2, 3, 4 o 5 o más. En algunas realizaciones, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en un conjunto que comprende una región específica del objetivo puede ser como máximo de 1, 2, 3, 4 o 5. Como se muestra en las Figuras 2A-C, en algunas realizaciones, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en un conjunto que comprende una región específica del objetivo es por lo menos de 2. En algunos casos, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en un conjunto que comprende una región específica del objetivo es 2 (Figuras 2A-B). En algunas realizaciones, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en un conjunto que comprende una región específica del objetivo es por lo menos 1. En algunos casos, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en un conjunto que comprende una región específica del objetivo es 1 (Figura 2C).
Un conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios puede comprender algunos reactivos de códigos de barras combinatorios que comprenden una región específica del objetivo y algunos reactivos de códigos de barras combinatorios que no comprenden una región específica del objetivo. En algunos casos, un conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios comprende un reactivo de códigos de barras combinatorios con una región específica del objetivo, y el resto de los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden no tener una región específica del objetivo (por ejemplo, pueden comprender una sección/secuencia de código de subunidad y uno o más conectores). En algunos casos, un conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios comprende dos reactivos de códigos de barras combinatorios con una región específica del objetivo, y el resto de los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden no tener una región específica del objetivo (por ejemplo, pueden comprender una sección/secuencia de código de subunidad y uno o más conectores).
El número de reactivos de códigos de barras combinatorios en un conjunto que puede no tener una región específica del objetivo puede ser, o ser por lo menos, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más. En algunas realizaciones, el número de reactivos de códigos de barras combinatorios en un conjunto que puede no tener una región específica de objetivo puede ser como máximo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
Un conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios puede codificar una pluralidad de códigos de barras combinatorios. Un código de barras combinatorio puede comprender la secuencia total de los reactivos de códigos de barras combinatorios del conjunto (es decir, para un polinucleótido objetivo dado). Un código de barras combinatorio puede ser la secuencia total de reactivos de códigos de barras combinatorios concatenados (por ejemplo, enlazados entre sí a través de conectores) para un polinucleótido objetivo dado. Un código de barras combinatorio puede incluir las secuencias conectoras de los reactivos de códigos de barras combinatorios. Un código de barras combinatorio puede excluir las secuencias conectoras de los reactivos del código de barras combinatorio (por ejemplo, solo incluye las secuencias de códigos de subunidades). Un código de barras combinatorio puede ser la secuencia total de las secuencias de las secciones de código de subunidades de los reactivos de códigos de barras combinatorios, para un polinucleótido objetivo dado.
En algunas realizaciones, un código de barras combinatorio puede referirse a (por ejemplo, formarse cuando) dos o más reactivos de códigos de barras combinatorios hibridados entre sí a través de una o más secuencias conectoras y/o hibridados con un polinucleótido objetivo a través de una o más regiones específicas del objetivo. En algunas realizaciones, un código de barras combinatorio puede referirse a dos o más reactivos de códigos de barras combinatorios incorporados en un solo polinucleótido con o sin un polinucleótido objetivo mediante extensión, transcripción inversa y/o amplificación.
En algunas realizaciones, un código de barras combinatorio puede ser bipartito. Una parte de un código de barras combinatorio puede conectarse al extremo 5' de un polinucleótido objetivo. Una parte de un código de barras combinatorio puede conectarse al extremo 3' del polinucleótido objetivo. El código de barras combinatorio completo puede conectarse al extremo 5' de un polinucleótido objetivo. El código de barras combinatorio completo puede conectarse al extremo 3' de un polinucleótido objetivo.
Una combinación de reactivos de códigos de barras combinatorios puede formar un código de barras combinatorio. El código de barras combinatorio puede comprender uno o más marcadores celulares, marcadores moleculares, marcadores universales, regiones de unión al objetivo, cualquier marcador de la divulgación o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, un reactivo de códigos de barras combinatorios puede no comprender un marcadora. Por ejemplo, si un código de barras combinatorio se compone de 4 reactivos de códigos de barras combinatorios, 1 reactivo de códigos de barras combinatorios puede no comprender un marcador, y 3 reactivos de códigos de barras combinatorios del código de barras combinatorio pueden comprender cualquier marcador divulgado en la presente. Un reactivo de códigos de barras combinatorios puede comprender un código de barras estocástico de la divulgación.
El conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios puede ser aleatorio. Por ejemplo, todas o algunas de las secuencias conectoras en un código de barras combinatorio pueden ser las mismas. Por lo tanto, los códigos de barras de los componentes pueden enlazarse en cualquier orden. El conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios puede ser no aleatorio. Por ejemplo, todas las secuencias conectoras en un código de barras combinatorio pueden ser diferentes. Por lo tanto, el orden de los códigos de barras de los componentes puede enlazarse en un orden específico.
En algunas realizaciones, un reactivo de códigos de barras combinatorios se une a cualquier soporte sólido o semisólido divulgado en la presente. Por ejemplo, los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden unirse a una combinación de una perla y una partícula de gel, o un primer reactivo de códigos de barras combinatorios en solución combinado con un segundo reactivo de códigos de barras combinatorios unido a una perla, o un primer reactivo de códigos de barras combinatorios inmovilizado en un sustrato dentro de un micropocillo y un segundo reactivo de códigos de barras combinatorios en solución o presente en una partícula sólida dentro del micropocillo. En algunas realizaciones, se incluye un reactivo de códigos de barras combinatorios dentro de hidrogeles o materiales similares que pueden actuar como un andamiaje similar a una esponja con el propósito de la localización de posición fija de muestras biológicas y ácidos nucleicos.
Soportes Sólidos
Los reactivos de códigos de barras combinatorios y/o los códigos de barras combinatorios divulgados en la presente pueden unirse a un soporte sólido (por ejemplo, perla, sustrato). Los reactivos de códigos de barras combinatorios y/o los códigos de barras combinatorios divulgados en la presente pueden localizarse en un soporte sólido (por ejemplo, en un micropocillo de una matriz). Como se usa en la presente, los términos "anclado", "unido" e "inmovilizado" se usan indistintamente y se refieren a medios covalentes o no covalentes para unir códigos de barras estocásticos a un soporte sólido. Puede usarse cualquiera de una variedad de diferentes soportes sólidos como soporte sólido para unir reactivos de códigos de barras combinatorios presintetizados o para la síntesis en fase sólida in situ de reactivos de códigos de barras combinatorios.
En algunos casos, un soporte sólido es una perla. Una perla puede abarcar cualquier tipo de esfera bola, rodamiento, cilindro u otra configuración similar sólida, porosa o hueca compuesta de material plástico, cerámico, metálico o polimérico sobre el que puede inmovilizarse un ácido nucleico (por ejemplo, de manera covalente o no covalente). Una perla puede comprender una partícula discreta que puede ser esférica (por ejemplo, microesferas) o tener una forma no esférica o irregular, como cúbica, cuboide, piramidal, cilíndrica, cónica, oblonga o con forma de disco, y similares. Una perla puede tener forma no esférica.
Las perlas pueden comprender una variedad de materiales que incluyen, pero no se limitan a, materiales paramagnéticos (por ejemplo, magnesio, molibdeno, litio y tántalo), materiales superparamagnéticos (por ejemplo, nanopartículas de ferrita (Fe3O4; magnetita), materiales ferromagnéticos (por ejemplo, hierro, níquel, cobalto, algunas aleaciones de los mismos y algunos compuestos de metales de tierras raras), cerámica, plástico, vidrio, poliestireno, sílice, metilestireno, polímeros acrílicos, titanio, látex, sefarosa, agarosa, hidrogel, polímero, celulosa, nailon y cualquier combinación del mismo.
El diámetro de las perlas puede ser, o ser por lo menos aproximadamente, de 5 gm, 10 gm, 20 gm, 25 gm, 30 gm, 35 gm, 40 gm, 45 gm o 50 gm. El diámetro de las perlas puede ser como máximo de aproximadamente 5 gm, 10 gm, 20 gm, 25 gm, 30 gm, 35 gm, 40 gm, 45 gm o 50 gm. El diámetro de la perla puede estar relacionado con el diámetro de los pocilios del sustrato. Por ejemplo, el diámetro de la perla puede ser, o ser por lo menos, un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% más largo o más corto que el diámetro del pocillo. En algunas realizaciones, el diámetro de la perla puede ser como máximo 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% más largo o más corto que el diámetro del pocillo. El diámetro de la perla puede estar relacionado con el diámetro de una célula (por ejemplo, una sola célula atrapada por el pocillo del sustrato). El diámetro de la perla puede ser, o ser por lo menos, un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, o 300% o más largo o más corto que el diámetro de la célula. En algunas realizaciones, el diámetro de la perla puede ser como máximo un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o 300% o más largo o más corto que el diámetro de la célula.
Puede unirse y/o incrustarse una perla en un sustrato de la divulgación. Una perla puede unirse y/o incrustarse en un gel, hidrogel, polímero y/o matriz. La posición espacial de una perla dentro de un sustrato (por ejemplo, gel, matriz, andamiaje o polímero) puede identificarse usando el marcador espacial presente en el código de barras estocástico en la perla que puede servir como dirección de localización.
Los ejemplos de perlas pueden incluir, pero no se limitan a, perlas de estreptavidina, perlas de agarosa, perlas magnéticas, Dynabeads®, microperlas MACS®, perlas conjugadas con anticuerpos (por ejemplo, microperlas antiinmunoglobulina), perlas conjugadas con proteína A, perlas conjugadas con proteína G, perlas conjugadas con proteína A/G, perlas conjugadas con proteína L, perlas conjugadas con oligodT, perlas de sílice, perlas similares a sílice, microperlas antibiotina, microperlas antifluorocromo y perlas magnéticas terminadas en carboxi BcMag™.
Una perla puede asociarse (por ejemplo, impregnarse con) puntos cuánticos o colorantes fluorescentes para hacerla fluorescente en un canal óptico de fluorescencia o en múltiples canales ópticos. Una perla puede asociarse con óxido de hierro u óxido de cromo para hacerla paramagnética o ferromagnética. Las perlas pueden ser identificables. Puede obtenerse una imagen de una perla usando una cámara. Una perla puede tener un código detectable asociado con la perla. Por ejemplo, una perla puede comprender una marcador RFID. Una perla puede comprender cualquier marcador detectable (por ejemplo, código UPC, código de barras electrónico, identificador grabado). Una perla puede cambiar de tamaño, por ejemplo, debido al hinchamiento en una solución orgánica o inorgánica. Una perla puede ser hidrófoba o hidrófila. Una perla puede ser biocompatible.
Puede visualizarse un soporte sólido (por ejemplo, una perla). El soporte sólido puede comprender una etiqueta de visualización (por ejemplo, un colorante fluorescente). Un soporte sólido (por ejemplo, una perla) puede grabarse con un identificador (por ejemplo, un número). El identificador puede visualizarse a través de imagenología de los soportes sólidos (por ejemplo, perlas).
Un soporte sólido puede comprender un material insoluble, semisoluble o insoluble. Puede hacerse referencia a un soporte sólido como "funcionalizado" cuando incluye un conector, un andamiaje, un bloque de construcción u otra fracción reactiva unida al mismo, mientras que un soporte sólido puede estar "no funcionalizado" cuando carece de dicha fracción reactiva unida al mismo. El soporte sólido puede emplearse libre en solución, como en un formato de pocillo de microtitulación; en un formato continuo, como en una columna; o en una tira reactiva.
El soporte sólido puede comprender una membrana, papel, plástico, superficie recubierta, superficie plana, vidrio, portaobjetos, chip o cualquier combinación de los mismos. Un soporte sólido puede tomar la forma de resinas, geles, microesferas u otras configuraciones geométricas. Un soporte sólido puede comprender chips de sílice, micropartículas, nanopartículas, placas, matrices, capilares, soportes planos como filtros de fibra de vidrio, superficies de vidrio, superficies metálicas (acero, oro, plata, aluminio, silicio y cobre), soportes de vidrio, soportes de plástico, soportes de silicona, chips, filtros, membranas, placas de micropocillos, portaobjetos, materiales plásticos, incluyendo placas o membranas de pocillos múltiples (por ejemplo, formadas de polietileno, polipropileno, poliamida, difluoruro de polivinilideno) y/u obleas, peines, alfileres o agujas (por ejemplo, matrices de alfileres adecuadas para síntesis o análisis combinatorios) o perlas en una matriz de hoyos o pocillos de nanolitros de superficies planas como obleas (por ejemplo, obleas de silicio), obleas con hoyos con o sin fondos de filtro.
El soporte sólido puede comprender una matriz polimérica (por ejemplo, gel, hidrogel). La matriz polimérica puede penetrar en el espacio intracelular (por ejemplo, alrededor de los orgánulos). La matriz polimérica puede bombearse por todo el sistema circulatorio.
Un soporte sólido puede ser una molécula biológica. Por ejemplo, un soporte sólido puede ser un ácido nucleico, una proteína, un anticuerpo, una histona, un compartimento celular, un lípido, un carbohidrato y similares. Los soportes sólidos que son moléculas biológicas pueden amplificarse, traducirse, transcribirse, degradarse y/o modificarse (por ejemplo, pegilarse, sumoilarse, acetilarse, metilarse). Un soporte sólido que es una molécula biológica puede proporcionar información espacial y temporal además del marcador espacial que se une a la molécula biológica. Por ejemplo, una molécula biológica puede comprender una primera conformación cuando no se modifica, pero puede cambiar a una segunda conformación cuando se modifica. Las diferentes conformaciones pueden exponer los códigos de barras estocásticos de la divulgación a los objetivos. Por ejemplo, una molécula biológica puede comprender códigos de barras estocásticos que son inaccesibles debido al plegamiento de la molécula biológica. Tras la modificación de la molécula biológica (por ejemplo, acetilación), la molécula biológica puede cambiar de conformación para exponer los marcadores estocásticos. La cadencia de la modificación puede proporcionar otra dimensión temporal al método de codificación con códigos de barras estocásticos de la divulgación.
En algunas realizaciones, la molécula biológica que comprende los reactivos de códigos de barras combinatorios de la divulgación puede localizarse en el citoplasma de una célula. Tras la activación, la molécula biológica puede moverse hacia el núcleo, con lo cual puede tener lugar una codificación con códigos de barras estocásticos. De esta manera, la modificación de la molécula biológica puede codificar información espacio-temporal adicional para los objetivos identificados por los códigos de barras estocásticos.
Un marcador de dimensión puede proporcionar información sobre el espacio-tiempo de un evento biológico (por ejemplo, división celular). Por ejemplo, puede añadirse un marcador de dimensión a una primera célula, la primera célula puede dividirse generando una segunda célula hija, la segunda célula hija puede comprender todos, algunos o ninguno de las marcadores de dimensión. Los marcadores de dimensión pueden activarse en la célula original y en la célula hija. De esta manera, el marcador de dimensión puede proporcionar información sobre el tiempo de creación de código de barras combinatorio en distintos espacios.
Sustratos
Un sustrato puede referirse a un tipo de soporte sólido. Un sustrato puede referirse a un soporte sólido que puede comprender reactivos de códigos de barras combinatorios de la divulgación. Un sustrato puede comprender una pluralidad de micropocillos. Un micropocillo puede comprender una pequeña cámara de reacción de volumen definido. Un micropocillo puede atrapar una o más células. Un micropocillo puede atrapar solo una célula. Un micropocillo puede atrapar uno o más soportes sólidos. Un micropocillo puede atrapar solo un soporte sólido. En algunos casos, un micropocillo atrapa una sola célula y un solo soporte sólido (por ejemplo, perla). Un micropocillo puede comprender reactivos de códigos de barras combinatorios de la divulgación.
Los micropocillos de la matriz pueden fabricarse en una variedad de formas y tamaños. Las geometrías de los pocillos pueden incluir, pero no se limitan a, cilíndricas, cónicas, hemisféricas, rectangulares o poliédricas (por ejemplo, geometrías tridimensionales compuestas de varias caras planas, por ejemplo, columnas hexagonales, columnas octogonales, pirámides triangulares invertidas, pirámides cuadradas invertidas, pirámides pentagonales invertidas, pirámides hexagonales invertidas o pirámides truncadas invertidas). Los micropocillos pueden tener una forma que combine dos o más de estas geometrías. Por ejemplo, un micropocillo puede ser parcialmente cilíndrico, teniendo el resto la forma de un cono invertido. Un micropocillo puede incluir dos cilindros uno al lado del otro, uno de mayor diámetro (por ejemplo, que corresponde aproximadamente al diámetro de las perlas) que el otro (por ejemplo, que corresponde aproximadamente al diámetro de las células), que están conectadas por un canal vertical (es decir, paralelo a los ejes de los cilindros) que se extiende por toda la longitud (profundidad) de los cilindros. La abertura del micropocillo puede estar en la superficie superior del sustrato. La abertura del micropocillo puede estar en la superficie inferior del sustrato. El extremo cerrado (o fondo) del micropocillo puede ser plano. El extremo cerrado (o fondo) del micropocillo puede tener una superficie curvada (por ejemplo, convexa o cóncava). La forma y/o el tamaño del micropocillo pueden determinarse en base a los tipos de células o soportes sólidos que se van a atrapar dentro de los micropocillos.
La parte del sustrato entre los pocillos puede tener una topología. Por ejemplo, la parte del sustrato entre los pocillos puede redondearse. La parte del sustrato entre los pocillos puede ser puntiaguda. La parte de separación del sustrato entre los pocillos puede ser plana. La parte del sustrato entre los pocillos puede no ser plana. En algunos casos, se redondea la parte del sustrato entre los pocillos. En otras palabras, la parte del sustrato que no comprende un pocillo puede tener una superficie curvada. La superficie curvada puede fabricarse de tal manera que el punto más alto (por ejemplo, el vértice) de la superficie curvada pueda estar en el punto más alejado entre los bordes de dos o más pocillos (por ejemplo, equidistante de los pocillos). La superficie curvada puede fabricarse de tal manera que el comienzo de la superficie curvada esté en el borde de un primer micropocillo y cree una parábola que termine al final de un segundo micropocillo. Esta parábola puede extenderse en 2 dimensiones para capturar micropocillos cercanos en la cuadrícula hexagonal de pocillos. La superficie curvada puede fabricarse de tal manera que la superficie entre los pocillos sea más alta y/o curvada que el plano de la abertura del pocillo. La altura de la superficie curvada puede tener, o tener por lo menos, 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5 o 7 o más micrómetros. En algunas realizaciones, la altura de la superficie curvada puede tener como máximo 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5 o 7 o más micrómetros.
Las dimensiones de los micropocillos pueden caracterizarse en términos del diámetro y la profundidad del pocillo. Como se usa en la presente, el diámetro del micropocillo se refiere al círculo más grande que puede inscribirse dentro de la sección transversal plana de la geometría del micropocillo. El diámetro de los micropocillos puede variar entre aproximadamente 1 vez y aproximadamente 10 veces el diámetro de las células o soportes sólidos que se van a atrapar dentro de los micropocillos. El diámetro del micropocillo puede ser, o ser por lo menos, 1 vez, por lo menos 1,5 veces, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, por lo menos 5 veces o por lo menos 10 veces el diámetro de las células o soportes sólidos que se van a atrapar dentro de los micropocillos. En algunas realizaciones, el diámetro de los micropocillos puede ser como máximo 10 veces, como máximo 5 veces, como máximo 4 veces, como máximo 3 veces, como máximo 2 veces, como máximo 1,5 veces, o como máximo 1 vez el diámetro de las células o soportes sólidos a atrapar dentro de los micropocillos. El diámetro de los micropocillos puede ser aproximadamente 2,5 veces el diámetro de las células o los soportes sólidos que se van a atrapar dentro de los micropocillos.
El diámetro de los micropocillos puede especificarse en términos de dimensiones absolutas. El diámetro de los micropocillos puede variar entre aproximadamente 5 y aproximadamente 60 micrómetros. El diámetro del micropocillo puede ser, o ser por lo menos, de 5 micrómetros, por lo menos 10 micrómetros, por lo menos 15 micrómetros, por lo menos 20 micrómetros, por lo menos 25 micrómetros, por lo menos 30 micrómetros, por lo menos 35 micrómetros, por lo menos 40 micrómetros, por lo menos por lo menos 45 micrómetros, por lo menos 50 micrómetros o por lo menos 60 micrómetros. El diámetro del micropocillo puede ser como máximo de 60 micrómetros, como máximo 50 micrómetros, como máximo 45 micrómetros, como máximo 40 micrómetros, como máximo 35 micrómetros, como máximo 30 micrómetros, como máximo 25 micrómetros, como máximo 20 micrómetros, como máximo 15 micrómetros, como máximo 10 micrómetros, o como máximo 5 micrómetros. El diámetro de los micropocillos puede ser de aproximadamente 30 micrómetros.
La profundidad de los micropocillos puede elegirse para proporcionar un atrapamiento eficiente de células y soportes sólidos. La profundidad de los micropocillos puede elegirse para proporcionar un intercambio eficaz de tampones de ensayo y otros reactivos contenidos en los pocillos. La relación de diámetro a altura (es decir, la relación de aspecto) puede elegirse de tal manera que una vez que una célula y un soporte sólido se asienten dentro de un micropocillo, no se desplacen por el movimiento del fluido por encima del micropocillo. Las dimensiones del micropocillo pueden elegirse de tal manera que el micropocillo tenga suficiente espacio para acomodar un soporte sólido y una célula de varios tamaños sin que se desplace por el movimiento del fluido por encima del micropocillo. La profundidad de los micropocillos puede variar entre aproximadamente 1 vez y aproximadamente 10 veces el diámetro de las células o soportes sólidos que se van a atrapar dentro de los micropocillos. La profundidad de los micropocillos puede ser, o ser por lo menos, 1 vez, por lo menos 1,5 veces, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, por lo menos 5 veces o por lo menos 10 veces el diámetro de las células o soportes sólidos a atrapar dentro de los micropocillos. La profundidad del micropocillo puede ser como máximo 10 veces, como máximo 5 veces, como máximo 4 veces, como máximo 3 veces, como máximo 2 veces, como máximo 1,5 veces o como máximo 1 vez el diámetro de las células o soportes sólidos a atrapar dentro de los micropocillos. La profundidad de los micropocillos puede ser aproximadamente 2,5 veces el diámetro de las células o de los soportes sólidos a atrapar dentro de los micropocillos.
La profundidad de los micropocillos puede especificarse en términos de dimensiones absolutas. La profundidad de los micropocillos puede variar entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 micrómetros. La profundidad del micropocillo puede ser, o ser por lo menos, de 10 micrómetros, por lo menos 20 micrómetros, por lo menos 25 micrómetros, por lo menos 30 micrómetros, por lo menos 35 micrómetros, por lo menos 40 micrómetros, por lo menos 50 micrómetros o por lo menos 60 micrómetros. La profundidad de los micropocillos puede ser como máximo de 60 micrómetros, como máximo 50 micrómetros, como máximo 40 micrómetros, como máximo 35 micrómetros, como máximo 30 micrómetros, como máximo 25 micrómetros, como máximo 20 micrómetros o como máximo 10 micrómetros. La profundidad de los micropocillos puede ser de aproximadamente 30 micrómetros.
El volumen de los micropocillos usados en los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación puede variar entre aproximadamente 200 micrómetros3 y aproximadamente 120000 micrómetros3. El volumen de los micropocillos puede ser de por lo menos 200 micrómetros3, por lo menos 500 micrómetros3, por lo menos 1000 micrómetros3, por lo menos 10.000 micrómetros3, por lo menos 25.000 micrómetros3, por lo menos 50.000 micrómetros3, por lo menos 100.000 micrómetros3, o por lo menos 120.000 micrómetros3. El volumen de los micropocillos puede ser como máximo de 120.000 micrómetros.3, como máximo de 100.000 micrómetros.3, como máximo 50.000 micrómetros3, como máximo 25.000 micrómetros3, como máximo 10.000 micrómetros3, como máximo 1.000 micrómetros3, como máximo 500 micrómetros3, o como máximo 200 micrómetros3. El volumen de los micropocillos puede ser de aproximadamente 25.000 micrómetros3. El volumen de los micropocillos puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 18.000 micrómetros3 hasta aproximadamente 30.000 micrómetros3).
El volumen del micropocillo puede ser, o ser por lo menos, de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 o más nanolitros3. El volumen del micropocillo puede ser como máximo de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 o más nanolitros3. El volumen de líquido que puede caber en el micropocillo puede ser de por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 40, 45 o 50 o más nanolitros3. El volumen de líquido que puede caber en el micropocillo puede ser como máximo de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 3540, 45 o 50 o más nanolitros3. El volumen del micropocillo puede ser, o ser por lo menos, de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 o más picolitros3. El volumen del micropocillo puede ser como máximo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 40, 45 o 50 o más picolitros3. El volumen de líquido que puede caber en el micropocillo puede ser de por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 3540, 45 o 50 o más picolitros3. El volumen de líquido que puede caber en el micropocillo puede ser como máximo de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 40, 45 o 50 o más picolitros3.
Los volúmenes de los micropocillos usados en los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación pueden caracterizarse además en términos de la variación de volumen de un micropocillo a otro. El coeficiente de variación (expresado como porcentaje) para el volumen de los micropocillos puede variar entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 10%. El coeficiente de variación para el volumen de los micropocillos puede ser de por lo menos el 1%, por lo menos 2%, por lo menos el 3%, por lo menos el 4%, por lo menos el 5%, por lo menos el 6%, por lo menos el 7%, por lo menos el 8%, por lo menos por lo menos el 9%, o por lo menos el 10%. El coeficiente de variación para el volumen de los micropocillos puede ser como máximo del 10%, como máximo del 9%, como máximo del 8%, como máximo del 7%, como máximo del 6%, como máximo del 5%, como máximo del 4%, como máximo del 3%, como máximo del 2%, o como máximo del 1%. El coeficiente de variación para el volumen de los micropocillos puede tener cualquier valor dentro de un intervalo comprendido por estos valores, por ejemplo, entre aproximadamente el 1,5% y aproximadamente el 6,5%. En algunas realizaciones el coeficiente de variación del volumen del micropocillo puede ser de aproximadamente el 2,5%.
La relación entre el volumen de los micropocillos y el área superficial de las perlas (o el área superficial de un soporte sólido al que pueden unirse los oligonucleótidos de códigos de barras estocásticos) usada en los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación puede variar de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 1.520 micrómetros. La relación puede ser de por lo menos 2,5, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 100, por lo menos 500, por lo menos 750, por lo menos 1.000 o por lo menos 1.520. La relación puede ser como máximo 1.520, como máximo 1.000, como máximo 750, como máximo 500, como máximo 100, como máximo 10, como máximo 5 o como máximo 2,5. La relación puede ser de aproximadamente 67,5. La relación entre el volumen de los micropocillos y el área superficial de la perla (o del soporte sólido usado para la inmovilización) puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 30 a aproximadamente 120).
Los pocillos de la matriz de micropocillos pueden disponerse en una matriz unidimensional, bidimensional o tridimensional. En algunas realizaciones, puede lograrse una matriz tridimensional, por ejemplo, apilando una serie de dos o más matrices bidimensionales (es decir, apilando dos o más sustratos que comprenden matrices de micropocillos).
El patrón y el espaciado entre los micropocillos pueden elegirse para optimizar la eficacia de atrapar una sola célula y un solo soporte sólido (por ejemplo, una perla) en cada pocillo, así como para maximizar el número de pocillos por unidad de área de la matriz. Los micropocillos pueden distribuirse de acuerdo con una variedad de patrones aleatorios o no aleatorios. Por ejemplo, pueden distribuirse por completo aleatoriamente a través de la superficie del sustrato de matriz, o pueden disponerse en una cuadrícula cuadrada, rectangular, hexagonal o similar. En algunos casos, los micropocillos están dispuestos hexagonalmente. La distancia (o espaciamiento) de centro a centro entre los pocillos puede variar de aproximadamente 5 micrómetros a aproximadamente 75 micrómetros. En algunos casos, el espacio entre los micropocillos es de aproximadamente 10 micrómetros. En otras realizaciones, el espacio entre pocillos es de por lo menos 5 micrómetros, por lo menos 10 micrómetros, por lo menos 15 micrómetros, por lo menos 20 micrómetros, por lo menos 25 micrómetros, por lo menos 30 micrómetros, por lo menos 35 micrómetros, por lo menos 40 micrómetros, por lo menos 45 micrómetros, por lo menos 50 micrómetros, por lo menos 55 micrómetros, por lo menos 60 micrómetros, por lo menos 65 micrómetros, por lo menos 70 micrómetros o por lo menos 75 micrómetros. El espacio entre micropocillos puede ser de 75 micrómetros como máximo, 70 micrómetros como máximo, 65 micrómetros como máximo, 60 micrómetros como máximo, 55 micrómetros como máximo, 50 micrómetros como máximo, 45 micrómetros como máximo, 40 micrómetros como máximo, 35 micrómetros como máximo, como máximo 30 micrómetros, como máximo 25 micrómetros, como máximo 20 micrómetros, como máximo 15 micrómetros, como máximo 10 micrómetros, como máximo 5 micrómetros. El espaciado entre micropocillos puede ser de aproximadamente 55 micrómetros. El espaciado de los micropocillos puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 18 micrómetros a aproximadamente 72 micrómetros).
La matriz de micropocillos puede comprender características superficiales entre los micropocillos que están diseñadas para ayudar a guiar las células y los soportes sólidos hacia los pocillos y/o evitar que se asienten en las superficies entre los pocillos. Los ejemplos de características superficiales adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, características superficiales abovedadas, acanaladas o puntiagudas que rodean los pocillos o se extienden a ambos lados de la superficie entre los pocillos.
El número total de pocillos en la matriz de micropocillos puede determinarse por el patrón y el espaciado de los pocillos y las dimensiones generales de la matriz. El número de micropocillos en la matriz puede variar entre aproximadamente 96 y aproximadamente 5.000.000 o más. El número de micropocillos en la matriz puede ser de por lo menos 96, por lo menos 384, por lo menos 1.536, por lo menos 5.000, por lo menos 10.000, por lo menos 25.000, por lo menos 50.000, por lo menos 75.000, por lo menos 100.000, por lo menos 500.000, por lo menos 1.000. 000, o por lo menos 5.000.000. El número de micropocillos en la matriz puede ser como máximo 5.000.000, como máximo 1.000.000, como máximo 75.000, como máximo 50.000, como máximo 25.000, como máximo 10.000, como máximo 5.000, como máximo 1.536, como máximo 384 o como máximo 96 pocillos. El número de micropocillos en la matriz puede ser de aproximadamente 96, 384 y/o 1536. El número de micropocillos puede ser de aproximadamente 150.000. El número de micropocillos en la matriz puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 100 a 325.000).
Las matrices de micropocillos pueden fabricarse usando cualquiera de varias técnicas de fabricación. Los ejemplos de métodos de fabricación que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, técnicas de micromecanizado a granel como fotolitografía y grabado químico húmedo, grabado con plasma o grabado profundo con iones reactivos; micromoldeo y microgofrado; micromecanizado láser; impresión 3D u otros procesos de fabricación de escritura directa usando materiales curables; y técnicas similares.
Las matrices de micropocillos pueden fabricarse a partir de cualquiera de varios materiales de sustrato. La elección del material puede depender de la elección de la técnica de fabricación y viceversa. Los ejemplos de materiales adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, silicio, sílice fundida, vidrio, polímeros (por ejemplo, agarosa, gelatina, hidrogeles, polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato (PC), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros de olefina cíclica (COP), copolímeros de olefina cíclica (COC), tereftalato de polietileno (PET), resinas epoxi, resinas a base de tioleno, metales o películas metálicas (por ejemplo, aluminio, acero inoxidable, cobre, níquel, cromo y titanio) y similares. En algunos casos, el micropocillo comprende adhesivo óptico. En algunos casos, el micropocillo está hecho de adhesivo óptico. En algunos casos, la matriz de micropocillos comprende y/o está hecha de PDMS. En algunos casos, el micropocillo está hecho de plástico. Puede ser deseable un material hidrófilo para la fabricación de matrices de micropocillos (por ejemplo, para mejorar la humectabilidad y minimizar la unión no específica de células y otro material biológico). También pueden usarse materiales hidrófobos que pueden tratarse o recubrirse (por ejemplo, mediante tratamiento con plasma de oxígeno o injerto de una capa superficial de óxido de polietileno). Puede ser deseable el uso de materiales hidrófilos porosos para la fabricación de la matriz de micropocillos para facilitar la evacuación/ventilación capilar de las burbujas de aire atrapadas en el dispositivo. La matriz de micropocillos puede fabricarse a partir de un solo material. La matriz de micropocillos puede comprender dos o más materiales diferentes que se han adherido o unido mecánicamente entre sí.
Las matrices de micropocillos pueden fabricarse usando sustratos de cualquiera de una variedad de tamaños y formas. Por ejemplo, la forma (o huella) del sustrato dentro del cual se fabrican los micropocillos puede ser de forma cuadrada, rectangular, circular o irregular. La huella del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser similar a la de una placa de microtitulación. El tamaño del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser similar al de los portaobjetos de microscopio estándar, por ejemplo, aproximadamente 75 mm de largo x 25 mm de ancho (aproximadamente 3" de largo x 1" de ancho), o aproximadamente 75 mm de largo x 50 mm de ancho largo (aproximadamente 3'' de largo x 2" de ancho). El espesor del sustrato dentro del cual se fabrican los micropocillos puede variar entre aproximadamente 0,1 mm de espesor y aproximadamente 10 mm de espesor, o más. El espesor del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser de por lo menos 0,1 mm de espesor, por lo menos 0,5 mm de espesor, por lo menos 1 mm de espesor, por lo menos 2 mm de espesor, por lo menos 3 mm de espesor, por lo menos 4 mm de espesor, por lo menos 5 mm de espesor, por lo menos 6 mm de espesor, por lo menos 7 mm de espesor, por lo menos 8 mm de espesor, por lo menos 9 mm de espesor, o por lo menos 10 mm de espesor. El espesor del sustrato de la matriz de micropocillos puede tener un espesor de como máximo 10 mm, un espesor de como máximo 9 mm, un espesor de como máximo 8 mm, un espesor de como máximo 7 mm, un espesor de como máximo 6 mm, un espesor de como máximo 5 mm, un espesor de como máximo 4 mm, un espesor de como máximo 3 mm, un espesor de como máximo 2 mm, un espesor de como máximo 1 mm, un espesor de como máximo 0,5 mm, o un espesor de como máximo 0,1 mm. El espesor del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser de aproximadamente 1 mm. El espesor del sustrato de la matriz de micropocillos puede tener cualquier valor dentro de estos intervalos, por ejemplo, el espesor del sustrato de la matriz de micropocillos puede estar entre aproximadamente 0,2 mm y aproximadamente 9,5 mm. El espesor del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser uniforme.
Pueden usarse una variedad de tratamientos de superficie y técnicas de modificación de superficie para alterar las propiedades de las superficies de la matriz de micropocillos. Los ejemplos pueden incluir, pero no se limitan a, tratamientos con plasma de oxígeno para hacer que las superficies de materiales hidrófobos sean más hidrófilas, el uso de técnicas de grabado húmedo o seco para alisar (o endurecer) las superficies de vidrio y silicona, adsorción o injerto de óxido de polietileno u otras capas de polímeros (como pluronic), o albúmina de suero bovino a superficies de sustrato para hacerlas más hidrófilas y menos propensas a la adsorción no específica de biomoléculas y células, el uso de reacciones de silano para injertar grupos funcionales químicamente reactivos en superficies de vidrio y silicio que de otro modo serían inertes, etc. Pueden usarse técnicas de fotodesprotección para activar selectivamente grupos funcionales químicamente reactivos en localizaciones específicas en la estructura de la matriz, por ejemplo, puede usarse la adición o activación selectivas de grupos funcionales químicamente reactivos como aminas primarias o grupos carboxilo en las paredes internas de los micropocillos para acoplar covalentemente sondas de oligonucleótidos, péptidos, proteínas u otras biomoléculas a las paredes de los micropocillos. La elección del tratamiento de superficie o la modificación de la superficie usados puede depender del tipo de propiedad de la superficie que se desea y del tipo de material del que está hecha la matriz de micropocillos.
Las aberturas de los micropocillos pueden sellarse, por ejemplo, durante los pasos de lisis celular para evitar la hibridación cruzada del ácido nucleico objetivo entre micropocillos adyacentes. Un micropocillo (o una matriz de micropocillos) puede sellarse o taparse usando, por ejemplo, una membrana flexible o una lámina de material sólido (es decir, una placa o platina) que se sujeta contra la superficie del sustrato de la matriz de micropocillos, o una perla adecuada, donde el diámetro de la perla es mayor que el diámetro del micropocillo.
Un sello formado usando una membrana flexible o lámina de material sólido puede comprender, por ejemplo, membranas de nanoporos inorgánicos (por ejemplo, óxidos de aluminio), membranas de diálisis, portaobjetos de vidrio, cubreobjetos, películas elastoméricas (por ejemplo, PDMS) o películas de polímero hidrófilas (por ejemplo, una película de polímero recubierta con una fina película de agarosa que se ha hidratado con tampón de lisis).
Los soportes sólidos (por ejemplo, perlas) usados para tapar los micropocillos pueden comprender cualquiera de los soportes sólidos (por ejemplo, perlas) de la divulgación. En algunos casos, los soportes sólidos son perlas de dextrano reticuladas (por ejemplo, Sephadex). El dextrano reticulado puede variar entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 80 micrómetros. Las perlas de dextrano reticuladas que se usan para la protección pueden tener un tamaño de 20 micrómetros a aproximadamente 50 micrómetros. En algunas realizaciones, las perlas pueden ser por lo menos aproximadamente un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% más grandes que el diámetro de los micropocillos. Las perlas usadas para tapar pueden ser como máximo un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% más grandes que el diámetro de los micropocillos.
El sello o la tapa pueden permitir que el tampón entre y salga del micropocillo, a la vez que evita que las macromoléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos) migren fuera del pocillo. El sello o la tapa puede evitar que una macromolécula de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos migre dentro o fuera del micropocillo. El sello o la tapa puede evitar que macromolécula de como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos dentro o fuera del micropocillo.
Los soportes sólidos (por ejemplo, perlas) pueden distribuirse entre un sustrato. Los soportes sólidos (por ejemplo, perlas) pueden distribuirse entre pocillos del sustrato, retirarse de los pocillos del sustrato o transportarse de otro modo a través de un dispositivo que comprende una o más matrices de micropocillos mediante centrifugación u otros medios no magnéticos. Un micropocillo de un sustrato puede precargarse con un soporte sólido. Un micropocillo de un sustrato puede contener por lo menos 1, 2, 3, 4 o 5 o más soportes sólidos. Un micropocillo de un sustrato puede contener como máximo 1, 2, 3, 4 o 5 o más soportes sólidos. En algunos casos, un micropocillo de un sustrato puede contener un soporte sólido.
Las células y perlas individuales pueden compartimentarse usando alternativas a los micropocillos, por ejemplo, un solo soporte sólido y una sola célula podrían estar confinados dentro de una sola gotita en una emulsión (por ejemplo, en un sistema microfluídico digital de gotitas).
Las células podrían potencialmente estar confinadas dentro de perlas porosas que comprenden en sí mismas la pluralidad de códigos de barras estocásticos anclados. Las células y los soportes sólidos individuales pueden compartimentarse en cualquier tipo de recipiente, microrecipiente, cámara de reacción, recipiente de reacción o similar.
La codificación con códigos de barras combinatorios de células individuales puede realizarse sin el uso de micropocillos. Los ensayos de codificación con códigos de barras combinatorios de célula individuales pueden realizarse sin el uso de ningún recipiente físico. Por ejemplo, la codificación con códigos de barras combinatorios sin un recipiente físico puede realizarse incorporando células y microesferas muy próximas entre sí dentro de una capa de polímero o una capa de gel para crear una barrera de difusión entre diferentes pares de células/esferas. En otro ejemplo, la codificación con códigos de barras combinatorios sin un recipiente físico puede realizarse in situ, in vivo, en un tejido sólido intacto, en una célula intacta y/o subcelularmente.
Las matrices de micropocillos pueden ser un componente consumible del sistema de ensayo. Las matrices de micropocillos pueden ser reutilizables. Las matrices de micropocillos pueden configurarse para su uso como un dispositivo independiente para realizar ensayos manualmente, o pueden configurarse para que comprendan un componente fijo o extraíble de un sistema de instrumentos que proporciona la automatización total o parcial del procedimiento de ensayo. En algunas realizaciones de los métodos divulgados, las bibliotecas basadas en perlas de códigos de barras estocásticos pueden depositarse en los pocillos de la matriz de micropocillos como parte del procedimiento de ensayo. En algunas realizaciones, las perlas pueden precargarse en los pocillos de la matriz de micropocillos y proporcionarse al usuario como parte de, por ejemplo, un kit para realizar la codificación con códigos de barras estocásticos y recuento digital de objetivos de ácido nucleico.
En algunas realizaciones, se proporcionan dos conjuntos de micropocillos emparejados, uno precargado con perlas que se mantienen en su lugar mediante un primer imán, y el otro para el uso por parte del usuario para cargar células individuales. Después de la distribución de las células en la segunda matriz de micropocillos, las dos matrices pueden colocarse cara a cara y puede quitarse el primer imán mientras se usa un segundo imán para atraer las perlas de la primera matriz hacia los micropocillos correspondientes de la segunda matriz asegurando de este modo que las perlas descansen por encima de las células en la segunda matriz de micropocillos y minimizando de este modo la pérdida por difusión de las moléculas objetivo después de la lisis celular, a la vez que se maximiza la unión eficiente de las moléculas objetivo a los códigos de barras estocásticos en la perla.
Las matrices de micropocillos de la divulgación pueden precargarse con soportes sólidos (por ejemplo, perlas). Cada pocillo de una matriz de micropocillos puede comprender un único soporte sólido. Por lo menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100% de los pocillos de una matriz de micropocillos pueden precargarse con un solo soporte sólido. Como máximo, el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100% de los pocillos de una matriz de micropocillos pueden precargarse con un solo soporte sólido. El soporte sólido puede comprender códigos de barras estocásticos y/o códigos de barras combinatorios de la divulgación. Los marcadores celulares de códigos de barras estocásticos en diferentes soportes sólidos pueden ser diferentes. Los marcadores celulares de los códigos de barras estocásticos sobre un mismo soporte sólido pueden ser iguales.
Sustratos tridimensionales
Una matriz tridimensional puede tener cualquier forma. Un sustrato tridimensional puede estar hecho de cualquier material usado en un sustrato de la divulgación. En algunos casos, un sustrato tridimensional comprende un origami de ADN. Las estructuras de origami de ADN incorporan ADN como material de construcción para hacer formas a nanoescala. El proceso de origami de ADN puede implicar el plegamiento de una o más cadenas de ADN de "andamiaje" largas en una forma particular usando una pluralidad de "cadenas de ADN grapa" diseñadas racionalmente. Las secuencias de las cadenas grapa pueden diseñarse de tal manera que hibriden con partes particulares de las cadenas de andamiaje y, al hacerlo, fuercen las cadenas de andamiaje en una forma particular. El origami de ADN puede incluir una cadena de andamiaje y una pluralidad de cadenas de grapa diseñadas racionalmente. La cadena de andamiaje puede tener cualquier secuencia suficientemente no repetitiva.
Las secuencias de las cadenas grapa pueden seleccionarse de tal manera que el origami de ADN tenga por lo menos una forma a la que puedan unirse marcadores estocásticos. En algunas realizaciones, el origami de ADN puede tener cualquier forma que tenga por lo menos una superficie interna y por lo menos una superficie externa. Una superficie interna puede ser cualquier área de superficie del origami de ADN que esté estéricamente impedida para interactuar con la superficie de una muestra, mientras que una superficie externa es cualquier área de superficie del origami de ADN que no esté estéricamente impedida para interactuar con la superficie de una muestra. En algunas realizaciones, el origami de ADN tiene una o más aberturas (por ejemplo, dos aberturas), de tal manera que las partículas (por ejemplo, soportes sólidos) pueden acceder a una superficie interna del origami de ADN. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el origami de ADN tiene una o más aberturas que permiten partículas de menos de 10 micrómetros, 5 micrómetros, 1 micrómetro, 500 nm, 400 nm, 300 micrómetros, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 45 nm o 40 nm hagan contacto con una superficie interna del origami de ADN
El origami de ADN puede cambiar de forma (conformación) en respuesta a uno o más estímulos ambientales. Así, un área del origami de ADN puede ser una superficie interior cuando el origami de ADN adopta algunas conformaciones, pero puede ser una superficie exterior cuando el dispositivo adopta otras conformaciones. En algunas realizaciones, el origami de ADN puede responder a ciertos estímulos ambientales adoptando una nueva conformación.
En algunas realizaciones, las cadenas grapa del origami de ADN pueden seleccionarse de tal manera que el origami de ADN tenga sustancialmente forma de barril o tubo. Las grapas del origami de ADN pueden seleccionarse de tal manera que la forma de barril esté cerrada en ambos extremos o abierta en uno o ambos extremos, permite que las partículas entren en el interior del barril y accedan a su superficie interna. En ciertas realizaciones, la forma de barril del origami de ADN puede ser un tubo hexagonal.
En algunas realizaciones, las cadenas grapa del origami de ADN pueden seleccionarse de tal manera que el origami de ADN tenga un primer dominio y un segundo dominio, en donde el primer extremo del primer dominio está unido al primer extremo del segundo dominio por una o más bisagras de ADN de cadena sencilla, y el segundo extremo del primer dominio está unido al segundo dominio del segundo dominio mediante uno o más pestillos moleculares. La pluralidad de grapas puede seleccionarse de tal manera que el segundo extremo del primer dominio se desprenda del segundo extremo del segundo dominio si todos los pestillos moleculares se ponen en contacto con sus estímulos externos respectivos. Los pestillos pueden formarse a partir de dos o más soportes básicos, incluyendo por lo menos una cadena básica que tiene por lo menos un dominio de unión a estímulos que puede unirse a un estímulo externo, como un ácido nucleico, un lípido o una proteína, y por lo menos otra cadena básica que tiene por lo menos un dominio de pestillo que se une al dominio de unión al estímulo. La unión del dominio de unión al estímulo al dominio de pestillo soporta la estabilidad de una primera conformación del origami de ADN.
Síntesis de códigos de barras combinatorios sobre soportes y sustratos sólidos
En algunas realizaciones, puede sintetizarse un reactivo de códigos de barras combinatorios sobre un soporte sólido (por ejemplo, una perla). Los reactivos de códigos de barras combinatorios presintetizados (por ejemplo, que comprenden la amina 5' que puede unirse al soporte sólido) pueden unirse a soportes sólidos (por ejemplo, perlas) a través de cualquiera de una variedad de técnicas de inmovilización que implican parejas de grupos funcionales en el soporte sólido y el código de barras estocástico. El reactivo de códigos de barras combinatorios puede comprender un grupo funcional. El soporte sólido (por ejemplo, una perla) puede comprender un grupo funcional. El grupo funcional del reactivo de códigos de barras combinatorios y el grupo funcional del soporte sólido pueden comprender, por ejemplo, biotina, estreptavidina, aminas primarias, carboxilos, hidroxilos, aldehídos, cetonas, y cualquier combinación de los mismos. Un código de barras combinatorio puede atarse a un soporte sólido, por ejemplo, acoplando (por ejemplo usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) un grupo amino 5' en el reactivo de códigos de barras combinatorios al grupo carboxilo del soporte sólido funcionalizado. Los reactivos de códigos de barras combinatorios no acoplados residuales pueden eliminarse de la mezcla de reacción realizando múltiples pasos de enjuague. En algunas realizaciones, el reactivo de códigos de barras combinatorios y el soporte sólido se unen indirectamente a través de moléculas conectoras (por ejemplo, moléculas de hidrocarburo funcionalizadas cortas o moléculas de óxido de polietileno) usando químicas de unión similares. Los conectores pueden ser conectores escindibles, por ejemplo, conectores lábiles a ácidos o conectores fotoescindibles.
Los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden sintetizarse en soportes sólidos (por ejemplo, perlas) usando cualquiera de varias técnicas de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida, como síntesis de fosfodiéster, síntesis de fosfotriéster, síntesis de fosfito triéster y síntesis de fosforamidita. Los nucleótidos individuales pueden acoplarse por etapas al reactivo de códigos de barras combinatorios anclado en crecimiento. En algunas realizaciones, puede acoplarse una secuencia (o bloque) presintetizada corta de varios oligonucleótidos al reactivo de códigos de barras combinatorios anclado en crecimiento.
Los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden sintetizarse intercalando reacciones de acoplamiento por etapas o de bloque con una o más rondas de síntesis de grupos divididos, en las que el grupo total de perlas de síntesis se divide en una serie de grupos individuales más pequeños, cada uno de los cuales se somete luego a una reacción de acoplamiento diferente, seguido de recombinación y mezcla de los grupos individuales para aleatorizar la creciente secuencia de reactivos de códigos de barras combinatorios en el grupo total de perlas. La síntesis de grupo dividido es un ejemplo de un proceso de síntesis combinatoria en el que se sintetiza un número máximo de compuestos químicos usando un número mínimo de pasos de acoplamiento químico. La diversidad potencial de la biblioteca de compuestos creada de este modo está determinada por el número de bloques de construcción únicos (por ejemplo, nucleótidos) disponibles para cada paso de acoplamiento. y el número de pasos de acoplamiento usados para crear la biblioteca. Por ejemplo, una síntesis de grupo dividido que comprende 10 rondas de acoplamiento usando 4 nucleótidos diferentes en cada paso producirá 410 = 1.048.576 secuencias de nucleótidos únicas. En algunas realizaciones, la síntesis de combinación dividida puede realizarse usando métodos enzimáticos como reacciones de extensión o ligadura de polimerasa en lugar de acoplamiento químico. Por ejemplo, en cada ronda de una reacción de extensión de polimerasa de grupo dividido, los extremos 3' de los códigos de barras estocásticos anclados a perlas en un grupo dado pueden hibridar con los extremos 5' de un conjunto de cebadores semialeatorios, por ejemplo, cebadores que tienen una estructura de 5'-(M)k-(X)i-(N)j-3', donde (X)i es una secuencia aleatoria de nucleótidos que tiene una longitud de i nucleótidos (el conjunto de cebadores que comprende todas las combinaciones posibles de (X)i), (N)j es un nucleótido específico (o una serie de j nucleótidos), y (M)k es un nucleótido específico (o una serie de k nucleótidos), en donde se añade un trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTP) diferente a cada grupo y se incorpora a los oligonucleótidos anclados mediante el polimerasa.
El número de reactivos de códigos de barras combinatorios conjugados o sintetizados en un soporte sólido puede comprender por lo menos 100, 1000, 10000 o 1000000 o más reactivos de códigos de barras combinatorios. El número de reactivos de códigos de barras combinatorios conjugados o sintetizados sobre un soporte sólido puede comprender como máximo 100, 1000, 10000 o 1000000 o más reactivos de códigos de barras combinatorios. El número de reactivos de códigos de barras combinatorios conjugados o sintetizados en un soporte sólido como una perla puede ser, o ser por lo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor que el número de ácidos nucleicos objetivo en una célula. El número de reactivos de códigos de barras combinatorios conjugados o sintetizados en un soporte sólido, como una perla, puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor que el número de ácidos nucleicos objetivo en una célula. Por lo menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, El 90 o el 100% del código de barras estocástico puede unirse a un ácido nucleico objetivo. Como máximo, el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100% del código de barras estocástico puede unirse a un ácido nucleico objetivo. Por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más ácidos nucleicos objetivo diferentes pueden ser capturados por el los reactivos de códigos de barras combinatorios sobre el soporte sólido. Como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más ácidos nucleicos objetivo diferentes pueden ser capturados por los reactivos de códigos de barras combinatorios sobre el soporte sólido.
Métodos de codificación con códigos de barras de una pluralidad de particiones
La divulgación proporciona métodos para codificar con barras una pluralidad de particiones con un conjunto de códigos de barras combinatorios. En alguna realización, la pluralidad de particiones puede ser una pluralidad de micropocillos en una matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el número de micropocillos en una matriz de micropocillos puede ser de por lo menos 96, por lo menos 384, por lo menos 1.536, por lo menos 5.000, por lo menos 10.000, por lo menos 25.000, por lo menos 50.000, por lo menos 75.000, por lo menos 100.000, por lo menos 500.000, por lo menos 1.000.000 o por lo menos 5.000.000 o más. En algunas realizaciones, cada matriz de micropocillos puede comprender un código de barras de la matriz, distinguible del código de barras de la matriz para otra matriz de micropocillos.
En algunas realizaciones, los métodos pueden comprender la introducción de varios códigos de barras de componentes en cada una de la pluralidad de particiones, en donde los códigos de barras de componentes se seleccionan de un conjunto de códigos de barras de componentes como se divulga en la presente. En algunas realizaciones, los códigos de barras de componentes en cada una de la pluralidad de particiones pueden conectarse entre sí para formar un código de barras combinatorio. Los códigos de barras de componentes pueden conectarse entre sí en presencia o ausencia de un polinucleótido objetivo de una muestra.
Como se describe en la Figura 3, los reactivos de códigos de barras combinatorios 305, 310, 315 y 320 pueden dispensarse en cualquier micropocillo particular 325 (por ejemplo, matriz de micropocillos 330). La dosificación puede realizarse, por ejemplo, mediante métodos como pipeteo, manchado con alfileres o impresión sin contacto. Los reactivos de códigos de barras combinatorios también pueden añadirse a los pocillos aleatoriamente, por ejemplo, usando métodos de administración como perlas u otras partículas. Por ejemplo, un cabezal de impresión de inyección de tinta puede dispensar reactivos de códigos de barras combinatorios en cada pocillo. Los reactivos de códigos de barras pueden dispensarse o crearse en particiones individuales. Los ejemplos de particiones pueden incluir, pero no se limitan a, un tubo, un pocillo en una placa de microtitulación, una celda de flujo, una fibra hueca, un micropocillo en un portaobjetos, una partícula cerrada o abierta hueca, una gotita encerrada, una partícula como un perlas u otras partículas sólidas, líquidas o de gel u otras particiones físicas usadas para separar una muestra de otra. El aislamiento físico también puede lograse por la separación de localizaciones de muestras individuales en una superficie bidimensional o sustrato en un sólido o andamiaje tridimensional.
Los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden diseñarse de tal manera que cada secuencia de código de subunidad de cada sección de código de subunidad pueda combinarse en un orden preprogramado usando conectores. El código final en cada micropocillo 325 puede ser único. Para cualquier combinación dada de reactivos de códigos de barras combinatorios, puede determinarse la localización del micropocillo. De esta forma, los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden usarse para determinar la localización espacial de una muestra en un micropocillo 325 en una matriz de micropocillos 330.
La divulgación proporciona composiciones y métodos para permitir la producción de un repertorio masivo de diversidad de reactivos de códigos de barras usando solo un pequeño conjunto de reactivos de códigos de barras de componentes (por ejemplo, códigos de barras combinatorios). Los métodos de codificación con códigos de barras combinatorios pueden combinarse con los métodos de codificación con códigos de barras estocásticos. En algunos casos, pueden procesarse en paralelo cientos de miles o más de millones de muestras. Por ejemplo, la cantidad de muestras que se pueden procesar en paralelo puede ser de por lo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 miles de muestras. El número de muestras que pueden procesarse en paralelo puede ser como máximo de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 miles de muestras. El número de muestras que pueden procesarse en paralelo puede ser de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más millones de muestras. El número de muestras que puede procesarse en paralelo puede ser de como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más millones de muestras.
En la presente se divulga un método para etiquetar con códigos de barras simultáneamente los ácidos nucleicos de muchas (de miles a millones) de muestras individuales. La etiqueta de código de barras puede consistir en una o más cadenas de secuencias de ácidos nucleicos aleatorias o predeterminadas/conocidas (el código de barras). El código de barras puede comprender un oligonucleótido sintético y/o un fragmento de ADN natural o no natural. Por ejemplo el código de barras puede tener, o tener por lo menos, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 o más nucleótidos de longitud. El código de barras puede tener, o tener por lo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos de longitud.
Además de diferentes secuencias de ADN, los códigos de barras combinatorios pueden estar compuestos de diferentes materiales o presentarse en diferentes formas. Por ejemplo, los códigos de barras de componentes pueden ser una combinación de una perla y una partícula de gel, o de un primer oligonucleótido en solución combinado con un segundo oligonucleótido en una perla, o un primer oligonucleótido inmovilizado en un sustrato dentro de un micropocillo y un segundo oligonucleótido en solución o presente en una partícula sólida dentro del micropocillo. Los códigos de barras también pueden incorporarse en hidrogeles o materiales similares que pueden actuar como un andamiaje similar a una esponja con el propósito de localizar en posición fija muestras biológicas y ácidos nucleicos. Por ejemplo, las células en una sección delgada de tejido pueden lisarse y los contenidos de ácido nucleico liberados pueden capturarse en posición. Los ácidos nucleicos capturados pueden incorporar códigos de barras específicos de la posición o códigos de barras combinatorios, y replicarse adicionalmente si se desea y detectarse o en posición o liberarse y aislarse para una caracterización adicional mediante métodos como la secuenciación de próxima generación.
Puede dispensarse una muestra en los micropocillos. En algunas realizaciones, la muestra puede ser una única célula. En algunas realizaciones, la muestra puede ser una sección de tejido. La muestra puede dispensarse antes de dispensar los reactivos de códigos de barras combinatorios. La muestra puede dispensarse después de dispensar los reactivos de códigos de barras combinatorios. La muestra puede dispensarse con un dispositivo de dispensación (por ejemplo, de aislamiento). Los dispositivos de distribución/aislamiento ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, un citómetro de flujo, una matriz de agujas y un microinyector. La matriz de micropocillos puede unirse a un dispositivo de aislamiento/dispensación de tal manera que la muestra pueda aislarse/dispensarse directamente en los pocillos de la matriz de micropocillos.
Las muestras que comprenden los códigos de barras de la divulgación (es decir, las muestras que se han sometido al método de codificación de barras de la divulgación) pueden usarse en aplicaciones en sentido descendente, como la secuenciación. Después de la secuenciación del ADN, además de las secuencias de ácidos nucleicos de la muestra obtenidas, cada secuencia leída puede llevar la cadena del código de barras de la muestra que permite la asignación de esa lectura a una muestra particular dentro de un grupo de muestras, por ejemplo, mediante procesamiento informático.
Puede dispensarse una muestra en los pocillos de un sustrato de manera no aleatoria. Puede conocerse la localización de cada muestra dispensada/aislada en la matriz de micropocillos. De esta manera, la distribución puede no seguir aleatoria y/o estocástica. Puede dispensarse una muestra en los pocillos de un sustrato de una manera no Poisson. Una distribución o curva de Poisson es una distribución de probabilidad discreta que expresa la probabilidad de que se produzca una cantidad de eventos en un período de tiempo fijo si estos eventos se producen a una tasa media conocida y son independientes entre sí. La fórmula de distribución de Poisson es la siguiente: f(k;A)=(e-AAkk!) donde k es el número de ocurrencias de un evento y A es un número real positivo del número esperado de ocurrencias durante el intervalo dado. La distribución no Poisson puede ser una distribución que no sigue la ecuación de Poisson.
Los micropocillos que comprenden los ácidos nucleicos, la célula individual, los ácidos nucleicos de una sola célula, los reactivos de códigos de barras combinatorios y los reactivos necesarios para la extensión y amplificación del cebador (por ejemplo, dNTP de polimerasa, tampón), o cualquier combinación de los mismos, pueden sellarse. El sellado de los micropocillos puede ser útil para evitar la hibridación cruzada del ácido nucleico objetivo entre micropocillos adyacentes. Un micropocillo puede sellarse con cinta y/o cualquier adhesivo. El sellador puede ser transparente. El sellador puede ser opaco. El sellador puede permitir el paso de la luz, lo que permite la detección visual del contenido del micropocillo sellado (por ejemplo, UV-Vis, fluorescencia). Los ácidos nucleicos (por ejemplo, de la muestra) en las particiones (por ejemplo, micropocillos de una matriz) pueden asociarse (por ejemplo, hibridar) con los reactivos de códigos de barras combinatorios dispensados en el micropocillo.
Los reactivos de códigos de barras combinatorios y los polinucleótidos objetivo dentro de un pocillo pueden extenderse y/o amplificarse para generar un transcrito y/o amplicón que comprenda la secuencia de los reactivos de códigos de barras combinatorios. La amplificación puede realizarse mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a, PCR, extensión de cebadores, transcripción inversa, amplificación isotérmica, amplificación lineal, amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), SDA en tiempo real, amplificación de círculo rodante o amplificación de círculo a círculo, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital y PCR ensamblada, PCR de punto final y PCR de supresión, o cualquier combinación de los mismos. En ciertos casos, la amplificación y/o extensión se realiza con amplificación isotérmica. En algunos casos, la amplificación y/o la extensión se realizan con desplazamiento de múltiples cadenas.
El contenido de los micropocillos puede combinarse después de la extensión y/o amplificación. La combinación de los contenidos puede reducir los errores en la preparación de muestras para los procesos posteriores. Las muestras de micropocillos pueden agruparse en un recipiente (por ejemplo, un tubo). Las muestras de micropocillos pueden agruparse en más de un recipiente (por ejemplo, tubo para indexación de muestra/placa).
Las muestras de micropocillos combinadas pueden manipularse con biología molecular. Por ejemplo, las muestras agrupadas pueden someterse a una o más rondas de amplificación. Las muestras agrupadas pueden someterse a un paso de purificación (por ejemplo, con perlas Ampure, selección por tamaño, filtración en gel/columna, eliminación de ARNr o cualquier otra impureza de ARN, degradación enzimática de impurezas, electroforesis en gel pulsado y sedimentación a través de un gradiente de sacarosa o un gradiente de cloruro de cesio y una cromatografía de exclusión por tamaño (cromatografía de permeación en gel).
Las muestras de micropocillos agrupadas pueden prepararse para secuenciación. La preparación para secuenciación puede comprender la adición de secuenciación (por ejemplo, adaptadores de células de flujo) ya sea mediante ligadura de adaptadores (por ejemplo, ligación TA) o extensión de cebadores (por ejemplo, en donde los cebadores comprenden las secuencias de los adaptadores de células de flujo). Los métodos para ligar adaptadores a fragmentos de ácido nucleico son bien conocidos. Los adaptadores pueden ser de cadena doble, de cadena sencilla o parcialmente de cadena sencilla. En algunos aspectos, los adaptadores se forman a partir de dos oligonucleótidos que tienen una región de complementariedad, por ejemplo, aproximadamente de 10 a 30, o aproximadamente de 15 a 40 bases de complementariedad perfecta; de modo que cuando los dos oligonucleótidos hibridan juntos forman una región de cadena doble. Opcionalmente, cualquiera o ambos de los oligonucleótidos pueden tener una región que no sea complementaria al otro oligonucleótido y forme un saliente de cadena sencilla en uno o ambos extremos del adaptador. Los salientes de cadena sencilla pueden tener de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 bases, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4. El saliente puede ser complementario del saliente creado por la escisión con una enzima de restricción para facilitar la ligadura del "extremo pegajoso". Los adaptadores pueden incluir otras características, como sitios de unión a cebadores y sitios de restricción. En algunos aspectos, el sitio de restricción puede ser para una enzima de restricción de Tipo IIS u otra enzima que corta fuera de su secuencia de reconocimiento, como EcoP151. Las muestras agrupadas pueden secuenciarse (por ejemplo, mediante los métodos descritos en la presente).
La secuenciación de los ácidos nucleicos con código de barras combinatorio puede comprender la secuenciación de por lo menos una parte del código de barras combinatorio (por ejemplo, las secuencias de los reactivos del código de barras combinatorio usados para elaborar el código de barras combinatorio). La secuenciación puede comprender secuenciar por lo menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100% del código de barras combinatorio del polinucleótido objetivo. La secuenciación puede comprender secuenciar como máximo el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100% del código de barras combinatorio del polinucleótido objetivo. La secuenciación puede comprender secuenciar por lo menos una parte del polinucleótido objetivo. La secuenciación puede comprender secuenciar por lo menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% del polinucleótido objetivo. La secuenciación puede comprender secuenciar como máximo del 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% del polinucleótido objetivo. La secuenciación puede comprender secuenciar por lo menos una parte del código de barras combinatorio y por lo menos una parte del polinucleótido objetivo. La secuenciación puede comprender secuenciar la unión entre el código de barras combinatorio y el polinucleótido objetivo. La secuenciación puede comprender secuenciación de extremos emparejados. La secuenciación de extremos emparejados puede permitir la determinación de dos o más lecturas de secuencias desde dos lugares en un solo dúplex de polinucleótidos.
Después de la secuenciación del ADN, además de las secuencias de ácidos nucleicos de la muestra obtenidas, cada secuencia leída puede llevar la cadena del código de barras de la muestra y/o una secuencia de ácidos nucleicos objetivo que permite la asignación de esa lectura a una muestra particular dentro de un grupo de muestras, por ejemplo, mediante procesamiento informático. Por ejemplo, las lecturas que comprenden una secuencia de código de barras combinatoria de un primer micropocillo pueden combinarse mientras que las lecturas que comprenden una secuencia de código de barras combinatoria de un segundo micropocillo pueden combinarse. Las lecturas de cada micropocillo (por ejemplo, bin) pueden analizarse y/o procesarse. Por ejemplo, cuando el material de partida es ADN cromosómico fragmentado, las lecturas pueden procesarse para formar cóntigos y/o la separación en fases de haplotipos puede realizarse como se describe en la Solicitud PCT N° PCT/US2016/22712.
Por ejemplo, pueden formarse cóntigos (secuencias continuas) a partir de los datos de caracterización de corto alcance de las lecturas. Las lecturas pueden combinarse. En cada bin, las firmas de sondas de corto alcance de las lecturas en ese bin pueden recuperarse y grabarse. Con el uso del análisis de contigüidad convencional en subconjuntos de lecturas combinadas, pueden usarse las firmas de corto alcance para determinar las órdenes de lectura y las distancias para las lecturas contiguas en el bin. Los cóntigos de bins vecinos pueden orientarse y conectarse para formar cóntigos más grandes.
En algunas realizaciones, las lecturas se combinan de acuerdo con sondeos de corto alcance. Después de las comparaciones iniciales de las firmas de las sondas de corto alcance, se forman grupos con lecturas de alta confianza. Luego, se determinan el orden de lectura y las distancias para las lecturas en el grupo. La información de la sonda de largo alcance para cada grupo de lectura se recupera y registra, y se forma una puntuación compuesta de largo alcance para el grupo. Este compuesto puede formarse para cada entrada tomando el máximo (u otra combinación aritmética) de las puntuaciones de comparación (de lectura) sobre todas las lecturas del grupo. El resultado es una combinación del grupo con respecto al genoma, y esta información de posicionamiento global puede usarse para determinar los grupos colindantes. Los cóntigos de los grupos combinados colindantes pueden luego orientarse y conectarse para formar cóntigos más grandes.
Codificación con códigos de barras de una pluralidad de objetivos de ADN
Algunas realizaciones divulgadas en la presente proporcionan métodos de codificación con códigos de barras de una pluralidad de objetivos de ADN en una pluralidad de particiones. La pluralidad de particiones puede codificarse con barras usando los códigos de barras combinatorios como se divulga en la presente. Por ejemplo, cada partición puede tener un código de barras con una combinación única de códigos de barras de componentes seleccionados de un conjunto de códigos de barras de componentes. En algunas realizaciones, cada código de barras combinatorio en cada una de la pluralidad de particiones comprende una región específica del objetivo que se une a uno o más objetivos de ADN en la partición. En la pluralidad de particiones puede introducirse una pluralidad de objetivos de ADN, como fragmentos de ADN genómico,. En algunas realizaciones, cada partición comprende no más de 1 objetivo de ADN. En algunas realizaciones, cada partición comprende no más de 1 objetivo de ADN del mismo cromosoma. En algunas realizaciones, cada partición puede comprender de media no más de 1, no más de 2, no más de 3, no más de 5, no más de 10, no más de 100 objetivos de ADN. En algunas realizaciones, los objetivos de ADN se introducen en las particiones después de que las particiones se hayan introducido con los códigos de barras de los componentes. En algunas realizaciones, los objetivos de ADN se introducen en las particiones antes de que se hayan introducido las particiones con los códigos de barras de componentes. En algunas realizaciones, uno o más de los códigos de barras de componentes en cada partición hibrida con uno o más objetivos de ADN en la partición. En algunas realizaciones, puede usarse el código de barras componente que hibridó con el objetivo de ADN como cebador para una reacción de extensión para producir un producto de extensión que comprende el objetivo de ADN y el código de barras combinatorio. En algunas realizaciones, el producto de extensión puede amplificarse y secuenciarse.
La Figura 4 representa una realización ejemplar del método de codificación con códigos de barras combinatorios de la divulgación para generar cóntigos. Un ácido nucleico (por ejemplo, un cromosoma) puede fragmentarse. La fragmentación puede producirse por cualquier método, como por ejemplo, sonicación, cizallamiento y fragmentación enzimática. Los fragmentos pueden tener, o tener por lo menos, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 kilobases o más de longitud. Los fragmentos pueden tener como máximo 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 kilobases o más de longitud. La fragmentación puede producir por lo menos 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107 o 1x108 o más fragmentos. La fragmentación puede producir como máximo 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107 o 1x108 o más fragmentos. Los fragmentos aislados en el pocillo pueden ser aproximadamente 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 5-20, 5-15, 5-10, 10-15 o 10-20 fragmentos por pocillo. Los fragmentos aislados en los pocillos pueden estar superpuestos. Los fragmentos aislados en los pocillos pueden no estar superpuestos. Los fragmentos de ácidos nucleicos 405 pueden aislarse en pocillos 410 de una matriz de micropocillos 415. Algunos o todos los pocillos de la matriz de micropocillos pueden comprender uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios 420 y 425 (por ejemplo, una agrupación conocida de reactivos de códigos de barras combinatorios, generando de este modo un código de barras combinatorio único). Los micropocillos pueden sellarse. El contenido de los micropocillos puede extenderse/amplificarse (por ejemplo, mediante extensión de cebador y/o desplazamiento de cadena múltiple) generando de este modo un transcrito que comprende el código de barras combinatorio 430. El transcrito/amplicón que comprende el código de barras combinatorio 430 puede secuenciarse. El análisis de secuenciación puede comprender lecturas en intervalos basadas en su secuencia de código de barras combinatorio, que corresponden al mismo micropocillo. Las lecturas pueden generarse en cóntigos. Los cóntigos pueden usarse para la eliminación progresiva de haplotipos (por ejemplo, de SNP originales).
Secuenciación de células individuales
Algunas realizaciones divulgadas en la presente proporcionan métodos de secuenciación de células individuales. La pluralidad de particiones puede tener un código de barras usando los códigos de barras combinatorios como se divulga en la presente. Por ejemplo, cada partición puede codificarse con barras con una combinación única de códigos de barras de componentes seleccionados de un conjunto de códigos de barras de componentes. En algunas realizaciones, cada código de barras combinatorio en cada una de la pluralidad de particiones comprende una región específica de objetivo que se une a uno o más polinucleótidos objetivo de la célula individual en la partición. En algunas realizaciones, los polinucleótidos objetivo comprenden ADN. En algunas realizaciones, los polinucleótidos objetivo comprenden ARN.
Puede introducirse una pluralidad de células individuales en una pluralidad de particiones, como micropocillos de una matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, las células pueden enriquecerse para las características deseables usando un citómetro de flujo. En algunas realizaciones, introducir la pluralidad de células individuales en los micropocillos de la matriz de micropocillos puede comprender depositar por citometría de flujo la pluralidad de células en los micropocillos de la matriz de micropocillos. Depositar por citometría de flujo la pluralidad de células individuales en los micropocillos de la matriz de micropocillos puede comprender el uso de un citómetro de flujo para depositar una única célula a la vez en los micropocillos de la matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, la pluralidad de particiones se compone de más de 1536 micropocillos. En algunas realizaciones, la pluralidad de particiones es un formato de matriz de micropocillos de 5 micrómetros o más. En algunas realizaciones, la pluralidad de particiones se define dimensionalmente, como mediante posicionamiento espacial.
La Figura 5 ilustra un método ejemplar para la secuenciación de células individuales. La muestra que se va codificar con barras puede comprender células individuales y/o ácido nucleico de células individuales. Las células individuales 505 pueden aislarse en pocillos 510 de una matriz de micropocillos 515. En algunas realizaciones, por lo menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100% de los pocillos pueden comprender una célula individual. En algunas realizaciones, como máximo el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100% de los pocillos pueden comprender una célula individual. Las células pueden distribuirse a un pocillo de manera no Poisson. Las células pueden distribuirse en los pocilios de manera no aleatoria. Las células pueden distribuirse en los pocilios en manera de Poisson. Las células pueden distribuirse en los pocillos de manera aleatoria.
Las células pueden lisarse, liberando de este modo el contenido de ácidos nucleicos de las células. Los pocillos pueden sellarse antes de la lisis. El contenido de ácidos nucleicos de las células puede asociarse con uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios en el micropocillo 520/525 (por ejemplo, una agrupación conocida de reactivos de códigos de barras combinatorios, generando de este modo un código de barras combinatorio único). El contenido de los micropocillos puede ampliarse/amplificarse (por ejemplo, mediante la extensión del cebador y/o el desplazamiento de múltiples cadenas) generando de este modo una transcripción que comprende el código de barras combinatorio 530. Puede secuenciarse la transcripción/amplicón que comprende el código de barras combinatorio 530. El análisis de secuenciación puede comprender lecturas en intervalos basadas en su secuencia de código de barras combinatorio, que corresponden al mismo micropocillo. Las lecturas pueden analizarse para el análisis de la expresión génica de la célula individual. Las lecturas pueden usarse para analizar la célula (por ejemplo, determinar el tipo de célula, diagnosticar la célula como parte de un trastorno o enfermedad, genotipar la célula, determinar o predecir la respuesta de la célula a una terapia o régimen y/o medir cambios en el perfil de expresión de la célula a lo largo del tiempo).
En algunos casos, los métodos de la divulgación pueden comprender la codificación con códigos de barras estocásticos y la codificación con códigos de barras combinatorios. Por ejemplo, y como se muestra en la Figura 6, las células 605 pueden distribuirse en los pocillos 610 de una matriz de micropocillos 615 de una manera no Poisson, de tal manera que un pocillo contenga una única célula. Las células pueden lisarse. Los ácidos nucleicos 620 de las células pueden ponerse en contacto con una pluralidad de códigos de barras estocásticos 625 que comprenden un oligo dT y un marcador celular, y el marcador molecular de la divulgación puede ponerse en contacto con un objetivo (por ejemplo, ARNm). El código de barras estocástico puede transcribirse de forma inversa, generando de este modo un ADNc con código de barras estocástico 630. El ADNc con código de barras estocástico puede ponerse en contacto con uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios 635/640 que puede realizar la síntesis de la segunda cadena. El uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios 635/640 para la síntesis de la segunda cadena pueden comprender una secuencia universal (por ejemplo, un sitio de unión del cebador de secuenciación, es decir, Illumina read 1). La síntesis de la segunda cadena puede dar como resultado una molécula 645 de ácido nucleico con codificada con código de barras estocástico y con código de barras combinatorio. La molécula de ácido nucleico codificada con código de barras estocástico y con código de barras combinatorio 645 puede someterse a métodos de preparación de biblioteca en sentido descendente (por ejemplo, combinación, adición de adaptador de secuenciación) y secuenciarse. La codificación con código de barras estocástico puede usarse para contar el número de ácidos nucleicos objetivo 620 en la muestra 605. El código de barras combinatorio puede usarse para identificar el pocillo 610 de la matriz de micropocillos 615 de la que procede la célula.
En algunos casos, los métodos de divulgación pueden comprender la codificación con códigos de barras combinatorios bipartitos. Por ejemplo, y como se muestra en la Figura 7, las células 705 pueden distribuirse en los pocillos 710 de una matriz de micropocillos 715 de una manera no Poisson, de tal manera que un pocillo contenga una sola célula. Las células pueden lisarse. Los ácidos nucleicos 720 de las células pueden ponerse en contacto con uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios 3' 725 que pueden ponerse en contacto con un objetivo (por ejemplo, ARNm). El uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios 3' 725 pueden transcribirse de manera inversa, generando de este modo un ADNc de código de barras combinatorio 3' 730. El ADNc de código de barras combinatorio 3' 730 puede ponerse en contacto con uno o más reactivos de código de barras combinatorio 5' 740 que puede realizar la síntesis de la segunda cadena. El uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios 5' 740 para la síntesis de la segunda cadena pueden comprender una secuencia universal (por ejemplo, un sitio de unión del cebador de secuenciación, es decir, Illumina read 1). La síntesis de la segunda cadena puede dar como resultado una molécula de ácido nucleico codificada combinatoriamente con código de barras bipartita 745. La molécula de ácido nucleico bipartita con código de barras combinatorio 745 puede someterse a métodos de preparación de biblioteca en sentido descendente (por ejemplo, agrupación, adición de adaptador de secuenciación) y secuenciarse. El código de barras combinatorio bipartito puede usarse para identificar el pocillo 710 de la matriz de micropocillos 715 del que procede la célula.
Los métodos divulgados en la presente pueden usarse para comparar células y/o transcripciones de ácidos nucleicos en puntos de tiempo variables. Los métodos de la divulgación pueden usarse para diagnosticar a un sujeto o comparar las células/ácidos nucleicos de un sujeto enfermo con un sujeto sano. Por ejemplo, cada pocillo de una matriz de micropocillos puede comprender una célula de un sujeto diferente.
Los métodos divulgados en la presente pueden usarse, por ejemplo, en pruebas farmacéuticas o pruebas de ensayos clínicos. Por ejemplo, los micropocillos del sustrato que comprende los reactivos de códigos de barras combinatorios pueden comprender un reactivo de modulación. Un reactivo de modulación puede comprender un fármaco, una terapia, una proteína, un ARN, un liposoma, un lípido o cualquier molécula terapéutica (por ejemplo, molécula de ensayo clínico, molécula aprobada por la FDA, molécula no aprobada por la FDA). Puede introducirse un agente de modulación en un pocillo antes del aislamiento de la muestra en el pocillo. Puede introducirse un agente de modulación en un pocilio después del aislamiento de la muestra en el pocilio (por ejemplo, el agente de modulación puede ponerse en contacto con las muestras en el pocillo). En un ejemplo, cada pocillo de una matriz de micropocillos puede comprender una célula de diferentes sujetos. Las células pueden tratarse con un agente de modulación. Los resultados de la secuenciación pueden usarse para determinar cómo el agente de modulación afectó a la expresión génica de la muestra (por ejemplo, una célula individual). Los resultados de secuenciación pueden usarse para determinar qué sujeto de una población de sujetos puede verse afectado por el agente de modulación y/o diagnosticar un sujeto en la población.
Métodos de codificación con códigos de barras estocásticos
La divulgación proporciona métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios y/o códigos de barras estocásticos de una muestra. Los métodos de codificación con códigos de barras combinatorios y códigos de barras estocásticos pueden combinarse. Los métodos pueden comprender colocar los códigos de barras estocásticos muy cerca de la muestra, lisar la muestra, asociar distintos objetivos con los códigos de barras estocásticos, amplificar los objetivos y/o contar digitalmente los objetivos. El método puede comprender además analizar y/o visualizar la información obtenida de los marcadores espaciales en los códigos de barras estocásticos. Una muestra (por ejemplo, una sección de una muestra, un corte fino, una célula) puede ponerse en contacto con un soporte sólido que comprende un código de barras estocástico. Los objetivos en la muestra pueden asociardr con los códigos de barras estocásticos. Los soportes sólidos pueden recogerse. La síntesis de ADNc puede realizarse en el soporte sólido. La síntesis de ADNc puede realizarse fuera del soporte sólido. La síntesis de ADNc puede incorporar la información del marcador de los marcadores en el código de barras estocástico en la nueva molécula objetivo de ADNc que se sintetiza, generando de este modo una molécula de código de barras objetivo. Las moléculas de código de barras objetivo pueden amplificarse mediante PCR. La secuencia de los objetivos y los marcadores del código de barras estocástico en la molécula del código de barras objetivo puede determinarse mediante métodos de secuenciación.
Poner en contacto una muestra y un código de barras estocástico
La divulgación proporciona métodos para distribuir una muestra (por ejemplo, una célula) a una pluralidad de pocillos de un sustrato, en donde los pocillos comprenden reactivos de códigos de barras combinatorios, y en donde la distribución se produce de manera no Poisson. La distribución/aislamiento de las células en los pocillos puede no ser aleatoria (por ejemplo, las células se clasifican específicamente en localizaciones específicas de la matriz). De esta manera, la distribución de células puede considerarse no Poisson.
Una muestra que comprende, por ejemplo, una sección delgada de célula, órgano o tejido, puede ponerse en contacto con códigos de barras estocásticos. Los soportes sólidos pueden flotar libremente. Los soportes sólidos pueden incorporarse en una matriz semisólida o sólida. Los códigos de barras estocásticos pueden no estar asociados a soportes sólidos. Los códigos de barras estocásticos pueden ser nucleótidos individuales. Los códigos de barras estocásticos pueden estar asociados con un sustrato. Cuando los códigos de barras estocásticos están muy cerca de los objetivos, los objetivos pueden hibridar con el código de barras estocástico. Los códigos de barras estocásticos pueden ponerse en contacto en una relación no de agotable de tal manera que cada objetivo distinto pueda asociarse con un código de barras estocástico distinto de la divulgación. Para garantizar una asociación eficiente entre el objetivo y el código de barras estocástico, los objetivos pueden reticularse con el código de barras estocástico.
La probabilidad de que dos objetivos distintos de una muestra puedan entrar en contacto con el mismo código de barras estocástico individual puede ser, o ser por lo menos, 10'6- 10-5, 10-4, 10-1, 10-2 o 10-1 o más. La probabilidad de que dos objetivos distintos de una muestra puedan entrar en contacto con el mismo código de barras estocástico único puede ser como máximo 10'6- 10'5, 10'4, 10'3, 10'2 o 10'1 o más. La probabilidad de que dos objetivos del mismo gen de la misma célula puedan entrar en contacto con el mismo código de barras estocástico puede ser, o ser por lo menos, 10'6- 10'5, 10'4, 10'3, 10'2 o 10'1 o más. La probabilidad de que dos objetivos del mismo gen de la misma célula puedan entrar en contacto con el mismo código de barras estocástico puede ser como máximo 10'6- 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 o 10-1 o más.
En algunos casos, las células de una población de células pueden separarse (por ejemplo, aislarse) en pocillos de un sustrato de la divulgación. La población de células puede diluirse antes de la separación. La población de células puede diluirse de tal manera que por lo menos el 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o el 100% de los pocillos del sustrato reciban una célula individual. La población de células puede diluirse de tal manera que como máximo el 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o el 100% de los pocillos del sustrato reciban una célula individual. La población de células puede diluirse de tal manera que el número de células en la población diluida sea, o sea por lo menos, del 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% del número de pocillos en el sustrato. La población de células puede diluirse de tal manera que el número de células en la población diluida sea, o sea por lo menos, el 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% del número de pocillos en el sustrato. En algunos casos, la población de células se diluye de tal manera que el número de células es aproximadamente el 10% del número de pocilios en el sustrato.
La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede seguir una distribución de Poisson. Por ejemplo, puede haber por lo menos un 0,1,0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10% o más de probabilidad de que un pocillo del sustrato tenga más de una célula. Puede haber por lo menos un 0,1, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10% o más de probabilidad de que un pocillo del sustrato tenga más de una célula. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede ser aleatoria. La distribución de células individuales en pocillos del sustrato puede no ser aleatoria. Las células pueden separarse de tal manera que un pocillo del sustrato reciba sólo una célula.
Lisis celular
Siguiendo la distribución de las células y los códigos de barras estocásticos, las células pueden lisarse para liberar las moléculas objetivo. La lisis celular puede lograrse mediante cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, por medios químicos o bioquímicos, por choque osmótico o por medio de lisis térmica, lisis mecánica o lisis óptica. Las células pueden lisarse mediante la adición de un tampón de lisis celular que comprende un detergente (por ejemplo, SDS, sulfato de dodecilo de Li, Triton X-100, Tween-20 o NP-40), un solvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetona) o enzimas digestivas (por ejemplo, proteinasa K, pepsina o tripsina), o cualquier combinación de los mismos. Para aumentar la asociación de un objetivo y un código de barras estocástico, la tasa de difusión de las moléculas objetivo puede alterarse, por ejemplo, reduciendo la temperatura y/o aumentando la viscosidad del lisado. Unión de códigos de barras estocásticos a moléculas de ácidos nucleicos objetivo
Después de la lisis de las células y la liberación de las moléculas de ácidos nucleicos de las mismas, las moléculas de ácidos nucleicos pueden asociarse aleatoriamente con los códigos de barras estocásticos del soporte sólido colocalizado. La asociación puede comprender, por ejemplo, la hibridación de una región de reconocimiento de objetivo de un código de barras estocástico con una porción complementaria de la molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, el oligo dT del código de barras estocástico puede interactuar con una cola poli-A de un objetivo). Las condiciones de ensayo usadas para la hibridación (por ejemplo, pH del tampón, fuerza iónica, temperatura, etc.) pueden elegirse para promover la formación de híbridos específicos y estables.
La unión puede comprender además la ligadura de una región de reconocimiento de objetivo de un código de barras estocástico y una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, la región de unión al objetivo puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que puede ser capaz de una hibridación específica con un saliente del sitio de restricción (por ejemplo, un saliente del extremo pegajoso de EcoRI). El procedimiento de ensayo puede comprender además el tratamiento de los ácidos nucleicos objetivo con una enzima de restricción (por ejemplo, EcoRI) para crear un saliente de sitio de restricción. Luego, el código de barras estocástico puede ligarse a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia complementaria al saliente del sitio de restricción. Para unir los dos fragmentos puede usarse una ligasa (por ejemplo, ADN ligasa T4).
Los objetivos marcados de una pluralidad de células (o una pluralidad de muestras) (por ejemplo, moléculas de código de barras objetivo) pueden agruparse posteriormente, por ejemplo recuperando los códigos de barras estocásticos y/o las perlas a las que se unen las moléculas de códigos de barras objetivo. La recuperación de colecciones basadas en soportes sólidos de moléculas de códigos de barras objetivo unidas puede implementarse mediante el uso de perlas magnéticas y un campo magnético aplicado externamente. Una vez que se han agrupado las moléculas del código de barras objetivo, todo el procesamiento posterior puede continuar en un único recipiente de reacción. El procesamiento adicional puede incluir, por ejemplo, reacciones de transcripción inversa, reacciones de amplificación, reacciones de escisión, reacciones de disociación y/o reacciones de extensión de ácidos nucleicos. Pueden realizarse reacciones adicionales de procesamiento dentro de los micropocillos, es decir, sin agrupar primero las moléculas de ácidos nucleicos objetivo marcadas de una pluralidad de células.
Transcripción inversa
La divulgación proporciona un método para crear un conjugado de código de barras-objetivo estocástico usando transcripción inversa. El conjugado de código de barras-objetivo estocástico puede comprender el código de barras estocástico y una secuencia complementaria de todo o una parte del ácido nucleico objetivo (es decir, una molécula de ADNc con código de barras estocástico). La transcripción inversa de la molécula de ARN asociada puede producirse mediante la adición de un cebador de transcripción inversa junto con la transcriptasa inversa. El cebador de transcripción inversa puede ser un cebador oligo-dT, un cebador de hexanucleótidos aleatorio o un cebador oligonucleotídico específico del objetivo. Los cebadores oligo-dT pueden tener una longitud de 12-18 nucleótidos y unirse a la cola poli-A endógena en el extremo 3' del ARNm de mamífero. Los cebadores de hexanucleótidos aleatorios pueden unirse al ARNm en una variedad de sitios complementarios. Los cebadores de oligonucleótidos específicos del objetivo típicamente ceban selectivamente el ARNm de interés.
Amplificación
Pueden realizarse una o más reacciones de amplificación de ácidos nucleicos para crear múltiples copias de las moléculas de ácidos nucleicos objetivo marcadas. La amplificación puede realizarse de forma multiplexada, en donde múltiples secuencias de ácidos nucleicos objetivo se amplifican simultáneamente. La reacción de amplificación puede usarse para añadir adaptadores de secuenciación a las moléculas de ácidos nucleicos. Las reacciones de amplificación pueden comprender la amplificación de por lo menos una parte de un marcador de muestra, si está presente. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar por lo menos una parte del marcador celular y/o molecular. Las reacciones de amplificación pueden comprender la amplificación de por lo menos una parte de una etiqueta de muestra, un marcador celular, un marcador espacial, un marcador molecular, un ácido nucleico objetivo o una combinación de los mismos. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar por lo menos el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% de la pluralidad de ácidos nucleicos. El método puede comprender además realizar una o más reacciones de síntesis de ADNc para producir una o más copias de ADNc de moléculas de códigos de barras objetivo que comprenden un marcador de muestra, un marcador celular, un marcador espacial y/o un marcador molecular.
En algunas realizaciones, la amplificación puede realizarse mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se usa en la presente, PCR puede referirse a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas mediante la extensión simultánea de cebadores de cadenas complementarias de ADN. Como se usa en la presente, la PCR puede abarcar formas derivadas de la reacción, incluyendo pero no limitadas a, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital y PCR ensamblada.
La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender métodos no basados en PCR. Los ejemplos de métodos no basados en PCR incluyen, pero no se limitan as, amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación de transcriptoma completo (WTA), amplificación de genoma completo (WGA), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), SDA en tiempo real, amplificación de círculo rodante o amplificación de círculo a círculo. Otros métodos de amplificación no basados en PCR incluyen ciclos múltiples de amplificación de transcripción de ARN impulsada por ARN polimerasa dependiente de ADN o síntesis y transcripción de ADN dirigida por ARN para amplificar objetivos de ADN o ARN, una reacción en cadena de ligasa (LCR) y un método de replicasa Qf3 (Qp), uso de sondas palindrómicas, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación impulsada por oligonucleótidos usando una endonucleasa de restricción, un método de amplificación en el que un cebador hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos y el dúplex resultante se escinde antes de la reacción de extensión y amplificación, amplificación por desplazamiento de cadena usando una polimerasa de ácido nucleico que carece de actividad de exonucleasa 5', amplificación de círculo rodante y amplificación por extensión de ramificación (RAM). En algunos casos, es posible que la amplificación no produzca transcripciones circularizadas.
Puede usarse PCR de supresión para los métodos de amplificación de la divulgación. La PCR de supresión puede referirse a la exclusión selectiva de moléculas de menos de cierto tamaño flanqueadas por repeticiones terminales invertidas, debido a su amplificación ineficiente cuando los cebadores usados para la amplificación corresponden a la repetición completa o a una fracción de la repetición. La razón de esto puede estar en el equilibrio entre el apareamiento del cebador de PCR productivo y el autoapareamiento no productivo de los extremos complementarios del fragmento. Con un tamaño fijo de una repetición invertida del terminal flanqueante, cuanto más corta sea la inserción, más fuerte será el efecto de supresión y viceversa. De igual manera, con un tamaño de inserción fijo, cuanto más larga sea la repetición invertida del terminal, más fuerte será el efecto de supresión.
La PCR de supresión puede usar adaptadores que se ligan al final de un fragmento de ADN antes de la amplificación por PCR. Tras la fusión y el apareamiento, los fragmentos de ADN de cadena sencilla que tienen adaptadores autocomplementarios en los extremos 5' y 3' de la cadena pueden formar estructuras supresoras con forma de "raqueta de tenis" que suprimen la amplificación de los fragmentos durante la PCR.
En algunos casos, los métodos divulgados en la presente comprenden además realizar una reacción en cadena de la polimerasa en el ácido nucleico marcado (por ejemplo, ARN marcado, ADN marcado, ADNc marcado) para producir un amplicón marcado estocásticamente. El amplicón marcado puede ser una molécula de cadena doble. La molécula de cadena doble puede comprender una molécula de ARN de cadena doble, una molécula de ADN de cadena doble o una molécula de ARN hibridada con una molécula de ADN. Una o ambas cadenas de la molécula de cadena doble pueden comprender un marcador de muestra, un marcador espacial, un marcador celular y/o un marcador molecular. El amplicón marcado estocásticamente puede ser una molécula de cadena sencilla. La molécula de cadena sencilla puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos de la divulgación pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos o alterados.
La amplificación puede comprender el uso de uno o más nucleótidos no naturales. Los nucleótidos no naturales pueden comprender nucleótidos fotolábiles o activables. Los ejemplos de nucleótidos no naturales pueden incluir, pero no se limitan a, ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico de glicol (GNA) y ácido nucleico de treosa (TNA). Pueden añadirse nucleótidos no naturales a uno o más ciclos de una reacción de amplificación. La adición de nucleótidos no naturales puede usarse para identificar productos como ciclos específicos o puntos temporales en la reacción de amplificación.
La realización de una o más reacciones de amplificación puede comprender el uso de uno o más cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. El uno o más cebadores pueden comprender menos de 12-15 nucleótidos. El uno o más cebadores pueden aparearse con por lo menos una parte de la pluralidad de objetivos marcados estocásticamente. El uno o más cebadores pueden aparearse con el extremo 3' o el extremo 5' de la pluralidad de objetivos marcados estocásticamente. El uno o más cebadores pueden aparearse con una región interna de la pluralidad de objetivos marcados estocásticamente. La región interna puede tener por lo menos aproximadamente 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430,440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 0, 590, 590600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1000 nucleótidos desde los extremos 3' de la pluralidad de objetivos marcados estocásticamente. El uno o más cebadores pueden comprender un panel fijo de cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos uno o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos uno o más cebadores de control. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos uno o más cebadores específicos de genes.
El uno o más cebadores pueden comprender cualquier cebador universal de la divulgación. El cebador universal puede aparearse con un sitio de unión del cebador universal. El uno o más cebadores personalizados pueden aparearse con un primer marcador de muestra, un segundo marcador de muestra, un marcador espacial, un marcador celular, un marcador molecular, un objetivo o cualquier combinación de los mismos. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal y un cebador personalizado. El cebador personalizado puede diseñarse para amplificar uno o más objetivos. Los objetivos pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos totales en una o más muestras. Los objetivos pueden comprender un subconjunto del total de objetivos marcados estocásticamente en una o más muestras. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos 96 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos 960 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos 9600 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores personalizados pueden aparearse con dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes. Los dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes pueden corresponder a uno o más genes.
Puede usarse cualquier esquema de amplificación en los métodos de la presente divulgación. Por ejemplo, en un esquema, la PCR de primera ronda puede amplificar moléculas (por ejemplo, unidas a la perla) usando un cebador específico de gen y un cebador contra la secuencia del cebador 1 de secuenciación universal de Illumina. La segunda ronda de PCR puede amplificar los primeros productos de PCR usando un cebador específico de gen anidado flanqueado por la secuencia del cebador 2 de secuenciación de Illumina y un cebador contra la secuencia del cebador 1 de secuenciación universal de Illumina. La tercera ronda de PCR añade P5 y P7 y el índice de muestra para convertir los productos de PCR en una biblioteca de secuenciación de Illumina. La secuenciación mediante secuenciación de 150 pb x 2 puede revelar el marcador celular y el índice molecular en la lectura 1, el gen en la lectura 2 y el índice de la muestra en la lectura del índice 1.
La amplificación puede realizarse en una o más rondas. En algunos casos, hay varias rondas de amplificación. La amplificación puede comprender dos o más rondas de amplificación. La primera amplificación puede ser una extensión de X' para generar la región específica del gen. La segunda amplificación puede producirse cuando un ácido nucleico de muestra hibrida con la cadena recién generada.
En algunas realizaciones, no es necesario que se produzca la hibridación al final de una molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, se hibrida y amplifica un ácido nucleico objetivo dentro de una cadena intacta de un ácido nucleico más largo. Por ejemplo, un objetivo dentro de una sección más larga de ADN genómico o ARNm. Un objetivo puede estar a más de 50 nt, más de 100 nt o más de 1000 nt de un extremo de un polinucleótido.
Secuenciación
Determinar el número de ácidos nucleicos marcados estocásticamente diferentes puede comprender determinar la secuencia del objetivo marcado, el marcador espacial, el marcador molecular, el marcador de muestra y el marcador celular o cualquier producto del mismo (por ejemplo, amplicones marcados, moléculas de ADNc marcadas). Un objetivo amplificado puede someterse a secuenciación. Determinar la secuencia del ácido nucleico marcado estocásticamente o cualquier producto del mismo puede comprender realizar una reacción de secuenciación para determinar la secuencia de por lo menos una parte de un marcador de muestra, un marcador espacial, un marcador celular, un marcador molecular y/o por lo menos una porción del objetivo marcado estocásticamente, un complemento del mismo, un complemento inverso del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
La determinación de la secuencia de un ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico amplificado, ácido nucleico marcado, copia de ADNc de un ácido nucleico marcado, etc.) puede realizarse usando una variedad de métodos de secuenciación que incluyen, pero no se limitan a, secuenciación por síntesis (SBS) secuenciación por hibridación (SBH), secuenciación por ligadura (SBL), secuenciación incremental cuantitativa por adición de nucleótidos fluorescentes (QIFNAS), ligadura y división por pasos, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), balizas moleculares, digestión con sonda indicadora TaqMan, pirosecuenciación, secuenciación fluorescente in situ (FISSEQ), perlas FISSEQ, secuenciación oscilante, secuenciación multiplex, secuenciación de colonias polimerizadas (POLONY); secuenciación de círculo rodante de nanogrid (ROLONY), ensayos de ligadura de oligos específicos de alelos (por ejemplo, ensayo de ligadura de oligo (OLA), OLA de molécula de plantilla única usando una sonda lineal ligada y una lectura de amplificación de círculo rodante (RCA), sondas de candado ligadas, u OLA de molécula de plantilla única usando una sonda de candado circular ligada y una lectura de amplificación de círculo rodante (RCA), y similares
En algunos casos, la determinación de la secuencia del ácido nucleico marcado o cualquier producto del mismo comprende secuenciación de extremos emparejados, secuenciación de nanoporos, secuenciación de alto rendimiento, secuenciación de escopeta, secuenciación de terminador de colorante, secuenciación de ADN con múltiples cebadores, caminata de cebadores, secuenciación didesoxi de Sanger, secuenciación de Maxim-Gilbert, pirosecuenciación, secuenciación de molécula única verdadera o cualquier combinación de las mismas. Alternativamente, la secuencia del ácido nucleico marcado o cualquier producto del mismo puede determinarse mediante microscopía electrónica o una matriz de transistores de efecto de campo sensible a productos químicos (chemFET).
También pueden utilizarse métodos de secuenciación de alto rendimiento, como la secuenciación de matriz cíclica usando plataformas como Roche 454, Illumina Solexa, ABI-SOLiD, ION Torrent, Complete Genomics, Pacific Bioscience, Helicos o la plataforma Polonator. La secuenciación puede comprender la secuenciación MiSeq. La secuenciación puede comprender la secuenciación HiSeq.
Los objetivos marcados estocásticamente pueden comprender ácidos nucleicos que representan desde aproximadamente el 0,01% de los genes del genoma de un organismo hasta aproximadamente el 100% de los genes del genoma de un organismo. Por ejemplo, pueden secuenciarse desde aproximadamente el 0,01% de los genes del genoma de un organismo hasta aproximadamente el 100% de los genes del genoma de un organismo usando una región complementaria objetivo que comprende una pluralidad de multímeros capturando los genes que contienen una secuencia complementaria de la muestra. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos marcados comprenden ácidos nucleicos que representan desde aproximadamente el 0,01% de las transcripciones del transcriptoma de un organismo hasta aproximadamente el 100% de las transcripciones del transcriptoma de un organismo. Por ejemplo, pueden secuenciarse desde aproximadamente el 0,501% de las transcripciones del transcriptoma de un organismo a aproximadamente el 100% de las transcripciones de un organismo usando una región complementaria del objetivo que comprende una cola poli-T capturando los ARNm de la muestra..
La secuenciación puede comprender secuenciar por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado y/o código de barras estocástico. La secuenciación puede comprender secuenciar como máximo aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado y/o código de barras estocástico. La secuenciación puede comprender secuenciar por lo menos aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado y/o código de barras estocástico. La secuenciación puede comprender secuenciar como máximo aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado y/o código de barras estocástico. La secuenciación puede comprender secuenciar por lo menos aproximadamente 1.500; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; o 10.000 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado y/o código de barras estocástico. La secuenciación puede comprender secuenciar como máximo aproximadamente 1.500; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; o 10.000 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado y/o código de barras estocástico.
La secuenciación puede comprender por lo menos aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más lecturas de secuenciación por ejecución. La secuenciación puede comprender como máximo aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más lecturas de secuenciación por ejecución. En algunos casos, la secuenciación comprende la secuenciación de por lo menos aproximadamente 1500; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; o 10.000 o más lecturas de secuenciación por ejecución. En algunos casos, la secuenciación comprende secuenciar como máximo aproximadamente 1.500; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; o 10.000 o más lecturas de secuenciación por ejecución. La secuenciación puede comprender secuenciar por lo menos 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 o más millones de lecturas de secuenciación por ejecución. La secuenciación puede comprender secuenciar como máximo 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 o más millones de lecturas de secuenciación por ejecución. La secuenciación puede comprender secuenciar por lo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 2000, 3000, 4000 o 5000 o más millones de lecturas de secuenciación en total. La secuenciación puede comprender secuenciar como máximo de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 2000, 3000, 4000 o 5000 o más millones de lecturas de secuenciación en total. La secuenciación puede comprender menos o igual a aproximadamente 1.600.000.000 lecturas de secuenciación por ejecución. La secuenciación puede comprender menos o igual a aproximadamente 200.000.000 lecturas por ejecución.
Métodos de codificación con códigos de barras espaciales
Algunas realizaciones divulgadas en la presente proporcionan métodos de codificación con códigos de barras espaciales de ácidos nucleicos en un objetivo de una muestra. En algunas realizaciones, se inmoviliza una pluralidad de oligonucleótidos en un sustrato, como un portaobjetos. En algunas realizaciones, el sustrato puede recubrirse con un polímero, una matriz, un hidrogel, un dispositivo de matriz de agujas, un anticuerpo o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región específica del objetivo, como una secuencia de oligo(dT), una secuencia específica de un gen, un multímero aleatorio, etc.
Una muestra que comprende, por ejemplo, un portaobjetos, una monocapa de células, células fijadas, una sección de tejido, puede ponerse en contacto con los oligonucleótidos del sustrato. Las células pueden comprender uno o más tipos de células. Por ejemplo, las células pueden ser células cerebrales, células cardíacas, células cancerosas, células tumorales circulantes, células de órganos, células epiteliales, células metastásicas, células benignas, células primarias, células circulatorias o cualquier combinación de las mismas. Las células pueden ponerse en contacto, por ejemplo, mediante flujo por gravedad, en donde las células pueden asentarse y crear una monocapa. La muestra puede ser una sección delgada de tejido. La sección delgada puede colocarse sobre el sustrato. La muestra puede ser unidimensional (por ejemplo, formar una superficie plana). La muestra (por ejemplo, células) puede esparcirse por el sustrato, por ejemplo, haciendo crecer/cultivando las células sobre el sustrato.
Lisis celular
Siguiendo la distribución de las células y los códigos de barras estocásticos, las células pueden lisarse para liberar las moléculas objetivo. La lisis celular puede lograrse mediante cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, mediante medios químicos o bioquímicos, mediante choque osmótico o por medio de lisis térmica, lisis mecánica o lisis óptica. Las células pueden lisarse mediante la adición de un tampón de lisis celular que comprende un detergente (por ejemplo, SDS, sulfato de dodecilo de Li, Triton X-100, Tween-20 o NP-40), un solvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetona) o enzimas digestivas (por ejemplo, proteinasa K, pepsina o tripsina), o cualquier combinación de los mismos. Para aumentar la asociación de un objetivo y un código de barras estocástico, la tasa de difusión de las moléculas objetivo puede alterarse, por ejemplo, reduciendo la temperatura y/o aumentando la viscosidad del lisado.
En algunas realizaciones, la muestra puede lisarse usando un papel de filtro. El papel de filtro puede empaparse con un tampón de lisis encima del papel de filtro. El papel de filtro puede aplicarse a la muestra con presión, lo que puede facilitar la lisis de la muestra y la hibridación de los objetivos de la muestra con el sustrato.
En algunas realizaciones, la lisis puede realizarse mediante lisis mecánica, lisis por calor, lisis óptica y/o lisis química. La lisis química puede incluir el uso de enzimas digestivas como proteinasa K, pepsina y tripsina. La lisis puede realizarse mediante la adición de un tampón de lisis al sustrato. Un tampón de lisis puede comprender Tris HCl. Un tampón de lisis puede comprender por lo menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 o 1 M o más de Tris HCl. Un tampón de lisis puede comprender como máximo aproximadamente 0,01,0,05, 0,1,0,5 o 1 M o más de Tris HCL. Un tampón de lisis puede comprender aproximadamente 0,1 M de Tris HCl. El pH del tampón de lisis puede ser por lo menos de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más. El pH del tampón de lisis puede ser como máximo de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más. En algunas realizaciones, el pH del tampón de lisis es de aproximadamente 7,5. El tampón de lisis puede comprender una sal (por ejemplo, LiCl). La concentración de sal en el tampón de lisis puede ser por lo menos de aproximadamente 0,1, 0,5 o 1M o más. La concentración de sal en el tampón de lisis puede ser como máximo de aproximadamente 0,1, 0,5 o 1 M o más. En algunas realizaciones, la concentración de sal en el tampón de lisis es de aproximadamente 0,5 M. El tampón de lisis puede comprender un detergente (por ejemplo, SDS, sulfato de dodecilo de Li, tritón X, tween, NP-40). La concentración del detergente en el tampón de lisis puede ser por lo menos de aproximadamente el 0,0001, 0,0005, 0. 001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7% o más. La concentración del detergente en el tampón de lisis puede ser como máximo de aproximadamente el 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7% o más. En algunas realizaciones, la concentración del detergente en el tampón de lisis es de aproximadamente el 1% de sulfato de dodecilo de Li. El tiempo usado en el método de lisis puede depender de la cantidad de detergente usada. En algunas realizaciones, cuanto más detergente se usa, menos tiempo se necesita para la lisis. El tampón de lisis puede comprender un agente quelante (por ejemplo, EDTA, EGTA). La concentración de un agente quelante en el tampón de lisis puede ser de por lo menos de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 mM o más. La concentración de un agente quelante en el tampón de lisis puede ser como máximo de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 mM o más. En algunas realizaciones, la concentración de agente quelante en el tampón de lisis es de aproximadamente 10 mM. El tampón de lisis puede comprender un reactivo reductor (por ejemplo, betamercaptoetanol, DTT). La concentración del reactivo reductor en el tampón de lisis puede ser por lo menos de aproximadamente 1, 5, 10, 15 o 20 mM o más. La concentración del reactivo reductor en el tampón de lisis puede ser como máximo de aproximadamente 1, 5, 10, 15, o 20 mM o más. En algunas realizaciones, la concentración de reactivo reductor en el tampón de lisis es de aproximadamente 5 mM. En algunas realizaciones, un tampón de lisis puede comprender TrisHCl aproximadamente 0,1 M, pH aproximadamente 7,5, LiCl aproximadamente 0,5 M, dodecilsulfato de litio aproximadamente al 1%, EDTA aproximadamente 10 mM y DTT aproximadamente 5 mM.
[0087] La lisis puede realizarse a una temperatura de aproximadamente 4, 10, 15, 20, 25 o 30 C. La lisis puede realizarse durante aproximadamente 1, 5, 10, 15 o 20 o más minutos. Una célula lisada puede comprender por lo menos aproximadamente 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000 o 700000 o más moléculas de ácidos nucleicos objetivo. Una célula lisada puede comprender como máximo aproximadamente 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000 o 700000 o más moléculas de ácidos nucleicos objetivo.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden hibridar con los ácidos nucleicos liberados de las células. Los ácidos nucleicos pueden comprender ADN, como ADN genómico, o ARN, como ARN mensajero (ARNm), microARN, ARN interferente pequeño (ARNip), productos de degradación de ARN, ARN que comprenden cada uno una cola poli(A), o cualquier combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos hibridados con los oligonucleótidos pueden usarse como plantilla para una reacción de extensión, como la transcripción inversa, la polimerización del ADN, etc.
Las moléculas de ácidos nucleicos liberadas de las células lisadas pueden asociarse con la pluralidad de sondas en el sustrato (por ejemplo, hibridar con las sondas en el sustrato). Cuando las sondas comprenden oligo dT, las moléculas de ARNm pueden hibridar con las sondas y transcribirse de manera inversa. La porción oligodT del oligonucleótido puede actuar como cebador para la síntesis de la primera cadena de la molécula de ADNc. La transcripción inversa de la molécula de ARN marcada puede producirse por la adición de un cebador de transcripción inversa. En algunos casos, el cebador de transcripción inversa es un cebador oligodT, un cebador de hexanucleótidos aleatorio o un cebador de oligonucleótidos específico del objetivo. Generalmente, los cebadores oligodT tienen una longitud de 12 a 18 nucleótidos y se unen a la cola poli(A)+ endógena en el extremo 3' del ARNm de mamífero. Los cebadores de hexanucleótidos aleatorios pueden unirse al ARNm en una variedad de sitios complementarios. Los cebadores de oligonucleótidos específicos del objetivo suelen cebar selectivamente el ARNm de interés.
La transcripción inversa puede producirse repetidamente para producir múltiples moléculas de ADNc marcadas. Los métodos divulgados en la presente pueden comprender realizar por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 reacciones de transcripción inversa. El método puede comprender realizar por lo menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 reacciones de transcripción inversa.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden eliminarse del sustrato usando escisión química. Por ejemplo, puede usarse un grupo químico o una base modificada presente en un ácido nucleico para facilitar su eliminación de un soporte sólido. Por ejemplo, puede usarse una enzima para eliminar un ácido nucleico de un sustrato. Por ejemplo, un ácido nucleico de un sustrato puede eliminarse a través de una digestión con endonucleasas de restricción. Por ejemplo, puede usarse el tratamiento de un ácido nucleico que contiene un dUTP o ddUTP con uracil-d-glicosilasa (UDG) para eliminar un ácido nucleico de un sustrato. Por ejemplo, puede eliminarse un ácido nucleico de un sustrato usando una enzima que realiza la escisión de nucleótidos, como una enzima reparadora de escisión de bases, como una endonucleasa apurínica/apirimidínica (AP). En algunas realizaciones, un ácido nucleico puede eliminarse de un sustrato usando un grupo fotoescindible y luz. En algunas realizaciones, puede usarse un conector escindible para eliminar un ácido nucleico del sustrato. Por ejemplo, el conector escindible puede comprender por lo menos uno de biotina/avidina, biotina/estreptavidina, biotina/neutravidina, Ig-proteína A, un conector fotolábil, un grupo conector lábil a ácidos o bases, o un aptámero.
Cuando las sondas son específicas de genes, las moléculas pueden hibridar con las sondas y ser transcritas y/o amplificadas de manera inversa. En algunas realizaciones, después de que se haya sintetizado el ácido nucleico (por ejemplo, transcrito de forma inversa), puede amplificarse. La amplificación puede realizarse de manera multiplex, en donde múltiples secuencias de ácidos nucleicos objetivo se amplifican simultáneamente. La amplificación puede añadir adaptadores de secuenciación al ácido nucleico.
La amplificación puede realizarse en el sustrato, por ejemplo, con amplificación de puente. Los ADNc pueden tener una cola de homopolímero para generar un extremo compatible para la amplificación del puente usando sondas oligo dT en el sustrato. En la amplificación puente, el cebador que es complementario al extremo 3' del ácido nucleico plantilla puede ser el primer cebador de cada par que se une covalentemente a la partícula sólida. Cuando una muestra que contiene el ácido nucleico plantilla se pone en contacto con la partícula y se realiza un solo ciclo térmico, la molécula plantilla puede hibridar con el primer cebador y el primer cebador se alarga en la dirección de avance mediante la adición de nucleótidos para formar una molécula dúplex que consiste en la molécula plantilla y una cadena de ADN recién formada que es complementaria a la plantilla. En el paso de calentamiento del siguiente ciclo, la molécula dúplex puede desnaturalizarse, liberando la molécula plantilla de la partícula y dejando la cadena de ADN complementaria unida a la partícula a través del primer cebador. En la etapa de apareamiento del paso de apareamiento y elongación que sigue, la cadena complementaria puede hibridar con el segundo cebador, que es complementario a un segmento de la cadena complementaria en una localización eliminada del primer cebador. Esta hibridación puede hacer que la cadena complementaria forme un puente entre el primer y el segundo cebadores asegurado al primer cebador por un enlace covalente y al segundo cebador por hibridación. En la etapa de elongación, el segundo cebador puede alargarse en la dirección inversa mediante la adición de nucleótidos en la misma mezcla de reacción, convirtiendo de este modo el puente en un puente de cadena doble. Entonces comienza el siguiente ciclo, y el puente de cadena doble puede desnaturalizarse para producir dos moléculas de ácidos nucleicos de cadena sencilla, cada una con un extremo unido a la superficie de la partícula a través del primer y el segundo cebador, respectivamente, con el otro extremo de cada uno sin unir. En el paso de apareamiento y elongación de este segundo ciclo, cada cadena puede hibridar con otro cebador complementario, no usado anteriormente, en la misma partícula, para formar nuevos puentes de cadena sencilla. Los dos cebadores no usados anteriormente que ahora están hibridados se alargan para convertir los dos nuevos puentes en puentes de cadena doble.
Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar por lo menos el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% de la pluralidad de ácidos nucleicos ácidos.
La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender métodos basados en PCR o métodos no basados en PCR. La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender la amplificación exponencial de los ácidos nucleicos marcados. La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender la amplificación lineal de los ácidos nucleicos marcados. La amplificación puede realizarse por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR puede referirse a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN mediante la extensión simultánea de cebadores de cadenas complementarias de ADN. La PCR puede abarcar formas derivadas de la reacción, incluyendo pero no limitadas as, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital, PCR de supresión, PCR semisupresora y PCR de ensamblaje.
En algunos casos, la amplificación de los ácidos nucleicos marcados comprende métodos no basados en PCR. Los ejemplos de métodos no basados en PCR incluyen pero no se limitan a, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), SDA en tiempo real, amplificación de círculo rodante o amplificación de círculo a círculo. Otros métodos de amplificación no basados en PCR incluyen ciclos múltiples de amplificación de transcripción de ARN impulsada por ARN polimerasa dependiente de ADN o síntesis y transcripción de ADN dirigida por ARN para amplificar objetivos de ADN o ARN, una reacción en cadena de ligasa (LCR), una replicasa Qp (Qp), uso de sondas palindrómicas, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación impulsada por oligonucleótidos usando una endonucleasa de restricción, un método de amplificación en el que un cebador se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos y el dúplex resultante se escinde antes de la reacción de extensión y amplificación, amplificación por desplazamiento de cadena usando una polimerasa de ácidos nucleicos que carece de actividad de exonucleasa 5', amplificación por círculo rodante y/o amplificación por extensión de ramificación (RAM).
En algunos casos, los métodos divulgados en la presente comprenden además la realización de una reacción en cadena de la polimerasa anidada en el amplicón amplificado (por ejemplo, el objetivo). El amplicón puede ser una molécula de cadena doble. La molécula de cadena doble puede comprender una molécula de ARN de cadena doble, una molécula de ADN de cadena doble o una molécula de ARN hibridada con una molécula de ADN. Una o ambas cadenas de la molécula de cadena doble pueden comprender una marcador de muestra o un marcador identificador molecular. Alternativamente, el amplicón puede ser una molécula de cadena sencilla. La molécula de cadena sencilla puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos o alterados.
En algunos casos, el método comprende amplificar repetidamente el ácido nucleico marcado para producir múltiples amplicones. Los métodos divulgados en la presente pueden comprender realizar por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 reacciones de amplificación. Alternativamente, el método comprende realizar por lo menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 reacciones de amplificación.
La amplificación puede comprender además añadir uno o más ácidos nucleicos de control a una o más muestras que comprenden una pluralidad de ácidos nucleicos. La amplificación puede comprender además añadir uno o más ácidos nucleicos de control a una pluralidad de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos de control pueden comprender un marcador de control.
La amplificación puede comprender el uso de uno o más nucleótidos no naturales. Los nucleótidos no naturales pueden comprender nucleótidos fotolábiles y/o activables. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico de glicol (GNA) y ácido nucleico de treosa (TNA). Pueden añadirse nucleótidos no naturales a uno o más ciclos de una reacción de amplificación. La adición de nucleótidos no naturales puede usarse para identificar productos como ciclos específicos o puntos temporales en la reacción de amplificación.
La realización de la una o más reacciones de amplificación puede comprender el uso de uno o más cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender uno o más oligonucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender por lo menos aproximadamente 7-9 nucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender menos de 12-15 nucleótidos. El uno o más cebadores pueden hibridar con por lo menos una parte de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden aparearse con el extremo 3' y/o el extremo 5' de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden aparearse con una región interna de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. La región interna puede tener por lo menos aproximadamente 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400,410, 420, 430,440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1000 nucleótidos desde los extremos 3' de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden comprender un panel fijo de cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos uno o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos uno o más cebadores de control. El uno o más cebadores pueden comprender por lo menos uno o más cebadores de genes de mantenimiento. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. El cebador universal puede aparearse con un sitio de unión del cebador universal. El uno o más cebadores personalizados pueden aparearse con el primer marcador de muestra, el segundo marcador de muestra, el marcador identificador molecular, el ácido nucleico o un producto del mismo. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal y un cebador personalizado. El cebador personalizado puede diseñarse para amplificar uno o más ácidos nucleicos objetivo. Los ácidos nucleicos objetivo pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos totales en una o más muestras. En algunos casos, los cebadores son las sondas unidas a la matriz de la divulgación.
Detección
Para detectar uno o más objetivos en el sustrato pueden usarse una o más sondas que son específicas del objetivo. En algunas realizaciones, las sondas pueden marcarse con fluorescencia. Puede generarse una imagen de las sondas hibridadas mediante, por ejemplo, imagenología fluorescente. En algunas realizaciones, las sondas pueden retirarse y se usa un conjunto diferente de sondas para detectar un conjunto diferente de objetivos.
Los objetivos (por ejemplo, moléculas, moléculas amplificadas) pueden detectarse, por ejemplo, usando sondas de detección (por ejemplo, sondas fluorescentes). La matriz puede hibridarse con por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más sondas de detección. La matriz puede hibridarse con un máximo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más sondas de detección. En algunas realizaciones, la matriz se hibrida con 4 sondas de detección.
Las sondas de detección pueden comprender una secuencia complementaria a una secuencia de un gen de interés. La longitud de la sonda de detección puede ser de por lo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. La longitud de la sonda de detección puede ser como máximo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. Las sondas de detección pueden comprender una secuencia que es perfectamente complementaria a una secuencia en un gen de interés (por ejemplo, objetivo). Las sondas de detección pueden comprender una secuencia que es imperfectamente complementaria a una secuencia en un gen de interés (por ejemplo, objetivo). Las sondas de detección pueden comprender una secuencia con por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más malapareamientos con la secuencia del gen de interés. Las sondas de detección pueden comprender una secuencia con como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más malapareamientos con la secuencia del gen de interés.
Las sondas de detección pueden comprender un marcador detectable. Los ejemplos de marcadores detectables pueden comprender un fluoróforo, un cromóforo, una molécula pequeña, una nanopartícula, un hapteno, una enzima, un anticuerpo y una propiedad magnética, o cualquier combinación de los mismos.
Pueden obtenerse imágenes de sondas hibridadas. La imagen puede usarse para determinar el nivel de expresión relativo de los genes de interés en base a la intensidad de la señal detectable (por ejemplo, señal fluorescente). Pueden usarse lectores o microscopios de fluorescencia láser de barrido para adquirir imágenes digitales de la luz emitida desde el sustrato (por ejemplo, micromatriz). Puede escanearse una fuente de luz enfocada (generalmente un láser) a través del sustrato hibridado haciendo que las áreas hibridadas emitan una señal óptica, como fluorescencia. Los datos de fluorescencia específicos del fluoróforo pueden recopilarse y medirse durante la operación de escaneo y luego puede reconstruirse una imagen del sustrato mediante algoritmos, software y hardware de ordenador apropiados. Las localizaciones esperadas o previstas de las características del ácido nucleico de la sonda pueden luego combinarse con las intensidades de fluorescencia medidas en esas localizaciones, para producir los datos que luego se usan para determinar los niveles de expresión génica o la secuencia de ácidos nucleicos de las muestras objetivo. El proceso de recopilación de datos de las localizaciones esperadas de la sonda puede denominarse "extracción de características". Las imágenes digitales pueden estar compuestas por varios miles a cientos de millones de píxeles que típicamente varían en tamaño de 5 a 50 micras.
Cada píxel de la imagen digital puede representarse mediante un número entero de 16 bits, lo que permite 65.535 valores de escala de grises diferentes. El lector puede adquirir secuencialmente los píxeles del sustrato escaneado y escribirlos en un archivo de imagen que puede almacenarse en el disco duro de un ordenador. Los sustratos pueden contener varias muestras de ADN de sonda marcadas con fluorescencia diferentes en cada localización de punto. El escáner escanea repetidamente todo el sustrato con un láser de la longitud de onda adecuada para excitar cada una de las muestras de ADN de la sonda y almacenarlas en sus archivos de imagen separados. Los archivos de imagen se analizan y posteriormente se visualizan con la ayuda de un ordenador programado.
Pueden obtenerse imágenes del sustrato con un escáner láser confocal. El escáner puede escanear el portaobjetos de sustrato para producir una imagen para cada colorante usado escaneando secuencialmente con un láser de una longitud de onda adecuada para el colorante en particular. Cada colorante puede tener un espectro de excitación conocido y un espectro de emisión conocido. El escáner puede incluir un divisor de haz que refleja un haz de láser hacia una lente objetivo que, a su vez, enfoca el haz en la superficie del portaobjetos para provocar una emisión esférica de fluorescencia. Una parte de la emisión puede viajar de regreso a través de la lente y el divisor de haz. Después de viajar a través del divisor de haz, el haz de fluorescencia puede ser reflejado por un espejo, viaja a través de un filtro de emisión, una lente detectora de enfoque y un orificio central.
Correlación entre el sondeo y la imagenología. Datos
Al correlacionar la imagen que muestra las localizaciones del objetivo con una imagen de la muestra, puede generarse el código de barras espacial del objetivo. Los datos del escaneo del sustrato pueden correlacionarse con la imagen de la muestra sin lisar en el sustrato. Los datos pueden superponerse generando de este modo un mapa. Puede construirse un mapa de la localización de los objetivos de una muestra usando la información generada usando los métodos divulgados en la presente. El mapa puede usarse para localizar una localización física de un objetivo. El mapa puede usarse para identificar la localización de varios objetivos. Los múltiples objetivos pueden ser la misma especie de objetivo, o los múltiples objetivos pueden ser múltiples objetivos diferentes. Por ejemplo, puede construirse un mapa de un cerebro para mostrar la cantidad y localización de múltiples objetivos.
El mapa puede generarse a partir de datos de una sola muestra. El mapa puede construirse usando datos de múltiples muestras, generando de este modo un mapa combinado. El mapa puede construirse con datos de decenas, cientos y/o miles de muestras. Un mapa construido a partir de múltiples muestras puede mostrar una distribución de objetivos asociados con regiones comunes a las múltiples muestras. Por ejemplo, en el mismo mapa pueden mostrarse ensayos replicados. En el mismo mapa pueden mostrarse por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más réplicas (por ejemplo, superpuestas). En el mismo mapa pueden mostrarse como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más réplicas (por ejemplo, superpuestas). La distribución espacial y el número de objetivos pueden representarse mediante una variedad de estadísticas.
La combinación de datos de múltiples muestras puede aumentar la resolución de localización del mapa combinado. La orientación de múltiples muestras puede registrarse mediante puntos de referencia comunes y/o posiciones x-y en la matriz, en donde las mediciones de localización individuales a través de las muestras son, por lo menos en parte, no contiguas. La multiplexación del enfoque anterior permitirá mapas de alta resolución de ácidos nucleicos objetivo en una muestra.
El análisis y la correlación de datos pueden ser útiles para determinar la presencia y/o ausencia de un tipo de célula específico (por ejemplo, célula rara, célula cancerosa). La correlación de datos puede ser útil para determinar las proporciones relativas de los ácidos nucleicos objetivo en distintas localizaciones dentro de una célula o dentro de una muestra.
Los métodos y composiciones divulgados en la presente pueden ser diagnósticos complementarios para un profesional médico (por ejemplo, un patólogo) en donde puede diagnosticarse a un sujeto observando visualmente una imagen patológica y correlacionando la imagen con la expresión genética (por ejemplo, identificación de la expresión de oncogenes). Los métodos y composiciones pueden ser útiles para identificar una célula de una población de células y determinar la heterogeneidad genética de las células dentro de una muestra. Los métodos y composiciones pueden ser útiles para determinar el genotipo de una muestra.
La divulgación proporciona métodos para hacer réplicas de sustratos. Los sustratos pueden volverse a probar con diferentes sondas para diferentes genes de interés, o para elegir selectivamente genes específicos. Por ejemplo, puede colocarse una muestra sobre un sustrato que comprende una pluralidad de sondas oligo(dT). Los ARNm pueden hibridar con las sondas. Los sustratos replicados que comprenden sondas oligo(dT) pueden ponerse en contacto con el portaobjetos inicial y hacer réplicas de los ARNm. Los sustratos replicados que comprenden sondas específicas de genes de ARN pueden ponerse en contacto con el portaobjetos inicial para hacer una réplica.
El ARNm puede transcribirse de forma inversa en ADNc. El ADNc puede tener una cola de homopolímero y/o amplificarse (por ejemplo, mediante amplificación de puente). La matriz puede ponerse en contacto con una matriz replicada. La matriz replicada puede comprender sondas específicas de genes que pueden unirse a los ADNc de interés. La matriz replicada puede comprender sondas poliA que pueden unirse a ADNc con una secuencia de poliadenilación.
El número de réplicas que pueden hacerse puede ser por lo menos de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más. El número de réplicas que pueden hacerse puede ser como máximo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más.
En algunas realizaciones, el sustrato inicial comprende una pluralidad de sondas específicas de genes y el sustrato replicado comprende las mismas sondas específicas de genes, o diferentes sondas que corresponden a los mismos genes que las sondas específicas de genes.
Imaaenoloaía
Puede analizarse la muestra en contacto con el sustrato (por ejemplo, con inmunohistoquímica, tinción y/o formación de imágenes). Ejemplos de métodos de inmunohistoquímica pueden comprender un paso de hacer reaccionar una sustancia biológica de sonda marcada obtenida introduciendo un marcador en una sustancia capaz de reconocer una sustancia biológica a detectar en una sección de tejido, para visualizar la sustancia biológica a detectar presente en la sección de tejido a través de una reacción de unión específica entre las sustancias biológicas.
Para especímenes de histología, las piezas de tejido pueden fijarse en un fijador adecuado, típicamente formalina, e incrustarlas en cera de parafina derretida. El bloque de cera puede cortarse en un micrótomo para producir un segmento fino de parafina que contiene el tejido. El segmento de espécimen puede aplicarse a un sustrato, secarse al aire y calentarse para que la muestra se adhiera al portaobjetos de vidrio. La parafina residual puede disolverse con un solvente adecuado, típicamente xileno, tolueno u otros. Estos denominados solventes desparafinantes pueden eliminarse con un reactivo de tipo lavado-deshidratación antes de la tinción. Los segmentos pueden prepararse a partir de muestras congeladas, se fijan brevemente en formalina al 10% y luego se infunden con reactivo deshidratante. El reactivo deshidratante puede eliminarse antes de teñir con un colorante acuoso.
En algunas realizaciones, puede usarse la técnica de tinción de Papanicolaou (por ejemplo, una tinción progresiva y/o hematoxilineosina [H&E], es decir, una tinción regresiva). La tinción HE (hematoxilina-eosina) usa hematoxilina y eosina como colorante. La hematoxilina es un colorante azul-violeta y tiene la propiedad de teñir tejidos basófilos como núcleos celulares, tejidos óseos, parte de los tejidos cartilaginosos y componentes serosos. La eosina es un colorante de rojo a rosa y tiene la propiedad de teñir tejidos eosinofílicos como el citoplasma, los tejidos conectivos de los tejidos blandos, los glóbulos rojos, la fibrina y los gránulos endocrinos.
La inmunohistoquímica (IHC) puede denominarse "tinción inmunológica'' debido al proceso de desarrollo de color para visualizar una reacción antígeno-anticuerpo que de otro modo sería invisible (en lo sucesivo, puede usarse para inmunohistoquímica el término "tinción inmunohistoquímica"). La tinción con lectina es una técnica que puede usar una propiedad de la lectina de unirse a una cadena de azúcar específica de una manera no inmunológica y específica para detectar una cadena de azúcar en un espécimen de tejido usando lectina.
Pueden usarse la tinción con HE, la inmunohistoquímica y la tinción con lectina para detectar una localización de, por ejemplo, células cancerosas en un espécimen de células. Por ejemplo, cuando se desea confirmar la localización de células cancerosas en una muestra de células, un patólogo, para determinar la presencia o ausencia de células cancerosas en el espécimen celular, puede preparar secciones de tejido y colocarlas en un sustrato de la divulgación. La sección de la matriz puede someterse a tinción con HE, imagenología o cualquier análisis inmunohistoquímico para obtener su información morfológica y/o cualquier otra característica de identificación (como la presencia o ausencia de células raras). La muestra puede lisarse y puede determinarse la presencia o ausencia de moléculas de ácidos nucleicos usando los métodos de la divulgación. La información del ácido nucleico puede compararse (por ejemplo, comparar espacialmente) con la imagen, indicando de este modo la localización espacial de los ácidos nucleicos en una muestra.
En algunas realizaciones, el tejido se tiñe con un potenciador de tinción (por ejemplo, un potenciador de penetración química). Los ejemplos de potenciadores de penetración química tisular que facilitan la penetración de la mancha en el tejido incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), surfactantes como polioxietilensorbitanes, polioxietilenéteres (monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20) y otros derivados de Tween, polioxietilensorbitanos 23 lauril éter (Brij 35), Triton X-100, Brij 35, Nonidet P-40, sustancias detergentes como lisolecitinas, saponinas, detergentes no iónicos como TRITON® X-100, etc., solventes apróticos como dimetil sulfóxido (DMSO), éteres como tetrahidrofurano, dioxano, etc.; ésteres como acetato de etilo, acetato de butilo, acetato de isopropilo; hidrocarburos como tolueno, solventes clorados como diclorometano, dicloroetano, clorobenceno, etc.; cetonas como acetona, nitrilos como acetonitrilo y/u otros agentes que aumentan la permeabilidad de la membrana celular.
En algunas realizaciones, se proporciona una composición que facilita la tinción de una muestra de tejido de mamífero. La composición puede comprender un colorante, como hematoxilina, o hematoxilina y eosina-Y, por lo menos un potenciador de la penetración química tisular, como un surfactante, un solvente aprótico y/o PEG, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, se obtienen imágenes de la muestra (por ejemplo, antes o después de IHC o sin IHC). La imagenología puede comprender microscopía tal como imágenes de campo claro, iluminación oblicua, imágenes de campo oscuro, tinción de dispersión, contraste de fase, contraste de interferencia diferencial, microscopía de reflexión de interferencia, fluorescencia, confocal, microscopía electrónica, microscopía electrónica de transmisión, microscopía electrónica de barrido e iluminación de un solo plano, o cualquier combinación de los mismos. La imagenología puede comprender el uso de una tinción negativa (por ejemplo, nigrosina, molibdato de amonio, acetato de uranilo, formiato de uranilo, ácido fosfotúngstico, tetróxido de osmio). La imagenología puede comprender el uso de metales pesados (por ejemplo, oro, osmio) que pueden dispersar electrones.
La imagenología puede comprender obtener imágenes de una parte de la muestra (por ejemplo, portaobjetos/matriz). La imagenología puede comprender la obtención de imágenes de por lo menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100% de la muestra. La imagenología puede comprender obtener imágenes como máximo del 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100% de la muestra. La imagenología puede realizarse en pasos discretos (por ejemplo, es posible que no sea necesario que la imagen sea contigua). La imagenología puede comprender tomar por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más imágenes diferentes. La imagenología comprender tomar como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más imágenes diferentes.
La Figura 9 ilustra una realización ejemplar del método de prolongación de homopolímeros de la divulgación. La divulgación proporciona un sustrato 910 que comprende una pluralidad de sondas 905 unidas a la superficie del sustrato. El sustrato 910 puede ser una micromatriz. La pluralidad de sondas 905 puede comprender un oligo(dT). La pluralidad de sondas 905 puede comprender una secuencia específica de gen. La pluralidad de sondas 105 puede comprender un código de barras estocástico. Una muestra (por ejemplo, células) 915 puede colocarse y/o cultivarse sobre el sustrato 910. El sustrato que comprende la muestra puede analizarse 920, por ejemplo, mediante imagenología y/o inmunohistoquímica. La muestra 915 puede lisarse 925 en el sustrato 910. Los ácidos nucleicos 930 de la muestra 915 pueden asociarse (por ejemplo, hibridarse) con la pluralidad de sondas 905 en el sustrato 910. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos 930 pueden transcribirse de manera inversa, prolongarse con homopolímero y/o amplificarse (por ejemplo, con amplificación de puente). Los ácidos nucleicos amplificados pueden interrogarse 935 con sondas de detección 940 (por ejemplo, sondas fluorescentes). Las sondas de detección 940 pueden ser sondas específicas de genes. La localización de unión de las sondas de detección 940 en el sustrato 910 puede correlacionarse con la imagen del sustrato, produciendo de este modo un mapa que indica la localización espacial de los ácidos nucleicos en la muestra.
En algunas realizaciones, los métodos pueden comprender elaborar 945 una réplica 946 del sustrato original 910. El sustrato replicado 946 puede comprender una pluralidad de sondas 931. La pluralidad de sondas 931 puede ser la misma que la pluralidad de sondas 905 en el sustrato original 910. La pluralidad de sondas 931 puede ser diferente de la pluralidad de sondas 905 en el sustrato original 910. Por ejemplo, la pluralidad de sondas 905 pueden ser sondas oligo(dT) y la pluralidad de sondas 931 en el sustrato replicado 946 puede ser sondas específicas de genes. El sustrato replicado puede procesarse como el sustrato original, como con sondas de interrogación por detección (por ejemplo, fluorescentes).
Muestras
Células
Una muestra para su uso en el método de la divulgación puede comprender una o más células. Una muestra puede referirse a una o más células. En algunas realizaciones, las células son células cancerosas extirpadas de un tejido canceroso, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cánceres de piel melanoma y no melanoma, y similares. En algunos casos, las células se derivan de un cáncer pero se obtienen de un fluido corporal (por ejemplo, células tumorales circulantes). Los ejemplos no limitativos de cánceres pueden incluir adenoma, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, carcinoma de células pequeñas, carcinoma indiferenciado de células grandes, condrosarcoma y fibrosarcoma.
En algunas realizaciones, las células son células que han sido infectadas con virus y contienen oligonucleótidos virales. En algunas realizaciones, la infección viral puede estar provocada por un virus seleccionado del grupo que consiste en virus de ADN de cadena doble (por ejemplo, adenovirus, virus del herpes, virus de la viruela), virus de ADN de cadena sencilla (cadena o "sentido") (por ejemplo parvovirus), virus de ARN de cadena doble (por ejemplo, reovirus), virus de ARN de cadena sencilla (cadena o sentido) (por ejemplo, picornavirus, togavirus), virus de ARN de cadena sencilla (cadena - o antisentido) (por ejemplo, ortomixovirus, rabdovirus), virus de ARN de cadena sencilla ((cadena o sentido) con un ADN intermedio en su ciclo de vida), virus de ARN-RT (por ejemplo, retrovirus) y virus de ADN-RT de cadena doble (por ejemplo, hepadnavirus). Los virus ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, SARS, VIH, coronavirus, ébola, malaria, dengue, hepatitis C, hepatitis B y gripe En algunas realizaciones, las células son bacterias. Estas pueden incluir bacterias grampositivas o gramnegativas. Los ejemplos de bacterias que pueden analizarse usando los métodos, dispositivos y sistemas divulgados incluyen, pero no se limitan a Actinomedurae, Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Nocardia, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epiderm, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae y similares. Las bacterias gram negativas incluyen, pero no se limitan a, Afipia felis, Bacteriodes, Bartonella bacilliformis, Bortadella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter, Escherichia coli, Francisella tularensis, Gardnerella vaginalis, Haemophilius aegyptius, Haemophilius ducreyi, Haemophilius influenziae, Heliobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Neisseria meningitidia, Porphyromonas gingivalis, Providencia sturti, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteridis, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella boydii, Streptobacillus moniliformis. Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis and the like. Otras bacterias pueden incluir Myobacterium avium, Myobacterium leprae, Myobacterium tuberculosis, Bartonella henseiae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia akari, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia typhi, Ureaplasma urealyticum, Diplococcus pneumoniae, Ehrlichia chafensis, Enterococcus faecium, Meningococci y similares.
En algunas realizaciones, las células son hongos. Los ejemplos no limitativos de hongos que pueden analizarse usando los métodos, dispositivos y sistemas divulgados incluyen, pero no se limitan a, Aspergilli, Candidae, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococci y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, las células son protozoos u otros parásitos. Los ejemplos de parásitos a analizar usando los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, Balantidium coli, Cryptosporidium parvum, Cyclospom cayatanensis, Encephalitozoa, Entamoeba histolytica, Enterocytozoon bieneusi, Giardia lamblia, Leishmaniae, Plasmodii, Toxoplasma gondii, Trypanosomae, ameba trapezoidal, gusanos (por ejemplo, helmintos), particularmente gusanos parásitos que incluyen, pero no se limitan a, Nematoda (ascárides, por ejemplo, tricocéfalos, anquilostomas, oxiuros, ascáridos, filaridas y similares), Cestoda (por ejemplo, tenias).
Como se usa en la presente, el término "célula" puede referirse a una o más células. En algunas realizaciones, las células son células normales, por ejemplo, células humanas en diferentes etapas de desarrollo, o células humanas de diferentes órganos o tipos de tejidos (por ejemplo, glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas, células epiteliales, células endoteliales, neuronas, células gliales, fibroblastos, células del músculo esquelético, células del músculo liso, gametos o células del corazón, pulmones, cerebro, hígado, riñón, bazo, páncreas, timo, vejiga, estómago, colon, intestino delgado). En algunas realizaciones, las células pueden ser células madre humanas no diferenciadas o células madre humanas que se han inducido a diferenciarse. En algunas realizaciones, las células pueden ser células humanas fetales. Las células fetales humanas pueden obtenerse de una madre embarazada del feto. En algunas realizaciones, las células son células raras. Una célula rara puede ser, por ejemplo, una célula tumoral circulante (CTC), célula epitelial circulante, célula endotelial circulante, célula endometrial circulante, célula madre circulante, célula madre, célula madre indiferenciada, célula madre cancerosa, célula de la médula ósea, célula progenitora, célula espumosa, célula mesenquimatosa, trofoblasto, célula del sistema inmunitario (huésped o injerto) , fragmento celular, orgánulo celular (por ejemplo, mitocondrias o núcleos), célula infectada por patógenos y similares.
En algunas realizaciones, las células son células no humanas, por ejemplo, otros tipos de células de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, cerdo, perro, vaca o caballo). En algunas realizaciones, las células son otros tipos de células animales o vegetales. En otras realizaciones, las células pueden ser cualquier célula procariota o eucariota.
En algunas realizaciones, se obtiene una primera muestra de células de una persona que no padece una enfermedad o afección, y se obtiene una segunda muestra de células de una persona que padece la enfermedad o afección. En algunas realizaciones, las personas son diferentes. En algunas realizaciones, las personas son las mismas pero las muestras de células se toman en diferentes momentos. En algunas realizaciones, las personas son pacientes y las muestras de células son muestras de pacientes. La enfermedad o afección puede ser un cáncer, una infección bacteriana, una infección vírica, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad neurodegenerativa, una enfermedad fúngica, una enfermedad parasitaria, un trastorno genético o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, las células adecuadas para su uso en los métodos actualmente divulgados varían en tamaño desde aproximadamente 2 micrómetros hasta aproximadamente 100 micrómetros de diámetro. En algunas realizaciones, las células tienen diámetros de por lo menos 2 micrómetros, por lo menos 5 micrómetros, por lo menos 10 micrómetros, por lo menos 15 micrómetros, por lo menos 20 micrómetros, por lo menos 30 micrómetros, por lo menos 40 micrómetros, por lo menos 50 micrómetros, por lo menos por lo menos 60 micrómetros, por lo menos 70 micrómetros, por lo menos 80 micrómetros, por lo menos 90 micrómetros o por lo menos 100 micrómetros. En algunas realizaciones, las células tienen diámetros de como máximo 100 micrómetros, como máximo 90 micrómetros, como máximo 80 micrómetros, como máximo 70 micrómetros, como máximo 60 micrómetros, como máximo 50 micrómetros, como máximo 40 micrómetros, como máximo 30 micrómetros, como máximo 20 micrómetros, como máximo 15 micrómetros, como máximo 10 micrómetros, como máximo 5 micrómetros, o como máximo 2 micrómetros. Las células pueden tener un diámetro de cualquier valor dentro de un intervalo, por ejemplo, desde aproximadamente 5 micrómetros hasta aproximadamente 85 micrómetros. En algunas realizaciones, las células tienen diámetros de aproximadamente 10 micrómetros.
En algunas realizaciones, las células se clasifican antes de asociar una célula con una perla y/o en un micropocillo. Por ejemplo, las células pueden clasificarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia o clasificación celular activada magnéticamente, o por ejemplo, mediante citometría de flujo. Las células pueden filtrarse por tamaño. En algunos casos, un retenido contiene las células que se van a asociar con la perla. En algunos casos, el flujo contiene las células que se van a asociar con la perla.
La muestra puede ser ácidos nucleicos. La muestra puede comprender ácidos nucleicos. La muestra puede ser una célula individual. Cuando la muestra es una célula individual, la célula puede lisarse para liberar los ácidos nucleicos de la célula individual. La muestra puede ser de varias células. Las muestras en diferentes pocillos pueden provenir del mismo sujeto. Las muestras en diferentes pocillos pueden provenir de diferentes sujetos. Las muestras en diferentes pocillos pueden provenir de diferentes tejidos (por ejemplo, cerebro, corazón, pulmón, riñón, bazo). Las muestras en diferentes pocillos pueden provenir del mismo tejido.
Difusión a través de un sustrato
Cuando una muestra (por ejemplo, una célula) está codificada con un código de barras estocástico y/o un código de barras combinatorio de acuerdo con los métodos de la divulgación, la célula puede lisarse. La lisis de una célula puede dar como resultado la difusión del contenido de la lisis (por ejemplo, el contenido de la célula) lejos de la localización inicial de la lisis. En otras palabras, el contenido de la lisis puede moverse a un área de superficie mayor que el área de superficie ocupada por la célula.
La difusión de la mezcla de lisis de la muestra (por ejemplo, que comprende objetivos) puede modularse mediante varios parámetros que incluyen, pero no se limitan a, la viscosidad de la mezcla de lisis, la temperatura de la mezcla de lisis, el tamaño de los objetivos, el tamaño de las barreras físicas en un sustrato, la concentración de la mezcla de lisis, y similares. Por ejemplo, la temperatura de la reacción de lisis puede realizarse a una temperatura de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 C o más. La temperatura de la reacción de lisis puede realizarse a una temperatura de como máximo 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 C o más. La viscosidad de la mezcla de lisis puede alterarse, por ejemplo, añadiendo reactivos espesantes (por ejemplo, glicerol, perlas) para ralentizar la tasa de difusión. La viscosidad de la mezcla de lisis puede alterarse, por ejemplo, añadiendo reactivos diluyentes (por ejemplo, agua) para aumentar la tasa de difusión. Un sustrato puede comprender barreras físicas (por ejemplo, pocillos, micropocillos, microcolinas) que pueden alterar la tasa de difusión de los objetivos de una muestra. La concentración de la mezcla de lisis puede alterarse para aumentar o disminuir la tasa de difusión de los objetivos de una muestra. La concentración de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse en por lo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces o más. La concentración de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 o más veces.
Puede aumentarse la tasa de difusión. La tasa de difusión puede disminuirse. La tasa de difusión de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse en por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces o más en comparación con una mezcla de lisis no alterada. La tasa de difusión de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces o más en comparación con una mezcla de lisis no alterada. La tasa de difusión de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse en por lo menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% en comparación con una mezcla de lisis no alterada. La tasa de difusión de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse en por lo menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% en comparación con una mezcla de lisis no alterada.
Software de visualización y análisis de datos
Análisis de datos y visualización de resolución espacial de objetivos.
La divulgación proporciona métodos para estimar el número y la posición de los objetivos con códigos de barras estocásticos y/o códigos de barras combinatorios y recuento digital. Los datos obtenidos de los métodos de la divulgación pueden visualizarse en un mapa. Los datos obtenidos de los métodos de la divulgación pueden visualizarse en un mapa de la matriz de micropocillos (por ejemplo, de tal manera que pueda hacerse un seguimiento de los resultados de cada muestra hasta una localización en la matriz de micropocillos). Puede construirse un mapa del número y la localización de los objetivos de una muestra usando la información generada usando los métodos descritos en la presente. El mapa puede usarse para localizar una localización física de un objetivo. El mapa puede usarse para identificar la localización de múltiples objetivos. Los múltiples objetivos pueden ser la misma especie de objetivo, o los múltiples objetivos pueden ser múltiples objetivos diferentes. Por ejemplo, puede construirse un mapa del cerebro para mostrar el recuento digital y la localización de múltiples objetivos.
El mapa puede generarse a partir de datos de una sola muestra. El mapa puede construirse usando datos de múltiples muestras, generando de este modo un mapa combinado. El mapa puede construirse con datos de decenas, cientos y/o miles de muestras. Un mapa construido a partir de múltiples muestras puede mostrar una distribución de recuentos digitales de objetivos asociados con regiones comunes a las múltiples muestras. Por ejemplo, pueden mostrarse en el mismo mapa ensayos replicados. Pueden mostrarse por lo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más réplicas (por ejemplo, superpuestas) en el mismo mapa. Pueden mostrarse como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más réplicas (por ejemplo, superpuestas) en el mismo mapa. La distribución espacial y el número de objetivos pueden representarse mediante una variedad de estadísticas.
En algunas realizaciones del sistema de instrumentos, el sistema comprenderá medios legibles por ordenador que incluyen código para proporcionar análisis de datos para los conjuntos de datos de secuencia generados al realizar ensayos de códigos de barras estocásticos de una célula individual. Los ejemplos de la funcionalidad de análisis de datos que puede proporcionar el software de análisis de datos incluyen, pero no se limitan a, (i) algoritmos para decodificar/demultiplexar el marcador de la muestra, el marcador celular, el marcador molecular y los datos de la secuencia objetivo proporcionados mediante la secuenciación de códigos de barras estocásticos y/o biblioteca de reactivos de códigos de barras combinatorios creada al ejecutar el ensayo, (ii) algoritmos para determinar el número de lecturas por gen por célula y el número de moléculas de transcripción únicas por gen por célula, en base a los datos, y la creación de tablas de resumen, (iii) análisis estadístico de los datos de la secuencia, por ejemplo para el agrupamiento de células por datos de expresión génica, o para predecir intervalos de confianza para determinaciones del número de moléculas de transcripción por gen por célula, etc., (iv) algoritmos para identificar subpoblaciones de células raras, por ejemplo, mediante análisis de componentes principales, análisis jerárquico agrupamiento, agrupamiento de media k, mapas de autoorganización, redes neuronales, etc., (v) capacidades de alineación de secuencias para alinear datos de secuencias de genes con secuencias de referencia conocidas y detección de mutaciones, marcadores polimórficos y variantes de corte y empalme, y (vi) agrupamiento automatizado de marcadores moleculares para compensar los errores de amplificación o secuenciación. En algunas realizaciones, puede usarse software disponible comercialmente para realizar todo o una parte del análisis de datos, por ejemplo, Seven Bridges (https://www.sbgenomics.com/) puede usarse software para compilar tablas del número de copias de uno o más genes que se encuentran en cada célula para la colección completa de células. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede incluir opciones para generar los resultados de secuenciación en formatos gráficos útiles, por ejemplo, mapas de calor que indican el número de copias de uno o más genes que se producen en cada célula de una colección de células. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede comprender además algoritmos para extraer el significado biológico de los resultados de la secuenciación, por ejemplo, correlacionando el número de copias de uno o más genes que se producen en cada célula de una colección de células con un tipo de célula, un tipo de célula rara, o una célula derivada de un sujeto que tiene una enfermedad o afección específica. En alguna realización, el software de análisis de datos puede comprender además algoritmos para comparar poblaciones de células en diferentes muestras biológicas.
En algunas realizaciones, toda la funcionalidad de análisis de datos puede empaquetarse dentro de un solo paquete de software. En algunas realizaciones, el conjunto completo de capacidades de análisis de datos puede comprender un conjunto de paquetes de software. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede ser un paquete independiente que se pone a disposición de los usuarios independientemente del sistema del instrumento de ensayo. En algunas realizaciones, el software puede estar basado en la web y puede permitir a los usuarios compartir datos.
Procesadores de sistemas y redes
En general, el ordenador o procesador incluido en los sistemas de instrumentos actualmente divulgados, puede entenderse además como un aparato lógico que puede leer instrucciones desde medios o un puerto de red, que puede conectarse opcionalmente a un servidor que tiene medios fijos. El sistema puede incluir una CPU, unidades de disco, dispositivos de entrada opcionales, como teclado o ratón, y un monitor opcional. La comunicación de datos puede lograrse a través del medio de comunicación indicado a un servidor en una localización local o remota. El medio de comunicación puede incluir cualquier medio de transmisión o recepción de datos. Por ejemplo, el medio de comunicación puede ser una conexión de red, una conexión inalámbrica o una conexión a Internet. Tal conexión puede permitir la comunicación a través de la World Wide Web. Se prevé que los datos relacionados con la presente divulgación puedan trasmitirse a través de tales redes o conexiones para la recepción o revisión por otra parte.
Puede usarse una realización ejemplar de un primer ejemplo de arquitectura de un sistema informático en relación con realizaciones ejemplares de la presente divulgación. El sistema informático ejemplar puede incluir un procesador para procesar instrucciones. Los ejemplos no limitativos de procesadores incluyen: procesador Intel XeonTM, procesador AMD OpteronTM, procesador Samsung RISC ARM 1176JZ(F)-S v1.0Tm de 32 bits, procesador ARM Cortex-A8 Samsung S5PC100TM, procesador ARM Cortex-A8 Apple A4TM, procesador Marvell Procesador PXA 930TM o un procesador funcionalmente equivalente. Pueden usarse varios subprocesos de ejecución para el procesamiento en paralelo. En algunas realizaciones, también pueden usarse múltiples procesadores o procesadores con múltiples núcleos, ya sea en un solo sistema informático, en un grupo o distribuidos entre sistemas a través de una red que comprende una pluralidad de ordenadores, teléfonos móviles, o dispositivos asistentes de datos personales.
Puede conectarse o incorporarse una memoria caché de alta velocidad en el procesador para proporcionar una memoria de alta velocidad para instrucciones o datos que el procesador ha usado recientemente o que usa con frecuencia. El procesador puede conectarse a un puente norte mediante un bus de procesador. El puente norte está conectado a la memoria de acceso aleatorio (RAM) mediante un bus de memoria y gestiona el acceso a la RAM por parte del procesador. El puente norte también puede conectarse a un puente sur mediante un bus de chipset. El puente sur está, a su vez, conectado a un bus periférico. El bus periférico puede ser, por ejemplo, PCI, PCI-X, PCI Express u otro bus periférico. El puente norte y el puente sur a menudo se denominan conjunto de chips del procesador y administran la transferencia de datos entre el procesador, la RAM y los componentes periféricos en el bus periférico. En algunas arquitecturas alternativas, la funcionalidad del puente norte puede incorporarse en el procesador en lugar de usar un chip de puente norte separado.
El sistema puede incluir una tarjeta aceleradora unida al bus de periféricos. El acelerador puede incluir matrices de puertas programables en campo (FPGA) u otro hardware para acelerar cierto procesamiento. Por ejemplo, puede usarse un acelerador para la reestructuración adaptativa de datos o para evaluar expresiones algebraicas usadas en el procesamiento de conjuntos extendidos.
El software y los datos pueden almacenarse en un almacenamiento externo y pueden cargarse en la memoria RAM o en la memoria caché para que los use el procesador. El sistema incluye un sistema operativo para administrar los recursos del sistema; Los ejemplos no limitativos de sistemas operativos incluyen: Linux, WindowsTM, MACOSTM, BlackBerry OSTM, iOSTM y otros sistemas operativos funcionalmente equivalentes, así como software de aplicación que se ejecuta sobre el sistema operativo para administrar el almacenamiento y la optimización de datos de acuerdo con las realizaciones ejemplares de la presente invención.
En este ejemplo, el sistema también incluye tarjetas de interfaz de red (NIC) y está conectado al bus de periféricos para proporcionar interfaces de red al almacenamiento externo, como el almacenamiento conectado a la red (NAS) y otros sistemas informáticos que pueden usarse para el procesamiento paralelo distribuido.
Un diagrama ejemplar de una red puede comprender una pluralidad de sistemas informáticos, una pluralidad de teléfonos móviles y asistentes de datos personales, y almacenamiento conectado a la red (NAS). En realizaciones de ejemplo, los sistemas pueden administrar el almacenamiento de datos y optimizar el acceso a los datos para los datos almacenados en el almacenamiento conectado a la red (NAS). Puede usarse un modelo matemático para los datos y evaluarse mediante el procesamiento paralelo distribuido entre sistemas informáticos y sistemas de asistentes de datos personales y teléfonos móviles. Los sistemas informáticos y los sistemas de asistentes de datos personales y teléfonos móviles también pueden proporcionar un procesamiento paralelo para la reestructuración de datos adaptativa de los datos almacenados en el almacenamiento conectado a la red (NAS). Puede usarse una amplia variedad de otras arquitecturas y sistemas informáticos junto con las varias realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, puede usarse un servidor blade para proporcionar procesamiento en paralelo. Los blades del procesador pueden conectarse a través de un plano posterior para proporcionar un procesamiento en paralelo. El almacenamiento también puede conectarse al plano posterior o como almacenamiento conectado a la red (NAS) a través de una interfaz de red independiente.
En algunas realizaciones de ejemplo, los procesadores pueden mantener espacios de memoria separados y transmitir datos a través de interfaces de red, plano posterior u otros conectores para procesamiento paralelo por otros procesadores. En otras realizaciones, algunos o todos los procesadores pueden usar un espacio de memoria de dirección virtual compartido.
Un ejemplo de un diagrama de bloques de un sistema informático multiprocesador puede comprender un espacio de memoria de dirección virtual compartido de acuerdo con una realización de ejemplo. El sistema puede incluir una pluralidad de procesadores que pueden acceder a un subsistema de memoria compartida. El sistema puede incorporar una pluralidad de procesadores de algoritmos de memoria (MAP) de hardware programable en el subsistema de memoria. Cada MAP puede comprender una memoria y una o más matrices de puertas programables en campo (FPGA). El MAP puede proporcionar una unidad funcional configurable y pueden proporcionarse algoritmos particulares o partes de algoritmos a los FPGA para su procesamiento en estrecha coordinación con un procesador respectivo. Por ejemplo, los MAP pueden usarse para evaluar expresiones algebraicas con respecto al modelo de datos y para realizar una reestructuración de datos adaptativa en realizaciones de ejemplo. En este ejemplo, cada MAP es accesible globalmente por todos los procesadores para estos propósitos. En una configuración, cada MAP puede usar Acceso Directo a Memoria (DMA) para acceder a una memoria asociada, lo que le permite ejecutar tareas independientemente y asincrónicamente desde el microprocesador respectivo. En esta configuración, un MAP puede enviar resultados directamente a otro MAP para canalizar y ejecutar algoritmos en paralelo.
Las arquitecturas y sistemas informáticos anteriores son solo ejemplos, y puede usarse una amplia variedad de otras arquitecturas y sistemas informáticos, de teléfonos móviles y de asistentes de datos personales en relación con realizaciones de ejemplo, incluyendo sistemas que usan cualquier combinación de procesadores generales, coprocesadores, FPGA y otros dispositivos lógicos programables, sistema en chips (SOC), circuitos integrados específicos de aplicación (ASIC) y otros elementos lógicos y de procesamiento. En algunas realizaciones, todo o parte del sistema informático puede implementarse en software o hardware. Puede usarse cualquier variedad de medios de almacenamiento de datos en relación con las realizaciones de ejemplo, que incluyen memoria de acceso aleatorio, discos duros, memoria flash, unidades de cinta, matrices de discos, almacenamiento conectado a la red (NAS) y otros dispositivos y sistemas de almacenamiento de datos locales o distribuidos.
En realizaciones de ejemplo, el subsistema informático de la presente divulgación puede implementarse usando módulos de software que se ejecutan en cualquiera de las arquitecturas y sistemas informáticos anteriores u otras. En otras realizaciones, las funciones del sistema pueden implementarse parcial o completamente en firmware, dispositivos lógicos programables como matrices de puertas programables en campo (FPGA), sistemas en chips (SOC), circuitos integrados específicos de aplicación (ASIC) u otros procesos y elementos lógicos. Por ejemplo, el Conjunto de Procesador y Optimizador puede implementarse con aceleración de hardware mediante el uso de una tarjeta aceleradora de hardware, como una tarjeta aceleradora.
Kits
En la presente se divulgan kits para realizar ensayos de codificación con códigos de barras estocásticos y/o codificación con códigos de barras combinatorios de células individuales. El kit puede comprender cualquier composición o mezclas de composiciones de la divulgación (por ejemplo, cualquier reactivo de códigos de barras combinatorios de cualquier tipo y cualquier número). El kit puede comprender uno o más reactivos de códigos de barras combinatorios de la divulgación. El kit puede comprender uno o más códigos de barras estocásticos de la divulgación. El kit puede comprender uno o más sustratos (por ejemplo, matriz de micropocillos), ya sea como un sustrato (o chip) independiente que comprende una o más matrices de micropocillos, o empaquetarse dentro de una o más células de flujo o cartuchos. El uno o más sustratos del kit pueden comprender los reactivos de códigos de barras combinatorios y/o los reactivos de códigos de barras estocásticos precargados en los pocillos. En algunos casos, los reactivos de códigos de barras estocásticos pueden precargarse en los pocillos del sustrato y el kit comprende reactivos de códigos de barras combinatorios para la adición por el usuario a los pocillos.
En algunos casos, un kit puede comprender un conjunto de reactivos de códigos de barras combinatorios. El segundo de los reactivos de códigos de barras combinatorios puede incluir un reactivo de códigos de barras combinatorios que comprende una región específica del objetivo (por ejemplo, para la cadena de sentido o antisentido) y otros reactivos de códigos de barras combinatorios que pueden no comprender una región específica del objetivo, pero pueden comprender conectores para enlazar todos los reactivos de códigos de barras combinatorios (por ejemplo, de tal manera que los reactivos de códigos de barras combinatorios se enlacen entre sí en un extremo de un ácido nucleico objetivo (ver la Figura 2C)).
Los kits pueden comprender una o más suspensiones de soporte sólido, en donde los soportes sólidos individuales dentro de una suspensión comprenden una pluralidad de códigos de barras estocásticos unidos de la divulgación. Los kits pueden comprender códigos de barras estocásticos que pueden no estar unidos a un soporte sólido. El kit puede comprender un sellador. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además un accesorio mecánico para montar un sustrato independiente para crear pocillos de reacción que faciliten el pipeteo de muestras y reactivos en el sustrato.
El kit puede comprender además reactivos, por ejemplo, tampones de lisis, tampones de enjuague o tampones de hibridación, para realizar el ensayo de codificación con códigos de barras estocásticos. El kit puede comprender además reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores, dNTP, NTP, inhibidores de ARNasa o tampones) para realizar reacciones de extensión de ácidos nucleicos, por ejemplo, reacciones de transcripción inversa y reacciones de extensión de cebador. El kit puede comprender además reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores universales, cebadores de secuenciación, cebadores específicos de objetivo o tampones) para realizar reacciones de amplificación para preparar bibliotecas de secuenciación. El kit puede comprender reactivos para prolongar homopolímeros de moléculas (por ejemplo, una enzima transferasa terminal y dNTP). El kit puede comprender reactivos para, por ejemplo, cualquier escisión enzimática de la divulgación (por ejemplo, nucleasa ExoI, enzima de restricción). Los reactivos pueden precargarse en los pocillos de un sustrato (por ejemplo, con reactivos de códigos de barras combinatorios).
El kit puede comprender cebadores de amplificación de bibliotecas de secuenciación. El kit puede comprender un cebador de síntesis de segunda cadena de la divulgación. El kit puede comprender cualquier cebador de la divulgación (por ejemplo, cebadores específicos de genes, multímeros aleatorios, cebadores de secuenciación y cebadores universales).
El kit puede comprender uno o más moldes, por ejemplo, moldes que comprenden una matriz de micropilares, para fundir sustratos (por ejemplo, matrices de micropocillos) y uno o más soportes sólidos (por ejemplo, perlas), en donde las perlas individuales dentro de una suspensión comprenden un pluralidad de códigos de barras estocásticos unidos de la divulgación. El kit puede comprender además un material para su uso en la fundición de sustratos (por ejemplo, agarosa, un hidrogel, PDMS, adhesivo óptico y similares).
El kit puede comprender uno o más sustratos que están precargados con soportes sólidos que comprenden una pluralidad de códigos de barras estocásticos unidos de la divulgación. En algunos casos, puede haber un soporte sólido por micropocillo del sustrato. En algunas realizaciones, la pluralidad de códigos de barras estocásticos pueden unirse directamente a una superficie del sustrato, en lugar de a un soporte sólido. En cualquiera de estas realizaciones, pueden proporcionarse una o más matrices de micropocillos en forma de sustratos independientes (o chips), o pueden empaquetarse en células de flujo o cartuchos.
En algunas realizaciones, el kit puede comprender uno o más cartuchos que incorporan uno o más sustratos. En algunas realizaciones, uno o más cartuchos comprenden además uno o más soportes sólidos precargados, en donde los soportes sólidos individuales dentro de una suspensión comprenden una pluralidad de códigos de barras estocásticos unidos de la divulgación. En algunas realizaciones, las perlas se distribuyen previamente en una o más matrices de micropocillos del cartucho. En algunas realizaciones, las perlas, en forma de suspensiones, pueden precargarse y almacenarse dentro de los pocillos de reactivo del cartucho. En algunas realizaciones, uno o más cartuchos comprenden además otros reactivos de ensayo que están precargados y almacenados dentro de los depósitos de reactivos de los cartuchos.
Los kits generalmente pueden incluir instrucciones para llevar a cabo uno o más de los métodos divulgados en la presente. Las instrucciones incluidas en los kits pueden fijarse al material de envasado o pueden incluirse como un prospecto en el paquete. Aunque las instrucciones suelen ser materiales escritos o impresos, no están limitan a ellos. La divulgación contempla cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Tales medios pueden incluir, pero no se limitan a, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), etiquetas RF y similares. Tal como se usa en la presente, el término "instrucciones" puede incluir la dirección de un sitio de Internet que proporcione las instrucciones.
Dispositivos
Celdas de flujo
El sustrato de matriz de micropocillos puede empaquetarse dentro de una celda de flujo que proporciona una interfaz conveniente con el resto del sistema de manejo de fluidos y facilita el intercambio de fluidos, por ejemplo, suspensiones de soporte sólido y celular, tampones de lisis, tampones de enjuague, etc., que se suministran a la matriz de micropocillos y/o gotita de emulsión. Las características de diseño pueden incluir: (i) uno o más puertos de entrada para introducir muestras de células, suspensiones de soporte sólido u otros reactivos de ensayo, (ii) una o más cámaras de matriz de micropocillos diseñadas para proporcionar un llenado uniforme y un intercambio de fluidos eficiente a la vez que se minimizan los remolinos o las zonas muertas, y (iii) uno o más puertos de salida para el suministro de fluidos a un punto de recogida de muestras o un depósito de desechos. El diseño de la celda de flujo puede incluir una pluralidad de cámaras de micromatrices que interactúan con una pluralidad de matrices de micropocillos de tal manera que una o más muestras de células diferentes puedan procesarse en paralelo. El diseño de la celda de flujo puede incluir además características para crear perfiles de velocidad de flujo uniformes, es decir, "flujo de tapón", a lo ancho de la cámara de la matriz para proporcionar un suministro más uniforme de células y perlas a los micropocillos, por ejemplo, mediante el uso de un barrera porosa localizada cerca de la entrada de la cámara y en sentido ascendente de la matriz de micropocillos como un "difusor de flujo", o dividiendo cada cámara de la matriz en varias subsecciones que en conjunto cubren la misma área total de la matriz, pero a través de las cuales fluye en paralelo la corriente de fluido de entrada dividida. En algunas realizaciones, la celda de flujo puede encerrar o incorporar más de un sustrato de matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el montaje integrado de matriz de micropocillos/célula de flujo puede constituir un componente fijo del sistema. En algunas realizaciones, el montaje de matriz de micropocillos/célula de flujo puede retirarse del instrumento.
En general, las dimensiones de los canales de fluidos y la cámara o cámaras de la matriz en los diseños de celdas de flujo se optimizarán para (i) proporcionar un suministro uniforme de células y microesferas a la matriz de micropocillos y (ii) minimizar el consumo de muestras y reactivos. En algunas realizaciones, la anchura de los canales de fluido estará entre 50 um y 20 mm. En otras realizaciones, la anchura de los canales de fluido puede ser de por lo menos 50 um, por lo menos 100 um, por lo menos 200 um, por lo menos 300 um, por lo menos 400 um, por lo menos 500 um, por lo menos 750 um, por lo menos 1 mm, por lo menos 2,5 mm, por lo menos 5 mm, por lo menos 10 mm, por lo menos 20 mm, por lo menos 50 mm, por lo menos 100 mm o por lo menos 150 mm. En otras realizaciones más, la anchura de los canales de fluido puede ser como máximo 150 mm, como máximo 100 mm, como máximo 50 mm, como máximo 20 mm, como máximo 10 mm, como máximo 5 mm, como máximo 2,5 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 um, como máximo 500 um, como máximo 400 um, como máximo 300 um, como máximo 200 um, como máximo 100 um, o como máximo 50 um. En una realización, la anchura de los canales de fluido es de aproximadamente 2 mm. La anchura de los canales de fluido puede estar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 250 um a aproximadamente 3 mm).
En algunas realizaciones, la profundidad de los canales de fluido puede ser de entre 50 um y 2 mm. En otras realizaciones, la profundidad de los canales de fluido puede ser de por lo menos 50 um, por lo menos 100 um, por lo menos 200 um, por lo menos 300 um, por lo menos 400 um, por lo menos 500 um, por lo menos 750 um, por lo menos 1 mm, por lo menos 1,25 mm, por lo menos 1,5 mm, por lo menos 1,75 mm o por lo menos 2 mm. En otras realizaciones más, la profundidad de los canales de fluido puede ser como máximo 2 mm, como máximo 1,75 mm, como máximo 1,5 mm, como máximo 1,25 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 um, como máximo 500 um, como máximo 400 um, como máximo 300 um, como máximo 200 um, como máximo 100 um, o como máximo 50 um. En una realización, la profundidad de los canales de fluido es de aproximadamente 1 mm. La profundidad de los canales de fluido puede estar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 800 um a aproximadamente 1 mm).
Las celdas de flujo pueden fabricarse usando una variedad de técnicas y materiales conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la celda de flujo puede fabricarse como una pieza separada y, posteriormente, sujetarse mecánicamente o unirse permanentemente al sustrato de la matriz de micropocillos. Los ejemplos de técnicas de fabricación adecuadas incluyen el mecanizado convencional, el mecanizado CNC, el moldeo por inyección, la impresión 3D, la alineación y laminación de una o más capas de películas de polímero troqueladas o con láser, o cualquiera de una serie de técnicas de microfabricación, como la fotolitografía y el grabado químico húmedo, grabado en seco, grabado profundo con iones reactivos o micromaquinado láser. Una vez que se ha fabricado la parte de la celda de flujo, puede unirse mecánicamente al sustrato de la matriz de micropocillos, por ejemplo, sujetándola contra el sustrato de la matriz de micropocillos (con o sin el uso de una junta), o puede unirse directamente al sustrato de la matriz de micropocillos usando cualquiera de una variedad de técnicas (dependiendo de la elección de los materiales usados) conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de unión anódica, unión térmica o cualquiera de una variedad de adhesivos o películas adhesivas, incluyendo los adhesivos a base de epoxi, a base de acrílico, a base de silicona, curables por UV, a base de poliuretano o a base de cianoacrilato.
Las celdas de flujo pueden fabricarse usando una variedad de materiales conocidos por los expertos en la técnica. En general, la elección del material usado dependerá de la elección de la técnica de fabricación usada, y viceversa. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen, pero no se limitan a, silicio, sílice fundida, vidrio, cualquiera de una variedad de polímeros, por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato (PC), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros de olefina cíclica (COP), copolímeros de olefina cíclica (COC), tereftalato de polietileno (PET), resinas epoxi, metales (por ejemplo, aluminio, acero inoxidable, cobre, níquel, cromo y titanio), un material antiadherente como el teflón (PTFE) o una combinación de estos materiales.
Cartuchos
En algunas realizaciones del sistema, la matriz de micropocillos, con o sin una celda de flujo unida, puede empaquetarse dentro de un cartucho consumible que interactúa con el sistema del instrumento. Las características de diseño de los cartuchos pueden incluir (i) uno o más puertos de entrada para crear conexiones de fluidos con el instrumento o introducir manualmente muestras de células, suspensiones de microesferas u otros reactivos de ensayo en el cartucho, (ii) uno o más canales de derivación, es decir, para automedición de muestras de células y suspensiones de perlas, para evitar el sobrellenado o el reflujo, (iii) uno o más ensamblajes integrados de matriz de micropocillos/celda de flujo, o una o más cámaras dentro de las cuales se colocan los sustratos de micromatriz, (iv) bombas en miniatura integradas u otros mecanismos de accionamiento de fluidos para controlar el flujo de fluido a través del dispositivo, (v) válvulas en miniatura integradas (u otros mecanismos de contención) para compartimentar reactivos precargados (por ejemplo, suspensiones de perlas, reactivos de códigos de barras combinatorios, códigos de barras estocásticos) o controlar el flujo de fluido a través del dispositivo, (vi) una o más ventilaciones para proporcionar una ruta de escape para el aire atrapado, (vii) uno o más depósitos de desechos de muestras y reactivos, (viii) uno o más puertos de salida para crear conexiones de fluido con el instrumento o proporcionar un punto de recogida de muestras procesadas, (ix) características de interfaz mecánica para colocar de manera reproducible el cartucho consumible extraíble con respecto al sistema del instrumento, y para proporcionar acceso de tal manera que los imanes externos puedan acercarse a la matriz de micropocillos, (x) componentes de control de temperatura integrados o una interfaz térmica para proporcionar un buen contacto térmico con el sistema del instrumento, y (xi) características de interfaz óptica, por ejemplo, una ventana transparente, para usar en la interrogación óptica de la matriz de micropocillos.
El cartucho puede diseñarse para procesar más de una muestra en paralelo. El cartucho puede comprender además una o más cámaras de recogida de muestras extraíbles que son adecuadas para interactuar con termocicladores de PCR independientes o instrumentos de secuenciación. El propio cartucho puede ser adecuado para interactuar con termocicladores de PCR independientes o instrumentos de secuenciación. El término "cartucho", tal como se usa en esta divulgación, puede incluir cualquier montaje de piezas que contenga la muestra y las perlas durante la realización del ensayo.
El cartucho puede comprender además componentes que están diseñados para crear barreras físicas o químicas que evitan la difusión (o aumentan las longitudes de paso y los tiempos de difusión) de moléculas grandes para minimizar la contaminación cruzada entre micropocillos. Los ejemplos de tales barreras pueden incluir, pero no se limitan a, un patrón de canales serpenteantes usados para el suministro de células y soportes sólidos (por ejemplo, perlas) a la matriz de micropocillos, una placa retráctil o una membrana deformable que se presiona para que entre en contacto con la superficie del sustrato de la matriz de micropocillos durante los pasos de lisis o incubación, el uso de perlas más grandes, por ejemplo, perlas de Sephadex como se ha descrito anteriormente, para bloquear las aberturas de los micropocillos, o la liberación de un fluido hidrófobo inmiscible desde un depósito dentro del cartucho durante los pasos de lisis o de incubación, para separar y compartimentar efectivamente cada micropocillo en la matriz.
Las dimensiones de los canales de fluidos y la cámara o cámaras de la matriz en los diseños de cartuchos pueden optimizarse para (i) proporcionar una distribución uniforme de células y microesferas a la matriz de micropocillos y (ii) minimizar el consumo de muestras y reactivos. La anchura de los canales de fluido puede estar entre 50 micrómetros y 20 mm. En otras realizaciones, la anchura de los canales de fluido puede ser de por lo menos 50 micrómetros, por lo menos 100 micrómetros, por lo menos 200 micrómetros, por lo menos 300 micrómetros, por lo menos 400 micrómetros, por lo menos 500 micrómetros, por lo menos 750 micrómetros, por lo menos 1 mm, por lo menos 2,5 mm, por lo menos 5 mm, por lo menos 10 mm o por lo menos 20 mm. En otras realizaciones más, la anchura de los canales de fluido puede ser de 20 mm como máximo, 10 mm como máximo, 5 mm como máximo, 2,5 mm como máximo, 1 mm como máximo, 750 micrómetros como máximo, 500 micrómetros como máximo, 400 micrómetros como máximo, como máximo 300 micrómetros, como máximo 200 micrómetros, como máximo 100 micrómetros, o como máximo 50 micrómetros. La anchura de los canales de fluido puede ser de aproximadamente 2 mm. La anchura de los canales de fluido puede estar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 250 um a aproximadamente 3 mm).
Los canales de fluido en el cartucho pueden tener una profundidad. La profundidad de los canales de fluido en los diseños de cartucho puede estar entre 50 micrómetros y 2 mm. La profundidad de los canales de fluido puede ser de por lo menos 50 micrómetros, por lo menos 100 micrómetros, por lo menos 200 micrómetros, por lo menos 300 micrómetros, por lo menos 400 micrómetros, por lo menos 500 micrómetros, por lo menos 750 micrómetros, por lo menos 1 mm, por lo menos 1,25 mm, por lo menos 1,5 mm, por lo menos 1,75 mm o por lo menos 2 mm. La profundidad de los canales de fluido puede ser de como máximo 2 mm, como máximo 1,75 mm, como máximo 1,5 mm, como máximo 1,25 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 micrómetros, como máximo 500 micrómetros, como máximo 400 micrómetros, como máximo 300 micrómetros, como máximo 200 micrómetros, como máximo 100 micrómetros, o como máximo 50 micrómetros. La profundidad de los canales de fluido puede ser de aproximadamente 1 mm. La profundidad de los canales de fluido puede estar dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 800 micrómetros a aproximadamente 1 mm).
Los cartuchos pueden fabricarse usando una variedad de técnicas y materiales conocidos por los expertos en la técnica. En general, los cartuchos se fabricarán como una serie de componentes separados y se ensamblarán posteriormente usando cualquiera de varias técnicas de unión o ensamblaje mecánico. Los ejemplos de técnicas de fabricación adecuadas incluyen, pero no se limitan a, mecanizado convencional, mecanizado CNC, moldeado por inyección, termoformado e impresión 3D. Una vez que se han fabricado los componentes del cartucho, pueden ensamblarse mecánicamente usando tornillos, clips y similares, o unirlos permanentemente usando cualquiera de una variedad de técnicas (dependiendo de la elección de los materiales usados), por ejemplo, mediante el uso de unión térmica/soldadura o cualquiera de una variedad de adhesivos o películas adhesivas, incluyendo adhesivos a base de epoxi, a base de acrílico, a base de silicona, curables con UV, a base de poliuretano, a base de cianocrilato.
Los componentes del cartucho pueden fabricarse usando cualquiera de una serie de materiales adecuados, incluyendo pero no limitados a, silicio, sílice fundida, vidrio, cualquiera de una variedad de polímeros, por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato (PC), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros olefínicos cíclicos (COP), copolímeros olefínicos cíclicos (COC), tereftalato de polietileno (PET), resinas epoxi, materiales antiadherentes como teflón (PTFE), metales (por ejemplo, aluminio, acero inoxidable, cobre, níquel, cromo y titanio) o cualquier combinación de los mismos.
Las características de entrada y salida del cartucho pueden diseñarse para proporcionar conexiones de fluido convenientes y a prueba de fugas con el instrumento, o pueden servir como depósitos abiertos para el pipeteo manual de muestras y reactivos dentro o fuera del cartucho. Los ejemplos de diseños mecánicos convenientes para los conectores de puerto de entrada y salida pueden incluir, pero no se limitan a, conectores roscados, conectores Luer lock, conectores Luer deslizantes o de "punta deslizante", conectores de ajuste a presión y similares. Los puertos de entrada y salida del cartucho pueden comprender además tapas, cubiertas o cierres accionados por resorte, o membranas de polímero que pueden abrirse o perforarse cuando el cartucho se coloca en el instrumento. y que sirven para evitar la contaminación de las superficies internas del cartucho durante el almacenamiento o que evitan que se derramen fluidos cuando se retira el cartucho del instrumento. El uno o más puertos de salida del cartucho pueden comprender además una cámara de recogida de muestras extraíble que es adecuada para interactuar con termocicladores de PCR autónomos o instrumentos de secuenciación.
El cartucho puede incluir bombas en miniatura integradas u otros mecanismos de accionamiento de fluidos para controlar el flujo de fluido a través del dispositivo. Los ejemplos de bombas en miniatura o mecanismos de accionamiento de fluidos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, mecanismos de jeringuilla o émbolo en miniatura accionados electromecánica o neumáticamente, bombas de diafragma de membrana accionadas neumáticamente o mediante un pistón externo, bolsas o vejigas de reactivo accionadas neumáticamente, o bombas electro-osmóticas.
El cartucho puede incluir válvulas en miniatura para compartimentar reactivos precargados o controlar el flujo de fluido a través del dispositivo. Los ejemplos de válvulas en miniatura adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, "válvulas" de un solo paso fabricadas usando tapones de cera o polímero que pueden derretirse o disolverse, o membranas de polímero que pueden perforarse; válvulas de manguito construidas con una membrana deformable y accionamiento neumático, magnético, electromagnético o electromecánico (solenoide), válvulas unidireccionales construidas con aletas de membrana deformable y válvulas de compuerta en miniatura.
El cartucho puede incluir respiraderos para proporcionar una ruta de escape para el aire atrapado. Los respiraderos pueden construirse de acuerdo con una variedad de técnicas, por ejemplo, usando un tapón poroso de polidimetilsiloxano (PDMS) u otro material hidrófobo que permita la capilaridad del aire pero bloquee la penetración del agua.
Las características de interfaz mecánica del cartucho pueden proporcionar un posicionamiento fácilmente extraíble pero altamente preciso y repetible del cartucho con respecto al sistema del instrumento. Las características de interfaz mecánica adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, clavijas de alineación, guías de alineación, topes mecánicos y similares. Las características de diseño mecánico pueden incluir características de relieve para acercar el aparato externo, por ejemplo, imanes o componentes ópticos, a la cámara de matriz de micropocillos.
El cartucho también puede incluir componentes de control de temperatura o funciones de interfaz térmica para acoplarse a módulos de control de temperatura externos. Los ejemplos de elementos de control de temperatura adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, elementos de calentamiento resistivos, fuentes de luz emisoras de infrarrojos en miniatura, dispositivos de calentamiento o refrigeración Peltier, disipadores de calor, termistores, termopares y similares. Las características de interfaz térmica pueden fabricarse con materiales que sean buenos conductores térmicos (por ejemplo, cobre, oro, plata, etc.) y pueden comprender una o más superficies planas capaces de hacer un buen contacto térmico con bloques de calentamiento o refrigeración externos.
El cartucho puede incluir funciones de interfaz óptica para su uso en imágenes ópticas o interrogación espectroscópica de la matriz de micropocillos. El cartucho puede incluir una ventana ópticamente transparente, por ejemplo, el propio sustrato del micropocillo o el lateral de la celda de flujo o la cámara de la micromatriz opuesta a la matriz de micropocillos, fabricado con un material que cumpla con los requisitos espectrales para la técnica de imagenología o espectroscópica usada para sondear el matriz de micropocillos. Los ejemplos de materiales de ventana óptica adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, vidrio, sílice fundida, polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato (PC), polímeros de olefina cíclica (COP) o copolímeros de olefina cíclica (COC).
En por lo menos algunas de las realizaciones descritas anteriormente, uno o más elementos usados en una realización pueden intercambiarse en otra realización a menos que dicho reemplazo no sea técnicamente factible. Los expertos en la técnica apreciarán que pueden realizarse varias otras omisiones, adiciones y modificaciones a los métodos y estructuras descritos anteriormente sin apartarse del alcance de la materia reivindicada. Se pretende que todas estas modificaciones y cambios entren dentro del alcance de la materia, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Con respecto al uso de sustancialmente cualquier término plural y/o singular en la presente, los expertos en la técnica pueden traducir del plural al singular y/o del singular al plural según sea apropiado para el contexto y/o la aplicación. Las varias permutaciones de singular/plural pueden establecerse expresamente en la presente en aras de la claridad. Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se pretende que cualquier referencia a "o" en la presente abarque "y/o" a menos que se indique lo contrario.
Los expertos en la técnica entenderán que, en general, se pretende que los términos usados en la presente, y especialmente en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, los cuerpos de las reivindicaciones adjuntas), generalmente se entiendan como términos "abiertos" (por ejemplo, debe interpretarse el término "que incluye" como "que incluye pero no se limita a", el término "que tiene" debe interpretarse como "que tiene por lo menos", el término "incluye" se debe interpretar como "incluye pero no se limita a", etc.). Los expertos en la técnica comprenderán además que si se pretende un número específico de una mención de reivindicación introducida, dicha intención se mencionará explícitamente en la reivindicación y, en ausencia de dicha mención, dicha intención no estará presente. Por ejemplo, como ayuda a la comprensión, las siguientes reivindicaciones adjuntas pueden contener el uso de las frases introductorias "por lo menos uno" y "uno o más" para introducir menciones de reivindicaciones. Sin embargo, no debe interpretarse el uso de tales frases en el sentido de que la introducción de una mención de reivindicación mediante los artículos indefinidos "un o "uno" limita cualquier reivindicación particular que contenga dicha mención de reivindicación introducida a las realizaciones que contengan solo una mención de este tipo, incluso cuando la misma afirmación incluye las frases introductorias "uno o más" o "por lo menos uno" y artículos indefinidos como "un" o "uno" (por ejemplo, "un" y/o "uno" debe interpretarse como "por lo menos uno" o "uno o más"); lo mismo se aplica al uso de artículos definidos usados para introducir menciones de reivindicaciones. Además, incluso si se menciona explícitamente un número específico de una mención de reivindicación introducida, los expertos en la técnica reconocerán que dicha mención debe interpretarse como por lo menos el número mencionado (por ejemplo, la mención simple de "dos menciones", sin otros modificadores, significa por lo menos dos menciones, o dos o más menciones). Además, en aquellos casos en los que se usa una convención análoga a "por lo menos uno de A, B y C, etc.", se pretende en general que tal construcción sea en el sentido en el que un experto en la técnica entendería la convención (por ejemplo, "un sistema que tiene por lo menos uno de A, B y C" incluiría, pero no se limitaría a, sistemas que tienen solo A, solo B, solo C, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). En aquellos casos en los que se usa una convención análoga a "por lo menos uno de A, B o C, etc.", en general, se pretende tal construcción en el sentido en el que la entenderían los expertos en la técnica (por ejemplo, "un sistema que tiene por lo menos uno de A, B o C" incluiría, pero no se limitaría a, sistemas que tienen A solo, B solo, C solo, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). Los expertos en la técnica comprenderán además que debe entenderse que prácticamente cualquier palabra y/o frase disyuntiva que presente dos o más términos alternativos, ya sea en la descripción, las reivindicaciones o los dibujos, contempla las posibilidades de incluir uno de los términos, cualquiera de los términos, o ambos términos. Por ejemplo, se entenderá que la frase "A o B" incluye las posibilidades de "A" o "B" o "A y B".
Además, cuando las características o aspectos de la divulgación se describen en términos de grupos Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la divulgación también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.
Como entenderá un experto en la técnica, para todos y cada uno de los propósitos, como en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos divulgados en la presente también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de los mismos.
Cualquier intervalo enumerado puede reconocerse fácilmente como una descripción suficiente y permitir que el mismo intervalo se divida en mitades, tercios, cuartos, quintos, décimos, etc., por lo menos iguales. Como ejemplo no limitativo, cada intervalo analizado en la presente puede dividirse fácilmente en un tercio inferior, un tercio medio y un tercio superior, etc. Como también entenderá un experto en la técnica, todo lenguaje como "hasta", "por lo menos", "mayor que", "menor que" y similares incluyen el número enumerado y se refieren a intervalos que pueden desglosarse posteriormente en subintervalos como se ha analizado anteriormente. Finalmente, como entenderá un experto en la técnica, un intervalo incluye cada miembro individual. Así, por ejemplo, un grupo que tiene de 1 a 3 artículos se refiere a grupos que tienen 1,2 o 3 artículos. De manera similar, un grupo que tiene de 1 a 5 artículos se refiere a grupos que tienen 1,2, 3, 4 o 5 artículos, y demás.
Aunque en la presente se han divulgado varios aspectos y realizaciones, otros aspectos y realizaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los varios aspectos y realizaciones divulgados en la presente tienen propósitos de ilustración y no se pretende que sean limitativos, el verdadero alcance estando indicado por las reivindicaciones siguientes.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método de codificación con códigos de barras de polinucleótidos objetivo en una pluralidad de particiones con un conjunto de códigos de barras combinatorios, en donde dicho método comprende:
introducir una serie de códigos de barras de componentes en cada una de la pluralidad de particiones, en donde los códigos de barras de componentes se seleccionan de un conjunto de códigos de barras de componentes, en donde por lo menos uno de dos o más códigos de barras de componentes se inmoviliza en un soporte sólido, en donde el código de barras de componentes inmovilizado en el soporte sólido comprende un marcador celular, en donde el marcador celular es idéntico para todos los códigos de barras de componentes inmovilizados en un soporte sólido dado, pero es diferente para diferentes soportes sólidos, en donde una partición de la pluralidad de particiones comprende una única célula y un único soporte sólido, en donde la partición es una gotita o un micropocillo;
conectar dos o más códigos de barras de componentes en cada una de la pluralidad de particiones entre sí para formar un código de barras combinatorio en presencia de un polinucleótido objetivo de una muestra extendiendo y/o amplificando los dos o más códigos de barras de componentes y el polinucleótido objetivo para generar una transcripción y/o amplicón que comprende las secuencias de los dos o más códigos de barras de componentes, en donde los dos o más códigos de barras de componentes comprenden cada uno una secuencia de subunidades de códigos de barras,
y en donde el código de barras combinatorio comprende un primer código de barras de componentes que comprende un marcador celular, seleccionado de un primer conjunto de secuencias de subunidades de códigos de barras, y un segundo código de barras de componentes que comprende un marcador molecular único, seleccionado de un segundo conjunto de secuencias de subunidades de códigos de barras.
2. Un método de secuenciación de células individuales en una pluralidad de particiones usando un conjunto de códigos de barras combinatorios, en donde dicho método comprende:
introducir una pluralidad de células individuales en una pluralidad de particiones,
lisar las células individuales para liberar el contenido de ácido nucleico de las células, asociar el contenido de ácido nucleico de cada célula con un reactivo de códigos de barras combinatorios que comprende una serie de códigos de barras de componentes y extender y/o amplificar el contenido de ácido nucleico de las células y el reactivo de códigos de barras combinatorios para generar una transcripción y/o amplicón que comprende un código de barras combinatorio único que comprende dos o más códigos de barras de componentes, de tal manera que para cualquier polinucleótido codificado con código de barras, puede averiguarse la partición, en donde por lo menos uno de los dos o más códigos de barras de componentes está inmovilizado en un soporte sólido, en donde cada uno de los códigos de barras de componentes inmovilizados en el soporte sólido comprende un marcador celular, en donde el marcador celular es idéntico para todos los códigos de barras de componentes inmovilizados en un soporte sólido dado, pero es diferente para diferentes soportes sólidos, en donde una partición de la pluralidad de particiones comprende una sola célula y un solo soporte sólido, en donde la partición es una gotita o un micropocillo,
en donde el código de barras combinatorio comprende dos o más secuencias de subunidades de códigos de barras de los dos o más códigos de barras de componentes, y
en donde el código de barras combinatorio comprende un primer código de barras de componentes que comprende un marcador celular, seleccionado de un primer conjunto de secuencias de subunidades de códigos de barras, y un segundo código de barras de componentes que comprende un marcador molecular único, seleccionado de un segundo conjunto de secuencias de subunidades de códigos de barras.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el polinucleótido objetivo o los contenidos de ácido nucleico comprenden ADN y/o ARN; opcionalmente, en donde el ADN puede comprender ADN genómico y/o el ARN puede comprender ARN mensajeros (ARNm), microARN, ARN interferente pequeño (ARNip), productos de degradación de ARN, ARN que comprenden cada uno una cola de poli(A), o cualquier combinación de los mismos.
4. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en donde el código de barras combinatorio en cada partición es único, de tal manera que para cualquier polinucleótido codificado con código de barras dado, puede determinarse la partición.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las dos o más secuencias de subunidades de códigos de barras están conectadas entre sí a través de una secuencia conectora y/o una secuencia de nucleótidos objetivo;
6. El método de la reivindicación 5, en donde las dos o más secuencias de subunidades de códigos de barras forman el código de barras combinatorio al conectarse entre sí a través de la hibridación de una o más secuencias conectoras seguido de extensión.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el código de barras combinatorio tiene m secuencias de subunidades de códigos de barras, opcionalmente en donde el código de barras combinatorio tiene m-1 o m-2 secuencias conectoras y en donde m es un número entero > 2.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el código de barras combinatorio comprende:
(a) un oligonucleótido que comprende la fórmula: secuencia de subunidad de código de barrasa-conectonsecuencia de subunidad de código de barrasb-conector2-...secuencia de subunidad de código de barrascconectorm-1-secuencia de subunidad de código de barrasd; o
(b) un primer oligonucleótido que comprende la fórmula secuencia de subunidad de código de barrasa-conectonsecuencia de subunidad de código de barrasb-conector2-...-secuencia de subunidad de código de barrasc; y un segundo oligonucleótido que comprende la secuencia de subunidad de código de barrasd-...-conector3-secuencia de subunidad de código de barrase-conectorm-2 -secuencia de subunidad de código de barrasf, opcionalmente en donde el primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido pueden estar conectados entre sí por una secuencia de nucleótidos objetivo.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde por lo menos uno de los dos o más códigos de barras de componentes comprende una región específica del objetivo; opcionalmente en donde la región específica del objetivo comprende un oligo-dT, una secuencia específica de gen o una secuencia multimérica aleatoria.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el conjunto de códigos de barras combinatorios comprende por lo menos 1000, por lo menos 10.000, por lo menos 100.000, por lo menos 200.000, por lo menos 300.000, por lo menos 400.000, por lo menos 500.000, por lo menos 1.000.000, por lo menos 10.000.000, por lo menos 100.000.000, por lo menos 1.000.000.000 o más códigos de barras combinatorios únicos.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además hibridar uno de los dos o más códigos de barras de componentes en cada partición con el polinucleótido objetivo en la partición, opcionalmente en donde el código de barras de componente que se hibrida con el polinucleótido objetivo se usa como un cebador para una reacción de extensión para producir un producto de extensión que comprende el objetivo y el código de barras combinatorio,
opcionalmente que comprende además amplificar y secuenciar el producto de extensión.
12. El método de la reivindicación 11, en donde el método comprende además agrupar los contenidos de la pluralidad de particiones después de la extensión y/o amplificación, opcionalmente en donde se secuencian los contenidos agrupados.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el soporte sólido es una perla.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la pluralidad de particiones es una pluralidad de micropocillos en una matriz de micropocillos.
ES20207621T 2015-03-30 2016-03-29 Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios Active ES2934982T3 (es)

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Application Number Title Priority Date Filing Date
ES20207621T Active ES2934982T3 (es) 2015-03-30 2016-03-29 Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11535882B2 (es)
EP (3) EP3277843A2 (es)
JP (2) JP2018509915A (es)
CN (1) CN107406888A (es)
ES (1) ES2934982T3 (es)
WO (1) WO2016160844A2 (es)

Families Citing this family (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US8825412B2 (en) 2010-05-18 2014-09-02 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
EP2473638B1 (en) 2009-09-30 2017-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
EP2656263B1 (en) 2010-12-22 2019-11-06 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
JP6153874B2 (ja) 2011-02-09 2017-06-28 ナテラ， インコーポレイテッド 非侵襲的出生前倍数性呼び出しのための方法
EP2766498B1 (en) 2011-10-14 2019-06-19 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
EP4108782B1 (en) 2011-12-22 2023-06-07 President and Fellows of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
SG11201405274WA (en) 2012-02-27 2014-10-30 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting
US9914967B2 (en) 2012-06-05 2018-03-13 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
WO2014210223A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
SG10201806890VA (en) 2013-08-28 2018-09-27 Cellular Res Inc Massively parallel single cell analysis
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
RU2717641C2 (ru) 2014-04-21 2020-03-24 Натера, Инк. Обнаружение мутаций и плоидности в хромосомных сегментах
ES2824700T3 (es) 2015-02-19 2021-05-13 Becton Dickinson Co Análisis unicelular de alto rendimiento que combina información proteómica y genómica
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
EP3277843A2 (en) 2015-03-30 2018-02-07 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
CN107532207B (zh) 2015-04-10 2021-05-07 空间转录公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析
CN107580632B (zh) 2015-04-23 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
WO2017044574A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
JP6882282B2 (ja) 2015-11-03 2021-06-02 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 三次元核酸含有マトリックスの立体撮像のための方法と装置
KR20180097536A (ko) * 2015-11-04 2018-08-31 아트레카, 인크. 단일 세포와 연관된 핵산의 분석을 위한 핵산 바코드의 조합 세트
CN108603191A (zh) * 2015-11-04 2018-09-28 塞勒密斯株式会社 分子克隆提取和验证方法
US10633648B2 (en) 2016-02-12 2020-04-28 University Of Washington Combinatorial photo-controlled spatial sequencing and labeling
CA3022290A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
US10822643B2 (en) 2016-05-02 2020-11-03 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
US10354747B1 (en) * 2016-05-06 2019-07-16 Verily Life Sciences Llc Deep learning analysis pipeline for next generation sequencing
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
CN109074430B (zh) 2016-05-26 2022-03-29 贝克顿迪金森公司 分子标记计数调整方法
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
EP4050112A1 (en) 2016-06-21 2022-08-31 10X Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing
CN109923216A (zh) 2016-08-31 2019-06-21 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
CN109983125A (zh) 2016-08-31 2019-07-05 哈佛学院董事及会员团体 生成用于通过荧光原位测序检测的核酸序列文库的方法
WO2018058073A2 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
EP3539035B1 (en) 2016-11-08 2024-04-17 Becton, Dickinson and Company Methods for expression profile classification
KR20190077061A (ko) 2016-11-08 2019-07-02 셀룰러 리서치, 인크. 세포 표지 분류 방법
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
US10324041B2 (en) * 2016-12-21 2019-06-18 Abbott Japan Co., Ltd. Optical imaging system using lateral illumination for digital assays
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
JP7104048B2 (ja) 2017-01-13 2022-07-20 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 流体チャネルの親水性コーティング
CN110291207A (zh) * 2017-01-27 2019-09-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用于长程测序的条形码化dna
CN110382708A (zh) 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
CA3049139A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
EP4218738A1 (en) * 2017-02-24 2023-08-02 The Regents of The University of California Particle-drop structures and methods for making and using the same
WO2018217625A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Molecular barcoding
CA3062334A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Myriad Women's Health, Inc. Preparation of concatenated polynucleotides
CA3059559A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
CN107354209B (zh) * 2017-07-14 2021-01-08 广州精科医学检验所有限公司 组合标签、接头及确定含有低频突变核酸序列的方法
CN107604046B (zh) * 2017-11-03 2021-08-24 上海交通大学 用于微量dna超低频突变检测的双分子自校验文库制备及杂交捕获的二代测序方法
EP3728636A1 (en) * 2017-12-19 2020-10-28 Becton, Dickinson and Company Particles associated with oligonucleotides
CN108165610A (zh) * 2017-12-22 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种单细胞全基因组扩增试剂盒
CN111712579A (zh) * 2017-12-22 2020-09-25 10X基因组学有限公司 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法
WO2019204702A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Error-correcting dna barcodes
JP7358388B2 (ja) 2018-05-03 2023-10-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 反対側の転写物末端における分子バーコーディング
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
EP3836967A4 (en) 2018-07-30 2022-06-15 ReadCoor, LLC METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PROCESSING OR ANALYSIS
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020047010A2 (en) * 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Increasing spatial array resolution
WO2020046833A1 (en) * 2018-08-28 2020-03-05 Cellular Research, Inc. Sample multiplexing using carbohydrate-binding and membrane-permeable reagents
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
CN113490677A (zh) * 2018-11-14 2021-10-08 佛西吉诺米克公司 用于测序的多聚体和用于制备并且分析所述多聚体的方法
WO2020117713A1 (en) * 2018-12-03 2020-06-11 California Institute Of Technology In situ readout of dna barcodes
CN109658981B (zh) * 2018-12-10 2022-10-04 海南大学 一种单细胞测序的数据分类方法
EP3894552A1 (en) 2018-12-13 2021-10-20 Becton, Dickinson and Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
WO2020180670A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Revere Biosensors, Llc Systems and methods for separating decoded arrays
WO2020180659A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 1Cellbio Inc. Nucleic acid labeling methods and composition
WO2020190871A1 (en) * 2019-03-19 2020-09-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Spatially mapped rna sequencing from single cells
CN110172504A (zh) * 2019-04-19 2019-08-27 武汉明了生物科技有限公司 一种外源基因的检测方法与试剂盒
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
CN114729350A (zh) 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) * 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
EP4242325A3 (en) 2020-04-22 2023-10-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
WO2021233996A1 (en) * 2020-05-19 2021-11-25 Alacris Theranostics Gmbh Method and system for fighting pandemic
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
WO2022015925A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 13.8, Inc. Methods, compositions, and systems for mapping locations of single molecules in multi-dimensional space
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US20230357834A1 (en) * 2020-09-26 2023-11-09 The Regents Of The University Of California Hybrid protocols and barcoding schemes for multiple sequencing technologies
EP4226379A1 (en) * 2020-10-06 2023-08-16 Nucleotrace Pty. Ltd. Oligonucleotides representing digital data
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析
CN112382340B (zh) * 2020-11-25 2022-11-15 中国科学院深圳先进技术研究院 用于dna数据存储的编解码方法和编解码装置
CN112530522B (zh) * 2020-12-15 2022-10-28 中国科学院深圳先进技术研究院 序列纠错方法、装置、设备和存储介质
US20220186295A1 (en) * 2020-12-15 2022-06-16 Quantum-Si Incorporated Molecular Barcode Analysis by Single-Molecule Kinetics
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
CN112961902B (zh) * 2021-02-26 2023-02-24 浙江大学 一种对大量样本进行标记的dna条形码标记方法
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
CN113106150B (zh) * 2021-05-12 2022-05-24 浙江大学 一种超高通量单细胞测序方法
WO2023019024A2 (en) * 2021-08-13 2023-02-16 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University A method for single-cell dna sequencing via in situ genomic amplification and combinatorial barcoding
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023064904A1 (en) * 2021-10-14 2023-04-20 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method for profiling of cells from groups of cells

Family Cites Families (520)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4510244A (en) 1980-04-17 1985-04-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Cell labeling with antigen-coupled microspheres
US4725536A (en) 1985-09-19 1988-02-16 Genetics Institute, Inc. Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods
US6150517A (en) 1986-11-24 2000-11-21 Gen-Probe Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
WO1989001050A1 (en) 1987-07-31 1989-02-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5149625A (en) 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
US5656731A (en) 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
WO1990001065A1 (en) 1988-07-26 1990-02-08 Genelabs Incorporated Rna and dna amplification techniques
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5871928A (en) 1989-06-07 1999-02-16 Fodor; Stephen P. A. Methods for nucleic acid analysis
US5925525A (en) 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5200314A (en) 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
JP3164814B2 (ja) 1990-08-27 2001-05-14 科学技術振興事業団 均一化ｃＤＮＡライブラリーの作製法
DE69132843T2 (de) 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
US5981179A (en) 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5981176A (en) 1992-06-17 1999-11-09 City Of Hope Method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
WO1995000530A1 (en) 1993-06-25 1995-01-05 Affymax Technologies N.V. Hybridization and sequencing of nucleic acids
US6087186A (en) 1993-07-16 2000-07-11 Irori Methods and apparatus for synthesizing labeled combinatorial chemistry libraries
US5500356A (en) 1993-08-10 1996-03-19 Life Technologies, Inc. Method of nucleic acid sequence selection
US6309823B1 (en) 1993-10-26 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes for analyzing biotransformation genes and methods of using the same
US5681697A (en) 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
US5714330A (en) 1994-04-04 1998-02-03 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US6495518B1 (en) 1994-06-13 2002-12-17 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
GB2293238A (en) 1994-09-13 1996-03-20 Inceltec Ltd Primers for replication and/or amplification reactions
US5695934A (en) 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US6600996B2 (en) 1994-10-21 2003-07-29 Affymetrix, Inc. Computer-aided techniques for analyzing biological sequences
ATE340866T1 (de) 1994-10-28 2006-10-15 Gen Probe Inc Zusammensetzungen und verfahren für die gleichzeitige detektion und quantifizierung von einer mehrheit spezifischer nuklein säure sequenzen
CN1181720A (zh) 1995-04-25 1998-05-13 伊萝莉公司 可远程编程的存储器材料及其应用
US5648245A (en) 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
US5968740A (en) 1995-07-24 1999-10-19 Affymetrix, Inc. Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid
US5763175A (en) 1995-11-17 1998-06-09 Lynx Therapeutics, Inc. Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6613544B1 (en) 1995-12-22 2003-09-02 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US5830712A (en) 1996-02-06 1998-11-03 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Selective template deletion method
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
WO1997045559A1 (en) 1996-05-29 1997-12-04 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
JPH1021373A (ja) 1996-07-05 1998-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd 画像解析装置
US20020172953A1 (en) 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field
US7169556B2 (en) 1996-07-29 2007-01-30 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6984491B2 (en) 1996-07-29 2006-01-10 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6100029A (en) 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US5935793A (en) 1996-09-27 1999-08-10 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method using tagged primers
US6124092A (en) 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
US6117631A (en) 1996-10-29 2000-09-12 Polyprobe, Inc. Detection of antigens via oligonucleotide antibody conjugates
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
EP0985142A4 (en) 1997-05-23 2006-09-13 Lynx Therapeutics Inc SYSTEM AND APPARATUS FOR THE SEQUENTIAL TREATMENT OF ANALYTES
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US6399334B1 (en) 1997-09-24 2002-06-04 Invitrogen Corporation Normalized nucleic acid libraries and methods of production thereof
AU1603199A (en) 1997-12-03 1999-06-16 Curagen Corporation Methods and devices for measuring differential gene expression
US6265163B1 (en) 1998-01-09 2001-07-24 Lynx Therapeutics, Inc. Solid phase selection of differentially expressed genes
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
WO2000014282A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Lynx Therapeutics, Inc. Method of screening for genetic polymorphism
US6480791B1 (en) 1998-10-28 2002-11-12 Michael P. Strathmann Parallel methods for genomic analysis
US6197554B1 (en) 1998-11-20 2001-03-06 Shi-Lung Lin Method for generating full-length cDNA library from single cells
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US20020019005A1 (en) 1999-02-18 2002-02-14 Arcaris, Inc. Process for identification of genes encoding proteins having cell proliferation-promoting activity
US6629040B1 (en) 1999-03-19 2003-09-30 University Of Washington Isotope distribution encoded tags for protein identification
EP1165839A2 (en) 1999-03-26 2002-01-02 Whitehead Institute For Biomedical Research Universal arrays
US6699661B1 (en) 1999-04-20 2004-03-02 Kankyo Engineering Co., Ltd. Method for determining a concentration of target nucleic acid molecules, nucleic acid probes for the method, and method for analyzing data obtained by the method
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
US6326148B1 (en) 1999-07-12 2001-12-04 The Regents Of The University Of California Detection of copy number changes in colon cancer
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
JP2001078768A (ja) 1999-09-16 2001-03-27 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 遺伝子発現の測定法
SE9903988D0 (sv) 1999-11-03 1999-11-03 Amersham Pharm Biotech Ab Method of analysis
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
US6500620B2 (en) 1999-12-29 2002-12-31 Mergen Ltd. Methods for amplifying and detecting multiple polynucleotides on a solid phase support
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
WO2001053539A1 (en) 2000-01-24 2001-07-26 Phylos, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US20020006617A1 (en) 2000-02-07 2002-01-17 Jian-Bing Fan Nucleic acid detection methods using universal priming
US20050214825A1 (en) 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
GB2364054B (en) 2000-03-24 2002-05-29 Smithkline Beecham Corp Method of amplifying quinolone-resistance-determining-regions and identifying polymorphic variants thereof
AU4263401A (en) 2000-03-29 2001-10-08 Lgc Teddington Ltd Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
DK2206791T3 (en) 2000-04-10 2016-10-24 Taxon Biosciences Inc Methods of study and genetic analysis of populations
US20030207300A1 (en) 2000-04-28 2003-11-06 Matray Tracy J. Multiplex analytical platform using molecular tags
US7630063B2 (en) 2000-08-02 2009-12-08 Honeywell International Inc. Miniaturized cytometer for detecting multiple species in a sample
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
EP1368460B1 (en) 2000-07-07 2007-10-31 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
JP2004525607A (ja) 2000-08-11 2004-08-26 ナノスフェアー　インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子とその使用方法
US6934408B2 (en) 2000-08-25 2005-08-23 Amnis Corporation Method and apparatus for reading reporter labeled beads
JP4915492B2 (ja) 2000-08-25 2012-04-11 独立行政法人理化学研究所 ノーマライズ／サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーの作成方法
ATE344834T1 (de) 2000-08-25 2006-11-15 Riken Methode zur herstellung von genormten und/oder subtrahierten cdna
EP1366192B8 (en) 2000-10-24 2008-10-29 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Direct multiplex characterization of genomic dna
AU2002230593A1 (en) 2000-12-08 2002-06-18 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20020142345A1 (en) 2000-12-22 2002-10-03 Nelsen Anita J. Methods for encoding and decoding complex mixtures in arrayed assays
US20030049616A1 (en) 2001-01-08 2003-03-13 Sydney Brenner Enzymatic synthesis of oligonucleotide tags
WO2002070684A2 (en) 2001-01-11 2002-09-12 Lion Bioscience Ag Gene library for screening methods
WO2002059355A2 (en) 2001-01-25 2002-08-01 Tm Bioscience Corporation Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof
MXPA02012739A (es) 2001-03-09 2004-04-20 Nugen Technologies Inc Metodos y composiciones para amplificacion de secuencias de arn.
JP2005233974A (ja) 2001-03-21 2005-09-02 Olympus Corp 生化学的検査方法
US7027932B2 (en) 2001-03-21 2006-04-11 Olympus Optical Co., Ltd. Biochemical examination method
JP4146239B2 (ja) 2001-03-28 2008-09-10 ナノスフェアー インコーポレイテッド オリゴヌクレオチド修飾粒子をベースとするバイオバーコード
US20030170675A1 (en) 2001-04-11 2003-09-11 The Gov't Of The U.S Of America As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. Methods of manipulating nucleic acids
WO2002083922A2 (en) 2001-04-11 2002-10-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Modified random primers for probe labeling
AUPR480901A0 (en) 2001-05-04 2001-05-31 Genomics Research Partners Pty Ltd Diagnostic method for assessing a condition of a performance animal
CA2344599C (en) 2001-05-07 2011-07-12 Bioneer Corporation Selective polymerase chain reaction of dna of which base sequence is completely unknown
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
WO2002101358A2 (en) 2001-06-11 2002-12-19 Illumina, Inc. Multiplexed detection methods
JP4244534B2 (ja) 2001-06-12 2009-03-25 横河電機株式会社 バイオチップ
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
US6830931B2 (en) 2001-07-12 2004-12-14 Automated Cell, Inc. Method and apparatus for monitoring of proteins and cells
AU2002363062B2 (en) 2001-10-09 2007-03-22 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20030077611A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Sention Methods and systems for dynamic gene expression profiling
CN100360722C (zh) 2001-11-21 2008-01-09 艾普勒拉公司 数字化分析
US20030175749A1 (en) 2001-12-08 2003-09-18 Jong-Yoon Chun Annealing control primer and its uses
AU2003202026A1 (en) 2002-01-16 2003-09-02 Dynal Biotech Asa Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample
AU2003206095A1 (en) 2002-01-29 2003-09-02 Global Genomics Ab Methods and means for amplifying nucleic acid
WO2003069421A2 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Immunivest Corporation Methods and algorithms for cell enumeration in a low-cost cytometer
US20030186251A1 (en) 2002-04-01 2003-10-02 Brookhaven Science Associates, Llc Genome sequence tags
US20050175993A1 (en) 2002-04-12 2005-08-11 Chia-Lin Wei Method for making full-length coding sequence cDNA libraries
US20070178478A1 (en) 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
US6808906B2 (en) 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
GB0212391D0 (en) 2002-05-29 2002-07-10 Axis Shield Asa Assay
US20050019776A1 (en) 2002-06-28 2005-01-27 Callow Matthew James Universal selective genome amplification and universal genotyping system
AU2003256285A1 (en) 2002-06-28 2004-01-19 Igen International, Inc. Improved assay systems and components
US7192700B2 (en) 2002-12-20 2007-03-20 Orchid Cellmark Inc. Methods and compositions for conducting primer extension and polymorphism detection reactions
EP1546723A4 (en) 2002-08-16 2007-03-07 Decision Biomarkers Inc READING FLUORESCENCE CARIES
ATE447040T1 (de) 2002-09-03 2009-11-15 Quanta Biosciences Inc Verbesserte zusammensetzungen und verfahren für die cdna-synthese
US7361821B2 (en) 2002-09-20 2008-04-22 Intel Corporation Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading
JP4201203B2 (ja) 2002-09-30 2008-12-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー チミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別のためのオリゴヌクレオチド
WO2004040001A2 (en) 2002-10-02 2004-05-13 California Institute Of Technology Microfluidic nucleic acid analysis
AU2003291481A1 (en) 2002-11-11 2004-06-03 Affymetrix, Inc. Methods for identifying dna copy number changes
US7822555B2 (en) 2002-11-11 2010-10-26 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
US7704687B2 (en) 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
EP1587940A4 (en) 2002-12-20 2006-06-07 Caliper Life Sciences Inc SINGLE MOLECULAR AMPLIFICATION AND DNA PROOF
DE602004015408D1 (de) 2003-01-23 2008-09-11 Us Genomics Inc Verfahren zur analyse von polymer-populationen
US7575865B2 (en) 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US8206913B1 (en) 2003-03-07 2012-06-26 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process
DK2374900T3 (en) 2003-03-07 2016-10-17 Rubicon Genomics Inc Polynucleotides for amplification and analysis of the total genomic and total transcription libraries generated by a DNA polymerization
WO2006102264A1 (en) 2005-03-18 2006-09-28 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
US7269518B2 (en) 2003-04-30 2007-09-11 Agilent Technologies, Inc. Chemical array reading
US20040259118A1 (en) 2003-06-23 2004-12-23 Macevicz Stephen C. Methods and compositions for nucleic acid sequence analysis
WO2005010145A2 (en) 2003-07-05 2005-02-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
EP1651776A2 (de) 2003-07-24 2006-05-03 Qiagen GmbH Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren
JP2007502116A (ja) 2003-08-13 2007-02-08 アフィメトリックス インコーポレイテッド 核酸サンプルを調製するための方法およびキット
GB0319332D0 (en) 2003-08-16 2003-09-17 Astrazeneca Ab Amplification
US20050048498A1 (en) 2003-08-29 2005-03-03 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for assembling probes
US7341837B2 (en) 2003-09-02 2008-03-11 Lawton Robert L Soluble analyte detection and amplification
US7354706B2 (en) 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
CA2536565A1 (en) * 2003-09-10 2005-05-12 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
US20050064435A1 (en) * 2003-09-24 2005-03-24 Xing Su Programmable molecular barcodes
JP2007512811A (ja) 2003-11-10 2007-05-24 インベスチゲン， インコーポレイテッド 検出のための核酸を調製する方法
CA2552858A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Lingvitae As Improving polynucleotide ligation reactions
WO2005080604A2 (en) 2004-02-12 2005-09-01 Compass Genetics, Llc Genetic analysis by sequence-specific sorting
US20100216153A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US7432055B2 (en) 2004-03-05 2008-10-07 Uchicago Argonne Llc Dual phase multiplex polymerase chain reaction
EP1745155B1 (en) 2004-05-07 2014-10-15 Cepheid Multiplexed detection of biological agents
US20050250147A1 (en) 2004-05-10 2005-11-10 Macevicz Stephen C Digital profiling of polynucleotide populations
US20060002824A1 (en) 2004-06-07 2006-01-05 Irm, Llc Dispensing systems, software, and related methods
US20060035258A1 (en) 2004-08-06 2006-02-16 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
US20060041385A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Bauer Kenneth D Method of quantitating proteins and genes in cells using a combination of immunohistochemistry and in situ hybridization
US7713697B2 (en) 2004-08-27 2010-05-11 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for amplifying DNA
JP4980219B2 (ja) 2004-09-10 2012-07-18 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド インターカレート型擬似ヌクレオチド（ｉｐｎ）を含有するインターカレーティング核酸（ｉｎａ）を含む増幅ブロッカー
US20060073506A1 (en) 2004-09-17 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for identifying biological samples
US7435084B2 (en) 2004-12-14 2008-10-14 Align Technology, Inc. System and methods for casting physical tooth model
EP1842226B2 (en) 2004-11-03 2014-07-02 Iris International, Inc. Homogeneous analyte detection
DE602005020691D1 (de) 2004-12-23 2010-05-27 Ge Healthcare Bio Sciences Rna-amplifikation auf ligationsbasis
US8883487B2 (en) 2004-12-23 2014-11-11 Abbott Point Of Care Inc. Molecular diagnostics system and methods
EP1845160A4 (en) 2005-02-10 2009-07-01 Riken NUCLEOTIDE-amplification
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
EP1856293A2 (en) 2005-03-16 2007-11-21 Compass Genetics, Llc Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms
WO2006110314A2 (en) 2005-03-25 2006-10-19 Ambion, Inc. Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
US7695886B2 (en) 2005-05-19 2010-04-13 Fuji Xerox Co., Ltd. Process for producing resin particle liquid dispersion for electrostatic image developing toner, electrostatic image developing toner and production process thereof
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
US8407013B2 (en) 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
US20070065844A1 (en) 2005-06-08 2007-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Solution-based methods for RNA expression profiling
US7796815B2 (en) 2005-06-10 2010-09-14 The Cleveland Clinic Foundation Image analysis of biological objects
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
US8486621B2 (en) 2005-08-11 2013-07-16 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid-based matrixes
US20070117121A1 (en) 2005-09-16 2007-05-24 Hutchison Stephen K cDNA library preparation
WO2007044974A2 (en) 2005-10-12 2007-04-19 The Research Foundation Of State University Of New York Absolute pcr quantification
WO2007053692A1 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Symyx Technologies, Inc. Liquid dispensing for high-throughput experimentation
US7375211B2 (en) 2005-11-18 2008-05-20 Kou Zhong C Method for detection and quantification of T-cell receptor Vβ repertoire
US20080070303A1 (en) 2005-11-21 2008-03-20 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
US7636465B2 (en) 2005-12-09 2009-12-22 Cytyc Corporation Cross-frame object reconstruction for image-based cytology applications
WO2007087310A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
US8460878B2 (en) 2006-02-21 2013-06-11 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for detecting cells and cellular components in small defined volumes
US20080038727A1 (en) 2006-03-10 2008-02-14 Applera Corporation MicroRNA and Messenger RNA Detection on Arrays
EP2002246A1 (en) 2006-04-04 2008-12-17 Sidec Technologies AB Extended electron tomography
US20080194414A1 (en) 2006-04-24 2008-08-14 Albert Thomas J Enrichment and sequence analysis of genomic regions
WO2007136874A2 (en) 2006-05-18 2007-11-29 President And Fellows Of Harvard College Genomic library construction
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
EP4108780A1 (en) 2006-06-14 2022-12-28 Verinata Health, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
EP2077912B1 (en) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
CA2660286A1 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
US20100159590A1 (en) 2006-10-05 2010-06-24 Nanopoint, Inc. Systems and methods for active microfluidic cell handling
WO2008057163A2 (en) 2006-10-09 2008-05-15 Carnegie Mellon University Preparation of functional gel particles with a dual crosslink network
SK50302009A3 (sk) 2006-10-18 2010-03-08 Osaki Electric Co., Ltd. Elektronický watthodinový elektromer
US20100184152A1 (en) 2006-10-23 2010-07-22 Vladislav Sandler Target-oriented whole genome amplification of nucleic acids
DK2518162T3 (en) 2006-11-15 2018-06-18 Biospherex Llc Multi-tag sequencing and ecogenomic analysis
US8050476B2 (en) 2006-11-22 2011-11-01 General Electric Company Heart rate demodulation of periodic movement in ultrasound data for object identification
EP2677309B9 (en) 2006-12-14 2014-11-19 Life Technologies Corporation Methods for sequencing a nucleic acid using large scale FET arrays, configured to measure a limited pH range
EP2096429A4 (en) 2007-01-16 2009-12-16 Olympus Corp FLUORESCENT SIGNAL ANALYSIS APPARATUS AND FLUORESCENT SIGNAL ANALYSIS METHOD
WO2008109207A2 (en) 2007-01-30 2008-09-12 The Regents Of The University Of California Methods and devices for biomolecular arrays
US20080269068A1 (en) 2007-02-06 2008-10-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplex decoding of sequence tags in barcodes
WO2008096318A2 (en) 2007-02-09 2008-08-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Identification system
US8003312B2 (en) 2007-02-16 2011-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multiplex cellular assays using detectable cell barcodes
SI2472264T1 (sl) 2007-02-27 2016-06-30 SentoClone International AB Karolinska Institute Science Park Multipleksna detekcija tumorskih celic z uporabo plošč vezavnih sredstev na zunajcelične markerje
US9029085B2 (en) 2007-03-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
KR100882711B1 (ko) 2007-03-12 2009-02-06 성균관대학교산학협력단 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도
JP2008256428A (ja) 2007-04-03 2008-10-23 Intec Systems Institute Inc マイクロアレイ画像のブロック位置検出方法
US20080268508A1 (en) 2007-04-30 2008-10-30 Sowlay Mohankumar R Methods and kits for negative selection of desired nucleic acid sequences
US20080274458A1 (en) 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
US20090061513A1 (en) 2007-05-15 2009-03-05 Picovitro Ab Cell sorting and cell cultivation methods
CN101720359A (zh) 2007-06-01 2010-06-02 454生命科学公司 从多重混合物中识别个别样本的系统和方法
EP2395113A1 (en) 2007-06-29 2011-12-14 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
EP2036989B1 (en) 2007-09-12 2012-07-25 Institut Pasteur Polynucleotide suitable for single cell based reporter assay to monitor gene expression patterns with high spatio-temporal resolution
US8114681B2 (en) 2007-10-05 2012-02-14 Affymetrix, Inc. Highly multiplexed particle-based assays
EP2294408A4 (en) 2008-02-21 2011-05-25 Gentel Biosciences Inc SUBSTRATES FOR MULTIPLEX TEST PROCEDURES AND USES THEREFOR
US8687189B2 (en) 2008-03-03 2014-04-01 Ajjer, Llc Analysis of arrays by laser induced breakdown spectroscopy
US8206925B2 (en) 2008-04-14 2012-06-26 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Splice variants of human IL-23 receptor (IL-23R) mRNA and use of a delta 9 isoform in predicting inflammatory bowel diseases
US20090298709A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 Affymetrix, Inc. Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
WO2009148560A2 (en) 2008-05-30 2009-12-10 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2010021936A1 (en) 2008-08-16 2010-02-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital pcr calibration for high throughput sequencing
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
TW201028432A (en) * 2008-09-30 2010-08-01 Abbott Lab Improved antibody libraries
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
WO2010053980A2 (en) 2008-11-04 2010-05-14 The Johns Hopkins University Dna integrity assay (dia) for cancer diagnostics, using confocal fluorescence spectroscopy
WO2010059820A1 (en) 2008-11-21 2010-05-27 Saint Louis University Biosensor for detecting multiple epitopes on a target
US20100159533A1 (en) 2008-11-24 2010-06-24 Helicos Biosciences Corporation Simplified sample preparation for rna analysis
US8492096B2 (en) 2008-12-24 2013-07-23 Boris Pasche TGFBR1 expression modifies risk for colorectal cancer
AU2010206843B2 (en) 2009-01-20 2015-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single cell gene expression for diagnosis, prognosis and identification of drug targets
US20100323348A1 (en) 2009-01-31 2010-12-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and Compositions for Using Error-Detecting and/or Error-Correcting Barcodes in Nucleic Acid Amplification Process
JPWO2010101164A1 (ja) 2009-03-05 2012-09-10 第一三共株式会社 ピリジン誘導体
EP2230312A1 (en) 2009-03-19 2010-09-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same
US20120010091A1 (en) 2009-03-30 2012-01-12 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
AU2010232439C1 (en) 2009-04-02 2017-07-13 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
JPWO2010131645A1 (ja) 2009-05-14 2012-11-01 和光純薬工業株式会社 Ｒｎａに対応する二本鎖ｄｎａの合成方法及び増幅方法
FR2945545B1 (fr) 2009-05-14 2011-08-05 Univ Aix Marseille Ii Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
GB0909923D0 (en) 2009-06-09 2009-07-22 Oxford Gene Tech Ip Ltd Picowell capture devices for analysing single cells or other particles
US20120058902A1 (en) 2009-06-25 2012-03-08 Livingston Robert J Method of measuring adaptive immunity
EP2449104B1 (en) 2009-06-29 2014-06-04 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
US8330957B2 (en) 2009-06-29 2012-12-11 Hager Enviromental and Atmospheric Technologies, LLC Device and method for quantification of gases in plumes by remote sensing
WO2011021102A2 (en) 2009-08-20 2011-02-24 Population Genetics Technologies Ltd Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement
WO2011028818A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Trustees Of Boston University High throughput multichannel reader and uses thereof
BR112012004382A2 (pt) 2009-09-01 2016-03-22 Koninkl Philips Electronics Nv dispositivo para a seleção específica de moléculas-alvo, método para selecionar especificamente moléculas-alvo e uso de um dispositivo
US9625454B2 (en) 2009-09-04 2017-04-18 The Research Foundation For The State University Of New York Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
US9488656B2 (en) 2009-09-30 2016-11-08 Quest Diagnostics Investments Incorporated BCR-ABL truncation mutations
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
EP2366031B1 (en) 2010-01-19 2015-01-21 Verinata Health, Inc Sequencing methods in prenatal diagnoses
US10662474B2 (en) 2010-01-19 2020-05-26 Verinata Health, Inc. Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic DNA by whole genome sequencing
CN102725424B (zh) 2010-01-25 2014-07-09 Rd生物科技公司 靶核酸的自折叠扩增
EP2534267B1 (en) 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5901046B2 (ja) 2010-02-19 2016-04-06 国立大学法人 千葉大学 ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
WO2011106738A2 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Use of tcr clonotypes as biomarkers for disease
US8951940B2 (en) 2010-04-01 2015-02-10 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
PT2556171E (pt) 2010-04-05 2015-12-21 Prognosys Biosciences Inc Ensaios biológicos codificados espacialmente
EP2569453B1 (en) 2010-05-14 2015-12-16 Fluidigm Corporation Nucleic acid isolation methods
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
CN102933721B (zh) 2010-06-09 2015-12-02 凯津公司 用于高通量筛选的组合序列条形码
US20120004132A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Affymetrix, Inc. Detection of Nucleic Acids and Proteins
CN102971638B (zh) 2010-07-07 2015-08-19 株式会社爱德万测试 对半导体器件进行试验的试验装置及试验方法
EP2407242A1 (en) 2010-07-13 2012-01-18 Dublin City University Direct clone analysis and selection technology
US20120040843A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Dublin City University Centrifugal capture system
ES2595433T3 (es) 2010-09-21 2016-12-30 Population Genetics Technologies Ltd. Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular
EP2436766A1 (en) 2010-09-29 2012-04-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Means and methods for improved protein interaction screening
WO2012042374A2 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Anssi Jussi Nikolai Taipale Method of determining number or concentration of molecules
US20120088691A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Gao Chen Highly multiplexed real-time pcr using encoded microbeads
CA2814049C (en) 2010-10-08 2021-07-13 President And Fellows Of Harvard College High-throughput single cell barcoding
US20130225623A1 (en) 2010-10-27 2013-08-29 Mount Sinai School Of Medicine Methods of Treating Psychiatric or Neurological Disorders with MGLUR Antagonists
EP2646795B1 (en) 2010-11-29 2019-02-20 Dako Denmark A/S Methods for analyzing images of specimens processed by a programmable quantitative assay
US9394511B2 (en) 2010-12-05 2016-07-19 Wenbin Jiang Rapid single cell based parallel biological cell sorter
CA2858608C (en) 2010-12-09 2020-03-10 Akonni Biosystems Sample analysis system
EP2652155B1 (en) 2010-12-16 2016-11-16 Gigagen, Inc. Methods for massively parallel analysis of nucleic acids in single cells
EP2656263B1 (en) 2010-12-22 2019-11-06 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
WO2012092515A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing
ES2632768T3 (es) 2011-01-17 2017-09-15 Life Technologies Corporation Flujo de trabajo para la detección de ligandos empleando ácidos nucleicos
WO2012103154A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 Nugen Technologies, Inc. Stem-loop composite rna-dna adaptor-primers: compositions and methods for library generation, amplification and other downstream manipulations
US20120190020A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
WO2016100976A2 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Apprise Bio, Inc. Methods for identifying multiple epitopes in selected sub-populations of cells
US9365897B2 (en) 2011-02-08 2016-06-14 Illumina, Inc. Selective enrichment of nucleic acids
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
JP6068365B2 (ja) 2011-02-23 2017-01-25 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム Ｄｎａ合成のためのテンプレートスイッチの使用
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
KR20120110431A (ko) 2011-03-29 2012-10-10 에스케이하이닉스 주식회사 반도체 메모리 장치
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
ES2625288T3 (es) 2011-04-15 2017-07-19 The Johns Hopkins University Sistema de secuenciación segura
EP2702175B1 (en) 2011-04-25 2018-08-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
SI2702146T1 (sl) 2011-04-28 2019-06-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identifikacija polinukleotidov, povezanih z vzorcem
GB201108259D0 (en) 2011-05-17 2011-06-29 Cambridge Entpr Ltd Gel beads in microfluidic droplets
WO2012162267A2 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Fluidigm Corporation Nucleic acid encoding reactions
SG193553A1 (en) 2011-05-24 2013-10-30 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
WO2012162621A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Brandeis University Methods for suppression pcr
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
WO2012177639A2 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
WO2013003498A2 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Life Technologies Corporation Acoustic cytometry methods and protocols
US9340826B2 (en) 2011-08-01 2016-05-17 Celemics, Inc. Method of preparing nucleic acid molecules
WO2013022961A1 (en) * 2011-08-08 2013-02-14 3The Broad Institute Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence
JP5816486B2 (ja) 2011-08-18 2015-11-18 オリンパス株式会社 蛍光観察装置および蛍光観察システム並びに蛍光観察装置の蛍光画像処理方法
KR102087062B1 (ko) 2011-09-16 2020-03-11 렉소겐 게엠베하 핵산 전사 방법
US9297047B2 (en) 2011-10-24 2016-03-29 Jennifer Furchak Molecular beacon based assay for the detection of biomarkers for breast cancer metastasis
US9777338B2 (en) 2011-11-11 2017-10-03 Meso Scale Technologies, Llc. Co-binder assisted assay methods
KR101337094B1 (ko) 2011-11-30 2013-12-05 삼성에스디에스 주식회사 염기 서열 정렬 장치 및 그 방법
US20150329855A1 (en) 2011-12-22 2015-11-19 Ibis Biosciences, Inc. Amplification primers and methods
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
WO2013120089A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Raindance Technologies, Inc. Molecular diagnostic screening assay
US10202628B2 (en) 2012-02-17 2019-02-12 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
EP2817418B1 (en) * 2012-02-24 2017-10-11 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
ES2776673T3 (es) 2012-02-27 2020-07-31 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y usos para etiquetas moleculares
SG11201405274WA (en) 2012-02-27 2014-10-30 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting
WO2013137737A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Flexgen B.V. Methods of creating and screening of dna encoded combinatorial libraries of chemical antibodies
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
ES2582554T3 (es) 2012-05-08 2016-09-13 Adaptive Biotechnologies Corporation Composiciones y método para medir y calibrar el sesgo de la amplificación en reacciones de PCR multiplexadas
CA2873585C (en) 2012-05-14 2021-11-09 Cb Biotechnologies, Inc. Method for increasing accuracy in quantitative detection of polynucleotides
SG11201407901PA (en) 2012-05-21 2015-01-29 Fluidigm Corp Single-particle analysis of particle populations
CN104508492B (zh) 2012-05-25 2018-07-27 北卡罗来纳-查佩尔山大学 微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法
EP2861761A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
JP6558830B2 (ja) 2012-06-15 2019-08-14 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 複数転写産物のハイスループットシークエンシング
US9957549B2 (en) 2012-06-18 2018-05-01 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
ES2637538T3 (es) 2012-07-17 2017-10-13 Counsyl, Inc. Sistema y métodos para la detección de una variación genética
US9695416B2 (en) 2012-07-18 2017-07-04 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Method of normalizing biological samples
JP2015523087A (ja) 2012-07-24 2015-08-13 シーケンタ インコーポレイテッド 配列タグを用いる単一細胞分析
WO2014018093A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 Illumina, Inc. Compositions and methods for the amplification of nucleic acids
WO2014026032A2 (en) 2012-08-08 2014-02-13 Apprise Bio, Inc. Increasing dynamic range for identifying multiple epitopes in cells
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
MX364957B (es) 2012-08-14 2019-05-15 10X Genomics Inc Composiciones y metodos para microcapsulas.
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378322A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150005200A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378349A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150376609A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Methods of Analyzing Nucleic Acids from Individual Cells or Cell Populations
US20150005199A1 (en) * 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN108267581A (zh) 2012-08-24 2018-07-10 耶鲁大学 用于高通量多重检测的系统、装置和方法
CA2886974C (en) 2012-10-17 2021-06-29 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
GB201218909D0 (en) 2012-10-22 2012-12-05 Univ Singapore Assay for the parallel detection of biological material based on PCR
CA2889862C (en) 2012-11-05 2021-02-16 Rubicon Genomics, Inc. Barcoding nucleic acids
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014108850A2 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. High throughput transcriptome analysis
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
US9562269B2 (en) 2013-01-22 2017-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Haplotying of HLA loci with ultra-deep shotgun sequencing
WO2014116979A1 (en) 2013-01-24 2014-07-31 Sabic Innovative Plastics Ip B.V. Microwell plate made from a polyester-polycarbonate
US10017761B2 (en) 2013-01-28 2018-07-10 Yale University Methods for preparing cDNA from low quantities of cells
ES2931314T3 (es) 2013-02-01 2022-12-28 Becton Dickinson Co Métodos y sistemas para evaluar el comportamiento de una muestra en un citómetro de flujo
CA2900481A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
CN105102696B (zh) 2013-02-08 2017-08-15 生物辐射实验室股份有限公司 用于目标分子检测的基于亲和力的划分试验
WO2014126937A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Suspension arrays and multiplexed assays based thereon
US9621600B2 (en) 2013-02-26 2017-04-11 PortAura Group Method and system for providing recommendations using location information
US20140274811A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Lyle J. Arnold Methods for Amplifying a Complete Genome or Transcriptome
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
GB2525568B (en) 2013-03-15 2020-10-14 Abvitro Llc Single cell barcoding for antibody discovery
CN114107458A (zh) 2013-03-15 2022-03-01 血统生物科学公司 测序免疫组库的方法
US9938523B2 (en) 2013-03-15 2018-04-10 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Nucleic acid-tagged compositions and methods for multiplexed protein-protein interaction profiling
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
US20140303005A1 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Raindance Technologies, Inc. Rare cell analysis after negative selection
JP6633514B2 (ja) 2013-04-25 2020-01-22 ファイアフライ バイオワークス， インコーポレイテッド 標的核酸の多重化分析
US10822605B2 (en) 2013-05-03 2020-11-03 Gensinta, Inc. Method and apparatus for producing sequence verified DNA
EP2805769A1 (en) 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
WO2014201273A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 The Broad Institute, Inc. High-throughput rna-seq
CA2915033C (en) 2013-06-12 2023-08-29 The General Hospital Corporation Methods, kits, and systems for multiplexed detection of target molecules and uses thereof
US20150011398A1 (en) 2013-06-17 2015-01-08 Kim Lewis Methods for quantitative determination of protein-nucleic acid interactions in complex mixtures
WO2014210223A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
KR102436171B1 (ko) * 2013-06-27 2022-08-24 10엑스 제노믹스, 인크. 샘플 처리를 위한 조성물 및 방법
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
US20160153973A1 (en) 2013-07-09 2016-06-02 Lucas David Smith Device and method of rapid linker mediated label-based immunoassays
US20150141257A1 (en) * 2013-08-02 2015-05-21 Roche Nimblegen, Inc. Sequence capture method using specialized capture probes (heatseq)
SG10201806890VA (en) 2013-08-28 2018-09-27 Cellular Res Inc Massively parallel single cell analysis
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
CN105683397A (zh) 2013-09-04 2016-06-15 富鲁达公司 用于检测单细胞中的核酸和蛋白的邻近测定
ES2875998T3 (es) 2013-09-30 2021-11-11 Vesicode Ab Procedimientos de perfilado de complejos moleculares mediante el uso de códigos de barras dependientes de la proximidad
GB201317301D0 (en) 2013-09-30 2013-11-13 Linnarsson Sten Method for capturing and encoding nucleic acid from a plurality of single cells
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
DK3572527T3 (da) 2013-10-17 2021-08-23 Illumina Inc Fremgangsmåder og præparater til fremstilling af nukleinsyrebiblioteker
US9709479B2 (en) 2013-10-25 2017-07-18 Massachusetts Institute Of Technology Method and apparatus for tracking cell identity
WO2015061844A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 The University Of Sydney Assay to stratify cancer patients
US10288608B2 (en) 2013-11-08 2019-05-14 Prognosys Biosciences, Inc. Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection
ES2912183T3 (es) 2013-12-30 2022-05-24 Atreca Inc Análisis de ácidos nucleicos asociados a células individuales utilizando códigos de barras de ácidos nucleicos
CA2938080A1 (en) 2014-01-27 2015-07-30 The General Hospital Corporation Methods of preparing nucleic acids for sequencing
EP3102678A2 (en) 2014-02-03 2016-12-14 Integrated DNA Technologies Inc. Methods to capture and/or remove highly abundant rnas from a heterogeneous rna sample
CA2941612A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
ES2777529T3 (es) 2014-04-17 2020-08-05 Adaptive Biotechnologies Corp Cuantificación de genomas de células inmunitarias adaptativas en una mezcla compleja de células
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
US10975371B2 (en) 2014-04-29 2021-04-13 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
CA3060708A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Illumina, Inc Multiplexed single cell gene expression analysis using template switch and tagmentation
EP3146080B1 (en) 2014-05-19 2021-01-06 William Marsh Rice University Allele-specific amplification using a composition of overlapping non-allele-specific primer and allele-specific blocker oligonucleotides
CN114214314A (zh) 2014-06-24 2022-03-22 生物辐射实验室股份有限公司 数字式pcr条码化
US20150376700A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
EP3626834B1 (en) 2014-07-15 2022-09-21 Qiagen Sciences, LLC Semi-random barcodes for nucleic acid analysis
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
AU2015318011B2 (en) 2014-09-15 2020-07-23 Abvitro Llc High-throughput nucleotide library sequencing
US9529672B2 (en) 2014-09-25 2016-12-27 Everspin Technologies Inc. ECC word configuration for system-level ECC compatibility
IL299976A (en) 2014-10-17 2023-03-01 Illumina Cambridge Ltd Continuity-preserving transposition
CN104404160B (zh) * 2014-12-09 2018-10-09 南京大学 一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法
CN107407691B (zh) 2015-01-22 2021-07-27 贝克顿迪金森公司 用于单细胞中核酸靶标的分子条码化的装置和系统
EP3763825B1 (en) 2015-01-23 2023-10-04 Qiagen Sciences, LLC High multiplex pcr with molecular barcoding
US10854315B2 (en) 2015-02-09 2020-12-01 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data
ES2824700T3 (es) 2015-02-19 2021-05-13 Becton Dickinson Co Análisis unicelular de alto rendimiento que combina información proteómica y genómica
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
EP3262189B1 (en) 2015-02-27 2021-12-08 Becton, Dickinson and Company Methods for barcoding nucleic acids for sequencing
US11873483B2 (en) 2015-03-11 2024-01-16 The Broad Institute, Inc. Proteomic analysis with nucleic acid identifiers
US20160266094A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 University Of Iowa Research Foundation Cellular barcode
US20180073073A1 (en) 2015-03-18 2018-03-15 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for labeling targets and haplotype phasing
US10301660B2 (en) 2015-03-30 2019-05-28 Takara Bio Usa, Inc. Methods and compositions for repair of DNA ends by multiple enzymatic activities
EP3277843A2 (en) 2015-03-30 2018-02-07 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
US20180057873A1 (en) 2015-04-17 2018-03-01 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for performing spatial profiling of biological materials
CN107580632B (zh) 2015-04-23 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
US9618871B2 (en) 2015-04-28 2017-04-11 Kyocera Document Solutions Inc. Image forming apparatus
US10988802B2 (en) 2015-05-22 2021-04-27 Sigma-Aldrich Co. Llc Methods for next generation genome walking and related compositions and kits
WO2016190795A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Kaarel Krjutskov Blocking oligonucleotides
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
JP6886962B2 (ja) 2015-08-24 2021-06-16 キアゲン ゲーエムベーハー Ｒｎａシークエンシングライブラリーを生成する方法
CN115928221A (zh) 2015-08-28 2023-04-07 Illumina公司 单细胞核酸序列分析
WO2017044574A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
US11156611B2 (en) 2015-09-24 2021-10-26 Abvitro Llc Single cell characterization using affinity-oligonucleotide conjugates and vessel barcoded polynucleotides
WO2017075265A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
KR20180097536A (ko) 2015-11-04 2018-08-31 아트레카, 인크. 단일 세포와 연관된 핵산의 분석을 위한 핵산 바코드의 조합 세트
JP2019500856A (ja) 2015-11-18 2019-01-17 タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド マルチウェルデバイスから試料をプールするための装置及び方法
US20190040381A1 (en) 2015-12-04 2019-02-07 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Cloning and expression system for t-cell receptors
EP3263715B1 (en) 2016-06-28 2020-01-08 Hifibio Method for transcriptome analysis of single cells
US11965891B2 (en) 2015-12-30 2024-04-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital protein quantification
US20170205404A1 (en) 2016-01-19 2017-07-20 General Electric Company Multifunctional beads and methods of use for capturing rare cells
US20170260584A1 (en) 2016-02-11 2017-09-14 10X Genomics, Inc. Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes
WO2017164936A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 The Broad Institute, Inc. Methods for determining spatial and temporal gene expression dynamics in single cells
CN109312331B (zh) 2016-04-01 2022-08-02 贝勒医学院 全转录组扩增的方法
US10822643B2 (en) 2016-05-02 2020-11-03 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
US20190161743A1 (en) 2016-05-09 2019-05-30 President And Fellows Of Harvard College Self-Targeting Guide RNAs in CRISPR System
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
CN109074430B (zh) 2016-05-26 2022-03-29 贝克顿迪金森公司 分子标记计数调整方法
TWI600309B (zh) 2016-05-28 2017-09-21 Hon Hai Prec Ind Co Ltd 角度調整機構
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10809266B2 (en) 2016-07-22 2020-10-20 Verily Life Sciences Llc Quantitative massively parallel proteomics
WO2018020489A1 (en) 2016-07-24 2018-02-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods and kits for analyzing dna binding moieties attached to dna
US20180037942A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Cellular Research, Inc. Enzyme-independent molecular indexing
WO2018031631A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Methods of de novo assembly of barcoded genomic dna fragments
WO2018058073A2 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
CN109804079A (zh) 2016-09-29 2019-05-24 富士胶片株式会社 供多重pcr的引物的设计方法
CN109790537A (zh) 2016-09-29 2019-05-21 富士胶片株式会社 供多重pcr的引物的设计方法
CN110114520B (zh) 2016-10-01 2023-08-08 伯克利之光生命科技公司 Dna条形码组合物和在微流体装置中原位识别的方法
EP4026905B1 (en) 2016-10-19 2024-04-17 10X Genomics, Inc. Methods for barcoding nucleic acid molecules from individual cells or cell populations
CN108473975A (zh) 2016-11-17 2018-08-31 领星生物科技（上海）有限公司 检测肿瘤发展的系统和方法
WO2018111872A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Grail, Inc. Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries
CN110325650A (zh) 2016-12-22 2019-10-11 夸登特健康公司 用于分析核酸分子的方法和系统
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20190177800A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
US20210087610A9 (en) 2017-01-12 2021-03-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods for analyzing t cell receptors and b cell receptors
US20180208975A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Assay for simultaneous genomic and proteomic analysis
EP4029939B1 (en) 2017-01-30 2023-06-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
CN110382708A (zh) 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
EP4324931A2 (en) 2017-02-02 2024-02-21 New York Genome Center, Inc. Methods and compositions for identifying or quantifying targets in a biological sample
KR20190133711A (ko) 2017-03-24 2019-12-03 싱가포르국립대학교 분자의 다중 검출 방법
EP3601606A2 (en) 2017-03-24 2020-02-05 Cellular Research, Inc. Synthetic multiplets for multiplets determination
US20200370105A1 (en) 2017-05-23 2020-11-26 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for performing spatial profiling of biological molecules
MA49352A (fr) 2017-05-26 2020-04-08 Abvitro Llc Séquençage de bibliothèque de polynucléotides à haut rendement et analyse de transcriptome
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
JP2020521486A (ja) 2017-05-29 2020-07-27 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シングルセルトランスクリプトームの増幅法
CA3059559A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US20200217850A1 (en) 2017-09-15 2020-07-09 Apton Biosystems, Inc. Heterogeneous single cell profiling using molecular barcoding
CN111247589A (zh) 2017-09-25 2020-06-05 贝克顿迪金森公司 免疫受体条形码错误校正
WO2019076768A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Tervisetehnoloogiate Arenduskeskus As METHOD AND KIT FOR PREPARING DNA BANK
WO2019084046A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 The Broad Institute, Inc. ENRICHING SINGLE CELL CELLULAR CONSTITUENT OF BARCODE SEQUENCING LIBRARY
US20200354767A1 (en) 2017-11-16 2020-11-12 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods to measure functional heterogeneity among single cells
WO2019113506A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
WO2019113499A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. High-throughput methods for identifying gene interactions and networks
EP3720605A1 (en) 2017-12-07 2020-10-14 Massachusetts Institute Of Technology Single cell analyses
SG11201907566TA (en) 2017-12-08 2019-09-27 10X Genomics Inc Methods and compositions for labeling cells
WO2019118355A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for single cell processing
CN111712579A (zh) 2017-12-22 2020-09-25 10X基因组学有限公司 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法
AU2018399524B2 (en) 2018-01-05 2022-05-26 Billiontoone, Inc. Quality control templates for ensuring validity of sequencing-based assays
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
WO2019178164A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Silicon Valley Scientific, Inc. Method and apparatus for processing tissue and other samples encoding cellular spatial position information
WO2019210049A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 X Gen Us Co. Methods and compositions for preparing polynucleotides
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
JP7358388B2 (ja) 2018-05-03 2023-10-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 反対側の転写物末端における分子バーコーディング
CN110499251A (zh) 2018-05-17 2019-11-26 中国科学院大连化学物理研究所 高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用
JP7413351B2 (ja) 2018-08-03 2024-01-15 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 単一細胞における核バーコード化および捕捉
EP3833976A4 (en) 2018-08-08 2022-04-27 Vanderbilt University SYSTEMS AND METHODS FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF ANTIGENS AND ANTIGEN-SPECIFIC ANTIBODIES
EP3837378B1 (en) 2018-08-17 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Aptamer barcoding
WO2020046833A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Cellular Research, Inc. Sample multiplexing using carbohydrate-binding and membrane-permeable reagents
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
EP3894552A1 (en) 2018-12-13 2021-10-20 Becton, Dickinson and Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
CA3123847A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Natera, Inc. Methods for analysis of circulating cells
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
CN113454234A (zh) 2019-02-14 2021-09-28 贝克顿迪金森公司 杂合体靶向和全转录物组扩增
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
WO2021146219A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Cell capture using du-containing oligonucleotides
US20210222244A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for single cell secretomics
EP4097228A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 Becton, Dickinson and Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
CN115427584A (zh) 2020-01-31 2022-12-02 贝克顿迪金森公司 嗜中温dna聚合酶延伸阻断物
CN115087746A (zh) 2020-02-12 2022-09-20 贝克顿迪金森公司 细胞内AbSeq
WO2021173719A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Becton, Dickinson And Company Bi-specific probes to enable the use of single-cell samples as single color compensation control
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
WO2021247593A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay
CN116157534A (zh) 2020-07-13 2023-05-23 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分析的cDNA加标对照
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US20220033810A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
WO2022108946A1 (en) 2020-11-17 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Combined analysis of cell-free nucleic acids and single cells for oncology diagnostics
WO2022109339A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Use of dextramer in single cell analysis
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析

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