CN100360722C - 数字化分析 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测样品中靶物质的方法和组合物。

Description

数字化分析
优先权文件
本申请要求对美国临时申请60/332,519(2001年11月21日提交)和60/384,731(2002年5月31日提交)的优先权益。申请60/332,519和60/384,731在此全文引入以供任何目的之参考。
发明领域
本发明涉及用于检测样品中靶物质的方法和组合物。
背景
经常在包含一种或多种靶序列的样品中检测是否存在一种或多种靶序列。例如，癌症以及多种传染性疾病诸如AIDS和肝炎的检测，通常包括筛选生物样品中是否存在诊断性核酸序列。检测是否存在核酸序列也经常用于法医学、亲子鉴定、遗传咨询和器官移植。
发明概述
在某些实施方案中，提供了定量靶物质的方法。在某些实施方案中，该方法包含形成反应混合物，其中包含：可能包含靶物质的样品；可编码的(codeable)标记；一种或多种靶特异性探针，其中每种靶特异性探针在选择性结合条件下特异性结合靶物质；以及分离成分。在某些实施方案中，该方法另外包含在反应条件下处理反应混合物，以便在存在靶物质时产生可检测的复合物，缺少靶物质时则不产生，其中该可检测复合物包含可编码标记、靶特异性探针和分离成分。在某些实施方案中，该方法另外包含将可检测复合物与不包括于其中的可编码标记分离，并通过计数可编码标记来定量靶物质。
在某些实施方案中，提供了定量至少两种不同的特定靶物质的方法。在某些实施方案中，该方法包含形成反应混合物，其中包含：可能包含两种或多种不同特定靶物质的样品；特异性针对每种不同特定靶物质的不同的可编码的标记；一种或多种特异性针对每种不同特定靶物质的不同靶特异性探针，其可在选择性结合条件下特异性结合靶物质；以及分离成分。在某些实施方案中，该方法另外包含在反应条件下处理反应混合物，以便在存在特定靶物质时产生可检测的复合物，其中包含特定靶物质特异性的可编码标记、特定靶物质特异性的靶特异性探针和分离成分；并且在缺少特定靶物质时，不产生可检测的复合物。在某些实施方案中，该方法另外包含将产生的任何可检测复合物与不包括在其中的可编码标记分离，并通过计数每种不同特定靶物质的特异性可编码标记来定量每种不同特定靶物质。
在某些实施方案中，提供了定量样品中至少两种不同靶核酸序列的方法。在某些实施方案中，该方法包含将样品与特异性针对至少两种不同靶核酸序列中每一种的不同探针组合相混合，形成连接反应混合物。在某些实施方案中，每种探针组合包含(a)至少一种包含磁性颗粒及第一种靶特异性探针的分离小珠，以及(b)至少一种包含可编码标记及第二种靶特异性探针的检测小珠；其中在互补靶序列上彼此相邻杂交时，每一组合中的靶特异性探针适合于连在一起。在某些实施方案中，该方法另外包含将连接反应混合物进行连接反应，其中相邻杂交的互补靶特异性探针彼此连接，形成包含分离小珠及检测小珠的连接产物。在某些实施方案中，该方法另外包含将任何连接产物与未连接的检测及分离小珠分离。在某些实施方案中，该方法另外包含通过计数可编码标记，定量至少两种不同靶核酸序列中的每一种。
在某些实施方案中，提供了检测样品中靶核酸序列的试剂盒。在某些实施方案中，该试剂盒包含每种靶核酸序列特异性的不同小珠组合。在某些实施方案中，每种不同小珠组合包含(a)至少一种分离小珠，其包含磁性颗粒、包含两种或多种标记的第一种可编码标记以及第一种靶特异性探针，其中第一种可编码标记特异性针对第一种靶特异性探针，以及(b)至少一种检测小珠，其包含含有一组两种或多种标记的第二种可编码标记以及第二种靶特异性探针，其中第二种可编码标记特异性针对第二种靶特异性探针；并且其中第一种可编码标记在检测上不同于第二种可编码标记。在某些实施方案中，在互补靶序列上彼此相邻杂交时，每一组合中的靶特异性探针适合于连在一起。
附图简述
图1显示本发明某些实施方案的探针组合。
图2显示使用本发明某些实施方案区分靶位点处两种可能的等位基因的方法。
图2(A)显示：(i)两种不同探针组合，具有不同的第一种靶特异性探针A和B，其中央(pivotal)互补物不同(A探针为T，B探针为C)，并具有相同的第二种靶特异性探针Z，以及(ii)包含中央核苷酸A的靶序列。
图2(B)显示与靶物质退火的三种靶特异性探针。探针A的序列特异性部分与包含中央核苷酸的3′靶区完全互补。探针B的中央互补物不与3′靶区互补。探针B的序列特异性部分因而在3′端包含一个碱基对的错配。探针Z的序列特异性部分与5′靶区完全互补。
图2(C)显示连接靶特异性探针A和Z，形成连接产物A-Z。由于探针B上错配的中央互补物，探针B和Z未彼此相连形成连接产物。
图2(D)显示使双链分子变性，释放A-Z连接产物以及未连接的探针B和Z。
图3显示某些实施方案使用两种颜色标记的某些可能的二元和三元编码。
图4显示某些实施方案的探针组合使用两种颜色二元编码时的某些标记组合(编码)的组合。图4还描述了使用两种三元色、10种二元色或6种三元色时，某些实施方案可能的探针组合编码的数目。
图5描述了典型的可变剪接(alternative splicing)。
图6描述了检测剪接变体的某些实施方案。
图7说明某些典型的实施方案，其中第一种靶特异性探针和第二种靶特异性探针在与样品中靶分子杂交之后相连。
图8说明某些典型的实施方案，其中将分离成分与可编码标记及可检测复合物分离。
图9说明某些检测从样品中分离的可检测复合物的实施方案。
图10说明某些典型的实施方案，其中将分离成分与可编码标记及可检测复合物分离。
图11说明某些典型的实施方案，其中将连接的可检测复合物与未连接的可编码标记分离。
图12说明某些典型的实施方案，其中在与样品和连接反应相同的容器内检测连接的可检测复合物。
图13说明某些典型的实施方案，其中在检测容器内表面包含凹槽，帮助排列连接的可检测复合物，以供检测。
图14(a)说明本发明某些实施方案的探针组合。
图14(b)说明本发明某些实施方案的两种探针组合、探针组合的连接及其检测。
图14(c)说明本发明某些实施方案的探针组合。
图15描述了包含小珠的连接的可检测复合物以及不包含小珠的连接产物的TaqmanTM分析结果。
图16显示连接反应后获得的可检测复合物的图片。
图17描述了在不同浓度靶分子中产生的连接的可检测复合物的Taqman分析结果。
图18说明某些典型的实施方案，通过连续流动将未配对的非磁性小珠与磁性小珠和可检测复合物分离，然后利用流式细胞术计数可检测复合物。
图19说明某些典型的实施方案，通过连续流动将未配对的非磁性小珠与磁性小珠和可检测复合物分离，利用可检测复合物与未配对磁性小珠的阻尼(drag)差异去除未配对的磁性小珠，然后利用流式细胞术计数可检测复合物。
图20说明某些典型的实施方案，通过连续流动将未配对的非磁性小珠与磁性小珠和可检测复合物分离，通过大小过滤分离未配对的磁性小珠，然后利用流式细胞术计数可检测复合物。
图21说明某些典型的实施方案，其分离方法利用磁性小珠及生物素包被的小珠。
图22说明某些典型的实施方案，其连接反应利用包含可寻址(addressable)部分的探针。
图23说明某些典型的实施方案，其中连接产物利用发夹结构连接于小珠。
图24说明某些典型的实施方案，其中连接产物利用连接寡核苷酸连接于小珠。
图25说明利用生物素分子的寡核苷酸连接(OLA)分析的某些典型的实施方案。
图26说明某些典型的实施方案，其可编码标记连接到与连接产物杂交的寡核苷酸。
图27说明某些典型的实施方案，将可检测复合物与不在其中的可编码标记分离。
图28说明某些典型的实施方案，使用管中管(a tube within a tube)将可检测复合物与不在其中的可编码标记分离。
图29说明某些典型的实施方案，其可编码标记连接到与连接产物杂交并连接的发夹结构。
典型实施方案详述
应当理解，上文概述及下文详述均仅为代表性及说明性，而不限制所申请的发明。在本申请中，除非另外特别注明，使用单数包括复数。在本申请中，除非另外注明，使用″或″是指″和/或″。另外，使用术语″包括″并非限制。同样，使用术语″部分″可能包括组成部分的一部分或全部。
此处使用的分节标题仅为组织目的，而不应认为限制所述主题。本申请引用的所有文件或其部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍以及论文，在此特别全文引入以供任何目的之参考。
定义及术语
此处所用术语″核苷酸碱基″是指一个或多个取代或未被取代的芳香环。在某些实施方案中，一个或多个芳香环包含至少一个氮原子。在某些实施方案中，核苷酸碱基能够与适当互补的核苷酸碱基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氢键。典型核苷酸碱基及其类似物包括但不限于，天然存在的核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶以及天然存在核苷酸碱基的类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、N6-A2-异戊烯腺嘌呤(6iA)、N6-A2-异戊烯-2-甲硫基腺嘌呤(2ms6iA)、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿嘧啶、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙烯胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、06-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、甲基胸腺嘧啶、5，6-二氢胸腺嘧啶、5，6-二氢尿嘧啶、吡唑啉酮[3，4-D]嘧啶(参见例如美国专利6,143,877和6,127,121以及PCT公开申请WO 01/38584)、亚乙烯基腺嘌呤(ethenoadenine)、吲哚例如硝基吲哚和4-甲基吲哚、以及吡咯例如硝基吡咯。例如可以在Fasman，1989，Practical Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology，385-394页，CRC Press，BocaRaton，Fla.，以及此处引用参考文献中找到某些典型的核苷酸碱基。
此处所用术语″核苷酸″是指包含与糖例如核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖及其糖类似物的C-1′碳相连的核苷酸碱基的化合物。术语核苷酸也包括核苷酸类似物。糖可能是取代或未被取代。取代的核糖包括但不限于这样的核糖，其中一个或多个碳原子例如2′-碳原子被一个或多个相同或不同的Cl、F、-R、-OR、-NR2或卤素基团取代，其中每个R分别是H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。典型核糖包括但不限于2′-(C1-C6)烷氧基核糖、2′-(C5-C14)芳氧基核糖、2′，3′-双脱氢核糖、2′-脱氧-3 ′-卤代核糖、2′-脱氧-3′-氟代核糖、2′-脱氧-3′-氯代核糖、2′-脱氧-3′-氨基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷氧基核糖及2′-脱氧-3′-(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-双脱氧核糖、2′-卤代核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖以及2′-烷基核糖例如2′-O-甲基、4′-α-端基异构性核苷酸、1′-α-端基异构性核苷酸、2′-4′-和3′-4′-连接的及其它″锁定的(locked)″或″LNA″、双环糖修饰物(参见例如PCT公开申请WO 98/22489、WO 98/39352和WO99/14226)。多核苷酸中的典型LNA糖类似物包括但不限于以下结构：
Figure C0282597100141
其中B为任何核苷酸碱基。
核糖2′-或3′-位点的修饰包括但不限于氢、羟基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基、叠氮基、氨基、烷基氨基、氟代、氯代和溴代。核苷酸包括但不限于天然D旋光异构体以及L旋光异构体形式(参见例如Garbesi(1993)Nucl.Acids Res.21：4159-65；Fujimori(1990)J.Amer.Chem.Soc.112：7435；Urata，(1993)Nucleic Acids Symposium Ser.No.29：69-70)。核苷酸碱基是嘌呤例如A或G时，核糖连在核苷酸碱基的N9-位。核苷酸碱基是嘧啶例如C、T或U时，戊糖连在核苷酸碱基的N1-位置，假尿嘧啶除外，其戊糖连在尿嘧啶核苷酸碱基的C5位(参见例如Kornberg and Baker，(1992)DNA Replication，2nd Ed.，Freeman，San Francisco，CA)。
核苷酸的一个或多个戊糖碳可由下式磷酸酯取代：
Figure C0282597100142
其中α是0-4的整数。在某些实施方案中，α是2，膦酸酯连在戊糖的3′-或5′-碳上。在某些实施方案中，核苷酸中的核苷酸碱基为嘌呤、7-脱氮嘌呤、嘧啶或其类似物。″核苷酸5′-三磷酸″是指5′位带有三磷酸酯基团的核苷酸，有时为特别指出核糖的结构特征而表示为″NTP″或″dNTP″和″ddNTP″。三磷酸酯基团可能包括硫取代各种氧，例如α-硫-核苷酸5′-三磷酸。核苷酸化学的综述参见Shabarova，Z.和Bogdanov，A.Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids，VCH，New York，1994。
此处所用术语″核苷酸类似物″是指核苷酸的戊糖和/或核苷酸碱基和/或一个或多个磷酸酯由其各自的类似物取代的实施方案。在某些实施方案中，典型的戊糖类似物如上所述。在某些实施方案中，核苷酸类似物具有上述的核苷酸碱基类似物。在某些实施方案中，典型的磷酸酯类似物包括但不限于磷酸烷基酯、磷酸甲基酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、二硫代磷酸酯、phosphoroselenoates，phosphorodiselenoates，phosphoroanilothioates，phosphoroanilidates，phosphoroamidates，boronophosphates等，并可能包括相关的平衡离子。
″核苷酸类似物″的定义还包括可以聚合成多核苷酸类似物的核苷酸类似物单体，其中DNA/RNA磷酸酯和/或糖磷酸酯主链由不同类型的核苷酸间连接所取代。典型多核苷酸类似物包括但不限于肽核酸，其中多核苷酸的糖磷酸主链由肽主链取代。
此处所用术语″多核苷酸″、″寡核苷酸″和″核酸″可交互使用，是指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括通过核苷酸间磷酸二酯键相连的2′-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)、或核苷酸间类似物以及相关的平衡离子例如H+、NH4、三烷基铵、Mg2+、Na+等。核酸可能由全部脱氧核糖核酸、全部核糖核酸或其嵌合混合物组成。核苷酸单体单位可能包含此处所述任何核苷酸，包括但不限于天然存在的核苷酸和核苷酸类似物。核酸一般大小为几个单体单位例如5-40个(在本领域提到寡核苷酸时)，至几千个单体核苷酸单位。除非另有所指，每当给出核酸序列时，应当理解核苷酸从左至右为5′-3′顺序，″A″表示脱氧腺苷或其类似物，″C″表示脱氧胞苷或其类似物，″G″表示脱氧鸟苷或其类似物，″T″表示胸苷或其类似物，除非另外注明。
核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化的核酸、从亚细胞器例如线粒体或叶绿体中获得的核酸以及从可能存在于生物样品中的微生物、或DNA或RNA病毒中获得的核酸。
核酸可能由单一类型的糖成分组成，例如RNA和DNA，或由不同糖成分的混合物组成，例如RNA/DNA嵌合体。在某些实施方案中，核酸是下列结构式所示核糖多核苷酸及2′-脱氧核糖多核苷酸。
其中每个B独立地是核苷酸的碱基部分，例如嘌呤、7-脱氮嘌呤、嘧啶或核苷酸类似物；每个m确定各个核酸的长度，为0至数千、数万或更多；每个R独立选自氢、卤素、--R″、--OR″、和--NR″R″，其中每个R″独立为(C1-C6)烷基或(C5-C14)芳基，或两个相邻的R共同成键，而使核糖为2′，3′-双脱氢核糖；每个R′独立为羟基或
其中α为0、1或2。
在上述核糖多核苷酸及2′-脱氧核糖多核苷酸的某些实施方案中，核苷酸碱基B如前所述共价附于糖成分的Cl′碳。
术语″核酸″、″多核苷酸″及″寡核苷酸″也可能包括核酸类似物、多核苷酸类似物及寡核苷酸类似物。术语″核酸类似物″、″多核苷酸类似物″及″寡核苷酸类似物″交互使用，如此处所用，是指包含至少一个核苷酸类似物、和/或至少一个磷酸酯类似物、和/或至少一个戊糖类似物的核酸。核酸类似物的定义还包括其中磷酸酯和/或糖磷酸酯连接由其它类型连接所取代的核酸，例如N-(2-氨乙基)-甘氨酸酰胺及其它酰胺(参见例如Nielsen等人，1991，Science 254：1497-1500；WO2/20702；美国专利5,719,262；美国专利5,698,685；)；吗啉代(参见例如美国专利5,698,685；美国专利5,378,841；美国专利5,185,144)；氨基甲酸酯(参见例如Stirchak&Summerton，1987，J.Org.Chem.52：4202)；亚甲基(甲基亚氨基)(参见例如Vasseur等人，1992，J.Am.Chem.Soc.114：4006)；3′-thioformacetals(参见例如Jones等人，1993，J.Org.Chem.58：2983)；氨基磺酸酯(参见例如美国专利5,470,967)；2-氨乙基甘氨酸，常称作PNA(参见例如Buchardt，WO 92/20702；Nielsen(1991)Science 254：1497-1500)；及其它(参见例如美国专利5,817,781；Frier&Altman，1997，Nucl.Acids Res.25：4429以及此处引用的参考文献)。磷酸酯类似物包括氮不限于(i)C1-C4烷基磷酸酯，例如磷酸甲基酯；(ii)氨基磷酸酯；(iii)C1-C6烷基磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯以及(v)二硫代磷酸酯。
术语″退火″和″杂交″交互使用，是指一个核酸与另一核酸的碱基配对相互作用，从而形成双链、三链或其它高级结构。在某些实施方案中，主要是根据Watson/Crick和Hoogsteen型氢键的碱基特异性相互作用，例如A/T和G/C。在某些实施方案中，碱基堆积和疏水性相互作用也可能有助于双链稳定性。
此处所用术语″变体″是指蛋白质的任何改变，包括但不限于氨基酸序列的改变、一个或多个氨基酸的置换、一个或多个氨基酸的添加、一个或多个氨基酸的缺失以及氨基酸自身的改变。在某些实施方案中，这些改变包括保守性氨基酸置换。保守性氨基酸置换可能包括将一个氨基酸替换为例如具有相似疏水性、亲水性、电荷或芳香性的另一氨基酸。在某些实施方案中，可能根据相似的亲水性指数(hydrophthicindices)进行保守性氨基酸置换。亲水性指数考虑氨基酸的疏水性及电荷特征，在某些实施方案中，可能用来指导选择保守性氨基酸置换。例如Kyte等人，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)讨论了亲水性指数。本领域应当理解，可能根据任何上述特征进行保守性氨基酸置换。
氨基酸的改变可能包括但不限于糖基化、甲基化、磷酸化、生物素化以及不引起氨基酸序列改变的任何共价和非共价的蛋白质加成。此处所用″氨基酸″是指可能通过酶促或合成掺入多肽或蛋白质中的任何天然或非天然氨基酸。
此处所用″亲和组合″是彼此特异性结合的一组分子。亲和组合包括但不限于生物素和亲和素、生物素和链亲和素、受体和配基、抗体和配基、抗体和抗原以及多核苷酸序列及其互补物。在某些实施方案中，结合的亲和组合可能解开。例如，杂交的多核苷酸序列可能变性，结合链亲和素的生物素可能经加热而解开。
″靶物质″是指可以利用探针而区分的任何物质。靶物质可能包括天然存在或合成的分子。
在某些实施方案中，靶物质可能包括核酸序列。在某些实施方案中，靶核酸序列可能包括RNA和DNA。典型的RNA靶序列包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA以及RNA变体。例如剪接变体。典型DNA靶序列包括但不限于基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、核仁DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。
在某些实施方案中，核酸序列包括但不限于cDNA、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、其它染色体外DNA以及核酸类似物。典型核酸类似物包括但不限于LNA、PNA、PPG及其它下述核酸类似物。
可利用多种方法获得用于本发明组合物及方法的靶核酸序列。通过从生物学基质中分离而获得靶核酸时，某些分离技术包括(1)有机提取后乙醇沉淀，例如使用酚/氯仿有机试剂(例如Ausubel等人编著，Current Protocols in Molecular Biology卷1，第二章，I节，John Wiley&Sons，New York(1993))，优选使用自动化DNA提取仪，例如PEApplied Biosystems(Foster City，CA)的Model 341 DNA提取仪；(2)静相吸附方法(例如Boom等人，美国专利5,234,809；Walsh等人，Biotechniques 10(4)：506-513(1991))；以及(3)盐致DNA沉淀方法(例如Miller等人，Nucleic Acids Research，16(3)：9-10(1988))，该沉淀方法一般称作″盐析″方法。在某些实施方案中，可在上述分离方法之前进行酶消化步骤，例如蛋白酶K或其它蛋白酶消化，以帮助从样品中去除不需要的蛋白质。
在某些实施方案中，靶核酸序列包括但不限于扩增产物、连接产物、转录产物、反转录产物、引物延伸产物、甲基化DNA以及断裂产物。在某些实施方案中，靶核酸序列可能通过全基因组扩增而制备。在某些实施方案中，靶核酸序列可能通过等温扩增和/或连接而制备。
在某些实施方案中，样品中核酸序列可能经过断裂程序，例如InvaderTM分析中的断裂程序(例如美国专利5,846,717；5,985,557；5,994,069；6,001,567；和6,090,543所例证)。当样品中存在目的核酸时，该程序产生断裂产物。在某些实施方案中，靶物质可能是这种断裂产物。简言之，断裂程序可能利用两种核酸寡核苷酸，它们被设计为与样品中核酸互补。第一种寡核苷酸包含不与样品中核酸互补的5′部分，相邻为与样品中核酸互补的3′部分。第二种寡核苷酸在与第一种寡核苷酸互补的样品中核苷酸的3′区与样品中核酸互补，并包括与第一种寡核苷酸互补区略微重叠的互补或非互补部分。两种寡核苷酸与样品中核酸杂交，通常在酶的存在下导致第一种寡核苷酸的一部分断裂。断裂产物一般是第一种寡核苷酸不与样品中核酸互补的5′部分，互补区部分则与第二种寡核苷酸重叠。该断裂产物包含已知的核酸序列。在某些实施方案中，该断裂产物可能是靶物质。
不同的靶核酸序列可能是单个邻近核酸的不同部分，或可能位于不同核酸中。单个邻近核酸的不同部分可能重叠。
在某些实施方案中，靶核酸序列包含上游或5′区、下游或3′区以及位于上游区和下游区之间的″中央核苷酸″(参见例如图1)。中央核苷酸是由探针组合检测的核苷酸，例如而非限制，可能代表多等位靶基因座的单个多态性核苷酸。
一般技术人员应当理解，靶核酸序列一般描述为单链分子，双链分子的另一链包含互补序列，也可能用作靶序列。
其它靶物质包括但不限于肽序列。肽序列包括但不限于蛋白质、蛋白质片段及其它氨基酸片段。在某些实施方案中，肽靶序列包括但不限于不同的肽等位体(peptide alleles)(具有不同氨基酸的类似肽)以及不同的肽构型(具有不同二级和三级结构的类似蛋白质)。其它天然存在的靶物质包括但不限于激素和其它信号分子，例如激素和其它类固醇型分子。
在某些实施方案中，靶物质包括但不限于合成肽、药物及其它有机小分子。
探针
术语″探针″或″靶特异性探针″是包含可特异性结合靶物质部分的任何成分。探针可能包括但不限于核酸、肽及其它可特异性结合样品中靶物质的分子。这种特异性结合包括但不限于核酸分子间杂交、抗体-抗原相互作用、配基与受体间相互作用以及适体(aptomer)与蛋白质间相互作用。
在某些实施方案中，探针包含核酸序列特异性部分，设计以序列特异性方式与所选靶核酸序列的互补区杂交。在某些实施方案中，探针的序列特异性部分可能特异性针对特定序列，或者可能是简并的，例如特异性针对一组序列。针对靶肽的探针可能包含抗体，这是非限制性实例。
在某些实施方案中，探针包含适体，这是特异性结合某些肽序列的核酸。在某些实施方案中，探针包含肽。这种肽包括但不限于抗体和受体分子。在某些实施方案中，探针包含针对特异性靶肽抗原的抗体。
在某些实施方案中，探针可能包括其它的独特结合对子的成员，例如链亲和素/生物素结合对，以及得自ProlinxTM(Bothell，WA)的亲和结合化学剂，例如美国专利5,831,046；5,852,178；5,859,210；5,872,224；5,877,297；6,008,406；6,013,783；6,031,17和6,075,126所例示。
本发明的″探针组合″是一组按设计检测至少一种靶物质的两种或多种探针。作为非限制性实例，探针组合可能包含按设计与靶物质杂交的两种核酸探针，这两种探针彼此相邻的与靶物质杂交时，它们适于相互连接。
在本发明范围内使用时，″适于连接″是指至少一个第一种靶特异性探针与至少一个第二种靶特异性探针各自包含合适的反应性基团。典型的反应性基团包括但不限于第一种探针3′端的游离羟基以及第二种探针5′端的游离磷酸基、硫代磷酸酯和甲苯磺酸盐或碘化物、酯和酰肼、RC(O)S-、卤代烷基、RCH2S和α-卤酰基、硫代磷酰和溴代乙酰氨基以及S-pivaloyloxymethyl-4-硫代胸苷。另外，在某些实施方案中，第一种和第二种靶特异性探针与靶序列杂交，以致第一种靶特异性探针的3′端和第二种靶特异性探针的5′端紧密相邻而可以连接。
可编码标记(codeable label)
术语″标记″是指能够提供可检测信号、或与另一种分子或该组分子中的其它成员相互作用、从而提供可检测信号(由第一种分子或第二种分子提供)例如FRET(荧光共振能量转移)的任何分子或分子组合。利用已知的标记、连接、连接基团、试剂、反应条件以及分析和纯化方法，使用大量已知技术中的任何一种，可以实现使用标记。标记包括但不限于产生或淬灭可检测荧光、化学发光或生物荧光信号的发光或吸光化合物(参见例如Kricka，L.in Nonisotopic DNA ProbeTechniques(1992)，Academic Press，San Diego，3-28页)。可用作标记的荧光报告染料包括但不限于荧光素(参见例如美国专利5,188,934；6,008,379和6,020,481)、罗丹明(参见例如美国专利5,366,860；5,847,162；5,936,087；6,051,719和6,191,278)、苯吩嗪(参见例如美国专利6,140,500)、能量转移荧光染料，包含供体和受体对(参见例如美国专利5,863,727；5,800,996和5,945,526)和花菁(参见例如Kubista，WO 97/45539)以及任何能够产生可检测信号的其它荧光成分。荧光素染料的例子包括但不限于6-羧基荧光素、2′，4′，1，4，-四氯荧光素以及2′，4′，5′，7′，1，4-六氯荧光素。
其它典型的标记包括但不限于发光的发光分子以及与发光反应有关的分子，例如非限制性实例是萤光素萤光素酶反应。标记还包括但不限于化学发光和电发光的分子及反应。一个非限制性实例是，化学发光标记可能对胶片曝光。胶片显色表明样品中是否存在靶物质、或样品中靶物质的数量。
其它典型标记包括但不限于供体-受体相互作用，其中供体分子放出能量，可由受体分子检测到。然后受体分子发出可检测信号。
其它典型标记包括但不限于涉及红外光子释放的分子。
标记还包括但不限于量子点。″量子点″是指能够因接触初级能量而响应发出次级能量的半导体纳晶化合物。一般而言，单个量子点发出的能量通常具有相同的可预测波长。典型的半导体纳晶化合物包括但不限于CdSe、CdS和ZnS晶体。美国专利5,990,479和6,207,392 B1以及″Quantum-dottagged microbeads for multiplexed optical codingof biomolecules，″Han等人，Nature Biotechnology，19：631-635(2001)描述了某些实施方案的合适量子点。
本发明的标记还包括磷光体(phosphors)和放射性同位素。放射性同位素可能直接检测，或可能激发荧光团，发出某一波长的光，然后检测。磷光体颗粒可能由红外光(约980nm左右)激发，但发出位于可见光谱的信号，因而显著降低或消除背景光。
某些典型标记的其它实例包括带有编码信息、例如条码(barcode)的颗粒，还包括美国专利4,053,433所述微粒标签。某些其它非放射性标记方法、技术和试剂综述于Non-Radioactive Labelling，A PracticalIntroduction，Garman，A.J.(1997)Academic Press，San Diego。
一类标记通过特异性或非特异性捕获而有效分离或固化一种分子，例如生物素、地高辛配基和其它半抗原(参见例如Andrus，A.″Chemical methods for 5′non-isotopic labeling of PCR probes andprimers″(1995)in PCR 2：A Practical Approach，Oxford UniversityPress，Oxford，39-54页)。
″可编码标记″是指特定成分特异性的一种或多种标记。在某些实施方案中，该成分是靶物质和/或探针。在可编码标记包含一种以上标记的实施方案中，该标记可能相同或不同。检测到指定的可编码标记表明存在该可编码标记特异性的成分。缺少指定的可编码标记表明不存在该可编码标记特异性的成分。
可编码标记可能被称作″检测差异(detectably different)″，是指可利用至少一种检测方法彼此区分。不同的可编码标记包括但不限于发出不同波长光的一种或多种标记、发出不同强度光的一种或多种标记、发出不同数目和/或不同形式信号的一种或多种标记、具有不同荧光衰变寿命的一种或多种标记、具有不同光谱特征的一种或多种标记、具有不同放射性衰变性质的一种或多种标记、不同电荷的一种或多种标记以及不同大小的一种或多种标记。
在某些实施方案中，计数可编码标记的数目是指实际计数各个可编码标记。计数可编码标记的数目不同于类似物信号检测，后者检测多个标记的总和信号水平。类似物信号检测一般使用相同类型多个标记的信号集成，以确定样品中存在的该标记数目。例如，类似物检测一般通过比较测试样品与含有已知量指定标记的对照样品的信号亮度或强度水平，提供指定类型标记的估计数目。
相反，计数是数字检测系统，它实际计数各个可编码标记的数目。因此，在某些实施方案中，如果样品中存在200个相同的可编码标记，则实际计数其中每个标记。在某些实施方案中，所计数的标记数目可能在样品中实际数目的20％之内。在某些实施方案中，所计数的标记数目可能在样品中实际数目的10％之内。在某些实施方案中，所计数的标记数目可能在样品中实际数目的50％之内。在某些实施方案中，计数样品中存在的代表性标记部分，根据代表性部分计数的标记数目确定样品中标记总数。相比之下，为利用类似物检测确定样品中标记数，测定200个标记的总和信号，并与已知标记数量的总和信号相比较。
在某些实施方案中，反应中的可编码标记和探针充分超过所存在的靶物质，计数的可编码标记数目代表存在的靶物质数目。在这类实施方案中，一般只有一个靶物质结合到每一可编码标记。
在某些实施方案中，由于包括实际计数可编码标记，数字化检测受背景″噪声″、或偶发光的影响可能较小，可以解释为类似物检测中的部分总和信号。
在某些实施方案中，通过计数可编码标记，可以精确区分不同样品中可编码标记的不同数目。相反，在某些情况下，类似物检测中多个标记的总和信号可能受不同样品中不定量的背景信号影响，可能遮蔽不同样品中标记数目的微小差别。
在检测样品中两种或多种可不同检测的可编码标记的某些实施方案中，由于可不同检测的可编码标记的信号重叠而致的可能错误，可能通过计数各个可不同检测的可编码标记而减至最小。在某些类似物检测方法中，来自一个标记的信号部分可能被检测为另一不同标记的信号，从而可能引起错误解读。如果不同标记的信号的发射范围重叠，则可能尤其如此。在某些实施方案中，通过计数各个可编码标记，可使测定不同标记总和信号强度的类似物检测中不时产生的错误减至最小。
在某些实施方案中，″可编码标记″是特异性针对不同靶特异性探针(不同靶序列特异性的不同探针)的不同量子点组合，不同量子点组合彼此可不同检测。
可编码标记可能直接连接于探针，或间接连接于另一分子，然后再连接于探针。在某些实施方案中，可编码标记可能在加入样品中之前连接于探针，或可能在形成可检测复合物的反应过程中连接于探针。在某些实施方案中，可编码标记可能直接连接于探针，或通过连接分子例如化学连接基团、或连接对例如链亲和素-生物素对。
在某些实施方案中，将标记掺入小珠中，然后连接于探针。″小珠″是指探针可以连接其上的任何物质。小珠可能是任何形状，包括但不限于球状、杆状、管状和棒状。小珠可能由任何物质组成，包括但不限于硅玻璃和聚合物。小珠可能是任意大小。小珠的某些非限制性实例包括以下所述，例如美国专利4,499,052(Fulwyler)；4,717,655(Fulwyler)；3,957,741(Rembaum，CalTech)；4,035,316(Rembaum，CalTech)；4,105,598(Rembaum，CalTech)；4,224,198(Rembaum，CalTech)；4,326,008(Rembaum，CalTech)；3,853,987(Dreyer，CalTech)；4,108,972(Dreyer，CalTech)；5,093,234(Flow CytometryStandards)；6,268,222(Luminex)；5,326,692(Molecular Probes)；5,573,909(Molecular Probes)；5,723,218(Molecular Probes)；5,786,219(Molecular Probes)；5,028,545(Soini)和5,132,242(SauCheung)；以及国际申请公开WO 01/13119(Luminex)；WO 01/14589(Luminex)；WO 97/14028(Luminex)；WO 99/19515(Luminex)；WO99/37814(Luminex)；WO 99/52708(Luminex)；WO 00/55363(Amersham)；WO 01/01141(Amersham)；WO 99/64867(Amersham)和WO 94/11735(Soini)。
在某些实施方案中，小珠包含包被或未包被的颗粒，该颗粒包含至少一种磁性物质、顺磁物质、硅玻璃、聚丙烯酰胺、多糖、塑料、乳胶、聚苯乙烯及其它聚合物质。
小珠可能包含可编码标记，例如某些实施方案的量子点组合。本领域技术人员了解获得具有量子点小珠的合适方法。参见例如Han等人，Nature Biotechnology，19：631-635(2001)以及美国专利6,207,392(Shuming Nie)；6,114,038(Biocrystal)；6,261,779(Biocrystal)；6,207,229(Bawendi)；6,251,303(Bawendi)；6,274,323(Quantum Dot)；5,990,479(Alivisatos)；6,207,392(Alivisatos)；国际申请公开WO00/29617(Shuming Nie)；WO 00/27365(Biocrystal)；WO 00/28089(Biocrystal)；WO 01/89585(Biocrystal)；WO 00/17642(Bawendi)；WO00/17656(Bawendi)；WO 99/26299(Bawendi)；WO 00/68692(Quantum Dot)；WO 00/55631(Alivisatos)；以及欧洲申请0 990 903Al(Bawendi)。小珠中可能包埋量子点或其它标记。
在某些实施方案中，一个非限制性实例是，可能将量子点掺入交联的聚合物小珠中。在某些实施方案中，可能于70℃使用苯乙烯(98％v/v)、二乙烯苯(1％v/v)和丙烯酸(1％v/v)乳剂合成聚苯乙烯小珠。在某些实施方案中，然后在包含5％(v/v)氯仿和95％(v/v)丙醇或丁醇的溶剂混合物中溶胀小珠。在某些实施方案中，在混合物中加入控制量的ZnS-包封(capped)的CdSe量子点。室温温育后完成包埋过程。在某些实施方案中，小珠的大小可由合成中所用稳定剂(例如聚乙烯吡咯酮)的数量来控制。在某些实施方案中，包含直径2-4nm量子点的直径2μm的球状小珠可能包含数万量子点。
制备上述小珠的方法可能产生数目不定的量子点的小珠。另外，如果使用一种以上颜色的量子点，则可能获得数目不定的不同颜色的小珠。在某些实施方案中，这样制备小珠之后，将所得小珠按照指定小珠中每种颜色量子点的相对数目进行分选，获得各组具有不同可编码标记的相同标记小珠。在某些实施方案中，可以通过仪器自动分选，例如荧光联合细胞分析仪(FAGS)或可以区分不同可编码标记的其它流式细胞仪类型检测方法。
技术人员应当理解，很多方法可以获得包含探针的小珠。这类方法包括但不限于，使用共价键、UV交联以及通过亲和组合连接，将探针连接于小珠。一个非限制性实例是，链亲和素分子可能共价连接于小珠表面的羧酸基团。寡核苷酸探针可能生物素化，然后通过亲和素分子连接小珠。
在某些实施方案中，小珠包含内参标记。在某些实施方案中，内参标记与可编码标记可检测的不同。在某些实施方案中，可能使用内参标记确证带有可编码标记的小珠数目。例如，在某些实施方案中，带有不同可编码标记的小珠将各自包括相同的内参标记，可用于鉴定单一小珠的存在。在某些实施方案中，为将带有可编码标记的单一第一种小珠从带有可编码标记的两种小珠中区分开(其联合强度类似于第一种小珠的可编码标记强度)，每一小珠可能包括单一的内参标记。在某些实施方案中，检测到两种内参标记应该表示存在两种小珠，而检测到单一内参标记应该表示存在单一小珠。因此，在某些实施方案中，内参比较有助于准确测定实际存在的小珠数目，只检测可编码标记则可能提供不明确结果。
例如，在小珠包含含有荧光团、染料或纳晶的编码元素的某些实施方案中，每一小珠中的内参标记可能是单一量子点。存在单一量子点可能用于表示存在单一小珠。存在两种量子点应该表示存在两种小珠，依此类推。
在某些实施方案中，另一非限制性实例是，内参标记可能提供可检测的不同于可编码标记信号的颜色信号。在某些实施方案中，每一小珠内参标记的信号强度可以用于鉴定单一小珠的存在。例如，在某些实施方案中，每一小珠的内参信号将提供强度约1个单位的红色信号。在某些这类实施方案中，可能利用两种不同小珠上的两种不同可编码标记来检测两种不同靶物质。例如，在某些实施方案中，针对第一种靶物质的第一种可编码标记提供强度为1个单位的绿色信号，针对第二种靶物质的第二种可编码标记提供强度为2个单位的绿色信号。若无内参标记，在某些实施方案中，可能难以确定强度为2个单位的绿色信号是表示存在针对第一种靶物质的两个小珠，还是存在针对第二种靶物质的一个小珠。在利用红色内参标记的某些实施方案中，检测到强度为1个单位的红色信号应表示存在针对第二种靶物质的一个小珠，而检测到强度为2个单位的红色信号应表示存在针对第一种靶物质的两个小珠。
利用不同大小的小珠时，掺入该小珠中的标记，例如以荧光染料为非限制性实例，其数量可能因小珠大小而变化。在某些实施方案中，在小珠中包含内参标记，可能用于标准化由小珠大小的变化所致可编码标记信号的变化。
在未利用内参标记的某些实施方案中，尝试使用大小相当一致的小珠，以试图避免因小珠大小差异所致相同可编码标记的信号差异。在某些实施方案中，小珠上的内参标记可能允许人们使用不同大小的小珠。在某些这类实施方案中，可能利用两种不同小珠上的两种不同可编码标记来检测两种不同靶物质。例如，如果小珠直径为X，针对第一种靶物质的第一种可编码标记提供强度为1个单位的绿色信号，针对第二种靶物质的第二种可编码标记提供强度为2个单位的绿色信号。若无内参标记，在利用不同大小小珠的某些实施方案中，可能难以确定提供强度为2个单位绿色信号的小珠是表示存在直径大于X的针对第一种靶物质的小珠，还是存在直径为X的第二种靶物质的小珠。
在某些实施方案中，可能利用包括内参标记的小珠，该内参标记可检测地不同于可编码标记。在某些实施方案中，可能利用如果小珠直径为X则提供强度为1个单位红色信号的内参标记。因此，如果小珠大小不同于直径X，该内参标记将提供不同于1个单位的强度。在某些这类实施方案中，检测到2个单位绿色信号的小珠，若红色信号为1个单位，则表示存在第二种靶物质，若红色信号为2个单位，则表示存在第一种靶物质。
在某些实施方案中，使用内参标记可能允许产生比不使用内参时可用的小珠更小的小珠。在某些实施方案中，小珠可能直径小于2μm。在某些实施方案中，使用内参标记也许能区分小珠大小的极小差别。
在某些实施方案中，通过分级分离(staging)或流式细胞术计数小珠时，可以使用内参标记。在某些实施方案中，可能在阵列中使用利用内参标记的小珠，其中分析物结合到阵列的特定区域。在某些实施方案中，可能使带有内参标记小珠的阵列成像。在某些实施方案中，利用软件标准化使用内参标记的数字化图像中的信号。
在某些实施方案中，可能使用小珠的大小作为编码元素。一个非限制性实例是，小珠具有利用两种颜色的100个不同编码。在某些实施方案中，由于不同大小的小珠提供不同的强度，可能使用不同大小的小珠作为部分编码。例如，在某些实施方案中，使用两种颜色的100个编码可能通过使用4种不同大小的小珠而增加到400个编码。
可检测复合物
本发明术语″可检测复合物″是包含可编码标记的复合物。在某些实施方案中，可检测复合物另外包含至少一种探针。
根据某些实施方案，存在靶物质时产生可检测复合物，不存在靶物质时则不产生。在某些实施方案中，如果靶物质和探针彼此特异性结合，则形成可检测复合物。
在某些实施方案中，可检测复合物在连接反应中产生。连接方法包括但不限于酶学及化学连接。
本发明的连接反应包含任何酶学或化学过程，其中在相邻杂交到模板的核酸序列的相对末端之间形成核苷酸间连接。另外，退火核酸序列的相对末端一般适于连接(连接的适合性取决于所用连接方法)。核苷酸间连接可能包括但不限于磷酸二酯键形成。该键的形成可能包括但不限于由DNA或RNA连接酶酶促产生，例如噬菌体T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶、Thermus thermophilus (Tth)连接酶、嗜热水生菌(Thermus aquaticus，Taq)连接酶或火球菌(Pyrococcus furiosus，Pfu)连接酶。其它核苷酸间连接包括但不限于合适反应基团间形成共价键，例如α-卤酰基与硫代磷酸基团之间形成硫化磷酰乙酰氨基、硫代磷酸甲苯磺酸或碘化物基团形成5′-磷酸硫酯和焦磷酸酯连接。
化学连接剂包括但不限于活化剂、凝聚剂和还原剂，例如碳二亚胺、溴化氰(BrCN)、N-氰基咪唑、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亚胺/胱胺、二硫苏糖醇(DTT)和紫外线。自连，即缺少连接剂的自发连接，也在本发明范围之内。化学连接方法的详细方案以及合适反应性基团的说明参见Xu等人，Nucleic Acid Res.，27：875-81(1999)；Gryaznov和Letsinger，Nucleic Acid Res.21：1403-08(1993)；Gryaznov等人，Nucleic Acid Res.22：2366-69(1994)；Kanaya和Yanagawa，Biochemistry 25：7423-30(1986)；Luebke和Dervan，Nucleic Acids Res.20：3005-09(1992)；Sievers和von Kiedrowski，Nature 369：221-24(1994)；Liu和Taylor，Nucleic Acids Res.26：3300-04(1999)；Wang和Kool，Nucleic Acids Res.22：2326-33(1994)；Purmal等人，NucleicAcids Res.20：3713-19(1992)；Ashley和Kushlan，Biochemistry30：2927-33(1991)；Chu和Orgel，Nucleic Acids Res.16：3671-91(1988)；Sokolova等人，FEBS Letters 232：153-55(1988)；Naylor和Gilham，Biochemistry 5：2722-28(1966)以及美国专利5,476,930。
在某些实施方案中，可能利用至少一个循环的以下连续过程：适于连接的第一种和第二种靶特异性探针的序列特异性部分与其各自互补的靶区域杂交；第一种靶特异性探针的3′端与第二种靶特异性探针的5′端连接，形成连接产物；核酸双链变性，将连接产物与靶序列分离。该循环可能重复或不重复。例如而非限制，通过热循环该连接反应来线性增加连接产物量。
连接技术也在本发明范围之内，例如间隙填补连接(gap-fillingligation)，包括但不限于间隙填补OLA和LCR、桥接寡核苷酸连接以及校正连接。这些技术的说明特别见美国专利5,185,243、公开的欧洲专利申请EP 320308和EP 439182以及公开的PCT专利申请WO90/01069。
可检测复合物也可能通过核酸杂交产生，而不经任何连接步骤。在某些实施方案中，与PNA、LNA或其它合成核酸进行杂交，Tm高于自然发生的核酸杂交。
还可能通过抗体-抗原相互作用、适体-蛋白质相互作用及其它特定结合对的作用(例如链亲和素-生物素反应)而产生其它可检测复合物。
通过引物延伸反应也可能产生可检测复合物。引物延伸反应包括但不限于单碱基延伸(SBE)反应、测序反应(例如Sanger双脱氧测序反应)以及包括聚合酶的其它反应。
在某些实施方案中，在配基-受体反应中产生可检测复合物。一个非限制性实例是，可编码标记和探针可能连接配基分子。受体连接至分离成分，例如磁珠。
在某些实施方案中，当存在靶核酸时，探针与靶核酸序列杂交，结合到单个核苷酸的可编码标记通过聚合酶反应连上探针。
在某些实施方案中，将包含与核酸靶序列互补核酸的探针连至分离成分，例如磁珠。在某些实施方案中，然后将探针加入包含核酸靶序列的样品中。在某些实施方案中，将连至核苷酸的可编码标记加入含有聚合酶的样品中。在某些实施方案中，如果样品中存在核酸靶序列，则探针与靶序列杂交，聚合酶将连有可编码标记的核苷酸加到寡核苷酸探针上，形成可检测复合物。在某些实施方案中，与样品核酸变性之后，再使用磁珠将探针与样品分离。在某些实施方案中，如果计数到可检测复合物，则样品中存在靶序列。
在某些实施方案中，将从样品中去除的可检测复合物数目相比检测反应开始时存在的可检测复合物数目，代表样品中的靶物质数目。在某些实施方案中，在样品中加入大量可检测复合物。在某些实施方案中，这些可检测复合物包含连在单链核酸探针一端的可编码标记，以及连在单链核酸探针另一端的分离成分。在某些实施方案中，样品中存在靶物质时，靶物质与单链探针杂交，形成双链分子。在某些实施方案中，反应中加入可切割双链核酸的核酸内切酶。在某些实施方案中，剩余的可检测复合物的数目等于最初加入反应中的可检测复合物数目减去样品中存在的靶物质数目。
分离成分和方法
术语″分离成分″是指任何成分，若包含在可检测复合物中，则可能用于将该可检测复合物与样品中至少一种其它成分相分离。
在某些实施方案中，在可检测复合物中不掺入任何特定分离成分而完成分离。在某些实施方案中，不利用特定分离成分的方法包括但不限于根据密度、大小、电或离子电荷、扩散、加热、流式细胞术和直接光照而分离。在某些实施方案中，无需可检测复合物与其它成分经任何分离而检测可检测复合物。
在某些实施方案中，该方法包含在定量、或检测是否存在一种或多种靶物质之前，将可检测复合物与未处于可检测复合物中的分离成分相分离。一般技术人员应当理解，可能根据某些实施方案使用若干方法将可检测复合物与未处于可检测复合物中的分离成分相分离。某些实施方案的非限制性实例是，可能利用分离成分的密度或大小差异，将可检测复合物与未处于可检测复合物中的分离成分相分离。分离方法包括但不限于使用筛分滤膜、筛分柱、密度梯度、通过重力分离以及通过离心分离。该大小分离成分的实例包括但不限于聚合物小珠。
例如，在某些实施方案中，可能如下将可检测复合物与未处于可检测复合物中的分离成分相分离。探针组合可能包括包含第一种探针的分离小珠以及包含第二种探针的检测小珠。分离小珠另外包含第一种可编码标记，检测小珠另外包含第二种可编码标记。分离小珠比检测小珠小。连接后，可以根据可检测复合物中的检测小珠与未处于可检测复合物中的分离小珠的大小差异，将可检测复合物与分离小珠相分离。例如，可能将物质通过允许分离小珠流过而保留可检测复合物的筛分滤膜。
在某些实施方案中，也可能如下将可检测复合物与未处于可检测复合物中的分离成分相分离。探针组合可能包括包含第一种探针的分离小珠以及包含第二种探针的检测小珠。分离小珠另外包含第一种可编码标记，检测小珠另外包含第二种可编码标记。分离小珠的密度比检测小珠高。形成可检测复合物以后，可以根据可检测复合物中的检测小珠与游离的分离小珠的密度差异，将可检测复合物与未处于可检测复合物中的分离小珠相分离。例如，在某些实施方案中，可能将物质置于密度梯度中，将可检测复合物与游离的分离小珠相分离。在某些实施方案中，也可能利用重力将可检测复合物与游离的分离小珠相分离。因此，如果分离小珠的密度比检测小珠高，分离小珠将沉降在可检测复合物之下。
根据某些实施方案，可能利用探针组合中探针的不同性质，将可检测复合物与未处于可检测复合物中的探针和可编码标记相分离。例如，在某些实施方案中，可能使用具有特定性质的分离成分，将其吸引到特定位置，而反应混合物中的其它成分缺少这种性质。例如，根据某些实施方案，该分离成分可能包含磁性颗粒，而反应混合物中的其它成分不包含磁性颗粒。
术语″磁性颗粒″是指可以使用磁力移动的物质。这包括但不限于磁化的颗粒、未磁化但受磁场影响的颗粒(例如胶体铁、氧化铁(例如铁氧体和磁石)、镍以及镍-铁合金)以及可以变成磁化的颗粒(例如铁氧体、磁石、铁、镍及其合金)。
在某些实施方案中，磁性颗粒包含一种或多种铁氧体、磁石、镍和铁，而反应混合物中的其它成分不包含这种物质。在这类实施方案中，可以使用该分离成分的这种独特性质将包括分离小珠的可检测复合物与未处于可检测复合物中的探针和可编码标记相分离。
将可检测复合物与其它成分分离的方法包括但不限于利用密度分离、利用电荷分离、利用阻尼系数(例如电泳迁移率)分离、利用扩散或透析分离、利用加热或光线分离(例如利用激光去除标记的颗粒)。
在某些实施方案中，可能在定量样品中一种或多种靶核酸序列之前，从包含可检测复合物的组合物中去除未处于可检测复合物中的分离成分、可编码标记或探针(游离组分)。在某些实施方案中，可能在定量(或检测是否存在)样品中一种或多种靶核酸序列之前，从包含游离组分的组合物中去除可检测复合物。
在某些实施方案中，分离可检测复合物与游离组分包含从靶核酸序列中分离可检测复合物，以及从样品中分离可检测复合物。
在某些实施方案中，可检测复合物是连接产物。在某些实施方案中，从靶序列中分离可检测复合物包含热变性。
一个非限制性实例是，在某些实施方案中，可能如下检测样品例如细胞裂解物中是否存在不同的靶核酸序列。将样品与特异性针对每种不同靶核酸序列的不同探针组合混合。每一探针组合包含含有掺入小珠中的磁性颗粒的分离小珠以及第一种靶特异性探针，并包含含有小珠以及第二种靶特异性探针的检测小珠。探针组合中的分离小珠比检测小珠的密度高。
每一探针组合的分离小珠另外包含特异性针对第一种靶特异性探针的第一种可编码标记，每一小珠组合的检测小珠另外包含特异性针对第二种靶特异性探针的第二种可编码标记。第一种可编码标记可检测地不同于第二种可编码标记。在互补靶序列上彼此相邻杂交时，每一小珠组合中的靶特异性探针适合于连在一起。
当样品包含与指定探针组合中第一种和第二种靶特异性探针互补的靶核酸序列时，探针退火并在连接酶(L)存在下相连，形成包含分离小珠和检测小珠的可检测复合物(参见例如图7)。连接以后，靶核酸序列与可检测复合物热变性。
在图8和图9描述的某些实施方案中，然后使样品经受密度梯度，使可检测复合物和检测小珠在容器中位于分离小珠之上。然后可能利用磁源将可检测复合物与未连接的检测小珠分离(参见图8)。例如，可以使用磁源从包含未连接检测小珠的样品中去除可检测复合物，并将可检测复合物置于不包含任何未连接小珠的分离容器中(参见图8和9)。然后可以通过计数可编码标记的独特组合，来检测是否存在可检测复合物。
在某些实施方案中，可能使用接近容器底部的第二种磁体，吸引并保留高密度的未连接分离小珠，而不吸引或保留低密度的可检测复合物和未连接检测小珠(参见图8)。然而，这一接近容器底部的第二种磁体并非必需。例如，在某些实施方案中，可以设计小珠的密度，使任何未连接的分离小珠和可检测复合物之间的分离距离可以将可检测复合物吸引到磁性装置，而不可以将未连接分离小珠吸引到该磁性装置。
在图10和11所述的某些实施方案中，连接后将样品加热，变性杂交的探针和靶核酸序列。未连接的分离小珠因重力而沉降在可检测复合物和未连接的检测小珠之下(参见图10)。然后可能将电磁体(磁体)放在接近容器底部，使其吸引和保留较高密度的未连接的分离小珠，而不吸引或保留较低密度的可检测复合物和未连接的检测小珠(参见图11)。也可能将电磁体(磁体)放在容器顶部，使其吸引和保留可检测复合物(参见图11)。
然后提起保留可检测复合物的电磁体，将可检测复合物与未连接的检测小珠分离(参见图11和12)。然后可以通过计数独特组合的可编码标记来检测是否存在可检测复合物，而无需从包括未连接的小珠的样品中移出(见图12)。图12描述了照射可检测复合物，识别编码，并利用PMT传感器计数连接产物的某些实施方案。
在图18描述的某些实施方案中，形成可检测复合物，其包含含有第一种可编码标记的磁性小珠以及含有第二种可编码标记的非磁性小珠。在某些实施方案中，将电磁体(磁体)置于包含小珠和可检测复合物的反应容器之下。开启电磁体，将可检测复合物和未处于可检测复合物中的磁性小珠吸引到容器底部。参见图18C。
在某些实施方案中，利用包含输入管和输出管的连续流系统，去除未处于可检测复合物中的非磁性小珠及其它非磁性成分。参见图18D。在某些实施方案中，然后关闭电磁体，利用流式细胞仪小管取出可检测复合物和未处于可检测复合物中的磁性小珠。参见图18E。
在某些实施方案中，然后将可检测复合物和未处于可检测复合物中的磁性小珠送样到流式细胞仪，只计数第一种和第二种可编码标记的组合物。参见图18F。在这类实施方案中，未处于可检测复合物中的磁性小珠只包括第一种可编码标记，将不被计数。
在某些实施方案中，可能利用不包括可编码标记的磁性小珠进行上述图18的方法。分离未处于可检测复合物中的非磁性小珠以后，将可检测复合物和未处于可检测复合物中的磁性小珠送样流式细胞仪。在这类实施方案中，由于磁性小珠不具有可编码标记，只计数可检测复合物中非磁性小珠的可编码标记。
在图19所述某些实施方案中，形成包含磁性小珠、非磁性小珠和可编码标记的可检测复合物。在某些实施方案中，将第一种电磁体置于包含小珠和可检测复合物的反应容器之下。开启第一种电磁体，将可检测复合物和未处于可检测复合物中的磁性小珠吸引到容器底部。参见图19C。
在某些实施方案中，利用包含输入管和输出管的连续流系统，去除未处于可检测复合物中的非磁性小珠及其它非磁性成分。参见图19D。在某些实施方案中，使用可翻转的容器，这样在翻转时不致流出大量液体。在某些实施方案中，这可能通过使用小容器而实现，当容器翻转时，其表面张力抑制液体流出容器。在利用可翻转容器的实施方案中，然后将容器和第一种电磁体翻转，并关闭第一种电磁体。然后开启位于翻转容器底部的第二种电磁体，吸引可检测复合物和未处于可检测复合物中的磁性小珠。参见图19F。在某些实施方案中，可检测复合物比未处于可检测复合物中的磁性小珠的阻尼大而密度小。因此，在这类实施方案中，未处于可检测复合物中的磁性小珠向第二种电磁体移动比可检测复合物更快。当未处于可检测复合物中的磁性小珠集中到第二种电磁体时(参见图19E)，在可检测复合物到达第二种电磁体之前，将容器翻转回来。
在某些实施方案中，然后利用流式细胞仪小管将可检测复合物取出(参见图19F)，送样流式细胞仪，计数可检测复合物的可编码标记。
在某些实施方案中，可能利用不包括可编码标记的磁性小珠进行上述图19的方法。在某些实施方案中，可能利用不包括可编码标记的非磁性小珠进行上述图19的方法。
在图20所述某些实施方案中，形成包含磁性小珠、非磁性小珠和可编码标记的可检测复合物。容器内包含滤膜。在某些实施方案中，设计磁性小珠可穿过滤膜，而非磁性小珠不能穿过滤膜。在某些实施方案中，将电磁体置于包含小珠和可检测复合物的反应容器之下。开启第一种电磁体，将可检测复合物和未处于可检测复合物中的磁性小珠吸引到容器底部。参见图20C。
未处于可检测复合物中的磁性小珠朝向磁体穿过滤膜。可检测复合物被吸向磁体，但由于复合物的非磁性小珠而不能穿过滤膜。通过磁体的吸引，将可检测复合物保留在滤膜上。在某些实施方案中，然后利用包含输入管和输出管的连续流系统，去除未处于可检测复合物中的非磁性小珠及其它非磁性成分。参见图20D。在某些实施方案中，然后将滤膜从电磁铁移开，分离可检测复合物与未处于可检测复合物中的磁性小珠。这样移开滤膜使可检测复合物离开电磁铁，离开未处于可检测复合物中的磁性小珠。
在某些实施方案中，然后利用流式细胞仪小管取出可检测复合物。参见图20E。在某些实施方案中，然后将可检测复合物送样到流式细胞仪，计数可检测复合物的可编码标记。参见图20F。
在某些实施方案中，可能利用不包括可编码标记的磁性小珠进行上述图20的方法。在某些实施方案中，可能利用不包括可编码标记的非磁性小珠进行上述图20的方法。
在某些实施方案中，可能按便于检测标记组合存在与否的方式，使用容器中的凹槽，帮助排列可检测复合物。在某些实施方案中，″排列的连接产物″是产物的分离小珠比检测小珠离容器的指定表面更近的产物。例如，在图13所述某些实施方案中，分离小珠比检测小珠更小。设计凹槽，使分离小珠适合凹槽，而分离小珠太大，不适合凹槽(参见图13)。在某些实施方案中，可能将磁源放在靠近容器的凹槽处，以吸引并保留分离小珠在凹槽中。然后可以计数可编码标记的组合，以检测可检测复合物存在与否。在图13所示某些实施方案中，凹槽决定可检测复合物的位置，以使成角度的激发光束照射到带有几个读数的两种小珠。
在某些实施方案中，也可能使用电泳通过电荷或荷质比分离该分离成分。在某些实施方案中，带电荷的分离成分也可能通过离子交换例如使用离子交换柱或基于电荷的层析进行分离。
在某些实施方案中，分离成分也可能是亲和组合的一员。亲和组合是彼此特异性结合的一组分子。典型的亲和组合包括但不限于链亲和素/生物素对，互补核酸、抗体-抗原对以及得自ProlinxTM(Bothell，WA)的亲和结合化学剂，例如美国专利5,831,046；5,852,178；5,859,210；5,872,224；5,877,297；6,008,406；6,013,783；6,031,17和6,075,126所例示。
在某些实施方案中，分离成分因其迁移率而分离。在某些实施方案中，因迁移率而分离根据分离成分的大小进行。在某些实施方案中，可能在电泳中利用迁移率调节剂。典型的迁移率调节剂及其使用方法描述于例如美国专利5,470,705；5,580,732；5,624,800；和5,989,871。在某些实施方案中，通过改变可编码标记的迁移率，可能将与靶物质存在有关的信号以及与靶物质存在无关的标记信号区分开。
在某些实施方案中，可能使用两种或多种不同的分离成分或方法。一个非限制性实例是，在某些实施方案中，可检测复合物可能包含磁性小珠、连接产物以及生物素包被的小珠。参见例如图21A部分。将链亲和素包被的电磁体放在样品中，并开启。参见例如图21B部分。可检测复合物和未处于可检测复合物中的磁性小珠被吸引到电磁体。处于可检测复合物中的生物素包被的小珠与电磁体上的亲和素结合。参见例如图21C部分。然后关闭电磁体，未处于可检测复合物中的磁性小珠从电磁体上脱落，而可检测复合物仍与电磁体结合。在某些实施方案中，然后从含有结合可检测复合物的电磁体的样品中取出电磁体，利用照相机或扫描仪检测处于可检测复合物中的可编码标记。参见例如图21D部分。
在某些实施方案中，靶物质的存在阻碍而非促进可检测复合物的形成。在某些实施方案中，探针和/或可编码标记的数目有限。在某些实施方案中，计数可检测复合物提供了与靶物质无关的可编码标记的数目。从在完全缺少靶物质的情况下预期的可检测复合物的总数中减去所计数的可检测复合物数目，便提供了样品中存在的靶物质数目。
管中管分离可检测复合物
在图28所述某些实施方案中，形成包含含有可编码标记的小珠以及分离成分例如生物素分子的可检测复合物。在某些实施方案中，形成可检测复合物的过程中可能包括连接反应。在某些实施方案中，形成可检测复合物的过程中可能包括抗体-肽反应。在某些实施方案中，可能利用生物素之外的分离成分。
在图28所述实施方案中，利用探针组合，其中包括带有包含可编码标记的第一种探针以及连接生物素的第二种探针。在图28A中，如果存在靶物质，则进行连接，形成可检测复合物。在图28(B)所示某些实施方案中，加入链亲和素包被的磁性小珠。链亲和素包被的磁性小珠结合可检测复合物中的生物素分子。在某些实施方案中，包含可编码标记、未连接生物素分子的小珠不结合链亲和素包被的小珠。在某些实施方案中，图28所示过程可能通过使用不包括连接的过程而修改，形成可检测复合物，其中包含含有可编码标记和生物素的小珠。
如图28(C)所述的某些实施方案所示，提供第一只管，其放在较大的第二只管中。在某些实施方案中，两个管部分填满缓冲液，缓冲液的密度大于包含可编码标记的小珠。在某些实施方案中，第二只管部分填满缓冲液，将第二只管放在外管中，使第一只和第二只管中的缓冲液高度达到平衡。
在某些实施方案中，连接反应之后，将至少部分样品放在第一只管中高密度缓冲液的顶部，使小珠漂浮在缓冲液中。在图28(D)所述某些实施方案中，然后在第二只管的底部施加磁体，使未结合的包被链亲和素的磁性小珠和可检测复合物被吸引到第二只管底部的磁体。包含未处于可检测复合物中的可编码标记的小珠仍漂浮于或朝向第一只管中高密度缓冲液的顶部。在图28(E)所述某些实施方案中，第一只管的顶部充分密封，将第一只管提到第二只管中缓冲液的上方。至此，包含未处于可检测复合物中的可编码标记的小珠与包含可检测复合物的缓冲液相分离。在某些实施方案中，第一只管防止小珠粘附到第二只管的管壁上。
在某些实施方案中，然后可能取出第二只管中的可检测复合物进行计数。在某些实施方案中，将可检测复合物上样流式细胞仪。在某些实施方案中，取出第二只管底部带有可检测复合物的磁体，检测磁体上的可编码标记。
检测方法
在某些实施方案中，本发明提供了可编码标记的检测。在某些实施方案中，本发明提供了标记的计数。预见了几种标记检测和/或计数的方法，本领域技术人员应当理解，可以利用多种方法检测和/或计数本发明的可编码标记。
如上所述，计数可编码标记是指实际计数各个标记。在某些实施方案中，如果在同一过程中利用多种可不同检测的标记，则检测和/或计数另外包括鉴定标记的编码。
在某些实施方案中，利用一种流式细胞术检测可编码标记，例如荧光结合细胞分选仪(FACS)、LuminexTM检测装置，或为检测单个可编码标记分子而发展的类似技术。在某些实施方案中，可编码标记通过电泳分离，并在其电泳迁移期间或之后检测。电泳包括但不限于毛细管电泳和电场电泳。在某些实施方案中，该方法包括激发可编码标记的装置(例如一个非限制性例子，激光)以及计数可编码标记的扫描装置。在图9所示某些实施方案中，将可检测复合物释放到检测容器中，由PMT传感器读取居于容器底部的可检测复合物。在某些实施方案中，PMT传感器是带有10个500kHz数字仪的6单元PMT装置，在10分钟内扫描10×106小珠。
在某些实施方案中，其它检测方法包括静态检测方法。在某些实施方案中，该检测方法包括将可编码标记或复合物置于平板(非限制性实例)，利用一种或多种激发源(例如激光或不同波长)激发可编码标记，使扫描装置通过平板，以便计数可编码标记。在某些实施方案中，将平板在扫描装置的检测场中来回移动。在某些实施方案中，将可编码标记连接于平板或玻片。在某些实施方案中，照相机可以对整个场成像，将图像扫描，以便计数可编码标记。
根据某些实施方案，可能在样品中检测多种靶物质，并使用不同的可编码标记进行区分。在某些实施方案中，可编码标记可以使用两种或多种标记编码(例如在某些实施方案中，使用量子点、荧光团或染料)。在某些实施方案中，可能使用多种波长或颜色的标记，增加了可能的不同可编码标记的数目。例如，如果给予指定的可编码标记一个二元编码，则可以检测是否存在特定颜色的标记(″1″或″0″-故为二元编码)。如果只使用二元色，则有两个编码，一个带有标记，一个没有标记。如果使用两种二元色(例如红色和蓝色)，则可能有4个编码-(1)红色，(2)蓝色，(3)红色和蓝色，(4)无色(参见例如图3)。每一附加的颜色增加两个可能的编码数目。因此，如果使用10种颜色，则可能有1,024个二元编码。
在某些实施方案中，将可编码标记掺入或连接到小珠。在某些实施方案中，可编码标记可能直接连接到探针，而不掺入小珠中。
也可能使用强度作为区分可编码标记的因素。在某些实施方案中，使用包括相同数目的单波长标记的可编码标记，但具有不同探针的不同可编码标记具有不同强度水平的标记，可能实现强度变化。在某些实施方案中，使用包括相同数目的单发射光谱标记的可编码标记，但具有不同探针的不同可编码标记具有不同强度水平的标记，可能实现强度变化。在某些实施方案中，通过改变连接不同探针的不同可编码标记中相同波长标记的数目，可能实现强度变化。在某些实施方案中，通过改变连接不同探针的不同可编码标记中相同发射光谱标记的数目，可能实现强度变化。例如，在某些实施方案中，可以在不同可编码标记中使用相同波长的标记，并在每一不同组合中使用不同标记数目区分可编码标记。例如，如果给予可编码标记三元编码(每一标记颜色3个强度水平)，则一个颜色标记提供3个可能的编码-(1)无标记，(2)一个标记，(3)两个标记。如果使用两种颜色，则可能有9个三元编码(参见图3中非限制性实例)。6种颜色将提供729个三元编码。
另外，将可编码标记连接到探针组合的两种探针时(例如通过掺入小珠中)，可能的编码数目进一步增加(参见图4中非限制性实例)。例如，在二元编码中使用两种颜色，可能有16种不同的探针组合(4X4)。在三元编码中使用两种颜色，可能有81种不同的探针组合(9X9)。在二元编码中使用10种颜色，可能有1百万种不同的探针组合(1,024X1,024)。在三元编码中使用6种颜色，可能有500,000种以上不同的探针组合(729X729)。
此外，在某些实施方案中，标记例如量子点传递信号特别有效，因而可以检测可编码标记。在某些这类实施方案中，可能使用可编码标记检测样品中极少量的分子，而无需靶序列扩增。
在某些实施方案中，探针组合包含含有分离成分、第一种探针和第一种可编码标记的分离小珠，并包含含有第二种探针和第二种可编码标记的检测小珠。在某些这类实施方案中，第一种可编码标记具有第一种探针特异性的强度水平。在某些这类实施方案中，第二种可编码标记具有第二种探针特异性的强度水平。在某些实施方案中，探针组合的小珠包含相同波长的标记，但第一种可编码标记具有第一种探针特异性的强度水平，第二种可编码标记具有第二种探针特异性的强度水平。
在某些实施方案中，可编码标记包含至少1,000个标记，其中该标记具有预定的波长组合，使每一可编码标记可与其它可编码标记相区分。
在某些实施方案中，可编码标记可能包含2-1,000以上任何数目的标记。在某些实施方案中，使用可以检测可检测复合物中是否存在特定靶特异性探针的可编码标记。在某些实施方案中，使用可编码标记，以便检测到存在特定标记组合，证实存在某一特定可检测复合物。而且，检测到缺少这一特定标记组合，证实缺少某一特定可检测复合物。
在某些实施方案中，标记选自量子点、磷光体和荧光染料。
在利用第一种小珠和第二种小珠的某些实施方案中，探针组合的分离小珠和检测小珠都包含磁性颗粒。在某些这类实施方案中，将小珠拉长，一端包含磁性颗粒，另一端包含靶特异性探针。小珠另外包含沿小珠长度按特定顺序放置的标记(参见例如图14(a))。参见例如美国专利4,053,433，其中描述了带有特定顺序标记的拉长的聚合物。
在某些实施方案中，设计小珠中磁性颗粒的极性和定位，以便于排列可检测复合物。例如，在某些实施方案中，包含可检测复合物的容器在接近磁源的表面上包括凹槽(参见例如图14(b))。设计小珠，以便小珠中磁性颗粒的极性或定位使可检测复合物排列于凹槽中，每一可检测复合物的第一种小珠比该可检测复合物的第二种小珠更接近于凹槽的一端(参见例如图14(b))。然后可以通过定量可编码标记组合的特定顺序来定量可检测复合物。
在这类实施方案中，由于在排列的可检测复合物中，第一种小珠和第二种小珠上的相同可编码标记的顺序不同(见图14(c))，可以使用具有包含相同可编码标记的第一种小珠和第二种小珠的探针组合。
本发明典型实施方案
在其中靶物质是核酸序列的某些实施方案中，探针的序列特异性部分足够长，以便允许与靶序列中互补序列特异性退火。在某些实施方案中，序列特异性部分的长度为1 2-35个核苷酸。提供序列特异性退火的探针设计的详述特别参见Diffenbach和Dveksler，PCR Primer，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1995以及Kwok等人(Nucl.Acid Res.18：999-1005，1990)。
在某些实施方案中，本发明的探针组合包含与同一靶序列相邻杂交的第一种靶特异性探针和第二种靶特异性探针。每一探针组合中第一种靶特异性探针的序列特异性部分被设计为按序列特异性方式与靶序列下游区杂交(参见例如图1中探针A)。该探针组合中第二种靶特异性探针的序列特异性部分被设计为按序列特异性方式与靶序列上游区杂交(参见例如图1中探针Z)。探针的序列特异性部分足够长，以便合适时允许与靶序列中互补序列特异性退火。在合适条件下，只要包含合适的反应基团，例如而非限制，游离的3′-羟基或5′-磷酸基，相邻杂交的探针便可能连在一起，形成连接产物。
在某些实施方案中，可能使用两种不同的探针组合来定量两种相差一个或多个核苷酸的不同靶序列(参见例如图2)。根据本发明某些实施方案，设计探针组合，以便第一种靶特异性探针的序列特异性部分与下游靶区域杂交(参见例如图1中探针A以及图2中探针A和B)，并且第二种靶特异性探针的序列特异性部分与上游靶区域杂交(参见例如图1和图2中探针Z)。在某些实施方案中，与中央核苷酸互补的核苷酸碱基，″中央互补物″，存在于探针组合的第一种靶特异性探针或第二种靶特异性探针的近端(参见例如图1中探针A的3′端以及图2中探针A和B的3′端)。
探针组合的第一种和第二种靶特异性探针与合适的上游和下游靶区域杂交，中央互补物与靶序列中中央核苷酸碱基配对，杂交的第一种和第二种靶特异性探针可能连在一起，形成连接产物(参见例如图2(b)-(c))。然而，即使两个探针均与其各自靶区域完全杂交，中央核苷酸的错配碱基也干扰连接(参见例如图2(b)-(c))。因此，在某些实施方案中，可以区分相差仅仅单个核苷酸的高度相关序列。
例如，根据某些实施方案，使用下述两种不同的探针组合，可以区分双等位基因座的两个潜在的等位基因。每一探针组合中第一种靶特异性探针的中央互补物彼此不同，与两种不同的第一种靶特异性探针结合的可编码标记可检测地不同(参见例如图2(a)中探针A和B的可编码标记)。每一探针组合也可以包含相同的第二种靶特异性探针，与两种相同的第二种靶特异性探针结合的可编码标记相同(参见例如图2(a)中探针Z的可编码标记)。
可以将样品与两种不同的探针组合相组合。在某些实施方案中，每一探针组合中的探针之一可以另外包含分离成分。所有三个靶特异性探针均在合适条件下与靶序列杂交(参见例如图2(b))。然而，只有带有杂交的中央互补物的第一种靶特异性探针与杂交的第二种靶特异性探针连接(参见例如图2(c))。因此，如果样品中只存在一个等位基因，则只产生该靶物质的一个连接产物(参见例如图2(d)中的连接产物A-Z)。杂合个体的样品应形成两种连接产物(A-Z和B-Z)。
另外，在某些实施方案中，探针组合的第一种和第二种靶特异性探针的末端不包含中央互补物。相反，待检测的靶核苷酸位于第一种靶特异性探针或第二种靶特异性探针的序列特异性部分之中。带有与其对应靶区域完全互补的序列特异性部分的探针将在高严谨性条件下杂交。相反，序列特异性部分带有一个或多个错配碱基的探针将不与其对应靶区域杂交。第一种靶特异性探针和第二种靶特异性探针必须均与靶序列杂交，才能产生连接产物。待检测的核苷酸可能在中央或内部。
在某些实施方案中，探针组合中的第一种靶特异性探针和第二种靶特异性探针被设计为具有相似的解链温度(Tm)。
在某些实施方案中，当探针包括中央互补物时，包含靶中央核苷酸目标的中央互补物的探针的Tm比探针组合中不包含中央互补物的其它探针低约4-6℃。包含中央互补物的探针的Tm优选设计为接近连接温度。因此，在这类实施方案中，带有错配核苷酸的探针在连接温度下更容易与靶序列解离。在这类实施方案中，连接温度因而提供了区别例如靶物质中潜在多个等位基因的另一方法。
检测靶物质的某些典型实施方案
本发明涉及定量样品中靶物质的方法、试剂和试剂盒。在某些实施方案中，使用连接检测是否存在靶核酸序列。
在某些实施方案中，对于每一待检靶核酸序列，将包含至少一个第一种靶特异性探针和至少一个第二种靶特异性探针的探针组合与样品及可选连接剂混合，形成连接反应混合物。该至少一个第一种探针另外包含第一种可编码标记，其含有至少两个标记，并特异性针对第一种靶特异性探针。该至少一个第二种探针另外包含第二种可编码标记，含有至少两个标记，并特异性针对第二种靶特异性探针。第一种可编码标记可检测地不同于第二种可编码标记。
在某些实施方案中，每一探针组合中的第一种和第二种靶特异性探针被设计为与紧邻靶序列中央核苷酸的序列互补(参见例如图2(a)中探针A、B和Z)。探针组合的第一种靶特异性探针或第二种靶特异性探针任一而非全部包含中央互补物(参见例如图2(a)中探针A)。样品中存在靶序列时，第一种和第二种靶特异性探针将在合适条件下与靶物质邻近区域杂交(参见例如图2(b))。中央互补物在合适连接剂存在下碱基配对时，两个相邻杂交的探针可能连在一起，形成连接产物(参见例如图Fig 2(c))。
通过检测是否存在该连接产物，可以检测是否存在靶核酸序列。
在包括但不限于检测多个等位基因的某些实施方案中，连接反应混合物可能包含针对多等位基因靶基因座中每一潜在等位基因的不同探针组合。在某些实施方案中，例如而非限制，可能使用简单筛选分析，利用6种探针组合来检测个体中三个双等位基因座(例如L1、L2和L3)的存在。参见例如下表1。
表1
基因座 等位基因 探针组合-探针(标记)
L1 1 A(2红)，Z(2篮)
2 B(4红)，Z(2篮)
L2 1 C(2橙)，Y(4篮)
2 D(4橙)，Y(4篮)
L3 1 E(2黄)，X(2绿)
2 F(4黄)，X(2绿)
在这类实施方案中，使用两种不同的探针组合检测每个基因座是否存在每个等位基因。针对每个基因座的两种不同探针组合的两个第一种靶特异性探针，例如基因座L1的探针A和B，包含相同的上游序列特异性部分，但中央互补物不同。两种不同的探针A和B也包含不同的可编码标记。针对每个基因座的两种不同探针组合的两个第二种靶特异性探针，例如基因座L1的探针Z，包含相同的下游序列特异性部分。探针Z也包含相同的可编码标记。(在某些实施方案中，每个探针组合的探针之一可能另外包含分离成分，每个探针组合的另一探针可能不包含分离成分)。
因此，在表1所述实施方案中，使用3个探针A、B和C形成两种可能的L1连接产物，其中AZ是第一种L1等位基因的连接产物，BZ是第二种L1等位基因的连接产物。同样，使用探针C、D和Y形成两种可能的L2连接产物。同样，使用探针E、F和X形成两种可能的L3连接产物。
在连接相邻杂交的第一种和第二种靶特异性探针之后，可以通过检测是否存在针对每个等位基因的可编码标记的独特组合，来检测是否存在针对每个基因座的每个等位基因的连接产物。例如，可能检测下列可编码标记组合：(1)2红/2篮；(2)4橙/4篮；(3)2黄/2绿；(4)4黄/2绿。这一个体应确定为L1基因座等位基因1的纯合子、L2基因座等位基因2的纯合子以及L3基因座等位基因1和2的杂合子。
一般技术人员应当理解，在某些实施方案中，使用这些方法也可以区分位于多等位基因座的3个或多个等位基因。在某些实施方案中，还可以分析一个以上的基因座。
熟练技术人员应当理解，在某些实施方案中，探针可以被设计为在第一种靶特异性探针或第二种靶特异性探针的任何位置带有中央互补物。另外，在某些实施方案中，包含多个中央互补物的靶特异性探针属于本发明范围之内。
检测剪接变体
根据某些实施方案，本发明可能用于鉴定靶核酸序列的剪接变体。例如基因，即编码蛋白质的DNA，可能包含一系列称为外显子的编码区，由称为内含子的非编码区分散开。在剪接过程中，去除内含子，并列外显子，以致最终RNA分子，一般是信使RNA(mRNA)，包含连续编码序列。某些基因编码单个蛋白质或多肽，其它基因因可变剪接而编码多个蛋白质或多肽。
例如，基因可能包含5个外显子，各自由至少一个内含子分开，参见图5。如图5上部所示编码初级转录物的假定基因编码3种不同蛋白质，各由三种成熟mRNA之一编码，如图5下部所示。因可变剪接(alternate splicing)，外显子1可能与(a)外显子2a-外显子3、(b)外显子2b-外显子3或(c)外显子2c-外显子3并列，三种剪接选项如图5所述，产生三种不同形式的成熟mRNA。
大鼠肌肉蛋白质肌钙蛋白T只是可变剪接的一个例子。编码肌钙蛋白T的基因包含5个外显子(W、X、α、R和Z)，各自编码最终蛋白质的一个结构域。这5各外显子由内含子分开。通过肌钙蛋白T基因的可变剪接产生两种不同蛋白质，α型和β型。α型由包含外显子W、X、α和Z的mRNA翻译。β型由包含外显子W、X、β和Z的mRNA翻译。
在某些实施方案中，提供了使用针对每一不同剪接变体的不同探针组合，检测样品中至少一个靶核酸序列是否存在不同剪接变体的方法。
图6说明了鉴定剪接变体的某些非限制性实施方案。这类实施方案可以鉴定两种不同的剪接变体。一种剪接变体包括外显子1、外显子2和外显子4(剪接变体El E2E4)。另一剪接变体包括外显子1、外显子3和外显子4(剪接变体El E3E4)。
特异性针对剪接变体El E2E4的探针组合包含至少一个第一种靶特异性探针Q，其中包含与至少一部分外显子1杂交的序列特异性部分，例如可以与邻近外显子2或外显子3的外显子1末端杂交。至少一个第一种靶特异性探针另外包含第一种可编码标记。特异性针对剪接变体El E2E4的探针组合另外包含至少一个第二种靶特异性探针R，其中包含与至少一部分外显子2杂交的序列特异性部分，例如可以与邻近外显子1的外显子2末端杂交。特异性针对剪接变体El E2E4的探针组合，其至少一个第二种靶特异性探针另外包含可检测地与第一种可编码标记不同的第二种可编码标记。
特异性针对剪接变体El E3E4的探针组合包含至少一个第一种探针，其与特异性针对剪接变体El E2E4的探针组合的至少一个第一种探针相同。特异性针对剪接变体El E3E4的探针组合另外包含至少一个第二种特异性探针S，其中包含与至少一部分外显子3杂交的序列特异性部分，例如可以与邻近外显子1的外显子3末端杂交。特异性针对剪接变体El E3E4的探针组合的至少一个第二种探针另外包含第二种可编码标记，可检测地不同于第一种可检测标记，并在可检测地不同于特异性针对剪接变体El E2E4的探针组合的至少一个第二种探针第二种可检测标记。
在连接相邻杂交的第一种和第二种靶特异性探针之后，可以通过检测是否存在每个剪接变体的可编码标记的独特组合，来检测是否存在每个剪接变体的连接产物。例如，在图6所述某些方法中，如果检测到存在带有2个点和4个点组合的连接产物，则检测到样品中存在剪接变体El E2E4。如果不存在可编码标记的组合，则检测到样品中不存在剪接变体El E2E4。同样，在图6所述某些方法中，如果检测到存在带有2个点和6个点组合的连接产物，则检测到样品中存在剪接变体El E3E4。如果不存在可编码标记的组合，则检测到样品中不存在剪接变体El E3E4。
在某些实施方案中，至少一种靶核酸序列包含至少一种由RNA产生的互补DNA(cDNA)。在某些实施方案中，至少一种cDNA由至少一种信使RNA(mRNA)产生。在某些实施方案中，至少一种靶核酸序列包含存在于样品中的至少一种RNA靶序列。
利用可寻址(addressable)部分的方法
在某些实施方案中，利用独特的可特异性寻址的寡核苷酸或″可寻址部分″。可寻址部分是设计为与可寻址部分的互补物杂交的寡核苷酸序列。对于一对彼此互补的可寻址部分，其一称作可寻址部分，另一则称作互补的可寻址部分。
在某些实施方案中，该方法包括形成包含第一种探针、第二种探针、连接剂和样品的连接混合物，第一种探针包含第一种可寻址部分和第一种靶特异性部分，第二种探针包含第二种可寻址部分和第二种靶特异性部分，其中第一种和第二种靶特异性部分在靶序列上彼此相邻杂交时适于连在一起。如果样品中存在靶物质，则第一种和第二种探针的第一种和第二种靶特异性部分连在一起，形成连接产物。
图22说明了包括连接反应混合物的典型实施方案，该连接反应混合物包含：第一种探针12，其中包含第一种靶特异性部分14和第一种可寻址部分18；以及第二种探针20，其中包含第二种靶特异性部分22和第二种可寻址部分24。该探针的靶特异性部分与靶序列16杂交。将连接反应混合物进行连接反应，第一种和第二种探针的第一种和第二种靶特异性部分连在一起，形成连接产物。
在某些实施方案中，在形成包含第一种可寻址部分和第二种可寻址部分的任何连接产物之后，向连接混合物中加入小珠对。在某些实施方案中，小珠对包含第一种小珠和第二种小珠，第一种小珠包含第一种互补可寻址部分，其中第一种互补可寻址部分与第一种可寻址部分互补；第二种小珠包含第二种互补可寻址部分，其中第二种互补部分与第二种可寻址部分互补。连接产物的第一种可寻址部分与第一种小珠的第一种互补可寻址部分杂交，连接产物的第二种可寻址部分与第二种小珠的第二种互补可寻址部分杂交，形成包含第一种小珠、连接产物和第二种小珠的可检测复合物。在某些实施方案中，第一种小珠或第二种小珠或两种小珠可能是分离成分。在某些实施方案中，第一种小珠或第二种小珠或两种小珠可能包含可编码标记。
在某些实施方案中，与小珠结合的互补可寻址部分包括在发夹结构中。在某些实施方案中，发夹结构包含互补可寻址部分和锚定部分。在某些实施方案中，锚定部分在互补可寻址部分上游，锚定部分包含彼此互补的第一部分和第二部分。在某些实施方案中，发夹结构的锚定部分连接小珠。图23描述了发夹结构52和54的某些典型实施方案。
在某些实施方案中，发夹结构锚定部分的第一和第二部分彼此杂交，使锚定部分包括与互补可寻址部分相邻的一端以及折回到与互补可寻址部分相邻一端相对的游离端。参见例如图23。在某些实施方案中，连接产物的第一种可寻址部分和第二种可寻址部分分别与第一种互补可寻址部分和第二种互补可寻址部分杂交，包括在两个不同的发夹结构中，连接两个不同的小珠，形成可检测复合物。参见例如图23。在某些实施方案中，设计发夹结构，使锚定部分的游离端适合连接与发夹结构杂交的连接产物的相邻可寻址部分。参见例如图23。在某些实施方案中，将连接产物和发夹结构进行连接反应。在这类实施方案中，可检测复合物包含小珠以及与连接小珠的发夹结构相连的连接产物。
在某些实施方案中，在形成包含第一种可寻址部分和第二种可寻址部分的任何连接产物之后，向连接混合物中加入连接寡核苷酸对和小珠对。某些这类典型实施方案如图24所示。在某些实施方案中，小珠对包含含有第三种可寻址部分的第一种小珠以及含有第四种可寻址部分的第二种小珠。在这类实施方案中，连接的寡核苷酸对包含第一种连接寡核苷酸和第二种连接寡核苷酸。第一种连接寡核苷酸包含：与连接产物第一种可寻址部分互补的第一种互补可寻址部分、以及与第一种小珠的第三种可寻址部分互补的第三种互补可寻址部分。第二种连接寡核苷酸包含：与连接产物第二种可寻址部分互补的第二种互补可寻址部分、以及与第二种小珠的第四种可寻址部分互补的第四种互补可寻址部分。第一种、第二种、第三种和第四种特异性可寻址部分分别与第一种、第二种、第三种和第四种特异性可寻址部分杂交，形成包含连接产物和小珠的连接产物。在某些实施方案中，第一种小珠或第二种小珠或两个小珠可能是分离成分。在某些实施方案中，第一种小珠或第二种小珠或两个小珠可能包含可编码标记。
在某些实施方案中，设计连接寡核苷酸，以至于在第一种、第二种、第三种和第四种特异性可寻址部分分别与第一种、第二种、第三种和第四种特异性可寻址部分杂交之后，第一种和第三种可寻址部分的邻近末端适合连在一起，第二种和第四种可寻址部分的邻近末端适合连在一起。在某些实施方案中，将杂交的连接产物、连接寡核苷酸以及小珠的可寻址部分进行连接反应。在这类实施方案中，可检测复合物包含小珠以及与小珠的可寻址部分相连的连接产物。
在某些实施方案中，在形成包含第一种可寻址部分和第二种可寻址部分的任何连接产物之后，将连接产物与未杂交靶物质的过量探针相分离。在某些该类实施方案中，可能利用滤膜，设计为捕获靶物质而使未杂交的探针通过。由于连接产物与靶物质杂交，该连接产物也将被滤膜捕获。在某些实施方案中，去除未杂交靶物质的探针，连接产物继续进行。
在某些实施方案中，可以通过使连接产物与靶物质变性，将连接产物与靶物质分离。在某些实施方案中，然后可以破坏靶物质。例如，在靶物质是mRNA的某些实施方案中，可以加入RNA酶分解mRNA，而不破坏连接产物。
单一小珠分析
在某些实施方案中，可能使用两种分离成分和一种可编码标记进行靶物质检测。在某些实施方案中，该检测利用包含第一种寡核苷酸探针的探针组合，该探针包含第一种可寻址部分(Z1)和第一种靶特异性部分(TSO1)，如图25所示。在某些实施方案中，该探针组合另外包含第二种寡核苷酸探针，该探针包含第二种靶特异性部分(TSO2)、非特异性间隔部分(S)以及第一种分离成分，例如生物素分子，如图25所示。在某些实施方案中，在靶物质存在下，第一种靶特异性部分和第二种靶特异性部分与靶物质杂交，以便这两种靶特异性部分适合相连。因此，在某些实施方案中，如果存在靶分子，则两个相邻杂交的第一种和第二种连接探针可能连在一起，形成包含第一种和第二种靶特异性部分、第一种可寻址部分、间隔部分以及生物素分子的连接产物，如图25所示。
在某些实施方案中，该方法利用包含可编码标记的小珠，该可编码标记连接包含第二种可寻址部分(Z2)的一种或多种寡核苷酸。参见例如图26。在某些实施方案中，第二种可寻址部分Z2与第一种可寻址部分Z1互补，以致如果形成连接产物，则该探针组合形成可检测复合物，其中包含含有可编码标记的小珠、与第一种可寻址部分Z1杂交的第二种可寻址部分Z2、第一种和第二种靶特异性部分(TSO1和TSO2)、间隔部分(S)和生物素分子的，如图26所示。
在某些实施方案中，包含第二种可寻址部分Z2寡核苷酸共价连接包含可编码标记的小珠。在某些实施方案中，第二种可寻址部分Z2可能包含DNA、LNA、PNA、2′-O-甲基核酸或任何其它探针物质。在某些实施方案中，将第一种和第二种可寻址部分(Z1和Z2)的序列优化为特定解链温度或杂交结合强度。
在某些实施方案中，第二种可寻址部分Z2是与包含可编码标记的小珠相连的发夹结构的一部分。参见例如图29。在图29所述某些实施方案中，该发夹结构是，如果第一种可寻址部分Z1与第二种可寻址部分Z2杂交，则第一种可寻址部分适于连接发夹结构的3′-端。在某些实施方案中，该连接产物连接发夹结构的3′-端，形成可检测复合物。
在某些实施方案中，包含可编码标记的小珠是用磁性物质例如铁氧体包埋的聚苯乙烯小珠，使这种小珠具有磁性，并比某些缓冲液密度大。在某些实施方案中，可编码标记可能是包埋于或连接小珠的发射光子的颗粒。在某些实施方案中，发射光子的颗粒可能产生独特波长的信号，而且每种小珠的颗粒数目可能不同，使不同的信号强度和波长增加独特小珠的数目。
在某些实施方案中，连接反应之后，将混合物加入包含可编码标记的容器中，如图27(A)所示。在某些实施方案中，在将混合物加入包含可编码标记的容器之前、连接反应之后，可能利用从3′磷酸末端开始分解探针的化学方法，充分去除未处于连接产物中的第一种寡核苷酸探针。在这类实施方案中，连接产物因生物素位于3′-端而不被分解。在某些实施方案中，可以利用酶例如非限制性例子RNase进行消化，充分去除靶物质。在某些实施方案中，可能使用滤膜去除RNA或DNA靶物质。
在图27(B)所示某些实施方案中，将可检测复合物暴露于包被链亲和素的磁体，小珠被吸引到磁体。在图27(C)所示某些实施方案中，将磁体关闭，带有生物素分子的可检测复合物仍连接链亲和素包被的磁体，而未处于可检测复合物中的包含可编码标记的小珠则从链亲和素包被的磁体上脱落。在某些实施方案中，可能将第二个磁体放在容器底部，以便第二个磁体从链亲和素包被的磁体上去除未结合的小珠，而不去除通过生物素分子结合到链亲和素包被的磁体上的处于可检测复合物中的小珠。在图27(D)和27(E)所示某些实施方案中，重复该过程，开启磁体，使可检测复合物附着到链亲和素表面，关闭磁体，使未处于可检测复合物中的包含可编码标记的小珠脱落。在图27(F)所示某些实施方案中，然后移开链亲和素包被的磁体连同结合的可检测复合物。在某些实施方案中，可能使用照相机评估可编码标记，以计数和鉴定连在磁体上的可检测复合物。然后利用可检测复合物的数目定量样品中的靶分子。
在某些实施方案中，可能使用多个微孔，每个微孔包含指定数目的带有不同可编码标记和不同可寻址部分的不同小珠的相同组合。在某些实施方案中，每个微孔包括一组第一种寡核苷酸探针，其具有与不同小珠的可寻址部分互补的不同可寻址部分。在分开的微孔中，第一种寡核苷酸探针可能具有与不同靶物质互补的不同靶特异性部分。在某些这类实施方案中，可能在利用不同小珠的相同组合的微孔中进行不同的多重分析。在某些实施方案中，如果每孔多重分析的数目是1,000，则1,000种不同的小珠能够在384孔板中进行384,000种不同的分析。
定量靶物质
在本发明某些实施方案中，可以定量样品中一种或多种靶物质，例如靶核酸序列的量。定量可以应用于上述有关检测是否存在靶物质的任何方法中。例如而非限制，可以定量样品中不同的特定核酸序列的数目，包括但不限于位于一个或多个基因座的各种等位基因的数目、特定单核苷酸多态性的数目以及特定剪接变体的数目。
在某些实施方案中，为定量样品中特定靶核酸序列的数量，通过确定连接产物可编码标记的特定组合的数量来确定样品中特定连接产物的数量。在某些这类实施方案中，可能确定生物样品中特定靶序列的数量，而无需对生物样品进行扩增反应例如聚合酶链式反应。
同样，在利用量子点作为标记的某些实施方案中，测定的量子点组合混合物的数目与样品中连接产物的实际数目直接相关。因此，在这类实施方案中，为评价样品中连接产物的数目，无需将荧光信号的强度水平与对照信号作比较。
定量核酸序列可能具有许多有益的应用。生物的遗传组成由该生物基因组中包含的基因决定。基因由编码制备蛋白质所需信息的长链或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物组成。生物的性质、能力和特征通常与该生物产生或未产生的蛋白质的类型和数量有关。
蛋白质可如下由基因产生。首先，通过已知″转录″的过程将编码蛋白质例如蛋白质″X″的基因的DNA转换为核糖核酸(RNA)。在转录过程中，产生基因的单链互补RNA拷贝。其次，该RNA拷贝，称为蛋白质X信使RNA(mRNA)，由细胞的生化机器用来生成蛋白质X，此过程称为″翻译″。基本上，细胞的蛋白质生产机器结合mRNA、″阅读″RNA密码、将其″翻译″为蛋白质X的氨基酸序列。总之，DNA转录产生mRNA，后者翻译产生蛋白质。
细胞生成的蛋白质X的数量通常主要依赖于细胞内存在的蛋白质X mRNA的数量。细胞内蛋白质X mRNA的数量至少部分取决于基因X表达的程度。特定基因是否表达，如果表达，其水平如何，可能对生物具有显著影响。
例如，蛋白质胰岛素特别调节血糖水平。个体产生胰岛素的数量可以决定该个体健康与否。胰岛素缺陷导致一种可能致命的疾病，糖尿病。糖尿病个体一般胰岛素mRNA水平低，因而生成低水平的胰岛素，而健康个体一般胰岛素mRNA水平较高，生成正常水平的胰岛素。
典型因基因异常低表达而致的另一人类疾病是Tay-Sachs病。Tay-Sachs病患儿缺少或缺陷鞘脂分解所需蛋白质。这些儿童因而具有异常高水平的鞘脂，引起神经系统病症，可能导致死亡。
鉴定和检测由基因过表达或低表达所致其它遗传疾病/病症很有用处。另外，癌症及某些其它已知疾病或病症可通过某些基因的过表达或低表达进行检测，或与某些基因的过表达或低表达有关。例如，前列腺癌男性一般产生异常高水平的前列腺特异性抗原(PSA)；据信来自肿瘤抑制基因的蛋白质在多种类型癌症的发展中具有重要作用。
在某些实施方案中，利用核酸技术，微量的生物样品一般可以提供足量物质，来同时检测多种类型疾病、病症和易病性(predisposition)。另外，许多其它情况将会需要定量细胞或生物体中特定靶核酸，例如mRNA，该过程有时被称作″基因表达模式″。已知例如特定细胞类型、或组织、或个体中特定靶核酸的数量时，可能在某些病例中开始汇集该细胞类型、组织或个体的基因表达模式。将个体的基因表达模式与已知的表达模式相比较，可能允许诊断某些病例中的某些疾病或病症。通过评价某些病例的基因表达模式，也可能鉴定未来发展某些疾病或病症的易病性或易感性。基因表达模式分析也可能特别用于某些病例的遗传咨询和法医鉴定。在某些实施方案中，可能使用根据此处公开的本发明方法获得的定量信息，来汇集一种或多种靶核酸序列的基因表达模式。
在某些实施方案中，已知某一样品中若干靶核酸序列的基因表达水平时，可以汇集该样品的基因表达模式，并与其它样品相比较。例如而非限制，样品可能得自相同细胞群体的两等份细胞，其中一等份在化学化合物或药物存在下生长，另一等份则不然。通过比较在或不在药物存在下生长的细胞的基因表达模式，可能确定该药物对特定靶基因表达的作用。
蛋白质检测
在本发明某些实施方案中，提供了检测样品中是否存在至少两种靶蛋白质的方法。在某些实施方案中，该方法包括混合样品和特异性针对至少两种靶蛋白质中每一种的不同探针组合，每一探针组合包含(a)至少一种分离小珠，其包含磁性颗粒、含有至少两种标记的第一种可编码标记以及第一种靶特异性探针，其中第一种可编码标记特异性针对第一种靶特异性探针，以及(b)至少一种检测小珠，其包含含有至少两种标记的第二种可编码标记以及第二种靶特异性探针，其中第二种可编码标记特异性针对第二种靶特异性探针。在某些实施方案中，第一种和第二种靶特异性探针结合相同靶蛋白质的不同部分。在某些实施方案中，如果样品中存在靶蛋白质，则形成可检测复合物。在某些实施方案中，该方法另外包括通过计数至少两种靶蛋白质各自的可检测复合物，来检测样品中是否存在至少两种不同蛋白质。
在某些实施方案中，靶特异性探针是抗体或抗体片段。
例如，在某些实施方案中，第一种靶特异性探针是可以特异性结合特定靶蛋白质第一部分的第一种抗体，第二种靶特异性探针是可以特异性结合特定靶蛋白质不同的第二部分的第二种抗体。某些这类实施方案制备抗体的一个非限制性实例是，利用靶蛋白质的一个片段产生第一种抗体，利用该靶蛋白质的不同片段产生第二种抗体。第一种抗体连接磁性分离成分。第二种抗体连接可编码标记。
在某些实施方案中，在靶蛋白质存在下，第一种抗体和第二种抗体特异性结合靶蛋白质的不同部分，以便第一种抗体或第二种抗体与蛋白质的结合不抑制另一抗体结合该蛋白质。如果存在靶蛋白质，则形成可检测复合物。在某些实施方案中，可能使用上述分离技术将可检测复合物与未结合抗体分离。通过计数可编码标记的独特组合，检测是否存在特定可检测复合物，来表明样品中是否存在靶蛋白质。在某些实施方案中，可能通过测定可检测复合物的数量，来测定样品中靶蛋白质的数量。
试剂盒的某些实施方案
在某些实施方案中，提供了检测样品中靶核酸序列的试剂盒。在某些实施方案中，该试剂盒包含每种靶核酸序列特异性的不同小珠组合。在某些实施方案中，每种不同小珠组合包含(a)至少一种分离小珠，其包含磁性颗粒、包含两种或多种标记的第一种可编码标记以及第一种靶特异性探针，其中第一种可编码标记特异性针对第一种靶特异性探针，以及(b)至少一种检测小珠，其包含含有一组两种或多种标记的第二种可编码标记以及第二种靶特异性探针，其中第二种可编码标记特异性针对第二种靶特异性探针；并且其中第一种可编码标记在检测上不同于第二种可编码标记。在某些实施方案中，在互补靶序列上彼此相邻杂交时，每一组合中的靶特异性探针适合于连在一起。
在某些实施方案中，该试剂盒包含连接剂。在某些实施方案中，该连接剂是连接酶。在某些实施方案中，该连接剂是热稳定性连接酶。在某些实施方案中，该热稳定性连接酶选自Tth连接酶、Taq连接酶和Pfu连接酶中的至少一种。
实施例
以下实施例说明本发明的某些实施方案，无论如何不限制本发明的范围。
实施例1
以下实验显示，在寡核苷酸连接分析(OLA)中，连接小珠的探针与靶核酸序列杂交并连接。连接小珠的探针所产生的连接产物数量与未连接小珠的相同探针所产生的连接产物数量相比较。
将磁性小珠连接到寡核苷酸探针。包被链亲和素的磁性小珠得自Seradyne(Sera-Mag.，Lot No.113564)。如下将生物素连接到寡核苷酸探针(靶特异性寡核苷酸(TSO探针))。生物素标记的寡核苷酸探针(靶特异性寡核苷酸(TSO探针))由Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)合成。设计TSO探针与靶核酸序列杂交。下表2给出了TSO探针的序列。将约100μl链亲和素包被的磁性小珠(1mg/ml)加入0.2ml管的100μl生物素-TSO探针(10μM)中。将混合物在4℃温育60分钟，使生物素结合链亲和素。
表2
TSO(SEQ ID1) TAC GGA TGC TCA CTA CGC TAG GTT TTT TTT TTTTTT TTT T
pTSO (SEQID 2) TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA TGC CTC GTG ACT GCTACC A
合成的靶序列(SEQ ID 3) AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCT AGC GTA GTG AGCATC CGT ATG GTA GCA GTC ACG AGG CAT AAA AAAAAAAAAAAAAAAAA
399-Taqman(SEQ ID 4) TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTATGC CTC GTG ACT GCTACC ATA CGG ATG CTC ACT ACG CTA GGT TTT TTTTTT TTT TTT TT
然后清洗磁性小珠，如下从小珠中去除未结合的TSO探针。将40μl PBS缓冲液加入每个0.2ml管的20μl混合物中。PBS缓冲液包含：
KPO4(二代的)1.82g/l
NaPO4(单代的)0.22g/l
NaCl    8.76g/l
调节到pH 7.4。
将样品短暂涡旋，然后置于磁体顶部4分钟。4分钟以后，从每个0.2ml管中取出40μl，而0.2ml管仍留在磁体上。将每管的40μl上清保存在1ml管中，供以后分析。磁性分离及清洗再重复3次，总计4次。
第二种寡核苷酸探针(pTSO探针)被设计为与邻近TSO探针序列互补区的靶核酸序列杂交。TSO和pTSO探针与靶核酸序列杂交时，pTSO探针与TSO探针相邻。TSO和pTSO探针均杂交到靶核酸序列时，它们可以在连接反应中连在一起。生物素标记的pTSO探针由Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)合成。表2给出了pTSO探针的序列。
包被链亲和素的荧光小珠得自Bangs Laboratories(Fisher，IN)。
进行了连接反应(OLA)。将连接TSO探针的磁性小珠、荧光标记的链亲和素包被小珠、连接生物素的pTSO探针、连接酶以及每一反应中不同浓度的合成靶核酸混合，制备11种不同反应。表2给出了合成靶物质序列。在11种反应的每一反应中，合成靶核酸序列的浓度由10nM低至10aM，按数量级下降(实际浓度参见图15)。有一个不含合成靶核酸序列的对照。
反应配方如下：
2μl 10x Taq连接酶缓冲液
2μl生物素标记的pTSO探针(100nM)
2μl荧光小珠(100μg/ml)
16μl连接TSO的磁性小珠(1mg/ml)
0.5μl连接酶(40U/μl)
2μl合成的靶物质(10nM-10aM)
在ABI 9700热循环仪上，将连接反应温育95℃、15秒然后冷却到50℃、20分钟的10个循环。Taq连接酶和连接酶缓冲液得自NewEngland Biolabs(Catalog No.M0208)。
连接反应之后，清洗磁性小珠，去除任何未连接的荧光小珠。将40μl PBS缓冲液加入每个0.2ml管的20μl混合物中。将样品短暂涡旋，然后置于磁体顶部4分钟。4分钟以后，从每个0.2ml管中取出40μl，而0.2ml管仍留在磁体上。将每管中40μl上清保存在1ml管中，供以后分析。磁性分离及清洗再重复3次，总计4次。
除了包括小珠的11种OLA反应之外，使用不含小珠的相同TSO和pTSO探针、相同连接酶、相同连接酶缓冲液以及相同浓度靶核酸序列，进行不含小珠的另外11种OLA反应。这些反应的配方如下：
2μl 10x连接酶缓冲液
11.5μl水
2μl生物素标记的TSO探针(100nM)
2μl生物素标记的pTSO探针(100nM)
0.5μl连接酶(40U/μl)
2μl合成的靶物质(10nM-10aM)
然后利用磁体从反应中取出每一不同浓度反应的磁性小珠。如上所述清洗小珠，并转移到每一不同反应分开的检测容器中。检测容器是Petroff-Hausser计数管(VWR，catalog No.15170-048)。然后利用ABI 7700(Applied Biosystems，Foster City，CA)检测连接产物的荧光小珠。
图16显示从5个反应中观察到的小珠对(包含荧光小珠)的5张图片，以及1张只利用可见光学显微镜观察的磁性小珠图片。每张图的″视野″代表平均体积约0.5μl的连接产物。图16表明，荧光小珠已经成功与磁性小珠配对、清洗并转移。
将含有连接探针的小珠的OLA反应与不含连接探针小珠的每个对应靶浓度的OLA反应作比较。利用TaqmanTM分析来测量连接产物。
399-Taqman探针由Applied Biosystems(Foster City，California)提供。表2给出了探针序列。TaqmanTM探针及其使用方法描述于例如美国专利5,538,848。TaqmanTM探针通过DNA聚合酶的5′核酸酶活性起作用。如果存在靶物质，则TaqmanTM探针与靶核酸序列杂交。Taqman探针的一端具有荧光分子，另一端具有淬灭分子。该探针连接的荧光分子和淬灭分子完整时，没有荧光信号。
加入也与靶核酸序列杂交的引物。然后在引物处启动向引物末端添加核苷酸的聚合反应。靶核酸序列上的TaqmanTM探针由于在DNA聚合过程中发生链的替换而在聚合反应期间断裂。断裂使荧光分子脱离了探针上淬灭分子的存在，导致荧光分子发出荧光。因此，检测到荧光表明存在与聚合酶反应有关的特定靶核酸序列。
此外，荧光水平与样品中靶核酸序列的数量相关(荧光水平越高，靶核酸序列的数量越大)。可以计算指定样品荧光水平的Ct值。Ct值与荧光水平负相关。换言之，Ct值越低，荧光水平越高。
对22种不同OLA反应中每个产物的TaqmanTM分析，配方如下：
1μl 399-TaqmanTM探针(5μM)
2.5μl 116/115引物(10μM)
6.5μl水
12.5μl 2x Master Mix
来自先前OLA反应的2.5μl样品
TaqmanTM反应在95℃温育10分钟，然后进入循环，包括第一步95℃、15秒和第二步60℃、1分钟。在一定数目的循环之后，出现信号。记录信号出现前反应经历的循环数目，称为Ct值。表2给出了TaqmanTM反应的116/115引物序列。Master Mix得自AppliedBiosystems(Cat.No.4318739)。
将存在小珠的每个OLA反应产物的Taqman分析与不含小珠的对应靶核酸序列浓度的OLA反应产物作比较。结果如图15所示。图15中Taqman分析显示了溶液中探针和连接小珠的探针的杂交(少于1小时)和靶敏感性(大于fM)。检测是在反应时间约1小时进行。
实施例2
进行下列实验，以测定在使用不同数量的合成靶分子时检测到的小珠对数目。
聚苯乙烯小珠得自Bangs(No.PA05N/2057)。小珠直径约3.1μM，表面带有105位点/μM2密度的-NH2基(根据厂商数据)，密度为1.073g/cm3。
如实施例1所述，TSO探针被设计为与靶核酸序列杂交。表2给出了TSO探针的序列。按照下列程序，将TSO探针的5′端连接Bangs小珠胺基，产生TSO-小珠。
如前所述，在10.0ml PBS中将小珠(1.0ml，100 mg/ml)清洗两次。第二次清洗之后，将小珠重悬于10.0ml戊二醛溶液(10％戊二醛的PBS)中。让小珠在室温下反应2小时，连续搅拌。然后如前所述在PBS中清洗小珠，重悬于5ml PBS。将偶联胺的TSO探针置于5ml PBS中，与包含小珠的5ml溶液混合。让混合物在室温下反应2-4小时，连续搅拌。然后再次清洗小珠，重悬于包含0.1％Tween-20的10mlPBS中。将重悬的小珠温育30分钟。然后再次清洗小珠，重悬于包含0.1％Tween-20的10ml PBS储液中。
如上所述，第二种寡核苷酸探针(pTSO探针)被设计为与邻近TSO探针序列互补区的靶核酸序列杂交。TSO和pTSO探针与靶核酸序列杂交时，pTSO探针与TSO探针相邻。TSO和pTSO探针均杂交到靶核酸序列时，它们可以在连接反应中连在一起。生物素标记的pTSO探针合成并得自Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)。表2给出了pTSO序列。
进行了寡核苷酸连接分析反应(OLA)。将TSO-小珠与生物素标记的pTSO、连接酶以及不同浓度的合成靶序列混合，制备8种不同反应。反应混合物如下：
2μl10x连接酶缓冲液
2μl生物素标记的pTSO(100nM)
2μl TSO-小珠
14μl ddH2O
0.25μl连接酶(40U/μl)
2μl合成靶序列(1nM降至1fM的不同浓度，外加一个不含靶序列的反应)
在ABI 9700热循环仪上，将连接反应温育95℃、15秒然后冷却到50℃、20分钟的10个循环。Taq连接酶和连接酶缓冲液得自NewEngland Biolabs(Catalog No.M0208)。
链亲和素包被的磁性小珠得自Seradyne(Sera-Mag.，Lot No.113564)，由包含40％磁铁矿(Fe3O4)的聚苯乙烯组成，直径约1.0μM，密度为1.5g/cm2。链亲和素以每小珠107位点的密度位于小珠表面。
在各个反应中，将20μl 8种不同OLA反应物之一加入20μl链亲和素包被的小珠(106小珠/μl)。这些混合物在4℃温育1小时。
温育之后，将每一40μl OLA链亲和素包被小珠混合物短暂涡旋，然后在VWR″Aquasonic″超声清洗仪功率水平9处超声10秒。超声之后，将每种混合物20μl置于各个0.2ml管中，然后进行磁性分离和清洗。
磁性分离和清洗的过程如下。将40μl PBS缓冲液加入每个0.2ml管的20μl混合物中。将样品短暂涡旋，然后置于磁体顶部4分钟。4分钟以后，从每个0.2ml管中取出40μl，而0.2ml管仍留在磁体上。将每管的40μl上清保存在1ml管中，供以后分析。磁性分离及清洗再重复3次，总计4次。
磁性分离及清洗以后，将收集在1ml管中的每个上清离心5分钟。
在磁性分离及清洗以后，将8种不同OLA反应中每个留在0.2ml管中的剩余部分进行TaqmanTM分析，以确定每一反应中相连小珠对的数目。此外，对1ml管中每种上清的一部分进行TaqmanTM分析，以确定多少小珠对未通过磁性分离过程从清洗缓冲液中分离。
399-Taqman探针由Applied Biosystems(Foster City，California)提供。表2给出了探针序列。一般而言，TaqmanTM探针及其使用方法描述于例如美国专利5,538,848。TaqmanTM探针通过DNA聚合酶的5′核酸酶活性起作用。如果存在靶物质，则TaqmanTM探针与靶核酸序列杂交。Taqman探针的一端具有荧光分子，另一端具有淬灭分子。该探针连接的荧光分子和淬灭分子完整时，没有荧光信号。
加入也与靶核酸序列杂交的引物。然后在引物处启动向引物末端添加核苷酸的聚合反应。靶核酸序列上的TaqmanTM探针由于在DNA聚合过程中发生链的替换而在聚合反应期间断裂。断裂使荧光分子脱离了探针上淬灭分子的存在，导致荧光分子发出荧光。因此，检测到荧光表明存在与聚合酶反应有关的特定靶核酸序列。
此外，荧光水平与样品中靶核酸序列的数量相关(荧光水平越高，靶核酸序列的数量越大)。可以计算指定样品荧光水平的Ct值。Ct值与荧光水平负相关。换言之，Ct值越低，荧光水平越高。
对8种不同OLA反应以及8种保存上清中每个产物的TaqmanTM分析，配方如下：
1μl 399-TaqmanTM探针(5μM)
2.5μl 116/115引物(10μM)
6.5μl水
12.5μl 2x Master Mix
2.5μl来自先前OLA反应的样品
TaqmanTM反应在95℃温育10分钟，然后进入循环，其包含第一步95℃、15秒和第二步60℃、1分钟。表2给出了TaqmanTM反应的116/115引物序列。Master Mix得自Applied Biosystems(Cat.No.4318739)。
此外，将来自每个反应和每个收集上清的小珠对部分分别铺在网格上。目视检查网格，以便计算每个上清和每个反应中的小珠对的总数。
TaqmanTM分析和目视检查的结果如图17和表3、4和5所示。
目视检查测定的每个反应中的小珠对和小珠数目
表3
靶浓度   靶数目 每格小珠对  小珠对总数  ％配对/靶物质  每格未配对小珠
100μM   1.2×10<sup>9</sup> 191  76400  0.0063  1
10μM   1.2×10<sup>8</sup> 208  83200  0.07  0
1μM   1.2×10<sup>7</sup> 150  60000  0.50  20
100fM   1.2×10<sup>6</sup> 85  34000  2.8  40
10fM   1.2×10<sup>5</sup> 11  4400  3.7  7
1fM   1.2×10<sup>4</sup> 4  1600  13  5
100aM  1.2×10<sup>3</sup>  4  1600  133  3
0  0  3  1200  NA  9
表3显示在每个反应的网格中计数的小珠对总数，以及计算的每个反应中磁性分离的小珠对数目，以网格中放置的反应物质百分比表示。还显示计算的样品中存在的每个靶分子产生的小珠对的百分比，以及未掺入小珠对的小珠数目。
由Taqman分析测定的成功连接的计算数
表4
靶浓度 分离前Ct 分离前产量(fM) 分离前连接数 分离前每个靶的连接％ 分离后Ct 分离后产量(fM)
100pM 16.35 10157 1.2×10<sup>8</sup> 10 16.66 7917.0
10pM 15.28 23579 2.8×10<sup>8</sup> 236 15.9 14412.9
1pM 17.17 5328.8 6.4×10<sup>7</sup> 533 17.28 4870.5
100fM 20.43 407.2 4.9×10<sup>6</sup> 407 20.98 264.8
10fM 22.65 70.6 8.5×10<sup>5</sup> 709 25.92 5.4
1fM 23.71 30.8 3.7×10<sup>5</sup> 3078 27.86 1.2
100aM 23.99 24.6 3.0×10<sup>5</sup> 24560 29.43 0.3
0 NA NA 28.63 0.6
表4显示由Taqman分析测定的连接产物的计算产量。表4显示磁性分离过程前后存在的连接产物计算浓度和数目，以及样品中每个靶物质产生的连接的计算百分比。
通过Taqman分析的分离后连接数目
表5
靶浓度 分离后连接数 分离后连接％
100pM 9.5×10<sup>7</sup> 78
10pM 1.7×10<sup>8</sup> 61
1pM  5.9×10<sup>7</sup> 91
 100fM   3.2×10<sup>6</sup>  65
 10fM   6.5×10<sup>4</sup>  8
 1fM   1.4×10<sup>4</sup>  4
 100aM   4.1×10<sup>3</sup>  1
 0   7.7×10<sup>3</sup>  NA
表5显示分离过程之后每个反应中存在的连接产物的计算数。表5还显示利用磁性分离过程从清洗缓冲液及其它反应物中分离的、每个OLA反应中产生的连接产物的计算百分比。由Taqman分析测定连接产物的数目。
实施例3
直径约5.6μM的编码聚苯乙烯小珠购自Luminex(LuminexCorp.，Austin，TX)。所购小珠已被掺入两种颜色染料，并具有不同的染料强度，产生可由Luminex 100流式细胞仪检测的独特光学编码。利用Luminex手册中描述的NH2酯化学，将寡核苷酸连到小珠表面。在Luminex小珠的胺基和连接的寡核苷酸5′-端之间包括一个聚乙二醇(PEG)接头。寡核苷酸包含20个碱基的引物序列和20个碱基长的序列(称为可寻址部分)，为在特定温度下具有最小交叉反应性的特异性杂交而设计。引物序列位于PEG接头和可寻址部分之间。连接寡核苷酸之后，如以上实施例1所述，利用含0.1％Tween-20的pH7.4磷酸缓冲盐水PBS清洗小珠4次，以便去除未共价结合小珠的寡核苷酸。在50-65℃清洗，持续20分钟。将连接两种不同编码小珠的、带有两种不同可寻址部分的两种不同寡核苷酸的序列命名为Z1和Z2，如下表6所示。序列Z1和Z2的可寻址部分由黑体显示。
表6
 Z1(SEQ ID5) NH<sub>2</sub>-PEG-GCTGATGCTACTGGATCGCT ACCGTGACCCTTCCGA
 Z2(SEQ ID6) NH<sub>2</sub>-PEG-GCTTGCCTGCTCGACTTAGAAATCGGTCTCGTCCTTCA
 ASO1(SEQID 7) p-GCGTAATCGTTGCTTCATAG CCTGGCAGTAAATTCTA G
 ASO2(SEQID 8) p-ACAGCAGTGAGTCTTTAGG  CCTGGCAGTAAATTCTA C
 Z3(SEQ ID9) CTATGAAGCAACGATTACGC  TCGGAAGGGTCACGGT
 Z4(SEQ ID10) CCTAAAGACTCACTGCTGT TGAAGGACGAGACCGATT
 LSO(SEQ ID11) p-CTCAACCTTACTTGAGGC  TGGTAGCAGTCACGAGGCAT-PEG-BIO
使用一组第一种Luminex小珠(B1)和一组第二种Luminex小珠(B2)(每组10,000个小珠)。第一种小珠(B1)包含第一种可编码标记和寡核苷酸Z1。第二种小珠(B2)包含第二种可编码标记和寡核苷酸Z2。
如下使用连接探针。两种探针是等位基因特异性寡聚物(oligo)(ASO1和ASO2，如表6所示)，其包含与包含特定单核苷酸多态性(SNP)的靶序列互补的靶特异性部分。ASO设计带有与位于探针3′端的SNP互补的碱基。因此，ASO1和ASO2的3′端具有不同碱基。
ASO1在靶特异性部分的5′包含可寻址部分。ASO2在靶特异性部分的5′包含不同的可寻址部分。两种ASO均为40个碱基长。ASO3′端的20个碱基是靶特异性部分，而5′端是可寻址部分。ASO1和ASO2的可寻址部分在表6中以黑体显示。
也提供了基因座特异性寡聚物(LSO)。LSO的序列如表6所示。LSO包含与靶序列互补的靶特异性部分，该靶序列邻近与ASO的靶特异性部分互补的靶序列部分，以致当LSO和ASO1或ASO2与靶序列杂交时，适合连在一起。LSO具有利用PEG接头连接到3′端的生物素分子。该PEG接头排在最后的3′核苷酸和生物素分子之间。LSO长度为40个碱基。LSO 5′端的20个碱基是靶特异性部分，而LSO 3′端的20个碱基与特定Taqman引物互补。
合成模板Z3包含与小珠B1上寡核苷酸Z1的可寻址部分互补的3′端序列，并包含与ASO1的可寻址部分互补的5′端序列，以致在与合成模板Z3杂交时，ASO1和寡核苷酸Z1适合相连。
合成模板Z4包含与小珠B2上寡核苷酸Z2的可寻址部分互补的3′端序列，并包含与ASO2的可寻址部分互补的5′端序列，以致在与合成模板Z4杂交时，ASO2和寡核苷酸Z2适合相连。
靶序列是在100℃加热30分钟的基因组DNA。已知靶序列(通过其它方法证实)包含与ASO1互补、但不与ASO2互补的单核苷酸多态性(SNP)。
连接反应的体积是6.75μl。反应混合物如下：
0.5μl 10x连接酶缓冲液
0.5μl的100nM ASO1探针(3×1010探针)
0.5μl的100nM ASO2探针(3×1010探针)
0.5μl的100nM LSO探针(3×1010探针)
0.5μl的10nM浓度模板Z3(3×109分子)
0.5μl的10nM浓度模板Z4(3×109分子)
1μl溶液B1(10,000小珠)
1μl溶液B2(10,000小珠)
0.25μl连接酶(40U/μl)
0.5μl加热的gDNA(100ng/μl)
Taq连接酶和10X连接酶缓冲液购自New England Biolabs(Catalog No.M0208)。在加入反应混合物之前，将小珠超声10秒。反应混合物进行温度循环，从50℃、5分钟开始，ASO和LSO探针在靶序列上杂交和连接，Z1或Z2寡核苷酸在合成模板上连接ASO探针。然后提高温度到85℃、15秒，以便将探针与靶序列变性，并将合成模板与探针和寡核苷酸变性。此循环重复100次。温度循环完成后，将小珠在0.1％Tween-20 PBS缓冲液中85℃清洗3次。
连接反应后，将约10×106、1μm直径的链亲和素包被的磁性小珠与反应混合物混合。小珠购自Seradyn Inc.，由带有40％磁铁矿(Fe3O4)的聚苯乙烯组成，密度为1.5g/cm3，并具有链亲和素包被(105-106链亲和素分子/小珠)。使用前利用0.1％Tween-20和0.1％BSA的PBS缓冲液将磁性小珠清洗5次，并超声15秒。用于使磁性小珠结合生物素分子的结合缓冲液是20μl体积含0.1％Tween-20的PBS (10μl来自连接反应的反应混合物，10μl磁性小珠)。20μl体积的磁性小珠和来自连接反应的反应混合物形成结合混合物，在管中室温(25℃)温育2小时，不断摇动小管。如果磁性小珠上的链亲和素结合到LSO上的生物素，则形成小珠对。
结合混合物温育后超声10秒。将结合混合物吸到位于第二只管中的第一只管，第二只管充满6X SSC(90mM柠檬酸钠、0.9 M NaCl，pH7.0)和0.1％牛血清白蛋白(New England Biolabs)的高密度溶液(～1.3g/cm3)。第一只管没有管底，以便部分充满高密度溶液。结合混合物的较低密度(～1.05g/cm3)结合缓冲液保持在较高密度流体的上部，而不明显混合。位于管下方的磁体将磁性小珠吸引到第二只管的底部。
未与磁性小珠配对的Luminex小珠仍然朝向第一只管上部，通过将第一只管从第二只管中移出而弃去。将第一只管顶部盖住，然后从第二只管中提起第一只管而移出。然后从磁体上释放由磁性小珠带下来的处于可检测复合物中的Luminex小珠，涡旋为均一溶液。然后将该均一溶液吸入流式细胞仪。每次一个读取Luminex小珠，利用小珠(B1或B2)上的独特编码确定其身份。几乎所有Luminex小珠是B1小珠，表明存在对应ASO1的SNP(数据略)。
序列表
<110>Vann，Charles
Lao，Kai Qin
Reed.Mark
<120>数字化分析
<130>7414.0048-00304
<150>US 60/332,519
<151>2001-11-21
<150>US 60/384,731
<151>2002-05-31
<160>11
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>1
tacggatgct  cactacgcta ggtttttttt  tttttttttt                        40
<210>2
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>2
tttttttttt  tttttttttt atgcctcgtg  actgctacca                        40
<210>3
<211>80
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>3
aaaaaaaaaa aaaaaaaacc tagcgtagtg agcatccgta tggtagcagt cacgaggcat    60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                80
<210>4
<211>80
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>4
tttttttttt tttttttttt atgcctcgtg actgctacca tacggatgct cactacgcta    60
ggtttttttt tttttttttt                                                80
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>5
gctgatgcta ctggatcgct accgtgaccc ttccga                              36
<210>6
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>6
gcttgcctgc tcgacttaga aatcggtctc gtccttca                            38
<210>7
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>7
gcgtaatcgt tgcttcatag cctggcagta aattctag                            38
<210>8
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>8
acagcagtga gtctttaggc ctggcagtaa attctac                             37
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>9
ctatgaagca acgattacgc tcggaagggt cacggt                              36
<210>10
<211>37
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>10
cctaaagact cactgctgtt gaaggacgag accgatt            37
<210>11
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>11
ctcaacctta cttgaggctg gtagcagtca cgaggcat           38

Claims (45)

1.定量样品中至少两种不同靶核酸序列的方法，其包括：
将样品与特异性针对至少两种不同靶核酸序列中每一种的不同探针组合相混合，形成连接反应混合物，每一探针组合包含(a)至少一种包含磁性颗粒及第一种靶特异性探针的分离小珠，以及(b)至少一种包含可编码标记及第二种靶特异性探针的检测小珠；其中可编码标记对第二种靶特异性探针有特异性；对每一种靶核酸序列有特异性的每一种探针组合包含一种可编码标记，所述可编码标记与特异性针对不同靶核酸序列的探针组合的可编码标记可检测地不同，其中在互补靶序列上彼此相邻杂交时，每一组合中的靶特异性探针适合于连在一起；
使连接反应混合物进行连接反应，其中相邻杂交的互补靶特异性探针彼此连接，形成包含分离小珠及检测小珠的连接产物；
将任何连接产物与未连接的分离小珠和检测小珠相分离；
通过可编码标记单独鉴别至少两种不同的靶核酸序列中的每一种；以及
通过计数连接产物中每种不同靶核酸序列的可编码标记的数目，定量至少两种不同靶核酸序列中的每一种。
2.权利要求1的方法，其中将连接产物与未连接的检测及分离小珠分离包括：
将连接产物与靶核酸序列分离，以及
将连接产物与样品分离。
3.权利要求2的方法，其中分离连接产物与靶核酸序列包括热变性。
4.权利要求3的方法，还包括在鉴别和定量靶核酸序列之前去除未处于连接产物中的任何分离小珠。
5.权利要求4的方法，其中去除未处于连接产物中的任何分离小珠包括：
将任何分离小珠及连接产物置于密度梯度中，其中该分离小珠及连接产物的密度不同；以及
去除未处于连接产物中的任何分离小珠。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中至少一种可编码标记具有对第二种靶特异性探针特异性的强度水平。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中至少一种可编码标记包含一个或多个量子点。
8.权利要求7的方法，其中每一探针组合的检测小珠包含至少1,000量子点，其中量子点具有使该检测小珠可与不同的检测小珠相区分的预定波长。
9.权利要求8的方法，其中该分离小珠包含至少1,000量子点，其中量子点具有使该分离小珠可与不同的分离小珠相区分的预定波长。
10.权利要求1-5中任一项的方法，其中在检测容器中定量样品中至少两种靶核酸序列，该检测容器接近磁源的一个表面上包含凹槽，其中分离小珠适合凹槽中，而检测小珠不适合凹槽中，并排列被吸引到磁源的连接产物。
11.权利要求1-5任一项的方法，其中该连接反应混合物还包含连接剂。
12.权利要求11的方法，其中该连接剂是连接酶。
13.权利要求11的方法，其中该连接剂是热稳定性连接酶。
14.权利要求13的方法，其中该热稳定性连接酶选自Tth连接酶、Taq连接酶和Pfu连接酶中的至少一种。
15.权利要求1-5中任一项的方法，其中每种分离小珠与每种检测小珠的密度不同，以致任何未处于连接产物中的分离小珠与连接产物之间的距离可使连接产物被吸引到磁性装置，而不使未处于连接产物中的分离小珠被吸引到磁性装置。
16.权利要求15的方法，其中在样品存在下进行连接产物的鉴别和定量。
17.权利要求1-5中任一项的方法，其中至少一种可编码标记包含至少两种磷光体。
18.权利要求1-5中任一项的方法，其中至少一种可编码标记包含至少两种荧光分子。
19.权利要求1-5中任一项的方法，其中该检测小珠还包含磁性颗粒。
20.权利要求19的方法，其中在检测容器中定量样品中至少两种靶核酸序列，该检测容器接近磁源的表面包含凹槽，其中凹槽包含第一端和第二端，并且其中连接产物中的分离小珠和检测小珠在凹槽中沿磁源排列，以致连接产物中的分离小珠较之连接产物中的检测小珠更接近于第一端排列。
21.检测样品中靶核酸序列的试剂盒，其包含：
特异性针对每种靶核酸序列的不同探针组合，每一探针组合包含
(a)至少一种包含磁性颗粒、包含两种或多种标记的第一种可编码标记以及第一种靶特异性探针的分离小珠，其中第一种可编码标记特异性针对第一种靶特异性探针，以及(b)至少一种包含含有至少两种标记的第二种可编码标记以及第二种靶特异性探针的检测小珠，其中第二种可编码标记特异性针对第二种靶特异性探针；其中对每一靶核酸序列有特异性的每一种探针组合包含第一种可编码标记，所述可编码标记与特异性针对不同靶核酸序列的探针组合的第一种可编码标记可检测地不同，其中每一探针组合的第一种可编码标记与探针组合的第二种可编码标记可检测地不同；并且其中在互补靶序列上彼此相邻杂交时，每一组合中的靶特异性探针适合于连在一起。
22.权利要求21的试剂盒，其还包含连接剂。
23.权利要求22的试剂盒，其中该连接剂是连接酶。
24.权利要求22的试剂盒，其中该连接剂是热稳定性连接酶。
25.权利要求24的试剂盒，其中该热稳定性连接酶选自Tth连接酶、Taq连接酶和Pfu连接酶中的至少一种。
26.检测样品中至少两种不同靶核酸序列的方法，其包括：
将样品与特异性针对至少两种不同靶核酸序列中每一种的不同探针组合相混合，形成连接反应混合物，每一探针组合包含(a)至少一种包含磁性颗粒、包含至少两种标记的第一种可编码标记以及第一种靶特异性探针的分离小珠，其中第一种可编码标记特异性针对第一种靶特异性探针，以及(b)至少一种包含含有至少两种标记的第二种可编码标记以及第二种靶特异性探针的检测小珠，其中第二种可编码标记特异性针对第二种靶特异性探针；其中对每一靶核酸序列有特异性的每一种探针组合包含第二种可编码标记，所述可编码标记与特异性针对不同靶核酸序列的探针组合的第二种可编码标记可检测地不同，其中每一探针组合的第一种可编码标记与探针组合的第二种可编码标记可检测地不同；其中在互补靶序列上彼此相邻杂交时，每一组合中的靶特异性探针适合于连在一起；
使连接反应混合物进行连接反应，其中相邻杂交的互补靶特异性探针彼此连接，形成包含分离小珠及检测小珠的连接产物；
将任何连接产物与未连接的分离小珠和检测小珠相分离；
通过可编码标记单独鉴别至少两种不同的靶核酸序列中的每一种；以及
通过定量连接产物来定量样品中的至少两种不同靶核酸序列。
27.权利要求26的方法，其中将连接产物与未连接的检测及分离小珠分离包括：
将连接产物与靶核酸序列分离，以及
将连接产物与样品分离。
28.权利要求27的方法，其中分离连接产物与靶核酸序列包括热变性。
29.权利要求28的方法，还包括在鉴别和定量靶核酸序列之前去除未处于连接产物中的任何分离小珠。
30.权利要求29的方法，其中去除未处于连接产物中的任何分离小珠包括：
将任何分离小珠及连接产物置于密度梯度中，其中该分离小珠及连接产物的密度不同；以及
去除未处于连接产物中的任何分离小珠。
31.权利要求26-30中任一项的方法，其中至少一种可编码标记具有对第二种靶特异性探针特异性的强度水平。
32.权利要求26-30中任一项的方法，其中至少一种可编码标记包含一个或多个量子点。
33.权利要求32的方法，其中每一探针组合的检测小珠包含至少1,000量子点，其中量子点具有使该检测小珠可与不同的检测小珠相区分的预定波长。
34.权利要求33的方法，其中该分离小珠包含至少1,000量子点，其中量子点具有使该分离小珠可与不同的分离小珠相区分的预定波长。
35.权利要求26-30中任一项的方法，其中在检测容器中定量样品中至少两种靶核酸序列，该检测容器接近磁源的一个表面上包含凹槽，其中分离小珠适合凹槽中，而检测小珠不适合凹槽中，并排列被吸引到磁源的连接产物。
36.权利要求26-30任一项的方法，其中该连接反应混合物还包含连接剂。
37.权利要求36的方法，其中该连接剂是连接酶。
38.权利要求36的方法，其中该连接剂是热稳定性连接酶。
39.权利要求38的方法，其中该热稳定性连接酶选自Tth连接酶、Taq连接酶和Pfu连接酶中的至少一种。
40.权利要求26-30中任一项的方法，其中每种分离小珠与每种检测小珠的密度不同，以致任何未处于连接产物中的分离小珠与连接产物之间的距离可使连接产物被吸引到磁性装置，而不使未处于连接产物中的分离小珠被吸引到磁性装置。
41.权利要求40的方法，其中在样品存在下进行连接产物的鉴别和定量。
42.权利要求26-30中任一项的方法，其中至少一种可编码标记包含至少两种磷光体。
43.权利要求26-30中任一项的方法，其中至少一种可编码标记包含至少两种荧光分子。
44.权利要求26-30中任一项的方法，其中该检测小珠还包含磁性颗粒。
45.权利要求44的方法，其中在检测容器中定量样品中至少两种靶核酸序列，该检测容器接近磁源的表面包含凹槽，其中凹槽包含第一端和第二端，并且其中连接产物中的分离小珠和检测小珠在凹槽中沿磁源排列，以致连接产物中的分离小珠较之连接产物中的检测小珠更接近于第一端排列。
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