JP7152599B2 - 塩基配列決定のためのモジュール式およびコンビナトリアル核酸試料調製のためのシステムおよび方法 - Google Patents
塩基配列決定のためのモジュール式およびコンビナトリアル核酸試料調製のためのシステムおよび方法 Download PDFInfo
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Description
異なるモジュール式核酸タグの各々は、場合によりセグメントCを含み、該セグメントCは、i)該セグメントAと該セグメントB、およびii)該セグメントA’と該セグメントB’のうちの1つの中間に位置する。該セグメントA、A’、B、B’、およびCの各々は、異なる核酸配列を有するセグメントのセットから選択される。該セグメントのセットの各セグメントは、少なくとも10ヌクレオチドからなる規定された配列を有し、該セグメントのセットは、少なくとも3の対ごとの編集距離を特徴とする。
本出願では、文脈から特に明確でない限り、(i)「a」という用語は「少なくとも1つ」を意味すると理解することができ、(ii)「または」という用語は、「および/または」を意味すると理解することができ、(iii)「を含んでいる(comprising)」および「を含む(including)」という用語は、それ自体で、または1つ以上の追加の構成要素もしくはステップと一緒にあるかどうかにかかわらず、項目別の構成要素またはステップを包含すると理解することができ、(iv)「約」および「おおよそ」という用語は、当業者によって理解されるであろう標準的な変動を許容するように理解することができ、(v)範囲が提供されている場合、端点が含まれる。
先でも論議したように、さまざまな状況において、塩基配列決定のための核酸試料調製のための方法を提供することが有用である可能性がある。当業者によって理解されるであろうように、所与の核酸塩基配列決定プラットフォームの設計は、塩基配列決定することができる核酸の種類および立体配置を決定する。そのため、塩基配列決定プラットフォームを使用するために、概して、試料中に存在する核酸をまず操作して、塩基配列決定プラットフォームと和合性のあるフォーマットで核酸を提供することが必要とされる。典型的な試料調製ワークフローは、核酸を試料の残部から分離すること、核酸を二本鎖分子(通常は二本鎖DNA)へ変換すること、核酸を、均一で規定された長さまたは長さの分布を有する分子へ断片化すること、および核酸アダプターを用いて核酸の末端を修飾することなどのステップを必要とする。
GGAAATUAGTGCAGTCTCTCAGTCAGTAGCT(配列番号1)
を有する第1の鎖202b、および塩基配列決定
GCTACTGACTGAGAGACTGCACTAATTUC(配列番号2)を有する第2の鎖204bを含む。
該タグ200bは、該第1のスタンド202bの5’部分(すなわち、セグメントA)および該第2の鎖204bの3’部分(すなわち、セグメントA’)からなるA/A’セグメント対206を含む。該タグ200bはさらに、ならびに該第1のスタンド202bの3’部分(すなわち、セグメントB)および該第2の鎖204bの5’部分(すなわち、セグメントB’)からなるB/B’セグメント対208を含む。特に、タグ200bは、図2Aのタグ200aと同じ全体構造を有し、さらに、該第1の鎖202bも該第2の鎖202bも、ヘアピンおよび対形成されていないループを含まないことを示している。第1の鎖202bは、各々が対形成されていない5’単一Gオーバーハングおよび3’単一Tオーバーハングを含むが、しかしながら、該タグ200bは、A/A’セグメント対206およびB/B’セグメント対208の中間の非介在性の対形成されていない配列を含まないことは認識されるであろう。
GGAAATUAGTGCAGTCTCTCAGTCAGTAGCT(配列番号1)
を有する第1の鎖212b、および塩基配列決定
GCTACTGACTGNNNNAGAGACTGCACTAATTUC(配列番号3)を有する第2の鎖214bを含む。
該タグ210bは、該第1のスタンド212bの5’部分(すなわち、セグメントA)および該第2の鎖214bの3’部分(すなわち、セグメントA’)からなるA/A’セグメント対218を含む。該タグ210bはさらに、ならびに該第1のスタンド212bの3’部分(すなわち、セグメントB)および該第2の鎖214bの5’部分(すなわち、セグメントB’)からなるB/B’セグメント対220を含む。特に、タグ210bは、図2Cのタグ210aと同じ全体構造を有し、さらに、第2の鎖212bが、A/A’セグメント対218およびB/B’セグメント対220の中間にある対形成されていないループ216bを含むことを示す。対形成されていないループ216bは、該第2の鎖214b内で分子内対形成も該第2の鎖212bとの分子間対形成も呈さない、4つの連続するヌクレオチド(すなわち、「NNNN」)からなる。図2Bにおける該タグ200bの場合にあるように、該タグ210bの第1の鎖212bは、各々が対形成されていない5’単一Gオーバーハングおよび3’単一Tオーバーハングを含むが、しかしながら、該タグ210bは、A/A’セグメント対206およびB/B’セグメント対208の中間の非介在性の対形成されていない配列を含まないことは認識されるであろう。
GGAAATUAGTGCAGTCTCTCAGTCAGTAGCT(配列番号1)
を有する第1の鎖224b、および塩基配列決定
GCTACTGACTGGCTCGAGCNNNNGCTCGAGCAGAGACTGCACTAATTUC(配列番号4)を有する第2の鎖226bを含む。
該タグ222bは、該第1のスタンド224bの5’部分(すなわち、セグメントA)および該第2の鎖226bの3’部分(すなわち、セグメントA’)からなるA/A’セグメント対234を含む。該タグ222bはさらに、ならびに該第1のスタンド224bの3’部分(すなわち、セグメントB)および該第2の鎖226bの5’部分(すなわち、セグメントB’)からなるB/B’セグメント対236を含む。該タグ222bはさらに、ならびにヘアピン230bおよび対形成されていないループ232bを含むCセグメント228bを含む。特に、タグ222bは、図2のタグ222aと同じ全体構造を有する。図2Eに示され、さらに、第2の鎖ra226bが、A/A’セグメント対234およびB/B’セグメント対236の中間のCセグメント228bを含むことを示す。該ヘアピン230bは、該第2の鎖226b内で分子内対形成を呈する8ヌクレオチドの2つの相補基からなる。対形成されていないループ232bは、該第2の鎖226b内での分子内対形成も該第2の鎖226bとの分子間対形成も呈さない、4つの連続するヌクレオチド(すなわち、「NNNN」)からなる。図2Bのタグ200bの場合のように、該タグ222bの第1の鎖224bは、各々が対形成されていない5’単一Gオーバーハングおよび3’単一Tオーバーハングを含むことが認識されるであろう。
Claims (17)
- モジュール式末端配列を有する核酸のライブラリーを調製する方法であって、
異なるモジュール式核酸タグのプールを、複数の二本鎖標的核酸を含む核酸試料と組み合わせること、
前記二本鎖標的核酸の各々の末端を、前記異なるモジュール式核酸タグのプールから選択されたタグに結合させて、複数の二重にタグ付けされた標的核酸を形成すること、
前記二重にタグ付けされた標的核酸の各々を増幅し、それにより、モジュール式末端配列を有する核酸のライブラリーを調製すること、および
前記モジュール式末端配列を有する増幅された核酸のライブラリーを検出すること、
を含み、
前記異なるモジュール式核酸タグの各々が、第1の鎖および第2の鎖を有し、
前記第1の鎖が、i)前記第1の鎖の5’末端を規定するセグメントA、およびii)前記第1の鎖の3’末端を規定するセグメントBを含み、
前記第2の鎖が、i)前記第2の鎖の5’末端を規定し、前記第1の鎖の前記セグメントBと相補的なセグメントB’、およびii)前記第2の鎖の3’末端を規定し、前記第1の鎖の前記セグメントAと相補的なセグメントA’を含み、
異なるモジュール式核酸タグの各々がセグメントCを含み、前記セグメントCがヘアピンを含み、i)前記セグメントAと前記セグメントB、およびii)セグメントA’とセグメントB’のうちの一方の中間に位置し、
前記セグメントA、A’、B、B’、およびCの各々が、異なる核酸配列を有するセグメントのセットから選択され、
前記セグメントのセットの各セグメントが、少なくとも10ヌクレオチドからなる規定された配列を有し、かつ
前記セグメントのセットが、少なくとも3の対ごとの編集距離を特徴とする、
方法。 - 前記ヘアピンが好ましくはステム領域およびループ領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記異なるモジュール式核酸タグの各々がさらに、少なくとも1つの鎖開裂部位を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記二重にタグ付けされた標的核酸を開裂剤と接触させて、前記二重にタグ付けされた標的核酸を前記開裂部位で開裂させ、それによって、開裂した二重にアダプター化された標的核酸を形成することをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 前記二重にタグ付けされた標的核酸を連結し、それによって、連結された二重にタグ付けされた標的核酸を形成することをさらに含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記連結された二重にタグ付けされた標的核酸の各々の末端をアダプターと結合させ、それによって、複数の二重にアダプター化されたコンカテマーを形成することをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 前記二重にアダプター化されたコンカテマーの各々を増幅することをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記モジュール式核酸タグへ結合させることが、ライゲーションによるものである、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記開裂部位が、1つ以上のデオキシウラシルを含み、前記開裂剤が、ウラシル-DNA-N-グリコシラーゼ(UNG)およびエンドヌクレアーゼを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼIII、エンドヌクレアーゼIV、およびエンドヌクレアーゼVIIIから選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記開裂部位が、1つ以上の脱塩基部位を含み、前記開裂剤が、エンドヌクレアーゼIII、エンドヌクレアーゼIV、およびエンドヌクレアーゼVIIIから選択されるエンドヌクレアーゼを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記モジュール式核酸タグが、ヌクレアーゼ保護ヌクレオチドを含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ保護ヌクレオチドが、ホスホロチオアート基を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記異なるモジュール式核酸タグの各々がさらに、句読点配列を含み、前記句読点配列が、少なくとも3つのブロックを含み、前記ブロックの各々が、少なくとも3つの同一ヌクレオチドからなるホモポリマーからなる、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
- モジュール式核酸タグのプールを含む組成物であって、各タグが
i)第1の鎖の5’末端を規定するセグメントA、およびii)前記第1の鎖の3’末端を規定するセグメントBを含む、前記第1の鎖、ならびに
i)第2の鎖の5’末端を規定し、前記第1の鎖のセグメントBと相補的なセグメントB’、およびii)前記第2の鎖の3’末端を規定し、前記第1の鎖のセグメントAと相補的なセグメントA’を含む、前記第2の鎖、
を含み、
モジュール式核酸タグの各々が、セグメントCを含み、前記セグメントCがヘアピンを含み、i)前記セグメントAと前記セグメントB、およびii)前記セグメントA’と前記セグメントB’のうちの一方の中間に位置し、
前記セグメントA、A’、B、B’、およびCの各々が、異なる核酸配列を有するセグメントのセットから選択され、
前記セグメントのセットの各セグメントが、少なくとも10ヌクレオチドからなる規定された配列を有し、かつ
前記セグメントのセットが、少なくとも3の対ごとの編集距離を特徴とする、
組成物。 - 前記モジュール式核酸タグの各々が、前記第1の鎖および前記第2の鎖のうちの1つの上にある前記セグメントCを含む、請求項15に記載の組成物。
- モジュール式末端配列を有する前記増幅された核酸のライブラリーを塩基配列決定し、それによって複数の塩基配列決定読出しを生成し、ならびにi)前記複数の塩基配列決定読出しを重複排除すること、およびii)コンセンサス配列を決定すること、のうちの少なくとも1つによって、前記複数の塩基配列決定読出しを解析することをさらに含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
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