CN115335520A - 用于通过测序对单细胞进行空间映射的条形码化的孔 - Google Patents

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CN115335520A CN202180025606.9A CN202180025606A CN115335520A CN 115335520 A CN115335520 A CN 115335520A CN 202180025606 A CN202180025606 A CN 202180025606A CN 115335520 A CN115335520 A CN 115335520A
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Abstract

本文的公开内容包括用于将测序数据分配到分区的方法的系统、方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，提供了将单细胞的测序数据和表型数据关联的方法。一些实施方案提供了减少测序数据中的噪声的方法。本文的公开内容包括包含分区索引序列的分区索引寡核苷酸。分区索引寡核苷酸可以与分区关联。位于同一分区内的分区索引寡核苷酸可以包含相同的分区索引序列。位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。

Description

用于通过测序对单细胞进行空间映射的条形码化的孔
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年1月29日提交的美国临时专利申请序列第62/967483号的权益，此相关申请的内容为了所有目的通过引用以其整体并入本文。
背景
领域
本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如使用分子条形码化(molecularbarcoding)确定基因表达。
对相关技术的描述
当前的技术允许在每个细胞与条形码化试剂珠在隔室(compartment)中共定位时通过将细胞特异性寡核苷酸条形码附接至来自个体细胞的多(A)mRNA分子而以大规模并行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。然而，当确定单细胞的表达谱时，两个细胞可以被识别为一个细胞，并且两个细胞的表达谱可以被识别为一个细胞的表达谱(例如，双重体(doublet)表达谱)。多重体(multiplet)表达谱(例如，源自与条形码化试剂珠在隔室中共定位的两个细胞)可能扭曲表达谱的解释。对减少测序数据中的噪声的系统和方法存在需求。此外，关于单细胞的表型信息可以源自通过测序测量基因表达和/或蛋白表达之前进行的实验。对将单细胞的测序数据和表型数据关联的系统和方法存在需求。还对将测序数据分配到分区的系统和方法存在需求。
概述
本文的公开内容包括将测序数据分配到分区的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对来自多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶。该方法可以包括：获得测序数据，所述测序数据包括条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段。该方法可以包括：鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列。该方法可以包括：基于测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，将多于一个测序读段中的每一个分配到多于一个分区中的分区。
本文的公开内容包括使单细胞的测序数据和表型数据关联的方法。在一些实施方案中，该方法包括：获得多于一个单细胞的表型数据，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝。该方法可以包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一个单细胞中的每一个分区到多于一个分区中的经鉴定的分区。该方法可以包括：使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对来自多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶。该方法可以包括：使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸。该方法可以包括：获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据。该方法可以包括：基于测序数据中多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物中的至少一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的分区索引序列，将多于一个单细胞中的至少一个细胞的测序数据和表型数据关联。该方法可以包括：将多于一个固体支持物分区到多于一个分区，其中多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记序列和细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。
本文的公开内容包括减少测序数据中的噪声的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。该方法可以包括：获得多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区，其中噪声分区是：(i)不包含细胞的分区，(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或(iii)包含多于一个细胞的分区。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对来自多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶。该方法可以包括：获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据。该方法可以包括：鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列。该方法可以包括：从获得的测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。
该方法可以包括：获得多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区，其中噪声分区是：(i)不包含细胞的分区，(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或(iii)包含多于一个细胞的分区；鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及从获得的测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。在一些实施方案中，测序数据包括条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段。该方法可以包括：从测序数据中去除一个或更多个噪声测序读段，其中噪声测序读段包括源自噪声分区的测序读段。该方法可以包括：鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及基于测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，将多于一个测序读段中的每一个分配到多于一个分区中的分区。该方法可以包括：获得多于一个单细胞的表型数据，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝；将多于一个单细胞中的每一个分区到多于一个分区中的经鉴定的分区；以及基于测序数据中多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物中的至少一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的分区索引序列，将多于一个单细胞中的至少一个细胞的测序数据与表型数据关联。该方法可以包括：对于指示多于一个单细胞中的单细胞的每一种独特细胞标记序列：确定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，从而将多于一个单细胞中的每一个细胞的测序数据和表型数据关联。
在一些实施方案中，多于一种条形码化核酸靶各自包含与核酸靶的至少一部分互补的序列和第一分子标记。在一些实施方案中，多于一种条形码化分区索引寡核苷酸各自包含与分区索引序列的至少一部分互补的序列和第一分子标记。在一些实施方案中，获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸的测序数据包括获得分区索引序列的至少一部分。在一些实施方案中，多于一个测序读段中的每一个包含(1)细胞标记序列和(2)第一分子标记序列。在一些实施方案中，多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的多于一个测序读段中的每一个包含分区索引序列的至少一部分。在一些实施方案中，分区是孔或液滴。
在一些实施方案中，每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列。在一些实施方案中，寡核苷酸条形码包含含有捕获序列的靶结合区。靶结合区可以包含例如基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸包含与捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置成捕获分区索引寡核苷酸。在一些实施方案中，与捕获序列互补的序列包含多(dA)区。
在一些实施方案中，将多于一个单细胞中的每一个分区到多于一个分区中的经鉴定的分区包括索引分选。在一些实施方案中，将多于一个单细胞中的每一个分区到多于一个分区中的经鉴定的分区包括将多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中。在一些实施方案中，将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区包括索引分选。在一些实施方案中，将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区包括将多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中。在一些实施方案中，将多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中包括将多于一个单细胞引入微孔阵列在多于一个经鉴定的微孔处的微孔中。在一些实施方案中，将多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中包括使多于一个单细胞通过流式细胞术沉积到微孔阵列的经鉴定的微孔中。在一些实施方案中，使多于一个单细胞通过流式细胞术沉积到微孔阵列的经鉴定的微孔中包括使用流式细胞仪一次使一个单细胞沉积到微孔阵列的经鉴定的微孔中。该方法可以包括：将流式细胞仪的分选组件与微孔阵列对齐。
在一些实施方案中，表型数据包括事件数据。在一些实施方案中，事件数据包括源自分选装置的定量生物事件数据。在一些实施方案中，事件数据包括侧向散射信号、前向散射信号、一个或更多个荧光信号或其任何组合。该方法可以包括：对单细胞的表型数据和测序数据进行相关性分析。相关性分析可以鉴定例如以下中的一种或更多种：候选生物标志物、候选治疗剂、治疗剂的候选剂量和/或候选治疗剂的细胞靶。
在一些实施方案中，多于一种条形码化分区索引寡核苷酸包含第一通用序列的互补体。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸包含第二通用序列。在一些实施方案中，获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的序列数据包括：使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与第二通用序列或其互补体杂交的引物来扩增多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物，以产生多于一种扩增的条形码化分区索引寡核苷酸；以及获得多于一种扩增的条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的测序数据。在一些实施方案中，获得序列信息包括将测序衔接子附接到多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物。
在一些实施方案中，多于一种分区索引寡核苷酸中的每一种包含分区接头官能团，多于一个分区中的每一个包含分区官能团，并且分区官能团和分区接头官能团彼此关联。在一些实施方案中，分区接头官能团和分区官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸通过分区接头与分区关联。在一些实施方案中，分区接头包含碳链，任选地碳链包含2-30个碳原子，并且还任选地碳链包含12个碳原子。在一些实施方案中，分区接头包含5’氨基修饰物C12(5AmMC12)或其衍生物。在一些实施方案中，分区索引序列的长度是6-60个核苷酸。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸的长度是50-500个核苷酸。
在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被附接到分区。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被共价附接到分区。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被缀合到分区。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸通过选自由以下组成的组的化学基团被缀合到分区：UV光可裂解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺及其组合。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被非共价附接到分区。
该方法可以包括：裂解一个或更多个单细胞。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被配置成可从分区脱离。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被配置成在细胞裂解期间从分区脱离。该方法可以包括：使分区索引寡核苷酸与分区解离。在一些实施方案中，使分区索引寡核苷酸与分区解离包括通过UV光裂解、化学处理、加热、酶处理或其任何组合使分区索引寡核苷酸从分区脱离。在一些实施方案中，解离发生在对分区索引寡核苷酸进行条形码化之后。在一些实施方案中，解离发生在对分区索引寡核苷酸进行条形码化之前。在一些实施方案中，解离发生在细胞裂解期间。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被配置成不可从分区脱离。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸与一个或更多个细胞中的任一个的基因组序列不同源，与一个物种的基因组序列同源，或其组合。在一些实施方案中，物种是非哺乳动物物种。
该方法可以包括：确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数包括基于与多于一种条形码化核酸靶或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、其互补体或其组合的数目来确定多于一个单细胞中核酸靶的拷贝数。该方法可以包括：使随机引物与多于一种条形码化核酸靶接触，其中随机引物中的每一种包含第三通用序列或其互补体；以及使与多于一种条形码化核酸靶杂交的随机引物延伸以产生多于一种延伸产物。该方法可以包括：使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补体杂交的引物来扩增多于一种延伸产物，从而产生第一多于一种条形码化扩增子。在一些实施方案中，扩增多于一种延伸产物包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一种延伸产物。
该方法可以包括：基于与第一多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数包括基于与第一多于一种条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定多于一个单细胞中的一个或更多个中多于一种核酸靶中的每一种的数目，所述第一多于一种条形码化扩增子包括多于一种核酸靶中的每一种的序列。在一些实施方案中，多于一种核酸靶中的每一种的序列包括多于一种核酸靶中的每一种的子序列。在一些实施方案中，第一多于一种条形码化扩增子中核酸靶的序列包括核酸靶的子序列。
该方法可以包括：使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补体杂交的引物来扩增第一多于一种条形码化扩增子，从而产生第二多于一种条形码化扩增子。在一些实施方案中，扩增第一多于一种条形码化扩增子包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到第一多于一种条形码化扩增子。该方法可以包括：基于与第二多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子包含全转录组扩增(WTA)产物。
该方法可以包括：使用多于一种条形码化核酸靶作为模板合成第三多于一种条形码化扩增子以产生第三多于一种条形码化扩增子。在一些实施方案中，合成第三多于一种条形码化扩增子包括对多于一种条形码化核酸靶进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，合成第三多于一种条形码化扩增子包括使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和靶特异性引物进行的PCR扩增。该方法可以包括：获得第三多于一种条形码化扩增子或其产物的序列数据，并且任选地获得序列信息包括将测序衔接子附接到第三多于一种条形码化扩增子或其产物。该方法可以包括：基于与第三多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数。
在一些实施方案中，核酸靶包括核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA或其任何组合。在一些实施方案中，核酸靶包括样品索引寡核苷酸，并且任选地样品索引寡核苷酸包含样品索引序列，并且多于一种样品索引组合物中的至少两种样品索引组合物的样品索引序列包含不同的序列。在一些实施方案中，核酸靶包括细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸。在一些实施方案中，细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含用于细胞组分结合试剂的独特标识符序列。
在一些实施方案中，使多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使多于一种寡核苷酸条形码延伸。在一些实施方案中，DNA聚合酶包括Klenow片段。在一些实施方案中，逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地其中病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。
在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列是相同的。在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列是不同的。在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种包含不同的第一分子标记序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码的每一种细胞标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码的每一种第一分子标记包含至少6个核苷酸。
在一些实施方案中，固体支持物包括合成颗粒。在一些实施方案中，固体支持物包括平坦表面。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种被固定在合成颗粒上、部分地固定在合成颗粒上、包封在合成颗粒中或部分地包封在合成颗粒中。在一些实施方案中，合成颗粒是可破坏的。在一些实施方案中，合成颗粒包括珠。在一些实施方案中，珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。在一些实施方案中，多于一个单细胞包括T细胞、B细胞、肿瘤细胞、髓样细胞、血细胞、正常细胞、胎儿细胞、母体细胞或其混合物。
本文的公开内容包括组合物(例如，试剂盒)。在一些实施方案中，组合物包含：微孔阵列，其中该微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围为约1,000μm3至约786,000μm3的体积，其中每个微孔包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一微孔内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同微孔内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。组合物还可以包括盒(cartridge)，其中盒包括以下中的至少一个：入口端口、出口端口、泵、阀、通风口(vent)、储器、样品收集室、温度控制设备或其任何组合。
本文的公开内容包括组合物。在一些实施方案中，组合物包含：盒，其中该盒包括以下中的至少一个：入口端口、出口端口、泵、阀、通风口、储器、样品收集室、温度控制设备或其任何组合，其中该盒包括微孔阵列，其中该微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围为约1,000μm3至约786,000μm3的体积，其中每个微孔包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一微孔内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同微孔内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。
组合物可以包含：缓冲液。组合物可以包含：一种或更多种用于逆转录反应的试剂、一种或更多种用于扩增反应的试剂，或两者。在一些实施方案中，盒包括用于对至少100个微孔进行光学成像的透明窗。组合物可以包含：成像系统，所述成像系统被配置成捕获和处理至少100个微孔的全部或一部分的图像，其中成像系统还包括照明子系统、成像子系统和处理器。在一些实施方案中，成像系统被配置成执行明场、暗场、荧光或定量相位成像。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸包含第二通用序列。
在一些实施方案中，多于一种分区索引寡核苷酸中的每一种包含分区接头官能团，多于一个微孔中的每一个包含分区官能团，并且分区官能团和分区接头官能团彼此关联。在一些实施方案中，分区接头官能团和分区官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸通过分区接头与微孔关联。在一些实施方案中，分区接头包含碳链。在一些实施方案中，碳链包含2-30个碳原子，例如12个碳原子。在一些实施方案中，分区接头包含5’氨基修饰物C12(5AmMC12)或其衍生物。在一些实施方案中，分区索引序列的长度是6-60个核苷酸。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸的长度是50-500个核苷酸。
在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被附接到微孔。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被共价附接到微孔。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被缀合到微孔。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸通过选自由以下组成的组的化学基团被缀合到微孔：UV光可裂解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺及其组合。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被非共价附接到微孔。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被配置成可从微孔脱离。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被配置成在细胞裂解期间从微孔脱离。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被配置成可通过UV光裂解、化学处理、加热、酶处理或其任何组合从微孔脱离。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸被配置成不可从微孔脱离。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸与一个或更多个细胞中的任一个的基因组序列不同源，与一个物种的基因组序列同源，或其组合。在一些实施方案中，物种是非哺乳动物物种。
组合物可以包括：多于一个固体支持物，所述多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码。在一些实施方案中，寡核苷酸条形码各自包含分子标记和细胞标记。在一些实施方案中，与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。在一些实施方案中，每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列。在一些实施方案中，寡核苷酸条形码包含含有捕获序列的靶结合区。在一些实施方案中，靶结合区包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸包含与捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置成捕获分区索引寡核苷酸。与捕获序列互补的序列可以包含多(dA)区。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码的每一种细胞标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码的每一种分子标记包含至少6个核苷酸。
在一些实施方案中，固体支持物包括平坦表面。在一些实施方案中，固体支持物包括合成颗粒。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被固定在颗粒上、部分地固定在颗粒上、包封在颗粒中、部分地包封在颗粒中或其组合。在一些实施方案中，合成颗粒是可破坏的。在一些实施方案中，合成颗粒包括珠。在一些实施方案中，珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。组合物可以包含：使用说明。
附图简述
图1图示了非限制性示例性条形码。
图2示出了条形码化和数字计数的非限制性示例性工作流程。
图3是示出用于从多于一种靶产生在3’末端条形码化的靶的索引文库(indexedlibrary)的非限制性示例性方法的示意图。
图4A-图4B描绘了如本文描述的包含分区索引寡核苷酸的分区的非限制性示例性设计。
图5A-图5D示出了用于本文提供的分区索引方法的非限制性示例性工作流程的示意图。
详述
以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指示，否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文提供的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解的是，如本文一般描述的以及附图中图示的本公开内容的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确设想并且构成本公开内容的一部分。
本文提及的所有专利、公开的专利申请、其他出版物和来自GenBank的序列，以及其他数据库关于相关技术通过引用以其整体并入。
对少量核酸(例如信使核糖核苷酸(mRNA)分子)进行定量对于确定例如在不同发育阶段或在不同环境条件下在细胞中表达的基因是临床上重要的。然而，确定核酸分子(例如，mRNA分子)的绝对数目也可以是非常具有挑战性的，尤其是当分子数目非常小时。确定样品中分子的绝对数目的一种方法是数字聚合酶链式反应(PCR)。理想地，PCR在每个循环中产生相同拷贝的分子。然而，PCR可具有缺点使得每个分子以随机概率复制，且此概率根据PCR循环和基因序列而变化，这导致扩增偏倚和不准确的基因表达测量。具有独特分子标记(molecular labels，也称为分子索引(molecular indexes，MI))的随机条形码可以用于计数分子数目和校正扩增偏倚。诸如PreciseTM测定(Cellular Research,Inc.(Palo Alto,CA))和RhapsodyTM测定(Becton,Dickinson and Company(Franklin Lakes,NJ))的随机条形码化可以通过使用分子标记(ML)在逆转录(RT)期间标记mRNA来校正由PCR和文库制备步骤引起的偏倚。
PreciseTM测定可以利用具有在多(T)寡核苷酸上的大量(例如6561种至65536种)独特分子标记序列的随机条形码的非耗尽性池(non-depleting pool)，以在RT步骤期间与样品中的所有多(A)-mRNA杂交。随机条形码可以包含通用PCR引发位点。在RT期间，靶基因分子与随机条形码随机反应。每种靶分子可以与随机条形码杂交，导致产生随机条形码化的互补核糖核苷酸(cDNA)分子。在标记后，可以将来自微孔板微孔的随机条形码化cDNA分子汇集到单个管中用于PCR扩增和测序。可以分析原始测序数据以产生读段的数目、具有独特分子标记序列的随机条形码的数目以及mRNA分子的数目。
本文的公开内容包括将测序数据分配到分区的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对来自多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶。该方法可以包括：获得测序数据，所述测序数据包括条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段。该方法可以包括：鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列。该方法可以包括：基于测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，将多于一个测序读段中的每一个分配到多于一个分区中的分区。
本文的公开内容包括使单细胞的测序数据和表型数据关联的方法。在一些实施方案中，该方法包括：获得多于一个单细胞的表型数据，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝。该方法可以包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一个单细胞中的每一个分区到多于一个分区中的经鉴定的分区。该方法可以包括：使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对来自多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶。该方法可以包括：使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸。该方法可以包括：获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据。该方法可以包括：基于测序数据中多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物中的至少一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的分区索引序列，将多于一个单细胞中的至少一个细胞的测序数据和表型数据关联。该方法可以包括：将多于一个固体支持物分区到多于一个分区，其中多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记序列和细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。
本文的公开内容包括减少测序数据中的噪声的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。该方法可以包括：获得多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区，其中噪声分区是：(i)不包含细胞的分区，(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或(iii)包含多于一个细胞的分区。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对来自多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶。该方法可以包括：获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据。该方法可以包括：鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列。该方法可以包括：从获得的测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。
本文的公开内容包括组合物(例如，试剂盒)。在一些实施方案中，组合物包含：微孔阵列，其中该微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围为约1,000μm3至约786,000μm3的体积，其中每个微孔包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一微孔内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同微孔内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。组合物还可以包括盒，其中盒包括以下中的至少一个：入口端口、出口端口、泵、阀、通风口、储器、样品收集室、温度控制设备或其任何组合。
本文的公开内容包括组合物。在一些实施方案中，组合物包含：盒，其中该盒包括以下中的至少一个：入口端口、出口端口、泵、阀、通风口、储器、样品收集室、温度控制设备或其任何组合，其中该盒包括微孔阵列，其中该微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围为约1,000μm3至约786,000μm3的体积，其中每个微孔包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一微孔内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同微孔内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。参见，例如，Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第2版，J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。为了本公开内容的目的，下文定义了以下术语。
如本文使用的，术语“衔接子”可以意指促进关联的核酸的扩增或测序的序列。关联的核酸可以包括靶核酸。关联的核酸可以包括空间标记、靶标记、样品标记、索引标记或条形码序列(例如，分子标记)中的一种或更多种。衔接子可以是线性的。衔接子可以是预腺苷酸化的衔接子。衔接子可以是双链或单链的。一种或更多种衔接子可以位于核酸的5’端或3’端。当衔接子在5’端和3’端包含已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸的5’端和/或3’端的衔接子可以能够与固定在表面上的一种或更多种寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，衔接子可以包含通用序列。通用序列可以是两种或更多种核酸分子共有的核苷酸序列的区域。两种或更多种核酸分子也可以具有不同序列的区域。因此，例如，5’衔接子可以包含相同和/或通用核酸序列，并且3’衔接子可以包含相同和/或通用序列。可以存在于多于一种核酸分子的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列互补的单种通用引物复制或扩增多于一种不同序列。类似地，可以存在于核酸分子的集合中的不同成员中的至少一种、两种(例如，一对)或更多种通用序列可以允许使用与通用序列互补的至少一种、两种(例如，一对)或更多种单一通用引物复制或扩增多于一种不同序列。因此，通用引物包含可与此类通用序列杂交的序列。可以修饰具有靶核酸序列的分子以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)附接到不同靶核酸序列的一个末端或两个末端。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以提供通用引物杂交的位点。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以彼此相同或不同。
如本文使用的，术语“关联”或“与...关联”可以意指，两个或更多个物质可以被鉴定为在某个时间点共定位。关联可以意指，两个或更多个物质在或曾经在相似的容器内。关联可以是信息学关联。例如，关于两个或更多个物质的数字信息可以被存储并且可以用于确定一种或更多种物质在某个时间点共定位。关联也可以是物理关联。在一些实施方案中，两个或更多个关联的物质彼此“拴系”、“附接”或“固定”或与共同的固体或半固体表面“拴系”、“附接”或“固定”。关联可以指用于将标记与固体或半固体支持物(诸如珠)附接的共价或非共价方式。关联可以是靶与标记之间的共价键。关联可以包括两个分子(诸如靶分子和标记)之间的杂交。
如本文使用的，术语“互补”可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸在给定位置处的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置处是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在全部互补性时它可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“互补体”。如果第一核苷酸序列和与第二序列相反的序列(即，核苷酸顺序相反)互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“反向互补体”。如本文使用的，“互补的”序列可以指序列的“互补体”或“反向互补体”。从本公开内容理解，如果一个分子可以与另一个分子杂交，则其可以与其所杂交的分子互补或部分互补。
如本文使用的，术语“数字计数”可以指用于估计样品中靶分子数目的方法。数字计数可以包括确定已经与样品中的靶关联的独特标记的数目的步骤。这种方法(其本质上可以是随机的)将计数分子的问题从相同分子的定位和鉴定之一转化为有关检测一组预定义标记的一系列是/否数字问题。
如本文使用的，术语“一种标记(label)”或“多于一种标记(labels)”可以指与样品中的靶关联的核酸代码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是可鉴定为有区别的天然核酸的一部分。标记可以是已知的序列。标记可以包括核酸序列的接点，例如天然和非天然序列的接点。如本文使用的，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在多种实施方案中，可以使用标记来确定样品的身份、样品的来源、细胞的身份和/或靶。
如本文使用的，术语“非耗尽性储库(non-depleting reservoir)”可以指由许多不同标记组成的条形码(例如，随机条形码)的池。非耗尽性储库可以包括大量不同的条形码，使得当非耗尽性储库与靶池关联时，每种靶可能与独特条形码关联。每种标记的靶分子的独特性可以通过随机选择的统计来确定，并且取决于与标记的多样性相比在集合中相同的靶分子的拷贝数。所得的标记的靶分子的集合的大小可以通过条形码化处理的随机性质来确定，并且然后对检测到的条形码的数目的分析允许计算原始集合或样品中存在的靶分子的数目。当存在的靶分子的拷贝数与独特条形码的数目的比率低时，标记的靶分子是高度独特的(即，多于一种靶分子被给定标记标记的概率非常低)。
如本文使用的，术语“核酸”是指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体(DNA/RNA hybrid)。核酸可以包括一种或更多种类似物(例如，改变的主链(backbone)、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、非天然核酸(xeno nucleic acid)、吗啉代核酸(morpholinos)、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核苷酸、虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)以及怀俄苷(wyosine)。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。
核酸可以包括一种或更多种修饰(例如，碱基修饰、主链修饰)，以为核酸提供新的或增强的特征(例如，改进的稳定性)。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是还包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。继而，此线性聚合化合物的各端可以进一步连接而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，磷酸基团通常可以称为形成核酸的核苷间主链。键(linkage)或主链可以是3’到5’磷酸二酯键。
核酸可以包括修饰的主链和/或修饰的核苷间键。修饰的主链可以包括那些在主链中保留磷原子的主链和那些在主链中没有磷原子的主链。合适的其中含磷原子的修饰的核酸主链可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯诸如3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidate)(包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、磷酸二酰胺酯(phosphorodiamidates)、硫代磷酰胺酯(thionophosphoramidates))、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼磷酸酯，具有正常3’-5’连接、2’-5’连接的类似物以及具有反向极性的类似物(其中一个或更多个核苷酸间连接是3’至3’、5’至5’或2’至2’连接)。
核酸可以包括由短链烷基或环烷基核苷间键，混合杂原子，和烷基或环烷基核苷间键，或者一个或更多个短链杂原子的或杂环的核苷间键形成的多核苷酸主链。这些可以包括具有吗啉代(morpholino)连接的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他的那些。
核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以意图包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键两者被非呋喃糖基团替代的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代也可以称为糖替代物(surrogate)。可以维持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖主链可以被含酰胺的主链替代，特别是被氨基乙基甘氨酸主链替代。核苷酸可以被保留，并且直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。PNA化合物中的主链可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这使得PNA具有含酰胺的主链。杂环碱基部分可以直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。
核酸可以包括吗啉代主链结构。例如，核酸可以包含替代核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，磷酸二酰胺酯或其他非磷酸二酯核苷间键可以替代磷酸二酯键。
核酸可以包括具有附接至吗啉代环的杂环碱基的连接的吗啉代单元(例如，吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子吗啉代的寡聚化合物与细胞蛋白可以具有较少的不期望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子模拟物。吗啉代类别内的各种化合物可以使用不同的连接基团来连接。另外类别的多核苷酸模拟物可以称为环己烯基核酸(CeNA)。核酸分子中通常存在的呋喃糖环可以被环己烯基环替代。使用亚磷酰胺化学可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增加DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸酯可以与核酸互补体形成复合体，具有与天然复合体相似的稳定性。另外的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基基团与糖环的4’碳原子连接，从而形成2’-C,4’-C-氧亚甲基连接，从而形成双环糖部分。连接可以是亚甲基(-CH2-)，桥接2’氧原子和4’碳原子的基团，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以显示与互补核酸的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3℃至+10℃)、对3’-外切核酸酶降解的稳定性和良好的溶解性。
核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))，以及嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成以及天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶(5-halouracil)和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶，8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可以包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳(G-clamps)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3’,2’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
如本文使用的，术语“样品”可以指包含靶的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的合适样品包括细胞、组织、器官或生物体。
如本文使用的，术语“采样装置”或“装置”可以指可以取样品的切片和/或将所述切片放置在基底上的装置。采样装置可以指例如荧光激活细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、刀片格栅和/或超薄切片机。
如本文使用的，术语“固体支持物”可以指可以附接多于一种条形码(例如，随机条形码)的离散固体或半固体表面。固体支持物可以包括任何类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座(bearing)、圆柱体或由塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)构成的其他类似配置，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。珠的形状可以是非球形的。以阵列间隔开的多于一个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。
如本文使用的，术语“随机条形码”可以指本公开内容的包含标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。
如本文使用的，术语“基因特异性随机条形码”可以指包含标记和基因特异性的靶结合区的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。
如本文使用的，术语“随机条形码化”可以指核酸的随机标记(例如，条形码化)。随机条形码化可以利用递归泊松策略来关联并对与靶关联的标记进行定量。如本文使用的，术语“随机条形码化”可以与“随机进行标记”互换使用。
如本文使用的，术语“靶”可以指可与条形码(例如，随机条形码)关联的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的示例性合适的靶包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微小RNA、tRNA等。靶可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，靶可以是蛋白、肽或多肽。在一些实施方案中，靶是脂质。如本文使用的，“靶”可以与“物质(species)”互换使用。
如本文使用的，术语“逆转录酶”可以指具有逆转录酶活性(即，催化从RNA模板合成DNA)的一组酶。通常，这样的酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒(retroplasmid)逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II组内含子衍生的逆转录酶，及它们的突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和II组内含子逆转录酶。II组内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LI.LtrB内含子逆转录酶、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GsI-IIC内含子逆转录酶。其他类别的逆转录酶可以包括许多类型的非逆转录病毒逆转录酶(即，尤其是逆转录子、II组内含子、以及多样性产生型逆转录元件)。
术语“通用衔接子引物”、“通用引物衔接子”或“通用衔接子序列”可互换地使用，以指可以用于与条形码(例如，随机条形码)杂交以产生基因特异性条形码的核苷酸序列。通用衔接子序列可以例如是在本公开内容的方法中使用的遍及所有条形码通用的已知序列。例如，当使用本文公开的方法标记多于一种靶时，每种靶特异性序列可以连接到相同的通用衔接子序列。在一些实施方案中，多于一种通用衔接子序列可以用于本文公开的方法中。例如，当使用本文公开的方法标记多于一种靶时，至少两种靶特异性序列连接到不同的通用衔接子序列。通用衔接子引物及其互补体可以被包括在两种寡核苷酸中，其中的一种寡核苷酸包含靶特异性序列且另一种寡核苷酸包含条形码。例如，通用衔接子序列可以是包含靶特异性序列的寡核苷酸的一部分以产生与靶核酸互补的核苷酸序列。包含条形码和通用衔接子序列的互补序列的第二寡核苷酸可与核苷酸序列杂交并产生靶特异性条形码(例如，靶特异性随机条形码)。在一些实施方案中，通用衔接子引物具有与本公开内容的方法中使用的通用PCR引物不同的序列。
条形码
条形码化，诸如随机条形码化，已经在例如，Fu等人,Proc Natl Acad SciU.S.A.,2011年5月31日,108(22):9026-31；美国专利申请公布第US2011/0160078号；Fan等人,Science,2015年2月6日,347(6222):1258367；美国专利申请公布第US2015/0299784号；和PCT申请公布第WO2015/031691号中描述；这些中的每一项的内容，包括任何支持或补充信息或材料，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本文公开的条形码可以是随机条形码，所述随机条形码可以是可以用于对靶进行随机标记(例如，条形码化、加标签)的多核苷酸序列。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或在这些值中的任何两个之间的数字或范围，则条形码可以称为随机条形码。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，则条形码可以称为随机条形码。随机条形码的条形码序列可以称为分子标记。
条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种标记。示例性标记可以包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记和/或前空间标记(pre-spatial label)。图1图示了具有空间标记的示例性条形码104。条形码104可以包含可以使条形码与固体支持物108连接的5’胺。条形码可以包含通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和/或分子标记。条形码中不同标记(包括但不限于通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和分子标记)的顺序可以变化。例如，如图1中所示，通用标记可以是最5’侧的标记(5’-most label)，且分子标记可以是最3’侧的标记(3’-most label)。空间标记、维度标记和细胞标记可以处于任何顺序。在一些实施方案中，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记和分子标记是处于任何顺序的。条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区可以包含可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡(dT)序列。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个核苷酸隔开。
标记(例如，细胞标记)可以包含一组独特的定义长度的核酸子序列，例如每种七个核苷酸(相当于一些汉明错误校正代码中使用的比特数目)，其可被设计成提供错误校正能力。可以设计包含七个核苷酸序列的错误校正子序列组，使得所述组中的序列的任何成对组合展现出定义的“遗传距离”(或错配碱基数)，例如一组错误校正子序列可被设计成展现三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，对于标记的靶核酸分子的序列数据组中的错误校正序列的审查(在下文更详细地描述)可允许人们检测或校正扩增错误或测序错误。在一些实施方案中，用于产生错误校正代码的核酸子序列的长度可以变化，例如，它们的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、31个、40个、50个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，其他长度的核酸子序列可以用来产生错误校正代码。
条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶相互作用。靶可以是以下或包括以下：核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有多(A)尾的RNA或其任何组合。在一些实施方案中，多于一种靶可以包括脱氧核糖核酸(DNA)。
在一些实施方案中，靶结合区可以包括可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡(dT)序列。条形码的一种或更多种标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列(例如，分子标记))可以通过间隔区(spacer)与条形码的另一种或两种剩余标记隔开。间隔区可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，条形码的标记中没有标记被间隔区隔开。
通用标记
条形码可以包含一种或更多种通用标记。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记可以是对于附接至给定固体支持物的条形码组中的所有条形码相同的。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记可以是对于附接至多于一个珠的所有条形码相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包括通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相关的测序引物。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序引物或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可以用于引发条形码转录的序列。通用标记可以包括可以用于延伸条形码或条形码内的区域的序列。通用标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。例如，通用标记可以包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。在一些实施方案中，可裂解接头或修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够从支持物上被裂解下来。
维度标记
条形码可以包含一种或更多种维度标记。在一些实施方案中，维度标记可以包括提供关于标记(例如，随机标记)发生的维度的信息的核酸序列。例如，维度标记可以提供关于靶被条形码化的时间的信息。维度标记可以与样品中条形码化(例如，随机条形码化)的时间关联。维度标记可以在标记的时间被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。维度标记提供关于靶、靶的组和/或样品被条形码化的顺序的信息。例如，在细胞周期的G0期可以将细胞的群体条形码化。在细胞周期的G1期，可以用条形码(例如，随机条形码)对细胞再次进行脉冲处理。在细胞周期的S期，可以用条形码对细胞再次进行脉冲处理，等等。每个脉冲(例如，细胞周期的每个时期)的条形码可以包含不同的维度标记。以这种方式，维度标记提供关于哪些靶在细胞周期的哪个时期被标记的信息。维度标记可以探询许多不同的生物时间。示例性的生物学时间可以包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一种实例中，样品(例如，细胞、细胞的群体)可以在用药物和/或疗法治疗之前和/或之后标记。不同靶的拷贝数的变化可以指示样品对药物和/或疗法的响应。
维度标记可以是可激活的。可激活的维度标记可以在特定时间点被激活。可激活的标记可以被例如组成性地激活(例如，不关闭)。可激活的维度标记可以被例如可逆地激活(例如，可激活的维度标记可以被打开和关闭)。维度标记可以被例如可逆地激活至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。维度标记可以被可逆地激活例如至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实施方案中，可以用荧光、光、化学事件(例如，裂解，连接另一种分子，添加修饰(例如，聚乙二醇化、类泛素化(sumoylate)、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)、光化学事件(例如，光囚禁(photocaging))以及引入非天然的核苷酸将维度标记激活。
在一些实施方案中，维度标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码(例如，随机条形码)可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的维度标记。
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特维度标记序列。维度标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。维度标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。维度标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。维度标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。维度标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
空间标记
条形码可以包含一种或更多种空间标记。在一些实施方案中，空间标记可以包含提供关于与条形码关联的靶分子的空间取向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品中的坐标关联。坐标可以是固定的坐标。例如，坐标可以相对于基底固定。空间标记可以参考二维或三维网格。坐标可以相对于界标(landmark)固定。界标可在空间中被鉴定。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然界标，诸如具有可鉴定标识(诸如色码、条形码、磁特性(magneticproperty)、荧光、放射性或独特尺寸或形状)的结构。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器或液滴)关联。在一些实施方案中，将多于一种空间标记一起用于编码空间中的一个或更多个位置。
空间标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是至少或是至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的空间标记。
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特空间标记序列。空间标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。空间标记的长度可以是至少以下或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。空间标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。空间标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。空间标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
细胞标记
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种细胞标记。在一些实施方案中，细胞标记可以包含提供用于确定哪种靶核酸来源于哪种细胞的信息的核酸序列。在一些实施方案中，细胞标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。例如，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的细胞标记。作为另一种实例，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的细胞标记。
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特细胞标记序列。细胞标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。作为另一种实例，细胞标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。作为又另一种实例，细胞标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
条形码序列
条形码可以包含一种或更多种条形码序列。在一些实施方案中，条形码序列可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。条形码序列可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器(例如，提供粗略近似)的核酸序列。
在一些实施方案中，将一组相异的(diverse)条形码序列附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以存在以下或可以存在约以下：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种独特分子标记序列或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的独特分子标记序列。例如，多于一种条形码可以包括约6561种具有不同序列的条形码序列。作为另一种实例，多于一种条形码可以包括约65536种具有不同序列的条形码序列。在一些实施方案中，可以存在至少以下或至多以下：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种或109种独特条形码序列。独特分子标记序列可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，独特分子标记序列部分地或完全地被颗粒(例如，水凝胶珠)包含。
在不同实施方式中，条形码的长度可以是不同的。例如，条形码的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。作为另一种实例，条形码的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
分子标记
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种分子标记。分子标记可以包含条形码序列。在一些实施方案中，分子标记可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。分子标记可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器的核酸序列。
在一些实施方案中，将一组相异的分子标记附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以存在以下或可以存在约以下：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的独特分子标记序列。例如，多于一种条形码可以包括约6561种具有不同序列的分子标记。作为另一种实例，多于一种条形码可以包括约65536种具有不同序列的分子标记。在一些实施方案中，可以存在至少或至多102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种或109种独特分子标记序列。具有独特分子标记序列的条形码可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。
对于使用多于一种随机条形码的条形码化(例如，随机条形码化)，不同分子标记序列的数目与任何靶的出现数目的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。在一些实施方案中，不同分子标记序列的数目与任何靶的出现数目的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。
分子标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。分子标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
靶结合区
条形码可以包含一个或更多个靶结合区，诸如捕获探针。在一些实施方案中，靶结合区可以与感兴趣的靶杂交。在一些实施方案中，靶结合区可以包含与靶(例如，靶核酸、靶分子，例如待分析的细胞核酸)特异性杂交(例如，与特定基因序列特异性杂交)的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含可以附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含能够与限制性酶位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。
在一些实施方案中，靶结合区可以包含非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指可以独立于靶核酸的特定序列结合多于一种靶核酸的序列。例如，靶结合区可以包含随机多聚体序列、多(dA)序列、多(dT)序列、多(dG)序列、多(dC)序列或其组合。例如，靶结合区可以是与mRNA分子上的多(A)尾杂交的寡(dT)序列。随机多聚体序列可以是，例如，随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的所有条形码，靶结合区是相同的。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的多于一种条形码，靶结合区可以包括两种或更多种不同的靶结合序列。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸、或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。例如，使用逆转录酶诸如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶可以逆转录mRNA分子，以产生具有多(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括具有多(dG)尾的靶结合区。在条形码的多(dG)尾和cDNA分子的多(dC)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子转换为条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cDNA分子含有在cDNA分子3’末端上的条形码序列(诸如分子标记)。
在一些实施方案中，靶结合区可以包含寡(dT)，所述寡(dT)可以与包含聚腺苷酸化末端的mRNA杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，可以将靶结合区配置为与靶的特定区域杂交。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。靶结合区的长度可以是约5-30个核苷酸。当条形码包含基因特异性靶结合区时，条形码在本文中可以称为基因特异性条形码。
定向特性(Orientation Property)
随机条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种可以用于定向(例如，比对)条形码的定向特性。条形码可以包含用于等电聚焦的部分。不同的条形码可以包含不同的等电聚焦点。当将这些条形码引入样品中时，样品可以经历等电聚焦，以便于将条形码定向成已知的方式。以这种方式，定向特性可以用于开发样品中条形码的已知的映射。示例性定向特性可以包括电泳迁移率(例如，基于条形码的尺寸)、等电点、自旋、电导率和/或自组装。例如，具有自组装的定向特性的条形码激活时可以自组装成特定的定向(例如，核酸纳米结构)。
亲和特性(Affinity Property)
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种亲和特性。例如，空间标记可以包含亲和特性。亲和特性可以包括可以促进条形码与另一种实体(例如，细胞受体)结合的化学部分和/或生物部分。例如，亲和特性可以包括抗体，例如，对于样品上的特定部分(例如，受体)特异性的抗体。在一些实施方案中，抗体可以将条形码引导至特定细胞类型或分子。在特定细胞类型或分子处和/或特定细胞类型或分子附近的靶可以被标记(例如，被随机标记)。在一些实施方案中，亲和特性可以提供空间标记的核苷酸序列之外的空间信息，因为抗体可以将条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是人源化的或嵌合的。抗体可以是裸抗体或融合抗体。
抗体可以是全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合性)部分(如抗体片段)。
抗体片段可以是例如抗体的一部分，诸如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。在一些实施方案中，抗体片段可以与由全长抗体识别的相同的抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离的片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段和其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于癌细胞抗体、病毒抗体、与细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)结合的抗体和治疗性抗体。
通用衔接子引物
条形码可以包含一种或更多种通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码(诸如基因特异性随机条形码)可以包含通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指遍及所有条形码的通用的核苷酸序列。通用衔接子引物可以用于构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是5-30个核苷酸。
接头
当条形码包含多于一种类型的标记(例如，多于一种细胞标记或多于一种条形码序列，诸如一种分子标记)时，标记之间可以散布有接头标记序列。接头标记序列的长度可以是至少约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。接头标记序列的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。在一些情况下，接头标记序列的长度是12个核苷酸。接头标记序列可以用于促进条形码的合成。接头标记可以包括错误校正(例如，汉明)码。
固体支持物
在一些实施方案中，本文公开的条形码(诸如随机条形码)可以与固体支持物关联。固体支持物可以是例如合成颗粒。在一些实施方案中，固体支持物上的多于一种条形码(例如，第一多于一种条形码)的一些或所有条形码序列(诸如，随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记)相差至少一个核苷酸。同一固体支持物上的条形码的细胞标记可以是相同的。不同的固体支持物上的条形码的细胞标记可以相差至少一个核苷酸。例如，第一固体支持物上的第一多于一种条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，且第二固体支持物上的第二多于一种条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支持物上的第一多于一种条形码的第一细胞标记和第二固体支持物上的第二多于一种条形码的第二细胞标记可以相差至少一个核苷酸。细胞标记可以是例如约5-20个核苷酸长。条形码序列可以是例如约5-20个核苷酸长。合成颗粒可以是例如珠。
珠可以是例如硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。珠可以包括材料诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮或其任何组合。
在一些实施方案中，珠可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合物珠(例如可变形珠或凝胶珠)(诸如来自10X Genomics(San Francisco,CA)的凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶珠可以包括基于聚合物的凝胶。凝胶珠可以例如通过将一种或更多种聚合物前体包封到液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生凝胶珠。
在一些实施方案中，颗粒可以是可破坏的(例如，可溶解的、可降解的)。例如，聚合物珠可以例如在期望的条件下溶解、熔化或降解。所期望的条件可以包括环境条件。所期望的条件可以导致聚合物珠以受控方式溶解、熔化或降解。凝胶珠可以由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁刺激、电刺激、光刺激或其任何组合而溶解、熔化或降解。
例如，分析物和/或试剂(诸如寡核苷酸条形码)可以偶联/固定至凝胶珠的内表面(例如，经由寡核苷酸条形码和/或用于产生寡核苷酸条形码的材料的扩散而可及的内部)和/或凝胶珠的外表面或本文描述的任何其他微胶囊。偶联/固定可以经由任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)。在一些实施方案中，本文描述的试剂与凝胶珠或任何其他微胶囊的偶联/固定可以是可逆的，诸如，例如经由不稳定型部分(例如，经由化学交联物，包括本文描述的化学交联物)。在施加刺激后，不稳定型部分可以被裂解并释放所固定的试剂。在一些实施方案中，不稳定型部分是二硫键。例如，在经由二硫键将寡核苷酸条形码固定至凝胶珠的情况下，使二硫键暴露于还原剂可以裂解二硫键并从珠释放寡核苷酸条形码。不稳定型部分可以作为凝胶珠或微胶囊的一部分、作为将试剂或分析物与凝胶珠或微胶囊连接的化学接头的一部分和/或作为试剂或分析物的一部分被包括。在一些实施方案中，多于一种条形码的至少一种条形码可以被固定在颗粒上、被部分固定在颗粒上、被包封在颗粒中、被部分包封在颗粒中或其任何组合。
在一些实施方案中，凝胶珠可以包括宽范围的不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感聚合物、盐敏感聚合物、化学敏感聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白和/或塑料。聚合物可以包括但不限于以下材料：诸如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸酯)(PSS)、聚(烯丙基胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(双烯丙基二甲基-氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯)(poly(pyrolle)，PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(邻苯二甲醛)(PPA)、聚(己基紫精)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
许多化学刺激可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。这些化学改变的实例可以包括但不限于pH介导的珠壁改变、经由交联键的化学裂解使珠壁崩解、珠壁的触发解聚和珠壁转换反应。批量(bulk)改变也可以用于触发珠的破坏。
通过各种刺激对微胶囊的批量或物理改变在设计胶囊以释放试剂方面也提供了许多优点。在宏观尺度上发生批量或物理改变，其中珠破裂是由刺激引起的机械-物理力的结果。这些过程可以包括但不限于压力引起的破裂、珠壁熔化或珠壁的孔隙率的改变。
生物刺激也可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。通常，生物触发物类似于化学触发物，但是许多实例使用生物分子或生命系统中常见的分子，诸如酶、肽、糖、脂肪酸、核酸等。例如，珠可以包含具有对特定蛋白酶的裂解敏感的肽交联的聚合物。更特别地，一种实例可以包括包含GFLGK肽交联的微胶囊。在添加生物触发物(诸如蛋白酶组织蛋白酶B)后，壳壁的肽交联被裂解并且珠的内容物被释放。在其他情况下，蛋白酶可以是热激活的。在另一种实例中，珠包括包含纤维素的壳壁。壳聚糖水解酶的添加用作纤维素键裂解、壳壁解聚及其内部内容物释放的生物触发物。
还可以在施加热刺激后诱导珠释放其内容物。温度的改变可以引起珠的各种改变。热量的变化可以引起珠熔化，使得珠壁崩解。在其他情况下，热量可以增加珠内部组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。在又其他的情况下，热量可以使珠转化成收缩的脱水状态。热量还可以作用于珠壁内的热敏聚合物，从而引起珠的破坏。
将磁性纳米颗粒包括在微胶囊的珠壁中可以允许珠的触发破裂以及将珠引导成阵列。本公开内容的装置可以包括用于任一目的的磁珠。在一种实例中，将Fe3O4纳米颗粒掺入含聚电解质的珠中，在存在振荡磁场刺激的情况下触发破裂。
珠也可以由于电刺激的结果被破坏、溶解或降解。与先前部分中描述的磁性颗粒类似，电敏珠可以允许珠的触发破裂以及其他功能，诸如电场中的对齐、电导率或氧化还原反应。在一种实例中，含电敏材料的珠在电场中对齐，从而可以控制内部试剂的释放。在其他实例中，电场可以在珠壁本身内引起氧化还原反应，这可以增加孔隙率。
也可以使用光刺激来破坏珠。许多光触发物是可能的，并且可以包括使用各种分子(诸如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团)的系统。例如，金属氧化物涂层可以用作胶囊触发物。涂覆有SiO2的聚电解质胶囊的UV照射可以导致珠壁的崩解。在又另一种实例中，可以将可光切换材料(诸如偶氮苯基团)掺入珠壁中。在施加UV或可见光后，诸如这些的化学物质在吸收光子后经历可逆的顺式至反式异构化。在此方面，掺入光子开关(photon switch)产生在施加光触发物后可以崩解或变得更多孔的珠壁。
例如，在图2中图示的条形码化(例如，随机条形码化)的非限制性实例中，在框208处将细胞(诸如单细胞)引入微孔阵列的多于一个微孔上之后，在框212处可以将珠引入微孔阵列的多于一个微孔上。每个微孔可以包含一个珠。珠可以包含多于一种条形码。条形码可以包含附接至珠的5’胺区域。条形码可以包含通用标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶结合区或其任何组合。
本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。与固体支持物关联的条形码可各自包含选自以下组的条形码序列，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的条形码序列。在一些实施方案中，与固体支持物关联的不同条形码可以包含具有不同序列的条形码。在一些实施方案中，与固体支持物关联的条形码的一定百分比包含相同的细胞标记。例如，百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。作为另一个实例，所述百分比可以是至少以下或可以是至多以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，与固体支持物关联的条形码可以具有相同的细胞标记。与不同固体支持物关联的条形码可以具有选自下组的不同的细胞标记，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的细胞标记。
本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。在一些实施方案中，可以用包括与多于一种条形码关联的多于一种合成颗粒的固体支持物将样品中的多于一种靶条形码化。在一些实施方案中，固体支持物可以包括与多于一种条形码关联的多于一个合成颗粒。不同固体支持物上的多于一种条形码的空间标记可以相差至少一个核苷酸。固体支持物可以例如在二维或三维包括多于一种条形码。合成颗粒可以是珠。珠可以是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。固体支持物可以包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物可以自由浮动。在一些实施方案中，固体支持物可以包埋到半固体或固体阵列中。条形码可以不与固体支持物关联。条形码可以是单独的核苷酸。条形码可以与基底关联。
如本文使用的，术语“拴系的”、“附接的”和“固定的”可以互换使用，并且可以指用于将条形码附接至固体支持物的共价或非共价方式。可以将各种不同的固体支持物中的任何一种用作固体支持物，以用于附接预先合成的条形码或用于原位固相合成条形码。
在一些实施方案中，固体支持物是珠。珠可以包括一种或更多种类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)的其他类似配置。珠可以由例如塑料、陶瓷、金属、聚合物材料或其任何组合构成。珠可以是或包括球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。在一些实施方案中，珠的形状可以是非球形的。
珠可以包含包括但不限于以下的各种材料：顺磁材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁材料(例如，铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴，它们的一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙或其任何组合。
在一些实施方案中，珠(例如，标记所附接的珠)是水凝胶珠。在一些实施方案中，珠包括水凝胶。
本文公开的一些实施方案包括一个或更多个颗粒(例如，珠)。每个颗粒可以包含多于一种寡核苷酸(例如，条形码)。多于一种寡核苷酸中的每一种可以包含条形码序列(例如，分子标记序列)、细胞标记和靶结合区(例如，寡(dT)序列、基因特异性序列、随机多聚体或其组合)。多于一种寡核苷酸的每一种的细胞标记序列可以是相同的。不同颗粒上的寡核苷酸的细胞标记序列可以是不同的，使得可以鉴定不同颗粒上的寡核苷酸。在不同实施方式中，不同细胞标记序列的数目可以是不同的。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是以下或可以是约以下：10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种、20000种、30000种、40000种、50000种、60000种、70000种、80000种、90000种、100000种、106种、107种、108种、109种、在这些值中的任何两个之间的数字或范围或更多。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是至少以下或可以是至多以下：10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种、20000种、30000种、40000种、50000种、60000种、70000种、80000种、90000种、100000种、106种、107种、108种或109种。在一些实施方案中，多于一个颗粒中不多于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个或更多个包含具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，包含具有相同细胞序列的寡核苷酸的多于一个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施方案中，多于一个颗粒全都不具有相同的细胞标记序列。
在每个颗粒上的多于一种寡核苷酸可以包含不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是以下或可以是约以下：10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种、20000种、30000种、40000种、50000种、60000种、70000种、80000种、90000种、100000种、106种、107种、108种、109种或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是至少以下或可以是至多以下：10种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种、20000种、30000种、40000种、50000种、60000种、70000种、80000种、90000种、100000种、106种、107种、108种或109种。例如，多于一种寡核苷酸中的至少100种包含不同的条形码序列。作为另一种实例，在单个颗粒中，多于一种寡核苷酸中的至少100种、500种、1000种、5000种、10000种、15000种、20000种、50000种、这些值中的任何两个之间的数字或范围或更多种包含不同的条形码序列。一些实施方案提供了多于一种包含条形码的颗粒。在一些实施方案中，待标记的靶和不同条形码序列的出现(或拷贝或数目)的比例可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或更高。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸的每一种还包含样品标记、通用标记或二者。颗粒可以是例如纳米颗粒或微米颗粒。
珠的尺寸可以不同。例如，珠的直径的范围可以是0.1微米至50微米。在一些实施方案中，珠的直径可以是以下或可以是约以下：0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。
珠的直径可以与基底的孔的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短以下或者约以下：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。珠的直径可以与细胞(例如，被基底的孔捕获的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。珠的直径可以与细胞(例如，被基底的孔捕获的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短以下或者约以下：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。
珠可以附接至基底和/或包埋到基底中。珠可以附接至凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质和/或包埋到凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。珠在基底(例如凝胶、基质、支架或聚合物)中的空间位置可以使用珠上的条形码上存在的空间标记来鉴定，该空间标记可以用作位置地址。
珠的实例可以包括但不限于链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、
Figure BDA0003869949420000431
微珠、抗体缀合的珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、蛋白A缀合的珠、蛋白G缀合的珠、蛋白A/G缀合的珠、蛋白L缀合的珠、寡(dT)缀合的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠和BcMagTM羧基封端磁珠。
珠可以与量子点或荧光染料关联(例如，用量子点或荧光染料浸渍)，以使其在一个荧光光学通道或多于一个光学通道中发荧光。珠可以与氧化铁或氧化铬关联，使其成为顺磁性或铁磁性。珠可以是可鉴定的。例如，可以使用照相机对珠成像。珠可以具有与珠关联的可检测代码。例如，珠可以包含条形码。珠可以改变尺寸，例如由于在有机溶液或无机溶液中溶胀。珠可以是疏水的。珠可以是亲水的。珠可以是生物相容的。
固体支持物(例如，珠)可以被可视化。固体支持物可以包含可视化标签(例如，荧光染料)。固体支持物(例如，珠)可以蚀刻有标识符(例如，数字)。标识符可以通过对珠成像来可视化。
固体支持物可以包括可溶性、半溶性或不溶性材料。当固体支持物包括接头、支架、构建模块(building block)或其他与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“官能化的”，而当固体支持物缺少这种与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以以溶液中游离，诸如在微量滴定孔中的形式；以流通形式，诸如在柱中；或以浸量尺(dipstick)使用。
固体支持物可以包括膜、纸(paper)、塑料、涂覆表面、平坦表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合。固体支持物可以采取树脂、凝胶、微球或其他几何配置的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片、微米颗粒、纳米颗粒、板、阵列、毛细管、平坦支持物诸如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、硅和铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片、塑料材料包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成)，和/或晶片、梳、针或针头(例如，适于组合合成或分析的针阵列)或珠，平坦表面诸如晶片(例如，硅晶片)的凹陷或纳升孔阵列，具有凹陷的晶片(具有或不具有过滤器底部)。
固体支持物可以包括聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可以能够渗透细胞内空间(例如，细胞器周围)。聚合物基质可以能够被泵送到整个循环系统。
基底和微孔阵列
如本文使用的，基底可以指固体支持物类型。基底可以指可以包含本公开内容的条形码或随机条形码的固体支持物。基底可以例如包括多于一个微孔。基底可以例如是包括两个或更多个微孔的孔阵列。在一些实施方案中，微孔可以包括定义体积的小的反应室。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个细胞。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个细胞。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个固体支持物。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个固体支持物。在一些实施方案中，微孔捕获单细胞和单个固体支持物(例如，珠)。微孔可以包含本公开内容的条形码试剂。
条形码化的方法
本公开内容提供了用于估计身体样品(例如，组织、器官、肿瘤、细胞)中不同位置处的不同靶的数目的方法。该方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)紧密接近样品放置，裂解样品，将不同的靶与条形码关联，对靶进行扩增和/或对靶进行数字计数。该方法还可以包括对从条形码上的空间标记获得的信息进行分析和/或可视化。在一些实施方案中，该方法包括使样品中的多于一种靶可视化。将多于一种靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在将样品中的多于一种靶条形码化(例如，随机条形码化)之前或之后产生二维映射图和三维映射图。将样品中的多于一种靶可视化可以包括将多于一种靶映射到样品的映射图上。将多于一种靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在对样品中的多于一种靶进行条形码化之前或之后生成二维映射图和三维映射图。在一些实施方案中，可以在裂解样品之前或之后生成二维映射图和三维映射图。在产生二维映射图或三维映射图之前或之后裂解样品可以包括加热样品、使样品与去污剂接触、改变样品的pH或其任何组合。
在一些实施方案中，将多于一种靶条形码化包括将多于一种条形码与多于一种靶杂交以产生条形码化靶(例如，随机条形码化的靶)。将多于一种靶条形码化可以包括产生条形码化靶的索引文库。产生条形码化靶的索引文库可以用包含多于一种条形码(例如，随机条形码)的固体支持物来进行。
使样品和条形码接触
本公开内容提供了用于使样品(例如，细胞)与本公开内容的基底接触的方法。可以使包括例如细胞、器官或组织薄切片的样品与条形码(例如，随机条形码)接触。细胞可以例如通过重力流来接触，其中可以使细胞沉淀并且产生单层。样品可以是组织薄切片。可以将薄切片放置于基底上。样品可以是一维的(例如，形成平坦表面)。可以使样品(例如，细胞)分散遍及基底，例如，通过在基底上生长/培养细胞。
当条形码紧密接近靶时，靶可以与条形码杂交。条形码可以按不可耗尽的比例接触，使得每种不同的靶可以与本公开内容的不同条形码关联。为了确保靶与条形码之间的有效关联，可以将靶与条形码交联。
细胞裂解
在细胞和条形码的分配之后，可以将细胞裂解以释放靶分子。细胞裂解可以通过各种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解的手段。可以通过添加包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)、有机溶剂(例如，甲醇或丙酮)或消化酶(例如，蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。为了增加靶与条形码的关联，可以通过例如降低裂解物的温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。
在一些实施方案中，可以使用滤纸来裂解样品。可以在滤纸上部用裂解缓冲液浸泡滤纸。可以将滤纸用压力施加至样品，这可以促进样品的裂解以及样品的靶与基底的杂交。
在一些实施方案中，裂解可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解和/或化学裂解来进行。化学裂解可以包括使用消化酶，诸如蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶。裂解可以通过将裂解缓冲液添加至基底来进行。裂解缓冲液可以包含Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至少约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至多约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含约0.1M Tris HCl。裂解缓冲液的pH可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。裂解缓冲液的pH可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH是约7.5。裂解缓冲液可以包含盐(例如，LiCl)。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至少约0.1M、0.5M或1M或更高。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至多约0.1M、0.5M或1M或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的盐浓度是约0.5M。裂解缓冲液可以包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、triton X、tween、NP-40)。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至多约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的去污剂浓度是约1％的十二烷基硫酸锂。裂解方法中使用的时间可以取决于所使用的去污剂的量。在一些实施方案中，使用的去污剂越多，裂解所需的时间越少。裂解缓冲液可以包含螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的螯合剂浓度是约10mM。裂解缓冲液可以包含还原剂(例如，β-巯基乙醇、DTT)。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。裂解缓冲液中还原剂的浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的还原剂浓度是约5mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液可以包含约0.1M Tris HCl，约pH 7.5，约0.5M LiCl，约1％十二烷基硫酸锂，约10mM EDTA和约5mM DTT。
裂解可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的温度进行。裂解可以进行约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟或20分钟或更多分钟。裂解的细胞可以包含至少约100000种、200000种、300000种、400000种、500000种、600000种或700000种或更多种靶核酸分子。裂解的细胞可以包含至多约100000种、200000种、300000种、400000种、500000种、600000种或700000种或更多种靶核酸分子。
将条形码附接至靶核酸分子
在细胞裂解和核酸分子从细胞释放之后，核酸分子可以与共定位的固体支持物的条形码随机关联。关联可以包括使条形码的靶识别区与靶核酸分子的互补部分杂交(例如，条形码的寡(dT)可以与靶的多(A)尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如，缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定的杂交体。在一些实施方案中，可以将从裂解的细胞释放的核酸分子与基底上的多于一种探针关联(例如，与基底上的探针杂交)。当探针包含寡(dT)时，可以将mRNA分子与探针杂交并且逆转录。寡核苷酸的寡(dT)部分可以充当用于cDNA分子的第一链合成的引物。例如，在图2中框216处图示的条形码化的非限制性实例中，mRNA分子可以与珠上的条形码杂交。例如，单链的核苷酸片段可以与条形码的靶结合区杂交。
附接还可以包括将条形码的靶识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，靶结合区可以包含可以能够与限制性位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。测定程序还可以包括用限制性酶(例如，EcoRI)处理靶核酸以产生限制性位点突出端。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可以用于连接两个片段。
例如，在图2中框220处图示的条形码化的非限制性实例中，随后可以将来自多于一个细胞(或多于一个样品)的标记的靶(例如，靶-条形码分子)汇集至例如管中。标记的靶可以通过例如回收(retrieving)条形码和/或附接靶-条形码分子的珠来汇集。
可以通过使用磁珠和外部施加的磁场来实现附接的靶-条形码分子的基于固体支持物的集合的回收。汇集靶-条形码分子后，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。进一步的处理可以包括，例如，逆转录反应、扩增反应、裂解反应、解离反应和/或核酸延伸反应。进一步的处理反应可以在微孔内进行，即，不先汇集来自多于一个细胞的标记的靶核酸分子。
逆转录或核酸延伸
本公开内容提供了使用逆转录(例如，在图2的框224处)或核酸延伸来产生靶-条形码缀合物的方法。靶-条形码缀合物可以包含条形码以及靶核酸的全部或一部分的互补序列(即，条形码化的cDNA分子，诸如随机条形码化的cDNA分子)。关联的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶而发生。逆转录引物可以是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。寡(dT)引物的长度可以是12-18个核苷酸或可以是约12-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’端的内源多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，mRNA分子向标记的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物而发生。在一些实施方案中，逆转录引物是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡(dT)引物的长度是12-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’端的内源多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，靶是cDNA分子。例如，使用逆转录酶诸如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶可以逆转录mRNA分子，以产生具有多(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括具有多(dG)尾的靶结合区。在条形码的多(dG)尾和cDNA分子的多(dC)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子转换为条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cDNA分子含有在cDNA分子3’末端上的条形码序列(诸如分子标记)。
逆转录可以重复地发生以产生多于一个标记的cDNA分子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次逆转录反应。该方法可以包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次逆转录反应。
扩增
可以进行一个或更多个核酸扩增反应(例如，在图2的框228处)以产生标记的靶核酸分子的多于一个拷贝。扩增可以以多重化方式进行，其中多于一种靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可以用于向核酸分子添加测序衔接子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶核酸或其组合的至少一部分。扩增反应可以包括扩增多于一种核酸的0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或在这些值中的任何两个之间的范围或数字。该方法还可以包括进行一个或更多个cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的靶-条形码分子的一个或更多个cDNA拷贝。
在一些实施方案中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如本文使用的，PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。如本文使用的，PCR可以包括所述反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重化PCR、数字PCR和装配PCR。
标记的核酸的扩增可以包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性核酸内切酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’核酸外切酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些实施方案中，扩增不产生环化转录物。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)进行聚合酶链式反应以产生标记的扩增子(例如，随机标记的扩增子)。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)。标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本公开内容的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括，但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的靶(例如，随机标记的靶)的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的靶的3’端或5’端。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的靶的内部区域。内部区域可以与多于一种标记的靶的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种基因特异性引物。
一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶或其任何组合。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以设计成扩增一种或更多种靶。靶可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。靶可以包括一个或更多个样品中总标记靶的子集。一种或更多种引物可以包括至少96种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少960种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少9600种或更多种定制引物。一种或更多种定制引物可以退火至两种或更多种不同的标记的核酸。两种或更多种不同的标记的核酸可以对应于一种或更多种基因。
可以在本公开内容的方法中使用任何扩增方案。例如，在一种方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物来扩增附接至珠的分子。第二轮PCR可以使用侧翼为Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引，以使PCR产物变成Illumina测序文库。使用150bp×2测序的测序可以揭示读段1上的细胞标记和条形码序列(例如，分子标记)、读段2上的基因以及索引1读段上的样品索引。
在一些实施方案中，可以使用化学裂解将核酸从基底去除。例如，存在于核酸中的化学基团或修饰的碱基可以用于促进将核酸从固体支持物去除。例如，酶可以用于将核酸从基底去除。例如，通过限制性核酸内切酶消化可以将核酸从基底去除。例如，用尿嘧啶-d-糖苷酶(UDG)处理含dUTP或ddUTP的核酸可以用于将核酸从基底去除。例如，可以使用进行核苷酸切除的酶(诸如，碱基切除修复酶，诸如无嘌呤/无嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)核酸内切酶)将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可光裂解基团以及光将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可裂解接头将核酸从基底去除。例如，可裂解接头可以包括以下中的至少一种：生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、Ig蛋白A、光不稳定型接头、酸或碱不稳定型接头基团或适配体。
当探针是基因特异性时，可以将分子与探针杂交，并且逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，核酸可以被扩增。扩增可以以多重方式进行，其中多种靶核酸序列同时扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。
在一些实施方案中，可以例如用桥接扩增在基底上进行扩增。cDNA可以加同聚物尾，以便产生相容末端，用于使用基底上的寡(dT)探针进行桥接扩增。在桥接扩增中，与模板核酸的3’末端互补的引物可以是共价地附接至固体颗粒的每对引物中的第一引物。当包含模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，可以将模板分子退火至第一引物，并且第一引物通过添加核苷酸而向前延长以形成双链体分子，所述双链体分子由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链构成。在下一循环的加热步骤中，双链体分子可以变性，从颗粒释放模板分子并且留下通过第一引物附接至颗粒的互补DNA链。在随后的退火和延长步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的区段互补。这种杂交可导致互补链在第一引物和第二引物之间形成桥，通过共价键连接第一引物并通过杂交连接第二引物。在延长阶段，在同一反应混合物中通过添加核苷酸，第二引物可以在反向方向上延长，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且双链桥可以变性以产生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子具有的一个末端分别经由第一引物和第二引物附接至颗粒表面，其中每个单链核酸分子的另一个末端是未附接的。在这第二个循环的退火和延长步骤中，每条链可以与同一颗粒上先前未使用的另外的互补引物杂交，以形成新的单链桥。现在杂交的两个先前未使用的引物延长从而将两个新的桥转换成双链桥。
扩增反应可以包括扩增多于一种核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。
标记的核酸的扩增可以包括基于PCR的方法或非基于PCR的方法。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的指数式扩增。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的线性扩增。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)来进行。PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重化PCR、数字PCR、抑制PCR、半抑制PCR以及装配PCR。
在一些实施方案中，标记的核酸的扩增包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和/或分支延伸扩增(RAM)。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对扩增的扩增子(例如，靶)进行巢式聚合酶链式反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标签或分子标识符标记。可选地，扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本发明的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
在一些实施方案中，该方法包括反复扩增标记的核酸以产生多于一个扩增子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次扩增反应。可选地，该方法包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次扩增反应。
扩增可以还包括将一种或更多种对照核酸添加至一个或更多个包含多于一种核酸的样品中。扩增可以还包括将一种或更多种对照核酸添加至多于一种核酸。对照核酸可以包含对照标记。
扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定型和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括一种或更多种寡核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含至少约7-9个核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的核酸的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的核酸的3’端和/或5’端。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的核酸的内部区域。内部区域可以与多于一种标记的核酸的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种管家基因引物。一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标签、第二样品标签、分子标识符标记、核酸或其产物。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或更多种靶核酸。靶核酸可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。在一些实施方案中，引物是与本公开内容的阵列附接的探针。
在一些实施方案中，将样品中的多于一种靶条形码化(例如，随机条形码化)还包括产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)或靶的条形码化片段的索引文库。不同的条形码的条形码序列(例如，不同的随机条形码的分子标记)可以彼此不同。产生条形码化靶的索引文库包括从样品中的多于一种靶产生多于一种索引多核苷酸。例如，对于包括第一索引靶和第二索引靶的条形码化靶的索引文库，第一索引多核苷酸的标记区与第二索引多核苷酸的标记区可以相差以下、相差约以下、相差至少以下或相差至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个核苷酸或在这些值中的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，产生条形码化靶的索引文库包括使多于一种靶(例如mRNA分子)与包含多(T)区和标记区的多于一种寡核苷酸接触；以及使用逆转录酶进行第一链合成以产生单链标记的cDNA分子(每种包含cDNA区和标记区)，其中多于一种靶包括至少两种不同序列的mRNA分子，且多于一种寡核苷酸包括至少两种不同序列的寡核苷酸。产生条形码化靶的索引文库还可以包括扩增单链标记的cDNA分子以产生双链标记的cDNA分子；以及对双链标记的cDNA分子进行巢式PCR以产生标记的扩增子。在一些实施方案中，该方法可以包括产生衔接子标记的扩增子。
条形码化(例如，随机条形码化)可以包括使用核酸条形码或标签以标记单种核酸(例如，DNA或RNA)分子。在一些实施方案中，其包括在从mRNA产生cDNA分子时将DNA条形码或标签添加至cDNA分子。可以进行巢式PCR以使PCR扩增偏倚最小化。可以添加用于测序(例如下一代测序(NGS))使用的衔接子。例如在图2的框232处，可以使用测序结果来确定靶的一个或更多个拷贝的细胞标记、分子标记和核苷酸片段的序列。
图3是示出了产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的索引文库，诸如条形码化的mRNA或其片段的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。如步骤1中示出的，逆转录过程可以用独特分子标记序列、细胞标记序列和通用PCR位点对每个mRNA分子进行编码。具体地，通过将一组条形码(例如，随机条形码)310与RNA分子302的多(A)尾区308杂交(例如，随机杂交)，可以将RNA分子302逆转录以产生标记的cDNA分子304(包括cDNA区306)。条形码310中的每一个可以包括靶结合区，例如多(dT)区312、标记区314(例如，条形码序列或分子)和通用PCR区316。
在一些实施方案中，细胞标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，分子标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，多于一种随机条形码中的每一种还包括通用标记和细胞标记中的一种或更多种，其中通用标记对于固体支持物上的多于一种随机条形码是相同的，并且细胞标记对于固体支持物上的多于一种随机条形码是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，细胞标记包含3个至20个核苷酸。
在一些实施方案中，标记区314可以包含条形码序列或分子标记318和细胞标记320。在一些实施方案中，标记区314可以包括通用标记、维度标记和细胞标记中的一种或更多种。条形码序列或分子标记318的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸，或这些值中的任何之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记320的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸，或这些值中的任何之间的数字或范围的核苷酸。通用标记的长度可以是以下、可以是约以下，可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸，或这些值中的任何之间的数字或范围的核苷酸。通用标记对于固体支持物上的多于一种随机条形码可以是相同的，并且细胞标记是对于固体支持物上的多于一种随机条形码相同的。维度标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值中的任何之间的数字或范围的核苷酸。
在一些实施方案中，标记区314可以包括以下、包括约以下、包括至少以下或包括至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个不同标记或在这些值中的任何之间的数字或范围的不同标记，诸如条形码序列或分子标记318和细胞标记320。每种标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值中的任何之间的数字或范围的核苷酸。一组条形码或随机条形码310可以包括以下、包括约以下、包括至少以下或可以是至多以下：10个、20个、40个、50个、70个、80个、90个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1020个条形码或随机条形码310或在这些值中的任何之间的数字或范围的条形码或随机条形码310。并且条形码或随机条形码310的组可以例如，各自包含独特标记区314。标记的cDNA分子304可以进行纯化以去除过量的条形码或随机条形码310。纯化可以包括Ampure珠纯化。
如步骤2中示出的，来自步骤1中的逆转录过程的产物可以汇集到1个管中，且用第1PCR引物池和第1通用PCR引物进行PCR扩增。因为独特标记区314，汇集是可能的。特别地，可以将标记的cDNA分子304扩增以产生巢式PCR标记的扩增子322。扩增可以包括多重PCR扩增。扩增可以包括以单一反应体积用96种多重引物进行的多重PCR扩增。在一些实施方案中，在单一反应体积中，多重PCR扩增可以利用以下、利用约以下、利用至少以下或利用至多以下：10种、20种、40种、50种、70种、80种、90种、102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种、1010种、1011种、1012种、1013种、1014种、1015种、1020种多重引物或在这些值中的任何之间的数字或范围的多重引物。扩增可以包括使用第1PCR引物池324，所述第1PCR引物池324包括靶向特定基因的定制引物326A-C和通用引物328。定制引物326可以与标记的cDNA分子304的cDNA部分306’内的区域杂交。通用引物328可以与标记的cDNA分子304的通用PCR区域316杂交。
如图3的步骤3中示出的，来自步骤2中的PCR扩增的产物可以用巢式PCR引物池和第2通用PCR引物扩增。巢式PCR可以使PCR扩增偏倚最小化。特别地，巢式PCR标记的扩增子322可通过巢式PCR进行进一步扩增。巢式PCR可以包括在单一反应体积中用巢式PCR引物332a-c的巢式PCR引物池330和第2通用PCR引物328’进行的多重PCR。巢式PCR引物池330可以包含以下、包含约以下、包含至少以下或包含至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种不同的巢式PCR引物332或在这些值中的任何之间的数字或范围的不同的巢式PCR引物332。巢式PCR引物332可以包含衔接子334，并与标记的扩增子322的cDNA部分306”内的区域杂交。通用引物328’可以包含衔接子336，并与标记的扩增子322的通用PCR区域316杂交。由此，步骤3产生衔接子标记的扩增子338。在一些实施方案中，巢式PCR引物332和第2通用PCR引物328’可以不包含衔接子334和衔接子336。而是，衔接子334和衔接子336可以连接至巢式PCR的产物以产生衔接子标记的扩增子338。
如步骤4中示出的，可以使用文库扩增引物将来自步骤3的PCR产物进行PCR扩增用于测序。特别地，可以使用衔接子334和衔接子336对衔接子标记的扩增子338进行一个或更多个另外的测定。衔接子334和衔接子336可以与引物340和引物342杂交。一种或更多种引物340和引物342可以是PCR扩增引物。一种或更多种引物340和引物342可以是测序引物。一种或更多种衔接子334和衔接子336可以用于衔接子标记的扩增子338的进一步扩增。一种或更多种衔接子334和衔接子336可以用于对衔接子标记的扩增子338测序。引物342可以包含板索引344，使得使用同一组条形码或随机条形码310产生的扩增子可以使用下一代测序(NGS)在一个测序反应中测序。
用于分区索引的方法和组合物
本文的公开内容包括用于分区索引的系统、方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，提供了用于单细胞的空间映射的条形码化分区(例如，孔)。在一些实施方案中，与分区(例如，孔)关联(例如，附接)的条形码化寡核苷酸可以在成像数据和测序数据之间实现分区中细胞位置的联系。本文提供的条形码化分区(例如，孔)可以用于通过测序对单细胞进行空间映射。
本文提供的方法和组合物可以改进单细胞工作流程。单细胞工作流程可以利用微孔阵列或微孔盒(例如，BD RhapsodyTM)或微流体装置(例如，10X Genomics(SanFrancisco,CA)、Drop-seq(McCarroll Lab,Harvard Medical School(Cambridge,Massachusetts)、Macosko等人,Cell,2015年5月21日16；5:1202，其内容通过引用以其整体并入本文)，或与条形码诸如随机条形码(例如，BD Rhapsody或Drop-seq)关联的固体颗粒或半固体颗粒组合的Abseq(Mission Bio(San Francisco,CA)；Shahi等人,Sci Rep.2017年3月14日；7:44447，其内容特此通过引用以其整体并入)，或包封可释放条形码诸如随机条形码(例如，10X Genomics或Abseq)的可破坏水凝胶颗粒。在一些实施方案中，提供了分区，诸如例如，微孔盒(例如，BD RhapsodyTM)，所述微孔盒在每个分区(例如，孔)中包含独特条形码序列(例如，包含分区索引序列的分区索引寡核苷酸)，其使使用者能够将来自测序数据的细胞标记与多于一个分区中的特定分区(例如，盒中的特定孔位置)关联。例如，通过获取成像数据(例如，Rhapsody扫描仪在几个步骤中拍摄盒的图像)，人们可以使用本文提供的方法和组合物来将来自这些图像的盒的特定位置中的细胞与测序数据关联。在一些实施方案中，每个分区(例如，盒孔)打印有数十到数百个寡核苷酸，所述寡核苷酸包含以下中的一种或更多种：1)对每个孔独特的条形码，2)用于测序文库产生的通用扩增区，和3)通过例如多A尾实现固体支持物(例如，Rhapsody细胞捕获珠)捕获的捕获区。这些寡核苷酸还可以包含任选的裂解间隔区/序列(例如，二硫键)以实现Rhapsody细胞捕获珠的更有效的捕获和从Rhapsody细胞捕获珠的延伸。这种裂解可以发生在细胞裂解期间。每个分区(例如，孔)可以含有一个固体支持物(例如，珠)和一个细胞。珠可以包含能够捕获来自裂解的细胞的mRNA的寡核苷酸条形码，以及分区索引寡核苷酸。分区(例如，孔)中的所有分区索引寡核苷酸可以含有相同的条形码(例如，分区索引序列)，并且每个分区可以具有不同的条形码。例如，Rhapsody盒的每个孔可以包含不同的条形码(例如，分区索引序列)，其对不同盒之间的该孔位置是相同的。分区索引寡核苷酸可以包含能够在细胞裂解期间实现脱离的裂解实体。
图4A-图4B描绘了如本文描述的包含分区索引寡核苷酸的分区的非限制性示例性设计。多于一个分区400(例如，包含多于一个微孔的微孔阵列)可以各自包含多于一种分区索引寡核苷酸。分区索引寡核苷酸可以各自包含分区索引序列。位于同一分区内的分区索引寡核苷酸可以包含相同的分区索引序列。位于不同分区内的分区索引寡核苷酸可以包含不同的分区索引序列。每个分区的分区索引寡核苷酸可以各自包含预定的分区索引序列(例如，可以是使用者已知的每个分区中存在的分区索引寡核苷酸的独特分区索引序列)。因此，由于分区包含具有已知(例如，预定的)分区索引序列的分区索引寡核苷酸，使用者可以：(i)在被提供与独特分区关联的预定的分区索引序列时，定位多于一个分区中的该独特分区，和/或(ii)召回(recall)与多于一个分区中的每个独特分区关联的预定的分区索引序列。多于一个固体支持物和多于一个单细胞可以被分区到多于一个分区。例如，多于一个分区400(例如，微孔阵列)的第一分区402a(例如，微孔)可以包含多于一种分区索引寡核苷酸404a、第一固体支持物406a和第一单细胞412a。第一单细胞412a可以包含核酸靶410a的拷贝。第一固体支持物406a可以包含第一多于一种寡核苷酸条形码408a。多于一个分区400中的第二分区402b可以包含第二多于一种分区索引寡核苷酸404b、第二固体支持物406b和第二单细胞412b。第二单细胞412b可以包含核酸靶410b的拷贝。第二固体支持物406b可以包含第二多于一种寡核苷酸条形码408b。第一多于一种寡核苷酸条形码408a可以包含相同的预定的分区索引序列。第二多于一种寡核苷酸条形码408b可以包含相同的预定的分区索引序列。第一多于一种寡核苷酸条形码408a和第二多于一种寡核苷酸条形码408b的预定的分区索引序列可以是不同的。在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码不与固体支持物关联。在一些这样的实施方案中，该方法可以包括：将多于一种寡核苷酸条形码和多于一个单细胞分区到多于一个分区。寡核苷酸条形码中的每一种可以包含细胞标记序列。位于同一分区中的多于一种寡核苷酸条形码的细胞标记可以包括相同的细胞标记序列。位于不同分区中的多于一种寡核苷酸条形码的细胞标记序列可以彼此不同。在一些实施方案中，每个经分区的寡核苷酸条形码相对于同一分区内的寡核苷酸条形码具有相同的细胞标记序列。在一些实施方案中，每个经分区的寡核苷酸条形码相对于其他分区内的寡核苷酸条形码具有不同的细胞标记序列。
在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸通过捕获区被寡核苷酸条形码捕获并被扩增。在通过捕获区与条形码杂交(例如，在Rhapsody珠上)后，逆转录酶可以将细胞标记序列添加到孔寡核苷酸(例如，分区索引寡核苷酸)。然后，可以使用用于通用孔寡核苷酸扩增序列的引物(例如，引物衔接子、第二通用序列)以及用于所有文库类型的通用扩增序列(例如，mRNA、样品标签、AbSeq)来制备测序文库。分区索引寡核苷酸可以包括通用孔寡核苷酸扩增区、孔条形码(例如，分区索引序列)和多dA或其他捕获区。寡核苷酸条形码可以包含多T尾或其他捕获序列、细胞条形码和分子条形码以及通用P5序列。分区索引寡核苷酸与Rhapsody珠的杂交可以通过珠捕获序列(例如多dT尾)发生，并且向cDNA的转化可以通过逆转录进行。逆转录酶可以产生杂交的分区索引寡核苷酸的互补体。
可用于文库制备的两种方法包括三步PCR方法和两步PCR方法。这两种方法都可以包括使用含有部分P7序列的孔寡核苷酸特异性引物的PCR，然后是添加全长Illumina序列的索引PCR(包括用于在Illumina测序仪上去多重化的索引)。索引PCR可以包括用2种Illumina引物进行扩增，并且P5和P7可用于添加两种全长Illumina测序引物(添加用于使测序文库去多重化的索引)。三步方法可以包括在工作流程开始时使用孔寡核苷酸特异性引物(不含所述部分P7序列)的另外的PCR。在一些实施方案中，三步方法改进了扩增分区索引寡核苷酸的特异性。三步PCR方法的PCR1可以包括用两种引物进行扩增：对所有分区索引寡核苷酸通用的孔寡核苷酸PCR1引物，和对珠上所有寡核苷酸通用的通用寡核苷酸(部分Illumina P5序列)。三步PCR方法的PCR2可以包括用两种引物进行扩增：对所有分区索引寡核苷酸通用并含有部分Illumina P7序列的孔寡核苷酸PCR2引物，和对珠上所有寡核苷酸通用的通用寡核苷酸(部分Illumina P5序列)。
在对孔寡核苷酸文库进行测序之后，可以基于附接到每种细胞标记的孔特异性条形码(例如，分区索引序列)将细胞标记与特定的孔位置关联。该信息可以与成像数据(例如，来自Rhapsody扫描仪的图像)组合，来鉴定包含多重体(孔中多于一个细胞)的细胞标记，以及与噪声(似乎包含来自真实细胞的mRNA，但实际上源自不包含细胞的孔)关联的细胞标记。本文提供的内容包括使使用者能够通过直接将成像数据与测序数据相联系来更确切地消除并非源自单细胞的细胞事件(例如，多重体、噪声)的方法和组合物。目前，这些事件可以通过生物信息学推断来鉴定，但目前还没有仅基于测序数据来确定这些事件是否真实的方法。
另外，与替代方法(诸如联系表型信息的替代方法)相比，本文提供的方法采用用于特定分区(例如，孔)的条形码(例如，分区索引序列)，该条形码在不同的盒之间保持相同(与用于特定分区的荧光条形码可以不同相比)。另外，本文提供的方法可以采用测序读出(例如，通过使用Rhapsody珠捕获孔关联的条形码)来将图像与测序数据关联，而不是采用单独荧光读出来将图像与测序数据关联。因此，本文提供的方法和组合物可以通过对每个孔采用已知(例如，预定的)条形码来避免对将图像和测序数据相联系的另外的条形码的荧光读出的需要，因为条形码的测序读出(而不是荧光)可以然后通过该条形码(例如，分区索引序列)与图像相联系。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物包括并入的基于图像的索引分选，使得单独分选的细胞的图像可以与测序数据相联系。例如，在一些实施方案中，采用基于图像的索引分选来将细胞分选到具有与每个孔相联系的特定条形码的板，这可以使被分选到每个孔的细胞的图像与测序数据及其特定分区(例如，孔)位置相联系。
在一些实施方案中，提供了将测序数据分配到分区的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对来自多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶。该方法可以包括：获得测序数据，所述测序数据包括条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段。该方法可以包括：鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列。该方法可以包括：基于测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，将多于一个测序读段中的每一个分配到多于一个分区中的分区。
在一些实施方案中，提供了将单细胞的测序数据和表型数据关联的方法。在一些实施方案中，该方法包括：获得多于一个单细胞的表型数据，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝。该方法可以包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一个单细胞中的每一个分区到多于一个分区中的经鉴定的分区。该方法可以包括：使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对来自多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶。该方法可以包括：使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸。该方法可以包括：获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据。该方法可以包括：基于测序数据中多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物中的至少一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的分区索引序列，将多于一个单细胞中的至少一个细胞的测序数据和表型数据关联。该方法可以包括：将多于一个固体支持物分区到多于一个分区，其中多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记序列和细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。
在一些实施方案中，提供了减少测序数据中的噪声的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。该方法可以包括：获得多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区，其中噪声分区是：(i)不包含细胞的分区，(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或(iii)包含多于一个细胞的分区。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸。该方法可以包括：使用多于一种寡核苷酸条形码对来自多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶。该方法可以包括：获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据。该方法可以包括：鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列。该方法可以包括：从获得的测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。
该方法可以包括：获得多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区，其中噪声分区是：(i)不包含细胞的分区，(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或(iii)包含多于一个细胞的分区；鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及从获得的测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。测序数据可以包括条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段。该方法可以包括：从测序数据中去除一个或更多个噪声测序读段。噪声测序读段可以包括源自噪声分区的测序读段。该方法可以包括：鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及基于测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，将多于一个测序读段中的每一个分配到多于一个分区中的分区。该方法可以包括：获得多于一个单细胞的表型数据，其中单细胞各自包含核酸靶的拷贝；将多于一个单细胞中的每一个分区到多于一个分区中的经鉴定的分区；以及基于测序数据中多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物中的至少一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的分区索引序列，将多于一个单细胞中的至少一个细胞的测序数据与表型数据关联。该方法可以包括：对于指示多于一个单细胞中的单细胞的每一种独特细胞标记序列：确定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，从而将多于一个单细胞中的每一个细胞的测序数据和表型数据关联。
多于一种条形码化分区索引寡核苷酸可以包含第一通用序列的互补体。分区索引寡核苷酸可以包含第二通用序列。在一些实施方案中，获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的序列数据包括：使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与第二通用序列或其互补体杂交的引物来扩增多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物，以产生多于一种扩增的条形码化分区索引寡核苷酸；以及获得多于一种扩增的条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的测序数据。获得序列信息可以包括将测序衔接子附接到多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物。
图5A-图5D示出了用于本文提供的分区索引方法的非限制性示例性工作流程的示意图。条形码(例如，随机条形码、寡核苷酸条形码516)可以包含靶结合区(例如，多(dT)524)，所述靶结合区可以经由多(dA)尾512结合到核酸靶(例如，多腺苷酸化RNA转录物或其他核酸靶，诸如例如，分区索引寡核苷酸502，无论是与分区关联还是与分区解离)，或其他核酸靶，用于标记或条形码化(例如，独特标记)。靶结合区可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。寡核苷酸条形码516也可以包含多个标记。寡核苷酸条形码516可以包含分子标记(ML)522和样品标记(例如，分区标记、细胞标记(CL)520)用于分别标记转录物和/或追踪RNA转录物(或核酸靶，诸如例如，抗体寡核苷酸，无论与抗体关联或已与抗体解离)的样品来源，以及每种条形码516的分子标记522/细胞标记520区域侧翼的一个或更多个另外的序列(诸如例如，第一通用序列518(例如，读段1序列))用于后续反应。每个样品的寡核苷酸条形码中分子标记的序列的库可以足够大以对RNA转录物进行随机标记。在一些实施方案中，样品标记是分区标记。在一些实施方案中，样品标记是细胞标记。在一些实施方案中，条形码与固体支持物(例如，颗粒514)关联。多于一种寡核苷酸条形码516可以与颗粒514关联。在一些实施方案中，颗粒是珠。珠可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合珠，例如可变形的珠或凝胶珠(诸如来自10X Genomics(San Francisco,CA)的凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶珠可以包括基于聚合物的凝胶。凝胶珠可以例如通过将一种或更多种聚合物前体包封到液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生凝胶珠。分区索引寡核苷酸502可以包含第二通用序列508(例如，引物衔接子、通用孔寡核苷酸扩增区)、分区索引序列510、与靶结合区互补的序列(例如，多(A)尾512)，或其互补体。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸510可以通过分区接头(例如，裂解实体506)与分区504(例如，微孔、盒孔)关联。
该工作流程可以包括裂解500a裂解实体506，从而产生解离的分区索引寡核苷酸526。该工作流程可以包括使解离的分区索引寡核苷酸526和寡核苷酸条形码502杂交500b。该工作流程可以包括使与解离的分区索引寡核苷酸526杂交的寡核苷酸条形码516延伸500c以产生条形码化分区索引寡核苷酸528，该条形码化分区索引寡核苷酸528包含分区索引序列的互补体510rc和第二通用序列的互补体508rc。该工作流程可以包括如本文描述的条形码化分区索引寡核苷酸528的下游引物延伸、扩增和/或测序。
条形码化分区索引寡核苷酸528可以用作一个或更多个延伸反应(例如，随机引发和延伸)和/或扩增反应(例如，PCR)的模板。例如，条形码化分区索引寡核苷酸528可以经历采用可以分别与第一通用序列和第二通用序列(或其互补体)退火的扩增引物532和534的第一轮扩增(“PCR1”)500d。PCR1 500d可以产生第一扩增的条形码化分区索引寡核苷酸536。PCR1500d可以包括1-30个循环(例如，15个循环)。第一扩增的条形码化分区索引寡核苷酸536可以经历采用可以分别与第一通用序列和第二通用序列(或其互补体)退火的扩增引物538和540的第二轮扩增(“PCR2”)500e。PCR2 500e可以产生第二扩增的条形码化分区索引寡核苷酸544。PCR2500e可以经由引物540中的突出端添加测序衔接子542。PCR2 500e可以包括1-30个循环(例如，15个循环)。该工作流程可以包括文库扩增(“索引PCR”)500f。索引PCR 500f可以包括用测序文库扩增引物546和548对第二扩增的条形码化分区索引寡核苷酸544进行文库扩增。测序文库扩增引物546和548可以与第一通用序列和第二通用序列(或其互补体)和/或测序衔接子542退火。索引PCR 500f可以经由测序文库扩增引物546和548中的突出端添加测序衔接子(例如，P5 552和P7 558)和样品索引554和/或556(例如i5、i7)。索引PCR扩增子550可以被测序并经历本公开内容的下游方法。使用150bp×2测序的测序500g可以揭示读段1上的细胞标记、分子标记和/或分区索引序列(或分区索引序列的部分序列)、读段2上的分区索引序列(或分区索引序列的部分序列)和/或分子标记，以及索引1读段和/或索引2读段上的样品索引。
在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸528可以经历采用可以分别与第一通用序列和第二通用序列(或其互补体)退火的扩增引物532和540的第一轮扩增(“PCR1”)500h。PCR1 500h可以产生第一扩增的条形码化分区索引寡核苷酸560。PCR1 500h可以包括1-30个循环(例如，15个循环)。PCR1 500h可以经由引物540中的突出端添加测序衔接子542。该工作流程可以包括文库扩增(“索引PCR”)500i。索引PCR 500i可以包括用测序文库扩增引物546和548对第一扩增的分区索引寡核苷酸560进行文库扩增。测序文库扩增引物546和548可以与第一通用序列和第二通用序列(或其互补体)和/或测序衔接子542退火。索引PCR500i可以经由测序文库扩增引物546和548中的突出端添加测序衔接子(例如，P5 552和P7558)和样品索引554和/或556(例如i5、i7)。索引PCR扩增子562可以被测序并经历本公开内容的下游方法。使用150bp×2测序的测序500j可以揭示读段1上的细胞标记、分子标记和/或分区索引序列(或分区索引序列的部分序列)、读段2上的分区索引序列(或分区索引序列的部分序列)和/或分子标记，以及索引1读段和/或索引2读段上的样品索引。
多于一种条形码化核酸靶各自可以包含与核酸靶的至少一部分互补的序列和第一分子标记。多于一种条形码化分区索引寡核苷酸各自可以包含与分区索引序列的至少一部分互补的序列和第一分子标记。获得多于一种条形码化分区索引寡核苷酸的测序数据可以包括获得分区索引序列的至少一部分。多于一个测序读段中的每一个可以包含(1)细胞标记序列和(2)第一分子标记序列。多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的多于一个测序读段中的每一个可以包含分区索引序列的至少一部分。分区可以是孔或液滴。每一种寡核苷酸条形码可以包含第一通用序列。寡核苷酸条形码可以包含含有捕获序列的靶结合区。靶结合区可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。分区索引寡核苷酸可以包含与捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置成捕获分区索引寡核苷酸。与捕获序列互补的序列可以包含多(dA)区。
该方法可以包括：裂解一个或更多个单细胞。该方法可以包括：使分区索引寡核苷酸与分区解离。在一些实施方案中，使分区索引寡核苷酸与分区解离可以包括通过UV光裂解、化学处理、加热、酶处理或其任何组合使分区索引寡核苷酸从分区脱离。解离可以发生在对分区索引寡核苷酸进行条形码化之前和/或之后。在一些实施方案中，解离发生在细胞裂解期间。
使多于一种寡核苷酸条形码延伸可以包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶(例如，Klenow片段)使多于一种寡核苷酸条形码延伸。逆转录酶可以包括病毒逆转录酶(例如，病毒逆转录酶，诸如例如，鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)。在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列可以是相同的或不同的。第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列可以包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。测序衔接子可以包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。测序引物可以包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种可以包含不同的第一分子标记序列。多于一种寡核苷酸条形码的每种细胞标记可以包含至少6个核苷酸。多于一种寡核苷酸条形码的每一种第一分子标记可以包含至少6个核苷酸。
固体支持物可以包括合成颗粒和/或平坦表面。多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种可以被固定在合成颗粒上、部分地固定在合成颗粒上、包封在合成颗粒中或部分地包封在合成颗粒中。合成颗粒可以是可破坏的。合成颗粒可以包括珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠，或其任何组合。合成颗粒可以包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。合成颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。多于一个单细胞可以包括T细胞、B细胞、肿瘤细胞、髓样细胞、血细胞、正常细胞、胎儿细胞、母体细胞或其混合物。
在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码不与固体支持物关联。在一些实施方案中，该方法包括：提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。该方法可以包括：将多于一种寡核苷酸条形码和多于一个单细胞分区到多于一个分区。寡核苷酸条形码中的每一种可以包含细胞标记序列。位于同一分区中的多于一种寡核苷酸条形码的细胞标记可以包括相同的细胞标记序列。位于不同分区中的多于一种寡核苷酸条形码的细胞标记可以彼此不同。在一些实施方案中，每个经分区的寡核苷酸条形码相对于同一分区内的寡核苷酸条形码具有相同的细胞标记序列。在一些实施方案中，每个经分区的寡核苷酸条形码相对于其他分区内的寡核苷酸条形码具有不同的细胞标记序列。
确定核酸靶的拷贝数的方法
本文提供的方法的一些实施方案包括确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数。确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数可以包括基于与多于一种条形码化核酸靶或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、其互补体或其组合的数目来确定多于一个单细胞中核酸靶的拷贝数。该方法可以包括：使随机引物与多于一种条形码化核酸靶接触，其中随机引物中的每一种包含第三通用序列或其互补体；以及使与多于一种条形码化核酸靶杂交的随机引物延伸以产生多于一种延伸产物。该方法可以包括：使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补体杂交的引物来扩增多于一种延伸产物，从而产生第一多于一种条形码化扩增子。扩增多于一种延伸产物可以包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一种延伸产物。该方法可以包括：基于与第一多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数。确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数可以包括基于与第一多于一种条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定多于一个单细胞中的一个或更多个中多于一种核酸靶中的每一种的数目，所述第一多于一种条形码化扩增子包含多于一种核酸靶中的每一种的序列。多于一种核酸靶中的每一种的序列可以包括多于一种核酸靶中的每一种的子序列。第一多于一种条形码化扩增子中核酸靶的序列可以包括核酸靶的子序列。
在一些实施方案中，该方法可以包括使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补体杂交的引物来扩增第一多于一种条形码化扩增子，从而产生第二多于一种条形码化扩增子。扩增第一多于一种条形码化扩增子可以包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到第一多于一种条形码化扩增子。该方法可以包括：基于与第二多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数。第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子可以包含全转录组扩增(WTA)产物。
在一些实施方案中，该方法可以包括使用多于一种条形码化核酸靶作为模板合成第三多于一种条形码化扩增子以产生第三多于一种条形码化扩增子。合成第三多于一种条形码化扩增子可以包括对多于一种条形码化核酸靶进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。合成第三多于一种条形码化扩增子可以包括使用能够与第一通用序列或其互补体杂交的引物以及靶特异性引物进行的PCR扩增。该方法可以包括：获得第三多于一种条形码化扩增子或其产物的序列数据。获得序列信息可以包括将测序衔接子连接到第三多于一种条形码化扩增子或其产物。该方法可以包括：基于与第三多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定多于一个单细胞中的一个或更多个中核酸靶的拷贝数。
核酸靶可以包括核酸分子，诸如例如，核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA或其任何组合。核酸靶可以包括样品索引寡核苷酸。样品索引寡核苷酸可以包含样品索引序列。本文提供的多于一种样品索引组合物中的至少两种样品索引组合物的样品索引序列可以包括不同的序列。核酸靶可以包括细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸。细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸可以包含用于细胞组分结合试剂的独特标识符序列。在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，核酸靶是结合试剂寡核苷酸(例如，抗体寡核苷酸(“AbOligo”或“AbO”)、结合试剂寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸、样品索引寡核苷酸)。本文公开的一些实施方案提供了多于一种组合物，所述多于一种组合物各自包含与寡核苷酸(例如，结合试剂寡核苷酸)缀合的细胞组分结合试剂(诸如蛋白结合试剂)，其中寡核苷酸包含用于与其缀合的细胞组分结合试剂的独特标识符。细胞组分结合试剂(诸如条形码化抗体)及其用途(诸如细胞的样品索引)已在美国专利申请公布第US2018/0088112号和美国专利申请公布第US2018/0346970号中描述；这些中的每一项的内容通过引用以其整体并入本文。
颗粒分析仪
将多于一个单细胞中的每一个分区到多于一个分区中的经鉴定的分区可以包括索引分选。将多于一个单细胞中的每一个分区到多于一个分区中的经鉴定的分区可以包括将多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中。将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区可以包括索引分选。将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到多于一个分区可以包括将多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中。将多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中可以包括将多于一个单细胞引入微孔阵列在多于一个经鉴定的微孔处的微孔中。将多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中可以包括使多于一个单细胞通过流式细胞术沉积到微孔阵列的经鉴定的微孔中。使多于一个单细胞通过流式细胞术沉积到微孔阵列的经鉴定的微孔中可以包括使用流式细胞仪一次使一个单细胞沉积到微孔阵列的经鉴定的微孔中。该方法可以包括：将流式细胞仪的分选组件与微孔阵列对齐。
表型数据可以包括源自分选装置(例如，流式细胞仪)的数据。表型数据可以包括事件数据。事件数据可以包括源自分类装置的定量生物事件数据。事件数据可以包括侧向散射信号、前向散射信号、一个或更多个荧光信号或其任何组合。如本文使用的，术语“事件”或“事件数据”应具有其通常的含义，并还应彼此可互换，并还应指从单个颗粒(诸如细胞或合成颗粒)测量的数据。通常，从单个颗粒测量的数据包括多个参数，包括一个或更多个光散射参数和至少一个荧光强度参数。因此，每个事件被表示为参数测量的向量(vectorof parameter measurements)，其中每个测量的参数对应于数据空间的一个维度。在某些生物学应用中，事件数据可以对应于指示特定蛋白或基因表达的定量生物数据。该方法可以包括：对单细胞的表型数据和测序数据进行相关性分析。相关性分析可以鉴定以下中的一种或更多种：候选生物标志物、候选治疗剂、治疗剂的候选剂量和/或候选治疗剂的细胞靶。
颗粒分析仪，诸如流式细胞仪和扫描细胞仪，是能够基于光学参数(诸如光散射和荧光)对颗粒(例如，单细胞)进行表征的分析工具。在流式细胞仪中，例如，流体悬浮液中的颗粒(诸如分子、结合分析物的珠或单个细胞)通过检测区域，在该检测区域中颗粒暴露于通常来自一束或更多束激光的激发光，并测量颗粒的光散射和荧光特性。颗粒或其组分通常用荧光染料标记以便于检测。通过使用光谱不同的荧光染料标记不同的颗粒或组分，可以同时检测多于一种不同的颗粒或组分。在一些实施方式中，分析仪中包括多于一个光电探测器，每个待测量的散射参数一个光电探测器，并且每个待检测的不同染料一个光电探测器。所获得的数据包括对每个光散射参数和荧光发射测量的信号。
使用流式细胞仪测量的参数通常包括由颗粒沿主要前向方向散射的激发光(称为前向散射(FSC))，由颗粒以主要侧向方向散射的激发光(称为侧向散射(SSC))，以及从光谱的一个或更多个通道(频率范围)中的荧光分子发射的光(称为FL1、FL2等)，或由主要在该通道中检测的荧光染料发射的光。由于用染料标记的抗体标记不同的细胞蛋白，可以通过散射参数和荧光发射来鉴定不同的细胞类型。
流式细胞仪和扫描细胞仪二者可以从例如BD Biosciences(San Jose,Calif.)商购得到。流式细胞术在例如以下中描述：Landy等人(编著),Clinical Flow Cytometry,Annals of the New York Academy of Sciences Volume 677(1993)；Bauer等人(编著),Clinical Flow Cytometry:Principles and Applications,Williams&Wilkins(1993)；Ormerod(编著),Flow Cytometry:A Practical Approach,Oxford Univ.Press(1994)；Jaroszeski等人(编著),Flow Cytometry Protocols,Methods in Molecular BiologyNo.91,Humana Press(1997)；和Practical Shapiro,Flow Cytometry,第四版,Wiley-Liss(2003)；其所有通过引用并入本文。荧光成像显微术在例如Pawley(编著),Handbook ofBiological Confocal Microscopy,第二版,Plenum Press(1989)中描述，其通过引用并入本文。
从通过多色流式细胞术分析细胞(或其他颗粒)获得的数据是多维的，其中每个细胞对应于由所测量的参数定义的多维空间中的一个点。细胞或颗粒的群体被鉴定为数据空间中的点簇。鉴定簇，并且从而鉴定群体，可以通过围绕一个或更多个二维图(称为数据的“散点图”或“点图”)中显示的群体绘制门手动地进行。可选地，簇可以被鉴定，并且定义群体极限的门可以被自动确定。用于自动门控的方法的实例已在例如以下中描述：美国专利第4,845,653号、第5,627,040号、第5,739,000号、第5,795,727号、第5,962,238号、第6,014,904号和第6,944,338号，以及美国专利公布第2012/0245889号，每项通过引用并入本文。
流式细胞术是用于分析和分离生物颗粒(诸如细胞及组成分子)的有价值的方法。因此，它具有广泛的诊断和治疗应用。该方法利用流体流来线性分隔颗粒，使得它们能够以单路通过检测设备。单个细胞可以根据它们在流体流中的位置和可检测标志物的存在来区分。因此，流式细胞仪可用于产生生物颗粒群体的诊断谱。
已经通过向流式细胞仪添加分选或收集功能实现了生物颗粒的分离。被检测为具有一种或更多种期望的特性的分隔流(segregated stream)中的颗粒通过机械或电去除从样品流中单独分离。这种流式分选方法已用于分选不同类型的细胞，分离携带X和Y染色体的精子用于动物繁育，分选染色体用于遗传分析，以及从复杂的生物群体中分离特定的生物体。
在流式细胞术分选中，使用索引分选意味着将单个细胞事件与它们在板或载玻片保持器中的目的地位置相联系的另外的信息是可得的。该信息可在采集后用于对细胞位于板装置上的何处物理位置进行另外的分析。它还允许使用者看到这些细胞在双变量图上位于何位置。
索引分选是其中分选装置可以记录每个事件(通常是悬浮在流式流中的细胞或其他颗粒)的分选决定并且数据可用于分选后分析的细胞分选。通常，索引分选通过检测颗粒的特性(诸如颜色)并将颗粒引导到收集板中来进行。板可以包括若干板目的地(例如，孔位置)。分选可以包括将颗粒引导到板内的特定板位置(例如，孔)。分选装置可以与针对事件的标识符关联地记录目的板和/或孔位置。因此，每个经分选事件具有来自检测器(PMT、光电二极管)的所有测量值以及孔位置和分选目的地。使用者可以检查经分选细胞的数据，并将其与板上的后续操作(例如，从对经分选细胞进行测序得到的基因表达)相关联。
可以为给定样品指定分选模式。分选模式包括控制对哪些事件进行分选的参数。例如，在分选装置处接收样品后，分选装置可以接收分选模式以控制哪些特性用于分选及应该在哪里对这些特性的检测值进行分选。分选模式可以包括可以将细胞分选仪配置成确保期望的细胞类型并且只有期望的细胞类型在门中的纯度模式。分选模式可以包括可以将细胞分选仪配置成确保只有单细胞在液滴内的单细胞模式。由于细胞可能在哪个液滴的边界附近可以存在不确定性，因此即使可以对随后的液滴进行分选，通常也不会对其进行分选。对于单细胞分选，这对某些实验(诸如基于基因组的测定，其中使用者可能希望将基因表达与流式细胞术来源的测量值相关联)可以是合意的。在这样的情况下，如果孔内有多于一个细胞，则基因序列来自哪个细胞就不清楚了。分选模式可以通过设置掩码来配置细胞分选仪，该掩码检查事件落在液滴内及液滴周围的位置。一些单细胞分选模式配置可以包括状态机或检查落在液滴内的事件队列。
在一些实施方式中，靶门(target gate)可用于鉴定感兴趣的事件。可以通过选择二维图上的区域来提供靶门。检测有二维选定区域内的特性值的事件被认为在靶门内，并且可以被分选到特定位置。事件可能在靶门内，但在某些分选模式(例如，纯度模式或单细胞模式)下，该事件可能未被正确分类，诸如如果另一事件与该事件在流体流中的同一滴内。在一些实施方式中，这可以被称为夹带(entrainment)或黏聚(cohesion)。
作为记录分选决定的一部分，分选装置的分选电子器件可以将分选目的地与事件原始数据一起传输。事件原始数据可以包括检测到的事件特性(例如，反射光值、荧光信息、光散射信息、事件的时间、事件的序列号、在分析事件时的分选装置操作特性(例如，温度、流速、分选模式等)等)。对于索引分选，当前的托盘、板、显微镜载玻片或具有空间分离池的其他物理介质(其中包含细胞的滴可以沉积)，特定事件的细胞沉积的位置的坐标也可以被传输。
在一些实施方案中，本文公开的方法可以包括针对感兴趣的细胞富集包含多于一个细胞的样品，以产生包含多于一个单细胞的富集的细胞样品，用于如本文所提供的分析。富集样品可以包括聚焦样品中感兴趣的细胞；用流式细胞仪分离富集的细胞样品中的一个或更多个感兴趣的细胞；以及获得来自如本文描述的一个或更多个分离的细胞中的每一个的一种或更多种多核苷酸的序列信息。可以使用各种聚焦方法和技术，例如，流体动力聚焦、磁场聚焦、电场聚焦、引力场聚焦、光场聚焦及其任何组合。在一些实施方案中，富集样品包括耗尽样品中不感兴趣的细胞。在一些实施方案中，富集样品包括声学聚焦和耗尽样品中不感兴趣的细胞二者。在一些实施方案中，可以耗尽(例如使用磁耗尽)样品中不感兴趣的细胞、干扰细胞和碎片中的一种或更多种。
噪声分区测序读段的鉴定与去除
本文的公开内容还包括本文提供的用于鉴定细胞过载、固体支持物过载、多重体和串扰噪声的方法、组合物、试剂盒和系统。本文提供的内容是使使用者能够通过直接将成像数据与测序数据相联系来更确切地消除并非源自单细胞(例如，多重体、噪声)的细胞事件的方法和组合物。在一些实施方案中，该方法包括获得多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区。噪声分区可以是(i)不包含细胞的分区，(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或(iii)包含多于一个细胞的分区。该方法可以包括鉴定与通过成像鉴定的每个噪声分区关联的预定的分区索引序列。该方法可以包括鉴定测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列。该方法可以包括从获得的测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。测序数据可以包括条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段。该方法可以包括：从测序数据中去除一个或更多个噪声测序读段。噪声测序读段可以包括源自噪声分区的测序读段。
噪声分区可以包含零个细胞。串扰噪声可以指源自不包含细胞的分区的测序数据。在对分区索引寡核苷酸进行测序之后，可以基于附接到每种细胞标记的分区索引序列将细胞标记与特定分区关联。该信息可以与成像数据(例如，来自Rhapsody扫描仪的图像)组合，以鉴定与串扰噪声(例如，分区似乎包含来自真实细胞的mRNA，但实际上源自不包含细胞的孔)关联的细胞标记。串扰噪声可以源自核酸、蛋白、抗体、生物分子或其任何组合从一个分区到另一分区的扩散。串扰噪声会扭曲对表达谱的解释。使用更高密度的分区阵列(例如，更高密度的微孔阵列)会产生伴随的串扰噪声的增加。本文提供的方法和组合物可以去除测序数据中的串扰噪声，从而得到对表达谱的改进解释。此外，本文提供的方法和组合物可以实现使用更高密度的微孔阵列。
作为另一种实例，本文提供的分区索引方法和组合物可用于多重体鉴定。多重体表达谱(例如，源自与分区中的条形码化试剂珠共定位的两个细胞)可能扭曲表达谱的解释。例如，当使用条形码化(例如，随机条形码化)确定两个细胞的表达谱时，两个细胞的mRNA分子可以与具有相同细胞标记的条形码关联。作为另一个实例，两个细胞可以与一个颗粒(例如珠)关联。颗粒可以包括具有相同细胞标记的条形码。在裂解细胞后，两个细胞中的mRNA分子可以与该颗粒的条形码关联，从而与相同的细胞标记关联。双重体表达谱可能扭曲对表达谱的解释。
噪声分区可以包含多于一个细胞和/或多于一个固体支持物。使用当前的细胞加载技术，当约20000个细胞被加载到具有～60000个微孔的微孔盒或阵列中时，具有两个或更多个细胞(称为双重体或多重体)的微孔或液滴的数目可以是极小的。然而，当加载的细胞数目增加时，具有多于一个细胞的微孔或液滴的数目可能显著增加。例如，当将约50000个细胞加载到微孔盒或阵列的约60000个微孔中时，具有多于一个细胞的微孔的百分比可以相当高，诸如11％-14％。这样将大量细胞加载到微孔中可称为细胞过载。同样地，当加载的固体支持物数目增加时，具有多于一个固体支持物(称为双重体或多重体)的微孔或液滴的数目会显著增加。可以加载到微孔盒的微孔上或加载到使用微流体装置产生的液滴中的细胞和/或固体支持物的数目可能受到多重体比率的限制。加载更多的细胞和/或固体支持物可能导致更多的多重体，这可能难以鉴定并在单细胞数据中产生噪声。本文提供的分区索引方法可以用于更准确地标记或鉴定多重体，并将多重体从测序数据或后续分析去除。能够用本文提供的分区索引方法和组合物以更高的置信度鉴定多重体，可以增加使用者对多重体比率的容忍度，并将更多的细胞和/或固体支持物加载到每个微孔盒上。
分区索引寡核苷酸
在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，提供了分区索引寡核苷酸。分区索引寡核苷酸可以与分区关联。分区索引寡核苷酸可以包含独特分区索引序列。每个分区的分区索引寡核苷酸可以包含预定的分区索引序列。位于同一分区内的分区索引寡核苷酸可以包含相同的分区索引序列。位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。在不同的实施方式中，每个分区中分区索引寡核苷酸的数目或平均数目可以是不同的。在一些实施方案中，每个分区中分区索引寡核苷酸的数目或平均数目可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、10000个、100000个、1000000个或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，每个分区中分区索引寡核苷酸的数目或平均数目可以是至少以下或可以是至多以下：2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、10000个、100000个或1000000个。
分区索引寡核苷酸可以包括如本文提供的任何核酸(例如DNA、RNA、PNA或其组合)。分区索引寡核苷酸的长度可以是50-500个核苷酸。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸包含长度是以下的核苷酸序列，或者长度是约以下的核苷酸序列：6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、128个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个、1000个核苷酸，或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸包含长度为至少以下或长度为至多以下的核苷酸序列：6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、128个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个或1000个核苷酸。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸与一个或更多个细胞中任一个的基因组序列不同源，与一个物种(例如，非哺乳动物物种)的基因组序列同源，或其组合。分区索引寡核苷酸可以包含与寡核苷酸条形码的捕获序列互补的序列，该捕获序列被配置成捕获分区索引寡核苷酸。
分区索引序列的长度可以是6-60个核苷酸。分区索引序列可以包含以下的核酸序列：至少3个核苷酸，例如至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个核苷酸，包括在所列值中的任何两个之间的范围，例如3-50个、3-45个、3-40个、3-35个、3-30个、3-25个、3-20个、3-15个、3-14个、3-13个、3-12个、3-11个、3-10个、3-9个、3-8个、3-7个、3-6个、3-5个、3-4个、4-50个、4-45个、4-40个、4-35个、4-30个、4-25个、4-20个、4-15个、4-14个、4-13个、4-12个、4-11个、4-10个、4-9个、4-8个、4-7个、4-6个、4-5个、5-50个、5-45个、5-40个、5-35个、5-30个、5-25个、5-20个、5-15个、5-14个、5-13个、5-12个、5-11个、5-10个、5-9个、5-8个、5-7个、5-6个、6-50个、6-45个、6-40个、6-35个、6-30个、6-25个、6-20个、6-15个、6-14个、6-13个、6-12个、6-11个、6-10个、6-9个、6-8个、6-7个、7-50个、7-45个、7-40个、7-35个、7-30个、7-25个、7-20个、7-15个、7-14个、7-13个、7-12个、7-11个、7-10个、7-9个、7-8个、8-50个、8-45个、8-40个、8-35个、8-30个、8-25个、8-20个、8-15个、8-14个、8-13个、8-12个、8-11个、8-10个、8-9个、9-50个、9-45个、9-40个、9-35个、9-30个、9-25个、9-20个、9-15个、9-14个、9-13个、9-12个、9-11个、9-10个、10-50个、10-45个、10-40个、10-35个、10-30个、10-25个、10-20个、10-15个、10-14个、10-13个、10-12个或10-11个核苷酸。在一些实施方案中，分区索引序列的长度是2-20个核苷酸。
在一些实施方案中，分区索引序列选自一组相异的分区索引序列。一组相异的分区索引序列可以包括至至少20种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少200种、至少300种、至少400种、至少500种、至少600种、至少700种、至少800种、至少900种、至少1,000种、至少2,000种、至少5,000种或更多种不同的分区索引序列。在一些实施方案中，一组分区索引序列被设计成与待分析样品的DNA或RNA序列具有最小的序列同源性。在一些实施方案中，一组分区索引序列的序列彼此或与其互补体具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个核苷酸或更多差异。在一些实施方案中，一组分区索引序列的序列彼此或与其互补体具有至少3％、至少5％、至少8％、至少10％、至少15％、至少20％或更多差异。
分区索引寡核苷酸可以包含通用序列(例如，引物衔接子、通用孔寡核苷酸扩增区、第二通用序列)。第二通用序列可以包含测序引物(例如，读段1测序引物、读段2测序引物)的结合位点和/或测序衔接子(例如，P5序列、P7序列)、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸包含引物衔接子。在一些实施方案中，引物衔接子包含以下的序列：第一通用引物、其互补序列、其部分序列或其组合。在一些实施方案中，第一通用引物包括扩增引物、其互补序列、其部分序列或其组合。在一些实施方案中，第一通用引物包括测序引物、其互补序列、其部分序列或其组合。在一些实施方案中，测序引物包括Illumina测序引物。在一些实施方案中，测序引物包括Illumina测序引物的一部分。在一些实施方案中，测序引物包括P7测序引物。在一些实施方案中，测序引物包括P7测序引物的一部分。在一些实施方案中，引物衔接子包括用于Illumina P7的衔接子。在一些实施方案中，引物衔接子包括用于Illumina P7的部分衔接子。在一些实施方案中，扩增引物是IlluminaP7序列或其子序列。在一些实施方案中，测序引物是Illumina R2序列或其子序列。在一些实施方案中，第一通用引物的长度是5-50个核苷酸。在一些实施方案中，引物衔接子可以包含以下的核酸序列：至少5个核苷酸，例如至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸，包括在所列值中的任何两个之间的范围，例如5-50个、5-45个、5-40个、5-35个、5-30个、5-25个、5-20个、5-15个、5-14个、5-13个、5-12个、5-11个、5-10个、5-9个、5-8个、5-7个、5-6个、6-50个、6-45个、6-40个、6-35个、6-30个、6-25个、6-20个、6-15个、6-14个、6-13个、6-12个、6-11个、6-10个、6-9个、6-8个、6-7个、7-50个、7-45个、7-40个、7-35个、7-30个、7-25个、7-20个、7-15个、7-14个、7-13个、7-12个、7-11个、7-10个、7-9个、7-8个、8-50个、8-45个、8-40个、8-35个、8-30个、8-25个、8-20个、8-15个、8-14个、8-13个、8-12个、8-11个、8-10个、8-9个、9-50个、9-45个、9-40个、9-35个、9-30个、9-25个、9-20个、9-15个、9-14个、9-13个、9-12个、9-11个、9-10个、10-50个、10-45个、10-40个、10-35个、10-30个、10-25个、10-20个、10-15个、10-14个、10-13个、10-12个或10-11个核苷酸。引物衔接子可以包含以下的核酸序列：第一通用引物、扩增引物、测序引物，其互补序列、其部分序列，或其组合的序列的至少5个核苷酸，例如至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸，包括在所列值中的任何两个之间的范围，例如第一通用引物、扩增引物、测序引物，其互补序列、其部分序列，或其组合的序列的5-50个、5-45个、5-40个、5-35个、5-30个、5-25个、5-20个、5-15个、5-14个、5-13个、5-12个、5-11个、5-10个、5-9个、5-8个、5-7个、5-6个、6-50个、6-45个、6-40个、6-35个、6-30个、6-25个、6-20个、6-15个、6-14个、6-13个、6-12个、6-11个、6-10个、6-9个、6-8个、6-7个、7-50个、7-45个、7-40个、7-35个、7-30个、7-25个、7-20个、7-15个、7-14个、7-13个、7-12个、7-11个、7-10个、7-9个、7-8个、8-50个、8-45个、8-40个、8-35个、8-30个、8-25个、8-20个、8-15个、8-14个、8-13个、8-12个、8-11个、8-10个、8-9个、9-50个、9-45个、9-40个、9-35个、9-30个、9-25个、9-20个、9-15个、9-14个、9-13个、9-12个、9-11个、9-10个、10-50个、10-45个、10-40个、10-35个、10-30个、10-25个、10-20个、10-15个、10-14个、10-13个、10-12个或10-11个核苷酸。
分区索引寡核苷酸可以通过多种机制与分区关联。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸可以与分区共价地缀合。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸可以与分区非共价地缀合。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸通过分区接头与分区关联。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸通过分区接头与分区缀合。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸可以包含分区接头。分区接头可以包含化学基团。化学基团可以可逆地或不可逆地附接至分区的分子。化学基团可以选自由以下组成的组：UV光可裂解基团、二硫键、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺及其任何组合。分区接头可以包含碳链。碳链可以包含例如5-50个碳原子。在不同实施方案中，碳链可以具有不同数目的碳原子。在一些实施方案中，碳链中碳原子的数目可以是以下或可以是约以下：3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或在这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，碳链中碳原子的数目可以是至少以下或可以是至多以下：3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个。在一些实施方案中，碳链包含2-30个碳原子，例如12个碳原子。在一些实施方案中，用于分区索引寡核苷酸的氨基修饰物可以缀合到分区。在一些实施方案中，分区接头包含5’氨基修饰物C6(5AmMC6)。在一些实施方案中，分区接头包含5’氨基修饰物C12(5AmMC12)。在一些实施方案中，分区接头包含5AmMC12的衍生物。在一些实施方案中，较长的分区接头实现了更高的缀合效率。在一些实施方案中，较长的分区接头在缀合之前实现了更高的修饰效率。在一些实施方案中，增加功能性胺与DNA序列之间的距离产生更高的缀合效率。在一些实施方案中，增加功能性胺与DNA序列之间的距离在缀合之前产生更高的修饰效率。多于一种分区索引寡核苷酸中的每一种可以包含分区接头官能团。多于一个分区中的每一个可以包含分区官能团，并且分区官能团和分区接头官能团可以彼此关联。分区接头官能团和分区官能团可以单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。分区索引寡核苷酸可以被配置成可从分区脱离。例如，分区索引寡核苷酸可以被配置成在细胞裂解期间从分区脱离。分区索引寡核苷酸可以被配置成不可从分区脱离。
组合物和试剂盒
本文的公开内容包括组合物(例如，试剂盒)。在一些实施方案中，组合物包含：微孔阵列，其中该微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围为约1,000μm3至约786,000μm3的体积，其中每个微孔包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一微孔内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同微孔内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。组合物还可以包括盒，其中盒包括以下中的至少一个：入口端口、出口端口、泵、阀、通风口、储器、样品收集室、温度控制设备或其任何组合。
本文的公开内容包括组合物。在一些实施方案中，组合物包含：盒，其中该盒包括以下中的至少一个：入口端口、出口端口、泵、阀、通风口、储器、样品收集室、温度控制设备或其任何组合，其中该盒包括微孔阵列，其中该微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围为约1,000μm3至约786,000μm3的体积，其中每个微孔包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一微孔内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同微孔内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。
组合物可以包含：缓冲液。组合物可以包含：一种或更多种用于逆转录反应的试剂、一种或更多种用于扩增反应的试剂，或两者。盒可以包括用于对至少100个微孔进行光学成像的透明窗。组合物可以包含：成像系统，其被配置成捕获和处理至少100个微孔的全部或一部分的图像。成像系统可以包括照明子系统、成像子系统和处理器。成像系统可以被配置成执行明场、暗场、荧光或定量相位成像。分区索引寡核苷酸可以包含第二通用序列。
多于一种分区索引寡核苷酸中的每一种可以包含分区接头官能团。多于一个微孔中的每一个可以包含分区官能团，并且分区官能团和分区接头官能团可以彼此关联。分区接头官能团和分区官能团可以单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。分区索引寡核苷酸可以通过分区接头与微孔关联。分区接头可以包含碳链。碳链可以包含2-30个碳原子。碳链可以包含12个碳原子。分区接头可以包含5’氨基修饰物C12(5AmMC12)或其衍生物。分区索引序列的长度可以是6-60个核苷酸。分区索引寡核苷酸的长度可以是50-500个核苷酸。分区索引寡核苷酸可以被附接到微孔。分区索引寡核苷酸可以被共价附接到微孔。分区索引寡核苷酸可以缀合到微孔。样品索引寡核苷酸可以通过选自由以下组成的组的化学基团缀合到微孔：UV光可裂解基团、链霉抗生物素蛋白、生物素、胺及其组合。分区索引寡核苷酸可以被非共价地附接到微孔。分区索引寡核苷酸可以被配置成可从微孔脱离。分区索引寡核苷酸可以被配置成在细胞裂解期间从微孔脱离。分区索引寡核苷酸可以被配置成可通过UV光裂解、化学处理、加热、酶处理或其任何组合从微孔脱离。分区索引寡核苷酸可以被配置成不可从微孔脱离。
组合物可以包括：多于一个固体支持物，所述多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码。寡核苷酸条形码各自可以包含分子标记和细胞标记。与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码可以包含相同的细胞标记序列，与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码可以包含不同的细胞标记序列。每一种寡核苷酸条形码可以包含第一通用序列。寡核苷酸条形码可以包括包含捕获序列的靶结合区。靶结合区可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。分区索引寡核苷酸可以包含与捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置成捕获分区索引寡核苷酸。与捕获序列互补的序列可以包含多(dA)区。多于一种寡核苷酸条形码的每种细胞标记可以包含至少6个核苷酸。多于一种寡核苷酸条形码的每一种分子标记可以包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，分区索引寡核苷酸与一个或更多个细胞中的任一个的基因组序列不同源，与一个物种(例如，非哺乳动物物种)的基因组序列同源，或其组合。
固体支持物可以包括平坦表面和/或合成颗粒。多于一种条形码中的至少一种条形码可以被固定在合成颗粒上、部分地固定在合成颗粒上、包封在合成颗粒中、部分地包封在合成颗粒中或其组合。合成颗粒可以是可破坏的。合成颗粒可以包括珠(例如，琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合)。合成颗粒可以包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。合成颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。组合物还可以包含使用说明。
术语
在至少一些先前描述的实施方案中，在一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以互换地用于另一种实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有此类修改和改变都旨在落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。
本领域技术人员将理解，对于本文公开的这个和其他过程和方法，在过程和方法中执行的功能可以以不同的顺序实现。此外，所概述的步骤和操作仅作为示例提供，并且一些步骤和操作可以是任选的，组合成更少的步骤和操作，或者扩展成另外的步骤和操作而不偏离所公开的实施方案的本质。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对于上下文和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语，并且特别是所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中的术语，通常旨在作为“开放性的”术语(例如，术语“包括/包含(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括/包含(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图所介绍的权利要求陈述中的特定数字，则这样的意图将明确地陈述于权利要求中，并且在这种陈述不存在的情况下，不存在这种意图。例如，作为对理解的帮助，以下所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含此类介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制到包含仅一种此类陈述的实施方案，甚至当同一权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字，本领域技术人员将认识到，此类陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”应被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到，本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括该范围的任何和所有可能的子范围和子范围组合。任何列举的范围可以被容易地认为充分地描述了并且使得同一范围能够被分成至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以被容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言诸如“多达(up to)”、“至少”“大于”“少于”等包括所述及的数字并且指随后可以被分成如以上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
从前述内容，应当理解本文出于说明的目的已经描述了本公开内容的各种实施方案，并且可以在不脱离本公开内容的范围和精神的情况下进行各种修改。因此，本文公开的各种实施方案并不旨在进行限制，实际的范围和精神由以下权利要求来指示。

Claims (98)

1.一种将测序数据分配到分区的方法，所述方法包括：
提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中所述分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列；
将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到所述多于一个分区，其中所述单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中所述多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列；
使用所述多于一种寡核苷酸条形码对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸；
使用所述多于一种寡核苷酸条形码对来自所述多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶；
获得测序数据，所述测序数据包括所述条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和所述多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段；
鉴定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及
基于所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，将所述多于一个测序读段中的每一个分配到所述多于一个分区中的分区。
2.一种将单细胞的测序数据和表型数据关联的方法，所述方法包括：
获得多于一个单细胞的表型数据，其中所述单细胞各自包含核酸靶的拷贝；
提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中所述分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列；
将所述多于一个单细胞中的每一个分区到所述多于一个分区中的经鉴定的分区；
使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对来自所述多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶；
使用与固体支持物关联的多于一种寡核苷酸条形码对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸；
获得所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和所述多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据；以及
基于所述测序数据中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物中的至少一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的分区索引序列，将所述多于一个单细胞中的至少一个细胞的测序数据与表型数据关联。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括将多于一个固体支持物分区到所述多于一个分区，其中所述多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含第一分子标记序列和细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。
4.一种减少测序数据中的噪声的方法，所述方法包括：
提供多于一个分区，所述多于一个分区各自包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中所述分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一分区内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同分区内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列；
将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到所述多于一个分区，其中所述单细胞各自包含核酸靶的拷贝，其中所述多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，所述多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记序列，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列；
获得所述多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区，其中所述噪声分区是：
(i)不包含细胞的分区，
(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或
(iii)包含多于一个细胞的分区；
使用所述多于一种寡核苷酸条形码对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化以产生多于一种条形码化分区索引寡核苷酸；
使用所述多于一种寡核苷酸条形码对来自所述多于一个单细胞中的至少一个的核酸靶的拷贝进行条形码化以产生多于一种条形码化核酸靶；
获得所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和所述多于一种条形码化核酸靶或其产物的测序数据；
鉴定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及
从获得的所述测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法包括：
获得所述多于一个分区的成像数据以鉴定一个或更多个噪声分区，其中所述噪声分区是：
(i)不包含细胞的分区，
(ii)包含多于一个固体支持物的分区，和/或
(iii)包含多于一个细胞的分区；
鉴定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及
从获得的所述测序数据中去除与各自与噪声分区的分区索引序列关联的一种或更多种细胞标记序列关联的测序数据。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述测序数据包括所述条形码化分区索引寡核苷酸或其产物和所述多于一种条形码化核酸靶或其产物的多于一个测序读段。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括从所述测序数据去除一个或更多个噪声测序读段，其中所述噪声测序读段包括源自噪声分区的测序读段。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，所述方法包括：
鉴定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列；以及
基于所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，将所述多于一个测序读段中的每一个分配到所述多于一个分区中的分区。
9.根据权利要求1和权利要求4-8中任一项所述的方法，所述方法包括：
获得多于一个单细胞的表型数据，其中所述单细胞各自包含核酸靶的拷贝；
将所述多于一个单细胞中的每一个分区到所述多于一个分区中的经鉴定的分区；以及
基于所述测序数据中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物中的至少一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的分区索引序列，将所述多于一个单细胞中的至少一个细胞的测序数据与表型数据关联。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法包括对于指示所述多于一个单细胞中的单细胞的每一种独特细胞标记序列：
确定所述测序数据中与每一种细胞标记序列关联的分区索引序列，从而将多于一个单细胞中的每一个细胞的测序数据和表型数据关联。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化核酸靶各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸各自包含与所述分区索引序列的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中获得所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸的测序数据包括获得所述分区索引序列的至少一部分。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述多于一个测序读段中的每一个包含(1)细胞标记序列和(2)第一分子标记序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的多于一个测序读段中的每一个包含所述分区索引序列的至少一部分。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述分区是孔或液滴。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸条形码包含含有捕获序列的靶结合区，任选地所述靶结合区包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸包含与所述捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置成捕获所述分区索引寡核苷酸，任选地与所述捕获序列互补的序列包含多(dA)区。
20.根据权利要求2-3和5-19中任一项所述的方法，将所述多于一个单细胞中的每一个分区到所述多于一个分区中的经鉴定的分区包括索引分选。
21.根据权利要求2-3和5-20中任一项所述的方法，将所述多于一个单细胞中的每一个分区到所述多于一个分区中的经鉴定的分区包括将所述多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中。
22.根据权利要求1和权利要求4-21所述的方法，其中将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到所述多于一个分区包括索引分选。
23.根据权利要求1和权利要求4-22所述的方法，其中将多于一个固体支持物和多于一个单细胞分区到所述多于一个分区包括将所述多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中将所述多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中包括将所述多于一个单细胞引入所述微孔阵列在多于一个经鉴定的微孔处的微孔中。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中将所述多于一个单细胞引入微孔阵列的微孔中包括使所述多于一个单细胞通过流式细胞术沉积到所述微孔阵列的经鉴定的微孔中。
26.根据权利要求25所述的方法，其中使所述多于一个单细胞通过流式细胞术沉积到所述微孔阵列的经鉴定的微孔中包括使用流式细胞仪一次使一个单细胞沉积到所述微孔阵列的经鉴定的微孔中。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，所述方法还包括使流式细胞仪的分选组件与所述微孔阵列对齐。
28.根据权利要求2-27中任一项所述的方法，其中所述表型数据包括事件数据并且任选地所述事件数据包括源自分选装置的定量生物事件数据。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述事件数据包括侧向散射信号、前向散射信号、一个或更多个荧光信号或其任何组合。
30.根据权利要求2-29中任一项的方法，所述方法包括对所述单细胞的表型数据和测序数据进行相关性分析。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述相关性分析鉴定以下中的一种或更多种：候选生物标志物、候选治疗剂、治疗剂的候选剂量和/或候选治疗剂的细胞靶。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸包含所述第一通用序列的互补体。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸包含第二通用序列。
34.根据权利要求32-33中任一项所述的方法，其中获得所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的序列数据包括：
使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补体杂交的引物，扩增所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物，以产生多于一种扩增的条形码化分区索引寡核苷酸；以及
获得所述多于一种扩增的条形码化分区索引寡核苷酸或其产物的测序数据。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述多于一种条形码化分区索引寡核苷酸或其产物。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，
其中所述多于一种分区索引寡核苷酸中的每一种包含分区接头官能团，
其中所述多于一个分区中的每一个包含分区官能团，以及
其中所述分区官能团和所述分区接头官能团彼此关联，任选地所述分区接头官能团和所述分区官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸通过分区接头与所述分区关联。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述分区接头包含碳链，任选地所述碳链包含2-30个碳原子，还任选地所述碳链包含12个碳原子，任选地所述分区接头包含5’氨基修饰物C12(5AmMC12)或其衍生物。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述分区索引序列的长度是6-60个核苷酸，和/或所述分区索引寡核苷酸的长度是50-500个核苷酸。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸被(i)附接到所述微孔；(ii)共价附接到所述微孔；(iii)缀合到所述微孔；(iv)非共价附接到所述微孔；(v)配置成可通过UV光裂解、化学处理、加热、酶处理或其任何组合从所述微孔脱离；(vi)配置成不可从所述微孔脱离；或(vii)(i)-(vi)的任何组合。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，所述方法包括裂解所述单细胞中的一个或更多个。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸被配置成可从所述分区脱离，任选地所述分区索引寡核苷酸被配置成在细胞裂解期间从所述分区脱离。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，所述方法包括使所述分区索引寡核苷酸与所述分区解离，并且任选地使所述分区索引寡核苷酸与所述分区解离包括通过UV光裂解、化学处理、加热、酶处理或其任何组合使所述分区索引寡核苷酸从所述分区脱离。
44.根据权利要求43所述的方法，其中(i)所述解离发生在对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化之后；(ii)所述解离发生在对所述分区索引寡核苷酸进行条形码化之前；和/或(iii)所述解离发生在细胞裂解期间。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述分区索引寡核苷酸与所述一个或更多个细胞中任一个的基因组序列不同源，与一个物种的基因组序列同源，或其组合，并且任选地所述物种是非哺乳动物物种。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，所述方法还包括确定所述多于一个单细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数。
47.根据权利要求46所述的方法，其中确定所述多于一个单细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述多于一种条形码化核酸靶或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、其互补体或其组合的数目来确定所述多于一个单细胞中所述核酸靶的拷贝数。
48.根据权利要求46-47中任一项所述的方法，所述方法包括：
使随机引物与所述多于一种条形码化核酸靶接触，其中所述随机引物中的每一种包含第三通用序列或其互补体；以及
使与所述多于一种条形码化核酸靶杂交的所述随机引物延伸以产生多于一种延伸产物。
49.根据权利要求48所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第三通用序列或其互补体杂交的引物来扩增所述多于一种延伸产物，从而产生第一多于一种条形码化扩增子。
50.根据权利要求49所述的方法，其中扩增所述多于一种延伸产物包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述多于一种延伸产物。
51.根据权利要求49-50中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述第一多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述多于一个单细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中确定所述多于一个单细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述第一多于一种条形码扩增子的条形码扩增子关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述多于一个单细胞中的一个或更多个中所述多于一种核酸靶中的每一种的数目，所述第一多于一种条形码化扩增子包含所述多于一种核酸靶中的每一种的序列。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述多于一种核酸靶中的每一种的序列包括所述多于一种核酸靶中的每一种的子序列。
54.根据权利要求49-53中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子中所述核酸靶的序列包括所述核酸靶的子序列。
55.根据权利要求49-54中任一项所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和能够与所述第三通用序列或其互补体杂交的引物来扩增所述第一多于一种条形码化扩增子，从而产生第二多于一种条形码化扩增子。
56.根据权利要求55所述的方法，其中扩增所述第一多于一种条形码化扩增子包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述第一多于一种条形码化扩增子。
57.根据权利要求55-56中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述第二多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述多于一个单细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数。
58.根据权利要求49-57中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种条形码化扩增子和/或所述第二多于一种条形码化扩增子包含全转录组扩增(WTA)产物。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，所述方法包括使用所述多于一种条形码化核酸靶作为模板来合成第三多于一种条形码化扩增子以产生第三多于一种条形码化扩增子，任选地合成第三多于一种条形码化扩增子包括对所述多于一种条形码化核酸靶进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；还任选地合成第三多于一种条形码化扩增子包括使用能够与所述第一通用序列或其互补体杂交的引物和靶特异性引物进行的PCR扩增。
60.根据权利要求59所述的方法，所述方法包括获得所述第三多于一种条形码化扩增子或其产物的序列数据，并且任选地获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述第三多于一种条形码化扩增子或其产物。
61.根据权利要求59-60中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述第三多于一种条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记的数目来确定所述多于一个单细胞中的一个或更多个中所述核酸靶的拷贝数。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述核酸靶包括核酸分子，并且任选地所述核酸分子包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA或其任何组合。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述核酸靶包括样品索引寡核苷酸，并且任选地所述样品索引寡核苷酸包含样品索引序列，并且多于一种样品索引组合物中的至少两种样品索引组合物的样品索引序列包含不同的序列。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述核酸靶包括细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，任选地细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含用于细胞组分结合试剂的独特标识符序列。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中使所述多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中至少一种的DNA聚合酶使所述多于一种寡核苷酸条形码延伸，任选地所述DNA聚合酶包括Klenow片段，还任选地所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地其中所述病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中(i)所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列是相同的；和/或(ii)所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列是不同的。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列、所述第二通用序列、所述第三通用序列包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分，任选地所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分，还任选地所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种包含不同的第一分子标记序列，任选地所述多于一种寡核苷酸条形码的每一种第一分子标记包含至少6个核苷酸，还任选地所述多于一种寡核苷酸条形码的每一种细胞标记包含至少6个核苷酸。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包括合成颗粒或平坦表面。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种被固定在所述合成颗粒上、部分地固定在所述合成颗粒上、包封在所述合成颗粒中或部分地包封在所述合成颗粒中。
71.根据权利要求69-70中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒是可破坏的，任选地所述合成颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
72.根据权利要求69-71中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒包括珠，并且任选地所述珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。
73.根据权利要求69-72中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述多于一个单细胞包括T细胞、B细胞、肿瘤细胞、髓样细胞、血细胞、正常细胞、胎儿细胞、母体细胞或其混合物。
75.一种组合物，所述组合物包含：
微孔阵列，
其中所述微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围为约1,000μm3至约786,000μm3的体积，其中每个微孔包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中所述分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一微孔内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同微孔内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。
76.根据权利要求75所述的组合物，所述组合物还包括盒，其中所述盒包括以下中的至少一个：入口端口、出口端口、泵、阀、通风口、储器、样品收集室、温度控制设备或其任何组合。
77.一种组合物，所述组合物包含：
盒，
其中所述盒包括以下中的至少一个：入口端口、出口端口、泵、阀、通风口、储器、样品收集室、温度控制设备或其任何组合，其中所述盒包括微孔阵列，其中所述微孔阵列包括至少100个微孔，其中每个微孔具有范围为约1,000μm3至约786,000μm3的体积，其中每个微孔包含多于一种分区索引寡核苷酸，其中所述分区索引寡核苷酸各自包含预定的分区索引序列，其中位于同一微孔内的分区索引寡核苷酸包含相同的分区索引序列，并且其中位于不同微孔内的分区索引寡核苷酸包含不同的分区索引序列。
78.根据权利要求75-77中任一项所述的组合物，所述组合物包含一种或更多种用于逆转录反应的试剂、一种或更多种用于扩增反应的试剂、缓冲液、使用说明或其任何组合。
79.根据权利要求75-78中任一项所述的组合物，其中所述盒包括用于对所述至少100个微孔进行光学成像的透明窗。
80.根据权利要求75-79中任一项所述的组合物，所述组合物还包含成像系统，所述成像系统被配置成捕获和处理所述至少100个微孔的全部或一部分的图像，其中所述成像系统还包括照明子系统、成像子系统和处理器，任选地所述成像系统被配置成执行明场、暗场、荧光或定量相位成像。
81.根据权利要求75-80中任一项所述的组合物，其中所述分区索引寡核苷酸包含第二通用序列。
82.根据权利要求75-81中任一项所述的组合物，
其中所述多于一种分区索引寡核苷酸中的每一种包含分区接头官能团，
其中所述多于一个微孔中的每一个包含分区官能团，以及
其中所述分区官能团和所述分区接头官能团彼此关联，任选地所述分区接头官能团和所述分区官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。
83.根据权利要求75-82中任一项所述的组合物，其中所述分区索引寡核苷酸通过分区接头与所述微孔关联。
84.根据权利要求83所述的组合物，其中所述分区接头包含碳链，任选地所述碳链包含2-30个碳原子，还任选地所述碳链包含12个碳原子，任选地所述分区接头包含5’氨基修饰物C12(5AmMC12)或其衍生物。
85.根据权利要求75-84中任一项所述的组合物，其中所述分区索引序列的长度是6-60个核苷酸，和/或所述分区索引寡核苷酸的长度是50-500个核苷酸。
86.根据权利要求75-85中任一项所述的组合物，其中所述分区索引寡核苷酸被：(i)附接到所述微孔；(ii)共价附接到所述微孔；(iii)缀合到所述微孔；(iv)非共价附接到所述微孔；(v)配置成可通过UV光裂解、化学处理、加热、酶处理或其任何组合从所述微孔脱离；(vi)配置成不可从所述微孔脱离；或(vii)(i)-(vi)的任何组合。
87.根据权利要求75-86中任一项所述的组合物，其中所述分区索引寡核苷酸被配置成可从所述微孔脱离，任选地所述分区索引寡核苷酸被配置成在细胞裂解期间从所述微孔脱离。
88.根据权利要求75-87中任一项所述的组合物，其中所述分区索引寡核苷酸与所述一个或更多个细胞中任一个的基因组序列不同源，与一个物种的基因组序列同源，或其组合，任选地其中所述物种是非哺乳动物物种。
89.根据权利要求75-88中任一项所述的组合物，所述组合物包含多于一个固体支持物，所述多于一个固体支持物各自包含多于一种寡核苷酸条形码，任选地所述寡核苷酸条形码各自包含分子标记和细胞标记。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中与同一固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列，并且其中与不同固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记序列。
91.根据权利要求89-90中任一项所述的组合物，其中每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸条形码包含含有捕获序列的靶结合区，任选地所述靶结合区包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。
93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述分区索引寡核苷酸包含与所述捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置成捕获所述分区索引寡核苷酸，任选地与所述捕获序列互补的序列包含多(dA)区。
94.根据权利要求89-93中任一项所述的组合物，其中所述多于一种寡核苷酸条形码的每一种细胞标记包含至少6个核苷酸和/或所述多于一种寡核苷酸条形码的每一种分子标记包含至少6个核苷酸。
95.根据权利要求89-94中任一项所述的组合物，其中所述固体支持物包括平坦表面或合成颗粒，任选地所述合成颗粒是可破坏的，还任选地所述合成颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。
96.根据权利要求95所述的组合物，其中所述多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种条形码被固定在所述合成颗粒上、部分地固定在所述合成颗粒上、包封在所述合成颗粒中、部分地包封在所述合成颗粒中或其组合。
97.根据权利要求95-96中任一项所述的组合物，其中所述合成颗粒包括珠，并且任选地所述珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。
98.根据权利要求95-97中任一项所述的组合物，其中所述合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。
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