JP2775346B2 - プローブ構成物および方法 - Google Patents
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Description
ドにおいて選択されたシーケンスを検出するための該構
成物を使用する方法に関する。
Bulletin.#11、Synthesis of Fluorescent Dye−Labe
led Oligonucleotides for Use as Pdrimers in Fluore
scence-Based DNA Sequencing(1989). ブレイクら、Biochemistry,24:6132(1985a). ブレイクら、Biochemistry,24:6139(1985b). カルサースら、J.Am Chem Soc,113(6324)(199
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領域を含む試料中の1個またはそれ以上の選択されたポ
リヌクレオチドシーケンスを検出するために利用でき
る。断片捕獲および標識化の簡単な方法では選択された
シーケンスを含む断片は固定化プローブにハイブリッド
形成することによって捕獲される。捕獲した断片は検出
できるレポーター部分を含む第2のプローブにハイブリ
ッド形成によって標識を付けることができる。
この方法では、試料中のDNA断片の混合物をゲル電気泳
動によって分別し、次にニトロセルロースフィルターに
固定する。フィルターを1個またはそれ以上の標識プロ
ーブとハイブリッド形成条件下に反応させて、プローブ
シーケンスを含むバンドの存在を同定することができ
る。この方法は特に、一定のプローブシーケンスを含む
制限酵素DNA消化物中の断片を同定するため、および制
限断片長多型(RFLPS)を分析するために有用である。
ーケンスの存在を検出するための別のアプローチは、ポ
リメラーゼ鎖反応(ムリス、サイキ)によるシーケンス
の選択的増幅を含む。この方法では、選択されたシーケ
ンスの向かい合った末端部分に相補的なプライマーを使
用して熱循環と共に、プライマー開始複製の次の繰り返
しを進める。増幅されたシーケンスは種々の技法によっ
て容易に同定できる。このアプローチは特にポリヌクレ
オチド含有試料中の低コピーシーケンスの存在を検出す
るため、例えば体液試料中の病原体シーケンスを検出す
るために有用である。
的シーケンスを同定する方法が報告された(ウ・ホワイ
トリイ、ランデグレン、ウィン−ディーン)。オリゴヌ
クレオチド連結反応アッセイ(OLA)として知られてい
る1つのアプローチでは、関係のある標的領域に広がる
2個のプローブまたはプローブエレメントが標的領域と
ハイブリッド形成される。プローブエレメントが、プロ
ーブエレメントの向かい合った端部にて隣接する標的塩
基と(塩基対を)マッチさせると、この2個のエレメン
トが連結反応によって、例えばリガーゼを用いて処理し
て結合することができる。連結したプローブエレメント
を次に分析して、標的シーケンスの存在を証明する。
トは1対の相補的プローブエレメントに対して鋳型とし
て働く。2対の相補的プローブエレメントの存在で変
性、再アニーリングおよび連結反応の連続したサイクル
を用いて、標的シーケンスを幾何学的に増幅し、極少量
の標的シーケンスを検出および/または増幅させる。こ
のアプローチはまたリガーゼ鎖反応(LCR)と呼ばれ
る。
々の存在または不在を検出する際に有用な方法に対し
て、例えば遺伝スクリーニングの分野において、成長す
る必要がある。例えば、150ほどの異なる突然変異体が
嚢胞性繊維症と関係していた。この病気に対する遺伝的
素因についてスクリーニングする際に、“嚢胞性繊維
症”の陽性の同定を行うために、関係するゲノムDNA中
の可能な異なる遺伝子シーケンスの突然変異の全部を試
験することが最適である。理想的には1回のアッセイで
可能な突然変異の部位の全部の存在または不在について
試験したい。
回のアッセイフォーマットで多数の選択されたシーケン
スを検出する際に使用するために容易に採用できない。
従って、ポリヌクレオチド試料中の多数の選択されたシ
ーケンスの存在または不在を検出するために迅速な1回
のアッセイフォーマットを提供することが望ましい。
動化の程度を向上させる試みによりキャピラリー電気泳
動を使用する配列決定のアプローチの開発に導かれた、
例えばファングら、Anal.Chem.,64巻、2149-2154頁(19
92);スウェルドロウら、Nucleic Acids Research,18
巻、1415-1419頁(1920)等。これらのアプローチを広
く応用するための主な障害は、キャピラリーの分離媒体
にゲルを使用する必要があることである。これは非常に
時間を要し、信頼できる便利な配列決定のために十分に
均一な品質をもつようにキャピラリー中にゲルを充填お
よび/または形成することが難しい。診断に応用するた
め、あるいはゲノム分析のための高速DNA塩基配列決定
は、ゲル分離媒体に関連する時間や品質コントロールの
問題はなくキャピラリーに容易に充填できる篩分けしな
い液体媒体中で電気泳動により大きさが異なるポリヌク
レオチドを分離することができる手段が入手できるなら
ば、大きく前進するだろう。
変えるための一般的方法にあり、これにより他の状態で
は電荷/並進摩擦抵抗の割合が実質的に等しい結合ポリ
マーを篩分けしない液体媒体で電気泳動により分離する
ことができる。通常結合ポリマーはポリヌクレオチドま
たはその類似体である。好ましくは、結合ポリマーの電
荷/並進摩擦抵抗は、電荷/並進摩擦抵抗がこの結合ポ
リマーのものとは異なるポリマー鎖を結合ポリマーに結
合させて変えられる。本発明によれば、異なる種類の同
じ大きさの結合ポリマーを、異なるポリマー鎖を各種類
の結合ポリマーに結合させて分離することができ、各種
類の得られた共役物は電荷/並進摩擦抵抗が独特の比で
ある。逆に言えば、異なる大きさの結合ポリマーは篩分
けしていない液体媒体中で実質的に同じポリマー鎖を各
大きさの種類の結合ポリマーに結合させて電気泳動によ
り分離することができ、各種類の得られた共役体は篩分
けしていない液体媒体中で独特の比の電荷/並進摩擦抵
抗を有する。後者の例は特にDNA塩基配列決定に応用で
きる。
るシーケンスのポリヌクレオチドを電気泳動により識別
する方法を含む。本方法を実施する際に、(i)検出で
きるレポーター標識および(ii)各異なるシーケンスの
ポリヌクレオチドに電荷/並進摩擦抵抗の特有の比を分
与する結合ポリマー鎖を含む、1またはそれ以上の異な
るシーケンスのポリヌクレオチドを形成する。形成され
る異なるシーケンスのポリヌクレオチドは篩分けしてい
ないマトリックス中でキャピラリー電気泳動によって分
別され、それらの観察された電気泳動移動率に従って検
出される。
溶性鎖、例えば異なるシーケンス結合ポリマーに結合し
た鎖が異なる数のポリマー単位を有する、ポリエチレン
オキシド(PEO)単位から成る鎖またはポリペプチド鎖
であってもよい。また、荷電または非荷電の連結基によ
って連結した多数のサブユニットの単位からなるポリマ
ーも含まれる。
行うために使用され、普通の5′末端をもつ標識ポリヌ
クレオチドの混合物を大きさによって電気泳動で分離す
る。好ましくは、同じポリマー鎖は標識ポリヌクレオチ
ドと合わせて、次にキャピラリー電気泳動によって分離
される共役体を形成する。以下に詳細に述べるように、
この具体例に関連した構成物は結合したポリマー鎖をも
つプライマーを含む。1の具体例では、ポリヌクレオチ
ドはスペクトルにより解像できる染料を用いて、共役的
に標識を付けたジデオキシヌクレオチドをもつ3′末端
で終わっており、各ポリヌクレオチドの3′末端ヌクレ
オチドを識別することができる。
たはそれ以上のシーケンスを検出するために使用され
る。本方法を実施する際に、1またはそれ以上のシーケ
ンス特異的プローブを標的ポリヌクレオチドに添加し、
各プローブは標的ポリヌクレオチドにおける標的シーケ
ンス中の隣接領域に結合するために有効な第1と第2の
プローブオリゴヌクレオチドを有する。第1と第2のプ
ローブオリゴヌクレオチドの1個はポリマー鎖で誘導さ
れる。プローブは、各プローブ中の第1と第2のオリゴ
ヌクレオチドをそれらの特異的標的シーケンスに結合す
るために有効な条件下に標的ポリヌクレオチドと反応す
る。次に標的ポリヌクレオチドに結合する第1と第2の
オリゴヌクレオチドは、それらの末端サブユニットが隣
接標的塩基と塩基対であるとき、オリゴヌクレオチドの
末端サブユニットを連結するために有効な条件下に連結
する。次にこのように形成した連結プローブは、続く電
気泳動分離と検出のため、標的ポリヌクレオチドから脱
離する。
ブのオリゴヌクレオチドに共役結合し、各第2のプロー
ブのオリゴヌクレオチドにレポーター標識を付ける。
連結反応のサイクルを繰り返して増幅される。連結した
プローブは標的シーケンスに対して連結していないプロ
ーブを繰り返して結合し連結することによって線状に増
幅される。あるいは、連結したプローブは、共に選択さ
れた連結プローブに相補的であるシーケンスを作る第1
と第2のプローブオリゴヌクレオチドの第2の対の存在
で、プローブの結合と連結のサイクルを繰り返して、指
数関数的に増幅することができる。
チドは、(i)会合した標的シーケンスの同じ部位にお
いて代替シーケンスに相補的であり、そして(ii)異な
る検出できるレポーターを用いて誘導される、2個の代
替シーケンスオリゴヌクレオチドを含む。この方法は標
的シーケンスの突然変異状態を、(a)そのプローブと
会合した標的シーケンスを同定する各プローブのサイン
電気泳動の移動度、および(b)その標的シーケンスの
突然変異状態を同定するサインレポーター部分に従って
決定することができる。
たはそれ以上の標的シーケンスを検出するためのもので
ある。この方法では、1またはそれ以上のシーケンス特
異的プローブを標的ポリヌクレオチドに添加し、各プロ
ーブは、それぞれ標的ポリヌクレオチド断片の相補的鎖
の向かい合った末端領域と混成するために有効な第1と
第2のシーケンス特異的プライマーオリゴヌクレオチド
をもつ。各プローブ中の第1のプライマーオリゴヌクレ
オチドはプローブ特異的ポリマー鎖を用いて誘導され
る。プローブは標的ポリヌクレオチドに両方のプライマ
ーオリゴヌクレオチドを結合するために有効な条件下
に、標的ポリヌクレオチドと反応し、そして標的ポリヌ
クレオチド中の標的断片はプライマー開始ポリメラーゼ
鎖反応によって増幅される。次に標的ポリヌクレオチド
における選択されたシーケンスの存在は電気泳動分離お
よび増幅シーケンスの検出によって決定することができ
る。
チドにレポーター標識を付け、電気泳動により分離され
検出される異なるシーケンスのポリヌクレオチドは二重
鎖である。
ーター標識を付けたヌクレオシドトリホスフェートの存
在で増幅を行うことができる。あるいは、増幅された標
的シーケンスに、一本鎖の形で、1またはそれ以上のレ
ポーター標識を付けたシーケンス特異的プローブを用い
てハイブリッド形成によって、または二本鎖の形で、臭
化エチジウムのようなレポーターを共役または非共役結
合によって標識付けすることができる。
以上の標的シーケンスの存在を検出するため、1または
それ以上のシーケンス特異的プローブを標的ポリヌクレ
オチドに添加し、各プローブは第1の一本鎖DNA断片、
および一本鎖RNAを含む第2の断片を含む。1の具体例
では、ポリマー鎖は第1の断片に結合し、検出できるレ
ポーター標識は第2の断片に結合する。プローブは、第
1と第2の断片をそれらの特異的標的シーケンスに結合
するために有効な条件下に標的ポリヌクレオチドと反応
させ、ハイブリッド形成プローブをRNA/DNA基質に特異
的なRNase酵素と反応させて、ポリマー鎖を欠いている
修飾標識プローブを形成する。次にプローブを電気泳動
分離のための標的ポリヌクレオチドから脱離する。
プローブ中の第1の断片に結合し、RNase酵素とハイブ
リッド形成プローブと反応し、第2の断片を欠く修飾標
識プローブを生成する。
ポーター標識を各プローブの第1の断片の5′末端に隣
接する塩基に結合することができ、ハイブリッド形成プ
ローブを処理してプローブから標識塩基を酵素により開
裂し、特有の電荷/並進摩擦抵抗をもつ標識プローブを
形成する。
以上の標的シーケンスを検出するため、標的ポリヌクレ
オチドを固体支持体上で固定する。
スのプローブを標的ポリヌクレオチドと反応させ、そこ
では各プローブは(i)検出できるレポーター標識およ
び(ii)各異なるシーケンスのプローブに電荷/並進摩
擦抵抗の特有の比を分与する結合ポリマー鎖を含む。標
的ポリヌクレオチドをプローブとの反応前または後に固
体支持体上に固定することができる。固定標的ポリヌク
レオチドを洗浄して非特異的結合プローブを除去した
後、標的ポリヌクレオチドを変性して標的ポリヌクレオ
チドにハイブリッド形成したプローブを脱離する。次に
脱離プローブを電気泳動により分離し検出する。好まし
くは、プローブは実質的に同じ長さである。
スの1またはそれ以上を検出する際に使用するためのプ
ローブ構成物もまた本発明の1部を形成する。この構成
物は複数のシーケンス特異的プローブを含み、各々は
(a)選択された結合条件下に、標的シーケンスの1に
ポリマーを塩基特異的結合するために設計されたサブユ
ニットのプローブ特異的シーケンスをもつ結合ポリマ
ー、および(b)結合ポリマーに結合し、結合ポリマー
の電荷/並進摩擦抵抗の比とは異なる比をもつポリマー
鎖によって特徴づけられる。
は第2の結合ポリマーを含み、そこではシーケンス特異
的プローブ中の前述の第1および第2の結合ポリマーが
塩基特異的方法で、選択された標的シーケンスの隣接し
た接触する領域に結合するために有効であり、シーケン
ス特異的方法で標的シーケンスに結合したとき2個の結
合ポリマーが連結することができる。好ましくは第2の
結合ポリマーは検出できる標識を含み、第1の結合ポリ
マーに結合したポリマー鎖は各連結したプローブ対に、
電荷/並進摩擦抵抗の特有の合わさった比を分与する。
的プローブは第2の結合ポリマーを含み、そこではシー
ケンス特異的プローブ中の前述の第1および第2の結合
ポリマーが、選択された二重の標的シーケンスの向かい
合った鎖の向かい合った末端領域に塩基特異的方法で結
合するために有効であり、各鎖の標的領域のプライマー
開始重合を可能にする。好ましくは第2の結合ポリマー
は検出できる標識を含み、第1の結合ポリマーに結合し
たポリマー鎖は各連結プローブ対に、電荷/並進摩擦抵
抗の特有の合わさった比を分与する。
ポリマー、結合ポリマーに結合したポリマー鎖、および
結合ポリマーに結合したレポーターを含む。
発明の詳細な説明を添付図面と共に読むとき一層明らか
になるだろう。
用される3つの一般的なタイプのプローブおよびプロー
ブエレメントを示す; 図2は選択された数のヘキサポリエチレンオキシド
(HEO)ユニットを有するポリエチレンオキシドポリマ
ー鎖の合成方法を示す; 図3はHEOユニットがビスウレタントリル連鎖によっ
て連結されているポリエチレングリコールポリマー鎖の
合成方法を示す; 図4Aおよび4Bは図2および3のポリマー鎖をポリヌク
レオチドの5′末端に、それぞれ結合するためのカップ
リング反応を示す; 図5は、ホスホジエステル連鎖によって、続いて蛍光
標識を付けて、HEOユニットを連続してオリゴヌクレオ
チドに付加するための反応行程を示す; 図6はヘキサエチレンオキシド(HEO)ユニットの1
(ピーク2)、2(ピーク3)、および4(ピーク4)
ユニットを用いて誘導化する前(ピーク1)および後の
24塩基オリゴヌクレオチドの、篩分けしていない媒体中
のキャピラリー電気泳動による電気泳動図であり; 図7A-7Dは標的シーケンスが塩基適合プローブエレメ
ントの連結(OLA)によって検出される本発明の具体例
を示す; 図8は図7の方法でみられる理想化された電気泳動パ
ターンを示し、標的ポリヌクレオチドは2個の異なる標
的領域に突然変異体を含む; 図9は、ポリペプチドポリマー鎖をもち、標的分子上
の隣接プローブの連結反応によって形成された標識プロ
ーブの、篩分けしていない媒体中の、キャピラリー電気
泳動による、電気泳動図であり; 図10A-10Cは本発明の具体例を示し、突然変異体は本
発明によるリガーゼ鎖反応(LCR)により塩基適合プロ
ーブの連結反応によって検出される; 図11は、ポリエチレンオキシドポリマー鎖をもち、LC
R反応によって形成された標識プローブの、篩分けして
いないマトリックス中のキャピラリー電気泳動による、
電気泳動図であり; 図12A-12Bは本発明の第2の具体例における工程を示
し、二重鎖標識プローブを生成するためプライマー開始
増幅を用いる; 図13Aおよび13Bは図12の方法において形成された増幅
標的シーケンスに標識を付けるための代替方法を示す; 図14Aおよび14Bは本発明の第3の一般的具体例の工程
を示し、標的結合プローブにレポーター標識ヌクレオチ
ド付加を用いて、標識プローブ種を形成する; 図15Aおよび15Bは本発明の方法により、既知のシーケ
ンスポリヌクレオチド断片を変更する他の方法を示す; 図16A-16Cは本発明の方法により、修飾された標識プ
ローブを形成するための代替方法を示す;そして 図17Aおよび17Bは、本発明の他の具体例により、修飾
された標識プローブを形成するための代替方法を示す; 図18A-18Bは、本発明によるプローブ連結方法の具体
例を示す; 図19Aおよび19Bは、本発明による修飾された標識プロ
ーブを形成するための他の方法を示す; 図20A-20Cは、本発明の他の具体例を示し、プローブ
は固体支持体に固定化された標的ポリヌクレオチドに対
してハイブリッド形成される。
または二本鎖RNAまたはDNA分子を含む、1個またはそれ
以上の核酸分子を含むことができる。
は、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの隣接する
シーケンスを意味する。このようなシーケンスの“複
数”は1またはそれ以上のヌクレオチド部位につき塩基
シーケンスが異なる2またはそれ以上の核酸シーケンス
を含む。
たは塩基シーケンス特異性をもつシーケンスサブセット
シーケンスに結合するために有効なポリマーを意味し、
選択されたハイブリッド形成条件下に、試験試料中の所
定の複数のシーケンスにおける任意の他の標的シーケン
スまたはシーケンスサブセットに対して、実質的に一層
低い結合親和性を有する。
基シーケンスおよび/または異なる数の塩基を含むポリ
ヌクレオチドを意味する。
正味の静電気電荷であり; ポリマーの“並進摩擦抵抗”は限定された篩分けして
いない液体媒体を通って電気泳動により移動するときの
ポリマーの摩擦抵抗の測定値である。
たポリマー分子のメッシュまたは網目またはマトリック
スを実質的に含まない液体媒体を意味する。
篩分けしていない媒体中の特有の、すなわち、独特の、
電気泳動移動によって証明される。
たはキャピラリィプレートにおける電気泳動を意味し、
分離カラムの直径または分離プレートの厚さは約25-500
μmであり、分離媒体を通して有効な熱放散と共に結果
的に媒体内の熱対流を下げることができる。
ポリマーに電荷/並進摩擦抵抗の特有の割合を分与する
ポリマー鎖を、選択された標的シーケンスに結合するた
めに有効な結合ポリマー、および検出できるレポーター
または標識から成るプローブを意味する。
識”は、レポーター標識抗体またはアビジンのような、
検出できる抗リガンドに特異的に高い親和力で結合でき
る、抗原またはビオチンのような、適当な検出器、また
はリガンドによって標識プローブを直接検出できる、蛍
光団、発光団、ラジオアイソトープ、またはスピン標識
を指す。
ポリメラーゼによって成長するDNA鎖に組み込まれた後
に、さらにポリヌクレオチド鎖が伸長または拡大するこ
とを妨げるヌクレオチドまたはその類似体を意味する。
通常、このようなヌクレオチドの鎖終始の性質は糖部分
の3′ヒドロキシル基の不在または修飾による。好まし
くは鎖終始ヌクレオチドは2′,3′−ジデオキシヌクレ
オチドである。
クトルにより分解できる”の語は、染料の蛍光放出バン
ドが充分にはっきりしている、すなわち充分にオーバー
ラップしていないことを意味し、各染料が結合している
標的物質、例えばポリヌクレオチドが、標準光検出装置
により各染料によって生じた蛍光信号を基礎として識別
でき、例えば、米国特許4,230,558、4,811,218等、また
はフィーレスら、pgs.21-76,in Flow Cytometry:Instru
mentation and DataAnalysis(Academic Press.New Yor
k.1985)に記載されている装置によって例示されるよう
なバンドパスフィルターおよび光電子増倍管の装置を用
いる。
前駆体”は、デオキシアデノシントリホスフェート(AT
P)、デオキシシチジントリホスフェート(CTP)、デオ
キシグアノシントリホスフェート(GTP)、およびチミ
ジントリホスフェート(TTP)、またはその類似体、例
えばデオキシイノシントリホスフェート(ITP)、7−
デアカデオキシグアノシントリホスフェート等を意味す
る。
たプローブの幾つかの具体例を述べる。代表的な場合
は、プローブは、セクションIIIに記載した方法に従っ
て、複数の標的シーケンスの1またはそれ以上を検出す
るために使用される複数のプローブを含むプローブ構成
物の1部である。図1Bおよび1Cを参照して記載したプロ
ーブは本発明に従ってプローブ構成物を作成するプロー
ブまたはプローブエレメントを代表する。
プローブの1つであるプローブ20を示す。以下に示すよ
うに、プローブの20のようなプローブを含むプローブ構
成物は、図1Aの点線26によって示される標的ポリヌクレ
オチドの領域24のシーケンスのような、標的シーケンス
を同定する“プローブ伸長”方法で、または、このよう
な標的シーケンスを同定するための“プローブ捕獲”方
法で使用するために設計される。両方法は以下のセクシ
ョンIVで述べる。
くは少なくとも10-20塩基を含むオリゴヌクレオチド結
合ポリマー22を含み、一本鎖形態と同様に、標的ポリヌ
クレオチド26において領域24に相補的である塩基シーケ
ンスを有する。この構成物の他のプローブは標的ポリヌ
クレオチドにおいて既知のシーケンスの他の標的領域に
対してシーケンス特異性をもつ。好適例では、異なるシ
ーケンスプローブ全部の結合ポリマーはほぼ同じ長さで
あり、実質的に同じハイブリッド形成反応の動態及び熱
力学(Tm)をもつ標的ポリヌクレオチドに異なるプロ
ーブのハリブリッド形成を可能にする。
ドのようなポリヌクレオチドの類似体であり、そして一
本鎖または二本鎖標的ポリヌクレオチドに塩基特異的に
結合できる他の結合ポリマーもまた予想される。荷電し
ていないがデオキシリボヌクレオチドサブユニット間の
立体異性メチルホスホネート連鎖が報告された(ミラ
ー、1979、1980、1990、ムラカミ、ブレイク、1985a,19
85b)。また種々の類似の荷電していないホスホルアミ
デート結合オリゴヌクレオチド類似体も報告された(フ
レーラー)。また、アキラルな荷電していないインター
サブユニット連鎖(スタチャク)をもつデオキシリボヌ
クレオシド類似体およびアキラルなインターサブユニッ
ト連鎖をもつ荷電していないモルホリノに基づくポリマ
ーが報告された(米国特許第5,034,506号)。このよう
な結合ポリマーはワトソン−クリック型塩基対によって
一本鎖標的分子にシーケンス特異的に結合するために、
または二本鎖核酸の主要溝中のフーグスディーン型結合
部位によって二本鎖標的ポリヌクレオチドにシーケンス
特異的に結合するために設計することができる(コンバ
ーグ)。
割合の電荷/並進摩擦抵抗を有し、この割合はプローブ
構成物を作る複数のプローブの異なるシーケンス結合ポ
リマー全部に対して実質的に同じであることができる。
これは篩分けしていない媒体において電気泳動によって
異なる大きさ(サブユニット数)およびシーケンスを有
するオリゴヌクレオチドの似ている移動速度によって証
明される。
その5′末端で、Nサブユニット28から成るポリマー鎖
27で誘導化される。このユニットはポリマーのサブユニ
ットまたはサブユニット群であることができる。例示的
なポリマー鎖はポリエチレンオキシド、ポリグリコール
酸、ポリ乳酸、ポリペプチド、オリゴ糖、ポリウレタ
ン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシ
ド、およびそれらのブロックポリマーから形成され、荷
電または非荷電連結基によって連結された多数のサブユ
ニットのユニットから成るポリマーを含む。
マーのそれとは異なる電荷/並進摩擦抵抗の比を有す
る。以下のセクションIVに詳述した本発明の方法におい
て、プローブを処理してシークエンス特異的方法で標的
シークエンスに結合したこれらのプローブを選択的に修
飾し、以下のセクションIIIに述べるように、篩分けし
ていないマトリックス中特有の電気泳動の移動によって
証拠となるように、電荷/並進摩擦係数の特徴的な比を
もつ修飾した標識プローブを生成する。以下にのべるよ
うに、電荷/並進摩擦係数の特徴的な比はポリマー鎖の
長さ(サブユニットの数)の差によって概して達成され
る。しかし、ポリマー鎖電荷の差はまた、結合するポリ
マー長の差であると考えられる。
モポリマー、ランダムポリマー、またはブロックコポリ
マーであり、ポリマーは直線、くし状、分枝状または樹
枝状構造をもつことができる。さらに、本発明は単一点
で会合した結合ポリマーに付着した一本ポリマーに関し
てここでは述べているが、本発明はまた1個以上のポリ
マー鎖エレメントによって誘導される結合ポリマーを企
図しており、そこではエレメントはポリマー鎖を集合的
に形成する。
チド結合ポリマーに結合するときプローブが容易に水性
媒体に溶解することを保証するために少なくとも十分に
親水性であるものである。またポリマー鎖はハイブリッ
ド形成反応の影響を受けるべきではない。結合ポリマー
が、オリゴヌクレオチドの場合のように、大きく荷電し
ている場合、ポリマー鎖は荷電せず、または結合ポリマ
ーのそれよりも実質的に小さい電荷/サブユニット密度
を有する。
ローブ固相合成方法の一部として、合成する方法は、ポ
リマー鎖の好ましい性質と共に、以下に記載される。
鎖はヘキサエチレンオキシド(HEO)ユニットから形成
され、HEOユニットは両端を突き合わせて結合し、図2
に示したように、エチレンオキシドサブユニットのこわ
れていない鎖を形成するか、以下に述べるように、また
は荷電(図5)または荷電していない(図3)連鎖によ
って結合される。以下に例示する他の具体例はN12量体P
EOユニットから成る鎖、およびNテトラペプチドユニッ
トから成る鎖を含む。
であり、それら自身、単一のプローブまたはプローブセ
ットとして、本発明による構成物を形成する3個の追加
のプローブまたはプローブエレメント対を記載する。
ンス特異的に結合するために設計されたポリマー21を結
合するシーケンス特異的オリゴヌクレオチドを有するプ
ローブ25を示す。これによって結合ポリマーは、一定の
ハイブリッド形成条件下に、それぞれ選ばれた一本鎖ま
たは二本鎖標的シーケンスと安定な二重または三重ハイ
ブリッドを形成するために有効なサブユニットのシーケ
ンスを含むことを意味する。以下の図17を参照して示さ
れるように、結合ポリマーはDNAとRNA断片の両方を含
む。Nユニット33から成るポリマー鎖31はその5′末端
で結合ポリマーに結合し、下記のように、特有の電荷/
並進摩擦抵抗の比を結合ポリマーに与える。結合ポリマ
ーの3′末端はレポーターまたはタグ39を用いて誘導さ
れる。ある面では、本発明は複数のこのようなプローブ
を含む構成物を含み、各々は関係する異なる標的領域に
対して標的となる異なるシーケンス結合ポリマーを有
し、各々は会合したポリマー鎖によって与えられる特有
の電荷/並進摩擦抵抗の比を有する。
から成るプローブ32を示し、特に点線40によって示した
標的ポリヌクレオチドの1またはそれ以上の各領域、例
えば領域38において選択シーケンスを検出するために設
計される。
えば点突然変異、または1または少数の塩基を含む追加
または削除型突然変異を含むことができる。代表的な例
では、突然変異の期待部位は既知のシーケンス標的領域
の中心点付近であり、その領域を2つの副領域に分け
る。例示すると、突然変異が点突然変異であり、突然変
異の期待される部位が2個の隣接塩基T−Gの1個にあ
り、T塩基は副領域38aの5′末端を画定し、隣接G塩
基は隣接副領域38bの3′末端を画定する。以下に示す
ように、プローブエレメントはまた種々の他のタイプの
標的シーケンス、例えば病原体に関連したシーケンスま
たは特定のゲノム遺伝子シーケンスを検出するために有
用である。
代表であるプローブエレメント32は、必須の塩基対特異
性のため、好ましくは少なくとも10-20塩基を含むポリ
マーエレメント42を結合するオリゴヌクレオチドから成
り、標的ポリヌクレオチド中の副領域38aに相補的であ
る塩基シーケンスを有する。特に、3′末端ヌクレオチ
ド塩基は対応する副領域、例えば図に示したA:Tマッチ
ングの5′末端ヌクレオチド塩基に対になっている塩基
に対して選択される。第1のプローブエレメントのオリ
ゴヌクレオチドは、その5′末端にて、ユニット28から
形成された鎖27に関して実質的に述べたように、好まし
くはユニット45を繰り返すNから成るポリマー鎖44と共
に、誘導される。プローブ20に関して述べたように、第
1のプローブエレメントのポリマー鎖は、電荷/並進摩
擦抵抗の比を与え、これは構成物中の各シーケンス特異
的プローブエレメントに対して特有である。
代表でもある第2のプローブエレメント36は、必須の塩
基対特異性のため、好ましくは少なくとも10-20塩基を
含むオリゴヌクレオチドポリマー結合エレメント46から
成り、標的ポリヌクレオチド中の副領域38bに相補的で
ある塩基シーケンスを有する。特に、5′末端ヌクレオ
チド塩基は対応する副領域、例えば図に示したC:Gマッ
チングの3′末端ヌクレオチド塩基に対になっている塩
基に対して選択される。
らの会合標的領域に対し共にハイブリッド形成すると
き、2個のプローブにおける対面する末端サブユニッ
ト、この実施例では対面するAおよびCの塩基は、隣接
する塩基、例えば標的ポリヌクレオチドにおける隣接す
るTおよびG塩基とマッチする。この状態では、2個の
プローブエレメントはそれらの対面する末端で連結する
ことができ、以下に述べる本発明の1具体例に従って、
両方のオリゴヌクレオチドエレメントを含む連結プロー
ブを形成し、シーケンス特異的ポリマー鎖および結合オ
リゴヌクレオチドの反対側末端に結合したレポーターを
有する。この2個のプローブにおける隣接塩基の状態
が、標的領域に対しプローブをハイブリッド形成した
後、エキソヌクレアーゼ処理によってオーバーラップす
るデオキシリボヌクレオチドを除去することにより、生
成されることもできることが認められるだろう。
の3′末端にて、図1Cにおいて、48にて示されるレポー
ターFのような検出できるレポーターを用いて標識を付
ける。好ましくは、このレポーターは、光学レポータ
ー、例えば光学検出装置によって容易に検出できる蛍光
分子である。異なる励起波長で検出できる多くの標準蛍
光標識、例えばFAM、JOE、TAMRA、およびROX、およびオ
リゴヌクレオチドにレポーターを取り付ける方法が報告
されている(Applid Biosystems,Connell)。
ブエレメントを含み、1個のエレメントは標的シーケン
スにおいてワイルドタイプの塩基と塩基対になることが
できる末端サブユニット塩基シーケンスを有し、第2の
エレメントはシーケンス中の予想される突然変異と塩基
対となる末端サブユニット塩基を有する。この2個の代
替エレメントは識別できるレポーターを用いて標識を付
け、以下のセクションIIIに記載するように、各標的領
域中の野生型または突然変異シーケンスの明確な同定を
可能にする。あるいは2個の第2のプローブエレメント
(例えばオリゴヌクレオチド)は同じレポーターを有
し、その第1のプローブエレメントは2個のプローブエ
レメントに対し異なる電荷/並進摩擦抵抗の比を与える
ポリマー鎖をもち、2個の標的領域を電気泳動の移動度
に基づき識別することができる。
された構成物中のプローブを代表するプローブ50を示
す。プローブは、第1と第2のプライマーエレメント5
2、54から成り、プライマーエレメントシーケンスによ
って結合される二本鎖標的ポリヌクレオチドにおける領
域の存在または不在を検出するために特に設計されてい
る。図1Dに示す例において、プライマーシーケンスによ
って結合した領域は56で示され、二本鎖標的ポリヌクレ
オチドの二本の鎖は点線58、60で示される。
を代表するプライマーエレメント52は、必須の塩基対特
異性に対し、少なくとも7−15塩基を好ましくは含むオ
リゴヌクレオチドプライマーエレメント62から成り、そ
して2個の標的鎖の1個、この場合は、鎖58における領
域56の3′末端部位に相補的である塩基シーケンスをも
つ。
ユニット28から形成される鎖27に関して実質的に記載し
たように、好ましくはユニット66を繰り返すNから成る
ポリマー鎖64を用いて誘導される。プローブ20に関して
述べたように、第1のプローブエレメントのポリマー鎖
は構成物中の各シーケンスに特異的なプライマーエレメ
ントに特有な電荷/並進摩擦抵抗の比を与える。
成物中の第2のプローブエレメントを代表し、必須の塩
基対特異性に対し、やはり少なくとも7−15塩基対を好
ましくは含むオリゴヌクレオチドプライマーエレメント
68から成り、そして反対側の鎖−−この場合には、領域
56を形成する二重のDNAの鎖60の5′末端部位に相補的
である塩基シーケンスをもつ。第2のプライマーエレメ
ントは、上述のように、検出できるレポーターを用いて
標識を付ける。あるいは、標識付けは、以下に述べるよ
うに、増幅した標識シーケンスを形成した後に行うこと
ができる。
既知のポリマーサブユニット合成方法に従う。選択され
た長さのPEO(ポリエチレンオキシド)鎖の形成方法は
以下に示され、そして実施例1−4において詳述する。
これらの方法は、一定の大きさのマルチサブユニットポ
リマーユニットを直接または荷電したまたは荷電してい
ない連結基を介して、互いにカップリングすることを含
み、広範囲のポリマー、例えばポリエチレンオキシド、
ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリウレタンポリマー、
オリゴ糖に一般に応用できる。
さのコポリマー、例えばポリプロピレンユニットと交替
するポリエチレンオキシドユニットのコポリマーを合成
するために適当である。選択された長さのポリペプチド
とアミノ酸構成物ホモポリマーまたは混合ポリマーのい
ずれかは、実施例5に略述したように、標準の固相方法
によって合成することができる。
製するための1方法を示す。図に示すように、HEO(ヘ
キサチレンオキシド)はジメトキシトリチル(DMT)で
一端が保護され、その他端でメタンスルホネートで活性
化する。活性化したHEOは次にDMT−保護HEOダイマーを
形成するため、第2のDMT保護HEO基と反応することがで
きる。このユニット付加は連続して所望のPEO鎖長にな
る迄行われる。この方法の詳細は実施例1に与えられ
る。
ってHEOユニットを連続してカップリングすることを記
載する。簡単に述べると、図3に関して、HEOは穏和な
条件でトリレン−2,4−ジイソシアネートの2ユニット
と反応し、活性化したHEOは次にHEOと両端でカップリン
グしてHEOのビスウレタントリル結合トリマーを形成す
る。
来のホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成方法の
拡充によって、または他の標準カップリング方法によっ
て行うことができる。図4Aは、ホスホルアミダイトカッ
プリングによって、固体支持体上に形成されたオリゴヌ
クレオチドの5′末端にPEOポリマー鎖をカップリング
することを示す。図4Bは、やはりホスホルアミダイトカ
ップリングによって、上記ビスウレタントリル結合ポリ
マー鎖を固体支持体上でオリゴヌクレオチドにカップリ
ングすることを示す。2つのカップリング方法の詳細
は、それぞれ、実施例3Bおよび3Cに示される。
リマー鎖ユニットをオリゴヌクレオチドに段階的に付加
することによって、オリゴヌクレオチド(または他のシ
ーケンス特異的結合ポリマー)に作り上げることができ
る。図5は固体支持体上に固相合成によって形成された
オリゴヌクレオチドにHEOユニットを段階的に付加する
ことを示す。本質的に、この方法は、段階的にヌクレオ
チド付加を行う際に使用される同じホスホルアミダイト
活性化および脱保護工程に従う。詳細は実施例4に示さ
れる。実施例5はオリゴヌクレオチドに選択された長さ
のポリペプチド鎖を形成するための同様の方法を記載し
ている。
なるシーケンスプローブに特有な電荷/並進摩擦抵抗の
比を与える。ポリマー鎖が誘導結合ポリマーの移動を行
う寄与は一般にポリマー鎖のサブユニット長に依存す
る。しかし、荷電基をポリマー鎖、例えば図5に示した
PEO鎖中の荷電した連結基、またはポリペプチド鎖中の
荷電したアミノ酸に付加することも使用され、プローブ
における選択されか電荷/並進摩擦抵抗特性を達成する
ことができる。
クレオチドの電気泳動による分離 本発明の重要な特徴によれば、それ自体が篩分けして
いない媒体中で電気泳動によって分離することができな
い異なる長さおよび/または異なるシーケンス結合のポ
リマーを有するプローブは、僅かに異なる大きさおよび
/または電荷の差をもつポリマー鎖を用いる誘導化によ
って精細に分離することができる。
ケンスのポリヌクレオチドを含むと解釈できると理解さ
れる。
ローブは篩分けしていないマトリックスにおいてキャピ
ラリー電気泳動によって分別される。キャピラリー電気
泳動の利点は、十分な熱放散が媒体内の熱対流を減らし
または実質的に除去し、従って電気泳動によって得られ
る分解能を改善することである。
方法によって行われ、電気泳動媒体それ自体が篩分けマ
トリックスを含まないことを除いて、従来のCE装置を用
いる。実施例6に記載したCEプロトコルは例示である。
または4ホスホネート連結HEOサブユニットをもつ5′
末端で誘導化されている(それぞれピーク2,3,および
4)螢光標識24塩基オリゴヌクレオチドプローブの電気
泳動図である。プローブは実施例4に記載するように調
製し、キャピラリー電気泳動は実施例6に詳述した条件
下に緩衝液媒体中で行った。
分、20.994分、および21.558分の移動時間で、4本のピ
ークに良く分解されている。ポリマー鎖の不在では、4
個のオリゴヌクレオチドプローブは同じかまたは実質的
に同じ電気泳動移動度で移動する、すなわち、単一の分
解しないピークで動く傾向がある。(これはオリゴヌク
レオチドが同じかまたは異なる大きさであるか否かが判
る(オリベラ、ヘルマンズ)。) 荷電した結合ポリマー、例えばオリゴヌクレオチド
を、篩分けマトリックスの不在で電気泳動によって分別
する能力は、多くの利点を与える。ひとつの利点はすべ
てが殆ど同じ大きさの荷電したポリマーを分別する能力
である。以下のセキションIVにおいて高く評価されるよ
うに、この特徴はプローブ構成物中のプローブが似てい
る大きさ、従って標的ポリヌクレオチドと似たハイブリ
ッド形成動力学と熱力学(Tm)をもつことを可能にす
る。他の利点は電気泳動、特にポリマーを篩分けするCE
が非常に便利であり、特にキャピラリーチューブ中の架
橋ゲルを形成し除去する問題が避けられる。
において1またはそれ以上異なるシーケンス領域を検出
するために設計される。本方法は、上記タイプの1また
はそれ以上のシーケンス特異的プローブを、標的ポリヌ
クレオチドに最初に添加することを含む。このプローブ
は、標的ポリヌクレオチドにおいて対応するシーケンス
にプローブのシーケンス特異的結合に有利である条件下
に標的ポリヌクレオチドを用いて反応させる。上述のよ
うに、この結合は代表的にはワトソン−クリック型塩基
対による標的とプローブにおける相補的塩基シーケンス
のハイブリッド形成を含む。
スとの間の塩基特異的水素結合対は、フーグスティーン
型塩基対を介して、代表的には重複分子の主な慣例にお
いて(コーンバーグ)また予期される。
ローブはシーケンス特異的方法において標的シーケンス
に結合したプローブを選択的に修飾し、修飾された標識
プローブを生成するように処理され、各々は特徴的な電
荷/並進摩擦抵抗比をもつ。この修飾工程は、以下のサ
ブセクションA−Fに記載されるように、期待される突
然変異位置の全域で、酵素連結反応のような連結反応、
選択された標識シーケンスのプライマー開始増幅、標識
を付けたヌクレオチドトリホスフェート分子の存在での
プローブ伸長、標的領域に結合したプローブの酵素分
解、または固定化標的上のプローブ捕獲によって、プロ
ーブエレメントを結合することを含むことができる。標
的結合プローブの選択的修飾によって生成された標識プ
ローブは、上記セクションIIIに述べたように、篩分け
していない媒体中の電気泳動によって分別される。この
修飾された標識プローブの移動速度を使用して標識プロ
ーブと会合した特定のシーケンスを同定し、標的ポリヌ
クレオチドにおける特定のシーケンスの存在を同定する
ことができる。
レオチドにおいて特定のシーケンスを特に検出するため
に設計される。標的ポリヌクレオチドは、二本鎖または
一本鎖のポリヌクレオチドの単一分子、例えばゲノムDN
A、cDNAまたはRNAを含むウィルスゲノム、またはポリヌ
クレオチドフラグメント、例えばゲノムDNAフラグメン
トまたは感染試料からのウィルスおよび体細胞のポリヌ
クレオチドフラグメントの混合物であってもよい。代表
的には、本具体例において、標的ポリヌクレオチドは例
えば熱により変性してプローブ結合ポリマーとハイブリ
ッド形成できる一本鎖標的分子を形成する二本鎖DNAで
ある。
ば、図示した3′ないし5′配向をもつ二本鎖標的の
“+”鎖を示す。ポリヌクレオチドは、それぞれ72、7
4、76、および78に示される複数の領域(標的シーケン
スとも呼ばれる)R1、R2、R3ないしRnを含み、それ
ぞれは異なる塩基シーケンスを含む。各領域は、好まし
くは約20-80の塩基対の間で、好ましくはほぼ同じ長
さ、すなわち、塩基対の数をもつ。本方法はまた僅かな
異なるシーケンス領域が検出される場所にも応用できる
が、本方法でアッセイされるべき領域Rnの全数は100ま
でまたはそれ以上であってもよい。
のようにして小さい突然変異の発生の他の型、例えば1
またはそれ以上の塩基の除去または付加が本方法によっ
て検出できるかが正しく認識されるだろう。さらに一般
的に、本方法を使用して、同時に、標的シーケンス、例
えば病原体標本の混合物と会合したシーケンス、または
ゲノムDNA断片混合物中の遺伝子シーケンスをアッセイ
することができる。
ヌクレオチド70の拡大部分を示す。領域74は、隣接する
塩基TおよびCを含み、これら2つの塩基で終わる2つ
の副領域74a、74bに領域を分けることを示している。T
およびCの塩基は野生型(突然変異していない)塩基で
あるが、これらの塩基のひとつ、例えばT塩基は、関係
する既知の点突然変異部位に相当する。同様に、領域76
は、この領域をこれら2個の塩基で終わる2個の副領域
76a、76bに分ける隣接塩基GおよびGを含む。副領域76
aのG塩基は野生型T塩基から点突然変異を示し、隣接
するG塩基は突然変異していない。このアッセイ方法
は、このような点突然変異を含む領域74および/または
76のような標的の領域を同定するように設計される。
しくは複数のプローブエレメント、例えば上記図1Bに関
して記載されたものから成る。この構成物を、変性した
形で、標的ポリヌクレオチドに添加し、その成分をアニ
ーリングしてプローブエレメントを、図1Bに示すよう
に、相補的シーケンス標的領域に対してハイブリッド形
成する。
プローブエレメント80a、80bを含み、それらのシーケン
スはそれぞれ標的ポリヌクレオチドの領域74において対
応する副領域74a、74bに相補的である。すなわち、プロ
ーブエレメントシーケンスが標的のR2領域の“−”鎖
のそれらに対応している。特に、プローブエレメント
は、エレメントが図に示すように領域74の相補的副領域
にハイブリッド形成されるとき、標的領域において隣接
する塩基TおよびCとワトソン−クリック型塩基対を形
成するために有効である末端サブユニットAおよびG塩
基を有する。
クレオチドの領域76でそれぞれ対応する副領域76a、76b
にシーケンスが相補的である一対のプローブエレメント
82a、82bを含む。この場合に、プローブエレメントは、
図に示すように、領域76の相補的副領域に対してエレメ
ントがハイブリッド形成されるとき、野生型標的領域に
おける隣接する塩基TおよびG塩基とワトソン−クリッ
ク型塩基対を形成するために有効である末端サブユニッ
トAおよびC塩基を有する。しかし、示した実施例で
は、TないしGの突然変異は会合した標的塩基にA末端
サブユニットのワトソン−クリック型塩基対を妨げる。
をアニーリングした後、反応混合物を連結試薬、好まし
くはリガーゼ酵素で処理して、対比する塩基が隣接する
標的塩基と塩基対となるプローブエレメントの対を連結
する。代表的な連結反応条件は実施例7Aに示される。連
結反応は末端サブユニットが標的塩基と塩基対となって
いるプローブエレメントに対して選択的である。従っ
て、図に示した例では、プローブエレメント80a、80bは
連結しているが、プローブエレメント82a、82bは連結し
ていない。
ゴヌクレオチドを検出できるレポーターを有するオリゴ
ヌクレオチドに結合し、1端がプローブ特異的ポリマー
鎖を用いて、その他端が検出できる(蛍光)レポーター
を用いて、標識を付けたオリゴヌクレオチドから成る、
連結したプローブ84のような、標識を付けた修飾プロー
ブを選択的に形成することは、高く評価できる。
ると、野生型の標的シーケンスに対応する連結し標識を
付けたプローブ、およびプローブエレメント末端サブユ
ニットにてあるいはその近くで、点突然変異体に対応す
る連結していないプローブエレメントとの混合物を脱離
する。各連結し標識を付けたプローブはポリマー鎖を有
し、これはプローブに対して、上記のように、特有の電
荷/並進摩擦抵抗比を与える。
つ(R3)は、相補的シーケンスプローブエレメントの
連結反応を妨げる突然変異体を含む。実施例として、全
体の標的ポリヌクレオチドは関心のある8個のシーケン
ス領域を含み、その領域のR3とR7はプローブエレメン
ト連結反応を妨げるタイプの突然変異体を有し、他の6
個の領域は連結し標識を付けたプローブに導く野生型シ
ーケンスであると思われる。図8は連結反応アッセイ方
法において期待される理想化した電気泳動パターンを示
す。図中のピーク1−8は、HEOユニットを連結した
1、2、3、4、5、6、7および8のような、段々長
くなるポリマー鎖をもつ連結オリゴヌクレオチドプロー
ブの予期される溶出時間である。観察された電気泳動パ
ターンは、図に示されるように、3と7のピーク位置で
ギャップを示し、3と7の標的位置における突然変異体
の証拠となる。全部の修飾されていないDNAは実質的に
N=Oのピークと共に溶出するだろう。
および分離の一般的な原理を示す。この方法では、1ま
たは2Phe-Ala-Phe-Alaテトラペプチドユニットを用いて
誘導化された25塩基オリゴヌクレオチドおよび螢光標識
25塩基オリゴヌクレオチドを、ハイブリッド形成の条件
下に、そのシーケンスがこの2つのオリゴヌクレオチド
に広がった標的ポリヌクレオチドと混合した。ハイブリ
ッド形成したプローブエレメントはリガーゼを用いて処
理し、1または2のテトラペプチドユニットを有する螢
光標識プローブを形成させる。
泳動は実質的に上述のように、また実施例7に詳述する
ように行われた。図9は連結反応前の螢光標識プローブ
(ピーク12.621)、および4−または8−アミノ酸ポリ
マー鎖を含む、プローブで連結したときの同じプローブ
(それぞれ、ピーク18.328および18.783)の電気泳動図
を示す。図に見られるように、2つの連結プローブおよ
び非連結プローブ(ピーク12.621)は篩分けしていない
媒体中でCEによって容易に分解される。
要ならば、繰り返されるプローブエレメントハイブリッ
ド形成と連結反応工程を用いて誘導されたプローブの増
幅によって高めることができる。簡単な追加の(線状)
増幅は標的として標的ポリヌクレオチドを用い、変性、
アニーリング、およびプローブエレメント連結反応を誘
導プローブが所望濃度に達するまで繰り返して達成する
ことができる。
って形成された連結プローブを、公表された方法(ウィ
ン−ディーン)に従って、また実施例8に述べたよう
に、リガーゼ鎖反応(LCR)によって増幅することがで
きる。図10A-10Cに示したこの方法では、図1Bに関して
述べたように2組のシーケンス特異的プローブが二本鎖
DNAの各標的領域に対して用いられ、この2本の鎖は図1
0Aでは170と172で示されている。174で示した1組のプ
ローブはプローブエレメント174a、174bを含み、これら
は、図に示したように、鎖170上の標的シーケンスの隣
接する次の領域にてシーケンス特異的結合するために設
計されており、そして176で示した第2の組のプローブ
はプローブエレメント176a、176bを含み、これらは、や
はり図に示したように、反対側の鎖172上の標的シーケ
ンスの隣接する次の領域にシーケンス特異的に結合する
ために設計されている。
の組32に類似して、プローブエレメント174aと176aはポ
リマー鎖を用いて誘導され、プローブエレメント174bと
176bは蛍光レポーターを用いて誘導される。2組のプロ
ーブを変性していない一本鎖標的シーケンスにハイブリ
ッド形成した後、各標的領域に結合したプローブエレメ
ントを連結し、反応生成物を変性して標的を付けたプロ
ーブ178、180を離脱する(図10B)。これらの標識を付
けたプローブは、図10Bに示すように、今は22個の標識
プローブを生成する連結反応を用いてプローブの組17
4、176を結合するため標的基体として供することができ
る。この工程を、N−2回繰り返して、図10Cに示すよ
うに、2N個の標識プローブ178、180を全部、理想的に
生成する。
トを調製し、1組は、上述のように、2または4ドデカ
エチレンオキシド(DEO)のいずれかを含有するポリマ
ー鎖を用いて誘導化される第1のプローブ、および螢光
レポーター(JOE)で標識化される第2のプローブを含
む。プローブエレメントの対は嚢胞性繊維症遺伝子のF5
08領域を標的とした。
緒にして、混合物中に増幅し連結したプローブをCEによ
って篩分けしていない緩衝液中で変性条件下に(8Mの尿
素)分別した。電気泳動図を図11に示す。ここで左側の
ピーク(ピーク19.058)は連結していないJOE標識プロ
ーブである。20.847と22.118のピークは、それぞれ、2
または4本のDEOユニット鎖を含む連結した増幅プロー
ブである。図に示されるように、異なる長さのポリマー
鎖をもつ2個のプローブは、互いに、そして篩分けして
いないマトリックス中でポリマー鎖を欠いているプロー
ブから良く分離される。
体を検出することについて上述したが、この方法はま
た、例えば異なる病原体シーケンスの存在または不在に
関係がある多重標的シーケンス、または高等生物の異な
るゲノムシーケンスを検出するためにも応用できること
が理解される。
の方法では、各シーケンス特異的プローブ、例えばプロ
ーブ204は一対のプローブエレメント、例えばエレメン
ト206、208を含み、これらは例えば標的ポリヌクレオチ
ド212のシーケンス210のような選択されたシーケンスの
隣接する位置に結合するために設計される。プローブ20
6は結合ポリマー214、プローブエレメントに特有の電荷
/並進摩擦抵抗を与えるポリマー鎖216、およびポリマ
ー鎖または結合ポリマーに取り付けられるレポーター21
8を含む。第2のプローブエレメントは、図7A-7Dについ
て上述したように、2個のエレメントを会合した標的シ
ーケンスにハイブリッド形成させるとき、プローブエレ
メント206と連結できるオリゴヌクレオチドである。
ブリッド形成し、連結し、そして脱離され、修飾した標
識プローブ220を生成する。このプローブの電荷/並進
摩擦抵抗比は連結後にプローブに対して、異なる比のポ
リヌクレオチド/ポリマー鎖の寄与によって変えられ
る。次に修飾プローブは、上述したように、篩分けして
いない媒体中で電気泳動によって分別し、関心のある異
なる標的シーケンスと会合したプローブを同定する。
よって実質的に影響を受けないままなので、ポリマー鎖
の不在で、2つのオリゴヌクレオチドの連結反応が、篩
分けしていないマトリックス中のプローブの電気泳動移
動度を変えないであろうことは高く評価されるだろう。
この場合には、しかしながら、プローブの結合した電荷
と並進摩擦抵抗に対するポリマー鎖と結合ポリマーの貢
献が異なり、この割合は結合ポリマーの長さに敏感であ
る。
ローブを修飾するための関連した方法を示す。この方法
を使用して、フラグメントT1ないしTn、例えばそれぞ
れ150および152で示した二本鎖フラグメントT1および
T3と会合した1個またはそれ以上のシーケンスS1ない
しSnの存在を検出する。このフラグメントはこの方法
では、関心のある各標的シーケンスに対して、1対のプ
ローブエレメント、例えば図1Bに記載したプローブエレ
メントの一般的な構造をもつプローブエレメント152、1
54を含むプローブ構成物を用いてハイブリッド形成によ
って修飾される。即ち、エレメント152はフラグメント
T1の1の領域に塩基特異的に結合するために設計され
たオリゴヌクレオチド156、および選択された長さのポ
リマー鎖157を含み、エレメント154はフラグメントの第
2の領域に塩基特異的に結合するために設計されたレポ
ーター標識オリゴヌクレオチド158である。図16Aおよび
16Bに示されるように、プローブはポリマー鎖(i,j、お
よびk)を含み、これらはポリマー鎖が取り付けられて
いる結合ポリマーに対して特有の電荷/並進摩擦抵抗比
を与える。
択された長さのポリマー鎖をもつ1のプローブと第2の
レポーター標識プローブを用いてハイブリッド形成した
フラグメント、例えばフラグメント160を形成するプロ
ーブ構成物中のプローブエレメントを用いて、ハイブリ
ッド形成によって修飾される。標的フラグメントはこの
方法では、2個のプローブエレメントを結合するプロー
ブ連結作用に役立つと考えられる。フラグメントそれ自
体は、結合したプローブエレメントの電気泳動の移動度
をはっきりとは変化させないので、電気泳動によって分
別するとき、この方法は1個のプローブエレメントのポ
リマー鎖によって与えられる特有の電荷/摩擦抵抗の比
に従って標的シーケンスフラグメントを同定することが
できる。図16Cでは、混合物中のフラグメントT1および
T3に相当する2個のピークが電気泳動図において観察
される。フラグメントT2(図16Cの点線)に相当するピ
ークの不在は、T2が試料中に存在しないことを示して
いる。
ローブは二本鎖標的ポリヌクレオチドの1またはそれ以
上の領域のプライマー開始増幅のために設計される。増
幅した標的領域の少なくとも1本の鎖は各増幅フラグメ
ントに特有の電荷/並進摩擦抵抗の比を与えるポリマー
鎖を有する。この増幅した領域は増幅中または増幅後に
レポーター標識を付けることができる。
ための少なくとも1個の、そして代表的には複数の領
域、例えば領域96を有する通常は2本鎖の標的ポリヌク
レオチド94の2本の分離鎖90、92を示す。標的は、図1C
について上述したプローブ50において、各プローブがプ
ライマーエレメント52、54のような1対のプライマーエ
レメントから成るプローブ構成物と反応させる。図12A
はプライマーエレメント100、102から成るプローブ98を
示す。プライマーエレメント100は、一本の鎖の領域96
の3′末端にハイブリッド形成のために設計されたオリ
ゴヌクレオチドプライマー104から成り、その5′末端
で、上記プライマーエレメント52に似ている選択された
長さのポリマー鎖106を有する。エレメント102は反対側
の鎖領域96の5′末端にハイブリッド形成するために設
計されたオリゴヌクレオチドプライマーであり、その
5′末端で蛍光レポーターを有する。
は、図12Aに示したように、反対側の標的ポリマーヌク
レオチド鎖の相補的領域に対してプローブ構成物中のプ
ライマーエレメントを容易にアニーリングするハイブリ
ッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと反応する。こ
の反応混合物を次に数回、そして代表的には約20-40
回、よく知られたポリメラーゼ鎖反応(PCR)方法(ム
リス、サイキ)に従って、プライマー伸長、変性、プラ
イマー/標的シーケンスアニーリングによって熱循環さ
せる。プローブプライマー100、102によって生じる1個
の増幅領域は図12Bにおいて100で示される。
つにレポーター標識を付けると、領域103のような2本
鎖増幅領域は1本の鎖上にあるポリマー鎖および他の鎖
上のレポーターを有する修飾した標識プローブを形成
し、ポリマー鎖は2重構造に特有の電荷/並進摩擦抵抗
比を与える。
うな挿入または架橋染料を添加して2本鎖形態で標識を
付けてもよい。異なるシーケンスの増幅プローブは、2
本鎖種の異なる電荷/並進摩擦抵抗比に基づいて、上述
のように電気泳動によって2本鎖形態で分別することが
できる。
1つはポリマー鎖とレポーター標識を含むことができ、
これによってプライマー開始ポリメラーゼ反応は修飾し
た標識1本鎖プローブを生成する。
されたシーケンスの存在に対してアッセイする際に有用
である。1例として、標的ポリヌクレオチドは多数の可
能な連結した遺伝子シーケンスをもつゲノムDNAであっ
てもよい。構成物中のプローブは関心のある連結シーケ
ンスのPCR増幅において有効なプライマー対である。シ
ーケンス増幅後に関心のあるシーケンスの存在または不
在を、標識プローブの電気泳動の移動位置から決定する
ことができる。
例えば縮重シーケンスが関心のある遺伝子シーケンスに
対して相補的であることをアッセイすることを望むこと
ができる。この応用では、プローブ構成物を使用して特
定のシーケンスを増幅する。各プライマーシーケンスは
特有のポリマー鎖をもつので、シーケンス末端領域に相
補的であるプライマーシーケンスは標識プローブの移動
性から決定することができる。上記の他の応用に加え
て、本方法は分別したプローブ混合物中に既知の大きさ
のポリマー鎖を用いて誘導された一連のオリゴヌクレオ
チド、およびテストプローブ上に有する標識を付けた異
なるレポーター基を含ませることを必要とし、電気泳動
による分離に対して移動速度基準を与える。
鎖形態におけるように、レポーター標識プローブを用い
て、増幅シーケンスに対してハイブリッド形成すること
によって標識を付ける。この応用は図13Aおよび13Bに示
され、一本の鎖の上にあるポリマー鎖114を有する増幅
標的シーケンス112を示す。アッセイの目的は任意の、
そしてどちらかの、プライマープローブによって生成し
た1またはそれ以上のフラグメントがプローブシーケン
スに対し相補的なシーケンスを含むかどうかを決定する
ことである。この例では、フラグメント112は塩基シー
ケンスが既知のシーケンスプローブ118のそれに対して
相補的である領域116を含む。
ブリッド形成条件下に1個またはそれ以上の標識プロー
ブとハイブリッド形成され、ポリマー鎖を含むフラグメ
ント116の鎖にプローブ118を結合し、従って、上記のよ
うに、電気泳動方法によって分別することができる修飾
した標識プローブを形成する。
32、134から成る二本鎖フラグメント130を修飾するため
の別の方法を示す。この示された具体例では、鎖132は
増幅中にフラグメントの1端でレポーター136を用いて
蛍光標識を付けた。フラグメント鎖は種々の方法、例え
ば標識dNTPの存在においてニックトランスレーションま
たはホモポリマーテイリングによって、またはレポータ
ー標識プライマーを用いるPCR増幅によってレポーター
標識を付けることができる。
の1本の鎖の異なるシーケンス領域にシーケンス特異的
に結合するために設計されたプローブ138、140、142を
含むプローブ構成物と混合する。代表としてプローブ13
8は、所望する領域に特異的な塩基シーケンスを有する
オリゴヌクレオチド144、および各異なるシーケンスプ
ローブに対して特有な電荷/摩擦抵抗の比を与えるポリ
マー鎖146を含む。
ってプローブ構成物中のプローブを用いて修飾され、プ
ローブ結合に対応する1またはそれ以上の二本鎖領域
と、フラグメント149のようなフラグメントを形成す
る。修飾フラグメントは1本鎖に標識を付け、反対側の
鎖プローブ中に1本またはそれ以上の選択された長さの
ポリマー鎖を用いて誘導される。次に修飾フラグメント
は電気泳動によって二本鎖形態に分別され、各フラグメ
ントを会合したポリマー鎖の数と大きさに従ってフラグ
メントを分別する。
132はプローブ138、142を結合し、このようにして全部
のi+k個のポリマー鎖単位を有するように修飾され
た。フラグメントは、電気泳動により、フラグメントに
会合したポリマー鎖単位の全数に依存する移動時間で移
動するので、各フラグメントに会合したプローブを同定
することができる。この方法は、例えばゲノムDNA内の
既知のシーケンス間の距離を調べるため、または連結し
たシーケンスを同定するために用いることができる。
第3の一般的方法は、図14Aと14Bに示される。この方法
では、図に120で示されるような一本鎖標的ポリヌクレ
オチドは、標的の選択された領域に塩基特異的に結合す
るために設計されているプローブ122のような、複数の
プローブを含むプローブ構成物と反応する。代表とし
て、プローブ122は図1Aのプローブ20に似ていて、フリ
ーの3′末端OH基を有するオリゴヌクレオチド、および
その5′末端に有する選択された長さのポリマー鎖を含
む。
たように、少なくとも1個のレポーター標識dNTPの存在
で,DNAポリメラーゼIを用いて処理される。染料標識dN
TPsは市販の原料から合成することができる。例えば、
アミノ7−dUTP(クロンテク、パロアルト、CA)は標準
のカップリング条件下にフルオレセインNHSエステル
(モレキュラープローブ、ユージン,OR)と反応するこ
とができ、フルオレセイン標識dUTPを形成する。ポリメ
ラーゼは全部で4個のヌクレオシドトリホスフェートの
存在で、128で示されるような1個またはそれ以上の標
識ヌクレオチドを混入し、標的結合プローブの3′末端
を伸長し、各プローブシーケンスの特性を示している各
異なるシヒケンスプローブと会合した特有のポリマー鎖
を有する所望の修飾した標識プローブを形成するのに効
果がある。あるいは、上記例においてプローブに混入し
た後、フルオレセインを修飾ヌクレオチド、例えばアミ
ノ−7−dUにカップリングすることができる。各々の異
なるシーケンス修飾標識プローブはその特有のポリマー
によって電荷/並進摩擦抵抗の明確な比をもつ。
うに電気泳動によって分別し、標的ヌクレオチドに含ま
れるシーケンスに対応する標識プローブの移動位置を同
定する。
はプローブ構成物は、標的ポリヌクレオチド188の領域1
86のような、一本鎖標的ポリヌクレオチドの領域にシー
ケンス特異的に結合するために設計された複数のシーケ
ンス特異的プローブ、例えばプローブ184を含む。代表
として、プローブ184は、第1の一本鎖DNA切片192、お
よび一本鎖RNA領域196を含む第2の切片194から成る結
合ポリマー190のプローブを含む。結合ポリマーの第1
の切片に取り付けられたポリマー鎖198は、上記のよう
に、結合ポリマーに、特有の電荷/並進摩擦抵抗比を与
える。レポーター200は結合ポリマーの第2の切片に取
り付けられる。特に、ポリマー鎖およびレポーターはRN
A領域の反対側にあり、この領域の選択的開裂はプロー
ブを第1の切片および取り付けられたポリマー鎖にレポ
ーターから分類するであろう。
イブリッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと反応
し、シーケンス特異的方法でプローブを相補的標的領域
に結合する。図18Aに見られるように、これは各結合プ
ローブにおいてRNA/DNA二本鎖の領域を生成する。反応
混合物は今は、RNase Hのような、二本鎖RNA/DNAを選択
的に切断することができる(Duck)ヌクレアーゼで処理
して、従って各プローブをそのRNA結合領域中で切断す
る。
って篩分けしていない媒体中で電気泳動によって遊離オ
リゴヌクレオチドとして移動する修飾した標識プローブ
を、各特異的に結合するプローブに対して変性し脱離す
る。代替の具体例では(図示していない)、ポリマー鎖
はプローブのレポーター側に取り付けることができ、従
ってRNAse処理は一部の結合ポリマーを放出し、残りの
プローブ(ポリマー鎖とレポーターを含む)の合わさっ
た電荷/合わさった並進摩擦抵抗を変えて、従って開裂
していないプローブについて、篩分けしていない媒体中
のプローブの電気泳動による移動度をシフトさせる。
体例では、プローブ修飾はアニーリングしたプローブか
ら(その5′末端を越えて)標的ポリヌクレオチド上流
までアニーリングしたプライマーを伸長する間に行われ
る。この伸長はまた5′ないし3′エキソヌクレアーゼ
活性(Holland)を組み込むDNAポリメラーゼによって生
成される。本方法は、関心のあるシーケンス領域224を
もつ標的ポリヌクレオチド222を示す図19に示される。
この方法でのプローブはポリマーの5′末端付近にサブ
ユニット229をもつ結合ポリマー228を含むプローブ226
によって例示される。この塩基にポリマー鎖230および
標識プローブ232(これはポリマー鎖のフリー末端に取
り付けることができる)が取り付けられている。また図
には、領域224の上流で、標的にシーケンス特異的に結
合するために設計されているプライマー234が示されて
いる。
よび1組のプライマー、例えばプライマー234は、ハイ
ブリッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと反応し、
会合したプローブおよび上流プライマーを標的の異なる
シーケンス領域に結合する。標的および取り付けたプロ
ーブは全4個のヌクレオシドトリホスフェートの存在で
上記ポリメラーゼで処理し、図19Bの複数のxによって
示すように、5′ないし3′方向においてプライマーを
重合する。ポリメラーゼが隣接するプローブの5′末端
に達すると、それはプローブを標的領域から置換し、ま
た5′末端サブユニットをプローブから開裂して取り去
る。図19Bに示すように、プローブからのサブユニット2
29の開裂は塩基229、レポーター232、および特有の電荷
/並進摩擦抵抗の比をプローブに与えるポリマー鎖230
から成る標識プローブ234を脱離する。
の種類の開裂法が実施されることは認識されるだろう;
ポリメラーゼ活性につながらないエキソヌクレアーゼ活
性を使用する(例えば、E.ColiポリメラーゼIからのN
末端選択的開裂フラグメントおよびバクテリオファージ
λのエキソヌクレアーゼ)、一定のDNAポリメラーゼの
3′→5′校正エキソヌクレアーゼ活性を使用する(こ
の場合ポリマー鎖198とレポーターFは好ましくはプロ
ーブの3′末端に取り付けられ、この3′末端は図17A
の鋳型ポリヌクレオチド188に不適正な1個またはそれ
以上のヌクレオチドを含む)、または制限エンドヌクレ
アーゼのような広範囲のシーケンス特異的エンドヌクレ
アーゼのいくつかを用いる。これらの場合のすべては、
好適な具体例は、開裂部位の同じ側にレポーターとポリ
マー鎖を配置し、それらが開裂に続いて共有結合するよ
うにする。追加のポリマー鎖は標識を付けていないプロ
ーブから標識を付けたプローブを最適に分離するため、
レポーターから開裂部位の反対側にプローブに付加する
かまたは付加しないことができる。
ていない液体媒体中で電気泳動により分離するDNA断片
(即ち、異なるシーケンスのオリゴヌクレオチド)によ
って実行される。本来のDNAは2つの線形ポリマー、ま
たはヌクレオチドの鎖から成る。各鎖はホスホジエステ
ル結合によって連結したヌクレオシドの鎖である。2本
の鎖は互いに、その2本の鎖:チミジン(T)と対のデ
オキアデノシン(A)およびデオキシシチジン(C)と
対のデオキシグアノシン(G)、のヌクレオチドの相補
的塩基間に水素結合によって逆平行の配向で保持されて
いる。
チがある:ジデオキシ鎖末端方法、例えばサンガーら、
Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.74p Pgs.5463-5467(197
7);および化学分解方法、例えばマキサムら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.,Vol.74,pgs.560-564(1977)。鎖末端方
法はいくつかの方法で改良され、現在得られる自動化DN
A配列決定機器全部に基礎として使われている、例えば
サンガーら、J.Mol.Biol.,Vol.143,pgs.161-178(198
0);シュライヤーら、J.Mol.Biol.,Vol.129,pgs.169-1
72(1979);ミルスら、Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.76,p
gs.2232-2235(1979);スミスら、Nucleic Acids Rese
arch,Vol.13,pgs.2399-2412(1985);スミスら、Natur
e,Vol.321,pgs.5674-679(1987);プロバーら、Scienc
e,Vol.238,pgs.336-341(1987)、セクションII、Meth.
Enzymol.,Vol.155,pgs.51-334(1987);チャーチら、S
cience,Vol240,pgs.185-188(1988);タボーら、Proc.
Natl.Acad.Sci.,Vol.84,pgs.4767-4771(1987);タボ
ーら、Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.86,pgs.4076-4080(19
89);インニスら、Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.85,pgs.9
436-9440(1988);およびコンネルら、Biotechniques,
Vol.5,pgs.342-348(1987)。
またはそれ以上の組、即ちDNA断片を重ね入れた組の生
成を必要とし、各々は共通の出所を有し、各々は既知の
塩基で終わっている。1組または複数の組の断片はシー
ケンス情報を与えるように大きさによって分離する必要
がある。両方の方法において、DNA断片は高分解ゲル電
気泳動によって分離される。一般に、DNA断片は放射性
ヌクレオシドトリホスフェート前駆体によってまたは蛍
光染料によって標識が付けられる。
(1)オリゴヌクレオチドプライマーおよび、サブシー
ケンスとして、シーケンスが決定される標的核酸を含む
鋳型核酸を用意し、(2)オリゴヌクレオチドプライマ
ーを鋳型核酸にハイブリッド形成し、(3)プライマー
を核酸ポリメラーゼ、例えば、T7 DNAポリメラーゼ、Se
quenase(登録商標)、逆転写酵素等を用いて、ヌクレ
オチドトリホスフェート前駆体と少なくとも1本の鎖終
止ヌクレオチドを含む反応混合物中で伸長し、より短い
全てのDNA断片がより長い全てのDNA断片のサブシーケン
スであり、同じ大きさの全てのDNA断片が同じ鎖終止ヌ
クレオチドで終わるように、DNA断片個体群の重ね入れ
た系列を形成し、(4)大きさによってDNA断片個体群
を分離し、そして(5)各DNA断片個体群と会合した鎖
終止ヌクレオチドを同定する。
を同定するための標識手段の性質、異なるDNA断片の個
体群を分離するための手段、鋳型核酸をハイブリッド形
成工程のために用意する方法等を含めて、当該分野で良
く知られている幾つかの要素に従って変わる。例えば、
DNA断片の個体群をプライマーに結合した蛍光染料によ
って同定する場合、各々は異なる蛍光標識を有する4個
の異なるプライマーを用意し、プライマーは4個の異な
る鎖終止ヌクレオチドに対応する4つの分離反応混合物
中に伸長する。または、DNA断片の個体群を、伸長工程
の間に放射活性で標識を付けたヌクレオチドトリホスフ
ェートを組み込むことによって同定する場合、伸長工程
は通常4個の分離反応混合物を含み、各々は異なる鎖終
止ヌクレオチドを含み、分離工程は通常大きさに従って
別々に各反応混合物のDNA断片個体群を分離することを
含む。一般に、本背景の第2のパラグラフに引用した参
考文献は、DNA配列決定の工程およびその重要な変更例
を開示する。従って、これらの参考文献が参照のために
組み入れられる。
チドに結合した蛍光染料によって同定する。従って、本
発明の方法では、プライマーはDNAポリメラーゼによっ
て、ATP、CTP、GTP、およびTTPの4つの1−チオトリホ
スフェート類似体、および各々が異なるメンバーの1組
のスペクトルにより解像できる蛍光染料で標識を付けた
4個の鎖終止ヌクレオチドを含む反応混合物中で例えば
フングら、米国特許4,855,255;プロバーら(上記)等に
よって開示されているように、伸長する。
for Model 370A DNAシーケンサー(アプライド・バイ
オシステムズ・インコーポレイテッド、フォスターシテ
ィ、CA)に従って用意される。例えば、標的シーケンス
を適当なクローニングベクターに、例えばM13クローニ
ングベクターの複製の形で挿入し、次に標的シーケンス
のコピー数を増幅するように増殖することができる。1
本鎖形態のM13は鋳型として使用するために単離する。
或いは、鋳型を当該分野で教示されているようなポリメ
ラーゼ鎖反応(PCR)によって用意することができる;
例えば、インニスら(上記);ウイルソンら、Biotechn
iques,Vol.8,pgs.184-189(1990);ギレンステン,Biot
echniques,Vol.7,pgs.700-708(1989)等。増幅後、鋳
型は重合化反応で液体相でまたは固体相支持体に結合し
て、例えばスターら、Nucleic Acids Research,Vol.16,
pgs.3025-3038(1988);ハルトマンら、Nucleic Acids
Research,Vol.17,pgs.4937-4946(1989)等によって教
示されているように、使用することができる。
器で合成することができ、または単独でまたはDNA増幅
および/または配列決定キットの成分として購入するこ
とができる、例えば、United Biochemical Corporation
(Clevelans,OH),Clontech(Palo Alto,CA)等。鋳型
にプライマーをハイブリッド形成する工程は引用した参
考文献に充分に開示されており、本発明の任意特定の具
体例に応用するための詳細なガイダンスを提供する。
はそれ以上のオリゴヌクレオチドから成る1またはそれ
以上のプライマーを含む。好ましくは、プライマーのオ
リゴヌクレオチドは長さで16と25個の間のヌクレオシド
である。好ましくは、本発明のキットはさらに、緩衝液
中に4個のヌクレオシドトリホスフェート前駆体から成
るヌクレオシドトリホスフェート前駆体ミックスを含
む。1の具体例では、ヌクレオシドトリホスフェート前
駆体ミックスはまた1またはそれ以上の鎖終止ヌクレオ
チドを含むことができる。また、鎖終止ヌクレオチドは
キットの分離成分であることができる。好ましくは、キ
ットはさらに核酸ポリメラーゼおよびポリメラーゼ反応
を行うための反応緩衝液を含む。核酸ポリメラーゼはDN
Aポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、および逆転写酵素等
を含む。好ましくは、キットDNAポリメラーゼ、例え
ば、ゲルファンド、米国特許4,889,818によって開示さ
れているようなタグポリメラーゼ;またはタボーら、米
国特許4,962,020;4,795,699;4,942,130;4,994,372;およ
び4,921,794によって開示されているようなシーケナー
ゼを含む。
ーミネーターミックスを成分として含む。染料ターミネ
ーターミックスは4個の鎖終止ヌクレオチドを含み、各
々は好ましくはスペクトルにより解像できる異なる蛍光
染料で標識を付けている。好ましくは、鎖終止ヌクレオ
チドはジデオキシヌクレオシドトリホスフェートであ
る。この具体例の一面では、各ジデオキシヌクレオシド
トリホスフェートは別々に、5−およひ6−カルボキシ
フルオレセイン、5−および6−カルボキシ−4,7−ジ
クロロフルオレセイン、2′,7′−ジメトキシ−5−お
よび6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、
2′,7′−ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ−5−およ
び6−カルボキシフルオレセイン、2′,7′−ジメトキ
シ−4′,5′−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−
4,7−ジクロロフルオレセイン、1′,2′,7′,8′−ジ
ベンゾ−5−および6−カルボキシ−4,7−ジクロロフ
ルオレセイン、1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−4′,5′
−ジクロロ−5−および6−カルボキシ−4,7−ジクロ
ロフルオレセイン、2′,7′−ジクロロ−5−および6
−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、および
2′,4′,5′,7′−テトラクロロ−5−および6−カル
ボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインから成る組から
選択された染料で標識を付ける。上記染料は参考文献と
して組み入れられる次の参考文献に開示されている:ホ
ップ ジュニア、米国特許4,997,928;フングら、米国特
許4,855,255;およびメンチェンら、PCT出願US90/0660
8。あるいは、本発明のジデオキシヌクレオチドはベル
ゴットら、PCT出願US90/05565によって教示されている
ようにスペクトルにより解像できるローダミン染料で標
識を付けることができる。
を含み、各々は異なるスペクトルにより解像できる蛍光
染料で、例えば、フングら(上記)によって教示されて
いるように、標識を付ける。
た標的ポリヌクレオチドからのプローブ捕獲と脱離を含
む。図20Aは複数のプローブ、例えばプローブ24-246
を、Ri、Rj、およびRnのような、関係のある異なる
シーケンス領域を含む標的ポリヌクレオチド248への付
加を示す。代表として、プローブ240は、結合ポリマー2
50、このプローブに特有の電荷/並進摩擦抵抗の比を与
えるポリマー鎖252、およびポリマー鎖に取り付けられ
たレポーター254を含む。図に示した具体例では、各異
なるシーケンスのプローブは特有の電荷/並進摩擦抵抗
の比を達成するため異なる長さのポリマー鎖をもつ。
に標的ポリヌクレオチドと反応する。図20Aに示した方
法では、プローブ240、242、および246の各々はそれぞ
れ、標的ポリヌクレオチドの領域Ri、Rj、およびRn
の相補的シーケンスとハイブリッド形成する。この例で
は、標的ポリヌクレオチドはプローブ244に相補的な領
域を含まず、このプローブは結合していないと仮定す
る。
ポリヌクレオチドを固定するように処理される。これは
本実施例では、標的ポリヌクレオチドの領域R1に相補
的であるオリゴヌクレオチドプローブ262を用いて誘導
された固体支持体260を付加し、このようにして図20Bに
示したように、固体支持体に標的を結合することによっ
て行われる。支持体および取り付けた標的とプローブは
洗浄して、非特異的に結合したプローブ、例えばプロー
ブ244を除去する。
性して、結合したプローブ、例えばプローブ240、242、
および246を脱離し、これらのプローブを次に、篩分け
していない媒体中で電気泳動によって分別し、この分別
した標識プローブの特有の電気泳動位置に基づいて、標
的シーケンスを同定する。
のように合致しているか高く評価されるだろう。本方法
は複数の標的シーケンスを単一のアッセイフォーマット
でアッセイすることができ、シーケンス特異的標識プロ
ーブと会合した異なる長さのポリマー鎖の移動距離(移
動割合)に従ってシーケンスを迅速に同定する。
結合分子を、篩分けマトリックスを必要としない簡単な
電気泳動方法で、分離することができる。特に、このCE
分別方法は、すべてが似ているかまたは同じ大きさの複
数のオリゴヌクレオチドを有効に分別することができ
る。この特徴の1つの利点は本方法で用いられる複数の
プローブ中がすべて似ているかまたは同じ大きさをもつ
ことができ、従って殆ど同じハイブリッド形成動力学お
よび熱力学(Tm)で標的シーケンスを用いてハイブリ
ッド形成できることである。
成することができる。一つの方法では、選択された数の
ユニットのポリマー鎖を直接オリゴヌクレオチド上で、
従来の固相合成方法によって形成することができる。
の例を記載するものである。これらの実施例は例示であ
るが、本発明の範囲を制限するものではない。
チルクロリド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチ
ルアミン、酢酸、ピリジン、メタンスルホニルクロリ
ド、水素化ナトリウム、2−シアノエチル−N,N,N′,
N′−テトライソプロピルホスホロジアミダイトは、ア
ルドリッチ、ミルウォーキィ、WIから入手した。ジイソ
プロピルアミンテトラゾール塩、FAM-NHS/DMSO、JOE-NH
S/DMSOおよびTAMRA-NHS/DMSOは、アプライド・バイオシ
ステムズ(ABI)、フォスターシティ、CAから入手し
た。LAN(リンカーアームヌクレオチド)5′−ジメト
キシル−トリチル−5−(N−(7−トリフルオロアセ
チルアミノヘプチル)−3−アクリルアミド)−2′−
デオキシウリジン−3′−ホスホルアミダイトはモレキ
ュラーバイオシステムズ インコーポレイテッド、サン
ジエゴ、CAから入手した。
ファーマシア、ウップサラ、スウェーデンから入手し
た。誘導オリゴヌクレオチドは1.5ml/分の流速と0.1Mト
リエチルアンモニウムアセテート/水pH7.0およびアセ
トニトリルのグランジエントを使用してABI RP-300(C
8)カラム(4.6×220mm)を用いてLC精製した。DNA合成
器:380B、ANI、フォスターシティ、CA. 実施例1 (HEO)N鎖の合成 この実施例に記載する反応は図2に示され、クロード
およびシェパルツのものと似ている。
ド(HEO) 27.0g(95.6ミリモル)のHEOを100mlのピリミジンに
溶解した。この溶液に室温で10時間かけて、27.0グラム
(79.7ミリモル)のジメトキシトリチルクロリドの150m
lピリミジン溶液を添加した。反応物を、室温で終夜撹
拌した(15時間)。溶媒を減圧除去し残渣を150mlのEtO
Acと100mlのH2O、2×100mlの塩水に入れ、有機相をN
a2SO4で乾燥させた。溶媒を除去して暗燈色の油(38.36
g)を与えた。粗物質を200gのキーゼルゲル60を用いて
2%のメタノール−塩化メチレンで溶出するシリカゲル
クロマトグラフィによって精製した(シリカゲルはトリ
エチルアミンで塩基性化した)。適当な画分を一緒にし
て29.52g(50.49ミリモル)の化合物1を与えた。DMT保
護HEO(図2の化合物1)の分析を示す:1 HNMR(300MHzCDCl3)δ7.5−6.8(m、13H芳香族)、 3.75(S、6H、OCH3)、3.6(20H、m、OCH2−CH
2O)、 3.5(2H、m、CH2‐OH)、3.2(2H、t、CH2ODMT)。
および0.029g(0.17ミリモル)のテトラゾールジイソプ
ロピルアンモニウム塩を不活性雰囲気下に10mlの塩化メ
チレンに溶解させた。これに0.59グラムの2−シアノエ
チルテトライソプロピルホスホルアミダイトを添加し、
混合物を終夜室温で撹拌した。反応混合物をNaHCO3の飽
和溶液、塩水で洗浄しNa2SO4で乾燥させた。溶媒を除去
して1.58gの粗精油を与え、生成物をフラッシュクロマ
トグラフィによってシリカゲルに通して50%EtOAc−ヘ
キサンで溶出して精製した(シリカゲルはトリエチルア
ミンで塩基性化した)。0.8g(1.3ミリモル)の精製ホ
スホルアミダイト(図2の化合物2)を回収した。
Oを10.4g(17.8ミリモル)溶解した。溶液を氷冷し、4.
59g(35.6ミリモル)のジイソプロピルエチルアミンを
添加し、次に2.06g(26.7ミリモル)の塩化メタンスル
ホニルを添加した。反応混合物を30分間撹拌し次にNaHC
O3の飽和溶液、塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。溶
媒を減圧除去し11.93gのメシレート(図2の化合物3)
を与えた。
新たに蒸留したテトラヒドロフランの懸濁液に10℃で1
分間かけて10.14g(36.0ミリモル)のヘキサエチレング
リコールを添加し、混合物を室温で30分間撹拌した。こ
れに、上記実施例1Cからの11.93g(17.9ミリモル)のHE
Oメシレートの50mlテトラヒドロフラン溶液を添加し
た。反応混合物を40-50℃まで3時間暖めて、その後に
溶媒を減圧除去して、残渣を150mlの塩化メチレンに入
れた。これを3×100mlのH2O、塩水で洗浄し、Na2SO4
で乾燥させた。溶媒を減圧除去して粗精油(13.37g)を
与えた。これを上記実施例1Aと同様にシリカゲルクロマ
トグラフィによって精製した。10.0gのDMT保護HEO二量
体(11.8ミリモル)を回収した。物質の分析(図2の化
合物4)を示す:1 HNMR(300MHzCDCl3)δ7.5−6.8(m、13H芳香族)、 3.75(S、6H、OCH3)、3.6(20H、m、OCH2−CH
2O)、 3.5(2H、m、CH2−OH)、3.2(2H、t、CH2ODMT)。
合物5) 実施例1Dからの1g(1.17ミリモル)のDMT保護HEO二量
体および20mg(0.12ミリモル)のテトラゾールジイソプ
ロピルアンモニウム塩を不活性雰囲気下、10mlの塩化メ
チレンに溶解した。これに室温で0.409g(1.35ミリモ
ル)の2−シアノエチルテトライソプロピルホスホルジ
アミダイドを添加した。15時間後、反応物を飽和NaHC
O3、塩水で洗浄しNa2SO4で乾燥させた。溶媒を減圧除去
し粗油(1.44g)を得た、これを実施例1Bのようにフラ
ッシュクロマトグラフィで精製した。0.76g(0.73ミリ
モル)の精製した生成物を回収した。精製した物質(図
2の化合物5)の分析を示す:31 P−NMR(CD3CN、H分断):δ151(S)。
合成 この実施例に記載した反応を図3に示す。
4−ジイソシアネート(TDC)(17.0ml)に30-35℃でア
ルゴン下に適下した。氷浴を使用して発熱反応をコント
ロールした。室温で終夜反応させ;熱いヘキサン(10
×)で洗浄し過剰のジイソシアネートを除去し;そして
減圧化に濃縮して粗ビスイソシアネート生成物(化合物
6、図3)を琥珀色の油(30g)として生成した。
ングリコール(7.0ml)のジクロロメタン(25ml)溶液
を室温で1時間撹拌し次にジブチルチンジラウレート
(0.1ml、アルドリッチ)を添加し、室温で22時間撹拌
し;ジクロロメタンで希釈し水(4×20ml)で洗浄し;
乾燥(MgSO4)させ;そして減圧下に濃縮して粗ジオー
ル生成物(化合物7、図3)を琥珀色の油(4.6g)とし
て得た。
2時間かけてアルゴン下に室温で、上記粗ジオール(4.
4g)とトリエチルアミン(0.6ml、アルドリッチ)のジ
クロロメタン(25ml)撹拌溶液に添加した。反応溶液を
室温で2時間撹拌し水で洗浄し;乾燥させ(MgSO4);
そして減圧下に濃縮して粗DMTアルコール生成物を琥珀
色の油(5.1g)として得た。粗DMTアルコールのカラム
クロマトグラフィ(トリエチルアミン中和シリカ、5%
メタノール/ジクロロメタン)は精製したDMTアルコー
ル(化合物8、図3)を粘性琥珀色の油(0.72g)とし
て与えた。化合物の分析を示す:1 H NMR/CDCl3:δ6.7−7.5(m、ArH、19H)、 δ4.3(m、NC(O)OCH2、8H)、δ3.77(s、CH3O、
6H)、 δ3.55−3.75(m、CH2OCH2、62H)、δ3.2(t、DMTOC
H2、2H)、 δ2.15(m、CH3Ar、6H)。
スホロジアミダイト(0.20ml)をアルゴン下、室温で、
上記精製したDMTアルコールとテトラゾールジイソプロ
ピルアミン塩(12mg)の乾燥ジクロロメタン(5ml)撹
拌溶液に添加した。室温で4時間撹拌した後、NaHCO3溶
液を添加し40分間撹拌した。ジクロロメタン層をさらに
ジクロロメタンで希釈し、塩水で洗浄し;乾燥させ(Mg
SO4);そして減圧下に濃縮して粗ホスホルアミダイト
生成物(化合物9、図3)を琥珀色の油(0.88g)とし
て得た。31 P NMR(CDCl3):151ppm。
図4Aと4Bに示す。
CTATGATGAATATAカルボキシフルオレセイン−3′をもつ
48塩基オリゴヌクレオチド(図4Aの構成物10)を3′連
結カルボキシフルオレセインポリスチレン支持体(アプ
ライドバイオシステムズ インコーポレイテッド)を用
いて調製し、または3′アミン−OH(オリゴヌクレオチ
ド)CPG(クロンテク、パロアルト,CA)および発表され
た方法(アプライド バイオシステムズ、カルサーズ、
コンネル)によるFAM-NHS(ABI)、およびアプライドバ
イオシステムズ380B DNA合成器で標準のホスホルアミダ
イト化学を用いて調製することができる。
(0.1μモルオリゴヌクレオチド)をトリクロロ酢酸と
反応させて脱保護し、洗浄し、標準DNA合成サイクルを
用いて、次に実施例1のようなホスホルアミダイト−PE
Oポリマーの1つと反応させた。図4Aに示した具体例は1
2個のエチレンオキシドサブユニットをもつポリマー鎖
を用いている。誘導化オリゴヌクレオチド(図4Aの化合
物11)はトリチルでカラムから引き離され、集められた
生成物(図4の化合物12)は、ABI RP-300(C−8)4.
6×220mmカラムおよび0.1Mトリエチルアンモニウムアセ
テート−水およびアセトニトリル溶媒系を用いて、液体
クロマトグラフィによって精製された。誘導化したオリ
ゴヌクレオチドは図4Aで化合物12として示される。
リゴヌクレオチド 上記の実施例3Aからの支持体結合オリゴヌクレオチド
(0.1μモルオリゴヌクレオチド)(化合物10、図4B)
を、標準のDNA合成サイクルを用いる実施例2のように
調製されたホスホルアミダイト−PEOビスウレタントリ
ル結合ポリマーと反応させた。(図4Bでサブユニット構
造DMT-HEO-Tol-HEO-Tol-HEOによって示されるトリル連
結ポリマーは図3の化合物9に相当する)。誘導化オリ
ゴヌクレオチド(図4Bの化合物13)をカラムから引き離
し、トリチルで脱保護し、ABI RP-300(C−8)4.6×2
20mmカラムおよび0.1Mトリエチルアンモニウムアセテー
ト−水およびアセトニトリル溶媒系を用いて、液体クロ
マトグラフィで精製した。集められた生成物は酢酸で脱
保護した。誘導化オリゴヌクレオチドは図4Bで化合物14
として示される。
N-T3′をもつ26塩基オリゴヌクレオチドを、標準ホスホ
ルアミダイト化学(図5の構成物15)を用いるABIモデ
ル380B DNA合成器で作成した。LANはTFA保護アミンを用
いて塩基修飾したデオキシウルジンホスホルアミダイト
(モレキュラー バイオシステムズ インコーポレイテ
ッド)である。この26量体は1μモルカラムから合成後
トリチルオンマニュアルプロトコルを用いて作成され
る。このカラム物質は10個の分離した0.1μモルカラム
に分けられた。
し、1.5ml/分の流速および0.1Mトリエチルアンモニウム
アセテート−水pH7.0とアセトニトリルの溶媒グラジエ
ントを用いるABI RP-300(C−8)カラム(4.6×220m
m)を用いて最初HPLCによって精製し、次いで以下に述
べる特定修飾の後、トリチル基を除去し、生成物を上記
条件を用いるHPLCによって単離した。
DMSO溶液(ABI)および40μlの1M NaHCO3/Na2CO3pH9.0
と共にアミン標識26量体の溶液を添加してFAMを用いて
標識を付けた。2時間後、反応混合物はファーマシアPD
-10セファデックス(登録商標)G25Mカラム(ファーマ
シア)を通過させ、集められた試料は次にHPLCで生成し
た。溶媒を除去した後、試料を80%酢酸−水で脱トリチ
ル化した。次に溶媒は減圧で除去し、残渣は0.5mlのH2
Oに入れて液体クロマトグラフィによって精製した。
トは実施例4Aからのオリゴの5′末端に、固体支持体の
標準ホスホルアミダイト化学によって添加され、図5の
構成物16を生成した。4ユニットに対し1ユニットを分
離反応に添加した。得られたHEO修飾オリゴを上記のよ
うに固体支持体から切り離し(化合物17、図5)FAMで
標識を付け、上述したように精製した(化合物18、図
5)。
3′をもつ25塩基オリゴヌクレオチドを実施例4Aに記載
したように作成した。DMT保護ホスホルアミダイトHEOユ
ニットをこの25量体の5′末端に添加し、実施例4Bに記
載したように精製した。
てCPG固体支持体に合成した。CPG支持オリゴヌクレオチ
ドの5′水酸基に標準のホスホルアミダイト化学を用い
るN−MMT−C6アミノモディファイヤーを添加した。こ
れはクロンテック ラボラトリイズ、パロアルト、CAか
ら市販されているモノメトキシトリチル保護アミノ結合
ホスホルアミダイトである。このモノメトキシトリチル
基はDNA合成器の標準トリチル開裂プロトコルを用いて
除去し、次いでDNA合成カラムを、FMOC化学を行うこと
ができるABIペプチド合成器に置いた。標準FMOCペプチ
ド合成プロトコルを用いて、4単位と8単位のアミノ酸
ペプチドをCPG支持オリゴヌクレオチドの5′末端アミ
ンに共役させた。合成完了後、ペプチドの末端アミンを
標準ペプチドキャッピングプロトコルを用いてアセチル
化した。
リゴヌクレオチドを支持体から開裂除去し上記のような
条件を用いるHPLCによって精製し、ペプチド−オリゴヌ
クレオチドAc−(PHe-Ala)2または4−NH(CH2)6−ホ
スフェート5′GGC ACC ATT AAA GAA-AAT ATC ATC T−
3′を生成した。ペプチド−オリゴヌクレオチドをオリ
ゴヌクレオチド標的の存在で実施例7Aに記載したように
蛍光標識オリゴヌクレオチドに結合させた。CE分析は図
9に示した。
器を含むCEブレッドボードを用いて行った。この装置は
高圧電力供給器、手動真空ポンプ、および検出光に530n
mRDFフィルターを備えたPMT検出器を含む。レーザーは4
0mWのArイオンレーザーであった。装置に使用したキャ
ピラリーチューブは長さ55cmで50μm i.d.および350μ
mの溶融シリカキャピラリーチューブであった。
素を含む75mMトリス−ホスフェート、pH7.6で充填し
た。
フェート連結HEOユニットで誘導化した26量体のオリゴ
ヌクレオチドを含有するDNA混合物を、89mMトリス−ボ
レート緩衝液、pH7.6で、約10-8Mの最後DNA濃度まで希
釈した。約2ナノリットルのDNA溶液を、動電注入によ
ってチューブのカソード末端に引き入れた。
にセットして実験した。蛍光検出は530nmであった。検
出器の出力信号はHPモデル3396A積分器/プロッターで
積分しプロットした。
字は電気泳動時間を分で示す。全実験時間は約22分であ
る。一番早い走行ピークは20.397分の走行時間であり、
誘導化していないオリゴヌクレオチドに相当する。1、
2、および4HEOグループのオリゴヌクレオチドはそれぞ
れ、20.612、20.994、および21.558の移動ピーク時間で
ある。
−3′をもつ第一のプローブはテトラペプチドPhe-Ala-
Phe-Ala、または実施例5に示した方法に従ってオクタ
ペプチドPhe-Ala-Phe-Ala-Phe-Ala-Phe-Alaのいずれか
で誘導化した。シーケンス5′P−TTG GTC TTT CCT AT
G ATG AAT ATA G JOE 3′をもつ第二のプローブは標準
方法によって調製した。
塩基オリゴヌクレオチドに対して標的にする。標的への
プローブハイブリッド形成およびハイブリッド形成した
プローブの連結反応は次のように実質的に行われた: ペプチド誘導化オリゴヌクレオチド(50nM、20μ
l)、および蛍光標識オリゴヌクレオチド(50nM、20μ
l)を標識オリゴヌクレオチド(50nM、20μl);鮭精
子DNA(4ug/10μl、20μl);10×反応緩衝液(200mM
トリス・HCl pH7.1;1M KCl;100mM MgCl2;100mMジチオト
レイトール;10mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド)(20μl);リガーゼ(30ユニット、100ユニット
/μl、エピセントレ テクノロジイズ アンプリガー
ゼ、マジソン、WI)および100μlの蒸留水と混合し
た。調製した試料は50ulの油を塗りパーキンエルマーセ
ッスDNAサーマルサイクラー(ノーウォーク、CT)中で9
4℃にて3分間加熱し、次に62℃にて60分間加熱した。
泳動分離 上記からの脱離し連結したおよび連結していないプロ
ーブをエタノール沈澱し、篩分けしていないマトリック
ス中でCE電気泳動によって分析した。キャピラリーチュ
ーブはDB−5−被覆キャピラリー(J & W Scientific,
Folsom,CA)、55mm長さ、検出器に40mmであった。この
キャピラリーを電気泳動の前に0.5%界面活性剤溶液で
被覆し、キャピラリー壁をさらに親水性にした。種々の
界面活性剤、例えばBRIJ(登録商標)およびTWEEN(登
録商標)jeffamineクラスの界面活性剤が、このために
入手できる。
れた。緩衝液媒体および電気泳動媒体は75mMトリス−ホ
スフェート緩衝液、pH8.0、8M尿素、10%(v/v)メタノ
ールであった。電気泳動走行条件は、実施例6に記載し
たように行った。電気泳動図の結果は上記の図9に示
す。
12量体)のエチレンオキシドであること以外は、実施例
4に記載した合成方法に従って、2または4ユニットの
DEO(ドデシルエチレンオキシド)ポリマー鎖を用い
て、5′末端に5′GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC
T−3′を誘導した。
3′−JOEは実施例7のように調製した。
3′−OHは公表された方法(アプライド バイオシスレ
ムズ)に従って調製した;そして (4) 5′−P−GAT GAT ATT TTC TTT AAT GGT GCC
−3′TAMRAは:公表された方法(アプライド バイオ
システムズ、カルサース、コンネル)を用いる3′−ア
ミン−ON CPG、5′−ホスフェート−ONおよびTAMRA-NH
S(ABI)で調製した。
伝子のF508領域の1本鎖の部分をスパンするように設計
する。プローブ3と4は、遺伝子の反対側の鎖のF508領
域の同じ部分をスパンするように設計する。リガーゼ鎖
反応は公表された方法(ウィン−ディーン)に従って行
われた。簡単に述べると、LCRアッセイは、1リットル
につき100mmolのK+、10mmolのMg2+、10mmolのジチオト
レイトール、1mlのトリトンX−100、および1mmolのNAD
+を含む20mmol/1のトリス・HCl緩衝液中、pH7.6で行わ
れた。各100μl反応混合物は4個のオリゴヌクレオチ
ドおよび15Uの熱安定リガーゼ(エピセントル テクノ
ロジーズ、マジソン、WI)の各々を1pmol含んでいた。
ヒトゲノムの複雑さを模倣するため、4μgの鰊精子DN
Aを各反応混合物に添加した。反応はThin Walled Gene-
Amp(登録商標、パーキン−エルマー セチュス、ノル
ウォーク、CT)反応管で100μlの無機油でオーバーレ
イした100μlの部分標本で行った。全LCR反応はパーキ
ン−エルマー セチュス モデル9600熱循環器中で30サ
イクルの94℃(10秒)および60℃(2分)で行った。循
環プロトコルの終わりに、反応物を4℃まで冷却した。
ス中でCE電気泳動によって分析した。キャピラリーチュ
ーブは、実施例7のように被覆キャピラリーであった。
10μlの試料を95℃まで2分間加熱し、チューブに入れ
た。緩衝液媒体および電気泳動媒体は75mMトリス−ホス
フェート緩衝液、pH8.0、8M尿素、10%(v/v)メタノー
ルであった。電気泳動走行条件は、実施例7に記載した
ように行った。電気泳動図の結果は上記の図11に示す。
終止アプローチにおいて配列決定プライマーとして結合
するポリマー/ポリマー鎖共役体を用意して行った。好
ましくは、同じポリマー鎖を各結合ポリマーに結合させ
て配列決定用のプライマーを形成する。DNAの鋳型鎖に
アニーリングした後、プライマーはヌクレオシドホスフ
ェート前駆体および鎖終止ヌクレオチドの存在でポリメ
ラーゼで伸長し、プライマーが標識を付けているかまた
は鎖ターミネーターが標識を付けているかどうかによっ
て、1またはそれ以上の組の異なる大きさのDNA断片を
形成する。DNA断片は各々共通の起源を有し、結合ポリ
マーは、既知の塩基で終り、同じポリマー鎖に同様に共
役させる。組の各々のDNA断片は次いで篩分けしていな
い液体媒体中で大きさによって電気泳動により分離す
る。
を配列決定鋳型として用いる。
TGC−3′ 11量体ヘキサエチレンオキシドポリマー鎖をもつ次のプ
ライマーを実施例1−4に記載したように合成する: 5′−(HEO)11-GCACCATTAAAGAAAATATCAT−3′ 次のことを除いては、染料標識鎖終止ヌクレオチドを
用いる配列決定反応用の製造業者のプロトコルを用い
て、アプライド バイオシステムズ モデル 373自動
化DNAシーケンサーで配列決定を行った。実施例7のキ
ャピラリー分離装置は4色蛍光測定には形成されていな
いので、分離した4回の反応を行った:4つの鎖終止ヌク
レオチドの各々について1回。製造業者のプロトコルに
従って鋳型から伸長生成物を融解した後、4つの配列決
定反応の伸長生成物を別々に実施例7に記載したように
キャピラリー電気泳動によって分離する。期待されたよ
うに、2本のピークがジデオキシシチジン伸長生成物で
観察され、7本のピークがジデオキシアデノシン伸長生
成物で観察され、10本のピークがジデオキシチミジン伸
長生成物で観察され、そして6本のピークがジデオキシ
グアノシン伸長生成物で観察される。
載したが、種々の変更および改変を本発明から逸脱する
ことなく行うことができることは高く評価されるだろ
う。
Claims (18)
- 【請求項1】1またはそれ以上の異なるシーケンスのポ
リヌクレオチドを形成し、各異なるシーケンスのポリヌ
クレオチドは(i)検出できるレポーター標識および
(ii)各異なるシーケンスのポリヌクレオチドに電荷/
並進摩擦抵抗の特有の比を分与する結合ポリマー鎖を含
み、 前記ポリヌクレオチドを、篩分けしていないマトリック
ス中でキャピラリー電気泳動によって分別し、そして 分別したポリヌクレオチドを検出する 工程から成る、篩分けしていない媒体中で電気泳動によ
り異なるシーケンスのポリヌクレオチドを識別する方
法。 - 【請求項2】ポリマー鎖が実質的に同じ長さであり、前
記異なるシーケンスのポリヌクレオチドが異なる長さで
ある、請求項1の方法。 - 【請求項3】DNAをジデオキシ鎖終結によって配列決定
するため、前記ポリヌクレオチドを前記ポリマー鎖が共
有結合している5′−プライマーを用いて形成する、請
求項2の方法。 - 【請求項4】各異なるシーケンスのポリヌクレオチドの
3′−末端ヌクレオチドを識別するために有効なスペク
トルにより解像できる染料で共役的に標識を付けるジデ
オキシヌクレオチドで3′−末端にて、前記異なるシー
ケンスのポリヌクレオチドが終結する、請求項3の方
法。 - 【請求項5】試料中の1またはそれ以上の標的シーケン
スを検出するために、前記形成する工程が、 1またはそれ以上の異なるシーケンスプローブを用意
し、 各異なるシーケンスプローブが(i)検出できるレポー
ター標識および(ii)各異なるシーケンスのポリヌクレ
オチドに電荷/並進摩擦抵抗の特有の比を分与する結合
ポリマー鎖を含み、 前記プローブと標的ポリヌクレオチドとを、標的ポリヌ
クレオチドとシーケンス相補的プローブとがハイブリッ
ド形成するために有効な条件下に反応させ、そこでは標
的ポリヌクレオチドは前記反応の前または後に固体支持
体上に固定化されており、 固定化した標的ポリヌクレオチドを洗浄してシーケンス
特異的方法で標的ポリヌクレオチドに結合していないプ
ローブを除去し、そして 標的ポリヌクレオチドを変性して標的ポリヌクレオチド
にハイブリッド形成した異なるシーケンスのプローブを
脱離し、電気泳動による分離のための異なるシーケンス
のポリヌクレオチドを形成する 各工程から成る、請求項1の方法。 - 【請求項6】前記異なるシーケンスのプローブが実質的
に同じ長さである、請求項5の方法。 - 【請求項7】試料中の1またはそれ以上の標的シーケン
スを検出するために、前記形成する工程が、(i)標的
ポリヌクレオチドに1またはそれ以上のシーケンス特異
的プローブを付加し、各プローブが、標的シーケンス中
の隣接領域に結合するために有効である第1と第2のプ
ローブオリゴヌクレオチドを有し、そして前記第1と第
2のプローブオリゴヌクレオチドは前記ポリマー鎖で誘
導化され、(ii)プローブを標的ポリヌクレオチドと、
各プローブ中で前記第1と第2のプローブオリゴヌクレ
オチドをそれらの特異的標的シーケンスに結合するため
に有効な条件下に反応させ、(iii)標的ポリヌクレオ
チドに結合した前記オリゴヌクレオチドを、それらの末
端サブユニットが隣接する標的塩基と塩基対になってい
るとき標的結合オリゴヌクレオチドの末端サブユニット
を連結するために有効な条件下に連結させ、連結したプ
ローブを形成し、そして(iv)連結したプローブを標的
ポリヌクレオチドから脱離して前記異なるシーケンスの
ポリヌクレオチドを形成する工程を含む、請求項1の方
法。 - 【請求項8】前記ポリマー鎖が前記第1のプローブオリ
ゴヌクレオチドに共役結合しており、そして各前記第2
のプローブオリゴヌクレオチドがレポーター標識を付け
ている、請求項7の方法。 - 【請求項9】前記脱離前に、前記連結したプローブをプ
ローブ結合および連結反応の繰り返しのサイクルによっ
て増幅する、請求項7の方法。 - 【請求項10】各プローブ中の第2のプローブオリゴヌ
クレオチドが、(i)会合した標的シーケンスの同じ位
置において代替シーケンスに相補的であり、そして(i
i)異なる検出できるレポーターで誘導化される2つの
代替シーケンスオリゴヌクレオチドを含み、そして前記
検出工程が(a)プローブと会合した標的シーケンスを
同定する各プローブのサイン電気泳動移動度、および
(b)標的シーケンスの突然変異状態を同定するサイン
レポーター部分に従って、各前記標的シーケンスの突然
変異状態を決定することを含む、請求項7の方法。 - 【請求項11】試料中の1またはそれ以上の標的シーケ
ンスを検出するために、前記形成する工程が、(i)標
的ポリヌクレオチドに1またはそれ以上のシーケンス特
異的プローブを付加し、各プローブは、それぞれ、標的
ポリヌクレオチド断片の相補的鎖の向い合った末端領域
でハイブリッド形成するために有効な第1と第2のシー
ケンス特異的プライマーオリゴヌクレオチドを有し、そ
こでは各プローブ中の第1のプライマーオリゴヌクレオ
チドがプローブ特異的ポリマー鎖で誘導化され、(ii)
プローブを標的ポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオ
チドの相補的鎖の向い合った末端領域に両方のプライマ
ーオリゴヌクレオチドを結合するために有効な条件下に
反応させ、そして(iii)プライマー開始ポリメラーゼ
鎖反応によって標的断片を増幅し、異なるシーケンスの
ポリヌクレオチドを形成する工程を含む、請求項1の方
法。 - 【請求項12】各前記第2のプライマーオリゴヌクレオ
チドがレポーター標識を付け、そして前記異なるシーケ
ンスのポリヌクレオチドが2本鎖である、請求項11の方
法。 - 【請求項13】前記形成する工程が、(i)標的ポリヌ
クレオチドに1またはそれ以上のシーケンス特異的プロ
ーブを付加し、各プローブは、第1の1本鎖DNA断片お
よび1本鎖RNAを含む第2の断片を含み、ポリマー鎖は
前記第1の断片に結合し、そして検出できるレポーター
標識は前記第2の断片に結合しており、(ii)プローブ
を標的ポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド中の
それらの特異的標的シーケンスに前記第1と第2の断片
を結合するために有効な条件下に反応させ、(iii)ハ
イブリッド形成したプローブをRNA/DNA基体に対して特
異的なRNase酵素と反応させて、ポリマー鎖を欠いてい
る修飾した標識プローブを形成し、そして(iv)修飾し
ていないまたは修飾した両方の標識プローブを、標的ポ
リヌクレオチドから脱離して前記異なるシーケンスのポ
リヌクレオチドを形成する工程を含む、請求項1の方
法。 - 【請求項14】複数のシーケンス特異的プローブを含
み、各々は(a)選択された結合条件下に、標的シーケ
ンスの1つにポリマーを塩基特異的に結合するために設
計されたサブユニットのプローブ特異的シーケンスをも
つ結合ポリマー、および(b)結合ポリマーに結合し、
結合ポリマーの電荷/並進摩擦抵抗の比とは異なる比を
もつポリマー鎖によって特徴づけられて成る、 標的ポリヌクレオチドにおける複数の異なるシーケンス
の1またはそれ以上を検出する際に使用するためのプロ
ーブ構成物。 - 【請求項15】前記ポリマー鎖は、ポリエチレンオキシ
ド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリペプチド、オリ
ゴ糖、およびポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホン
アミド、ポリスルホキシド、およびそれらのブロックコ
ポリマー、荷電または非荷電連結基によって連結された
多数のサブユニットのユニットから成るポリマーを含
む、から成る群から選ばれる、請求項14の方法。 - 【請求項16】各シーケンス特異的プローブがさらにレ
ポーターを有する第2の結合ポリマーを含み、シーケン
ス特異的プローブ中の上記第1および第2の結合ポリマ
ーは、選ばれた標的シーケンスの隣接し接触する領域に
塩基特異的方法で結合するために有効であり、シーケン
ス特異的方法で標的シーケンスに結合したとき2つの結
合ポリマーを連結させ、そして第1の結合ポリマーに結
合したポリマー鎖が各連結したプローブ対に、電荷/並
進摩擦抵抗の合わさった特有の比を与える、請求項14記
載の構成物。 - 【請求項17】各シーケンス特異的プローブがさらに第
2の結合ポリマーを含み、シーケンス特異的プローブ中
の上記第1および第2の結合ポリマーは、選ばれた2本
鎖の標的シーケンスの向い合った鎖の向い合った末端領
域に塩基特異的方法で結合するために有効であり、各鎖
中の標的領域の重合をプライマーに開始させ、そして第
1の結合ポリマーに結合したポリマー鎖が各重合した領
域に、電荷/並進摩擦抵抗の合わさった特有の比を与え
る、請求項14記載の構成物。 - 【請求項18】各シーケンス特異的プローブが、第1の
1本鎖DNA断片および1本鎖RNAを含む第2の断片から成
る結合ポリマーを含み、ポリマー鎖は前記第1の断片に
結合し、検出できるレポーターは前記第2の断片に結合
し、そして各ポリマー鎖は前記ポリマー鎖が結合してい
るプローブに、電荷/並進摩擦抵抗の特有の比を与え
る、請求項14記載の構成物。
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