KR20170086661A - Pd-1 길항제에 대한 반응의 유전자 시그너처 바이오마커를 유도하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Pd-1 길항제에 대한 반응의 유전자 시그너처 바이오마커를 유도하기 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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앤드리 로보다
제러드 케이. 룬세포드
테릴 케이. 맥클라나한
에린 이. 머리
마이클 네보진
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Abstract

다중 종양 유형에서 PD-1 길항제에 대한 반응과 상관되는 유전자들의 세트 및 정규화 유전자 세트의 조합물인 유전자 발현 플랫폼이 개시된다. 이러한 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응의 유전자 시그너처 바이오마커를 유도하고 예측성 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 환자 샘플을 테스트하는 방법 및 시스템이 또한 개시된다.

Description

PD-1 길항제에 대한 반응의 유전자 시그너처 바이오마커를 유도하기 위한 시스템 및 방법{SYSTEM AND METHODS FOR DERIVING GENE SIGNATURE BIOMARKERS OF RESPONSE TO PD-1 ANTAGONISTS}
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 프로그램화된 사멸(Programmed Death) 1 (PD-1)의 길항제로 암을 치료하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 PD-1 길항제에 대한 반응을 예측하는 치료-전 유전자 시그너처를 규정하는 것, 및 PD-1 길항제로의 요법에 반응할 가능성이 가장 높은 환자를 확인하기 위한 바이오마커로서의 이같은 유전자 시그너처의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
PD-1은 면역 조절 및 말초 내성의 유지에서 중요한 분자로 인식된다. PD-1은 미접촉(naive) T, B 및 NKT 세포에서 중등도로 발현되고, T/B 세포 수용체 신호전달에 의해 림프구, 단핵구 및 골수 세포에서 상향-조절된다 (1).
PD-1에 대한 2개의 공지된 리간드는 PD-L1 (B7-H1) 및 PD-L2 (B7-DC)이고, 이들은 다양한 조직에서 발생하는 인간 암에서 발현된다. 예를 들어 난소암, 신암, 결장직장암, 췌장암, 간암 및 흑색종의 대형 샘플 세트에서, PD-L1 발현이 후속 치료와 관계없이 불량한 예후 및 감소된 전체 생존과 상관된 것으로 나타났다 (2-13). 유사하게, 종양 침윤 림프구에서의 PD-1 발현이 유방암 및 흑색종에서 기능장애 T 세포를 나타내는 것으로 발견되었고 (14-15), 신암에서 불량한 예후와 상관되는 것으로 발견되었다 (16). 따라서, PD-L1을 발현하는 종양 세포가 PD-1을 발현하는 T 세포와 상호작용하여 T 세포 활성화를 약화시키고 면역 감시를 피함으로써, 종양에 대한 손상된 면역 반응에 기여하는 것으로 제안되었다.
PD-1과 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 양쪽 모두 사이의 상호작용을 억제함으로써 PD-1 활성을 길항하는 여러 모노클로날 항체 (mAb)가 암을 치료하기 위해 임상 개발 중이다. 이는 PD-1에 결합하는 니볼루맙(nivolumab) 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 및 PD-L1에 결합하는 MPDL3280A를 포함한다. 이러한 mAb들의 임상 연구가 일부 암 유형에서 지속성 항종양 반응을 일으켰지만, 상당수의 환자가 항종양 반응을 나타내지 못했다. 따라서, 어떤 암 환자가 PD-1 길항제로의 치료에 대해 임상 이점을 달성할 가능성이 가장 높은지를 확인하기 위한 진단 도구가 요구된다.
암 연구에서의 활발한 분야는 특정 유형 또는 아유형의 암에 특징적이고 임상 결과와 연관될 수 있는, 유전자 세트 (통상적으로 유전자 시그너처 또는 분자 시그너처로 지칭됨)에 대한 종양내 발현 패턴을 확인하는 것이다.
발명의 개요
본 발명의 시스템 및 방법은 본 발명가들이 다중 종양 유형에 대해 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응과 상관되는 치료-전 종양내 RNA 발현 수준을 갖는 상이한 유전자 세트 ("유전자 시그너처")를 유도하기 위한 도구로서 디자인한, 임상 반응 유전자 세트 및 정규화 유전자 세트의 조합물을 기초로 하고, 이는 본원에서 "유전자 발현 플랫폼"으로 지칭된다. 또한 본 발명가들은 이러한 유전자 발현 플랫폼이 상관관계에 대한 시그너처 내의 개별적인 유전자의 상대적인 기여에 가중치를 주는 채점 알고리즘을 유도하여 유전자 시그너처 내의 모든 유전자의 정규화된 RNA 수준의 산술적 합성물 (본원에서 "유전자 시그너처 점수"로 지칭됨)을 생성시키데 유용할 것으로 생각한다. 관심 종양 유형이 동일하고 PD-1 길항제로 치료된 환자들의 코호트에 대해 수득된 유전자 시그너처 점수 및 항종양 반응을 비교함으로써, 본 발명가들은 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응을 달성할 확률이 더 높은 것 또는 더 낮은 것에 따라 환자를 분리하는 차단값 점수를 선택할 수 있을 것으로 생각한다. 특정 종양 유형에 대한 예측성 시그너처 점수가 본원에서 유전자 시그너처 바이오마커로 지칭된다. 본 발명에 따라 유도된 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 환자의 종양이 양성으로 테스트되는 환자는 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 환자의 종양이 음성으로 테스트되는 환자보다 PD-1 길항제로의 요법이 이로울 가능성이 더 높다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 관심 종양 유형에 대해 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응을 예측하는 유전자 시그너처 바이오마커를 도출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 관심 종양 유형으로 진단된 환자 코호트 내의 각각의 환자로부터 치료-전 종양 샘플을 수득하는 단계; (b) 코호트 내의 각각의 환자에 대해, PD-1 길항제로의 치료 후 항종양 반응 값을 수득하는 단계; (c) 유전자 발현 플랫폼 내의 각각의 유전자에 대해 각각의 종양 샘플 내의 미처리 RNA 수준을 측정하고, 여기서 유전자 발현 플랫폼이 임상 반응 유전자의 세트 및 정규화 유전자의 세트를 포함하는 단계; (d) 각각의 종양 샘플에 대해, 임상 반응 유전자에 대한 각각의 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하는 단계; (e) 각각의 종양 샘플 및 관심 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자에 대해, 이러한 유전자에 대한 미리 규정된 곱셈 계수를 사용하여, 정규화된 RNA 발현 수준에 가중치를 주는 단계; (f) 각각의 종양 샘플에 대해, 가중된 RNA 발현 수준을 합산하여 유전자 시그너처 점수를 생성시키는 단계; 및 (g) 모든 종양 샘플에 대한 유전자 시그너처 점수 및 코호트 내의 모든 환자에 대한 항종양 반응 값을 비교하여, 표적 바이오마커 임상 유용성 기준을 충족시키도록 환자 코호트를 분리하는 유전자 시그너처 점수에 대한 차단값을 선택하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 유전자 시그너처 점수가 선택된 차단값 이상인 종양 유형의 임의의 종양 샘플을 바이오마커 양성으로 지정하고, 유전자 시그너처 점수가 선택된 차단값 미만인 종양 유형의 임의의 종양 샘플을 바이오마커 음성으로 지정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명가들은 본 발명의 상기 방법을 사용하여 유도된 유전자 시그너처 바이오마커가 다양한 임상 연구 및 환자 치료 환경에서, 예를 들어, 바이오마커 양성 환자만 PD-1 길항제의 임상 시험에 선택적으로 등록시키거나, 바이오마커 양성 또는 음성 상태를 기초로 PD-1 길항제의 임상 시험의 분석을 계층화하거나, 또는 PD-1 길항제로의 치료에 대한 환자의 적격성을 결정하는데 유용할 것으로 생각한다.
따라서, 제2 측면에서, 본 발명은 특정 종양 유형으로 진단된 환자로부터 제거된 종양 샘플을 PD-1 길항제에 대한 이러한 종양 유형의 항종양 반응의 유전자 시그너처 바이오마커의 존재 또는 부재에 대해 테스트하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 유전자 발현 플랫폼 내의 각각의 유전자에 대해 종양 샘플 내의 미처리 RNA 수준을 측정하고, 여기서 유전자 발현 플랫폼이 임상 반응 유전자의 세트 및 정규화 유전자의 세트를 포함하는 단계; (b) 종양 유형에 대한 미리 규정된 유전자 시그너처 내의 각각의 임상 반응 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하는 단계; (c) 미리 규정된 곱셈 계수를 사용하여 각각의 정규화된 RNA 값에 가중치를 주는 단계; (d) 가중된 RNA 발현 수준을 합산하여 유전자 시그너처 점수를 생성시키는 단계; (e) 생성된 점수를 유전자 시그너처 및 종양 유형에 대한 기준 점수에 비교하는 단계; 및 (f) 종양 샘플을 바이오마커 양성 또는 바이오마커 음성으로 분류하고, 여기서 생성된 점수가 기준 점수 이상이면, 종양 샘플을 바이오마커 양성으로 분류하고, 생성된 점수가 기준 점수 미만이면, 종양 샘플을 바이오마커 음성으로 분류하는 단계를 포함한다.
제3 측면에서, 본 발명은 특정 종양 유형으로 진단된 환자로부터 제거된 종양 샘플을 PD-1 길항제에 대한 이러한 종양 유형의 항종양 반응의 유전자 시그너처 바이오마커의 존재 또는 부재에 대해 테스트하기 위한 시스템을 제공한다. 이러한 시스템은 (i) 임상 반응 유전자의 세트 및 정규화 유전자의 세트로 이루어지는 유전자 발현 플랫폼 내의 각각의 유전자의 미처리 RNA 발현 수준을 측정하기 위한 샘플 분석기, 및 (ii) (a) 종양 유형에 대한 미리 규정된 유전자 시그너처 내의 각각의 임상 반응 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하고; (b) 미리 규정된 곱셈 계수를 사용하여 각각의 정규화된 RNA 값에 가중치를 주고; (c) 가중된 RNA 발현 수준을 합산하여 유전자 시그너처 점수를 생성시키고; (d) 생성된 점수를 유전자 시그너처 및 종양 유형에 대한 기준 점수에 비교하고; (e) 종양 샘플을 바이오마커 양성 또는 바이오마커 음성으로 분류하고, 여기서 생성된 점수가 기준 점수 이상이면, 종양 샘플을 바이오마커 양성으로 분류하고, 생성된 점수가 기준 점수 미만이면, 종양 샘플을 바이오마커 음성으로 분류하기 위한, 측정된 RNA 발현 수준을 수신 및 분석하기 위한 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
본 발명의 상기 측면 각각에서, 유전자 발현 플랫폼 내의 임상 반응 유전자는 (a) 개별적으로, 1개를 초과하는 종양 유형에서 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응과 상관되고, (b) 총괄적으로, 각각의 종양 유형에서 실질적으로 유사한 공분산 패턴을 생성시킨다. 임상 반응 유전자 세트 내의 제1 유전자 서브세트는 항종양 반응과 양성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내는 한편, 임상 반응 유전자 세트 내의 제2 유전자 서브세트에 대한 종양내 RNA 수준은 항종양 반응과 음성으로 상관된다. 한 실시양태에서, 임상 반응 유전자 세트는 약 57개의 유전자를 포함하고, 제1 서브세트는 약 51개의 유전자를 포함하며, 제2 서브세트는 약 6개의 유전자를 포함한다. 본 발명의 상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 유전자 발현 플랫폼은 표 1A 및 1B에 열거된 57개의 유전자를 포함한다.
본 발명의 상기 측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 유전자 발현 플랫폼 내의 정규화 유전자의 세트는 개별적으로 상이한 종양 유형의 다중 샘플에 걸쳐 낮은 분산의 종양내 RNA 수준을 나타내고, 총괄적으로 상이한 종양 유형들에서의 임상 반응 유전자의 종양내 발현 수준의 범위 내에 걸쳐지는 종양내 RNA 수준의 범위를 나타내는 유전자들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 정규화 유전자 세트는 10 내지 12개의 유전자를 포함한다. 본 발명의 상기 측면 중 임의의 것의 한 실시양태에서, 유전자 발현 플랫폼은 하기 표 1C에 열거된 11개의 정규화 유전자를 포함한다.
<표 1>
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명가들은 임상 반응 유전자에서 표시되고, 다중 종양 유형에 걸쳐 펨브롤리주맙에 대한 반응과 상관되는, 하기 표 2에 제시된 특정한 유전자 시그너처를 확인하였다. 이러한 유전자 시그너처 각각에 공통적인 몇몇 유전자가 있기 때문에, 본 발명가들은 PD-1 길항제에 대한 반응을 예측하는 유전자 시그너처 바이오마커가 이러한 시그너처 중 임의의 것, 뿐만 아니라 표 1의 임상 반응 유전자 중 2 내지 57개의 임의의 조합을 포함하는 다른 유전자 시그너처에 대해 유도될 수 있다는 것을 제안한다.
<표 2>
Figure pct00003
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 또는 시스템에서 평가되는 유전자 시그너처는 표 1의 임상 반응 유전자 중 적어도 2개의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 3, 4, 5, 6, 7, 13 또는 18개, 또는 2 내지 57개 사이의 임의의 개수의 표 1의 임상 반응 유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 시그너처는 표 1A 및 1B의 57개의 임상 반응 유전자, 표 1A의 51개의 임상 반응 유전자, 및 표 2에 열거된 유전자 시그너처로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 유전자 시그너처는 표 2에 제시된 18 유전자 업-다운 시그너처이다.
본 발명의 상기 측면 및 실시양태 중 임의의 것에서 사용되는 항종양 반응 값은 개별적인 환자에서의 항종양 반응의 임의의 정량적 또는 정성적 측정에 대한 것일 수 있거나, 또는 환자 코호트에서 관찰된 항종양 반응의 비율일 수 있다. 항종양 반응 값은 PD-1 길항제로의 코호트의 임의의 치료 기간 동안 또는 그 후에 수득될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항종양 반응 값은 객관적인 값, 예컨대 RECIST 1.1 또는 irRC에 의해 측정된 바와 같은 부분 반응, 완전 반응, 또는 최상의 전체 반응이다. 한 실시양태에서, 항종양 반응 값은 항종양 반응의 지속기간, 예를 들어, 환자에 무진행 생존, 무질환 생존 또는 일부 다른 진행성 항종양 반응이 있는 일수, 개월수, 또는 년수이다. 또 다른 실시양태에서, 항종양 반응 값은 PD-1 길항제로 치료된 환자 코호트에 대한 반응률, 예컨대 객관적 반응률 (ORR) 또는 중앙값 전체 생존이다. 일부 실시양태에서, 항종양 반응 값 (개별적인 값 또는 코호트 반응률)은 PD-1 길항제의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9회 또는 이를 초과하는 횟수의 용량 후에 수득된다. 다른 실시양태에서, 항종양 반응 값은 지속적인 항종양 반응에 대한 것이고, 이는 환자 기준에 의해 환자에서의 PD-1 길항제의 최종 용량 후의 임의의 시점에, 예를 들어, 최종 용량을 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 또는 24개월 후에 평가된다.
본 발명가들은 상기 방법 및 시스템이 다양한 PD-1 길항제 및 종양 유형에 대한 유전자 시그너처 바이오마커를 유도하는데 사용될 수 있는 것으로 생각한다. 일부 실시양태에서, PD-1 길항제는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙이다. 환자 코호트는 단독요법으로서 또는 하나 이상의 다른 암 치료를 포함하는 조합 요법의 일부로서 PD-1 길항제로 치료될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 유형은 방광암, 결장직장암, 위암, 두경부암, 흑색종, 비-소세포 폐암, 난소암, 전립선암 또는 신암이다. 한 실시양태에서, PD-1 길항제는 펨브롤리주맙이고, 종양 유형은 항문암, 담관암, 방광암, 결장직장암, 식도암, 위암, 두경부암, 흑색종 또는 난소암이다.
본 발명의 방법 및 시스템의 일부 실시양태에서, 표 1의 각각의 임상 반응 유전자 및 표 1의 각각의 정규화 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준의 log(10) 변환을 수행하고, 정규화 유전자의 log10 변환 RNA 수준의 산술 평균을 계산하고, 계산된 평균을 표 1의 각각의 임상 반응 유전자에 대한 log10 변환 RNA 수준에서 차감함으로써, 각각의 샘플에 대한 임상 반응 유전자의 정규화된 RNA 발현 수준이 수득된다.
표 2의 특정한 유전자 시그너처 중 임의의 것을 사용하는 일부 실시양태에서, 시그너처 내의 각각의 임상 반응 유전자 및 정규화 유전자의 세트에 대한 측정된 미처리 RNA 수준의 log(10) 변환을 수행하고, 정규화 유전자의 log10 변환 RNA 수준의 산술 평균을 계산하고, 계산된 평균을 각각의 임상 반응 유전자에 대한 log10 변환 RNA 수준에서 차감함으로써, 측정된 RNA 값이 수득된다. 일부 실시양태에서, 정규화 유전자의 세트는 표 1C에 열거된 정규화 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 시그너처는 표 2에 기재된 5-유전자 IFNg-유도형 시그너처 또는 7-유전자 MIPFS 시그너처이다. 한 실시양태에서, 유전자 시그너처는 표 2에 기재된 18-유전자 업-다운 시그너처이고, 정규화 유전자의 세트는 표 1C에 열거된 10개의 유전자로 이루어진다.
한 실시양태에서, 관심 유전자 시그너처 (즉, 특정 종양 유형에 대한 미리 규정된 유전자 시그너처) 내의 각각의 유전자가 종양 반응 상관관계에 동등하게 기여하는 것으로 가정되고, 따라서 각각의 유전자가 동등하게 가중된다. 따라서, 이러한 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자에 대한 미리 규정된 곱셈 계수는 1이고, 유전자 시그너처 내의 유전자에 대한 정규화된 RNA 발현 점수가 선형 합계에 의해 또는 산술 평균을 계산함으로서 조합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 특정 유전자 시그너처 내의 상이한 유전자들이 항종양 반응 상관관계에 기여하는 정도가 다르고, 환자 코호트에 대해 결정된 항종양 반응 값 및 정규화된 유전자 발현 수준에 다변량 통계 모델을 적용함으로써, 이러한 기여 차이에 가중치를 주는 계수가 미리 규정되었다. 하기 표 3은 본 발명의 여러 유전자 시그너처에 대해 시그너처 점수를 계산하는데 사용하기 위한 가중 계수의 예시적인 세트를 기재한다. 표 3A에서 확인되는 유전자 시그너처는 표 1의 57개의 임상 반응 유전자로 이루어지고, 표 3B의 유전자 시그너처는 표 2에 기재된 14-유전자 업-다운 및 18-유전자 업-다운 시그너처이다.
<표 3A>
57-유전자 업-다운 시그너처에 대한 예시적인 채점 가중치 세트
Figure pct00004
Figure pct00005
<표 3B>
표 1로부터 유도된 업-다운 시그너처에 대한 예시적인 채점 가중치 세트
Figure pct00006
따라서, 한 실시양태에서, 환자로부터 제거된 종양 샘플에 대해 시그너처 점수를 생성시키는 것은 (i) 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자에 대해 수득된 정규화된 RNA 값에 채점 가중치 세트로부터의 이러한 유전자에 대한 계수를 곱하여, 시그너처 내의 각각의 유전자에 대해 가중된 RNA 값을 생성시키는 단계, 및 (ii) 가중된 RNA 값을 합산하여 종양 샘플에 대한 시그너처 점수를 생산하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자 시그너처가 표 3A의 57 업-다운 시그너처로 이루어지는 경우에는 채점 가중치 세트가 세트 1.1, 세트 1.2, 세트 2.1, 세트 2.2, 세트 2.3 및 세트 2.4로 이루어진 군으로부터 선택되고, 유전자 시그너처가 표 3B의 14-유전자 업-다운 시그너처로 이루어지는 경우에는 채점 가중치 세트가 표 3B의 두 번째 열의 가중치로 이루어지며, 유전자 시그너처가 표 3B의 18-유전자 업-다운 시그너처로 이루어지는 경우에는 채점 가중치 세트가 표 3B의 세 번째 열의 가중치로 이루어진다.
표 3A 또는 3B의 채점 가중치 세트 중 하나를 사용하여 시그너처 점수를 생성시키는 일부 실시양태에서, 시그너처 내의 각각의 임상 반응 유전자 및 표 1C의 각각의 정규화 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준의 log(10) 변환을 수행하고, 정규화 유전자의 log10 변환 RNA 수준의 산술 평균을 계산하고, 계산된 평균을 각각의 임상 반응 유전자에 대한 log10 변환 RNA 수준에서 차감함으로써, 정규화된 RNA 발현 수준이 수득된다. 한 실시양태에서, 선택된 차단값 점수에 의해 충족되는 표적 바이오마커 유용성 기준은 코호트 내의 반응자 환자의 대부분은 유전자 시그너처 점수가 차단값 이상인 한편, 비-반응자 환자의 대부분은 유전자 시그너처가 차단값 미만인 것이다. 또 다른 실시양태에서, 표적 바이오마커 유용성 기준은 환자 코호트 내의 반응자 환자의 적어도 20％, 40％, 60％ 또는 80％가 유전자 시그너처 점수가 선택된 차단값 점수 이상인 것이다. 또 다른 실시양태에서, 코호트 내의 비-반응자 환자의 적어도 80％, 85％, 90％ 또는 95％, 또는 거의 100％가 유전자 시그너처 점수가 차단값 점수 미만인 표적 바이오마커 유용성 기준을 만족시키도록 차단값 점수가 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 표적 바이오마커 유용성 기준은 환자 코호트 내의 별개의 환자들에게 적용되었을 때 적어도 25％, 30％, 35％ 또는 이를 초과하는 값의 선택된 차단값에 대한 양성 예측값 (PPV) 및 적어도 90％, 93％, 96％ 또는 이를 초과하는 값의 음성 예측값 (NPV)이다.
한 실시양태에서, PD-1 길항제는 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙이고, 유전자 시그너처는 적어도 5개의 표 1에 열거된 임상 반응 유전자로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 유전자 시그너처는 표 2에 열거된 유전자 시그너처로부터 선택되고, 환자는 방광암, 위암, 두경부암 또는 흑색종으로 진단되었다.
일부 실시양태에서, PD-1 길항제는 펨브롤리주맙이고, 유전자 시그너처는 표 2에 제시된 IFNg, PD-L1, 확장형 면역 또는 TCR 신호전달 시그너처이며, 환자는 방광암, 위암, 두경부암 또는 흑색종으로 진단되었다.
일부 실시양태에서, 유전자 시그너처에 대한 기준 점수가 PD-1 길항제에 대한 반응자 군의 적어도 대부분을 PD-1 길항제에 대한 비-반응자의 적어도 대부분으로부터 분리하는 것으로 결정되었다. 따라서, 환자의 종양 샘플이 바이오마커 양성으로 분류된 환자는 환자의 종양 샘플이 바이오마커 음성으로 분류된 환자보다 PD-1 길항제에 반응하거나 이에 대해 더 양호한 반응을 달성할 가능성이 더 높다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 유전자 시그너처 중 임의의 것에 대한 정규화된 RNA 발현 점수를 수득하도록 종양 샘플을 검정하기 위한 키트를 제공한다.
한 실시양태에서, 이러한 키트는 표 1의 각각의 유전자에 의해 발현되는 전사체에 특이적으로 결합할 수 있는 혼성화 프로브의 세트, 및 각각의 혼성화 프로브로 형성된 특이적인 혼성화 복합체의 수를 정량하도록 디자인된 시약 세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 세트 내의 각각의 혼성화 프로브는 독특한 검출가능한 표지가 있고, 임상 반응 유전자 및 정규화 유전자 중 하나에 독특한 표적 서열에 특이적으로 혼성화하도록 디자인됨으로써, 종양 샘플 내의 표 1 유전자 모두에 대한 전사체를 단일 혼성화 반응에서 검출할 수 있게 한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 키트는 테스트 종양 샘플과 동일한 방식으로 임상 반응 및 정규화 유전자의 발현에 대해 검정될 수 있는 적어도 하나의 대조군 종양 샘플을 또한 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 (1) 표 2에 제시된 유전자 시그너처 군으로부터 선택된 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자 및 표 1에 열거된 각각의 정규화 유전자에 의해 발현되는 전사체에 특이적으로 결합할 수 있는 혼성화 프로브의 세트, 및 (2) 각각의 혼성화 프로브로 형성된 특이적인 혼성화 복합체의 수를 정량하도록 디자인된 시약 세트를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 종양이 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성인지 또는 음성인지를 결정하는 단계, 및 종양이 바이오마커에 대해 양성이면 대상체에게 PD-1 길항제를 투여하고, 종양이 바이오마커에 대해 음성이면 대상체에게 PD-1 길항제를 포함하지 않는 암 치료를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자 시그너처 바이오마커가 적어도 2개의 표 1의 임상 반응 유전자를 포함하는, 종양이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 유전자 시그너처는 표 2에 열거된 유전자 시그너처로부터 선택된다.
추가 측면에서, 본 발명은 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성으로 테스트되는 종양이 있는 대상체에서 사용하기 위한 PD-1 길항제를 포함하는 제약 조성물이고, 여기서 유전자 시그너처 바이오마커가 표 2에 열거된 유전자 시그너처로부터 선택된 유전자 시그너처에 대한 것인 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제약 조성물 및 처방 정보를 포함하는 약품이다. 제약 조성물은 PD-1 길항제 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 처방 정보는 제약 조성물이 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성으로 테스트되는 종양이 있는 대상체에서의 사용에 대해 지시된다는 것을 서술하고, 여기서 유전자 시그너처 바이오마커는 표 2에 열거된 유전자 시그너처로부터 선택된 유전자 시그너처에 대한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 표 2에 열거된 MIPFS 유전자 시그너처와 표 1B에 열거된 6-유전자 반-상관(anti-correlated) 유전자 서브세트의 다중 두경부 종양 샘플에 걸친 자율(unsupervised) 클러스터링 분석의 결과를 나타낸다.
도 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h 및 2i는 다중 흑색종 종양 샘플 대 하기 종양 유형의 다중 종양 샘플에서의 표 1의 57개의 임상 반응 유전자 중 일부 또는 모두에 대한 정규화된 RNA 발현 수준의 쌍별 상관관계의 산점도를 나타낸다: 두경부암 (도 2a), 방광암 (도 2b), 위암 (도 2c), NSCLC (도 2d), 결장직장암 (도 2e), 신암 (도 2f), 전립선암 (도 2g), 난소암 (도 2h), 및 삼중 음성 유방암 (도 2i).
도 3은 펨브롤리주맙으로 치료된 3개의 상이한 암 코호트에서의 치료-전 종양 샘플 및 임상 반응 데이터의 메타 분석에서 무진행 생존 시간에 대해 플롯팅된 표 1의 57개의 임상 반응 유전자의 유전자 시그너처에 대해 결정된 모델-유도 유전자 시그너처 점수를 나타낸다.
도 4는 표 1에 열거된 57개의 임상 반응 유전자에 대해 치료-전 종양 샘플에 대해 결정된 모델-유도 유전자 시그너처 점수에 대해 플롯팅된 펨브롤리주맙으로 치료된 위암 코호트 내의 반응자 및 비-반응자 환자의 퍼센트의 막대 그래프를 나타낸다.
도 5는 도 4에 제시된 모델-기반 유전자 시그너처 점수의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 6은 두경부 코호트 내의 환자의 펨브롤리주맙에 대한 BOR을 예측하는 것에 대한 표 1에 표시된 IFNg 유전자 시그너처의 잠재적인 유용성을 도해하고, 차단값 점수를 증가시키는 것이 유전자 시그너처 점수가 차단값을 초과하는 코호트 내의 환자의 유병률 (상부 패널), 양성 예측값 (PPV, 중간 패널) 및 음성 예측값 (NPV, 하부 패널)에 미치는 효과를 나타낸다.
도 7은 표 1의 57-유전자 시그너처에 대한 시그너처 점수의 예상 BOR PPV 프로파일을 나타내고, 이러한 점수는 KEYNOTE-012 및 KEYNOTE-028의 계층적 베이지안 메타 분석 하에 세트 1.1의 가중치를 사용하여 계산되었다.
도 8은 표 1의 57-유전자 시그너처에 대한 시그너처 점수의 예상 BOR NPV 프로파일을 나타내고, 이러한 점수는 KEYNOTE-012 및 KEYNOTE-028의 계층적 베이지안 메타 분석 하에 세트 1.1의 가중치를 사용하여 계산되었다.
도 9a 및 9b는 펨브롤리주맙 치료에 반응한 식도암 환자 (반응자) 또는 이에 반응하지 않은 식도암 환자 (비-반응자) 사이의 57 유전자 시그너처에 대한 치료-전 시그너처 점수의 분포를 나타내는 막대 그래프이고, 여기서 시그너처 점수는 예시적인 채점 가중치 세트 1.1 (도 9a) 또는 세트 2.4 (도 9b)를 사용하여 계산되었다.
도 10a 및 10b는 펨브롤리주맙 치료에 반응한 결장직장암 환자 (반응자) 또는 이에 반응하지 않은 결장직장암 환자 (비-반응자) 사이의 57 유전자 시그너처에 대한 치료-전 시그너처 점수의 분포를 나타내는 막대 그래프이고, 여기서 시그너처 점수는 예시적인 채점 가중치 세트 1.1 (도 10a) 또는 세트 2.4 (도 10b)를 사용하여 계산되었다.
도 11a 및 11b는 펨브롤리주맙 치료에 반응한 항문암 환자 (반응자) 또는 이에 반응하지 않은 항문암 환자 (비-반응자) 사이의 57 유전자 시그너처에 대한 치료-전 시그너처 점수의 분포를 나타내는 막대 그래프이고, 여기서 시그너처 점수는 세트 1.1 (도 11a) 또는 세트 2.4 (도 11b)에서 확인되는 채점 가중치 세트를 사용하여 계산되었다.
상세한 설명
I. 약어.
본 발명의 상세한 설명 및 실시예 전반에 걸쳐, 하기 약어가 사용될 것이다:
BOR 최상의 전체 반응
CDR 상보성 결정 영역
CHO 차이니즈 햄스터 난소
CR 완전 반응
DFS 무질환 생존
FFPE 포르말린-고정, 파라핀-포매
FR 프레임워크 영역
IHC 면역조직화학 또는 면역조직화학적
irRC 면역 관련 반응 기준
NCBI 국립 생물공학 정보 센터
NPV 순량 예측값
OR 전체 반응
OS 전체 생존
PD 진행성 질환
PD-1 프로그램화된 사멸 1
PD-L1 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 1
PD-L2 프로그램화된 세포 사멸 1 리간드 2
PFS 무진행 생존 (PFS)
PPV 양성 예측값
PR 부분 반응
Q2W 2주 마다 1회 용량
Q3W 3주 마다 1회 용량
RECIST 고형 종양의 반응 평가 기준
ROC 수용자 조작 특성
SD 안정적 질환
VH 면역글로불린 중쇄 가변 영역
VK 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역
II. 정의
본 발명이 더욱 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 기술 과학 용어가 하기에서 구체적으로 정의된다. 본 문서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 다른 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다.
첨부된 청구항을 포함하여 본원에서 사용된 바와 같이, "a", "an" 및 "the"와 같은 단수형 형태의 단어는 맥락적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 이의 상응하는 복수형 지시대상을 포함한다.
숫자로 규정되는 파라미터 (예를 들어, 본원에서 논의되는 유전자 시그너처에 대한 유전자 시그너처 점수, 또는 PD-1 길항제의 투여량, 또는 PD-1 길항제로의 치료 시간의 길이)를 수식하는데 사용되는 경우의 "약"은 파라미터가 이러한 파라미터에 대한 언급된 수치의 많게는 10％ 초과 또는 미만만큼 변할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 약 10개의 유전자로 이루어지는 유전자 시그너처는 9개 내지 11개의 유전자가 있을 수 있다. 유사하게, 약 2.462의 기준 유전자 시그너처 점수는 2.2158 및 2.708의 점수 및 이들 사이의 임의의 점수를 포함한다.
동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생체액에 적용된 바와 같은 "투여" 및 "처리"는 외인성 제약, 치료, 진단 작용제, 또는 조성물과 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생체액의 접촉을 지칭한다. 세포 처리는 시약과 세포의 접촉, 뿐만 아니라 시약과 체액 (체액이 세포와 접촉되어 있는 경우)의 접촉을 포함한다. "투여" 및 "처리"는 시약, 진단제, 결합 화합물에 의해 또는 또 다른 세포에 의해 세포를 예를 들어 시험관 내 및 생체 외에서 처리하는 것을 또한 의미한다. 용어 "대상체"는 유기체, 바람직하게는 동물, 보다 바람직하게는 포유동물 (예컨대, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼), 가장 바람직하게는 인간을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 원하는 생물학적 또는 결합 활성을 나타내는 임의 형태의 항체를 지칭한다. 따라서, 이는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간화 항체, 완전히 인간형인 항체, 키메라 항체 및 낙타화 단일 도메인 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "모 항체"는 면역계를 항원에 노출시킴으로써 수득되는, 의도되는 용도를 위한 항체의 변형, 예컨대 인간 치료제로서 사용하기 위한 마우스에서 생성된 모 항체의 인간화 전의 항체이다.
일반적으로, 기본적인 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 각각의 쌍에는 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50-70 kDa)가 있다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 규정할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 또한, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 항체의 아이소형을 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 또한 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다.
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 무손상 항체에는 2개의 결합 부위가 있다. 이관능성 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다.
전형적으로, 중쇄 및 경쇄 양쪽 모두의 가변 도메인은 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR) 내에 위치하는 3개의 초가변 영역 (상보성 결정 영역 (CDR)으로 또한 칭해짐)을 포함한다. CDR은 일반적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어, 특이적 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 한다. 일반적으로, N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 양쪽 모두는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 아미노산을 각각의 도메인에 할당하는 것은, 일반적으로, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991)]; [Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75]; [Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616]; [Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917] 또는 [Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883]의 정의에 따른다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" (즉, 경쇄 가변 도메인 내의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄 가변 도메인 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.] (항체의 CDR 영역을 서열에 의해 규정함)을 참조하고, 문헌 [Chothia and Lesk (1987) J. Mol . Biol. 196: 901-917] (항체의 CDR 영역을 구조에 의해 규정함)을 또한 참조한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 CDR 잔기로 규정되는 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 항체의 항원 결합 단편, 즉 전장 항체가 결합하는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체 단편, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역을 유지하는 단편을 지칭한다. 항체의 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자, 예를 들어, sc-Fv; 나노바디, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 표적 단백질에 "특이적으로 결합하는" 항체는 다른 단백질에 비교하여 이러한 표적에 대한 우선적인 결합을 나타내는 항체이지만, 이러한 특이성은 절대적인 결합 특이성을 필요로 하지 않는다. 항체의 결합이, 예를 들어 원치 않는 결과 예컨대 거짓 양성을 일으키지 않으면서, 샘플 내의 표적 단백질의 존재를 결정지으면 항체가 이의 의도되는 표적에 대해 "특이적"인 것으로 간주된다. 본 발명에서 유용한 항체 또는 이의 결합 단편은 비-표적 단백질과의 친화력보다 적어도 2배 더 큰, 바람직하게는 적어도 10배 더 큰, 더욱 바람직하게는 적어도 20배 더 큰, 가장 바람직하게는 적어도 100배 더 큰 친화력으로 표적 단백질에 결합할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항체가 소정의 아미노산 서열, 예를 들어, 성숙형 인간 PD-1 또는 인간 PD-L1 분자의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하지만 이러한 서열이 결여된 단백질에는 결합하지 않으면, 항체가 이러한 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다고 한다.
"키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종 (예를 들어, 인간)으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종 (예를 들어, 마우스)로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편을 지칭한다.
"인간 항체"는 인간 면역글로불린 단백질 서열만 포함하는 항체를 지칭한다. 인간 항체는 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 유래되는 하이브리도마에서 생산되는 경우 뮤린 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "래트 항체"는 각각 마우스 또는 래트 면역글로불린 서열만 포함하는 항체를 지칭한다.
"인간화 항체"는 인간 항체뿐만 아니라 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체로부터의 서열을 함유하는 항체 형태를 지칭한다. 이같은 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것에 상응한다. 임의적으로 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 또한 포함할 것이다. 설치류 항체의 인간화 형태는 일반적으로 모 설치류 항체와 동일한 CDR 서열을 포함할 것이지만, 친화력을 증가시키기 위해, 인간화 항체의 안정성을 증가시키기 위해, 또는 다른 이유로 특정 아미노산 치환이 포함될 수 있다.
치료제, 예컨대 PD-1 길항제로 치료된 암 환자를 언급할 때의 "항종양 반응"은 적어도 하나의 양성 치료 효과, 예를 들어, 암 세포 수의 감소, 종양 크기의 감소, 주변 기관 내로의 암 세포 침윤 속도의 감소, 종양 전이 또는 종양 성장 속도의 감소, 또는 무진행 생존을 의미한다. 암에서의 양성 치료 효과를 다수의 방식으로 측정할 수 있다 (문헌 [W. A. Weber, J. Null. Med. 50:1S-10S (2009)]; [Eisenhauer et al., 상기 문헌] 참조). 일부 실시양태에서, RECIST 1.1 기준, 이차원 irRC 또는 일차원 irRC를 사용하여 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응을 평가한다. 일부 실시양태에서, 항종양 반응은 SD, PR, CR, PFS, DFS 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 유전자 시그너처 바이오마커는 고형 종양이 있는 대상체가 PR 또는 CR을 달성할 가능성이 있는지 여부를 예측한다.
"이차원 irRC"는 문헌 [Wolchok JD, et al. Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria. Clin Cancer Res. 2009;15(23):7412-7420]에 기술된 기준 세트를 지칭한다. 이러한 기준들은 각각의 병변의 가장 긴 직경과 가장 긴 수직 직경을 곱함 (㎠)으로써 수득되는 표적 병변의 이차원 종양 치수를 이용한다.
"생물치료제"는 종양 유지 및/또는 성장을 지지하거나 항종양 면역 반응을 억제하는 임의의 생물학적 경로 내의 리간드 / 수용체 신호전달을 차단하는 생물학적 분자, 예컨대 항체 또는 융합 단백질을 의미한다.
용어 "암", "암성", 또는 "악성"은 조절되지 않은 세포 성장을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종, 및 육종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이같은 암의 더욱 특정한 예는 편평세포 암종, 골수종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발성 골수종, 위장(관) 암, 신암, 난소암, 간암, 림프모구 백혈병, 림프구 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 흑색종, 연골육종, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 아교모세포종, 자궁경부암, 뇌암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종, 및 두경부암을 포함한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 특히 바람직한 암은 테스트된 조직 샘플에서 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 양쪽 모두의 상승된 발현을 특징으로 하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "CDR" 또는 "CDR"은 달리 지시되지 않는 한, 카바트(Kabat) 번호매김 시스템을 사용하여 정의되는, 면역글로불린 가변 영역 내의 상보성 결정 영역(들)을 의미한다.
"화학요법제"는 암 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 클래스는 알킬화제, 항대사물질, 키나제 억제제, 방추체 독물 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 토포이소머라제 억제제, 광감작제, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 항-프로게스테론, 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD), 에스트로겐 수용체 길항제, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 효능제, 항-안드로겐, 아로마타제 억제제, EGFR 억제제, VEGF 억제제, 비정상적인 세포 증식 또는 종양 성장에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 안티-센스 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 치료 방법에서 유용한 화학요법제는 세포증식억제 및/또는 세포독성 작용제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "코티아(Chothia)"는 문헌 [Al-Lazikani et al., JMB 273:927-948 (1997)]에 기술된 항체 번호매김 시스템을 의미한다.
"포함하는" 또는 변형 예컨대 "포함한다", "~을 포함한다"는 명확한 언어 또는 필연적인 함의로 인해 맥락적으로 달리 요구되지 않는 한, 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐 포괄적인 의미로, 즉 언급된 특색의 존재를 명시하지만, 본 발명의 임의의 실시양태의 작용 또는 유용성을 실질적으로 강화할 수 있는 추가적인 특색의 존재 또는 추가를 배제하지 않도록 사용된다.
명세서 및 청구항 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 "본질적으로 ~로 이루어진다" 및 변형 예컨대 "본질적으로 ~로 이루어지는"은 임의의 열거된 요소 또는 요소 군을 포함하는 것, 및 명시된 투여량 체계, 방법 또는 조성물의 기본적이거나 신규한 성질을 실질적으로 변화시키지 않는, 열거된 요소 이외의 유사하거나 상이한 성질의 다른 요소를 임의적으로 포함하는 것을 가리킨다. 비제한적인 예로서, 유전자 시그너처 점수가 명시된 유전자 목록으로 이루어지는 유전자 세트에 대한 합성 RNA 발현 점수로서 정의되는 경우, 통상의 기술자는 하나 이상의 추가적인 유전자, 바람직하게는 3개 이하의 추가적인 유전자에 대해 결정된 RNA 수준을 포함하는 것이 예측력에 실질적으로 영향을 미치지 않는다면, 이러한 유전자 시그너처 점수가 이를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 CDR 영역을 제외한 면역글로불린 가변 영역을 의미한다.
"상동성"은 2개의 폴리펩티드 서열이 최적으로 정렬되었을 때의 이들 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 2개의 비교되는 서열 양쪽 모두 내의 위치를 동일한 아미노산 단량체 서브유닛이 차지하는 경우에, 예를 들어, 2개의 상이한 Ab의 경쇄 CDR 내의 위치를 알라닌이 차지하면, 2개의 Ab가 이러한 위치에서 상동성이다. 상동성 퍼센트는 2개의 서열이 공유하는 상동성 위치의 수를 비교되는 위치의 총수로 나눈 것 × 100이다. 예를 들어, 서열들이 최적으로 정렬되었을 때 2개의 서열 내의 10개의 위치 중 8개가 매칭되거나 상동성이면, 2개의 서열은 80％ 상동성이다. 일반적으로, 2개의 서열이 최대 퍼센트 상동성을 제공하도록 정렬되었을 때 비교가 이루어진다. 예를 들어, 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 알고리즘의 파라미터가 선택되는 BLAST 알고리즘에 의해 비교가 수행될 수 있다.
하기의 참고문헌들은 서열 분석에 종종 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: BLAST 알고리즘: 문헌 [Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272]; [Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141]; [Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; [Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656]; [Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163]; [Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70]; 정렬 채점 시스템: 문헌 [Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins", Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC]; [Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships", Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC]; [Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565]; [States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70]; [Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919]; [Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300]; 정렬 통계학: 문헌 [Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]; [Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]; [Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039]; 및 [Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments", Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York]. "단리된 항체" 및 "단리된 항체 단편"은 정제 상태를 지칭하고, 이같은 맥락에서, 지명된 분자에 다른 생물학적 분자 예컨대 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 기타 물질 예컨대 세포 잔해물 및 성장 배지가 실질적으로 없다는 것을 의미한다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 본원에 기술된 바와 같은 결합 화합물의 실험적 또는 치료적 용도를 실질적으로 방해하는 양으로 존재하지 않는 한, 이같은 물질의 완전한 부재 또는 물, 완충제 또는 염의 부재를 지칭하도록 의도되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 "카바트"는 엘빈 에이. 카바트(Elvin A. Kabat) ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)가 창시한 면역글로불린 정렬 및 번호매김 시스템을 의미한다.
"모노클로날 항체" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 균질한 항체들의 집단을 지칭하고, 즉 집단을 이루는 항체 분자들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 아미노산 서열 면에서 동일하다. 대조적으로, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제는 항체의 가변 도메인, 특히 이의 CDR 내에 상이한 아미노산 서열이 있는 다수의 상이한 항체들을 전형적으로 포함하고, 이들은 종종 상이한 에피토프들에 대해 특이적이다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 것으로서의 항체 특성을 가리키고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567을 참조한다). "모노클로날 항체"는 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628] 및 [Marks et al. (1991) J. Mol . Biol. 222: 581-597]에 기술된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다. 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin . Immunol. 116:731]을 또한 참조한다.
PD-1 길항제로의 치료에 대한 특정한 항종양 반응을 지칭하는 경우의 "비-반응자 환자"는 환자가 항종양 반응을 나타내지 않았다는 것을 의미한다.
"올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 길이가 5 내지 100개의 연속적인 염기이고, 가장 빈번하게는 길이가 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-50, 20-40, 20-30 또는 20-25개의 연속적인 염기인 핵산을 지칭한다.
"환자"는 요법이 요망되거나 또는 임상 시험, 역학 연구에 참여 중이거나 대조군으로서 이용되는 임의의 단일한 인간 대상체를 지칭한다.
"PD-1 길항제"는 암 세포 상에서 발현되는 PD-L1이 면역 세포 (T 세포, B 세포 또는 NKT 세포) 상에서 발현되는 PD-1에 결합하는 것을 차단하고, 바람직하게는 암 세포 상에서 발현되는 PD-L2가 면역 세포에서 발현되는 PD-1에 결합하는 것을 또한 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 의미한다. PD-1 및 이의 리간드에 대한 대안적인 명칭 또는 동의어는 PD-1에 대한 PDCD1, PD1, CD279 및 SLEB2; PD-L1에 대한 PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 및 B7-H; 및 PD-L2에 대한 PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc 및 CD273을 포함한다. 인간 개체가 치료되는 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태 중 임의의 것에서, PD-1 길항제는 인간 PD-L1이 인간 PD-1에 결합하는 것을 차단하고, 바람직하게는 인간 PD-L1 및 PD-L2 양쪽 모두가 인간 PD-1에 결합하는 것을 차단한다. 인간 PD-1 아미노산 서열을 NCBI 유전자좌 번호(Locus No.): NP_005009에서 확인할 수 있다. 인간 PD-L1 및 PD-L2 아미노산 서열을 각각 NCBI 유전자좌 번호 NP_054862 및 NP_079515에서 확인할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면 및 실시양태 중 임의의 것에서 유용한 PD-1 길항제는 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 인간 PD-1 또는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 (mAb) 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 이러한 mAb는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있고, 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직한 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, F(ab')2, scFv 및 Fv 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
인간 PD-1에 결합하고 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태에서 유용한 mAb의 예가 US7521051, US8008449, 및 US8354509에 기술되어 있다. 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태에서 PD-1 길항제로서 유용한 특정한 항-인간 PD-1 mAb는 문헌 [WHO Drug Information, Vol. 27, No. 2, pages 161-162 (2013)]에 기술된 구조의 인간화 IgG4 mAb인 펨브롤리주맙, 문헌 [WHO Drug Information, Vol. 27, No. 1, pages 68-69 (2013)]에 기술된 구조의 인간 IgG4 mAb인 니볼루맙 (BMS-936558), 피딜리주맙 (pidilizumab) (CT-011이고, hBAT 또는 hBAT-1로도 알려져 있음), 및 WO2008/156712에 기술된 인간화 항체 h409A11, h409A16 및 h409A17을 포함한다.
본 발명의 다양한 측면 및 실시양태 중 임의의 것에서 유용한 추가적인 PD-1 길항제는 펨브롤리주맙 바이오시밀러 또는 펨브롤리주맙 변이체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "펨브롤리주맙 바이오시밀러"는 (a) 머크 앤드 컴퍼니, 인크(Merck and Co., Inc.) 또는 이의 자회사 이외의 회사가 판매하고, (b) 펨브롤리주맙 바이오시밀러로서 판매되는 것에 대해 임의의 국가에서 감독 기관에 의해 승인된 생물학적 제품을 의미한다. 한 실시양태에서, 펨브롤리주맙 바이오시밀러는 약물 물질로서의 펨브롤리주맙 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, 펨브롤리주맙 바이오시밀러는 펨브롤리주맙과 아미노산 서열이 동일하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "펨브롤리주맙 변이체"는 경쇄 CDR 바깥에 위치하는 장소의 3, 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환 및 중쇄 CDR 바깥에 위치하는 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환이 있는 것을 제외하고는 펨브롤리주맙에서의 것과 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 모노클로날 항체를 의미하고, 예를 들어, 변이체 장소는 FR 영역 또는 불변 영역 내에 위치한다. 달리 말하면, 펨브롤리주맙 및 펨브롤리주맙 변이체는 동일한 CDR 서열을 포함하지만, 이들의 전장 경쇄 및 중쇄 서열 내의 각각 3개 또는 6개 이하의 장소에 보존적 아미노산 치환이 있기 때문에 서로 상이하다. 펨브롤리주맙 변이체는 하기의 성질과 관련하여 펨브롤리주맙과 실질적으로 동일하다: PD-1에 대한 결합 친화력, 및 PD-L1 및 PD-L2 각각이 PD-1에 결합하는 것을 차단하는 능력.
인간 PD-L1에 결합하고 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태 중 임의의 것에서 유용한 mAb의 예가 WO2013/019906, W02010/077634 A1 및 US8383796에 기술되어 있다. 본 발명의 다양한 측면 및 실시양태에서 PD-1 길항제로서 유용한 특정한 항-인간 PD-L1 mAb는 MPDL3280A (아테졸리주맙(atezolizumab)), BMS-936559, MEDI4736, MSB0010718C (아벨루맙(avelumab)), 및 각각 WO2013/019906의 서열식별번호(SEQ ID NO): 24 및 서열식별번호: 21의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명의 다양한 측면 및 실시양태 중 임의의 것에서 유용한 기타 PD-1 길항제는 PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 인간 PD-1 또는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 이뮤노어드헤신(immunoadhesin), 예를 들어, 면역글로불린 분자의 불변 영역 예컨대 Fc 영역에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 함유하는 융합 단백질을 포함한다. PD-1에 특이적으로 결합하는 이뮤노어드헤신 분자의 예가 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 기술되어 있다. 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도에서 PD-1 길항제로서 유용한 특정한 융합 단백질은 AMP-224 (B7-DCIg로도 알려짐)를 포함하고, 이는 PD-L2-FC 융합 단백질이고, 인간 PD-1에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "프로브"는 엄격한 혼성화 조건 하에 표 1에 열거된 관심 유전자에 의해 발현되는 전사체에 특이적으로 혼성화할 수 있고, 일부 바람직한 실시양태에서는 엄격한 혼성화 조건 하에 관심 유전자에 대한 표 1에 열거된 특정 전사체에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "RECIST 1.1 반응 기준"은 반응이 측정되는 상황을 기초로 적합한 바와 같은, 표적 병변 및 비-표적 병변에 대해 문헌 [Eisenhauer et al., E.A. et al., Eur. J Cancer 45:228-247 (2009)]에 기재된 정의를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "기준 IFN-γ 유전자 시그너처 점수"는 테스트 대상체와 종양 유형이 동일하고 PD-1 길항제로 치료된 대상체들의 기준 집단에서 반응자의 적어도 대부분을 비-반응자의 적어도 대부분으로부터 분리하도록 결정된 IFN-γ 유전자 시그너처에 대한 점수를 의미한다. 바람직하게는, 기준 집단 내의 반응자의 적어도 60％, 70％, 80％, 또는 90％ 중 임의의 ％는 IFN-γ 유전자 시그너처 점수가 선택된 기준 점수를 초과하는 한편, 기준 집단 내의 비-반응자의 적어도 60％, 70％ 80％, 90％ 또는 95％ 중 임의의 ％에 대한 IFN-γ 유전자 시그너처 점수는 선택된 기준 점수보다 낮을 것이다. 일부 실시양태에서, 기준 점수의 음성 예측값이 양성 예측값보다 크다. 일부 바람직한 실시양태에서, 기준 집단 내의 반응자는 RECIST 1.1 기준에 의해 측정 시 부분 반응 (PR) 또는 완전 반응 (CR)을 달성한 대상체로서 정의되고, 비-반응자는 어떠한 RECIST 1.1 임상 반응도 달성하지 않은 것으로 정의된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 기준 집단 내의 대상체들은 테스트 대상체에 대해 고려되는 것과 실질적으로 동일한 항-PD-1 요법, 즉 동일하거나 실질적으로 유사한 투여량 체계를 사용하는 동일한 PD-1 길항제의 투여로 치료되었다.
본원에서 언급된 종양 또는 임의의 다른 생물학적 물질을 지칭하는 경우의 "샘플"은 대상체로부터 제거된 샘플을 의미하고, 따라서, 본원에 기술된 테스트 방법 중 어느 것도 대상체 내에서 또는 대상체 상에서 수행되지 않는다.
PD-1 길항제로의 치료에 대한 특정한 항종양 반응을 지칭하는 경우의 "반응자 환자"는 환자가 항종양 반응을 나타냈다는 것을 의미한다.
"지속 반응"은 본원에 기술된 치료제 또는 조합 요법으로의 치료를 중단한 후의 지속적인 치료 효과를 의미한다. 일부 실시양태에서, 지속 반응은 기간이 적어도 치료 기간과 동일하거나 또는 치료 기간보다 적어도 1.5, 2.0, 2.5 또는 3배 더 길다.
"조직 절편"은 조직 샘플의 단일한 부분 또는 조각, 예를 들어, 정상 조직 또는 종양의 샘플로부터 절단된 조직의 박편을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 암을 "치료하다" 또는 "치료하는"은 적어도 하나의 양성 치료 효과, 예를 들어, 암 세포 수의 감소, 종양 크기 또는 종양 부담의 감소, 주변 기관 내로의 암 세포 침윤 속도의 감소, 또는 종양 전이 또는 종양 성장 속도의 감소를 달성하기 위해 암에 걸렸거나 또는 암으로 진단된 대상체에게 PD-1 길항제 및 다른 치료제를 투여하는 것을 의미한다. 암에서의 양성 치료 효과를 다수의 방식으로 측정할 수 있다 (문헌 [W. A. Weber, J. Null. Med. 50:1S-10S (2009)]; [Eisenhauer et al., 상기 문헌] 참조). 일부 바람직한 실시양태에서, RECIST 1.1 기준 또는 irRC를 사용하여 PD-1 길항제에 대한 반응을 평가한다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효량에 의해 달성되는 치료는 PR, CR, PFS, DFS, OR 또는 OS 중 임의의 것이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자 시그너처 바이오마커는 고형 종양이 있는 대상체가 PR 또는 CR을 달성할 가능성이 있는지 여부를 예측한다. 암 환자를 치료하는데 효과적인 본원에 기술된 요법의 투여량 체계는 환자의 질환 상태, 연령 및 체중, 및 요법이 대상체에서 항암 반응을 도출하는 능력과 같은 요인에 따라 다를 수 있다. 본 발명의 치료 방법, 약제 및 용도의 실시양태는 모든 대상체에서 양성 치료 효과를 달성하는데 효과적이지 않을 수 있지만, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 통계 검정 예컨대 스튜던트(Student) t-검정, 카이2-검정, 만 & 휘트니((Mann & Whitney)에 따른 U-검정, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정 (H-검정), 존키어-테르프스트라(Jonckheere-Terpstra)-검정 및 윌콕슨(Wilcoxon)-검정에 의해 결정 시 통계적으로 유의한 수의 대상체에서 효과적이어야 한다.
암으로 진단되었거나 암에 걸린 것으로 추정되는 대상체에 적용된 바와 같은 "종양"은 임의 크기의 악성이거나 잠재적으로 악성인 신생물 또는 조직 덩어리를 지칭하고, 원발성 종양 및 2차 신생물을 포함한다. 고형 종양은 일반적으로 낭 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 성장물 또는 덩어리이다. 상이한 유형의 고형 종양들이 이를 형성하는 세포의 유형에 따라 명명된다. 고형 종양의 예는 육종, 암종, 및 림프종이다. 백혈병 (혈액의 암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다 (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).
"종양 부담" ("종양 부하(load)"로도 지칭됨)는 신체 전반에 걸쳐 분포된 종양 물질의 총량을 지칭한다. 종양 부담은 림프절 및 골수를 포함하여 신체 전반에 걸친 암 세포의 총수 또는 종양(들)의 총 크기를 지칭한다. 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 대상체로부터의 제거 시에, 예를 들어 캘리퍼스를 사용하여, 또는 신체 내에 있는 동안 영상화 기술, 예를 들어, 초음파, 골 스캔, 컴퓨터 단층촬영술 (CT) 또는 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔을 사용하여 종양(들)의 치수를 측정함으로써, 종양 부담을 결정할 수 있다.
용어 "종양 크기"는 종양의 길이 및 폭으로서 측정될 수 있는 종양의 총 크기를 지칭한다. 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 대상체로부터의 제거 시에, 예를 들어 캘리퍼스를 사용하여, 또는 신체 내에 있는 동안 영상화 기술, 예를 들어, 골 스캔, 초음파, CT 또는 MRI 스캔을 사용하여 종양(들)의 치수를 측정함으로써, 종양 크기를 결정할 수 있다.
"일차원 irRC"는 문헌 [Nishino M, Giobbie-Hurder A, Gargano M, Suda M, Ramaiya NH, Hodi FS. Developing a Common Language for Tumor Response to Immunotherapy: Immune-related Response Criteria using Unidimensional measurements. Clin Cancer Res. 2013;19(14):3936-3943]에 기술된 기준 세트를 지칭한다. 이러한 기준들은 각각의 병변의 가장 긴 직경 (cm)을 이용한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "가변 영역" 또는 "V 영역"은 상이한 항체들 사이에서 서열 면에서 가변적인 IgG 쇄의 분절을 의미한다. 이는 경쇄 내의 카바트 잔기 109 및 중쇄 내의 113까지에 이른다.
III. 유전자 발현 플랫폼의 조성
본 발명가들은 상기 표 1에 열거된 57개의 임상 반응 유전자 및 11개의 정규화 유전자의 유전자 발현 플랫폼을 구축하였고, 임상 반응 유전자 세트에서 표시되고 다중 종양 유형에 걸쳐 펨브롤리주맙에 대한 반응과 상관되는, 상기 표 2에 제시된 유전자 시그너처를 추가로 확인하였다. 이러한 유전자 시그너처 각각에 공통적인 몇몇 유전자가 있기 때문에, 본 발명가들은 PD-1 길항제에 대한 반응을 예측하는 유전자 시그너처 바이오마커가 이러한 시그너처 중 임의의 것에 대해, 뿐만 아니라 표 1의 임상 반응 유전자 중 2 내지 57개의 임의의 조합을 포함하는 다른 유전자 시그너처에 대해 유도될 수 있다는 것을 제안한다. 표 1의 각각의 유전자에 대해 RNA 수준을 측정한 후, 정규화된 RNA 수준으로부터 각각의 관심 유전자 시그너처 내의 유전자에 대해서만 시그너처 점수를 산정함으로써, 단일 유전자 발현 분석 시스템을 상이한 유전자 시그너처들 및 상이한 종양 유형들에 대한 유전자 시그너처 점수를 생성시키고 평가하는데 사용하여 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응의 후보 바이오마커를 유도할 수 있다.
그러나, 본 발명가들은 표 1에 제시된 플랫폼과 매우 유사한 기능성을 제공하는, 임상 반응 유전자 세트 및 정규화 유전자 세트를 포함하는 다른 유전자 발현 플랫폼이 구축될 수 있다고 생각하고, 단 플랫폼 내의 유전자 세트는 하기 기준 모두를 충족시킨다: (1) 임상 반응 유전자 세트 내의 유전자가 (a) 개별적으로, 1개를 초과하는 종양 유형에서 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응과 상관되고, (b) 총괄적으로, 각각의 종양 유형에서 실질적으로 유사한 공분산 패턴을 생성시키며; (2) 임상 반응 유전자 세트가 약 50개 내지 약 60개의 유전자로 이루어지고, 임상 반응 유전자의 약 90％가 항종양 반응과 양성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내고, 임상 반응 유전자의 약 10％가 항종양 반응과 음성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내고; (3) 정규화 유전자 세트 내의 유전자가 개별적으로 상이한 종양 유형의 다중 샘플에 걸쳐 낮은 분산의 종양내 RNA 수준을 나타내고, 총괄적으로 상이한 종양 유형들에서의 임상 반응 유전자의 종양내 발현 수준의 범위에 걸쳐지는 종양내 RNA 수준의 범위를 나타내며; (4) 정규화 유전자 세트가 약 10개 내지 약 12개의 하우스키핑 유전자로 이루어진다.
이같은 대안적인 유전자 발현 플랫폼이 하기 실시예 2에 기술된 접근법을 따라 구축될 수 있다. 본 발명의 방법 및 시스템에서 유용한 대안적인 유전자 발현 플랫폼은 적어도 40, 45, 50 또는 55개의 표 1의 임상 반응 유전자 및 표 1에 없는 하나 이상의 추가적인 임상 반응 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 임상 반응 유전자 세트는 55 내지 57개 사이의 임의의 개수의 표 1의 임상 반응 유전자를 포함하고, 정규화 유전자 세트는 적어도 9개의 표 1의 정규화 유전자 및 표 1에 없는 적어도 하나의 하우스키핑 유전자를 포함한다.
IV. 유전자 시그너처 점수의 모델-기반 유도
피팅(fitted) 모델 계수를 사용하여 시그너처 점수를 결정할 다변량 통계 모델에 대한 입력 공변량 세트, 예를 들어 로지스틱 또는 콕스(Cox) 회귀에서의 선형 예측인자로서 전체 임상 반응 유전자 세트, 또는 이의 임의의 서브세트를 사용함으로써 유전자 시그너처 점수가 유도될 수 있다. 다변량 전략의 한 구체적인 예는 라쏘(lasso) 및 리지(ridge) 회귀의 벌점 사이의 하이브리드를 이용하는 벌점 회귀 접근법인 엘라스틱 넷(elastic net) 모델링 (Zou & Hastie, 2005, J.R . Statist Soc. B 67(2): 301-320; Simon et al., 2011, J. Statistical Software 39(5): 1-13)을 벌점 파라미터를 선택하기 위한 교차 검증과 함께 사용하는 것이다. 전부는 아니더라도 대부분의 임상 반응 유전자에 대한 RNA 발현 수준이 예측적일 것으로 예상되기 때문에, 한 실시양태에서, L1 벌점 파라미터가 매우 낮게 설정될 수 있어, 사실상 리지 회귀를 실행시킨다.
다변량 접근법은 암 적응증들에 걸친 데이터를 조합하는 메타 분석을 사용할 수 있거나, 또는 단일 암 적응증 내에서 적용될 수 있다. 어느 경우든, 분석은 항종양 반응을 종속 변수로 하여 시그너처 유전자의 정규화된 종양내 RNA 발현 수준을 입력 예측인자로서 사용할 것이다. 이같은 분석의 결과는 모델 피트에서 이용되는 환자로부터의 종양 샘플, 뿐만 아니라 미래의 환자로부터의 종양 샘플에 대한 시그너처 점수를 항종양 반응을 예측할 것으로 예상되는 시그너처 유전자의 정규화된 RNA 발현 수준에 대한 곱셈 계수의 숫자 조합으로서 알고리즘에 의해 규정한다. 유전자 시그너처 점수는 선택된 조정 파라미터 값에서의 엘라스틱 넷 모델 계수의 최종 추정값에 의해 지시되는 바와 같이, 시그너처 유전자의 선형 조합에 의해 결정된다. 구체적으로, 소정의 종양 샘플에 대해, 각각의 유전자에 대한 추정된 계수에 종양 샘플 내의 이러한 유전자의 정규화된 RNA 발현 수준을 곱한 후, 생성된 곱을 합산하여 이러한 종양 샘플에 대한 시그너처 점수가 산출된다. 엘라스틱 넷 이외의 다변량 모델-기반 전략을 유전자 시그너처 점수를 결정하는데 또한 사용할 수 있다.
이같은 모델-기반 시그너처 점수에 대한 대안은 단순 평균화 접근법의 사용일 것이고, 예를 들어, 각각의 종양 샘플에 대한 시그너처 점수가 항종양 반응과 양성으로 연관될 것으로 여겨지는 시그너처 유전자에 대한 이러한 샘플의 정규화된 RNA 발현 수준의 평균에서 항종양 반응과 음성으로 연관될 것으로 여겨지는 시그너처 유전자에 대한 이러한 샘플의 정규화된 RNA 발현 수준의 평균을 차감한 것으로서 규정될 것이다.
V. 본 발명의 유전자 시그너처 및 바이오마커의 유용성
본원에 기술된 시스템 및 방법을 사용하여 유도된 유전자 시그너처 및 유전자 시그너처 바이오마커는 PD-1 길항제로의 치료로부터 임상 이점을 달성할 가능성이 가장 높은 암 환자를 확인하는데 유용할 수 있다. 이러한 유용성은 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성으로 테스트되는지 또는 음성으로 테스트되는지를 기초로 환자가 선택되는 PD-1 길항제의 임상 시험, 환자의 유전자 시그너처 점수를 결정하거나 또는 환자를 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성 또는 음성으로 분류하기 위한 진단 방법 및 제품, 환자의 약물 요법을 환자의 유전자 시그너처 점수 또는 바이오마커 상태를 기초로 맞추는 것을 수반하는 개인화된 치료 방법, 뿐만 아니라 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성으로 테스트되는 환자를 치료하는 것에서 사용하기 위한 PD-1 길항제를 포함하는 제약 조성물 및 약품을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 연구 및 상업 용도에서 이같은 바이오마커를 사용하는 것을 뒷받침한다.
본원에서 청구되는 연구 및 상업 용도 중 임의의 것의 유용성은 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성으로 테스트되는 환자의 100％가 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응을 달성하는 것을 요구하지 않거나; 또는 모든 대상체에서 바이오마커의 존재 또는 부재를 결정하는 것에서 진단 방법 또는 키트에 특정한 정도의 특이도 또는 민감도가 있는 것을 요구하지 않거나, 또는 본원에서 청구되는 진단 방법이 모든 대상체에 대해 대상체가 PD-1 길항제에 대한 이로운 반응이 있을 가능성이 있는지 여부를 예측하는 것에서 100％ 정확한 것을 요구하지 않는다. 따라서, 본 발명가들은 용어 "결정하다", "결정하는", 및 "예측하는"이 확정적이거나 특정한 결과를 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다는 것을 의도한다; 그보다는, 이러한 용어들은 청구된 방법이 대상체의 적어도 대부분에 대해 정확한 결과를 제공한다는 것 또는 임의의 소정의 대상체에 대한 결과 또는 예측이 틀리기보다는 맞을 가능성이 더 높다는 것을 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
바람직하게는, 본 발명의 진단 방법이 제공하는 결과의 정확도는 숙련된 기술자 또는 규제 기관이 방법이 사용되는 특정 용도에 적절할 것으로 간주할 정확도이다.
유사하게, 청구된 약품 및 치료 방법의 유용성은 모든 암 환자에서 청구되거나 바람직한 효과가 생성되는 것을 요구하지 않는다; 모든 적용가능한 규범에 부합하는 자신의 전문적인 판단을 적용할 때 임상의가 청구된 방법에 따라 또는 청구된 조성물 또는 약품으로 소정의 환자의 치료하는 것의 청구된 효과를 달성할 기회를 결정하는 것이 요구될 뿐이다.
A. 유전자 시그너처 및 바이오마커에 대한 종양 샘플의 분석
대상체로부터 제거된 종양 조직의 샘플에서 유전자 시그너처 점수가 결정된다. 종양은 원발성 또는 재발성일 수 있고, 임의 유형 (상기 기술된 바와 같음), 임의 단계 (예를 들어, I기, II기, III기 또는 IV기, 또는 다른 단계화 시스템의 등가물), 및/또는 조직학의 종양일 수 있다. 대상체는 임의의 연령, 성별, 치료 이력 및/또는 정도, 및 완화 기간의 대상체일 수 있다.
외과적 절제, 흡인 또는 생검을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 절차로 종양 샘플을 수득할 수 있다. 조직 샘플을 절편화하여 신선한 검체로서 검정할 수 있거나, 대안적으로, 조직 샘플을 추가적인 절편화를 위해 냉동시킬 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 고정시키고 파라핀 등 내에 포매하는 것에 의해 조직 샘플이 보존된다.
통상적인 방법으로 종양 조직 샘플을 고정시킬 수 있고, 고정 기간은 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 좌우된다. 중성 완충 포르말린, 글루타르알데히드, 부앙(Bouin) 및 파라포름알데히드가 고정제의 비제한적인 예이다. 바람직한 실시양태에서, 포르말린으로 조직 샘플이 고정된다. 일부 실시양태에서, 고정된 조직 샘플이 또한 파라핀 내에 포매되어 FFPE 조직 샘플이 제조된다.
전형적으로, 조직 샘플을 일련의 상승 알콜로 고정 및 탈수시키고, 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질을 침윤시켜 이에 포매시킨다. 대안적으로, 먼저 종양 조직 샘플을 절편화한 후, 개별적인 절편을 고정시킨다.
일부 바람직한 실시양태에서, 현미경 슬라이드 상에 마운팅되고 건조된 약 3-4 밀리미터, 바람직하게는 4 마이크로미터의 FFPE 조직 절편을 사용하여 종양에 대한 유전자 시그너처 점수가 결정된다.
종양 조직의 적절한 샘플이 수득되었으면, 이를 분석하여 표 1의 각각의 유전자 또는 이로부터 유도된 유전자 시그너처에 대해 RNA 발현 수준을 정량한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "유전자의 RNA 발현 수준을 결정한다"는 문구는 이러한 유전자로부터 전사된 RNA를 검출 및 정량하는 것을 지칭한다. 용어 "RNA 전사체"는 유전자로부터 전사된 mRNA, 및/또는 이의 특정 스플라이싱 변이체 및/또는 이같은 mRNA 및 스플라이싱 변이체의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 1 유전자에 대한 RNA 전사체는 표 1에 열거된 표적 영역을 포함한다.
관련 분야의 기술자는 다수의 방법을 사용하여 분석을 위해 조직 샘플로부터 RNA를 단리할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 구아니디늄 이소티오시아네이트에서의 균질화 및 산 페놀-클로로포름 추출에 의해 동결 조직 샘플로부터 RNA를 단리할 수 있다. 시판 키트가 FFPE 샘플로부터 RNA를 단리하는데 이용가능하다.
종양 샘플이 유리 슬라이드 상의 FFPE 조직 절편이면, 단리된 전체 RNA보다는 전체 세포 용해물 상에서 유전자 발현 분석을 수행하는 것이 가능하다. 하기 실시예 1에 기술된 바와 같이 이러한 용해물을 제조할 수 있다.
관련 기술 분야의 기술자는 단리된 RNA 또는 전체 세포 용해물 내의 RNA 전사체의 수준을 검출 및 정량하는데 유용한 여러 방법을 또한 인지한다. 정량적 검출 방법은 어레이 (즉, 마이크로어레이), 정량적 실시간 PCR (RT-PCR), 다중 검정법, 뉴클레아제 보호 검정법, 및 노던 블롯 분석을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 이같은 방법들은 검출될 각각의 전사체의 일부분에 대해 상보적인 표지된 프로브를 이용한다. 이러한 방법에서 사용하기 위한 프로브는 유전자 및 이에 의해 발현되는 전사체의 공지된 서열을 기초로 쉽게 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 1의 유전자의 전사체를 검출하기 위한 프로브는 표 1에서 확인되는 이러한 유전자에 대한 표적 영역에 특이적으로 혼성화하도록 디자인된다. 프로브에 대한 적절한 표지는 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 형광, 화학발광 및 방사성 표지를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표 1의 유전자 또는 이로부터 유도된 유전자 시그너처의 발현에 대해 종양 샘플을 검정하는 것은 분자 비콘(beacon) 검출 분자와 조합된 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)을 사용하여 실시간으로 RNA 수준을 검출 및 정량하는 것을 이용한다. 예를 들어, 문헌 [Compton J., Nature 350 (6313):91-92 (1991)]에 NASBA가 기술되어 있다. NASBA는 단일 단계의 등온성 RNA-특이적 증폭 방법이다. 일반적으로, 이러한 방법은 하기의 단계들을 수반한다: RNA 주형이 반응 혼합물에 제공되고, 여기서 제1 프라이머가 이의 상보성 부위를 주형의 3' 끝부분에 부착한다; 역전사효소가 반대쪽의 상보적 DNA 가닥을 합성한다; RNAse H가 RNA 주형을 파괴한다 (RNAse H는 RNA-DNA 하이브리드 내의 RNA만 파괴하고, 단일 가닥 RNA는 파괴하지 않는다); 제2 프라이머가 DNA 가닥의 3' 끝부분에 부착되고, 역전사효소가 제2 DNA 가닥을 합성한다; T7 RNA 중합효소가 이중 가닥 DNA에 결합하고, 상보적 RNA 가닥을 생산하며, 이는 단계 1에서 다시 사용될 수 있어, 반응이 순환적이다.
다른 실시양태에서, 검정법 양식은 플랩(flap) 엔도뉴클레아제-기반 양식, 예컨대 인베이더(Invader)™ 검정법 (써드 웨이브 테크놀러지즈(Third Wave Technologies))이다. 인베이더 방법을 사용하는 경우에, 표적 부위에 대해 3'인 영역에 특이적인 서열을 함유하는 인베이더 프로브, 및 주형의 표적 부위에 대해 5'인 영역에 특이적인 서열 및 관련되지 않은 플랩 서열을 함유하는 제1 프로브가 제조된다. 그 후, 이러한 프로브들, 표적 분자, 뿐만 아니라 플랩 서열에 상보적인 서열 및 형광 염료 및 켄처 양쪽 모두로 표지된 자가-상보적 서열을 함유하는 FRET 프로브의 존재 하에 클리바제(Cleavase)가 작용하게 된다. 제1 프로브가 주형과 혼성화하면, 인베이더 프로브의 3' 끝부분이 표적 부위에 침투하고, 이러한 구조가 클리바제에 의해 절단되어, 플랩 해리가 초래된다. 플랩이 FRET 프로브에 결합하고, 형광 염료 부분이 클리바제에 의해 절단되어, 형광 방출이 초래된다.
또 다른 실시양태에서, 검정법 양식은 분지형 DNA (퀀티진(QuantiGene)™, 파노믹스(Panomics)) 또는 하이브리드 캡처(Hybrid Capture)™ (다이진(Digene))으로의 직접적인 mRNA 포착을 이용한다.
본 발명의 유전자 발현 플랫폼 내의 유전자의 발현을 측정하는데 사용하기에 적절한 어레이 기술의 한 예는 HTG 몰레큘러(HTG Molecular) (애리조나주 투손)가 판매하고 문헌 [Martel, R.R., et al., Assay and Drug Development Technologies 1(1):61-71, 2002]에 기술된 어레이플레이트(ArrayPlate)™ 검정법 기술이다. 간략하게, 이러한 기술은 뉴클레아제 보호 검정법과 어레이 검출을 조합한다. 마이크로플레이트 웰 내의 세포를 뉴클레아제 보호 검정법에 적용한다. 세포를 표적화된 mRNA 종에 결합하는 프로브의 존재 하에 용해시킨다. SI 뉴클레아제 첨가 시, 과량의 프로브 및 혼성화되지 않은 mRNA가 분해되어, mRNA:프로브 듀플렉스만 잔존한다. 알칼리성 가수분해가 듀플렉스의 mRNA 성분을 파괴하여, 프로브를 무손상으로 남긴다. 중화 용액을 첨가한 후, 프로세싱된 세포 배양 플레이트의 내용물을 프로그래밍된 어레이플레이트™로 칭해지는 또 다른 어레이플레이트™로 옮긴다. 어레이플레이트™는 각각의 웰의 바닥에 16-요소 어레이를 함유한다. 각각의 어레이 요소는 위치-특이적 앵커 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이는 한 검정법에서 다음 검정법까지 동일하게 잔존한다. 16개의 앵커 각각의 결합 특이성이 프로그래밍된 링커 올리고뉴클레오티드로 칭해지는 올리고뉴클레오티드로 변형되고, 이는 한쪽 끝부분에서는 앵커에 대해, 다른쪽 끝부분에서는 뉴클레아제 보호 프로브에 대해 상보적이다. 혼성화 반응 동안, 배양 플레이트로부터 옮겨진 프로브가 고정된 프로그래밍 링커에 의해 포착된다. 포착된 프로브는 검출 링커 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 의해 표지되고, 차례로 이는 페록시다제가 혼입된 검출 접합체로 표지된다. 효소에 화학발광 기질을 공급하고, 효소가 생산한 빛을 디지털 영상에서 포착한다. 어레이 요소에서의 빛 강도가 원래의 세포 내에 존재하는 상응하는 표적 mRNA의 양의 척도이다.
추가적인 예로서, DNA 마이크로어레이를 사용하여 유전자 발현을 측정할 수 있다. 간략하게, DNA 마이크로어레이 (DNA 칩으로도 칭해짐)는 규정된 패턴으로 고체 지지체 상에 배치된 DNA 단편, 예컨대 합성 올리고뉴클레오티드의 미시적인 어레이이고, 여기서 이들이 표준 혼성화 방법에 의한 분석을 받을 수 있다 (문헌 [Schena, BioEssays 18:427 (1996)]을 참조한다). 예시적인 마이크로어레이 및 이의 제작 및 사용 방법이 문헌 [T.R. Hughes et al., Nature Biotechnology 9:342-347 (2001)]에 기재되어 있다. 다수의 상이한 마이크로어레이 구성 및 이의 제조 방법이 관련 기술 분야의 기술자에게 공지되어 있고, 미국 특허 번호 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,445,934; 5,556,752; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,561,071; 5,571,639; 5,593,839; 5,624,711 ; 5,700,637; 5,744,305; 5,770,456; 5,770,722; 5,837,832; 5,856,101; 5,874,219; 5,885,837; 5,919,523; 6,022,963; 6,077,674; 및 6,156,501; 문헌 [Shena, et al., Tibtech 6:301-306, 1998]; [Duggan, et al., Nat. Genet. 2:10-14, 1999]; [Bowtell, et al., Nat. Genet. 21:25-32, 1999]; [Lipshutz, et al., Nat. Genet. 21:20-24, 1999]; [Blanchard, et al., Biosensors and Bioelectronics 77:687- 90, 1996]; [Maskos, et al., Nucleic Acids Res. 2:4663-69, 1993]; 및 [Hughes, et al., Nat. Biotechnol . 79:342-347, 2001]에 개시되어 있다. 다양한 용도에서 어레이를 사용하는 방법을 기술하는 특허는 미국 특허 번호 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,848,659; 및 5,874,219를 포함하고, 이들의 개시내용은 본원에서 참고로 포함된다.
한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 어레이가 고체 지지체 상에 합성될 수 있다. 예시적인 고체 지지체는 유리, 플라스틱, 중합체, 금속, 메탈로이드, 세라믹, 유기물질 등을 포함한다. 칩 차폐 기술 및 광보호 화학을 사용하여, 핵산 프로브의 정렬된 어레이를 생성시킬 수 있다. 예를 들어 "DNA 칩" 또는 초대규모 고정형 중합체 어레이 ("VLSIPS®" 어레이)로 알려진 이러한 어레이들은 약 1 ㎠ 내지 수 ㎠ 면적의 기판 상에 수백만 개의 규정된 프로브 영역을 포함할 수 있고, 이에 의해 수 개 내지 수백만 개의 프로브가 혼입된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,631,734를 참조한다).
발현 수준을 비교하기 위해, 표지된 핵산을 표적 핵산과 어레이 상의 프로브 사이의 결합에 충분한 조건 하에 어레이와 접촉시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 원하는 수준의 혼성화 특이성을 제공하도록 혼성화 조건, 즉, 표지된 핵산과 마이크로어레이 상의 프로브 사이에서 혼성화가 발생하기에 충분한 조건을 선택할 수 있다.
혼성화는 본질적으로 특이적인 혼성화를 허용하는 조건에서 수행될 수 있다. 핵산의 길이 및 GC 함량이 열 융점을 결정할 것이고, 따라서 프로브가 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 것을 수득하기 위해 필요한 혼성화 조건을 결정할 것이다. 이러한 요인들은 관련 기술 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 또한 검정법에서 테스트될 수 있다. 핵산 혼성화에 대한 광범위한 안내를 문헌 [Tijssen, et al., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed.; Elsevier, N.Y. (1993)]에서 확인할 수 있다. 상기 기술된 방법은 표지된 표적 핵산의 혼성화 패턴이 어레이 표면 상에 생산되는 것을 초래할 것이다. 표적 핵산의 특정 표지를 기초로 선택되는 특정 검출 방식으로, 표지 핵산의 초래된 혼성화 패턴을 다양한 방식으로 가시화 또는 검출할 수 있다. 대표적인 검출 수단은 섬광 카운팅, 자가방사선술, 형광 측정, 열계량 측정, 광 방출 측정, 광 산란 등을 포함한다.
한 이같은 검출 방법은 시판되는 어레이 스캐너 (어피메트릭스(Affymetrix), 캘리포니아주 산타클라라), 예를 들어, 417® 어레이어(Arrayer), 418® 어레이 스캐너(Array Scanner), 또는 애질런트 진 어레이® 스캐너(Agilent Gene Array® Scanner)를 사용한다. 이러한 스캐너는 인터페이스 및 사용이 용이한 소프트웨어 툴이 있는 시스템 컴퓨터로부터 제어된다. 출력물을 다양한 소프트웨어 어플리케이션 내로 직접적으로 불러올 수 있거나 또는 이에 의해 직접적으로 읽을 수 있다. 예시적인 스캐닝 장치가, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,143,854 및 5,424,186에 기술되어 있다.
표 1에 열거된 유전자에 대해 전사체 존재도(abundance)를 측정하는 바람직한 검정 방법은 나노스트링® 테크놀러지즈(NanoString® Technologies) (미국 워싱턴주 시애틀)가 판매하는 엔카운터(nCounter)® 분석 시스템을 이용한다. 문헌 [Geiss et al., Nature Biotechnol. 2(3):317-325 (2008)]에 기술된 이러한 시스템은 검출될 전사체에 대해 상보적인 35- 내지 50-염기 서열을 각각 포함하는 한 쌍의 프로브, 즉 포착 프로브 및 리포터 프로브를 이용한다. 포착 프로브는 데이터 수집을 위해 복합체가 고정되게 하는 고정 태그, 예를 들어 친화력 태그에 커플링된 짧은 공통 서열을 추가적으로 포함한다. 리포터 프로브는 검출가능한 신호 또는 표지를 추가적으로 포함하고, 예를 들어, 색별 태그에 커플링된다. 혼성화 후, 과량의 프로브가 샘플로부터 제거되고, 혼성화된 프로브/표적 복합체가 카트리지 내의 친화력 또는 기타 태그를 통해 정렬 및 고정된다. 그 후, 예를 들어 디지털 분석기 또는 이러한 목적으로 개조된 기타 프로세서를 사용하여, 샘플을 분석한다. 일반적으로, 각각의 전사체 상의 색별 태그를 카운팅하고, 각각의 표적 전사체에 대해 표로 만들어서, 샘플 내의 각각의 전사체의 발현 수준이 산출된다. 이러한 시스템은 나노스트링이 디자인한 포착 및 리포터 프로브를 사용하여 단일한 복합 검정법에서 수백 개의 독특한 유전자 전사체의 발현을 측정하게 한다.
본원에 기술된 표 1의 임상 반응 유전자의 발현을 측정하는 것에서, 종양 샘플 내의 각각의 유전자의 절대적인 발현이 대조군에 비교된다; 예를 들어, 대조군은 각각 대상체 풀 내의 각각의 유전자의 평균 발현 수준일 수 있다. 그러나, 비교 민감도를 증가시키기 위해, 바람직하게는 발현 수준 값이 다수의 방식으로 변환된다.
본원에 기술된 유전자 발현 플랫폼의 임상 반응 유전자의 미처리 발현 값을 하기 중 임의의 것에 의해 정규화할 수 있다: 통상적인 기준 분포에 대한 분위수 정규화, 하우스키핑 유전자 세트의 평균 RNA 수준, 백분위수, 예를 들어, 75 백분위수에 의존하는 전체 정규화, 또는 관련 기술 분야의 기술자에게 공지된 다른 생물학적으로 관련되는 정규화 접근법.
예를 들어, 각각의 임상 반응 유전자의 발현 수준을 유전자 발현 플랫폼 내의 모든 유전자의 평균 RNA 발현 수준에 의해 또는 정규화 유전자, 예를 들어, 하우스키핑 유전자의 세트의 평균 발현 수준에 의해 정규화할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 유전자 발현 플랫폼 내의 유전자가 프로브 세트에 의해 표시되고, 각각의 유전자의 RNA 발현 수준이 표시된 유전자 모두에 걸친, 즉 본원에 기술된 유전자 발현 플랫폼 내의 모든 임상 반응 및 정규화 유전자에 걸친 평균 또는 중앙값 발현 수준에 의해 정규화된다. 구체적 실시양태에서, 유전자 발현 플랫폼 내의 모든 유전자의 RNA 발현의 중앙값 또는 평균 수준으로 나눔으로써 정규화가 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 임상 반응 유전자의 RNA 발현 수준이 정규화 유전자 세트의 발현의 평균 또는 중앙값 수준에 의해 정규화된다. 구체적 실시양태에서, 정규화 유전자는 하우스키핑 유전자를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 측정된 수준을 정규화 유전자의 중앙값 또는 평균 발현 수준으로 나눔으로써 임상 반응 유전자에 대한 측정된 RNA 발현 수준의 정규화가 달성된다.
유전자 시그너처 내의 개별적인 유전자의 발현 수준이 종양 샘플들의 풀 내의 동일한 유전자의 발현에 비교되면 유전자 시그너처 점수의 민감도가 증가될 수 있다. 바람직하게는, 비교는 샘플들의 풀 내의 각각의 시그너처 유전자의 평균 또는 중앙값 발현 수준에 대한 것이다. 이는 샘플 내의 유전자와 풀 전체 내의 유전자 사이의 발현에서의 상대적인 차이를 강조하는 효과가 있어, 비교를 절대적인 발현 수준을 단독으로 사용하는 것보다 더욱 민감하게, 그리고 의미있는 결과를 생성시킬 가능성이 더 높게 한다. 발현 수준 데이터는 임의의 통상적인 방식으로 변환될 수 있고, 바람직하게는 모든 유전자에 대한 발현 수준 데이터가 평균 또는 중앙값을 취하기 전에 로그 변환된다.
풀에 대한 비교를 수행하는 것에서, 2가지 접근법을 사용할 수 있다. 첫째로, 샘플로부터 유래되는 핵산 및 풀로부터 유래되는 핵산이 단일 실험 과정 동안 혼성화되어, 샘플 내의 시그너처 유전자의 발현 수준이 풀 내의 이러한 유전자의 발현 수준에 비교될 수 있다. 이같은 접근법은 각각의 비교 또는 제한된 횟수의 비교를 위해 새로운 핵산 풀이 생성되는 것을 필요로 하고, 따라서 이용가능한 핵산의 양에 의해 제한된다. 대안적으로, 그리고 바람직하게는, 풀에서의 발현 수준 (정규화 및/또는 변환 여부를 불문함)이 컴퓨터 또는 컴퓨터에서 판독가능한 매체 상에 저장되어 샘플로부터의 개별적인 발현 수준 데이터에 대한 비교에서 사용된다 (즉, 단일-채널 데이터).
대상체의 종양 샘플을 표준물 또는 대조군과 비교할 때, 샘플 내의 특정 유전자의 발현 값이 표준물 또는 대조군 내의 이러한 유전자의 발현 값에 비교된다. 본 발명의 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자에 대해, 표준물 또는 대조군에 비교하여 개별적인 샘플 내의 발현 값에 대해 log(10) 비가 생성된다. 시그너처 내의 유전자의 평균 log(10) 비를 결정함으로서 유전자 시그너처에 대한 점수가 계산된다. 테스트 샘플에 대한 유전자 시그너처 점수가 이러한 유전자 시그너처에 대한 미리 정해진 역치 이상이면, 샘플이 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성인 것으로 간주된다. 미리 정해진 역치는 표준물 또는 대조군으로서 사용된 샘플 선집 또는 풀링된 샘플에서의 이러한 유전자 시그너처에 대한 점수의 평균, 중앙값 또는 백분위수일 수도 있다.
관련 기술 분야의 기술자는 값이 유전자의 전사체 존재도의 객관적인 치수를 나타내는 한, log(10) 비 이외의 다른 상이한 발현 값이 시그너처 점수를 계산하는데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예는 xdev, 오차-가중 log (비), 및 평균 차감 log(강도)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
조직 샘플을 수득하는 단계, 유전자 발현을 검정하기 위해 이로부터 하나 이상의 조직 절편을 제조하는 단계, 검정법을 수행하는 단계, 및 결과를 채점하는 단계 각각은 별개의 개체에 의해 별개의 장소에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 외과의가 생검에 의해 암 환자의 종양으로부터 조직 샘플을 수득한 후, 조직 샘플을 병리학 실험실로 보낼 수 있고, 실험실의 기술자가 조직 샘플을 고정한 후, 검정법을 위한 하나 이상의 슬라이드 (각각 단일한 조직 절편이 있음)를 제조할 수 있다. 슬라이드(들)를 제조 직후에 검정할 수 있거나, 또는 추후의 검정법을 위해 보관할 수 있다. 조직 절편을 제조한 실험실이 검정법을 수행할 수 있거나, 또는 슬라이드(들)를 다른 실험실로 보내 검정법을 수행할 수 있다. 유전자 시그너처에 대해 슬라이드(들)를 채점하는 기술자는 진단 실험실에서 일할 수 있거나, 또는 독립적인 계약자일 수 있다. 대안적으로, 단일한 진단 실험실이 대상체의 의사 또는 외과의로부터 조직 샘플을 수득한 후, 조직 절편 제조, 슬라이드(들) 검정 및 조직 절편(들)에 대한 유전자 시그너처 점수 계산에서 수반되는 모든 단계를 수행한다.
일부 실시양태에서, 조직 절편의 제조 및 유전자 시그너처 또는 유전자 시그너처 바이오마커에 대한 검정에서 수반되는 개체는 샘플이 테스트되는 대상체의 신원을 모른다; 즉, 실험실이 받는 샘플은 실험실로 보내지기 전에 일부 방식으로 익명화된다. 예를 들어, 샘플은 단순히 숫자 또는 일부 다른 코드 ("샘플 ID")에 의해서 확인될 수 있고, 검정법의 결과는 샘플 ID를 사용하여 테스트를 주문한 관계자에게 보고된다. 바람직한 실시양태에서, 대상체의 신원과 대상체의 조직 샘플 사이의 연계는 개체 또는 개체의 의사에게만 알려진다.
일부 실시양태에서, 테스트 결과가 수득된 후, 진단 실험실이 테스트 보고서를 작성하고, 이는 하기 결과 중 임의의 하나 또는 양쪽 모두를 포함할 수 있다: 조직 샘플이 바이오마커 양성 또는 음성이었음, 종양 샘플에 대한 유전자 시그너처 점수 및 이러한 유전자 시그너처에 대한 기준 점수. 테스트 보고서는 검정법에서 발현이 분석된 유전자의 목록을 또한 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 테스트 보고서는 대상체가 PD-1 길항제에 반응할 가능성이 있는지를 예측하기 위해 결과를 해석하는 방법에 관한 지침을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 테스트된 종양 샘플이 흑색종으로부터의 것이고, 이의 유전자 시그너처 점수가 미리 특정된 역치 이상이면, 테스트 보고서는 대상체가 PD-1 길항제로의 치료에 대한 반응 또는 더욱 양호한 반응과 연관되는 점수를 갖는다는 것을 가리킬 수 있는 한편, 유전자 시그너처 점수가 역치 미만이면, 테스트 보고서는 환자가 PD-1 길항제로의 치료에 대한 무반응 또는 불량한 반응과 연관되는 점수를 갖는다는 것을 가리킨다.
일부 실시양태에서, 테스트 보고서는 진단 실험실에서 작성한 문서이고, 출력물로서 또는 전자 메일을 통해 환자 또는 환자의 의사에게 보내진다. 다른 실시양태에서, 테스트 보고서는 컴퓨터 프로그램에 의해 생성되고, 의사의 진료실에서 비디오 모니터 상에 디스플레이된다. 테스트 보고서는 테스트 결과를 의사의 진료소에서 환자 또는 환자의 의사 또는 위임된 고용인에게 직접적으로 구두 전달하는 것을 포함할 수도 있다. 유사하게, 테스트 보고서는 의사가 환자의 파일 내에 작성하는 테스트 결과의 기록을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 유전자 발현 플랫폼 또는 유전자 시그너처 내의 유전자의 발현에 대해 종양 샘플을 검정하는 것은 이러한 목적을 위해 특수하게 디자인된 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 키트는 표 1에 열거된 표적 전사체의 세트에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 18 유전자 업-다운 시그너처의 유전자 및 표 1C의 정규화 유전자에 대해 표 1에 열거된 표적 전사체의 세트에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프로브 세트는 고체 표면, 예컨대 마이크로칩, 실리카 비드 (예컨대 일루미나(Illumina) (캘리포니아주 샌디에고)로부터의 비드어레이(BeadArray) 기술), 또는 유리 슬라이드 상의 올리고뉴클레오티드의 정렬된 어레이를 포함할 수 있다 (예를 들어, WO 98/20020 및 WO 98/20019를 참조한다). 일부 실시양태에서, 액체 또는 건조 형태의 하나 이상의 조성물에서 올리고뉴클레오티드 프로브가 제공된다.
본 발명의 키트 내의 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 표적 영역, 예를 들어, RNA 전사체 또는 이로부터 생성된 cDNA에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 특이적 혼성화는 올리고뉴클레오티드가 특정한 혼성화 조건 하에 표적 영역과 역평행 이중가닥 구조를 형성하는 한편, 비-표적 영역과는 동일한 혼성화 조건 하에 폴리뉴클레오티드와 함께 인큐베이션되었을 때 이같은 구조를 형성하지 못하는 것을 의미한다. 키트 내의 각각의 올리고뉴클레오티드의 조성 및 길이는 표적 영역을 함유하는 전사체의 성질, 뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드로 수행될 검정법의 유형에 좌우될 것이고, 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정된다.
일부 실시양태에서, 키트 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 이의 표적 영역의 완벽한 상보물이다. 분자들 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 상응하는 위치에서의 뉴클레오티드에 대해 상보적이면, 올리고뉴클레오티드를 또 다른 핵산 분자의 "완벽한" 또는 "완전한" 상보물이라고 한다. 완전한 상보성 올리고뉴클레오티드가 표 1 유전자의 전사체를 검출하는데 바람직하지만, 완전한 상보성으로부터의 이탈도 그 이탈로 인해 분자가 상기 정의된 바와 같이 표적 영역에 특이적으로 혼성화하는 것이 방지되지 않는 경우 고려된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브는 이의 5' 끝부분 또는 3' 끝부분에 하나 이상의 비-상보적 뉴클레오티드가 있을 수 있고, 프로브의 나머지는 표적 영역에 완전히 상보적이다. 대안적으로, 생성된 프로브가 여전히 특이적으로 표적 영역에 혼성화할 수 있는 한 비-상보적 뉴클레오티드가 프로브 내로 산재될 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 키트 내의 각각의 올리고뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에 이의 표적 영역에 특이적으로 혼성화한다. 엄격한 혼성화 조건은 서열-의존적이고, 상황에 따라 다르다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮게 선택된다. Tm은 표적 서열에 대해 상보적인 프로브의 50％가 평형 상태에서 표적 서열에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서의 온도)이다. 일반적으로 표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서, 프로브의 50％가 평형 상태에서 차지된다.
전형적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 적어도 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)의 염 농도를 포함하고, 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해 온도는 적어도 약 25℃이다. 탈안정화제 예컨대 포름아미드의 첨가로 엄격한 조건이 또한 달성될 수 있다. 예를 들어, 5×SSPE (750 mM NaCl, 50 mM 인산나트륨, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25-30℃의 온도의 조건이 대립유전자-특이적 프로브 혼성화에 적절하다. 추가적인 엄격한 조건을 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]의 제7장, 제9장 및 제11장, 및 [NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, A PRACTICAL APPROACH, Haymes et al., IRL Press, Washington, D.C., 1985]에서 확인할 수 있다.
엄격한 혼성화 조건의 한 비제한적인 예는 약 65-70℃에서의 4× 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 내에서의 혼성화 (또는 별법적으로 약 42-50℃에서의 4× SSC + 50％ 포름아미드 내에서의 혼성화)에 이어서 약 65-70℃에서 1× SSC에서 1회 이상 세정하는 것을 포함한다. 고도로 엄격한 혼성화 조건의 비제한적인 예는 약 65-70℃에서의 1× SSC 내에서의 혼성화 (또는 별법적으로 약 42-50℃에서의 1× SSC + 50％ 포름아미드 내에서의 혼성화)에 이어서 약 65-70℃에서 0.3× SSC에서 1회 이상 세정하는 것을 포함한다. 감소된 엄격도의 혼성화 조건의 비제한적인 예는 약 50-60℃에서의 4× SSC 내에서의 혼성화 (또는 별법적으로 약 40-45℃에서의 6× SSC + 50％ 포름아미드 내에서의 혼성화)에 이어서 약 50-60℃에서 2× SSC에서 1회 이상 세정하는 것을 포함한다. 상기 열거된 값, 예를 들어, 65-70℃ 또는 42-50℃에 대해 중간인 범위에서의 엄격도 조건 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. SSPE (1×SSPE는 0.15 M NaC1, 10 mM NaH2PO4, 및 1.25 mM EDTA, pH 7.4이다)가 혼성화 및 세정 완충제에서 SSC (1× SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트르산나트륨이다)를 대체할 수 있다; 세정은 혼성화가 완료된 후 각각 15분 동안 수행된다.
길이가 염기쌍 50개 미만으로 예상되는 하이브리드에 대한 혼성화 온도는 하이브리드의 용융 온도 (Tm)보다 5-10℃ 낮아야 하고, 여기서 Tm은 하기 식에 따라 결정된다. 길이가 염기쌍 18개 미만인 하이브리드의 경우, Tm (℃) = 2(A + T 염기의 #) + 4(G + C 염기의 #)이다. 길이가 염기쌍 18개 내지 49개인 하이브리드의 경우, Tm (℃) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(％G+C)-(600/N)이고, 식 중 N은 하이브리드 내의 염기의 수이고, [Na+]는 혼성화 완충제 내의 나트륨 이온의 농도이다 (1× SSC에 대한 [Na+] = 0.165 M).
본 발명의 키트 내의 올리고뉴클레오티드는 임의의 인산화 상태의 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 및 무고리형 뉴클레오티드 유도체, 및 기능적으로 등가인 기타 유도체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드는 포스페이트가 없는 백본을 가질 수 있고, 이는 카르복시메틸, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 폴리아미드 (펩티드 핵산 (PNA)) 등과 같은 연결을 포함할 수 있다 (Varma, MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, A COMPREHENSIVE DESK REFERENCE, Meyers, ed., pp. 6 17-20, VCH Publishers, Inc., 1995). 올리고뉴클레오티드는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 화학적 합성에 의해 제조될 수 있거나, 또는, 예를 들어, 제한 소화에 의해, 생물학적 샘플로부터 유도될 수 있다. 방사성 표지, 형광 표지, 효소 표지, 단백질, 합텐, 항체, 서열 태그 등의 사용을 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 기술에 따라, 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 표지를 함유할 수 있다. 키트 내의 올리고뉴클레오티드는 분석물 특이적 시약 (ASR)으로서 제작 및 판매될 수 있거나, 또는 승인된 진단 장치의 구성 성분일 수 있다.
본 발명의 키트는 다른 시약 예컨대 혼성화 완충제 및 특정 표적 분자와의 혼성화가 발생하는 경우에 검출하기 위한 시약을 또한 함유할 수 있다. 검출 시약은 비오틴- 또는 형광-태그가 부착된 올리고뉴클레오티드 및/또는 효소-표지 항체 및 효소가 이에 작용할 때 검출가능한 신호를 생성시키는 하나 이상의 기질을 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 생물학적 또는 화학적 활성을 보존하고 검정법에서의 올바른 사용을 허용하기 위해 적합한 경우 검정법을 수행하기 위한 올리고뉴클레오티드 세트 및 시약이 키트 용기 내에 놓인 별개의 저장소에서 제공될 것임을 이해할 것이다.
다른 실시양태에서, 키트 내의 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 모든 다른 시약은 표 1의 유전자, 또는 표 2의 유전자 시그너처 내의 유전자 및 표 1C의 정규화 유전자의 FFPE 종양 절편 내의 종양 RNA 발현 수준을 정량하도록 디자인된 검정법에서의 최적의 성능에 대해 품질이 테스트되었다. 일부 실시양태에서, 키트는 정량된 RNA 발현 수준으로부터 유전자 시그너처 점수를 계산하는 방법을 기술하는 사용 설명서를 포함한다.
B. 제약 조성물, 약품 및 치료 체계
본원에 기술된 방법 및 제품 중 임의의 것으로 치료될 개체는 종양으로 진단된 인간 대상체이고, 본원에 기술된 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 유도된 유전자 시그너처 바이오마커의 존재 또는 부재에 대해 테스트하는 것에서 사용하기 위해 대상체의 종양의 샘플이 입수가능하거나 수득가능하다.
종양 조직 샘플은 대상체가 하나 이상의 치료 처치 체계, 예를 들어, PD-1 길항제, 화학요법제, 방사선 요법에 노출되기 전 및/또는 후에 대상체로부터 수집될 수 있다. 따라서, 종양 샘플은 대상체로부터 일정 기간에 걸쳐 수집될 수 있다. 외과적 절제, 흡인 또는 생검을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 절차로 종양 샘플을 수득할 수 있다.
의사는 PD-1 길항제 또는 다른 화학요법제(들)로의 치료에 감수성인 암 유형으로 진단된 환자를 치료하는 방법을 결정하는 것에서 유전자 시그너처 점수를 지침으로서 사용할 수 있다. PD-1 길항제 또는 다른 화학요법제(들)로의 치료를 시작하기 전에, 전형적으로 의사는 환자로부터 제거된 종양 조직 샘플이 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성인지 또는 음성인지를 결정하는 진단 테스트를 주문할 것이다. 그러나, 1차 용량의 PD-1 길항제 또는 다른 화학요법제(들)가 개체에게 투여된 후의 임의의 시점에 의사가 1차 또는 후속 진단 테스트를 주문할 수 있는 것으로 생각된다. 일부 실시양태에서, 의사는 환자의 종양이 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성으로 테스트되는 환자에 대해 지시되는 제약 제품으로 환자를 치료할지 여부를 고려 중일 수 있다. 예를 들어, 보고된 점수가 PD-1 길항제로의 치료에 대한 반응 또는 더욱 양호한 반응과 연관되는 미리 특정된 역치 점수 이상이면, 환자가 적어도 PD-1 길항제 (임의적으로, 하나 이상의 화학요법제와 조합됨)를 포함하는 치료 체계로 치료되고, 보고된 유전자 시그너처 점수가 PD-1 길항제로의 치료에 대한 무반응 또는 불량한 반응과 연관되는 미리 특정된 역치 점수 미만이면, 환자가 어떠한 PD-1 길항제도 포함하지 않는 치료 체계로 치료된다.
임의의 개별적인 환자를 치료하는데 유전자 시그너처 테스트 결과를 사용하는 방법을 결정하는 것에서, 의사는 다른 관련된 상황, 예컨대 암의 병기, 환자의 체중, 성별 및 일반적인 상태를 또한 고려할 수 있고, 이는 이러한 요인들 및 유전자 시그너처 바이오마커 테스트 결과의 조합을 의사가 요법 및/또는 이러한 요법으로의 치료 체계를 선택하는데 도움이 되는 모델에 입력하는 것을 포함한다.
의사는 바이오마커 양성으로 테스트되는 환자를 PD-1 길항제 및 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함하는 조합 요법 체계로 치료하는 것을 선택할 수 있다. 추가적인 치료제는, 예를 들어, 화학요법제, 생물치료제 (VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 다른 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CD-40L, GITR, CTLA-4, OX-40, 4-1BB, 및 ICOS에 대한 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 면역원성 작용제 (예를 들어, 약독화된 암성 세포, 종양 항원, 항원 제시 세포 예컨대 종양 유래 항원 또는 핵산이 펄싱된(pulsed) 수지상 세포, 면역 자극 시토카인 (예를 들어, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 GM-CSF와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 면역 자극 시토카인을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포)일 수 있다.
화학요법제의 예는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 예컨대 에네딘 항생제 (예를 들어 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 파이I1, 예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조; 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 에네딘 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀; 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬 작용제, 예컨대 타목시펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤(Fareston))을 예를 들어 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM); 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 아로마타제 효소를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트, 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸, 레트로졸, 및 아나스트로졸; 및 항-안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 또한 포함된다.
바이오마커 양성 환자를 치료하는데 사용되는 조합 요법의 각각의 치료제는 표준 제약 관례에 따라 단독으로 또는 이러한 치료제 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함하는 약제 (본원에서 제약 조성물로도 지칭됨)에서 투여될 수 있다.
바이오마커 양성 환자를 치료하는데 사용되는 조합 요법의 각각의 치료제는 동시에 (즉, 동일한 약제에서), 동반적으로 (즉, 임의 순서로 하나가 투여된 직후에 다른 것이 투여되는 별개의 약제에서), 또는 임의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 조합 요법의 치료제들이 상이한 투여 형태 (한 작용제는 정제 또는 캡슐이고, 또 다른 작용제는 무균 액체임)이고/이거나 상이한 투약 일정으로 투여되는 경우, 예를 들어, 적어도 매일 투여되는 화학요법제 및 덜 빈번하게, 예컨대 매주 1회, 2주마다 1회, 또는 3주마다 1회로 투여되는 생물치료제의 경우, 순차 투여가 특히 유용하다.
일부 실시양태에서, 조합 요법의 치료제 중 적어도 하나는 치료제가 동일한 암을 치료하기 위해 단독요법으로서 사용되는 경우에 전형적으로 사용되는 것과 동일한 투여량 체계 (용량, 빈도 및 치료 기간)을 사용하여 투여된다. 다른 실시양태에서, 조합 요법의 치료제 중 적어도 하나는 치료제가 단독요법으로서 사용될 때보다 더 낮은 총량, 예를 들어, 더 적은 용량, 덜 빈번한 용량, 및/또는 더 짧은 치료 기간으로 환자에게 제공된다.
바이오마커 양성 환자를 치료하는데 사용되는 조합 요법의 각각의 치료제는 경구로, 또는 정맥내, 근육내, 복막내, 피하, 직장, 국소 및 경피 투여 경로를 포함하는 비경구로 투여될 수 있다.
PD-1 길항제는 종양을 제거하는 수술 전 또는 후에 환자에게 투여될 수 있고, 방사선 요법 전, 동안 또는 후에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, PD-1 길항제는 이전에 생물치료제 또는 화학요법제로 치료되지 않은 환자, 즉 치료 경험이 없는 환자에게 투여된다. 다른 실시양태에서, PD-1 길항제는 생물치료제 또는 화학요법제로의 선행 요법 후에 지속 반응을 달성하지 못한 환자, 즉 치료 경험이 있는 환자에게 투여된다.
PD-1 길항제를 포함하는 요법은 촉진에 의해 또는 관련 기술 분야에 널리 공지된 영상화 기술, 예컨대 MRI, 초음파, 또는 CAT 스캔에 의해 발견되기에 충분히 큰 종양을 치료하는데 전형적으로 사용된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 요법은 치수가 적어도 약 200 ㎣, 300 ㎣, 400 ㎣, 500 ㎣, 750 ㎣, 또는 최대 1000 ㎣인 진행성 병기의 종양을 치료하는데 사용된다.
PD-1 길항제를 포함하는 요법에 대한 투여량 체계 (본원에서 투여 체계로도 지칭됨)를 선택하는 것은 물질의 혈청 또는 조직 교체율, 증상 수준, 물질의 면역원성, 및 치료되는 개체에서의 표적 세포, 조직 또는 기관의 접근성을 포함하는 여러 요인에 좌우된다. 바람직하게는, 투여량 체계는 허용가능한 부작용 수준에 부합하여 환자에게 전달되는 PD-1 길항제의 양을 최대화한다. 따라서, 용량 및 투약 빈도는 특정 PD-1 길항제, 사용될 임의의 다른 치료제, 및 치료 중인 암의 중증도, 및 환자 특징에 부분적으로 좌우된다. 항체, 시토카인 및 소형 분자의 적합한 용량을 선택하는 것에서의 지침이 입수가능하다. 예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK]; [Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY]; [Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY]; [Baert et al. (2003) New Engl . J. Med . 348:601-608]; [Milgrom et al. (1999) New Engl . J. Med . 341:1966-1973]; [Slamon et al. (2001) New Engl . J. Med . 344:783-792]; [Beniaminovitz et al. (2000) New Engl . J. Med . 342:613-619]; [Ghosh et al. (2003) New Engl . J. Med . 348:24-32]; [Lipsky et al. (2000) New Engl . J. Med . 343:1594-1602]; [Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed)]; [Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002)]을 참조한다. 적합한 투여량 체계의 결정은, 예를 들어, 관련 기술 분야에서 치료에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있거나 또는 추정되거나, 또는 치료에 영향을 미칠 것으로 예상되는 파라미터 또는 인자를 사용하여, 임상의에 의해 이루어질 수 있고, 예를 들어, 환자의 임상 병력 (예를 들어, 선행 요법), 치료될 암의 유형 및 병기, 및 조합 요법의 치료제 중 하나 이상에 대한 반응의 바이오마커에 좌우될 것이다.
PD-1 길항제와 조합되어 사용되는 생물치료제는 연속 주입에 의해, 또는, 예를 들어, 매일, 격일, 1주에 3회, 또는 매주, 2주, 3주, 매월, 2개월에 1회 등의 간격의 용량에 의해 투여될 수 있다. 총 매주 용량은 일반적으로 체중 1 ㎏ 당 적어도 0.05 ㎍/kg, 0.2 ㎍/kg, 0.5 ㎍/kg, 1 ㎍/kg, 10 ㎍/kg, 100 ㎍/kg, 0.2 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg 또는 이를 초과하는 값이다. 예를 들어, 문헌 [Yang et al. (2003) New Engl . J. Med . 349:427-434]; [Herold et al. (2002) New Engl . J. Med . 346:1692-1698]; [Liu et al. (1999) J. Neurol . Neurosurg. Psych. 67:451-456]; [Portielji et al. (20003) Cancer Immunol . Immunother. 52:133-144]을 참조한다.
항-인간 PD-1 mAb를 PD-1 길항제로서 사용하는 일부 실시양태에서, 투약 체계는 항-인간 PD-1 mAb를 치료 과정 전체에 걸쳐 약 14일 (± 2일) 또는 약 21일 (± 2일) 또는 약 30일 (± 2일)의 간격으로 1, 2, 3, 5 또는 10 mg/kg의 용량으로 투여하는 것을 포함할 것이다.
항-인간 PD-1 mAb를 PD-1 길항제로서 사용하는 다른 실시양태에서, 투약 체계는 항-인간 PD-1 mAb를 환자내 용량을 상승시키면서 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로 투여하는 것을 포함할 것이다. 다른 상승 용량 실시양태에서, 용량들 사이의 간격은 점진적으로 짧아질 것이고, 예를 들어, 제1 용량과 제2 용량 사이의 약 30일 (± 2일), 제2 용량과 제3 용량 사이의 약 14일 (± 2일)이다. 특정 실시양태에서, 용량 간격은 제2 용량 이후의 용량에 대해 약 14일 (± 2일)일 것이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 PD-1 길항제 중 임의의 것을 포함하는 약제의 정맥내 (IV) 주입이 대상체에게 투여될 것이고, 이같은 투여는 PD-1 길항제를 단독요법 체계로서 또는 조합 요법의 일부로서 사용하는 치료 체계의 일부일 수 있다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, PD-1 길항제는 니볼루맙이고, 이는 1 mg/kg Q2W, 2 mg/kg Q2W, 3 mg/kg Q2W, 5 mg/kg Q2W, 10 mg Q2W, 1 mg/kg Q3W, 2 mg/kg Q3W, 3 mg/kg Q3W, 5 mg/kg Q3W, 및 10 mg Q3W로 이루어진 군으로부터 선택되는 용량으로 정맥내 투여된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, PD-1 길항제는 펨브롤리주맙이고, 이는 200 mg Q3W, 1 mg/kg Q2W, 2 mg/kg Q2W, 3 mg/kg Q2W, 5 mg/kg Q2W, 10 mg Q2W, 1 mg/kg Q3W, 2 mg/kg Q3W, 3 mg/kg Q3W, 5 mg/kg Q3W, 및 10 mg Q3W 또는 이러한 용량 중 임의의 것의 등가물 (예를 들어, 펨브롤리주맙의 PK 모델은 200 mg Q3W의 고정 용량이 2 mg/kg Q3W로 수득되는 것과 일치하는 노출을 제공한다고 추정한다)로 이루어진 군으로부터 선택되는 용량으로 액체 약제로서 투여된다. 일부 특히 바람직한 실시양태에서, 펨브롤리주맙은 10 mM 히스티딘 완충제 pH 5.5 내의 25 mg/ml 펨브롤리주맙, 7％ (w/v) 수크로스, 0.02％ (w/v) 폴리소르베이트 80을 포함하는 액체 약제로서 투여되고, 선택된 용량의 약제는 30분의 기간에 걸쳐 IV 주입에 의해 투여된다. 임의의 다른 치료제와 조합된 펨브롤리주맙에 대한 최적 용량은 용량 상승에 의해 확인될 수 있다.
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 PD-1 길항제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약제를 또한 제공한다. PD-1 길항제가 생물치료제, 예를 들어, mAb인 경우, 통상적인 세포 배양 및 회수/정제 기술을 사용하여 CHO 세포에서 길항제를 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체를 PD-1 길항제로서 포함하는 약제는 액체 제형으로서 제공될 수 있거나, 또는 동결건조된 분말을 사용 전에 주사용 무균수로 재구성시킴으로써 제조될 수 있다. WO 2012/135408에 펨브롤리주맙을 포함하는 액체 및 동결건조 약제의 제조가 기술되어 있고, 이는 본 발명에서 사용하기에 적절하다. 일부 바람직한 실시양태에서, 펨브롤리주맙을 포함하는 약제는 약 50 mg의 펨브롤리주맙을 함유하는 유리 바이알에서 제공된다.
하기에 열거된 예시적인 구체적 실시양태를 포함하여 본 발명의 이러한 측면 및 기타 측면이 본원에 함유된 교시내용으로부터 명백할 것이다.
VI. 본 발명의 예시적인 구체적 실시양태
1. (a) 관심 종양 유형으로 진단된 환자 코호트 내의 각각의 환자로부터 치료-전 종양 샘플을 수득하는 단계;
(b) 코호트 내의 각각의 환자에 대해, PD-1 길항제로의 치료 후의 항종양 반응 값을 수득하는 단계;
(c) 유전자 발현 플랫폼 내의 각각의 유전자에 대해 각각의 종양 샘플 내의 미처리 RNA 수준을 측정하고,
여기서 유전자 발현 플랫폼은 약 50개 내지 약 60개의 유전자의 임상 반응 유전자 세트 및 약 10개 내지 약 12개의 하우스키핑 유전자의 정규화 유전자 세트를 포함하고, 여기서 임상 반응 유전자의 약 90％는 항종양 반응과 양성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내고, 임상 반응 유전자의 약 10％는 항종양 반응과 음성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내는 것인 단계;
(d) 각각의 종양 샘플에 대해, 임상 반응 유전자에 대한 각각의 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하는 단계;
(e) 각각의 종양 샘플 및 관심 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자에 대해, 이러한 유전자에 대한 미리 규정된 곱셈 계수를 사용하여, 정규화된 RNA 발현 수준에 가중치를 주는 단계;
(f) 각각의 환자에 대해, 가중된 RNA 발현 수준을 합산하여 코호트 내의 각각의 환자에 대한 유전자 시그너처 점수를 생성시키는 단계; 및
(g) 모든 종양 샘플에 대한 유전자 시그너처 점수 및 코호트 내의 모든 환자에 대한 항종양 반응 값을 비교하여, 표적 바이오마커 임상 유용성 기준을 충족시키도록 환자 코호트를 분리하는 유전자 시그너처 점수에 대한 차단값을 선택하는 단계
를 포함하는, 적어도 하나의 관심 종양 유형에 대해 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응을 예측하는 유전자 시그너처 바이오마커를 도출하는 방법.
2. 실시양태 1에 있어서, 유전자 시그너처 점수가 선택된 차단값 이상인 종양 유형의 임의의 종양 샘플을 바이오마커 양성으로 지정하고, 유전자 시그너처 점수가 선택된 차단값 미만인 종양 유형의 임의의 종양 샘플을 바이오마커 음성으로 지정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3. (a) 유전자 발현 플랫폼 내의 각각의 유전자에 대해 종양 샘플 내의 미처리 RNA 수준을 측정하고, 여기서 유전자 발현 플랫폼은 약 50개 내지 약 60개의 유전자의 임상 반응 유전자 세트 및 약 10개 내지 약 12개의 하우스키핑 유전자의 정규화 유전자 세트를 포함하고, 여기서 임상 반응 유전자의 약 90％는 항종양 반응과 양성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내고, 임상 반응 유전자의 약 10％는 항종양 반응과 음성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내는 것인 단계;
(b) 종양 유형에 대한 미리 규정된 유전자 시그너처 내의 각각의 임상 반응 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하고, 여기서 미리 규정된 유전자 시그너처가 적어도 2개의 임상 반응 유전자로 이루어지는 것인 단계;
(c) 미리 규정된 곱셈 계수를 사용하여 각각의 정규화된 RNA 값에 가중치를 주는 단계;
(d) 가중된 RNA 발현 수준을 합산하여 유전자 시그너처 점수를 생성시키는 단계;
(e) 생성된 점수를 유전자 시그너처 및 종양 유형에 대한 기준 점수에 비교하는 단계; 및
(f) 종양 샘플을 바이오마커 양성 또는 바이오마커 음성으로 분류하고,
여기서 생성된 점수가 기준 점수 이상이면, 종양 샘플을 바이오마커 양성으로 분류하고, 생성된 점수가 기준 점수 미만이면, 종양 샘플을 바이오마커 음성으로 분류하는 단계
를 포함하는, 특정 종양 유형으로 진단된 환자로부터 제거된 종양 샘플을 PD-1 길항제에 대한 이러한 종양 유형의 항종양 반응의 유전자 시그너처 바이오마커의 존재 또는 부재에 대해 테스트하는 방법.
4. (i) 임상 반응 유전자의 세트 및 정규화 유전자의 세트로 이루어지는 유전자 발현 플랫폼 내의 각각의 유전자의 미처리 RNA 발현 수준을 측정하기 위한 샘플 분석기, 및
(ii) (a) 종양 유형에 대한 미리 규정된 유전자 시그너처 내의 각각의 임상 반응 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하고;
(b) 미리 규정된 곱셈 계수를 사용하여 각각의 정규화된 RNA 값에 가중치를 주고;
(c) 가중된 RNA 발현 수준을 합산하여 유전자 시그너처 점수를 생성시키고;
(d) 생성된 점수를 유전자 시그너처 및 종양 유형에 대한 기준 점수에 비교하고;
(e) 종양 샘플을 바이오마커 양성 또는 바이오마커 음성으로 분류하고, 여기서 생성된 점수가 기준 점수 이상이면, 종양 샘플을 바이오마커 양성으로 분류하고, 생성된 점수가 기준 점수 미만이면, 종양 샘플을 바이오마커 음성으로 분류하기 위한,
측정된 RNA 발현 수준을 수신 및 분석하기 위한 컴퓨터 프로그램
을 포함하는, 특정 종양 유형으로 진단된 환자로부터 제거된 종양 샘플을 PD-1 길항제에 대한 이러한 종양 유형의 항종양 반응의 유전자 시그너처 바이오마커의 존재 또는 부재에 대해 테스트하기 위한 시스템.
5. 실시양태 1 내지 4 중 임의의 것에 있어서, 유전자 발현 플랫폼이 적어도 40, 45, 50 또는 55개의 표 1의 임상 반응 유전자 및 표 1에 없는 하나 이상의 추가적인 임상 반응 유전자를 포함하는 방법 또는 시스템.
6. 실시양태 1 내지 5 중 임의의 것에 있어서, 임상 반응 유전자 세트가 55 내지 57개 사이의 임의의 개수의 표 1의 임상 반응 유전자를 포함하고, 정규화 유전자 세트가 적어도 9개의 표 1의 정규화 유전자 및 표 1에 없는 적어도 하나의 하우스키핑 유전자를 포함하는 방법 또는 시스템.
7. 실시양태 1 내지 6 중 임의의 것에 있어서, 임상 반응 유전자 세트가 표 1A 및 표 1B의 57개의 임상 반응 유전자로 이루어지는 방법 또는 시스템.
8. 실시양태 1 내지 7 중 임의의 것에 있어서, 정규화 유전자 세트가 표 1C의 유전자로 이루어지는 방법 또는 시스템.
9. 실시양태 1 내지 8 중 임의의 것에 있어서, 항종양 반응 값이 부분 반응, 완전 반응, 최상의 전체 반응, 무진행 생존 기간, 무질환 생존 기간, 객관적 반응률 및 중앙값 전체 생존으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법 또는 시스템.
10. 실시양태 1 내지 9 중 임의의 것에 있어서, 항종양 반응 값이 RECIST 1.1 또는 irRC로 측정된 바와 같은 부분 반응 또는 완전 반응인 방법 또는 시스템.
11. 실시양태 1 내지 10 중 임의의 것에 있어서, 항종양 반응 값이 환자가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10회로 이루어진 군으로부터 선택된 다수의 용량의 PD-1 길항제로 치료된 후에 수득되는 방법 또는 시스템.
12. 실시양태 1 내지 11 중 임의의 것에 있어서, PD-1 길항제가 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 바이오시밀러 또는 펨브롤리주맙 변이체인 방법 또는 시스템.
13. 실시양태 1 내지 12 중 임의의 것에 있어서, 항종양 반응 값이 적어도 4회의 200 mg 용량의 펨브롤리주맙을 Q3W마다 투여한 후에 수득되는 방법 또는 시스템.
14. 실시양태 1 내지 13 중 임의의 것에 있어서, 관심 유전자 시그너처 또는 미리 규정된 유전자 시그너처가 표 2에 열거된 유전자 시그너처로부터 선택되는 방법 또는 시스템.
15. 실시양태 1 내지 14 중 임의의 것에 있어서, 종양 유형이 방광암, 유방암, 투명세포 신장암, 두경부 편평 세포 암종, 폐 편평세포 암종, 악성 흑색종, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암, 소세포 폐암 (SCLC), 지방육종, 삼중 음성 유방암, 급성 림프모구 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), EBV-양성 DLBCL, 원발성 종격 거대 B-세포 림프종, T-세포/조직구-풍부 거대 B-세포 림프종, 소포 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 외투 세포 림프종 (MCL), 다발성 골수종 (MM), 골수 세포 백혈병-1 단백질 (Mcl-1), 골수형성이상 증후군 (MDS), 비-호지킨 림프종 (NHL), 버킷 림프종 또는 소림프구성 림프종 (SLL)인 방법 또는 시스템.
16. 실시양태 1 내지 15 중 임의의 것에 있어서, 종양 유형이 방광암, 결장직장암, 위암, 두경부암, 흑색종, 비-소세포 폐암, 난소암, 전립선암 또는 신암인 방법 또는 시스템.
17. 실시양태 1 내지 16 중 임의의 것에 있어서, 종양 유형이 방광암, 위암, 두경부암 또는 흑색종인 방법 또는 시스템.
18. 실시양태 1 내지 17 중 임의의 것에 있어서, 임상 반응 유전자 세트가 표 1A 및 표 1B의 57개의 임상 반응 유전자로 이루어지고, 정규화 유전자 세트가 표 1C 또는 표 1D의 유전자로 이루어지며, 각각의 임상 반응 유전자에 대한 미리 규정된 곱셈 계수가 (i) 정수 1이거나 또는 (ii) 표 3A의 세트 1.1, 세트 1.2, 세트 2.2, 세트 2.3 및 세트 2.4에서 제시된 상응하는 채점 가중치인 방법 또는 시스템.
19. (a) 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자에 대해 종양 샘플 내의 미처리 RNA 수준을 측정하고, 여기서 유전자 시그너처가 표 3B에 기재된 14-유전자 업-다운 시그너처 및 18-유전자 업-다운 시그너처로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계:
(b) 선택된 시그너처 내의 각각의 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준을 표 1C에 기재된 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하는 단계;
(c) 각각의 정규화된 RNA 값에 선택된 시그너처에 대한 표 3B에 기재된 상응하는 채점 가중치 세트를 곱하여, 가중된 RNA 발현 값을 생성시키는 단계; 및
(d) 가중된 RNA 발현 값을 합산하여 유전자 시그너처 점수를 생성시키는 단계
를 포함하는, 환자로부터 제거된 종양 샘플을 테스트하여 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응과 상관되는 유전자 시그너처에 대한 시그너처 점수를 생성시키는 방법.
20. 실시양태 18 또는 19에 있어서, PD-1 길항제가 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 바이오시밀러 또는 펨브롤리주맙 변이체인 방법.
21. 실시양태 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 항종양 반응이 무진행 생존, 부분 반응 또는 완전 반응인 방법.
22. 실시양태 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 종양 샘플이 항문암, 담관암, 방광암, 결장직장암, 식도암, 위암, 두경부암, 난소암 및 삼중 음성 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로부터의 것인 방법.
23. 실시양태 22에 있어서, 암이 환자가 PD-1 길항제 이외의 요법으로 치료된 후에 진행된 방법.
24. 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙인 시스템 또는 방법.
25. (a) 표 1A, 1B 및 1C에 열거된 표적 전사체
(b) 하기 표 2.1에 열거된 표적 전사체
<표 2.1>
Figure pct00007
로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 전사체의 세트에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 포함하는, 유전자 시그너처 내의 유전자의 발현을 정량인하기 위한 키트.
실시예
실시예 1. FFPE 조직으로부터의 총 RNA의 단리, 및 이어지는 나노스트링 엔카운터 ™ 시스템을 사용한 유전자 발현 분석
본 실시예는 하기 실시예에서 논의되는 FFPE 종양 샘플 내의 유전자 발현을 분석하는데 사용되는 방법을 기술한다. 나노스트링 엔카운터™ 유전자 발현 플랫폼 (나노스트링 테크놀러지즈, 워싱턴주 시애틀)에서의 분석을 위해 FFPE 조직의 슬라이드로부터 전체 RNA를 단리하였다. RNA 추출 전에, 전체 조직 절편을 슬라이드로부터 마크로절단하고/긁어 내고, 200 ㎕의 100％ 에탄올을 함유하는 표지된 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 각각의 샘플에 새로운 스캘펄을 사용하여 교차 오염 가능성을 방지하였다. 그 후, FFPE 조직용 앰비온® 리커버올™ 전체 핵산 단리 키트(Ambion® RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE tissue) (카탈로그 번호 AM1975)의 권장 프로토콜을 사용하여 샘플에서 파라핀을 제거하고 프로테아제로 소화시켰다. 상기 언급된 앰비온 리커버올™ 키트 (카탈로그 번호 AM1975)를 사용하여 제조사의 권장 설명서에 따라 전체 RNA 추출을 수행하였다. 나노스트링 엔카운터™ 시스템을 사용하여 유전자 발현 프로파일링을 수행할 때까지 전체 RNA를 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2. 본 발명의 바람직한 유전자 발현 플랫폼의 구축
본 발명가들은 표 1에 제시된 유전자 발현 플랫폼에 대한 57개의 임상 반응 유전자를 이러한 유전자 세트가 펨브롤리주맙으로의 치료에 대한 상이한 종양 유형들의 임상 결과를 예측할 수 있다는 증거의 축적을 기초로 선택하였다.
이러한 유전자들은 680개의 유전자 (657개의 후보 임상 반응 유전자 및 23개의 하우스키핑 유전자)의 발견 세트로부터 확인되었다. 후보 임상 반응 유전자는 하기 출처로부터 유래되었다: 1) 인간 종양의 대형 세트에 대한 유전자 발현 데이터베이스로부터 유래된 PD-L1에 대한 공동발현이 있는 면역 시그너처로부터의 유전자; 2) T 세포 생물학, 면역 조절, 종양-침윤 림프구 (TIL) 및 종양-연관 대식세포 (TAM)의 세포 마커에서 수반되는 것으로 공지된 유전자; 및 3) 마우스의 항-마우스 PD-1 mAb로의 치료에 대한 반응이 있는 동계(syngeneic) 종양 마우스 모델로부터의 시그너처. 종양 샘플 내의 이러한 680개의 발견 유전자 세트의 유전자 발현을 검정하기 위한 프로브의 코드세트를 나노스트링으로부터 수득하였다.
흑색종 코호트의 종양 샘플 내의 680 발견 세트의 치료-전 유전자 발현 수준의 분석으로 "PD-L1", "IFNg", 및 "확장형 면역" 시그너처로 명명된 3개의 유전자 시그너처가 생성되었고, 이들은 펨브롤리주맙에 대한 항종양 반응과 통계적으로 유의한 연관을 나타냈다. 제2 흑색종 코호트에서의 확인적 가설 검정에서 이러한 3개의 시그너처 각각이 펨브롤리주맙으로의 항종양 반응과 통계적으로 유의한 연관을 나타냈다는 것이 실연되었다.
680-유전자 발견 유전자 세트의 추가 분석은 항원 제시 및 T-세포 수용체 (TCR) 신호전달에 수반되는 유전자가 임상 종점 중 일부에 대한 낮은 거짓 발견율 (FDR)을 달성하여 흑색종 샘플에서의 가장 예측적인 특색 중 일부인 것으로 보였음을 가리켰다. 이러한 발견들을 사용하여 펨브롤리주맙의 임상 시험에 참여하는 환자 코호트로부터의 독립적인 세트의 두경부 (H&N) 치료-전 종양 샘플에서 추가로 테스트하기 위한 이전의 3개의 시그너처에 추가될 추가적인 시그너처를 규정하였다.
H&N 종양 샘플을 테스트하기 전에, 흑색종 환자의 항종양 반응을 예측하는 능력에 기여하는 것으로 발견되지 않은 일부 개별적인 유전자를 제거함으로써, 이전에 규정된 유전자 시그너처 ("PD-L1", "IFNg", 및 "확장형" 면역)를 정련하였다. 이러한 정련 후, 이러한 3개의 시그너처는 상기 표 2의 상응하는 열에 제시된 유전자로 이루어졌다. H&N 연구의 1차 목표는 항종양 반응과 정련된 유전자 시그너처 사이의 연관에 대해 추가로 테스트하는 것이었다. 하기 표 4에 제시된 바와 같이, 독립적인 H&N 종양 세트에서의 가설 검정에서 이러한 시그너처 모두가 펨브롤리주맙에 대한 항종양 반응의 예측인자였음이 확증되었다.
<표 4>
두경부암에서의 표 2에 열거된 유전자 시그너처 중 4개에 대한 가설 검정 결과
Figure pct00008
이러한 4개의 미리 특정된 유전자 시그너처, 뿐만 아니라 680 유전자 발견 세트 내의 657개의 후보 임상 반응 유전자의 세트의 개별적인 구성원 유전자의 분석은 두경부암에서 다수의 유전자에 대해 약간의 매우 낮은 추정 거짓 발견율을 나타냈다. 따라서 본 발명가들은 다른 종양 유형에 대한 치료-전 유전자 발현 데이터 및 펨브롤리주맙 치료 후의 항종양 반응 데이터를 사용하는 것에 의해 추가적인 고도로 연관된 유전자를 포착하기 시작하였다.
처음에, 본 발명가들은 흑색종 및 두경부 코호트로부터의 치료-전 유전자 발현 및 치료-후 반응 데이터만 사용하여 원형 임상 반응 유전자 세트에 대한 유전자 51개의 세트를 확인하였다. 이러한 51개의 유전자를 하기의 방식으로 수득하였다. 하기의 어느 임상 결과와 양성 연관을 나타낸 모든 유전자의 합집합을 취함으로써 유전자를 선택하였다:
1. 하기의 임상 결과 척도 3개: 최대 ％ 종양 수축, 최상의 전체 반응 (BOR), 및 PFS 모두에 대해 H&N에 대해 발견 유전자 세트에 걸쳐 추정 FDR ≤ 25％를 달성하였거나; 또는
2. 하기의 임상 결과 척도 3개: BOR, PFS, 및 OS 모두에 대해 흑색종에 대해 발견 유전자 세트에 걸쳐 추정 FDR ≤ 33％를 달성하였거나; 또는
3. 표 2에 제시된 바와 같은 PD-L1, IFNg, 확장형 면역, 또는 TCR 신호전달 시그너처에 포함된 것.
그 후, 유전자 51개의 이러한 예비 세트를 미리 특정된 임상 반응 유전자 세트로서 방광암 및 위암 코호트에서 테스트하였고, 이는 연관의 통계적 유의성 면에서 발견 유전자 세트 내의 나머지 유전자와 현저하게 상이한 것으로 확인되었다.
임상 반응 유전자의 고도로 예측적인 유전자 세트가 확인되었음이 입증된 후, 펨브롤리주맙으로 치료된 3가지 종양 유형 (위, 방광 및 두경부)으로부터의 치료-전 유전자 발현 및 임상 반응 데이터를 사용하여 이러한 세트를 정련하도록 메타 분석 실험에 착수하였다. 항종양 반응의 척도로서 PFS에 초점을 두고, 두경부, 방광 및 위 코호트를 사용하여, 가장 연관된 유전자를 이해하기 위해 이러한 코호트들로부터의 데이터를 함께 풀링한 전체 680-유전자 발견 플랫폼의 메타 분석을 수행하였다.
1) 먼저, 메타-분석으로부터 p-값 순위화에 의해 상위 100개의 최고 연관 특색에 나타나지 않았고, 또한 유전자 B2M 또는 표 2의 시그너처 (위 코호트에서의 테스트했을 때 확인된 시그너처) 중 임의의 것의 구성원 유전자가 아닌, 예비 51-유전자 목록의 일부분인 10개의 유전자를 제거하고,
2) 3개 모두의 적응증에 걸친 다변량 분석에 의해 확인된 16개의 새로운 예측 유전자를 추가함으로써
임상 반응 유전자의 최종 유전자 세트를 수득하였다. 따라서, 유전자 57개의 최종 세트를 확인하였고, 여기에 11개의 하우스키핑 유전자를 추가하여 표 1에 제시된 68-유전자 발현 플랫폼이 산출되었다.
임상 반응 유전자 세트 내의 반-상관 유전자 서브세트의 존재는 2가지 역할을 수행하도록 의도된다: 유전자 시그너처의 잠재적인 구성원으로서의 역할 및 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응과 연관되는 주요 면역 패턴이 예상대로 행동하는지를 점검하기 위한 대조군으로서의 역할. 이러한 대조군 기능의 유용성을 두경부암 코호트에서 표 1B에 열거된 음성으로 상관되는 유전자 서브세트 및 표 2에 열거된 MIPFS 7-유전자 시그너처에 대한 유전자 발현 패턴의 자율 클러스터링 분석을 수행함으로써 평가하였다. 결과가 도 1에서 제시된다. 표 1 임상 반응 유전자 모두 또는 이러한 유전자 중 37개의 서브세트의 정규화된 RNA 발현 수준에 대한 공분산 패턴을 69개의 흑색종 종양에서 다른 암 유형의 다중 종양에 대비하여 분석함으로써 다른 종양 유형에 대한 유전자 시그너처 및 유전자 시그너처 바이오마커를 유도하기 위한 이러한 플랫폼의 잠재적인 유용성을 조사하였다. 분석된 환자 종양 샘플 및 표 1 임상 반응 유전자의 수가 하기 표 5에서 제시된다. 37 유전자 서브세트는 CCL5, CCR5, CD2, CD27, CD274, CD276, CD3E, CD3G, CD4, CTAG1B, CXCL10, CXCL9, EGFR, GRAP2, GZMB, GZMK, HLA-DRA, HLA-E, IDO1, IFNG, IKZF3, IL10R, IL2RB, IL2RG, IRF8, LAG3, LCK, P2RY8, PDCD1LG2, PSMB10, SLC2A1, STAT1, TIGIT, TNFRSF14, TNFSF13B, TSLP 및 ZAP70으로 이루어졌다. 표 1의 11개의 정규화 유전자의 평균에 의해 RNA 발현 수준을 정규화하였다.
<표 5>
흑색종 대 다른 종양 유형에서의 임상 반응 유전자에 대한 RNA 발현 수준의 공분산의 평가
Figure pct00009
도 2a 내지 2i에 나타난 바와 같이, 시험된 표 1 임상 반응 유전자에 대해 공분산 패턴이 크게 보존된다.
실시예 3. 표 1의 유전자 발현 플랫폼을 사용한 유전자 시그너처 점수의 모델-기반 유도
40명의 두경부암 환자, 29명의 방광암 환자 및 33명의 위암 환자에 대해 치료-후 PFS 시간 및 표 1의 57 임상 반응 유전자 세트의 정규화된 치료-전 종양내 RNA 발현 수준에서 콕스 PFS 엘라스틱 넷 메타 분석을 수행하였다. 57개 모두의 임상 반응 유전자를 모델 (사실상 리지 회귀) 내에 포함하도록 L1 벌점은 0.001로 설정되었고, 교차 검증을 사용하여 L2 벌점 값을 선택하였다. 모델은 PFS 분포에서의 적응증 특이적 차이 및 환자 수행 상태의 적응증 특이적 효과를 포착하는 항목에 더하여 57개의 유전자 각각에 대한 계수를 포함하였다. 이러한 회귀를 피팅하기 전에, 하우스키핑-정규화 유전자 발현 수준을 이의 평균에 의해 중심화하였고, 이의 표준 편차에 의해 척도화하였다 (각각의 암 적응증에서). 도 3의 X축에 플롯팅된 최종 시그너처 점수는 교차 검증 피트로부터의 위험 함수의 "선형 예측인자"이고, 사실상 하우스키핑-정규화 유전자 (중심화 및 척도화됨)의 선형 조합이며, 여기서 57개의 유전자에 대한 추정 모델 계수 (및 동일한 그래프 내에 상이한 적응증들을 플롯팅하기 위해 필요한 적응증 특이적 모델 항목)에 의해 가중이 특정된다. 도 3은 환자의 PFS 시간에 대해 플롯팅된 메타 분석에서 이용된 환자에 대한 모델-유도 유전자 시그너처 점수를 나타낸다.
위 코호트에 대해 상기에서 유도된 유전자 시그너처 점수를 또한 코호트 내의 반응자 상태에 의해 비교하였고, 결과가 도 4에서 제시된다.
도 5는 이러한 위암 코호트에서의 이러한 모델-기반 유전자 시그너처에 대한 잠재적인 차단값에 대한 ROC 곡선을 나타낸다. ROC 곡선하 면적은 0.86이고, 유덴 지수(Youden Index) (곡선 상에 표지됨) 기반 차단값과 연관되는 통계는 하기와 같다: PPV 57％, NPV 95％, 및 차단값 초과의 유병률 42％.
그 후, 모델 피트에 의해 특정된 57개의 유전자의 선형 조합을 각각의 적응증에서 사용하여, 하기 실시예 4에서 논의된 바와 같이, 항종양 반응 척도 중 하나를 사용하여 임상 유용성 프로파일을 추정하는 것에 의해 또는 수용자 조작 특성 (ROC) 곡선을 통해 적합한 차단값을 선택할 수 있다.
일단 이같은 모델-기반 접근법을 사용하여 추정되면, 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자에 대한 가중치를 모델을 다시 피팅하지 않으면서 미래의 환자에 대해 유전자 시그너처 점수를 계산하는 시스템의 일부로서 사용할 수 있고, 즉, 가중치가 고정된 것으로 간주된다.
실시예 4. 본 발명의 유전자 발현 플랫폼으로부터 유도된 유전자 시그너처 점수에 대한 차단값의 유도
도 6은 잠재적인 차단값이 점점 더 큰 값으로 설정될 때의 항종양 반응 값으로 최상의 전체 반응 (BOR)을 사용하는 두경부암에서의 IFNg 시그너처에 대한 유전자 시그너처 점수의 추정된 임상 진단 유용성 프로파일을 나타낸다. 시그너처 점수를 조건으로 하여 반응 확률을 기술하는 로지스틱 회귀 모델과 조합된 IFNg 시그너처 점수의 경험적 분포를 사용하여 PPV (시그너처 점수 ≥ 차단값인 환자에서의 반응률), NPV (시그너처 점수 < 차단값인 환자에서의 무반응률), 및 시그너처 점수 ≥ 차단값인 환자의 유병률에 대한 프로파일을 계산하였다. 이러한 프로파일을 소정의 차단값을 선택하는 것의 영향을 이해하는데 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, IFNg 유전자 시그너처 점수의 임상 유용성 프로파일은 ~0.3의 차단값이 ~90％ NPV, ~40％ PPV를 달성할 것이고, H/N 환자의 ~25％의 고-바이오마커 아군 유병률을 초래할 것임을 시사한다. 대안적으로, ~0.10의 차단값은 ~92％ NPV, ~33％ PPV, 및 ~40％의 고-바이오마커 아군 유병률을 달성할 것이다. ROC 곡선 분석을 이러한 임상 유용성 평가와 조합하여, 차단값 선택, 및 PD-1 길항제로의 치료에 대해 반응자를 선택하고 비-반응자를 배제하는 것에 대한 민감도 및 특이도의 이해를 도울 수 있다.
이러한 실시예는 어떻게 유전자 시그너처, 예컨대 표 2에 열거된 IFNg 유전자 시그너처가 점수 생성 및 PD-1 길항제로의 치료가 암 환자에게 이로울 가능성이 더 높은지 여부를 구별하는 차단값의 설정에 이용될 수 있는지를 실연한다. 실시예 3에 기술된 바와 같은 모델-기반 유전자 시그너처 점수 또한 이같은 유용성 분석에 대한 입력물일 수 있다.
실시예 5. 표 1의 유전자 발현 플랫폼에 대한 예시적인 채점 방법의 유도.
본 실시예는 표 3에 열거된 2개의 시그너처 채점 가중치 세트의 유도 및 유용성을 기술한다. 각각의 채점 가중치 세트에 이의 각각의 메타-분석 내에 포함하는 중복되는 암 조직학이 있었다. 양쪽 세트에 대해, 채점 방법에 대한 입력물은 표 1의 57개의 개별적인 임상 반응 유전자의 정규화된 RNA 발현 수준의 세트였다. 시그너처 내의 각각의 임상 반응 유전자 및 표 1C의 각각의 정규화 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준의 log(10) 변환을 수행하고, 정규화 유전자의 log10 변환 RNA 수준의 산술 평균을 계산하고, 계산된 평균을 각각의 임상 반응 유전자에 대한 log10 변환 RNA 수준에서 차감함으로써, 측정된 (예를 들어, 미처리) RNA 발현 값을 정규화하였고, 이러한 정규화된 값 (적응증 내에서의 어떠한 추가 표준화도 없음)이 엘라스틱 넷 피팅에 대한 입력물이었다. 추가적으로, 하기의 경우 모두에, 사용된 엘라스틱 넷 모델은 조직학, 기준선 수행 상태, 및 조직학과 기준선 수행 사이의 상호작용에 대한 항목을 포함하였다 (그리고, 엘라스틱 넷 하에 적용된 벌점화가 모델 추정 동안 이러한 항목에 또한 적용되었다).
제1 채점 방법 세트는 MK-3475-012/KEYNOTE-012 (이하 KEYNOTE-012)로부터의 두경부 (H&N) 암, 위암, 및 방광암 환자를 이용하여 유도되었다. 이러한 연구는 진행성 삼중 음성 유방암 (TNBC) (코호트 A), H&N 암 (코호트 B 및 B2), 진행성 요로상피암 (코호트 C), 또는 진행성 위암 (코호트 D) 환자에서 펨브롤리주맙 (MK-3475)의 안전성, 허용성 및 항종양 활성을 조사하고 있는 1b상 다중-코호트 연구이다. 이러한 제1 채점 알고리즘 세트를 유도하는데 이용된 환자 모두가 2주마다 1회 IV 투여된 10 mg/kg 펨브롤리주맙으로 치료되었다.
제2 채점 방법 세트는 KEYNOTE-012로부터의 H&N 암, 위암, 방광암, 및 삼중 음성 유방암 환자 및 MK-3475-028/KEYNOTE-028 (이하 KEYNOTE-028)로부터의 항문암, 담관암, 결장직장암, 식도암, 및 난소암 환자를 이용하여 유도되었다. KEYNOTE-028은 불치성인 진행성 PD-L1-양성 고형 종양이 있는 참가자에게 투여된 펨브롤리주맙의 효능 및 안정성을 평가하도록 디자인된 1b상 연구이다. KEYNOTE-028의 환자는 2주마다 1회 IV 투여된 10 mg/kg 펨브롤리주맙으로 치료된다.
채점 세트 1의 설명:
세트 1.1. 고정된 저수준의 L1 벌점을 무진행 생존 (PFS)의 콕스 메타 분석에서 사용한 엘라스틱 넷 피트와 L2 벌점을 결정하기 위한 교차 검증 하에서 유도된 선형 조합. 선택된 값의 L1 및 L2 벌점에서의 최종 콕스 PFS 모델 피트로부터의 회귀 계수를 이의 각각의 유전자에 곱한 후, 생성된 가중된 값을 합산하여 시그너처 점수가 생성된다. 이러한 회귀 계수 값, 즉, 가중치가 표 3A에서 세트 1.1 하에 열거된다.
세트 1.2. 고정된 저수준의 L1 벌점을 최상의 전체 반응 (BOR)의 로지스틱 회귀 메타 분석에서 사용한 엘라스틱 넷 피트와 L2 벌점을 결정하기 위한 교차 검증 하에서 유도된 선형 조합. 선택된 값의 L1 및 L2 벌점에서의 최종 로지스틱 모델 피트로부터의 회귀 계수를 이의 각각의 유전자에 대한 정규화된 RNA 발현 수준에 곱한 후, 생성된 가중된 값을 합산하여 시그너처 점수가 생성된다. 이러한 회귀 계수 값, 즉, 가중치가 표 3A에서 세트 1.2 하에 열거된다.
KEYNOTE-012로부터의 3가지 암 코호트 (H&N, 위 및 방광)를 사용하여 세트 1.1 및 1.2의 회귀 계수가 확인되었다. 이러한 채점 가중치 세트들이 펨브롤리주맙에 대한 항종양 반응을 예측하는 시그너처 점수를 생성시킬 수 있다는 가설을 검정하기 위해, 이러한 채점 가중치 세트들을 펨브롤리주맙 치료 전에 KEYNOTE-028 환자로부터 제거된 종양 샘플에 대해 결정된, 57 유전자 시그너처에 대한 정규화된 RNA 값으로부터 시그너처 점수를 계산하는데 적용하였다. 표 6에 나타난 바와 같이, 채점 가중치 세트 1.1 또는 1.2를 사용하여 수득된 시그너처 점수가 다양한 암에 걸린 KEYNOTE-028로부터의 환자들의 독립적인 세트에서 예측적이었다. 이러한 결과는 세트 1.1 또는 세트 1.2에서의 채점 가중치를 사용하여 계산된 시그너처 점수가 다른 암 유형에 대한 유전자 시그너처 바이오마커를 유도하는데 유용할 것임을 가리킨다.
<표 6>
KEYNOTE-028 환자에서의 57-유전자 시그너처 점수의 통계적 유의성.
Figure pct00010
채점 세트 1은 KEYNOTE-028로부터의 임상 반응 데이터의 입수가능성 전에 유도되었다. 이러한 가중 세트에 대한 잠재적인 개선을 탐구하기 위해, KEYNOTE-012 및 KEYNOTE-028로부터의 모든 암 유형 및 임상 반응 데이터를 사용하여 추가적인 채점 세트를 확인 및 분석하였다. 이러한 분석에서 사용된 KEYNOTE-012로부터의 임상 반응 데이터는 채점 세트 1을 유도하는데 사용된 임상 반응 데이터보다 더 많은 펨브로리주맙 용량이 환자에게 제공된 후에 수득된 데이터를 포함하였다. 이러한 분석을 사용하여 유도된 채점 세트가 하기에 기술된다.
채점 세트 2의 설명:
세트 2.1. 고정된 저수준의 L1 벌점을 콕스 무진행 생존 (PFS) 메타 분석에서 사용한 엘라스틱 넷 피트 하에, 그리고 L2 벌점을 결정하기 위한 교차 검증을 사용하여 유도된 선형 조합. 선택된 값의 L1 및 L2 벌점에서의 최종 콕스 PFS 모델 피트로부터의 회귀 계수를 이의 각각의 유전자에 대한 정규화된 RNA 발현 수준에 곱한 후, 생성된 가중된 값을 합산하여 시그너처 점수가 생성된다. 이러한 회귀 계수 값, 즉, 가중치가 표 3A에서 세트 2.1 하에 열거된다.
세트 2.2. 고정된 저수준의 L1 벌점을 최상의 전체 반응의 로지스틱 회귀 메타 분석에서 사용한 엘라스틱 넷 피트 하에, 그리고 L2 벌점을 결정하기 위한 교차 검증을 사용하여 유도된 선형 조합. 선택된 값의 L1 및 L2 벌점에서의 최종 로지스틱 모델 피트로부터의 회귀 계수를 이의 각각의 유전자에 대한 정규화된 RNA 발현 수준에 곱한 후, 생성된 가중된 값을 합산하여 시그너처 점수가 생성된다. 이러한 회귀 계수 값, 즉, 가중치가 표 3A에서 세트 2.2 하에 열거된다.
저수준의 L1 벌점을 사용하여 채점 세트 1.1, 1.2, 2.1 및 2.2를 유도하는 것은 대부분의 유전자가 펨브롤리주맙으로의 치료에 대한 다중 암 유형의 항종양 반응과 연관될 것으로 예상된다는 전제 하에 57개의 임상 반응 유전자 모두에 대한 발현 수준이 시그너처 점수의 일부분이게 하도록 의도되었다. 반응의 견고한 "조직학-교차(cross-histology)" 예측인자를 확인하기 위한 대안적인 전략은 시그너처 점수를 생성시키는데 사용되는 표 1로부터의 임상 반응 유전자의 세트를 추가로 감소시키는 것이다. 연구된 암 유형 모두에 걸쳐 견고하게 예측값을 나타낼 표 1 임상 반응 유전자의 특정 서브세트 및 이에 대한 시그너처 점수를 검색하기 위해 이러한 접근법을 KEYNOTE-012 및 KEYNOTE-028로부터의 다중 암 유형의 환자들에 대한 조합된 임상 반응 데이터에 적용하였다. 이러한 접근법이 하기 기술된 바와 같은 채점 가중치 세트 2.3 및 2.4의 유도에 의해 설명된다.
세트 2.3. 콕스 무진행 생존 (PFS) 메타 분석에서 L1 및 L2 벌점 양쪽 모두를 결정하기 위한 교차 검증을 사용한 엘라스틱 넷 피트 하에 유도된 선형 조합. 선택된 값의 L1 및 L2 벌점에서의 최종 콕스 PFS 모델 피트로부터의 회귀 계수를 이의 각각의 유전자에 대한 정규화된 RNA 발현 수준에 곱한 후, 생성된 가중된 값을 합산하여 시그너처 점수가 생성된다. 이러한 회귀 계수 값, 즉, 가중치가 표 3A에서 세트 2.3 하에, 그리고 표 3B의 제2열에 열거된다.
세트 2.4. 로지스틱 회귀 메타 분석에서 L1 및 L2 벌점 양쪽 모두를 결정하기 위한 교차 검증을 사용한 엘라스틱 넷 피트 하에 유도된 선형 조합. 선택된 값의 L1 및 L2 벌점에서의 최종 로지스틱 모델 피트로부터의 회귀 계수를 이의 각각의 유전자에 대한 정규화된 RNA 발현 수준에 곱한 후, 생성된 가중된 값을 합산하여 시그너처 점수가 생성된다. 이러한 회귀 계수 값, 즉, 가중치가 표 3A에서 세트 2.4 하에, 그리고 표 3B의 제3열에 열거된다.
표 3B의 유전자 시그너처의 검사로부터 명백한 바와 같이, 우세하게, 세트 2.3 및 2.4의 가중치가 각각 생산된 PFS 및 BOR 회귀가 동일한 유전자들을 보유하고, 이는 우세하게 어느 한쪽의 임상 종점을 사용하여 동일한 유전자들이 선택된다는 것을 나타낸다. 다른 임상 반응 유전자에 대한 0의 가중치는 이러한 유전자의 발현 수준이 개별적으로 임상 결과와 강하게 연관되지 않는다는 것을 의미하는 것으로 해석되지 않아야 하고, 다만 모든 유전자가 예측값을 나타내도록 동시에 경쟁 중인 경우에 벌점화 PFS 회귀 메타 분석 환경에서 예측을 개선하는 것과 관련하여 이들이 계수가 0이 아닌 것들을 넘어서는 추가적인 값을 부가하는 것으로 보이지 않을 뿐이다.
실시예 6. 채점 가중치 세트를 사용하여 계산된 시그너처 점수의 임상 유용성
가중 계수를 사용하여 생성된 시그너처 점수의 임상 유용성을 도해하기 위해, 도 7 및 8은 예상 PPV 및 NPV 프로파일의 추정값 (적응증에 걸친 평균화)을 세트 1.1 가중치를 사용하여 계산된 시그너처 점수에 대한 추정 차단값의 함수로서 나타낸다. 이러한 예상 프로파일은 조합된 KEYNOTE-028 및 KEYNOTE-012 데이터의 계층적 베이지안 메타 분석을 사용하여 계산되었고, 여기서 실선은 PPV의 예상값을 나타내고 (사후 중앙값에 의해 포착됨), 실선 위 및 아래의 점선은 예상값에 대한 90％ 신용 구간의 상한 및 하한을 가리킨다.
도 6 및 7의 PPV 및 NPV 프로파일은 세트 1.1 가중치를 사용하여 계산된 시그너처 점수의 잠재적인 차단값과 이같은 차단값이 암시하는 임상 유용성 척도, 예컨대 PPV 및 NPV 사이의 예상되는 관계가 어떻게 최소 시그너처 점수를 환자를 바이오마커 양성으로 지정하기 위한 차단값으로서 선택하는 것을 뒷받침하는데 사용될 수 있는지를 도해한다. 이같은 차단값은 유전자 발현 수준을 PD-1 길항제로의 요법에 대한 임상 반응에 관련시키는 데이터가 수집되지 않았거나 거의 수집되지 않은 암 적응증에 미리 특정된 방식으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 예상 임상 유용성 프로파일의 메타 분석 추정은 다중 암 유형에 유용한 단일한 차단값 점수에 대한 2가지 일반적인 가능성을 시사한다:
Figure pct00011
90％에 가까운 예상 NPV를 유지하면서 예상 PPV가 30％에 가까운 NPV를 선호하는 "낮은" 차단값.
Figure pct00012
85％에 가까운 예상 NPV를 유지하면서 예상 PPV가 40％에 가까운 PPV를 선호하는 "높은" 차단값.
표 3에 열거된 각각의 가중 세트를 이에 의해 결정되는 시그너처 점수를 사용하여 하나 이상의 암 유형에 대한 임상 유용성 프로파일의 유사한 분석을 수행하는데 사용할 수 있다.
도 9 내지 11은 3가지 상이한 암 (식도, 결장직장 및 항문)에 대한 펨브롤리주맙 반응 상태에 의한 시그너처 점수의 분포를 나타내고, 여기서 시그너처 점수는 세트 1.1 또는 세트 2.4의 채점 가중치를 사용하여 계산되었다. 이러한 데이터는 어떻게 시그너처 점수가 펨브롤리주맙 치료에 대한 반응자와 비-반응자 사이에서 분포가 상이한지를 도해한다. PPV 및 NPV 프로파일, 및 각각의 후보 차단값 점수를 사용하여 선택될 환자의 암시적인 유병률을 검사함으로써 이러한 암 유형 중 임의의 것 또는 모두에 대해 예측적인 차단값 시그너처 점수를 선택할 수 있다.
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Claims (24)

  1. (a) 관심 종양 유형으로 진단된 환자 코호트 내의 각각의 환자로부터 치료-전 종양 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 코호트 내의 각각의 환자에 대해, PD-1 길항제로의 치료 후 항종양 반응 값을 수득하는 단계;
    (c) 유전자 발현 플랫폼 내의 각각의 유전자에 대해 각각의 종양 샘플 내의 미처리 RNA 수준을 측정하고,
    여기서 유전자 발현 플랫폼은 약 50개 내지 약 60개의 유전자의 임상 반응 유전자 세트 및 약 10개 내지 약 12개의 하우스키핑 유전자의 정규화 유전자 세트를 포함하고, 여기서 임상 반응 유전자의 약 90％는 항종양 반응과 양성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내고, 임상 반응 유전자의 약 10％는 항종양 반응과 음성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내는 것인 단계;
    (d) 각각의 종양 샘플에 대해, 임상 반응 유전자에 대한 각각의 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하는 단계;
    (e) 각각의 종양 샘플 및 관심 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자에 대해, 이러한 유전자에 대한 미리 규정된 곱셈 계수를 사용하여, 정규화된 RNA 발현 수준에 가중치를 주는 단계;
    (f) 각각의 환자에 대해, 가중된 RNA 발현 수준을 합산하여 코호트 내의 각각의 환자에 대한 유전자 시그너처 점수를 생성시키는 단계; 및
    (g) 모든 종양 샘플에 대한 유전자 시그너처 점수 및 코호트 내의 모든 환자에 대한 항종양 반응 값을 비교하여, 표적 바이오마커 임상 유용성 기준을 충족시키도록 환자 코호트를 분리하는 유전자 시그너처 점수에 대한 차단값을 선택하는 단계
    를 포함하는, 적어도 하나의 관심 종양 유형에 대해 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응을 예측하는 유전자 시그너처 바이오마커를 도출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 발현 플랫폼이 표 1에 열거된 유전자로 이루어지는 것인 방법:
    <표 1>
    Figure pct00013

    Figure pct00014
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 시그너처 점수가 선택된 차단값 이상인 종양 유형의 임의의 종양 샘플을 바이오마커 양성으로 지정하고, 유전자 시그너처 점수가 선택된 차단값 미만인 종양 유형의 임의의 종양 샘플을 바이오마커 음성으로 지정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙(pembrolizumab)인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 유형이 방광암, 위암, 두경부암, 삼중 음성 유방암, 항문암, 담관암, 결장직장암, 식도암, 난소암 또는 흑색종인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 임상 반응 유전자에 대한 미리 규정된 곱셈 계수가 표 3A에 열거된 채점 가중치 세트의 군으로부터 선택된 동일한 채점 가중치 세트의 구성원인 방법:
    <표 3A>
    Figure pct00015

    Figure pct00016
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 임상 반응 유전자에 대한 미리 규정된 곱셈 계수가 정수 1인 방법.
  8. (a) 유전자 발현 플랫폼 내의 각각의 유전자에 대해 종양 샘플 내의 미처리 RNA 수준을 측정하고, 여기서 유전자 발현 플랫폼은 약 50개 내지 약 60개의 유전자의 임상 반응 유전자 세트 및 약 10개 내지 약 12개의 하우스키핑 유전자의 정규화 유전자 세트를 포함하고, 여기서 임상 반응 유전자의 약 90％는 항종양 반응과 양성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내고, 임상 반응 유전자의 약 10％는 항종양 반응과 음성으로 상관되는 종양내 RNA 수준을 나타내는 것인 단계;
    (b) 종양 유형에 대한 미리 규정된 유전자 시그너처 내의 각각의 임상 반응 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하고, 여기서 미리 규정된 유전자 시그너처가 적어도 2개의 임상 반응 유전자로 이루어지는 것인 단계;
    (c) 미리 규정된 곱셈 계수를 사용하여 각각의 정규화된 RNA 값에 가중치를 주는 단계;
    (d) 가중된 RNA 발현 수준을 합산하여 유전자 시그너처 점수를 생성시키는 단계;
    (e) 생성된 점수를 유전자 시그너처 및 종양 유형에 대한 기준 점수에 비교하는 단계; 및
    (f) 종양 샘플을 바이오마커 양성 또는 바이오마커 음성으로 분류하고,
    여기서 생성된 점수가 기준 점수 이상이면, 종양 샘플을 바이오마커 양성으로 분류하고, 생성된 점수가 기준 점수 미만이면, 종양 샘플을 바이오마커 음성으로 분류하는 단계
    를 포함하는, 특정 종양 유형으로 진단된 환자로부터 제거된 종양 샘플을 PD-1 길항제에 대한 이러한 종양 유형의 항종양 반응의 유전자 시그너처 바이오마커의 존재 또는 부재에 대해 테스트하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 유전자 발현 플랫폼이 표 1의 유전자로 이루어지는 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, PD-1 길항제가 펨브롤리주맙인 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 유형이 방광암, 위암, 두경부암, 삼중 음성 유방암, 항문암, 담관암, 결장직장암, 식도암, 난소암 또는 흑색종인 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 규정된 유전자 시그너처가 표 3A의 57개의 유전자로 이루어지고, 가중 단계가 표 3A에 열거된 가중치 세트로부터 채점 가중치 세트를 선택하고, 각각의 유전자에 대한 정규화된 RNA 값에 선택된 채점 가중치 세트 내의 상응하는 가중치를 곱하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 규정된 유전자 시그너처가 표 3A의 57개의 유전자로 이루어지고, 미리 규정된 곱셈 계수가 정수 1인 방법.
  14. (i) 임상 반응 유전자의 세트 및 정규화 유전자의 세트로 이루어지는 유전자 발현 플랫폼 내의 각각의 유전자의 미처리 RNA 발현 수준을 측정하기 위한 샘플 분석기, 및
    (ii) (a) 종양 유형에 대한 미리 규정된 유전자 시그너처 내의 각각의 임상 반응 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하고;
    (b) 미리 규정된 곱셈 계수를 사용하여 각각의 정규화된 RNA 값에 가중치를 주고;
    (c) 가중된 RNA 발현 수준을 합산하여 유전자 시그너처 점수를 생성시키고;
    (d) 생성된 점수를 유전자 시그너처 및 종양 유형에 대한 기준 점수에 비교하고;
    (e) 종양 샘플을 바이오마커 양성 또는 바이오마커 음성으로 분류하고, 여기서 생성된 점수가 기준 점수 이상이면, 종양 샘플을 바이오마커 양성으로 분류하고, 생성된 점수가 기준 점수 미만이면, 종양 샘플을 바이오마커 음성으로 분류하기 위한,
    측정된 RNA 발현 수준을 수신 및 분석하기 위한 컴퓨터 프로그램
    을 포함하는, 특정 종양 유형으로 진단된 환자로부터 제거된 종양 샘플을 PD-1 길항제에 대한 이러한 종양 유형의 항종양 반응의 유전자 시그너처 바이오마커의 존재 또는 부재에 대해 테스트하기 위한 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 유전자 발현 플랫폼이 표 1의 유전자로 이루어지는 것인 시스템.
  16. 제14항에 있어서, 미리 규정된 곱셈 계수가 표 3A에 열거된 채점 가중치 세트로부터 선택된 채점 가중치 세트의 구성원인 시스템.
  17. (a) 표 1의 각각의 유전자에 의해 발현되는 전사체에 특이적으로 결합할 수 있는 혼성화 프로브의 세트; 및
    (b) 각각의 혼성화 프로브로 형성된 특이적인 혼성화 복합체의 수를 정량하도록 디자인된 시약 세트
    를 포함하는, 표 1에 표시된 유전자 시그너처에 대한 정규화된 RNA 발현 점수를 수득하도록 종양 샘플을 검정하기 위한 키트.
  18. 종양 샘플이 유전자 시그너처 바이오마커에 대해 양성인지 또는 음성인지를 결정하는 단계, 및 종양이 바이오마커에 대해 양성이면 환자에게 PD-1 길항제를 투여하고, 종양이 바이오마커에 대해 음성이면 대상체에게 PD-1 길항제를 포함하지 않는 암 치료를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자 시그너처 바이오마커는 적어도 2개의 표 1의 임상 반응 유전자를 포함하는 유전자 시그너처에 대한 것인, 종양이 있는 환자를 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 유전자 시그너처가 표 1A 및 1B의 57개의 임상 반응 유전자 또는 표 1A의 51개의 임상 반응 유전자로 이루어지는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 유전자 시그너처가 하기 표 2에 열거된 유전자 시그너처로부터 선택되는 것인 방법:
    <표 2>
    Figure pct00017
  21. (a) 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자 및 정규화 유전자 세트 내의 각각의 유전자에 대해 종양 샘플 내의 미처리 RNA 수준을 측정하고, 여기서 유전자 시그너처 및 정규화 유전자 세트는 바로 아래의 표에 기재된 유전자로 이루어지는 것인 단계:
    Figure pct00018

    (b) 유전자 시그너처 내의 각각의 유전자에 대한 측정된 미처리 RNA 수준을 정규화 유전자의 측정된 RNA 수준을 사용하여 정규화하는 단계;
    (c) 각각의 정규화된 RNA 값에 바로 아래의 표에 기재된 상응하는 채점 가중치 세트를 곱하여, 가중된 RNA 발현 값을 생성시키는 단계;
    Figure pct00019

    및
    (d) 가중된 RNA 발현 값을 합산하여 유전자 시그너처 점수를 생성시키는 단계
    를 포함하는, 환자로부터 제거된 종양 샘플을 테스트하여 PD-1 길항제에 대한 항종양 반응과 상관되는 유전자 시그너처에 대한 시그너처 점수를 생성시키는 방법.
  22. 제21항에 있어서, PD-1 길항제가 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙, 펨브롤리주맙 바이오시밀러 또는 펨브롤리주맙 변이체인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 측정 단계가 조직 샘플로부터 RNA를 단리하고, 조직 샘플을 바로 아래의 표에 열거된 유전자 표적 영역에 특이적으로 혼성화하도록 디자인된 프로브들의 세트와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법:
    Figure pct00020
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 식도암으로 진단된 환자인 방법.
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