JP2018505658A - Ｐｄ−１アンタゴニストに対する応答の遺伝子シグネチャーバイオマーカーを得るための系および方法 - Google Patents

Ｐｄ−１アンタゴニストに対する応答の遺伝子シグネチャーバイオマーカーを得るための系および方法 Download PDF

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Abstract

複数の腫瘍型におけるＰＤ−１アンタゴニストに対する応答と相関する遺伝子のセットと正規化遺伝子セットとの組合せである遺伝子発現プラットフォームを開示する。ＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答の遺伝子シグネチャーバイオマーカーを得るために及び予測的遺伝子シグネチャーに関して患者のサンプルを試験するために遺伝子発現プラットフォームを使用する方法および系も開示する。【選択図】図１０Ａ

Description

本発明は、全般的には、プログラム死１（ＰＤ−１）のアンタゴニストでの癌の治療に関する。特に、本発明は、ＰＤ−１アンタゴニストに対する応答を予測する治療前遺伝子シグネチャーを定めること、およびＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い患者を特定するためのバイオマーカーとしてのそのような遺伝子シグネチャーの使用に関する。
ＰＤ−１は、免疫調節および末梢性免疫寛容の維持における重要な分子として認識されている。ＰＤ−１は、ナイーブＴ、ＢおよびＮＫＴ細胞上で中等度に発現され、リンパ球、単球および骨髄性細胞上のＴ／Ｂ細胞受容体シグナリングによりアップレギュレーションされる（１）。
ＰＤ−１に対する２つの公知リガンドはＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）であり、これらは、種々の組織において生じるヒト癌において発現される。例えば卵巣、腎臓、結腸直腸、膵臓、肝臓癌および黒色腫の大きなサンプルセットにおいて、ＰＤ−Ｌ１発現は、後続治療には無関係に、予後不良および全生存期間の短縮と相関することが示された（２−１３）。同様に、腫瘍浸潤性リンパ球上のＰＤ−１発現は乳癌および黒色腫における機能不全Ｔ細胞の指標となること（１４−１５）ならびに腎癌における予後不良と相関すること（１６）が判明した。したがって、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞は、ＰＤ−１を発現するＴ細胞と相互作用して、免疫監視の回避およびＴ細胞活性化の低減をもたらし、それにより腫瘍に対する免疫応答の低下に関与することが提示されている。
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の一方または両方との間の相互作用を抑制することによりＰＤ−１活性に拮抗する幾つかのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が癌治療のために臨床開発中である。これらには、ＰＤ−１に結合するニボルマブおよびペンブロリズマブ、ならびにＰＤ−Ｌ１に結合するＭＰＤＬ３２８０Ａが含まれる。これらのｍＡｂでの臨床研究は幾つかの癌型において持続的抗腫瘍応答をもたらしているが、相当数の患者が抗腫瘍応答を示さなかった。したがって、どの癌患者がＰＤ−１アンタゴニストでの治療で臨床利益を得る可能性が高いかを特定するための診断手段が必要とされている。
癌研究における活発な領域は、遺伝子シグネチャーまたは分子シグネチャーと一般に称される、遺伝子のセットに関する腫瘍内発現パターンの特定であり、これは癌の特定の型または亜型に特徴的であり、臨床結果に関連づけられうる。
発明の概括
本発明の系および方法は、本明細書においては「遺伝子発現プラットフォーム」と称される正規化（標準化）（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）遺伝子セットと臨床応答遺伝子セットとの組合せに基づいており、本発明者らは、複数の腫瘍型に関するＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答と相関する治療前腫瘍内ＲＮＡ発現レベル（「遺伝子シグネチャー（ｇｅｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」）を有する複数の遺伝子の種々のセットを得るための手段として、これを設計した。また、この遺伝子発現プラットフォームは、シグネチャーにおける個々の遺伝子の相関に対する相対的寄与を重みづけし、遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の全ての正規化ＲＮＡレベルの算術複合体（本明細書において「遺伝子シグネチャースコア」と称される）を生成するスコア化アルゴリズムを得るのに有用である、と本発明者らは考えている。関心のある同じ腫瘍型を有しＰＤ−１アンタゴニストで治療された患者のコホートに関して得られた抗腫瘍応答および遺伝子シグネチャースコアを比較することにより、本発明者らは、ＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答を達成する可能性がより高い又は低いことよって患者を分類するカットオフスコアが選択されうる、と考えている。個々の腫瘍型に関する予測シグネチャースコアは本明細書においては遺伝子シグネチャーバイオマーカーと称される。本発明により得られた遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して腫瘍が陽性の試験結果を示す患者は、該遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して腫瘍が陰性の試験結果を示す患者より、ＰＤ−１アンタゴニストによる治療から利益を得る可能性が高い。
したがって、第１の態様において、本発明は、関心のある少なくとも１つの腫瘍型に関してＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答を予測する遺伝子シグネチャーバイオマーカーを得る方法を提供する。該方法は、（ａ）該腫瘍型を有すると診断された患者コホートにおける各患者から治療前腫瘍サンプルを得、（ｂ）該コホートにおける各患者に関して、ＰＤ−１アンタゴニストでの治療の後に抗腫瘍応答値を得、（ｃ）臨床応答遺伝子のセットおよび正規化遺伝子のセットを含む遺伝子発現プラットフォームにおいて各遺伝子に関して各腫瘍サンプルにおける生ＲＮＡレベルを測定し、（ｄ）該正規化遺伝子の測定生レベルを用いて、臨床応答遺伝子の測定生ＲＮＡレベルのそれぞれを各腫瘍サンプルに関して正規化し、（ｅ）関心のある遺伝子シグネチャーにおける各腫瘍サンプルおよび各遺伝子に関して、その遺伝子の所定の増倍係数を用いて正規化ＲＮＡ発現レベルを重み付けし、（ｆ）各腫瘍サンプルに関して、該重み付けＲＮＡ発現レベルを加えて、遺伝子シグネチャースコアを得、（ｇ）該腫瘍サンプルの全てに関する遺伝子シグネチャースコアと該コホートにおける患者の全てに関する抗腫瘍応答値とを比較して、目標のバイオマーカーの臨床有用性基準を満たすように患者コホートを分類する該遺伝子シグネチャースコアに関するカットオフを選択することを含む。１つの実施形態においては、該方法は、選択されたカットオフ以上の遺伝子シグネチャースコアを有する腫瘍型の任意の腫瘍サンプルをバイオマーカー陽性として定め、選択されたカットオフ未満の遺伝子シグネチャースコアを有する腫瘍型の任意の腫瘍サンプルをバイオマーカー陰性として定めることを更に含む。
本発明の前記方法を用いて得られた遺伝子シグネチャーバイオマーカーは、例えば、ＰＤ−１アンタゴニストの臨床試験にバイオマーカー陽性患者のみを選択的に登録するために、あるいはバイオマーカー陽性または陰性状態に基づいてＰＤ−１アンタゴニストの臨床試験の分析を階層化するために、あるいはＰＤ−１アンタゴニストでの治療に対する患者の適格性を判定するために、種々の臨床研究および患者の治療場面において有用である、と本発明者らは考えている。
したがって、第２の態様において、本発明は、特定の腫瘍型を有すると診断された患者から摘出された腫瘍サンプルを、ＰＤ−１アンタゴニストに対する該腫瘍型の抗腫瘍応答の遺伝子シグネチャーバイオマーカーの存在または非存在に関して試験するための方法を提供する。該方法は、（ａ）臨床応答遺伝子のセットおよび正規化遺伝子のセットを含む遺伝子発現プラットフォームにおいて各遺伝子に関して腫瘍サンプルにおける生ＲＮＡレベルを測定し、（ｂ）該正規化遺伝子の測定ＲＮＡレベルを用いて、該腫瘍型に関する所定の遺伝子シグネチャーにおける各臨床応答遺伝子に関する測定生ＲＮＡレベルを正規化し、（ｃ）所定の増倍係数を用いて各正規化ＲＮＡ値を重み付けし、（ｄ）該重み付けＲＮＡ発現レベルを加えて、遺伝子シグネチャースコアを得、（ｅ）得られたスコアを該遺伝子シグネチャーおよび腫瘍型に関して基準スコアと比較し、（ｆ）バイオマーカー陽性またはバイオマーカー陰性として腫瘍サンプルを分類することを含み、ここで、得られたスコアが該基準スコア以上である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陽性として分類し、得られたスコアが該基準スコア未満である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陰性として分類する。
第３の態様において、本発明は、特定の腫瘍型を有すると診断された患者から摘出された腫瘍サンプルをＰＤ−１アンタゴニストに対する腫瘍型の抗腫瘍応答の遺伝子シグネチャーバイオマーカーの存在または非存在に関して試験するための系を提供する。該系は、（ｉ）臨床応答遺伝子のセットおよび正規化遺伝子のセットからなる遺伝子発現プラットフォームにおける各遺伝子の生ＲＮＡ発現レベルを測定するためのサンプル分析装置、ならびに（ｉｉ）（ａ）該正規化遺伝子の測定ＲＮＡレベルを用いて、該腫瘍型に関する所定の遺伝子シグネチャーにおける各臨床応答遺伝子に関する測定生ＲＮＡレベルを正規化し、（ｂ）所定の増倍係数を用いて各正規化ＲＮＡ値を重み付けし、（ｃ）該重み付けＲＮＡ発現レベルを加えて、遺伝子シグネチャースコアを得、（ｄ）得られたスコアを該遺伝子シグネチャーおよび腫瘍型に関して基準スコアと比較し、（ｅ）バイオマーカー陽性またはバイオマーカー陰性として腫瘍サンプルを分類するために、測定されたＲＮＡ発現レベルを受信し、分析するためのコンピュータプログラムを含み、ここで、得られたスコアが該基準スコア以上である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陽性として分類し、得られたスコアが該基準スコア未満である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陰性として分類する。
本発明の前記態様のそれぞれにおいては、遺伝子発現プラットフォームにおける臨床応答遺伝子は、（ａ）２以上の腫瘍型におけるＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答と個々に相関し、（ｂ）該腫瘍型のそれぞれにおいて実質的に類似した共分散パターンを一括して生成する。臨床応答遺伝子セットにおける遺伝子の第１サブセットは、抗腫瘍応答と正に相関した腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、一方、臨床応答遺伝子セットにおける遺伝子の第２サブセットの腫瘍内ＲＮＡレベルは抗腫瘍応答と負に相関する。１つの実施形態においては、臨床応答遺伝子セットは約５７個の遺伝子を含み、第１サブセットは約５１個の遺伝子を含み、第２サブセットは約６個の遺伝子を含む。本発明の前記態様のいずれかの幾つかの実施形態においては、遺伝子発現プラットフォームは、表１Ａおよび１Ｂに挙げられている５７個の遺伝子を含む。
本発明の前記態様のいずれかの幾つかの実施形態においては、種々の腫瘍型の複数のサンプルにわたる低い分散の腫瘍内ＲＮＡレベルを個々に示し、種々の腫瘍型における臨床応答遺伝子の腫瘍内発現レベルの範囲を含む範囲の腫瘍内ＲＮＡレベルを一括して示す遺伝子を、遺伝子発現プラットフォームにおける正規化遺伝子のセットは含む。幾つかの実施形態においては、該正規化遺伝子セットは１０〜１２個の遺伝子を含む。本発明の前記態様のいずれかの実施形態においては、遺伝子発現プラットフォームは、以下の表１に挙げられている１１個の正規化遺伝子を含む。
Figure 2018505658
Figure 2018505658
本発明者らは、以下の表２に示されている特定の遺伝子シグネチャーを特定した。これらは臨床応答遺伝子において表されており、複数の腫瘍型にわたるペンブロリズマブに対する応答と相関する。これらの遺伝子シグネチャーのそれぞれに共通する幾つかの遺伝子が存在するため、本発明者らは、ＰＤ−１アンタゴニストに対する応答を予測する遺伝子シグネチャーバイオマーカーが、これらの任意のシグネチャーに関して、および表１における臨床応答遺伝子の２〜５７個の任意の組合せを含む他の遺伝子シグネチャーに関して得られうることを提案する。
Figure 2018505658
したがって、幾つかの実施形態においては、本発明の方法または系において評価される遺伝子シグネチャーは、表１における臨床応答遺伝子の少なくとも２つの任意の組合せを含むことが可能であり、表１における３、４、５、６、７、１３もしくは１８個または２〜５７個の任意の数の臨床応答遺伝子を含むことが可能である。幾つかの実施形態においては、該遺伝子シグネチャーは、表１Ａおよび１Ｂにおける５７個の臨床応答遺伝子、表１Ａにおける５１個の臨床応答遺伝子ならびに表２に挙げられている遺伝子シグネチャーからなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、該遺伝子シグネチャーは、表２に示されている１８遺伝子アップ−ダウンシグネチャーである。
本発明の前記態様および実施形態のいずれかにおいて用いられる抗腫瘍応答値は、個々の患者における抗腫瘍応答の任意の定量的または定性的測定に関するものであることが可能であり、あるいは患者コホートにおいて観察された抗腫瘍応答の率であることが可能である。抗腫瘍応答値はＰＤ−１アンタゴニストでのコホートの治療の任意の期間中または期間後に得られうる。もう１つの実施形態においては、抗腫瘍応答値は客観的値、例えば、ＲＥＣＩＳＴ １．１またはｉｒＲＣにより測定された部分的応答、完全応答または最良全応答である。１つの実施形態においては、抗腫瘍応答値は、抗腫瘍応答の持続期間、例えば、患者が無進行生存、無病生存または何らかの他の進行中の抗腫瘍応答を示す日数、月数または年数である。もう１つの実施形態においては、抗腫瘍応答値は、ＰＤ−１アンタゴニストで治療された患者コホートに関する応答率、例えば奏効率（ＯＲＲ）または全生存期間中央値である。幾つかの実施形態においては、抗腫瘍応答値（個々の値またはコホート応答率）は、ＰＤ−１アンタゴニストの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上の用量の投与の後で得られる。他の実施形態においては、抗腫瘍応答値は持続的抗腫瘍応答に関するものであり、これは、患者ごとのＰＤ−１アンタゴニストの最終用量の投与の後の任意の時点、例えば、最終用量の投与の３、６、９、１２、１５、１８、２１または２４カ月後に評価される。
本発明者らは、前記方法および系は、種々のＰＤ−１アンタゴニストおよび腫瘍型に関する遺伝子シグネチャーバイオマーカーを得るために使用されうると想定している。幾つかの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはニボルマブまたはペンブロリズマブである。患者コホートは、単独療法として又は１以上の他の癌治療を含む併用療法として、ＰＤ−１アンタゴニストで治療されうる。幾つかの実施形態においては、腫瘍型は膀胱癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頸部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌または腎癌である。１つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはペンブロリズマブであり、腫瘍型は肛門癌、胆道癌、膀胱癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、黒色腫または卵巣癌である。
本発明の方法および系の幾つかの実施形態においては、表１における各臨床応答遺伝子および表１における各正規化遺伝子に関する測定生ＲＮＡレベルのｌｏｇ（１０）変換を行い、正規化遺伝子のｌｏｇ１０変換ＲＮＡレベルの算術平均を算出し、表１における各臨床応答遺伝子に関するｌｏｇ１０変換ＲＮＡレベルから該算出平均を差し引くことにより、各サンプルに関する臨床応答遺伝子の正規化ＲＮＡ発現レベルを得る。
表２における特定の遺伝子シグネチャーのいずれかを使用する幾つかの実施形態においては、該シグネチャーにおける各臨床応答遺伝子に関する及び正規化遺伝子のセットに関する測定生ＲＮＡレベルのｌｏｇ（１０）変換を行い、正規化遺伝子のｌｏｇ１０変換ＲＮＡレベルの算術平均を算出し、各臨床応答遺伝子に関するｌｏｇ１０変換ＲＮＡレベルから該算出平均を差し引くことにより、測定ＲＮＡ値を得る。幾つかの実施形態においては、正規化遺伝子のセットは、表１Ｃに挙げられている正規化遺伝子を含む。１つの実施形態においては、遺伝子シグネチャーは、表２に記載されている５−遺伝子ＩＦＮｇ誘導性シグネチャーまたは７−遺伝子ＭＩＰＦＳシグネチャーである。１つの実施形態においては、遺伝子シグネチャーは、表２に記載されている１８−遺伝子アップ−ダウンシグネチャーであり、正規化遺伝子のセットは、表１Ｃに挙げられている１０個の遺伝子からなる。
１つの実施形態においては、関心のある遺伝子シグネチャー（すなわち、特定の遺伝子型に関する所定の遺伝子シグネチャー）における各遺伝子は腫瘍応答に同等に寄与すると考えられ、したがって、各遺伝子は同等に重み付けされる。したがって、遺伝子シグネチャーにおける各遺伝子に関する所定の増倍係数は１であり、遺伝子シグネチャーにおける遺伝子に関する正規化ＲＮＡ発現スコアは直接的な加算により、または算術平均を算出することにより組合されうる。
もう１つの実施形態においては、特定の遺伝子シグネチャーにおける種々の遺伝子が抗腫瘍応答相関に寄与する度合は様々であり、これらの寄与の差を重み付けするための係数は、患者コホートに関して決定された抗腫瘍応答値および正規化遺伝子発現レベルに多変量統計モデルを適用することにより予め定められている。以下の表３は、本発明の幾つかの遺伝子シグネチャーに関するシグネチャースコアの計算において使用される係数を重み付けする典型的なセットを示す。表３Ａにおいて特定されている遺伝子シグネチャーは表１における５７個の臨床応答遺伝子からなり、表３Ｂにおける遺伝子シグネチャーは、表２に記載されている１４−遺伝子アップ−ダウンおよび１８−遺伝子アップ−ダウンシグネチャーである。
Figure 2018505658
Figure 2018505658
Figure 2018505658
したがって、１つの実施形態においては、患者から摘出された腫瘍サンプルに関するシグネチャースコアの生成は、（ｉ）遺伝子シグネチャーにおける各遺伝子に関して得られた正規化ＲＮＡ値にスコア化重みのセットからのその遺伝子に関する係数を掛け算して、該シグネチャーにおける遺伝子のそれぞれに関する重み付けＲＮＡ値を得、（ｉｉ）重み付けＲＮＡ値を加えて該腫瘍サンプルに関するシグネチャースコアを得ることを含み、ここで、遺伝子シグネチャーが表３Ａにおける５７アップ−ダウンシグネチャーからなる場合には、スコア化重みセットは、セット１．１、セット１．２、セット２．１、セット２．２、セット２．３およびセット２．４からなる群から選択され、遺伝子シグネチャーが表３Ｂにおける１４−遺伝子アップ−ダウンシグネチャーからなる場合には、スコア化重みセットは、表３Ｂの第２列における重みからなり、遺伝子シグネチャーが表３Ｂにおける１８−遺伝子アップ−ダウンシグネチャーからなる場合には、スコア化重みセットは、表３Ｂの第３列における重みからなる。
シグネチャースコアを得るために表３Ａまたは３Ｂにおけるスコア化重みセットの１つを使用する幾つかの実施形態においては、該シグネチャーにおける各臨床応答遺伝子に関する及び表１Ｃにおける各正規化遺伝子のセットに関する測定生ＲＮＡレベルのｌｏｇ（１０）変換を行い、正規化遺伝子のｌｏｇ１０変換ＲＮＡレベルの算術平均を算出し、各臨床応答遺伝子に関するｌｏｇ１０変換ＲＮＡレベルから該算出平均を差し引くことにより、正規化ＲＮＡ値を得る。１つの実施形態においては、選択されたカットオフスコアによって満たされる目標（標的）バイオマーカー有用性基準は、コホートにおける応答患者の大多数が、該カットオフ以上の遺伝子シグネチャースコアを有し、非応答患者の大多数が、該カットオフ未満の遺伝子シグネチャーを有していたことである。もう１つの実施形態においては、目標バイオマーカー有用性基準は、患者コホートにおける応答患者の少なくとも２０％、４０％、６０％または８０％が、選択されたカットオフスコア以上の遺伝子シグネチャースコアを有することである。もう１つの実施形態においては、該カットオフスコアは、該カットオフスコア未満の遺伝子シグネチャースコアを有するコホートにおける非応答患者の少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％または１００％近くの目標バイオマーカー有用性基準を満たすように選択される。もう１つの実施形態においては、目標バイオマーカー有用性基準は、患者コホートにおける別々の患者に適用された場合の、少なくとも２５％、３０％、３５％またはそれ以上の、選択されたカットオフに関する陽性予測値（ＰＰＶ）、および少なくとも９０％、９３％、９６％またはそれ以上の陰性予測値（ＮＰＶ）である。
１つの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）またはニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）であり、遺伝子シグネチャーは、表１に挙げられている臨床応答遺伝子の少なくとも５つからなる。
幾つかの実施形態においては、遺伝子シグネチャーは、表２に挙げられている遺伝子シグネチャーから選択され、患者は膀胱癌、胃癌、頭頸部癌または黒色腫を有すると診断されている。
幾つかの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはペンブロリズマブであり、遺伝子シグネチャーはＩＦＮｇ、表２に示されているＰＤ−Ｌ１、拡張免疫またはＴＣＲシグナリングシグネチャーであり、患者は膀胱癌、胃癌、頭頸部癌または黒色腫を有すると診断されている。
幾つかの実施形態においては、遺伝子シグネチャーに関する基準スコアは、ＰＤ−１アンタゴニストに対する非応答者の少なくとも過半数から、ＰＤ−１アンタゴニストに対する応答者の群の少なくとも過半数を分けると判断されている。したがって、腫瘍サンプルがバイオマーカー陽性として分類された患者は、腫瘍サンプルがバイオマーカー陰性として分類された患者よりＰＤ−１アンタゴニストに応答する又はより良好な応答を達成する可能性がより高い。
更にもう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されている任意の遺伝子シグネチャーの正規化ＲＮＡ発現スコアを得るために腫瘍サンプルをアッセイするのに有用なキットを提供する。
１つの実施形態においては、該キットは、表１における遺伝子のそれぞれにより発現される転写産物に特異的に結合しうるハイブリダイゼーションプローブのセット、および各ハイブリダイゼーションプローブと形成される特異的ハイブリダイゼーション複合体の数を定量するために設計された試薬のセットを含む。１つの実施形態においては、該セットにおける各ハイブリダイゼーションプローブは特有の検出可能な標識を有し、臨床応答遺伝子および正規化遺伝子の１つに特有である標的配列に特異的にハイブリダイズするように設計され、それにより、単一のハイブリダイゼーション反応における腫瘍サンプルにおける表１の遺伝子の全ての転写産物の検出を可能にする。１つの実施形態においては、本発明のキットは、試験腫瘍サンプルと同様に臨床応答および正規化遺伝子の発現に関してアッセイされうる少なくとも１つの対照腫瘍サンプルを含みうる。
もう１つの実施形態においては、該キットは、（１）表２に示されている遺伝子シグネチャーの群から選択される遺伝子シグネチャーにおける遺伝子のそれぞれにより、および表１に挙げられている正規化遺伝子のそれぞれにより発現される転写産物に特異的に結合しうるハイブリダイゼーションプローブのセット、ならびに（２）各ハイブリダイゼーションプローブと形成される特異的ハイブリダイゼーション複合体の数を定量するために設計された試薬のセットを含む。
更にもう１つの態様においては、本発明は、遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して腫瘍が陽性であるか陰性であるかを決定し、該バイオマーカーに関して腫瘍が陽性である場合には、ＰＤ−１アンタゴニストを対象に投与し、該バイオマーカーに関して腫瘍が陰性である場合には、ＰＤ−１アンタゴニストを含まない癌治療剤を対象に投与することを含む、腫瘍を有する患者の治療方法を提供し、ここで、該遺伝子シグネチャーバイオマーカーは、表１における臨床応答遺伝子の少なくとも２つを含む遺伝子シグネチャーに関するものである。１つの実施形態においては、該遺伝子シグネチャーは、表２に挙げられている遺伝子シグネチャーから選択される。
更にもう１つの態様においては、本発明は、遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して陽性の試験結果を示す腫瘍を有する対象における使用のためのＰＤ−１アンタゴニストを含む医薬組成物を提供し、ここで、該遺伝子シグネチャーバイオマーカーは、表２に挙げられている遺伝子シグネチャーから選択される。
本発明の更にもう１つの態様は、医薬組成物および処方情報を含む薬品である。該医薬組成物はＰＤ−１アンタゴニストおよび少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤を含む。該処方情報は、該医薬組成物が、遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して陽性の試験結果を示す腫瘍を有する対象における使用に適応することを示し、ここで、該遺伝子シグネチャーバイオマーカーは、表２に挙げられている遺伝子シグネチャーから選択される。
詳細な説明
Ｉ．略語
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、以下の略語を用いる。
ＢＯＲ 最良全応答
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣
ＣＲ 完全応答
ＤＦＳ 無病生存
ＦＦＰＥ ホルマリン固定パラフィン包埋
ＦＲ フレームワーク領域
ＩＨＣ 免疫組織化学または免疫組織化学的
ｉｒＲＣ 免疫関連応答基準
ＮＣＢＩ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ＮＰＶ 正味予測値
ＯＲ 全応答
ＯＳ 全生存
ＰＤ 進行性疾患
ＰＤ−１ プログラム死１
ＰＤ−Ｌ１ プログラム細胞死１リガンド１
ＰＤ−Ｌ２ プログラム細胞死１リガンド２
ＰＦＳ 無進行生存（ＰＦＳ）
ＰＰＶ 陽性予測値
ＰＲ 部分的応答
Ｑ２Ｗ ２週間ごとに１用量
Ｑ３Ｗ ３週間ごとに１用量
ＲＥＣＩＳＴ 固形腫瘍における応答評価基準
ＲＯＣ 受信者動作特性
ＳＤ 安定した疾患
ＶＨ 免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ 免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
ＩＩ．定義
本発明がより容易に理解されうるように、ある科学技術用語を以下に明確に定義する。本明細書中の他の箇所において特に示されていない限り、本明細書中で用いられる全ての他の科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。
添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形の単語は、文脈に明らかに矛盾しない限り、それらの対応複数形対象物を含む。
数的に定義されるパラメーター（例えば、本明細書に記載されている遺伝子シグネチャーに関する遺伝子シグネチャースコア、またはＰＤ−１アンタゴニストの投与量、またはＰＤ−１アンタゴニストでの治療時間の長さ）を修飾するために用いる「約」は、該パラメーターが、そのパラメーターに関する示されている数値の上下１０％も変動しうることを意味する。例えば、約１０個の遺伝子からなる遺伝子シグネチャーは９〜１１個の遺伝子を有しうる。同様に、約２．４６２の基準遺伝子シグネチャースコアは２．２１５８および２．７０８のスコアならびに２．２１５８〜２．７０８の任意のスコアを含む。
「投与」および「治療（処理）」は、それが動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用される場合には、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体との外因性医薬、治療用物質、診断剤または組成物の接触を意味する。細胞の処理は、該細胞との試薬の接触、および該細胞に接触している流体との試薬の接触を含む。「投与」および「処理（治療）」は、試薬、診断剤、結合性化合物または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）処理をも意味する。「対象（被験者）」なる語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを含む。
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、所望の生物活性または結合活性を示す、抗体の任意の形態を意味する。したがって、それは最も広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化完全ヒト抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体（これらに限定されるものではない）を含む。「親抗体」は、ヒト治療用物質としての使用のためのマウスにおいて産生された親抗体のヒト化のような意図される使用のための抗体の修飾の前の、抗原への免疫系の曝露により得られる抗体である。
一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを含み、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主にもたらす定常領域を定めうる。典型的には、ヒト軽鎖はカッパおよびラムダ軽鎖として分類される。更に、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとしての、抗体のイソタイプを定める。軽鎖および重鎖においては、可変領域および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、無傷抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は一般に同じである。
典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、特定のエピトープへの結合が可能になるように、フレームワーク領域により整列されている。一般に、Ｎ末端からＣ末端方向に、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３の定義に基づいている。
本明細書中で用いる「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらす、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）からのアミノ酸残基を含む。Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（配列により抗体のＣＤＲ領域を定めている）を参照されたい。また、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（構造により抗体のＣＤＲ領域を定めている）も参照されたい。本明細書中で用いる「フレームワーク」または「ＦＲ」残基なる語は、ＣＤＲ残基として本明細書中で定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。
本明細書中で用いる「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」は、特に示されていない限り、抗体の抗原結合性フラグメント、すなわち、完全長抗体により結合される抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体フラグメント、例えば、１以上のＣＤＲ領域を保有するフラグメントを意味する。抗体結合性フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ジアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ；ナノボディ、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
特定の標的タンパク質に「特異的に結合する」抗体は、他のタンパク質と比較してその標的への優先的結合を示す抗体であるが、この特異性は絶対的な結合特異性を要しない。抗体がその意図される標的に「特異的」だとみなされるのは、その結合が、例えば偽陽性のような望ましくない結果をもたらすことなく、サンプル中の標的タンパク質の存在を決定するものである場合である。本発明において有用な抗体またはその結合性フラグメントは、非標的タンパク質に対するアフィニティより少なくとも２倍大きな、好ましくは少なくとも１０倍大きな、より好ましくは少なくとも２０倍大きな、最も好ましくは少なくとも１００倍大きなアフィニティで標的タンパク質に結合するであろう。本明細書中で用いる抗体が、与えられたアミノ酸配列、例えば成熟ヒトＰＤ−１またはヒトＰＤ−Ｌ１分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合すると言えるのは、それが、その配列を含むポリペプチドには結合するが、その配列を欠くタンパク質には結合しない場合である。
「キメラ抗体」は、所望の生物活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種（例えば、ヒト）に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同である一方で、該鎖の残部が、別の種（例えば、マウス）に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同であるタンパク質抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントを意味する。
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体は、マウスにおいて、またはマウス細胞において、またはマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて産生された場合には、マウス炭水化物鎖を含有しうる。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」は、それぞれ、マウスまたはラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体を意味する。
「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、マウス）抗体およびヒト抗体からの配列を含有する抗体の形態を意味する。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する。一般に、該ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分を含んでいてもよい。アフィニティーを増加させるため、またはヒト化抗体の安定性を増強するため、または他の理由により、あるアミノ酸置換が含まれうるが、げっ歯類抗体のヒト化形態は、一般に、該親げっ歯類抗体の同一ＣＤＲ配列を含む。
治療用物質、例えばＰＤ−１アンタゴニストで治療される癌患者に言及する場合の「抗腫瘍応答」は、少なくとも１つの陽性治療効果、例えば、癌細胞数の減少、腫瘍サイズの減少、末梢器官内への癌細胞浸潤の速度の低下、腫瘍転移もしくは腫瘍増殖の速度の低下、または無進行生存を意味する。癌における陽性治療効果は多数の方法で測定されうる（Ｗ．Ａ．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｎｕｌｌ．Ｍｅｄ．５０：１Ｓ−１０Ｓ（２００９）；Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら，前掲を参照されたい）。幾つかの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答は、ＲＥＣＩＳＴ１．１基準、二次元ｉｒＲＣまたは一次元ｉｒＲＣを用いて評価される。幾つかの実施形態においては、抗腫瘍応答はＳＤ、ＰＲ、ＣＲ、ＰＦＳ、ＤＦＳのいずれかである。幾つかの実施形態においては、本発明の遺伝子シグネチャーバイオマーカーは、固形腫瘍を有する対象がＰＲまたはＣＲを達成しうるかどうかを予測する。
「二次元ｉｒＲＣ」は、Ｗｏｌｃｈｏｋ ＪＤら，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ： ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９；１５（２３）：７４１２−７４２０に記載されている基準のセットを意味する。これらの基準は標的病変の二次元腫瘍測定を用い、これは、各病変の最長直径と最長垂直直径（ｃｍ２）とを掛け算することにより得られる。
「生物療法剤」は、腫瘍の維持および／もしくは成長を支持する又は抗腫瘍免疫応答を抑制するいずれかの生物学的経路におけるリガンド／受容体シグナリングを遮断する生物学的分子、例えば抗体または融合タンパク質を意味する。
「癌」、「癌性」または「悪性」なる語は、無制御な細胞増殖により典型的に特徴づけられる、哺乳動物における生理的状態を意味し又は示す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、白血病、芽腫および肉腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような癌の更に詳細な例には、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸（管）癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌および頭頸部癌が含まれる。本発明に従い治療されうる特に好ましい癌には、被検組織サンプルにおけるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の一方または両方の発現の上昇により特徴づけられる癌が含まれる。
本明細書中で用いる「ＣＤＲ」または「ＣＤＲｓ」は、特に示されていない限り、Ｋａｂａｔ（カバト）の番号付け系を用いて定められる、免疫グロブリン可変領域内の相補性決定領域を意味する。
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化合物である。化学療法剤のクラスには、限定的なものではないが以下のものが含まれる：アルキル化剤、代謝拮抗剤、キナーゼ阻害剤、紡錘体毒植物アルカロイド、細胞毒性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼインヒビター、光増感剤、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、抗プロゲステロン、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）、エストロゲン受容体アンタゴニスト、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、抗アンドロゲン、アロマターゼインヒビター、ＥＧＦＲインヒビター、ＶＥＧＦインヒビター、異常な細胞増殖または腫瘍成長に関連した遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド。本発明の治療方法において有用な化学療法剤には、静細胞剤および／または細胞毒性剤が含まれる。
本明細書中で用いる「Ｃｌｏｔｈｉａ（クロチア）」は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら，ＪＭＢ ２７３：９２７−９４８（１９９７）に記載されている抗体の番号付け系を意味する。
「含む」、または「含み」、「含んでいて」もしくは「含まれる」のような変形は、明確な言語または必然的暗示によって文脈に矛盾している場合を除き、本明細書および特許請求の範囲の全体において包括的な意味で用いられ、すなわち、本発明の実施形態のいずれかの実施または有用性を実質的に促進しうる更なる特徴の存在または付加を排除することなく、示されている特徴の存在を特定するために用いられる。
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって用いる「から実質的になる」、または「から実質的になり」もしくは「から実質的になっていて」のような変形は、任意の列挙されている要素または要素群の包含、および特定されている投与レジメン、方法または組成物の基本的または新規特性を実質的に変化させない、列挙されている要素と類似した又は異なる性質の他の要素の随意的包含を示す。非限定的な例としては、遺伝子シグネチャースコアが、特定されている遺伝子一覧からなる遺伝子のセットに関する複合的ＲＮＡ発現スコアとして定義されている場合には、この遺伝子シグネチャースコアは、１以上の追加的遺伝子、好ましくは、３個以下の追加的遺伝子に関して決定されたＲＮＡレベルを含みうる（ただし、そのような包含は推測力に実質的な影響を及ぼさないものである）、と当業者は理解するであろう。
本明細書中で用いる「フレームワーク領域」または「ＦＲ」はＣＤＲ領域以外の免疫グロブリン可変領域を意味する。
「相同性」は、最適にアライメント（整列）された２つのポリペプチド配列の間の配列類似性を意味する。それらの２つの比較される配列の両方における位置が同一アミノ酸単量体サブユニットにより占拠されている場合、例えば、２つの異なるＡｂの軽鎖ＣＤＲにおける位置がアラニンにより占拠されている場合、それらの２つのＡｂはその位置において相同である。相同性の割合（％）は、２つの配列により共有される相同位置の数を、比較される位置の総数で割り算し、１００を掛け算したものである。例えば、２つの配列における位置の１０個中８個が、それらの配列が最適にアライメントされた場合に、一致（マッチ）している又は相同である場合、それらの２つの配列は８０％相同である。一般に、該比較は、最大相同性（％）を与えるように２つの配列がアライメントされた場合に行われる。例えば、該比較はＢＬＡＳＴアルゴリズムにより実施可能であり、この場合、該アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大マッチが得られるように選択される。
以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”．Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３”．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。「単離された抗体」および「単離された抗体フラグメント」は精製状態を指し、そのような文脈において、挙げられている分子が、他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質、例えば細胞残渣および増殖培地を実質的に含有しないことを意味する。一般に、「単離（された）」なる語は、そのような物質の完全な非存在または水、バッファーもしくは塩の非存在を意味するものではないが、それらは、本明細書に記載されている結合性化合物の実験用途または治療用途を実質的に妨げる量で存在してはならない。
本明細書中で用いる「Ｋａｂａｔ（カバト）」は、Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ（（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）により開拓された免疫グロブリンのアライメントおよび番号付け系を意味する。
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」または「Ｍａｂ」は実質的に均一な抗体の集団を意味し、すなわち、該集団を構成する抗体分子は、僅かな量で存在しうる考えられうる自然突然変異以外は、アミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに対して特異的であることが多い可変ドメイン、特にＣＤＲ内に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという該抗体の特性を示しており、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要するとは解釈されない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により製造可能である。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２２２：５８１−５９７に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されうる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。
ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に対する特異的抗腫瘍応答に言及する場合の「非応答患者」は、該患者が該抗腫瘍応答を示さなかったことを意味する。
「オリゴヌクレオチド」は、通常は５〜１００個の長さの連続的塩基、最も頻繁には、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０または２０〜２５個の長さの連続的塩基である核酸を意味する。
「患者」は、治療が望まれる又は臨床試験、疫学調査に参加している又は対照として用いられるいずれかの単一のヒト対象を意味する。
「ＰＤ−１アンタゴニスト」は、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫＴ細胞）上で発現されるＰＤ−１への、癌細胞上で発現されるＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する、そして好ましくはまた、免疫細胞により発現されるＰＤ−１への、癌細胞上で発現されるＰＤ−Ｌ２の結合を遮断する任意の化合物または生物学的分子を意味する。ＰＤ−１およびそのリガンドの別名または同義語には、ＰＤ−１に関するＰＤＣＤ１、ＰＤ１、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２；ＰＤ−Ｌ１に関するＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４およびＢ７−Ｈ；ならびにＰＤ−Ｌ２に関するＰＤＣＤ１Ｌ２、ＰＤＬ２、Ｂ７−ＤＣ、ＢｔｄｃおよびＣＤ２７３が含まれる。ヒト個体が治療される本発明の種々の態様および実施形態のいずれにおいても、ＰＤ−１アンタゴニストはヒトＰＤ−１へのヒトＰＤ−Ｌ１の結合を遮断し、そして好ましくは、ヒトＰＤ−１へのヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方の結合を遮断する。ヒトＰＤ−１アミノ酸配列はＮＣＢＩローカス（Ｌｏｃｕｓ）番号：ＮＰ ００５００９において見出されうる。ヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２アミノ酸配列は、それぞれ、ＮＣＢＩローカス番号ＮＰ ０５４８６２およびＮＰ ０７９５１５において見出されうる。
本発明の種々の態様および実施形態のいずれかにおいて有用なＰＤ−１アンタゴニストには、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、そして好ましくは、ヒトＰＤ−１またはヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはその抗原結合性フラグメントが含まれる。該ｍＡｂはヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることが可能であり、ヒト定常領域を含みうる。幾つかの実施形態においては、該ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４定常領域からなる群から選択され、好ましい実施形態においては、該ヒト定常領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。幾つかの実施形態においては、該抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖフラグメントからなる群から選択される。
ヒトＰＤ−１に結合し、本発明の種々の態様および実施形態において有用であるｍＡｂの例はＵＳ７５２１０５１、ＵＳ８００８４４９およびＵＳ８３５４５０９に記載されている。本発明の種々の態様および実施形態においてＰＤ−１アンタゴニストとして有用である具体的な抗ヒトＰＤ−１ ｍＡｂには、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．２，ｐｐ．１６１−１６２（２０１３）に記載されている構造を有するヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂであるペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１，ｐｐ．６８−６９（２０１３）に記載されている構造を有するヒトＩｇＧ４ ｍＡｂであるニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（ＢＭＳ−９３６５５８）；ピジリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）（ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ−１としても公知であるＣＴ−０１１）；ならびにＷＯ２００８／１５６７１２に記載されているヒト化抗体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７が含まれる。
本発明の種々の態様および実施形態のいずれかにおいて有用な追加的なＰＤ−１アンタゴニストには、ペンブロリズマブバイオシミラーまたはペンブロリズマブ変異体が含まれる。
本明細書中で用いる「ペンブロリズマブバイオシミラー」は、（ａ）Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．およびその子会社以外の企業体により販売されており、（ｂ）ペンブロリズマブバイオシミラーとして販売することに関して、いずれかの国の規制機関により承認されている生物学的製品を意味する。１つの実施形態においては、ペンブロリズマブバイオシミラーは薬物としてペンブロリズマブ変異体を含む。１つの実施形態においては、ペンブロリズマブバイオシミラーはペンブロリズマブと同じアミノ酸配列を有する。
本明細書中で用いる「ペンブロリズマブ変異体」は、軽鎖ＣＤＲの外部に位置する位置の３、２または１個の保存的アミノ酸置換および重鎖ＣＤＲの外部に位置する６、５、４、３、２または１個の保存的アミノ酸置換を有すること以外はペンブロリズマブにおけるものと同じ重鎖および軽鎖配列を含むモノクローナル抗体を意味し、例えば、変異位置はＦＲ領域または定常領域内に位置する。換言すれば、ペンブロリズマブおよびペンブロリズマブ変異体は同一ＣＤＲ配列を含むが、それぞれ、それらの完全長軽鎖および重鎖配列における３または６個以下の他の位置における保存的アミノ酸置換を有する点でそれぞれとは異なる。ペンブロリズマブ変異体は、以下の特性、すなわち、ＰＤ−１に対する結合アフィニティ、ならびにＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のそれぞれの結合を遮断する能力の点で、ペンブロリズマブと実質的に同じである。
ヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、本発明の種々の態様および実施形態のいずれかにおいて有用であるｍＡｂの例はＷＯ２０１３／０１９９０６、ＷＯ２０１０／０７７６３４ Ａ１およびＵＳ８３８３７９６に記載されている。本発明の種々の態様および実施形態においてＰＤ−１アンタゴニストとして有用である具体的な抗ヒトＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂには、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ））、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ））、ならびにＷＯ２０１３／０１９９０６のそれぞれ配列番号２４および配列番号２１の重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体が含まれる。
本発明の種々の態様および実施形態のいずれかにおいて有用な他のＰＤ−１アンタゴニストには、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、そして好ましくは、ヒトＰＤ−１またはヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するイムノアドヘシンが含まれ、例えば、免疫グロブリン分子のＦｃ領域のような定常領域に融合したＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外またはＰＤ−１結合性部分を含有する融合タンパク質が含まれる。ＰＤ−１に特異的に結合する分子上のイムノアドヘシンの例はＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されている。本発明の治療方法、医薬および使用におけるＰＤ−１アンタゴニストとして有用な特定の融合タンパク質には、ＰＤ−Ｌ２−ＦＣ融合タンパク質でありヒトＰＤ−１に結合するＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇとしても公知）が含まれる。
本明細書中で用いる「プローブ」は、表１に挙げられている関心のある遺伝子により発現される転写産物にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズしうる、そして幾つかの好ましい実施形態においては、関心のある遺伝子として表１に挙げられている特定の転写産物にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。
本明細書中で用いる「ＲＥＣＩＳＴ １．１応答基準」は、応答が測定されている状況に基づいて適切なものとして標的病変または非標的病変に関してＥｉｓｅｎｈａｕｅｒら，Ｅ．Ａ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４５：２２８−２４７（２００９）に記載されている定義を意味する。
本明細書中で用いる「基準ＩＦＮ−γ遺伝子シグネチャースコア」は、標的対象と同じ腫瘍型を有しＰＤ−１アンタゴニストで治療された対象の基準集団における非応答者の少なくとも過半数から応答者の少なくとも過半数を分けると判定されているＩＦＮ−γ遺伝子シグネチャーに関するスコアを意味する。好ましくは、基準集団における応答者の６０％、７０％、８０％または９０％の少なくともいずれかが、選択された基準スコアを超えるＩＦＮ−γ遺伝子シグネチャースコアを有し、一方、基準集団における非応答者の６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の少なくともいずれかに関するＩＦＮ−γ遺伝子シグネチャースコアが、選択された基準スコアより低い。幾つかの実施形態においては、基準スコアの陰性予測値は陽性予測値より大きい。幾つかの好ましい実施形態においては、基準集団における応答者は、ＲＥＣＩＳＴ １．１基準による測定で部分的応答（ＰＲ）または完全応答（ＣＲ）を達成した対象と定義され、非応答者は、いずれのＲＥＣＩＳＴ １．１臨床応答をも達成しなかったものと定義される。特に好ましい実施形態においては、基準集団における対象を、試験対象で検討されるものと実質的に同じ抗ＰＤ−１療法、すなわち、同じ又は実質的に類似した投与レジメンを用いる同じＰＤ−１アンタゴニストの投与で治療した。
本明細書において言及されている腫瘍またはいずれかの他の生物学的材料に言及する場合の「サンプル」は、被験者（対象）から摘出されたサンプルを意味し、したがって、本明細書に記載されている試験方法はいずれも、被験者において又は被験者上では行われない。
ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に対する特異的抗腫瘍応答に言及する場合の「応答患者」は、抗腫瘍応答を示した患者を意味する。
「持続的応答」は、治療用物質または組合せ療法（本明細書に記載されているもの）での治療の中止の後の持続的治療効果を意味する。幾つかの実施形態においては、持続的応答は、治療持続期間と少なくとも同じ、または治療持続期間より少なくとも１．５、２．０、２．５もしくは３倍長い持続期間を示す。
「組織切片」は、組織サンプルの単一の部分または断片、例えば、正常組織または腫瘍のサンプルから切断された組織の薄片を意味する。
本明細書中で用いる、癌を「治療する」または「治療」は、ＰＤ−１アンタゴニストまたは他の治療用物質を、癌を有する又は癌を有すると診断された対象に投与して、少なくとも１つの陽性（正）の治療効果、例えば、癌細胞数の減少、腫瘍サイズもしくは腫瘍負荷の減少、末梢器官内への癌細胞浸潤の速度の低下、または腫瘍転移もしくは腫瘍成長の速度の低下を達成することを意味する。癌における陽性の治療効果は幾つかの方法で測定されうる（Ｗ．Ａ．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５０：１Ｓ−１０Ｓ（２００９）；Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら，前掲を参照されたい）。幾つかの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストに対する応答は、ＲＥＣＩＳＴ １．１基準またはｉｒＲＣを用いて評価される。幾つかの実施形態においては、治療的有効量により達成される治療はＰＲ、ＣＲ、ＰＦＳ、ＤＦＳ、ＯＲまたはＯＳのいずれかである。幾つかの好ましい実施形態においては、本発明の遺伝子シグネチャーバイオマーカーは、固形腫瘍を有する対象がＰＲまたはＣＲを達成しうるかどうかを予測する。癌患者を治療するのに有効である、本明細書に記載されている療法の投与レジメンは、患者の病態、年齢および体重ならびに対象において抗癌応答を惹起する該療法の能力のような要因に応じて変動しうる。本発明の治療方法、医薬および使用の実施形態は、全ての対象において陽性治療効果を達成するのに有効だとは限らないが、当技術分野で公知のいずれかの統計的検定、例えばスチューデントｔ検定、カイ２乗検定、マンおよびホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンケーレ−テルプストラ検定およびウィルコクソン検定により判定された場合に、統計的に有意な数の対象においては有効であるはずである。
「腫瘍」は、癌を有すると診断された又は癌を有する疑いのある対象に適用される場合には、任意のサイズの悪性または潜在的に悪性の新生物または組織塊を意味し、原発腫瘍および続発性新生物を含む。固形（充実性）腫瘍は、嚢胞または液体領域を通常は含有しない、組織の異常成長または塊を意味する。種々のタイプの固形腫瘍が、それらを形成する細胞のタイプにちなんで命名されている。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌腫およびリンパ腫が挙げられる。白血病（血液の癌）は、一般に、固形腫瘍を形成しない（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｒｍｓ）。
「腫瘍量」は「腫瘍負荷」とも称され、全身に分布する腫瘍物質の総量を意味する。腫瘍負荷は、リンパ節および骨髄を含む身体全体にわたる癌細胞の総数または腫瘍の全サイズを意味する。腫瘍負荷は当技術分野で公知の種々の方法により決定可能であり、例えば、被験者からの摘除に際して例えばカリパスを使用して、あるいはイメージング技術、例えば超音波、骨スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）スキャンを用いて全身において、腫瘍の寸法を測定することにより決定されうる。
「腫瘍サイズ」なる語は、腫瘍の長さおよび幅として測定されうる腫瘍の全サイズを意味する。腫瘍サイズは当技術分野で公知の種々の方法により決定可能であり、例えば、被験者からの摘除に際して例えばカリパスを使用して、あるいはイメージング技術、例えば骨スキャン、超音波、ＣＴまたはＭＲＩスキャンを用いて全身において、腫瘍の寸法を測定することにより決定されうる。
「一次元ｉｒＲＣ」は、Ｎｉｓｈｉｎｏ Ｍ，Ｇｉｏｂｂｉｅ−Ｈｕｒｄｅｒ Ａ，Ｇａｒｇａｎｏ Ｍ，Ｓｕｄａ Ｍ，Ｒａｍａｉｙａ ＮＨ，Ｈｏｄｉ ＦＳ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｕｓｉｎｇ Ｕｎｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３；１９（１４）：３９３６−３９４３に記載されている基準のセット（組合せ）を意味する。これらの基準は各病変の最長直径（ｃｍ）を用いる。
本明細書中で用いる「可変領域」または「Ｖ領域」は、異なる抗体間で配列において可変性である、ＩｇＧ鎖のセグメントを意味する。それは軽鎖においてはＫａｂａｔ残基１０９まで、そして重鎖においては１１３まで伸長している。
ＩＩＩ．遺伝子発現プラットフォームの組成
本発明者らは、前記の表１に挙げられている５７個の臨床応答遺伝子および１１個の正規化遺伝子の遺伝子発現プラットフォームを構築し、更に、前記の表２に示されている遺伝子シグネチャーを特定した。該遺伝子シグネチャーは臨床応答遺伝子セットにおいて表されており、複数の腫瘍型にわたるペンブロリズマブに対する応答と相関する。これらの遺伝子シグネチャーのそれぞれに共通する幾つかの遺伝子が存在するため、本発明者らは、ＰＤ−１アンタゴニストに対する応答を予測する遺伝子シグネチャーバイオマーカーが、これらの任意のシグネチャーに関して、および表１における臨床応答遺伝子の２〜５７個の任意の組合せを含む他の遺伝子シグネチャーに関して得られうることを提案する。表１における各遺伝子のＲＮＡレベルを測定し、ついで、関心のある各遺伝子シグネチャーにおける遺伝子のみに関する正規化ＲＮＡレベルからシグネチャースコアを算出することにより、単一遺伝子発現分析系を用いて、異なる遺伝子シグネチャーおよび異なる腫瘍型に関する遺伝子シグネチャースコアを得、評価して、ＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答の候補バイオマーカーを得ることが可能である。
しかし、本発明者らは、表１に示されているプラットフォームに非常に類似した機能性をもたらす、臨床応答遺伝子セットと正規化遺伝子セットとを含む他の遺伝子発現プラットフォームが構築されうる、と想定している。ただし、該プラットフォームにおける遺伝子セットは以下の基準の全てを満たす必要がある：（１）臨床応答遺伝子セットにおける遺伝子は（ａ）２以上の腫瘍型におけるＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答と個々に相関し、（ｂ）該腫瘍型のそれぞれにおいて実質的に類似した共分散パターンを一括して生成する；（２）臨床応答遺伝子セットは約５０個〜約６０個の遺伝子からなり、臨床応答遺伝子の約９０％は、抗腫瘍応答と正に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、臨床応答遺伝子の約１０％は、抗腫瘍応答と負に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示す；（３）正規化遺伝子セットにおける遺伝子は種々の腫瘍型の複数のサンプルにわたる低い分散の腫瘍内ＲＮＡレベルを個々に示し、種々の腫瘍型における臨床応答遺伝子の腫瘍内発現レベルの範囲を含む範囲の腫瘍内ＲＮＡレベルを一括して示す；ならびに（４）正規化遺伝子セットは約１０個〜約１２個のハウスキーピング遺伝子を含む。
そのような代替的遺伝子発現プラットフォームは、後記の実施例２に記載されているアプローチに従い構築されうる。本発明の方法および系において有用な代替的遺伝子発現プラットフォームは表１における臨床応答遺伝子の少なくとも４０、４５、５０または５５個、および表１に示されていない１以上の追加的臨床応答遺伝子を含む。１つの実施形態においては、臨床応答遺伝子セットは５５〜５７個の任意の数の表１における臨床応答遺伝子を含み、正規化遺伝子セットは表１における正規化遺伝子の少なくとも９個、および表１に示されていない少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含む。
ＩＶ．モデルに基づく遺伝子シグネチャースコアの取得
遺伝子シグネチャースコアは、例えばロジスティックまたはコックス回帰における線形予測のようなフィット化（適合）モデル係数を用いてシグネチャースコアを決定する多変量統計モデルへの入力共変量のセットとして、全臨床応答遺伝子セットまたはその任意のサブセットを使用することにより取得しうる。多変量法の１つの具体例は弾性ネットモデリング（Ｚｏｕ ＆ Ｈａｓｔｉｅ，２００５，Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ Ｓｏｃ．Ｂ ６７（２）：３０１−３２０；Ｓｉｍｏｎら，２０１１，Ｊ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３９（５）：１−１３）の使用であり、これは、ペナルティパラメータを選択するために交差検定と共にラッソ（ｌａｓｓｏ）およびリッジ（ｒｉｄｇｅ）回帰のペナルティの間のハイブリッドを用いる罰金付（ｐｅｎａｌｉｚｅｄ）回帰アプローチである。臨床応答遺伝子の全てではなくともほとんどのＲＮＡ発現レベルは予測的なものであると予想されるため、１つの実施形態においては、Ｌ１ペナルティパラメータは、リッジ回帰を有効に行うために非常に低く設定されうる。
多変量アプローチは、癌適応にわたるデータを組合せるメタ分析を利用することが可能であり、あるいは単一癌適応において適用されうる。いずれの場合にも、分析は、入力予測変数としてのシグネチャー遺伝子の正規化腫瘍内ＲＮＡ発現レベルを、従属変数としての抗腫瘍応答と共に用いるであろう。そのような分析の結果は、抗腫瘍応答を予測するものであると予想されるシグネチャー遺伝子の正規化ＲＮＡ発現レベルに関する増倍係数の数的組合せとして、モデルフィットにおいて使用された患者からの腫瘍サンプルに関する及び将来の患者からの腫瘍サンプルに関するシグネチャースコアをアルゴリズム的に定める。遺伝子シグネチャースコアは、調整パラメータの選択された値における弾性ネットモデル係数の最終推定値により定められるとおり、シグネチャー遺伝子の線形結合により決定される。特に、与えられた腫瘍サンプルに関して、各遺伝子に関する推定係数に、該腫瘍サンプルにおけるその遺伝子の正規化ＲＮＡ発現レベルを掛け算し、得られた積を合計して、その腫瘍サンプルに関するシグネチャースコアを得る。弾性ネット以外の多変量モデルに基づく方法も、遺伝子シグネチャースコアを決定するために用いられうるであろう。
そのようなモデルに基づくシグネチャースコアに代わる代替手段は、単純平均法を用いることであろう。例えば、各腫瘍サンプルに関するシグネチャースコアは、抗腫瘍応答と正に関連しているとみなされるシグネチャー遺伝子に関するそのサンプルの正規化ＲＮＡ発現レベルの平均から、抗腫瘍応答と負に関連しているとみなされるシグネチャー遺伝子に関するそのサンプルの正規化ＲＮＡ発現レベルの平均を差し引いたものとして定められるであろう。
Ｖ．本発明の遺伝子シグネチャーおよびバイオマーカーの有用性
本明細書に記載されている系および方法を用いて得られる遺伝子シグネチャーおよび遺伝子シグネチャーバイオマーカーは、ＰＤ−１アンタゴニストでの治療から臨床利益を得る可能性が非常に高い癌患者を特定するために有用でありうる。この有用性は種々の研究および商業的用途におけるそのようなバイオマーカーの使用を支持し、これらには、遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して陽性または陰性の試験結果を患者が示すかどうかに基づいて患者が選択されるＰＤ−１アンタゴニストの臨床試験、患者の遺伝子シグネチャースコアを決定するための及び遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して陽性または陰性として患者を分類するための診断方法および製品、患者の遺伝子シグネチャースコアまたはバイオマーカー状態に基づいて患者の薬物療法を適合させる個別化治療方法、ならびに遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して陽性の試験結果を示す患者の治療に使用されるＰＤ−１アンタゴニストを含む医薬組成物および薬品が含まれるが、これに限定されるものではない。
本出願において特許請求されている研究および商業的用途のいずれかの有用性は、遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して陽性の試験結果を示す患者の１００％がＰＤ−１アンタゴニスト抗腫瘍応答を達成することを要するわけではなく、また、診断方法またはキットが各被験者（対象）におけるバイオマーカーの存在または非存在の決定における特定の度合の特異性または感度を有することを要するわけでもなく、また、ＰＤ−１アンタゴニストに対する有益な応答を被験者が有する可能性があるかどうかを各被験者に関して予測することにおいて、本出願で特許請求されている診断方法が１００％正確であることを要するわけでもない。したがって、「決定」、「判定」および「予測」なる語は明確または確実な結果を要すると解釈されるべきではなく、これらの語は、特許請求している方法が被験者の少なくとも過半数に関して正確な結果をもたらすこと、あるいはいずれかの与えられた被験者に関する結果または予測が不正確であるよりも正確である可能性が高いことを意味すると解釈されるべきである、と本発明者らは本発明において意図している。
好ましくは、本発明の診断方法により得られる結果の精度は、当業者または監督当局が、該方法が使用される個々の用途に適切だとみなすものである。
同様に、特許請求している薬品および治療方法の有用性は、特許請求している又は所望の効果が各癌患者において得られることを要しない。全ての適用可能な基準に合致して臨床実施者の専門的判断を行う際に、特許請求している方法に従い又は特許請求している組成物もしくは薬品で、与えられた患者を治療する場合に、特許請求している治療効果が達成されると臨床実施者によって判断されることが、必要な全てである。
Ａ．遺伝子シグネチャーおよびバイオマーカーに関する腫瘍サンプルのアッセイ
遺伝子シグネチャースコアは、対象（被験者）から摘出された腫瘍組織のサンプルにおいて決定される。該腫瘍は原発性または再発性であることが可能であり、任意の型、任意のステージ（病期）（例えば、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶまたは他の段階分け系の等価体）および／または組織学のものでありうる。対象は、任意の年齢、性別、治療歴ならびに／または寛解の度合および持続期間のものでありうる。
腫瘍サンプルは、外科的切除、吸引または生検（これらに限定されるものではない）を含む種々の方法により得られうる。組織サンプルは切片化され、新鮮な試料としてアッセイされうる。あるいは組織サンプルは更なる切片化のために凍結されうる。幾つかの好ましい実施形態においては、組織サンプルは固定およびパラフィンなどにおける包埋により保存される。
腫瘍組織サンプルは通常の方法により固定可能であり、固定の長さは組織サンプルのサイズおよび使用される固定剤に左右される。中性緩衝化ホルマリン、グルタルアルデヒド、ブアン（Ｂｏｕｉｎ’ｓ）およびパラホルムアルデヒドは固定剤の非限定的な例である。好ましい実施形態においては、組織サンプルをホルマリンで固定する。また、幾つかの実施形態においては、ＦＦＰＥ組織サンプルを調製するために、固定組織サンプルをパラフィン内に包埋する。
典型的には、組織サンプルを固定し、上昇系列のアルコールで脱水し、パラフィンまたは他の切片化媒体で浸潤および包埋して、組織サンプルを切片化することが可能である。あるいは、まず、腫瘍組織サンプルを切片化し、ついで個々の切片を固定する。
幾つかの好ましい実施形態においては、約３〜４ミリメートル、好ましくは４マイクロメートルのＦＦＰＥ組織切片を使用し、それをマウントし、顕微鏡スライド上で乾燥させて、腫瘍に関する遺伝子シグネチャースコアを決定する。
腫瘍組織の適切なサンプルが得られたら、それを分析して、表１における遺伝子のそれぞれに関する、またはそれから得られた遺伝子シグネチャーに関するＲＮＡ発現レベルを定量する。本明細書中で用いる「遺伝子のＲＮＡ発現レベルを決定する」なる表現は、その遺伝子から転写されたＲＮＡを検出および定量することを意味する。「ＲＮＡ転写産物」なる語は遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、ならびに／またはその特異的スプライス化変異体ならびに／またはそのようなｍＲＮＡおよびスプライス化変異体の断片を含む。幾つかの実施形態においては、表１の遺伝子のＲＮＡ転写産物は、表１に挙げられている標的領域を含む。
分析のために組織サンプルからＲＮＡを単離するためには多数の方法が用いられうると当業者は理解するであろう。例えば、ＲＮＡは、グアニジニウムイソチオシアナート中での均質化および酸フェノール−クロロホルム抽出により凍結組織サンプルから単離されうる。ＦＦＰＥサンプルからＲＮＡを単離するためには市販キットが利用可能である。
腫瘍サンプルがガラススライド上のＦＦＰＥ組織切片である場合、単離された全ＲＮＡ上ではなく全細胞ライセート上で遺伝子発現分析を行うことが可能である。これらのライセートは、後記の実施例１に記載されているとおりに調製されうる。
単離されたＲＮＡまたは全細胞ライセートにおいてＲＮＡ転写産物を検出し、そのレベルを定量するための幾つかの方法も当業者に公知である。定量的検出方法には、アレイ（すなわち、マイクロアレイ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、マルチプレックス（多重）アッセイ、ヌクレアーゼ保護アッセイおよびノーザンブロット分析が含まれるが、これらに限定されるものではない。一般に、そのような方法は、検出される各転写産物の一部分に相補的である標識プローブを使用する。これらの方法において使用されるプローブは、遺伝子およびそれにより発現される転写産物の公知配列に基づいて容易に設計されうる。幾つかの実施形態においては、表１における遺伝子の転写産物を検出するためのプローブは、表１に特定されているその遺伝子の標的領域に特異的にハイブリダイズするように設計される。プローブ用の適当な標識はよく知られており、例えば蛍光標識、化学発光標識および放射能標識を包含する。
幾つかの実施形態においては、表１における遺伝子の発現またはそれから得られる遺伝子シグネチャーに関する腫瘍サンプルのアッセイは、分子ビーコン検出分子と組合された核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を用いるリアルタイムでのＲＮＡレベルの検出および定量を用いる。ＮＡＳＢＡは、例えばＣｏｍｐｔｏｎ Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５０（６３１３）：９１−９２（１９９１）に記載されている。ＮＡＳＢＡは一工程等温ＲＮＡ特異的増幅法である。一般に、該方法は以下の工程を含む：ＲＮＡ鋳型を反応混合物に供与し、ここで、第１プライマーは該鋳型の３’末端におけるその相補的部位に結合する；逆転写酵素が逆の相補的ＤＮＡ鎖を合成する；ＲＮアーゼＨがＲＮＡ鋳型を破壊する（ＲＮアーゼＨはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにおけるＲＮＡのみを破壊し、一本鎖ＲＮＡを破壊しない）；第２プライマーがＤＮＡ鎖の３’末端に結合し、逆転写酵素がＤＮＡの第２鎖を合成する；およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡに結合し、相補的ＲＮＡ鎖を産生し、これは工程１において再使用可能であり、したがって該反応は循環的である。
他の実施形態においては、アッセイ形態は、フラップ（ｆｌａｐ）エンドヌクレアーゼに基づく形態、例えばＩｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。インベーダー法を使用する場合には、標的部位の３’側の領域に特異的な配列を含有するインベーダープローブ、および鋳型の標的部位の５’側の領域に特異的な配列を含有する一次プローブ、および無関係なフラップ配列を調製する。ついで、これらのプローブ、標的分子、ならびに蛍光色素およびクエンチャーの両方で標識された自己相補的配列およびフラップ配列に相補的な配列を含有するＦＲＥＴプローブの存在下、クリベースを作用させる。一次プローブが鋳型にハイブリダイズすると、インベーダープローブの３’末端が標的部位へと突き進み、この構造はクリベースにより切断されてフラップの解離をもたらす。フラップはＦＲＥＴプローブに結合し、蛍光色素部分がクリベースにより切断されて、蛍光の発光が生じる。
更に他の実施形態においては、アッセイ形態は、分岐ＤＮＡ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（商標），Ｐａｎｏｍｉｃｓ）またはＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）（Ｄｉｇｅｎｅ）を使用する直接ｍＲＮＡ捕捉を用いる。
本発明の遺伝子発現プラットフォームにおける遺伝子の発現の測定における使用に適したアレイ技術の一例はＡｒｒａｙＰｌａｔｅ（商標）アッセイ技術であり、これはＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｔｕｃｓｏｎ Ａｒｉｚｏｎａにより販売されており、Ｍａｒｔｅｌ，Ｒ．Ｒ．ら，Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １（１）：６１−７１，２００２に記載されている。簡潔に説明すると、この技術はヌクレアーゼ保護アッセイとアレイ検出とを組合せたものである。マイプロプレートウェル内の細胞をヌクレアーゼ保護アッセイに付す。標的ｍＲＮＡ種に結合するプローブの存在下で細胞を細胞溶解する。ＳＩヌクレアーゼを加えると、過剰のプローブおよび未ハイブリダイズｍＲＮＡが分解して、ｍＲＮＡ：プローブ二本鎖のみが残る。アルカリ加水分解は該二本鎖のｍＲＮＡ成分を破壊して、プローブを無傷のまま残す。中和溶液の添加の後、処理された細胞培養プレートの内容物を、プログラム化ＡｒｒａｙＰｌａｔｅ（商標）と称される別のＡｒｒａｙＰｌａｔｅ（商標）に移す。ＡｒｒａｙＰｌａｔｅ（商標）は各ウェルの底に１６素子アレイを含有する。各アレイ素子は、１つのアッセイから次のアッセイになっても同じ状態のままである位置特異的アンカーオリゴヌクレオチドを含む。それらの１６個のアンカーのそれぞれの結合特異性は、プログラミングリンカーオリゴヌクレオチドと称されるオリゴヌクレオチドで修飾され、これは一方の末端においてはアンカーに対して、そして他の末端においてはヌクレアーゼ保護プローブに対して相補的である。ハイブリダイゼーション反応中、培養プレートから移されたプローブは固定化プログラミングリンカーにより捕捉される。捕捉されたプローブは検出リンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより標識され、そして該検出リンカーオリゴヌクレオチドは、ペルオキシダーゼを取り込む検出コンジュゲートで標識される。該酵素は化学発光基質と共に供給され、酵素により生じた光がデジタルイメージにおいて捕捉される。アレイ素子における光強度は、元の細胞に存在する対応標的ｍＲＮＡの量の尺度である。
更なる例としては、遺伝子発現を測定するためにＤＮＡマイクロアレイが使用されうる。簡潔に説明すると、ＤＮＡマイクロアレイはＤＮＡチップとも称され、固体支持体上に一定のパターンで配置された合成オリゴヌクレオチドのようなＤＮＡ断片の顕微鏡的アレイであり、この場合、それらは標準的なハイブリダイゼーション法による分析に適している（Ｓｃｈｅｎａ，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １８：４２７（１９９６）を参照されたい）。典型的なマイクロアレイならびにそれらの製造および使用のための方法はＴ．Ｒ．Ｈｕｇｈｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３４２−３４７（２００１）に記載されている。多数の様々なマイクロアレイ形態およびそれらの製造方法が当業者に公知であり、以下のものに開示されている：米国特許第５，２４２，９７４号、第５，３８４，２６１号、第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号、第５，４２４，１８６号、第５，４２９，８０７号、第５，４３６，３２７号、第５，４４５，９３４号、第５，５５６，７５２号、第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号、第５，４２４，１８６号、第５，４２９，８０７号、第５，４３６，３２７号、第５，４７２，６７２号、第５，５２７，６８１号、第５，５２９，７５６号、第５，５４５，５３１号、第５，５５４，５０１号、第５，５６１，０７１号、第５，５７１，６３９号、第５，５９３，８３９号、第５，６２４，７１１号、第５，７００，６３７号、第５，７４４，３０５号、第５，７７０，４５６号、第５，７７０，７２２号、第５，８３７，８３２号、第５，８５６，１０１号、第５，８７４，２１９号、第５，８８５，８３７号、第５，９１９，５２３号、第６，０２２，９６３号、第６，０７７，６７４号および第６，１５６，５０１号；Ｓｈｅｎａら，Ｔｉｂｔｅｃｈ ６：３０１−３０６，１９９８；Ｄｕｇｇａｎら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０−１４，１９９９；Ｂｏｗｔｅｌｌら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２５−３２，１９９９；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２０−２４，１９９９；Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ７７：６８７−９０，１９９６；Ｍａｓｋｏｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２：４６６３−６９，１９９３；ならびにＨｕｇｈｅｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：３４２−３４７，２００１。種々の用途におけるアレイの使用方法を記載している特許には、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，２８８，６４４号、第５，３２４，６３３号、第５，４３２，０４９号、第５，４７０，７１０号、第５，４９２，８０６号、第５，５０３，９８０号、第５，５１０，２７０号、第５，５２５，４６４号、第５，５４７，８３９号、第５，５８０，７３２号、第５，６６１，０２８号、第５，８４８，６５９号、第５，８７４，２１９号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）が含まれる。
１つの実施形態においては、オリゴヌクレオチドのアレイは固体支持体上で合成されうる。典型的な固体支持体には、ガラス、プラスチック、ポリマー、金属、メタロイド、セラミックス、有機物などが含まれる。チップマスキング技術および光保護化学を用いて、核酸プローブの秩序だったアレイを作製することが可能である。これらのアレイは例えば「ＤＮＡチップ」または非常に大規模の固定化ポリマーアレイ（「ＶＬＳＩＰＳ（登録商標）」アレイ）として公知であり、約１ｃｍ２〜数ｃｍ２の面積を有する基体上に数百万個の一定のプローブ領域を含み、それにより数個〜数百万個のプローブを含むことが可能である（例えば、米国特許第５，６３１，７３４号を参照されたい）。
発現レベルを比較するために、アレイ上のプローブと標的核酸との結合に十分な条件下、標識核酸をアレイと接触させることが可能である。１つの実施形態においては、ハイブリダイゼーション条件は、所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性が得られるように選択されうる（すなわち、マイクロアレイ上のプローブと標識核酸とのハイブリダイゼーションが生じるのに十分な条件）。
ハイブリダイゼーションは、実質的に特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件において行われうる。核酸の長さおよびＧＣ含量は熱融解温度を決定し、したがって、標的核酸に対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションを得るのに必要なハイブリダイゼーション条件を決定する。これらの要因は当業者によく知られており、アッセイにおいても試験されうる。核酸ハイブリダイゼーションの詳細な指針はＴｉｊｓｓｅｎら，（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編，；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３））において見出されうる。前記の方法はアレイ表面上の標識標的核酸のハイブリダイゼーションパターンの生成をもたらす。標識核酸の、得られたハイブリダイゼーションパターンは、種々の方法で可視化または検出可能であり、個々の検出方法は標的核酸の個々の標識に基づいて選択される。代表的な検出手段には、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、発光測定、光散乱などが含まれる。
１つのそのような検出方法は、商業的に入手可能（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）なアレイスキャナー、例えば４１７（登録商標）Ａｒｒａｙｅｒ、４１８（登録商標）アレイスキャナーまたはＡｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ（登録商標）スキャナーを使用する。このスキャナーは、インターフェースおよび使いやすいソフトウェアツールを伴うシステムコンピュータから制御される。出力は種々のソフトウェアアプリケーション内に直接取り込まれ、または種々のソフトウェアアプリケーションによって直接読取られうる。典型的なスキャニング装置は例えば米国特許第５，１４３，８５４号および第５，４２４，１８６号に記載されている。
表１に挙げられている遺伝子に関する転写産物の存在量を測定するための好ましいアッセイ法は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＵＳＡ）により販売されているｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析系（Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用する。この系はＧｅｉｓｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（３）：３１７−３２５（２００８）に記載されており、プローブのペア、すなわち、捕捉プローブおよびレポータープローブを使用し、それぞれは、検出されるべき転写産物に相補的な３５〜５０塩基の配列を含む。捕捉プローブは更に、固定化タグ（例えば、データ収集のために複合体が固定化されることを可能にするアフィニティタグ）に結合した短い共通配列を含む。レポータープローブは更に、検出可能なシグナルまたは標識を含み、例えば、色分けされたタグに結合している。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブをサンプルから除去し、ハイブリダイズしたプローブ／標的複合体を整列させ、カートリッジにおいてアフィニティタグまたは他のタグを介して固定化する。ついで、例えば、この目的に適合させたデジタル分析装置または他のプロセッサを使用して、サンプルを分析する。一般に、各転写産物上の色分けされたタグを計数し、各標的転写産物に関して集計して、サンプルにおける各転写産物の発現レベルを得る。この系は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇにより設計された捕捉およびレポータープローブを使用する単一のマルチプレックスアッセイにおいて数百個の固有遺伝子産物の発現を測定することを可能にする。
本明細書に記載されている表１における臨床応答遺伝子の発現の測定においては、腫瘍サンプルにおける該遺伝子のそれぞれの絶対的発現を対照と比較する。例えば、対照は、それぞれ、被験者のプールにおける該遺伝子のそれぞれの発現の平均レベルでありうる。しかし、比較の感度を増加させるために、発現レベル値は、好ましくは、多数の方法で変換される。
本明細書に記載されている遺伝子発現プラットフォームにおける臨床応答遺伝子の生発現値は、共通基準分布への分位正規化、ハウスキーピング遺伝子のセットの平均ＲＮＡレベル、パーセンタイル（例えば、７５パーセンタイル）に基づく包括的正規化または当業者に公知の他の生物学的に妥当な正規化アプローチのいずれかにより正規化されうる。
例えば、各臨床応答遺伝子の発現レベルは、遺伝子発現プラットフォームにおける遺伝子の全ての平均ＲＮＡ発現レベルにより、または正規化遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子のセットの平均発現レベルにより正規化されうる。したがって、１つの実施形態においては、遺伝子発現プラットフォームにおける遺伝子はプローブのセットにより表され、該遺伝子のそれぞれのＲＮＡ発現レベルは、表された遺伝子の全てにわたる、すなわち、本明細書に記載されている遺伝子発現プラットフォームにおける全ての臨床応答および正規化遺伝子にわたる平均または中央値発現レベルにより正規化される。特定の実施形態においては、正規化は、遺伝子発現プラットフォームにおける遺伝子の全てのＲＮＡ発現の中央値または平均レベルを割ることにより行われる。もう１つの実施形態においては、臨床応答遺伝子のＲＮＡ発現レベルは正規化遺伝子のセットの平均または中央値レベルにより正規化される。特定の実施形態においては、正規化遺伝子はハウスキーピング遺伝子を含む。もう１つの特定の実施形態においては、臨床応答遺伝子に関する測定されたＲＮＡ発現レベルの正規化は、測定されたレベルを正規化遺伝子の中央値または平均発現レベルにより割り算することにより達成される。
遺伝子シグネチャーにおける個々の遺伝子の発現レベルを腫瘍サンプルのプールにおける同じ遺伝子の発現と比較した場合、遺伝子シグネチャースコアの感度は増加しうる。好ましくは、該比較はサンプルのプールにおける各シグネチャー遺伝子の平均または中央値発現レベルに対するものである。これは、サンプルにおける遺伝子とプール全体における遺伝子との間の発現における相対的相違を強調する効果を有し、比較をより高感度にし、有意義な結果をもたらす可能性が絶対的発現レベルのみの使用より高い。発現レベルのデータはいずれかの簡便な方法で変換されうる。好ましくは、全遺伝子に関する発現レベルのデータは、平均または中央値を取る前に対数変換される。
プールに対する比較を行う際には、２つのアプローチが用いられうる。第１に、サンプルにおけるシグネチャー遺伝子の発現レベルはプールにおけるそれらの遺伝子の発現レベルと比較可能であり、ここで、サンプルに由来する核酸およびプールに由来する核酸は単一実験の経過中にハイブリダイズされうる。そのようなアプローチは、核酸の新たなプールが各比較または限られた数の比較のために作製されることを要し、したがって、利用可能な核酸の量によって制限される。あるいは、そして好ましくは、プールにおける発現レベルは、正規化および／または変換されているか否かにかかわらず、コンピュータ上またはコンピュータ可読媒体上に保存されて、サンプルからの個々の発現レベルのデータ（すなわち、単一チャネルデータ）との比較において使用される。
被験者の腫瘍サンプルを標準または対照と比較する場合、サンプルにおける個々の遺伝子の発現値を標準または対照におけるその遺伝子の発現値と比較する。本発明の遺伝子シグネチャーにおける各遺伝子に関して、標準または対照に対する個々のサンプルにおける発現値に関するｌｏｇ（１０）比を得る。該シグネチャーにおける遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比を決定することにより、遺伝子シグネチャーのスコアを算出する。試験サンプルの遺伝子シグネチャースコアがその遺伝子シグネチャーに関する所定閾値以上であれば、該サンプルは該遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して陽性とみなされる。また、所定閾値は、標準または対照として使用されるサンプルの収集物またはプール化サンプルにおけるその遺伝子シグネチャーのスコアの平均、中央値またはパーセンタイルでありうる。
シグネチャースコアを算出するためには、ｌｏｇ（１０）比以外の他の差次的発現値が使用されうる、と当業者により認識される。ただし、該値は遺伝子の転写産物の存在量の客観的測定値を表すものでなければならない。具体例には、ｘｄｅｖ、誤差重み付け（ｅｒｒｏｒ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ）ｌｏｇ（比）および平均差分（ｍｅａｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）ｌｏｇ（強度）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
組織サンプルを得る工程、遺伝子発現をアッセイするためにそれから１以上の組織切片を調製する工程、該アッセイを行う工程および結果をスコア化（評価）する工程のそれぞれは別々の場所において別々の個人によって行われうる。例えば、外科医が癌患者の腫瘍から生検により組織サンプルを得、ついで該組織サンプルを病理試験施設へ送ることが可能であり、該試験施設の技師が該組織サンプルを固定し、ついで、単一組織切片をそれぞれが含有する１以上のスライドをアッセイ用に調製することが可能である。該スライドは調製直後にアッセイされ、または将来のアッセイのために保存されうる。組織切片を調製した試験施設はアッセイを行い、またはアッセイの実施のために該スライドを異なる試験施設へ送ることが可能である。遺伝子シグネチャーに関して該スライドをスコア化する技師は診断試験施設の勤務者であってもよく、あるいは独立した契約者であってもよい。あるいは、１つの診断試験施設が被験者の医師または外科医から組織サンプルを得、ついで、組織切片の調製、スライドのアッセイおよび組織切片に関する遺伝子シグネチャースコアの算出に関わる工程の全てを行う。
幾つかの実施形態においては、遺伝子シグネチャーまたは遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関する組織切片の調製およびアッセイに関わる者は、試験されるサンプルの被験者の正体（誰であるか）を知らない。すなわち、試験施設が受け取るサンプルは、該試験施設に送られる前に、何らかの形で匿名化されている。例えば、サンプルは番号または何らかの他の記号（「サンプルＩＤ」）のみによって特定されることが可能であり、該アッセイの結果は、サンプルＩＤを使用して試験発注者に報告される。好ましい実施形態においては、被験者の正体と被験者の組織サンプルとの関連性は本人または本人の医師しか知らない。
幾つかの実施形態においては、試験結果が得られた後、診断試験施設は試験報告を作成する。試験報告は以下の結果のいずれか１つ又は両方を含みうる：組織サンプルがバイオマーカー陽性または陰性であったこと、腫瘍サンプルに関する遺伝子シグネチャースコア、およびその遺伝子シグネチャーに関する基準スコア。試験報告は、アッセイにおいて発現が分析された遺伝子の一覧をも含みうる。
他の実施形態においては、試験報告は、被験者がＰＤ−１アンタゴニストに応答する可能性があるかどうかを予測するための結果をどのように解釈するかに関する指針をも含みうる。例えば、１つの実施形態においては、試験腫瘍サンプルが黒色腫からのものであり、所定閾値以上の遺伝子シグネチャースコアを有する場合には、試験報告は、ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に対する応答またはより良好な応答に関連したスコアを被験者が有することを示すことが可能であり、一方、遺伝子シグネチャースコアが閾値未満である場合には、試験報告は、ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に対する無応答または不良な応答に関連したスコアを患者が有することを示す。
幾つかの実施形態においては、試験報告は、診断試験施設により作成された文書であり、ハードコピーとして又は電子メールにより患者または患者の医師へ送られる。他の実施形態においては、試験報告はコンピュータプログラムにより作成され、医師の診察室内のビデオモニター上に表示される。試験報告は、直接的に患者または患者の医師または医院における許可された従業員への試験結果の口頭伝達をも含みうる。同様に、試験報告は、患者のファイルにおいて医師が作成する試験結果の記録を含みうる。
本明細書に記載されている遺伝子発現プラットフォームまたは遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現に関する腫瘍サンプルのアッセイは、この目的のために特別に設計されたキットを使用して行われうる。１つの実施形態においては、該キットは、表１に挙げられている標的転写産物のセットにハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブのセットを含む。もう１つの実施形態においては、該キットは、１８遺伝子アップ−ダウンシグネチャーにおける遺伝子に関して及び表１Ｃにおける正規化遺伝子に関して表１に挙げられている標的転写産物のセットにハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブのセットを含む。オリゴヌクレオチドプローブのセットは、例えばマイクロチップ、シリカビーズ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡのＢｅａｄＡｒｒａｙテクノロジー）またはガラススライドのような固体表面上のオリゴヌクレオチドの秩序だったアレイを含みうる（例えば、ＷＯ ９８／２００２０およびＷＯ ９８／２００１９を参照されたい）。幾つかの実施形態においては、該オリゴヌクレオチドプローブは液体または乾燥形態の１以上の組成物中で提供される。
本発明のキットにおけるオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡ転写産物またはそれから作製されたｃＤＮＡの標的領域に特異的にハイブリダイズしうる。本明細書中で用いる特異的ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドが或るハイブリダイゼーション条件下で標的領域とは逆平行二本鎖構造を形成するが、同じハイブリダイゼーション条件下で該ポリヌクレオチドと共にインキュベートされた場合に非標的領域とはそのような構造を形成しないことを意味する。該キットにおける各オリゴヌクレオチドの組成および長さは、標的領域を含有する転写産物の性質、および該オリゴヌクレオチドで行われるアッセイのタイプに左右され、当業者によって容易に決定される。
幾つかの実施形態においては、該キットにおける各オリゴヌクレオチドはその標的領域の完全な相補体である。オリゴヌクレオチドが別の核酸分子の「完全」または「完璧」な相補体と言えるのは、該分子の１つの各ヌクレオチドが他方の分子の対応位置におけるヌクレオチドに相補的である場合である。表１の遺伝子の転写産物を検出するためには、完全に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましいが、完全な相補性からの逸脱が想定される。ただし、そのような逸脱は、前記の標的領域に該分子が特異的にハイブリダイズすることを妨げるものであってはならない。例えば、オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端または３’末端に１以上の非相補的ヌクレオチドを有することが可能であり、該プローブの残部は標的領域に完全に相補的である。あるいは、非相補的ヌクレオチドが該プローブ内に点在していてもよいが、この場合、生じるプローブは標的領域に尚も特異的にハイブリダイズしうることが必要である。
幾つかの好ましい実施形態においては、各該キットにおけるオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、その標的領域に特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は配列依存的であり、状況に応じて様々である。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、一定のイオン強度およびｐＨにおいて特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（一定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度におけるもの）である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍにおいては、プローブの５０％が平衡状態で占拠される。
典型的には、ストリンジェントな条件はｐＨ７．０〜８．３において少なくとも約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）の塩濃度を含み、温度は短いオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約２５℃である。ストリンジェントな条件は、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成されうる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）の条件および２５〜３０℃の温度は対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。追加的なストリンジェントな条件はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），第７，９および１１章、ならびにＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｈａｙｍｅｓら，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８５に見出されうる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な一例には、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーション（あるいは、約４２〜５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％ ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）、およびそれに続く、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中の１回以上の洗浄が含まれる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な一例には、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（あるいは、約４２〜５０℃での１×ＳＳＣ＋５０％ ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）、およびそれに続く、約６５〜７０℃での０．３×ＳＳＣ中の１回以上の洗浄が含まれる。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な一例には、約５０〜６０℃での４×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション（あるいは、約４０〜４５℃での６×ＳＳＣ＋５０％ ホルムアミド中のハイブリダイゼーション）、およびそれに続く、約５０〜６０℃での２×ＳＳＣ中の１回以上の洗浄が含まれる。中等度〜前記値（例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃）の範囲のストリンジェンシー条件も本発明に含まれると意図される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーにおいてはＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍ ＮａＣ１、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）がＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）の代わりに使用されうる。洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、それぞれ１５分間行われる。
５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度はハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０度低いべきであり、ここで、Ｔｍは以下の式に従い決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８〜４９塩基対長のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの場合の［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
本発明のキットにおけるオリゴヌクレオチドは、任意のリン酸化状態のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および非環状ヌクレオチド誘導体、および他の機能的等価誘導体を含みうる。あるいはオリゴヌクレオチドはホスファート非含有バックボーンを有することが可能であり、これはカルボキシメチル、アセトアミド、カルバマート、ポリアミド（ペプチド核酸（ＰＮＡ））などのような結合を含みうる（Ｖａｒｍａ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ａ ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＤＥＳＫ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ，Ｍｅｙｅｒｓ編，ｐｐ．６ １７−２０，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５）。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の適当な方法を用いる化学合成により製造可能であり、あるいは生物学的サンプルから、例えば制限消化により、得ることができる。オリゴヌクレオチドは、放射能標識、蛍光標識、酵素標識、タンパク質、ハプテン、抗体、配列タグなどの使用を含む、当技術分野で公知の任意の技術に従う、検出可能な標識を含有しうる。該キットにおけるオリゴヌクレオチドはアナライト特異的試薬（ＡＳＲ）として製造され、販売されることが可能であり、あるいは、承認された診断装置の構成成分でありうる。
本発明のキットは他の試薬、例えばハイブリダイゼーションバッファー、および特異的標的分子とのハイブリダイゼーションが生じた場合に検出するための試薬をも含有しうる。検出試薬は、ビオチンタグ化もしくは蛍光タグ化オリゴヌクレオチドおよび／または酵素標識抗体、ならびに酵素作用に際して検出可能なシグナルを生成する１以上の基質を含みうる。アッセイを行うための試薬およびオリゴヌクレオチドのセットは、生物学的または化学的活性を維持するのに適当であるならば、キット容器内に配置された別々の容器内で提供され、アッセイにおける適切な使用を可能にする、と当業者に理解される。
他の実施形態においては、該オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれ及び該キットにおける全ての他の試薬は、表１における遺伝子または表２における遺伝子シグネチャーにおける遺伝子および表１Ｃにおける正規化遺伝子の、ＦＦＰＥ腫瘍切片における腫瘍ＲＮＡ発現レベルを定量するために設計されたアッセイにおける最適な性能に関して品質検査されている。幾つかの実施形態においては、該キットは、定量されたＲＮＡ発現レベルから遺伝子シグネチャースコアを算出する方法を記載している取扱い説明書を含む。
Ｂ．医薬組成物、薬品および治療レジメン
本明細書に記載されている方法および産物のいずれかにより治療される個体は、腫瘍を有すると診断されたヒト被験者であり、被験者の腫瘍のサンプルは、本明細書に記載されている遺伝子発現プラットフォームを使用して誘導される遺伝子シグネチャーバイオマーカーの存在または非存在に関する試験において使用するために利用可能または入手可能である。
腫瘍組織サンプルは、１以上の治療レジメン（例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト、化学療法剤、放射線療法）に被験者を付す前および／または後、被験者から収集されうる。したがって、腫瘍サンプルは或る期間にわたって被験者から収集されうる。腫瘍サンプルは、外科的切除、吸引または生検（これらに限定されるものではない）を含む種々の方法により得られうる。
医師は、ＰＤ−１アンタゴニストまたは他の化学療法剤での治療に感受性である型の癌を有すると診断された患者の治療方法を決定する際の指針として遺伝子シグネチャースコアを使用することが可能である。ＰＤ−１アンタゴニストまたは他の化学療法剤での治療の開始前に、医師は、典型的には、患者から摘出された腫瘍組織サンプルが遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して陽性であるか陰性であるかを決定するための診断試験を指示するであろう。しかし、医師は、ＰＤ−１アンタゴニストまたは他の化学療法剤の第１用量が個体に投与された後の任意の時点で最初または後続の診断試験を指示しうると予想される。幾つかの実施形態においては、医師は、遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して陽性の試験結果を示す腫瘍を有する患者に適応する医薬品で患者を治療すべきかどうかを考慮しうる。例えば、報告されたスコアが、ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に対する応答またはより良好な応答に関連した所定閾値以上である場合には、患者は、少なくともＰＤ−１アンタゴニスト（所望により、１以上の化学療法剤と組合されていてもよい）を含む治療レジメンで治療され、報告された遺伝子シグネチャースコアが、ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に対する無応答または不良な応答に関連した所定閾値スコア未満である場合には、患者は、任意のＰＤ−１アンタゴニストを含まない治療レジメンで治療される。
いずれかの個々の患者の治療における遺伝子シグネチャー試験結果の使用方法を決定する際に、医師は、他の関連する状況、例えば癌の病期、患者の体重、性別および全身状態をも考慮すること（療法および／またはその療法での治療レジメンの選択において医師を導くのを助けるモデルにこれらの要因および遺伝子シグネチャーバイオマーカー試験結果の組合せを入力することを含む）が可能である。
医師は、バイオマーカー陽性の試験結果を示す患者を、ＰＤ−１アンタゴニストと１以上の追加的な治療用物質とを含む組合せ療法（併用療法）レジメンで治療することを選択しうる。そのような追加的な治療用物質は、例えば化学療法剤、生物療法剤（ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ−４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−ＩＢＢおよびＩＣＯＳに対する抗体を含むが、これらに限定されるものではない）、免疫原性剤（例えば、弱毒化癌細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸でパルスされた樹状細胞のような抗原提示細胞、免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮα２、ＧＭ−ＣＳＦ）、および免疫刺激性サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ（これに限定されるものではない）をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞）でありうる。
化学療法剤の例には以下のものが含まれる：アルキル化剤、例えばチオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）およびシクロスホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；アルキルスルホナート、例えばブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、イムプロスルファン（ｉｍｐｒｏｓｕｌｆａｎ）およびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミンおよびメチルアメルアミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例えばアルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｍｅ）；アセトゲニン（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｎ）（特にブルラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）およびブルラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）（合成類似体トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）を含む）；ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ）；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成類似体を含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；ドュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成類似体ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エリューテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；窒素マスタード、例えばクロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メクロルエタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メクロルエタミンオキシド塩酸塩、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード（ｕｒａｃｉｌ ｍｕｓｔａｒｄ）；ニトロソウレア、例えばカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質［例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、特にカリケアマイシン・ガンマ１Ｉおよびカリケアマイシン・ファイＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照されたい）；ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、例えばダイネマイシンＡ；ビスホスホナート、例えばクロドロナート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）；エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ならびにネオカルジノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団］、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン（ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメックス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）；プリン類似体、例えばフルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ジデオキシウリジン（ｄｉｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロクスリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）プロピオナート、エピチオスタノール（ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）；抗アドレナール、例えばアミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、トリロスタン（ｔｒｉｌｏｓｔａｎｅ）；葉酸補充物、例えばフロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン（ａｃｅｇｌａｔｏｎｅ）；アルドホスファミド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）グリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、例えばメイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトザントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）（特にＴ−２毒素、ベルラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）；ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）；タキソイド、例えばパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）；メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）；白金類似体、例えばシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）およびカルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）；ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）；白金；エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）（ＶＰ−１６）；イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ミトザントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）；ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）；アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）；キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；ならびに前記のいずれかのものの医薬上許容される塩、酸または誘導体。また、例えば以下のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節または抑制するよう作用する抗ホルモン剤も含まれる：抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびトレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター、例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、酢酸メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、フォルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎ）、ファドロゾール（ｆ
ａｄｒｏｚｏｌｅ）、ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）およびアナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）；ならびに抗アンドロゲン、例えばフルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）およびゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）；ならびに前記のいずれかのものの医薬上許容される塩、酸または誘導体。
バイオマーカー陽性患者を治療するために用いられる組合せ療法における各治療用物質は、単独で、または該治療用物質と１以上の医薬上許容される担体、賦形剤および希釈剤を含む医薬（本明細書においては医薬組成物とも称される）中で、標準的な医薬慣例に従い投与されうる。
バイオマーカー陽性患者を治療するために用いられる組合せ療法における各治療用物質は、同時に（すなわち、同一医薬中で）、共に（すなわち、いずれかの順序で次々と投与される別々の医薬中で）、またはいずれかの順序で連続的に投与されうる。該組合せ療法における治療用物質が、異なる剤形である（１つの物質は錠剤またはカプセル剤であり、もう１つの物質は無菌液体である）、および／または異なる投与スケジュールで投与される（例えば、少なくとも毎日投与される化学療法剤、および週１回、２週間に１回または３週間に１回のようにそれほど頻繁には投与されない生物療法剤）場合には、連続的投与が特に有用である。
幾つかの実施形態においては、該組合せ療法における治療用物質の少なくとも１つは、該物質が同じ癌の治療のための単独療法として使用される場合に典型的に用いられるのと同じ投与レジメン（治療の用量、頻度および持続期間）を用いて投与される。他の実施形態においては、患者は、該組合せ療法における治療用物質の少なくとも１つの、該物質が単独療法として使用される場合より低い総量（例えば、より小さい用量、より低い頻度の投与および／またはより短い治療持続期間）の投与を受ける。
バイオマーカー陽性患者を治療するために用いられる組合せ療法における各治療用物質は、経口的または非経口的（静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸、局所および経皮投与経路を含む）に投与されうる。
ＰＤ−１アンタゴニストは、腫瘍を摘出するための手術の前または後で患者に投与されることが可能であり、放射線療法の前、途中または後で使用されうる。
幾つかの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは、生物療法剤または化学療法剤で未だ治療されていない（すなわち、未治療）患者に投与される。他の実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストは、生物療法剤または化学療法剤での過去の療法の後で持続的応答が得られなかった（すなわち、治療経験）患者に投与される。
ＰＤ−１アンタゴニストを含む療法は、典型的には、触診により又は当技術分野でよく知られているイメージング技術、例えばＭＲＩ、超音波もしくはＣＡＴスキャンにより見出されるのに十分な程度に大きな腫瘍を治療するために用いられる。幾つかの好ましい実施形態においては、該療法は、少なくとも約２００ｍｍ３、３００ｍｍ３、４００ｍｍ３、５００ｍｍ３、７５０ｍｍ３、または１０００ｍｍ３までの寸法を有する進行期腫瘍を治療するために用いられる。
ＰＤ−１アンタゴニストを含む療法のための投与計画（本明細書においては投与レジメンとも称される）の選択は、該物質の血清または組織代謝回転速度、症状の程度、該物質の免疫原性、および治療される個体における標的細胞、組織または器官の接近可能性を含む幾つかの要因に左右される。好ましくは、投与計画は、許容可能なレベルの副作用と調和して患者に運搬されるＰＤ−１アンタゴニストの量を最大にする。したがって、用量および投与頻度は、部分的には、個々のＰＤ−１アンタゴニスト、使用されるいずれかの他の治療用物質、および治療される癌の重症度、および患者の特性に左右される。抗体、サイトカインおよび小分子の適当な用量を選択する際の指針が利用可能である。例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎら（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７ｔｈ Ｅｄ）；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；第５７版（２００２年１１月）を参照されたい。適当な投与計画の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野で知られている若しくは疑われている又は治療に影響を及ぼすと予想されるパラメータまたは因子を用いて、臨床家によりなされることが可能であり、例えば、患者の臨床履歴（例えば、過去の治療）、治療される癌のタイプおよび病期、ならびに該組合せ療法における治療用物質の１以上に対する応答のバイオマーカーに左右されるであろう。
ＰＤ−１アンタゴニストと組合せて使用される生物療法剤は、連続的注入により、または例えば、毎日、隔日、週３回、または週１回、２週間に１回、３週間に１回、毎月、隔月などの間隔での投与により投与されうる。毎週の全用量は、一般に、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ、０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ体重以上である。例えば、Ｙａｎｇら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４；Ｈｅｒｏｌｄら（２００２）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８；Ｌｉｕら（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４を参照されたい。
ＰＤ−１アンタゴニストとして抗ヒトＰＤ−１ ｍＡｂを使用する幾つかの実施形態においては、投与計画は、治療経過の全体にわたって約１４日（±２日）または約２１日（±２日）または約３０日（±２日）の間隔で１、２、３、５または１０ｍｇ／ｋｇの用量で抗ヒトＰＤ−１ ｍＡｂを投与することを含むであろう。
ＰＤ−１アンタゴニストとして抗ヒトＰＤ−１ ｍＡｂを使用する他の実施形態においては、投与計画は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で、患者内用量増加を伴って、抗ヒトＰＤ−１ ｍＡｂを投与することを含むであろう。他の増加用量実施形態においては、投与間隔は次第に短縮され、例えば、第１投与と第２投与の間で約３０日（±２日）、第２投与と第３投与との間で約１４日（±２日）となるであろう。ある実施形態においては、投与間隔は第２投与の後の投与に関しては約１４日（±２日）であろう。
ある実施形態においては、対象は、本明細書に記載されているＰＤ−１アンタゴニストのいずれかを含む医薬の静脈内（ＩＶ）注入の投与を受け、そのような投与は、単独療法レジメンとして又は組合せ療法の一部としてＰＤ−１アンタゴニストを使用する治療レジメンの一部でありうる。
本発明の１つの好ましい実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）であり、これは、１ｍｇ／ｋｇ Ｑ２Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ Ｑ２Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ Ｑ２Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ Ｑ２Ｗ、１０ｍｇ Ｑ２Ｗ、１ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗおよび１０ｍｇ Ｑ３Ｗからなる群から選択される用量で静脈内投与される。
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストはペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）であり、これは、２００ｍｇ Ｑ３Ｗ、１ｍｇ／ｋｇ Ｑ２Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ Ｑ２Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ Ｑ２Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ Ｑ２Ｗ、１０ｍｇ Ｑ２Ｗ、１ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗ、２ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗ、３ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗ、５ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗおよび１０ｍｇ Ｑ３Ｗまたはこれらの用量のいずれかの等価体（例えば、ペンブロリズマブのＰＫモデルは、２００ｍｇ Ｑ３Ｗの一定用量が、２ｍｇ／ｋｇ Ｑ３Ｗで得られるものに合致した曝露をもたらすと推定している）からなる群から選択される用量で液体医薬中で投与される。幾つかの特に好ましい実施形態においては、ペンブロリズマブは、２５ｍｇ／ｍｌ ペンブロリズマブ、７％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を１０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．５）中に含む液体医薬として投与され、該医薬の選択された用量は３０分にわたってＩＶ注入により投与される。いずれかの他の治療用物質と組合されたペンブロリズマブの最適用量は用量増加により特定されうる。
本発明はまた、前記のＰＤ−１アンタゴニストと医薬上許容される賦形剤とを含む医薬を提供する。ＰＤ−１アンタゴニストが生物療法剤、例えばｍＡｂである場合、該アンタゴニストは、通常の細胞培養および回収／精製技術を用いてＣＨＯ細胞内で製造されうる。
幾つかの実施形態においては、ＰＤ−１アンタゴニストとして抗ＰＤ−１抗体を含む医薬は液体製剤として提供されることが可能であり、あるいは使用前に注射用無菌水で凍結乾燥粉末を再構成（還元）することにより調製されうる。ＷＯ ２０１２／１３５４０８は、本発明における使用に適したペンブロリズマブを含む液体および凍結乾燥医薬の製剤を記載している。幾つかの好ましい実施形態においては、ペンブロリズマブを含む医薬は、約５０ｍｇのペンブロリズマブを含有するガラスバイアル中で提供される。
以下に列挙する典型的な特定の実施形態を含む本発明のこれらの及び他の態様は、本明細書に含まれる教示から明らかであろう。
ＶＩ．本発明の典型的な特定の実施形態
１．関心のある少なくとも１つの腫瘍型に関してＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答を予測する遺伝子シグネチャーバイオマーカーを得る方法であって、
（ａ）該腫瘍型を有すると診断された患者コホートにおける各患者から治療前腫瘍サンプルを得、
（ｂ）該コホートにおける各患者に関して、ＰＤ−１アンタゴニストでの治療の後に抗腫瘍応答値を得、
（ｃ）遺伝子発現プラットフォームにおいて各遺伝子に関して各腫瘍サンプルにおける生ＲＮＡレベルを測定し、
ここで、該遺伝子発現プラットフォームは約５０〜約６０個の遺伝子の臨床応答遺伝子セットおよび約１０〜約１２個のハウスキーピング遺伝子の正規化遺伝子セットを含み、該臨床応答遺伝子の約９０％は、該抗腫瘍応答と正に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、該臨床応答遺伝子の約１０％は、該抗腫瘍応答と負に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、
（ｄ）該正規化遺伝子の測定ＲＮＡレベルを用いて、該臨床応答遺伝子の測定生ＲＮＡレベルのそれぞれを各腫瘍サンプルに関して正規化し、
（ｅ）関心のある遺伝子シグネチャーにおける各腫瘍サンプルおよび各遺伝子に関して、その遺伝子の所定の増倍係数を用いて該正規化ＲＮＡ発現レベルを重み付けし、
（ｆ）各患者に関して、該重み付けＲＮＡ発現レベルを加えて、該コホートにおける各患者に関する遺伝子シグネチャースコアを得、
（ｇ）該腫瘍サンプルの全てに関する遺伝子シグネチャースコアと該コホートにおける患者の全てに関する抗腫瘍応答値とを比較して、目標のバイオマーカーの臨床有用性基準を満たすように患者コホートを分類する該遺伝子シグネチャースコアに関するカットオフを選択することを含む方法。
２．選択されたカットオフ以上の遺伝子シグネチャースコアを有する腫瘍型の任意の腫瘍サンプルをバイオマーカー陽性として定め、選択されたカットオフ未満の遺伝子シグネチャースコアを有する腫瘍型の任意の腫瘍サンプルをバイオマーカー陰性として定めることを更に含む、実施形態１記載の方法。
３．特定の腫瘍型を有すると診断された患者から摘出された腫瘍サンプルを、ＰＤ−１アンタゴニストに対する該腫瘍型の抗腫瘍応答の遺伝子シグネチャーバイオマーカーの存在または非存在に関して試験するための方法であって、該方法が、
（ａ）遺伝子発現プラットフォームにおいて各遺伝子に関して該腫瘍サンプルにおける生ＲＮＡレベルを測定し、ここで、該遺伝子発現プラットフォームは約５０〜約６０個の遺伝子の臨床応答遺伝子セットおよび約１０〜約１２個のハウスキーピング遺伝子の正規化遺伝子セットを含み、該臨床応答遺伝子の約９０％は、該抗腫瘍応答と正に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、該臨床応答遺伝子の約１０％は、該抗腫瘍応答と負に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、
（ｂ）該正規化遺伝子の測定ＲＮＡレベルを用いて、該腫瘍型に関する所定の遺伝子シグネチャーにおける各臨床応答遺伝子に関する測定生ＲＮＡレベルを正規化し、ここで、該所定遺伝子シグネチャーは該臨床応答遺伝子の少なくとも２つからなり、
（ｃ）所定の増倍係数を用いて各正規化ＲＮＡ値を重み付けし、
（ｄ）該重み付けＲＮＡ発現レベルを加えて、遺伝子シグネチャースコアを得、
（ｅ）得られたスコアを該遺伝子シグネチャーおよび腫瘍型に関して基準スコアと比較し、
（ｆ）バイオマーカー陽性またはバイオマーカー陰性として該腫瘍サンプルを分類することを含み、
ここで、得られたスコアが該基準スコア以上である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陽性として分類し、得られたスコアが該基準スコア未満である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陰性として分類する、方法。
４．特定の腫瘍型を有すると診断された患者から摘出された腫瘍サンプルをＰＤ−１アンタゴニストに対する該腫瘍型の抗腫瘍応答の遺伝子シグネチャーバイオマーカーの存在または非存在に関して試験するための系であって、該系が、
（ｉ）臨床応答遺伝子のセットおよび正規化遺伝子のセットからなる遺伝子発現プラットフォームにおける各遺伝子の生ＲＮＡ発現レベルを測定するためのサンプル分析装置、ならびに
（ｉｉ）（ａ）該正規化遺伝子の測定ＲＮＡレベルを用いて、該腫瘍型に関する所定の遺伝子シグネチャーにおける各臨床応答遺伝子に関する測定生ＲＮＡレベルを正規化し、
（ｂ）所定の増倍係数を用いて各正規化ＲＮＡ値を重み付けし、
（ｃ）該重み付けＲＮＡ発現レベルを加えて、遺伝子シグネチャースコアを得、
（ｄ）得られたスコアを該遺伝子シグネチャーおよび腫瘍型に関して基準スコアと比較し、
（ｅ）バイオマーカー陽性またはバイオマーカー陰性として該腫瘍サンプルを分類するために、測定されたＲＮＡ発現レベルを受信し、分析するためのコンピュータプログラムを含み、
ここで、得られたスコアが該基準スコア以上である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陽性として分類し、得られたスコアが該基準スコア未満である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陰性として分類する、系。
５．遺伝子発現プラットフォームが、表１における臨床応答遺伝子の少なくとも４０、４５、５０または５５個、および表１に示されていない１以上の追加的な臨床応答遺伝子を含む、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
６．臨床応答遺伝子セットが５５〜５７個の任意の数の表１における臨床応答遺伝子を含み、正規化遺伝子セットが表１における正規化遺伝子の少なくとも９個および表１に示されていない少なくとも１つのハウスキーピング遺伝子を含む、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
７．臨床応答遺伝子セットが表１Ａおよび表１Ｂにおける５７個の臨床応答遺伝子からなる、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
８．正規化遺伝子セットが表１Ｃにおける遺伝子からなる、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
９．抗腫瘍応答値が、部分的応答、完全応答、最良全応答、無進行生存の持続期間、無病生存の持続期間、客観的応答率および全生存中央値からなる群から選択される、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１０．抗腫瘍応答値が、ＲＥＣＩＳＴ １．１またはｉｒＲＣにより測定される部分的応答または完全応答である、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１１．抗腫瘍応答値が、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から選択される用量数のＰＤ−１アンタゴニストで患者が治療された後で得られる、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１２．ＰＤ−１アンタゴニストがニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブバイオシミラーまたはペンブロリズマブ変異体である、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１３．抗腫瘍応答値が、少なくとも４つの２００ｍｇ用量のペンブロリズマブのＱ３Ｗごとの投与の後で得られる、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１４．関心のある遺伝子シグネチャーまたは所定の遺伝子シグネチャーが、表２に挙げられている遺伝子シグネチャーから選択される、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１５．腫瘍型が膀胱癌、乳癌、明細胞腎癌、頭／頸部扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、脂肪肉腫、トリプルネガティブ乳癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチ大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄性細胞白血病−１タンパク質（Ｍｃｌ−１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１６．腫瘍型が膀胱癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頸部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌または腎癌である、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１７．腫瘍型が膀胱癌、胃癌、頭頸部癌または黒色腫である、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１８．臨床応答遺伝子セットが表１Ａおよび表１Ｂにおける５７個の臨床応答遺伝子からなり、正規化遺伝子セットが表１Ｃまたは表１Ｄにおける遺伝子からなり、各臨床応答遺伝子に関する所定の増倍係数が（ｉ）整数１、または（ｉｉ）表３Ａにおけるセット１．１、セット１．２、セット２．２、セット２．３およびセット２．４に示されている対応するスコア化重みである、前記実施形態のいずれか１項記載の方法または系。
１９．ＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答と相関する遺伝子シグネチャーに関するシグネチャースコアを得るために患者から摘出された腫瘍サンプルを試験する方法であって、
（ａ）該遺伝子シグネチャーにおける各遺伝子に関する該腫瘍サンプルにおける生ＲＮＡレベルを測定し、ここで、該遺伝子シグネチャーは、表３Ｂに記載されている１４−遺伝子アップ−ダウンシグネチャーおよび１８−遺伝子アップ−ダウンシグネチャーからなる群から選択され、
（ｂ）表１Ｃに記載されている正規化遺伝子の測定されたＲＮＡレベルを用いて、選択されたシグネチャーにおける各遺伝子に関して該測定生ＲＮＡレベルを正規化し、
（ｃ）各正規化ＲＮＡ値に、選択されたシグネチャーに関する表３Ｂに記載されている対応スコア化重みを掛け算して、重み付けＲＮＡ発現値を得、
（ｄ）該重み付けＲＮＡ発現値を加えて遺伝子シグネチャースコアを得ることを含む方法。
２０．該ＰＤ−１アンタゴニストがニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブバイオシミラーまたはペンブロリズマブ変異体である、実施形態１８または１９記載の方法。
２１．抗腫瘍応答が無進行生存、部分的応答または完全応答である、実施形態１８〜２０のいずれか１項記載の方法。
２２．腫瘍サンプルが、肛門癌、胆道癌、膀胱癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、卵巣癌およびトリプルネガティブ乳癌からなる群から選択される癌からのものである、実施形態１８〜２１のいずれか１項記載の方法。
２３．患者がＰＤ−１アンタゴニスト以外の療法で治療された後で該癌が進行した、実施形態２２記載の方法。
２４．遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現を定量するためのキットであって、
（ａ）表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに挙げられている標的転写産物、
（ｂ）以下の表２．１に挙げられている標的転写産物
からなる群から選択される標的転写産物のセットにハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブのセットを含むキット。
Figure 2018505658
Figure 2018505658
図１は、表１Ｂに挙げられている６−遺伝子抗相関遺伝子サブセットでの表２に挙げられているＭＩＰＦＳ遺伝子シグネチャーの複数の頭頸部腫瘍サンプルにわたる教師なしクラスター分析の結果を示す。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈおよび２Ｉは、以下の腫瘍型、すなわち、頭頸部癌（図２Ａ）、膀胱癌（図２Ｂ）、胃癌（図２Ｃ）、ＮＳＣＬＣ（図２Ｄ）、結腸直腸癌（図２Ｅ）、腎癌（図２Ｆ）、前立腺癌（図２Ｇ）、卵巣癌（図２Ｈ）およびトリプルネガティブ乳癌（図２Ｉ）の多発性腫瘍サンプルと比較した場合の、多発性黒色腫腫瘍サンプルにおける表１における５７個の臨床応答遺伝子の一部または全部に関する正規化ＲＮＡ発現レベルの対相関の散布図を示す。 図３は、ペンブロリズマブで治療された３つの異なる癌コホートにおける臨床応答データおよび治療前腫瘍サンプルのメタ分析における無進行生存期間に対してプロットされた表１における５７個の臨床応答遺伝子の遺伝子シグネチャーに関して決定されたモデル由来遺伝子シグネチャースコアを示す。 図４は、表１に挙げられている５７個の臨床応答遺伝子に関する治療前腫瘍サンプルに関して決定されたモデル由来遺伝子シグネチャースコアに対してプロットされた、ペンブロリズマブで治療された胃癌コホートにおける応答患者および非応答患者の百分率のヒストグラムを示す。 図５は、図４に示されている、モデルに基づく遺伝子シグネチャースコアのＲＯＣ曲線を示す。 図６は、頭頸部コホートにおける患者のペンブロリズマブに対するＢＯＲを予測するための、表１に表されているＩＦＮｇ遺伝子シグネチャーの潜在的有用性を示し、カットオフ（上パネル）、陽性予測値（ＰＰＶ、中パネル）および陰性予測値（ＮＰＶ、下パネル）より高い遺伝子シグネチャースコアを有するコホートにおける患者の罹患率に対する、カットオフスコアを増加させる効果を示す。 図７は、表１の５７−遺伝子シグネチャーに関するシグネチャースコアの予想ＢＯＲ ＰＰＶプロファイルを示し、該スコアは、ＫＥＹＮＯＴＥ−０１２およびＫＥＹＮＯＴＥ−０２８の階層的ベイジアンメタ分析下のセット１．１の重みを用いて算出された。 図８は、表１の５７−遺伝子シグネチャーに関するシグネチャースコアの予想ＢＯＲ ＮＰＶプロファイルを示し、該スコアは、ＫＥＹＮＯＴＥ−０１２およびＫＥＹＮＯＴＥ−０２８の階層的ベイジアンメタ分析下のセット１．１の重みを用いて算出された。 図９Ａおよび９Ｂは、ペンブロリズマブ治療に応答した食道癌患者（応答者）または応答しなかった食道癌患者（非応答者）における５７遺伝子シグネチャーに関する治療前シグネチャースコアの分布を示すヒストグラムであり、ここで、該シグネチャースコアは、典型的なスコア化重みであるセット１．１（図９Ａ）またはセット２．４（図９Ｂ）を用いて算出された。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ペンブロリズマブ治療に応答した結腸直腸癌患者（応答者）または応答しなかった結腸直腸癌患者（非応答者）における５７遺伝子シグネチャーに関する治療前シグネチャースコアの分布を示すヒストグラムであり、ここで、該シグネチャースコアは、典型的なスコア化重みであるセット１．１（図１０Ａ）またはセット２．４（図１０Ｂ）を用いて算出された。 図１１Ａおよび１１Ｂは、ペンブロリズマブ治療に応答した肛門癌患者（応答者）または応答しなかった肛門癌患者（非応答者）における５７遺伝子シグネチャーに関する治療前シグネチャースコアの分布を示すヒストグラムであり、ここで、該シグネチャースコアは、典型的なスコア化重みであるセット１．１（図１１Ａ）またはセット２．４（図１１Ｂ）を用いて算出された。
実施例
実施例１．ＦＦＰＥ組織からの全ＲＮＡの単離、およびそれに続く、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）系を使用する遺伝子発現分析
本実施例は、後記実施例に記載されているＦＦＰＥ腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を分析するために用いた方法を記載する。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）遺伝子発現プラットフォーム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）上の分析のためにＦＦＰＥ組織のスライドから全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ抽出前に、全組織切片を該スライドからマクロダイセクトし／擦り取り、２００μＬの１００％ エタノールを含有する１．５ｍＬの標識エッペンドルフチューブに移した。交差汚染の可能性を避けるために、各サンプルに新鮮な外科用メスを使用した。ついでサンプルを脱パラフィンし、プロテアーゼで消化した［ＦＦＰＥ組織用Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）全核酸単離キット（Ｃａｔ ｎｏ．ＡＭ１９７５）における推奨プロトコールを用いた］。前記のＡｍｂｉｏｎ ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）キット（Ｃａｔ ｎｏ．ＡＭ１９７５）を使用し、該製造業者の推奨指示に従い、全ＲＮＡ抽出を行った。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）系を使用して遺伝子発現プロファイリングを行うまで、全ＲＮＡを−８０℃で保存した。
実施例２．本発明の好ましい遺伝子発現プラットフォームの構築
本発明者らはここで、表１に示されている遺伝子発現プラットフォームのための５７個の臨床応答遺伝子を選択した。これは、この遺伝子セットがペンブロリズマブでの治療に対する種々の腫瘍型の臨床結果を予測しうるという証拠の蓄積に基づくものであった。
該遺伝子を６８０個の遺伝子（６５７個の候補臨床応答遺伝子および２３個のハウスキーピング遺伝子）の発見セット（ディスカバリーセット）から特定した。該候補臨床応答遺伝子は以下の起源から得た：１）ヒト腫瘍の大きなセットに関する遺伝子発現データベースから得られたＰＤ−Ｌ１に対する共発現による免疫シグネチャーからの遺伝子；２）Ｔ細胞生物学、免疫調節、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の細胞マーカーに関与することが知られている遺伝子；ならびに３）マウス抗マウスＰＤ−１ ｍＡｂでの治療に対する応答を示す同系腫瘍マウスモデルからのシグネチャー。腫瘍サンプルにおけるこの６８０個の発見遺伝子セットの遺伝子発現をアッセイするためのプローブのコードセットをＮａｎｏｓｔｒｉｎｇから入手した。
黒色腫コホートの腫瘍サンプルにおける該６８０発見セットの治療前遺伝子発現レベルの分析は、「ＰＤ−Ｌ１」、「ＩＦＮｇ」および「拡張免疫」シグネチャーと称される３つの遺伝子シグネチャーの生成をもたらした。それらは、ペンブロリズマブに対する抗腫瘍応答との統計的に有意な関連性を示した。第２の黒色腫コホートにおける確認仮説検定は、これらの３つのシグネチャーのそれぞれが、ペンブロリズマブでの抗腫瘍応答治療との統計的に有意な関連性を示すことを実証した。
該６８０遺伝子発見遺伝子セットの更なる分析は、抗原提示およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナリングに関与する遺伝子が、臨床エンドポイントの幾つかに関して低い偽発見率（ＦＤＲ）をもたらす、黒色腫サンプルにおける最も予測的な特徴の幾つかであるらしいことを示した。これらの知見を用いて、ペンブロリズマブの臨床試験に参加している患者コホートからの頭頸部（Ｈ＆Ｎ）治療前腫瘍サンプルの独立セットにおける更なる試験のためにこれまでの３つのシグネチャーに追加すべき追加的シグネチャーを定めた。
頭頸部腫瘍サンプルを試験する前に、黒色腫患者の抗腫瘍応答を予測する能力に寄与することが判明しなかった幾つかの個々の遺伝子を除去することにより、既に定められている遺伝子シグネチャー（「ＰＤ−Ｌ１」、「ＩＦＮｇ」および「拡張」免疫）を改良した。この改良後、これらの３つのシグネチャーは、前記表２の対応する列に示されている遺伝子からなるものであった。頭頸部研究の主目的は、抗腫瘍応答と該改良遺伝子シグネチャーとの関連性を更に試験（検定）することであった。以下の表４に示されているとおり、頭頸部腫瘍の独立セットにおける仮説検定は、これらのシグネチャーの全てがペンブロリズマブに対する抗腫瘍応答の予測因子であることを証明した。
Figure 2018505658
該６８０遺伝子発見セットにおける６５７個の候補臨床応答遺伝子のセットにおける及びこれらの４つの特定前遺伝子シグネチャーの個々の構成遺伝子の分析は頭頸部癌における幾つかの遺伝子に関する非常に低い推定偽発見率を示した。したがって、本発明者らはここで、他の腫瘍型に関する治療前遺伝子発現データおよびペンブロリズマブ治療後の抗腫瘍応答データを使用することにより、追加的な高度に関連した遺伝子を捕捉することに着手した。
最初に、本発明者らは、黒色腫および頭頸部コホートのみからの治療前遺伝子発現および治療後応答データを使用して、原型臨床応答遺伝子セットのための５１個の遺伝子のセットを特定した。これらの５１個の遺伝子は以下のとおりに入手した。以下のいずれかの臨床結果と正の関連性を示した全遺伝子の結びつきを考慮することにより、遺伝子を選択した。
１．以下の臨床結果尺度の３つ全てに関する頭頸部の発見遺伝子セットにわたって推定ＦＤＲ＜２５％を達成した：最大％腫瘍退縮、最良全応答（ＢＯＲ）およびＰＦＳ；または
２．以下の臨床結果尺度の３つ全てに関する黒色腫の発見遺伝子セットにわたって推定ＦＤＲ＜３３％を達成した：ＢＯＲ、ＰＦＳおよびＯＳ；または
３．表２に示されているＰＤ−Ｌ１、ＩＦＮｇ、拡張免疫またはＴＣＲシグナリングシグネチャーに含まれた。
ついで５１個の遺伝子のこの予備的セットを膀胱および胃癌コホートにおける特定前臨床応答遺伝子セットとして試験したところ、該予備的セットは関連性の統計的有意性の点で該発見遺伝子セットの遺伝子の残りのものとは著しく異なることが判明した。
臨床応答遺伝子の高度に予測的な遺伝子セットが特定されたことが証明されたため、ペンブロリズマブで治療された３つの腫瘍型（胃、膀胱および頭頸部）からの治療前遺伝子発現および臨床応答データを使用して、このセットを改良するためにメタ分析実施を行った。頭頸部、膀胱および胃コホートを用い、抗腫瘍応答の尺度としてのＰＦＳに焦点を合わせて、最も関連した遺伝子を理解するためにこれらのコホートから一緒にデータを集めた６８０遺伝子発見プラットフォーム全体のメタ分析を行った。臨床応答遺伝子の最終遺伝子セットは、
１）まず、該メタ分析から、ｐ値の順位付けにより、最も関連している上位１００個の特徴のなかに現れなかった、かつ、遺伝子Ｂ２Ｍでもなく、表２におけるシグニチャー（胃コホートにおいて試験時までに特定されていたシグニチャー）のいずれのメンバー遺伝子でもなかった予備的な５１遺伝子の一覧の一部であった１０個の遺伝子を除去し、
２）３つ全ての適応にわたる多変量分析により特定された１６個の新たな予測的遺伝子を追加することにより得られた。
したがって、５７遺伝子の最終セットを特定し、これに１１個のハウスキーピング遺伝子を追加して、表１に示されている６８遺伝子の発現プラットフォームを得た。
臨床応答遺伝子セットにおける抗相関遺伝子サブセットの存在は、２つの役割、すなわち、遺伝子シグネチャーの潜在的メンバーとしての役割、およびＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答に関連した鍵免疫パターンが予想どおりに挙動していることを確認するための対照としての役割を果たすと意図される。頭頸部癌コホートにおける表２に挙げられているＭＩＰＦＳ７−遺伝子シグネチャーおよび表１Ｂに挙げられている負相関性遺伝子サブセットに関する遺伝子発現パターンの教師無しクラスター分析を行うことにより、この対照機能の有用性を評価した。結果を図１に示す。他の腫瘍型に関する遺伝子シグネチャーおよび遺伝子シグネチャーバイオマーカーを得るためのこのプラットフォームの潜在的有用性を、他の癌型の複数の腫瘍に対する、６９個の黒色腫腫瘍における表１の臨床応答遺伝子の全て又はそれらの遺伝子の３７個のサブセットの正規化ＲＮＡ発現レベルに関する共分散パターンを分析することにより調べた。分析した患者の腫瘍サンプルおよび表１の臨床応答遺伝子の数を以下の表５に示す。３７遺伝子サブセットはＣＣＬ５、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ４、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＥＧＦＲ、ＧＲＡＰ２、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＫ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−Ｅ、ＩＤＯ１、ＩＦＮＧ、ＩＫＺＦ３、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＲＦ８、ＬＡＧ３、ＬＣＫ、Ｐ２ＲＹ８、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＳＭＢ１０、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＴＡＴ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＳＬＰおよびＺＡＰ７０からなるものであった。表１における１１個の正規化遺伝子の平均によりＲＮＡ発現レベルを正規化した。
Figure 2018505658
図２Ａ〜２Ｉに示されているとおり、調べた表１の臨床応答遺伝子に関しては共分散パターンはほとんど維持された。
実施例３．表１の遺伝子発現プラットフォームを使用する遺伝子シグネチャースコアのモデルベース取得
４０名の頭頸部癌患者、２９名の膀胱癌患者および３３名の胃癌患者に関する表１における５７臨床応答遺伝子セットの正規化治療前腫瘍内ＲＮＡ発現レベルおよび治療後ＰＦＳＣｏｘ ＰＦＳ時間に関して、弾性ネットメタ分析を行った。該モデル（実際上はリッジ回帰）において全５７個の臨床応答遺伝子を含むようにＬ１ペナルティを０．００１に設定し、交差検証を用いてＬ２ペナルティの値を選択した。該モデルは、ＰＦＳ分布における適応（症状）特異的相違および患者の能力状態の特異的効果を捕捉する項に加えて、５７個の遺伝子のそれぞれに関する係数を含んでいた。この回帰をフィットさせる前に、ハウスキーピング正規化遺伝子発現レベルをそれらの平均によりセンタリングし、それらの標準偏差によりスケーリングした（各癌適応内）。図３のＸ軸上にプロットされた最終シグネチャースコアは、交差検証フィット、実際上は、ハウスキーピング正規化遺伝子（センタリングおよびスケーリングされたもの）の線形結合からのハザード関数の「線形予測因子」であり、ここで、重み付けは前記の５７個の遺伝子に関する推定モデル係数（および、異なる適応を同じグラフ内にプロットするために必要な適応特異的モデル項）により特定される。図３は、ＰＦＳ時間に対してプロットされた、メタ分析において用いられた患者に関するモデル由来遺伝子シグネチャースコアを示す。
また、胃コホートに関して前記で得られた遺伝子シグネチャースコアを該コホートにおける応答状態により比較した。その結果を図４に示す。
図５は、この胃癌コホートにおけるこのモデルに基づく遺伝子シグネチャーに関する潜在的カットオフのＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ曲線下面積は０．８６であり、ユーデン（Ｙｏｕｄｅｎ）指数（該曲線上に表示されている）に基づくカットオフに関連した統計値は５７％のＰＰＶ、９５％のＮＰＶ、および４２％の、カットオフを超える罹患率である。
ついで、後記実施例４に記載されている受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線により又は抗腫瘍応答尺度の１つを用いて臨床有用性プロファイルを評価することにより、適当なカットオフを選択するために、モデルフィットにより特定された５７個の遺伝子の線形結合を各適応において用いることが可能であった。
遺伝子シグネチャーにおける各遺伝子に関する重みは、そのようなモデルベースアプローチを用いて一旦推定されたら、該モデルを再フィットさせることなく将来の患者に関する遺伝子シグネチャースコアを算出するための系の一部として使用されうる（すなわち、該重みは一定だとみなされる）。
実施例４．本発明の遺伝子発現プラットフォームから得られる遺伝子シグネチャースコアに関するカットオフの取得
図６は、潜在的カットオフが漸増値に設定された場合の抗腫瘍応答値として最良全応答（ＢＯＲ）を用いた場合の頭頸部癌におけるＩＦＮｇシグネチャーに関する遺伝子シグネチャースコアの推定臨床診断有用性プロファイルを示す。シグネチャースコアが与えられた応答の確率を示すロジスティック回帰モデルと組合されたＩＦＮｇシグネチャースコアの経験分布を用いて、ＰＰＶ（カットオフ以上のシグネチャースコアを有する患者における応答率）、ＮＰＶ（カットオフ未満のシグネチャースコアを有する患者における非応答率）およびカットオフ以上のシグネチャースコアの患者の罹患率に関するプロファイルを算出した。このプロファイルは、与えられたカットオフを選択する影響を理解するために用いられうる。したがって、例えば、ＩＦＮｇ遺伝子シグネチャースコアの臨床有用性プロファイルは、〜０．３のカットオフが〜９０％ ＮＰＶ、〜４０％ ＰＰＶを達成し、Ｈ／Ｎ患者の〜２５％のバイオマーカー高亜群罹患率をもたらすことを示唆している。あるいは、〜０．１０のカットオフは〜９２％ ＮＰＶ、〜３３％ ＰＰＶ、および〜４０％のバイオマーカー高亜群罹患率を達成するであろう。カットオフを選択し、ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に関する応答者の選択および非応答者の除外の感度および特異性を理解するのを助けるために、ＲＯＣ曲線分析を臨床有用性のこの評価と組合せることが可能である。
ＰＤ−１アンタゴニストでの治療から癌患者が利益を得る可能性がより高いか否かを識別するカットオフを設定し、スコアを得るために、表２に挙げられているＩＦＮｇ遺伝子シグネチャーのような遺伝子シグネチャーが使用されうることを、本実施例は実証している。実施例３に記載されているモデルベース遺伝子シグネチャースコアはそのような有用性分析に対する入力情報にもなりうるであろう。
実施例５．表１の遺伝子発現プラットフォームに関する典型的なスコア化法の取得
本実施例は、表３に挙げられているシグネチャースコア化重みの２セットの取得および有用性を記載する。各スコア化重みセットは、そのそれぞれのメタ分析に含まれる重複した癌組織学的特徴を有していた。どちらのセットの場合も、該スコア化法に対する入力情報は表１における５７個の個別の臨床応答遺伝子の正規化ＲＮＡ発現レベルのセットであった。シグネチャーにおける各臨床応答遺伝子に関する及び表１Ｃにおける各正規化遺伝子に関する測定生ＲＮＡのｌｏｇ（１０）変換を行い、正規化遺伝子のｌｏｇ１０変換ＲＮＡレベルの算術平均を算出し、各臨床応答遺伝子に関するｌｏｇ１０変換ＲＮＡレベルから該算出平均を差し引くことにより、測定（例えば、生）ＲＮＡ発現値を正規化した。これらの正規化値（適応内のいずれの更なる標準化をも伴わない）は弾性ネットフィッティングの入力情報であった。後記の全ての場合には更に、用いた弾性ネットモデルは組織学、ベースライン性能状態、および組織学とベースライン性能状態との相互作用に関する項を含んでいた（そして、弾性ネット下で適用された罰則化（ｐｅｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）もモデル推定中にこれらの項に適用された）。
ＭＫ−３４７５−０１２／ＫＥＹＮＯＴＥ−０１２（以下、ＫＥＹＮＯＴＥ−０１２と称される）からの頭頸部（Ｈ＆Ｎ）癌、胃癌および膀胱癌を有する患者を用いて、スコア化法の第１セットを取得した。この研究は、進行性トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を有する患者（コホートＡ）、頭頸部癌を有する患者（コホートＢおよびＢ２）、進行性尿路上皮癌を有する患者（コホートＣ）または進行性胃癌を有する患者（コホートＤ）においてペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）の安全性、許容性および抗腫瘍活性を調べるフェーズ１ｂマルチコホート研究である。スコア化アルゴリズムのこの第１セットを得るために用いた患者の全てを、２週間に１回ＩＶ投与される１０ｍｇ／ｋｇ ペンブロリズマブで治療した。
ＫＥＹＮＯＴＥ−０１２からの頭頸部癌、胃癌、膀胱癌およびトリプルネガティブ乳癌を有する患者ならびにＭＫ−３４７５−０２８／ＫＥＹＮＯＴＥ−０２８（以下、ＫＥＹＮＯＴＥ−０２８と称される）からの肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、食道癌および卵巣癌を有する患者を用いて、スコア化法の第２セットを誘導した。ＫＥＹＮＯＴＥ−０２８は、不治の進行性ＰＤ−Ｌ１陽性固形腫瘍を有する参加者に投与されるペンブロリズマブの有効性および安全性を評価するために設計されたフェーズ１ｂ研究である。ＫＥＹＮＯＴＥ−０２８における患者を、２週間に１回ＩＶ投与される１０ｍｇ／ｋｇ ペンブロリズマブで治療する。
スコア化セット１の説明：
セット１．１
Ｌ２ペナルティを決定するための交差検証を伴う無進行生存（ＰＦＳ）のコックス（Ｃｏｘ）メタ分析において一定の低レベルのＬ１ペナルティを用いた弾性ネットフィット下で誘導された線形結合。Ｌ１およびＬ２ペナルティの選択値における最終コックスＰＦＳモデルフィットからの回帰係数をそれらのそれぞれの遺伝子と掛け算し、ついで、得られた重み付き値を合計してシグネチャースコアを得る。回帰係数のこれらの値（すなわち、重み）は表３Ａにおけるセット１．１に挙げられている。
セット１．２
Ｌ２ペナルティを決定するための交差検証を伴う最良全応答（ＢＯＲ）のロジスティック回帰メタ分析において一定の低レベルのＬ１ペナルティを用いた弾性ネットフィット下で誘導された線形結合。Ｌ１およびＬ２ペナルティの選択値における最終ロジスティックモデルフィットからの回帰係数をそれらのそれぞれの遺伝子に関する正規化ＲＮＡ発現レベルと掛け算し、ついで、得られた重み付き値を合計してシグネチャースコアを得る。回帰係数のこれらの値（すなわち、重み）は表３Ａにおけるセット１．２に挙げられている。
ＫＥＹＮＯＴＥ−０１２（頭頸部、胃および膀胱）からの３つの癌コホートを用いて、セット１．１および１．２における回帰係数を特定した。これらのスコア化重みセットが、ペンブロリズマブに対する抗腫瘍応答を予測するシグネチャースコアを与えうるという仮説を検定するために、これらのスコア化重みセットを適用して、ペンブロリズマブ治療前にＫＥＹＮＯＴＥ−０２８患者から摘出された腫瘍サンプルに関して決定された５７遺伝子シグネチャーに関する正規化ＲＮＡ値からシグネチャースコアを算出した。表６に示されているとおり、スコア化重みセット１．１または１．２のいずれかを使用して得られたシグネチャースコアは、種々の癌を有するＫＥＹＮＯＴＥ−０２８からの患者の独立セットにおいて予測的であった。これらの結果は、セット１．１またはセット１．２におけるスコア化重みを使用して算出されたシグネチャースコアが、他の癌型に関する遺伝子シグネチャーバイオマーカーを得るための有用性を有することを示している。
Figure 2018505658
ＫＥＹＮＯＴＥ−０２８から、臨床応答データが利用可能となる前に、スコア化セット１を誘導した。これらの重みセットに対する潜在的改良を探るために、ＫＥＹＮＯＴＥ−０１２およびＫＥＹＮＯＴＥ−０２８からの癌型および臨床応答データの全てを用いて、追加的スコア化セットを特定し、分析した。この分析において使用したＫＥＹＮＯＴＥ−０１２からの臨床応答データセットは、スコア化セット１を得るために使用した臨床応答データセットより多いペンブロリズマブ用量の投与を患者が受けた後で得られたデータを含んでいた。この分析を用いて誘導されたスコア化セットを以下に記載する。
スコア化セット２の説明：
セット２．１
Ｌ２ペナルティを決定するために交差検証を用い、コックス（Ｃｏｘ）無進行生存（ＰＦＳ）メタ分析において一定の低レベルのＬ１ペナルティを用いた弾性ネットフィット下で誘導された線形結合。Ｌ１およびＬ２ペナルティの選択値における最終コックスＰＦＳモデルフィットからの回帰係数をそれらのそれぞれの遺伝子に関する正規化ＲＮＡ発現レベルと掛け算し、ついで、得られた重み付き値を合計してシグネチャースコアを得る。回帰係数のこれらの値（すなわち、重み）は表３Ａにおけるセット２．１に挙げられている。
セット２．２
Ｌ２ペナルティを決定するために交差検証を用い、最良全応答のロジスティック回帰メタ分析において一定の低レベルのＬ１ペナルティを用いた弾性ネットフィット下で誘導された線形結合。Ｌ１およびＬ２ペナルティの選択値における最終ロジスティックモデルフィットからの回帰係数をそれらのそれぞれの遺伝子に関する正規化ＲＮＡ発現レベルと掛け算し、ついで、得られた重み付き値を合計してシグネチャースコアを得る。回帰係数のこれらの値（すなわち、重み）は表３Ａにおけるセット２．２に挙げられている。
スコア化セット１．１、１．２、２．１および２．２を得るために低レベルのＬ１ペナルティを用いることは、５７個の臨床応答遺伝子のほとんどがペンブロリズマブでの治療に対する複数の癌型の抗腫瘍応答に関連していると予想されるという前提のもと、それらの５７個の臨床応答遺伝子の全てに関する発現レベルがシグネチャースコアの一部となることを可能にすることを意図したものであった。応答の頑強な「交差組織学（ｃｒｏｓｓ−ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）」予測因子を特定するための代替方法は、シグネチャースコアを得る際に使用される表１からの臨床応答遺伝子のセットを更に減少させることである。このアプローチは、研究された癌型の全てにわたる頑強予測値を示すであろう表１の臨床応答遺伝子の特異的サブセットおよびそのシグネチャースコアを探索するために、ＫＥＹＮＯＴＥ−０１２およびＫＥＹＮＯＴＥ−０２８からの複数の癌型を有する患者に関する組合せ臨床応答データに適用された。該アプローチは、以下に示すスコア化重みセット２．３および２．４の取得により例示される。
セット２．３
コックス（Ｃｏｘ）無進行生存（ＰＦＳ）メタ分析においてＬ１およびＬ２の両ペナルティを決定するために交差検証を用いた弾性ネットフィット下で取得された線形結合。Ｌ１およびＬ２ペナルティの選択値における最終コックスＰＦＳモデルフィットからの回帰係数をそれらのそれぞれの遺伝子に関する正規化ＲＮＡ発現レベルと掛け算し、ついで、得られた重み付き値を合計してシグネチャースコアを得る。回帰係数のこれらの値（すなわち、重み）は表３Ａにおけるセット２．３および表３Ｂの第２列に挙げられている。
セット２．４
ロジスティック回帰メタ分析においてＬ１およびＬ２の両ペナルティを決定するために交差検証を用いた弾性ネットフィット下で取得された線形結合。Ｌ１およびＬ２ペナルティの選択値における最終ロジスティックモデルフィットからの回帰係数をそれらのそれぞれの遺伝子に関する正規化ＲＮＡ発現レベルと掛け算し、ついで、得られた重み付き値を合計してシグネチャースコアを得る。回帰係数のこれらの値（すなわち、重み）は表３Ａにおけるセット２．４および表３Ｂの第３列に挙げられている。
表３Ｂにおける遺伝子シグネチャーの精査から明らかなとおり、それぞれセット２．３および２．４の重みを与えたＰＦＳおよびＢＯＲ回帰によってほぼ同じ遺伝子が保持され、このことは、いずれかの臨床エンドポイントを用いてほぼ同じ遺伝子が選択されることを示している。その他の臨床応答遺伝子に対するゼロ重みは、これらの遺伝子の発現レベルが臨床結果に個々に強くは関連していないことを意味すると解釈されるべきではなく、ただ単に、それらは、該遺伝子の全てが予測値を示すために同時に競合している場合に、罰則化（ｐｅｎａｌｉｚｅｄ）ＰＦＳ回帰メタ分析の場合における予測の改善に関して非ゼロ係数でのものを超える追加的な値を加えないらしいことであるに過ぎない。
実施例６．スコア化重みセットを使用して算出されたシグネチャースコアの臨床有用性
重み付け係数を使用して得られるシグネチャースコアの臨床有用性を例示するために、図７および８は、セット１．１の重みを使用して算出されたシグネチャースコア上の推定カットオフの関数としての、予想されるＰＰＶおよびＮＰＶプロファイル（複数の適応にわたる平均）の推定を示す。これらの予想プロファイルは、組合されたＫＥＹＮＯＴＥ−０２８およびＫＥＹＮＯＴＥ−０１２データの階層的ベイジアンメタ分析を用いて算出された。実線曲線は［後位（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）中央値（ｍｅｄｉａｎ）により捕捉された］ＰＰＶの予想値の推定を示し、該曲線の上および下の点線は該予想値上の９０％ 信頼区間の上限および下限を示す。
図６および７におけるＰＰＶおよびＮＰＶプロファイルは、セット１．１の重みを使用して算出されたシグネチャースコアの潜在的カットオフ値と、そのようなカットオフにより示唆される臨床有用性尺度（例えば、ＰＰＶおよびＮＰＶ）との間の予想される関係が、バイオマーカー陽性として患者を定めるためのカットオフとしての最小シグネチャースコアの選択を支持するためにどのように用いられうるかを例示している。そのようなカットオフは、ＰＤ−１アンタゴニストでの療法に対する臨床応答に遺伝子発現レベルを関連づけるデータがほとんど又は全く集められていない癌適応症（癌徴候）に、予め特定された方法で適用されうるであろう。例えば、これらの予想臨床有用性プロファイルのメタ分析推定は、複数の癌型に有用である単一カットオフスコアに関する以下の２つの一般的な可能性を示唆している。
・３０％に近い予想ＰＰＶを示す一方で９０％に近い予想ＮＰＶを維持する、ＮＰＶに有利な「低い」カットオフ。
・４０％に近い予想ＰＰＶを示す一方で８５％に近い予想ＮＰＶを維持する、ＰＰＶに有利な「高い」カットオフ。
表３に挙げられている重みセットのそれぞれは、それにより決定されたシグネチャースコアを使用して１以上の癌型に関する臨床有用性プロファイルの類似分析を行うために使用されうるであろう。
図９〜１１は３つの異なる癌（食道、結腸直腸および肛門）に関するペンブロリズマブ応答状態によるシグネチャースコアの分布を示し、ここで、該シグネチャースコアは、セット１．１またはセット２．４におけるスコア化重みを用いて算出された。これらのデータは、シグネチャースコアがペンブロリズマブ治療に対する応答者と非応答者との間の異なる分布をどのように有するかを例示している。ＰＰＶおよびＮＰＶプロファイルならびに各候補カットオフスコアを使用して選択される患者の示唆される罹患率を調べることにより、これらの癌型のいずれか又は全てに関して予測的カットオフシグネチャースコアが選択されうるであろう。
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１１．Ｇａｏら，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤ−Ｌ１ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００９）１５：９７１−９７９．
１２．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｊ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｇｒａｄｅ ａｎｄ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００７）５６：１１７３− １１８２．
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１４．Ｇｈｅｂｅｈ Ｈ．Ｆｏｘｐ３＋ ｔｒｅｇｓ ａｎｄ Ｂ７−Ｈ１＋／ＰＤ−１＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｃｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２００８ Ｆｅｂ ２３；８：５７．
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本明細書中に引用されている全ての参考文献を、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。参照により組み入れるというこの陳述は、そのような引用が、参照により組み入れるという宣誓陳述の直前直後にない場合であっても、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従い、各個の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許［それらのそれぞれは３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従い明らかに特定されるものである］に関連づけることを出願人が意図しているものである。参照により組み入れるという宣誓陳述が明細書中に含まれている場合、それは、参照により組み入れるというこの一般的（ｇｅｎｅｒａｌ）陳述を何ら弱めるものではない。本明細書における参考文献の引用は、該参考文献が関連先行技術であると自認するものではなく、また、それは、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。

Claims (24)

  1. 関心のある少なくとも１つの腫瘍型に関してＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答を予測する遺伝子シグネチャーバイオマーカーを得る方法であって、
    （ａ）該腫瘍型を有すると診断された患者コホートにおける各患者から治療前腫瘍サンプルを得、
    （ｂ）該コホートにおける各患者に関して、ＰＤ−１アンタゴニストでの治療の後に抗腫瘍応答値を得、
    （ｃ）遺伝子発現プラットフォームにおいて各遺伝子に関して各腫瘍サンプルにおける生ＲＮＡレベルを測定し、
    ここで、遺伝子発現プラットフォームは約５０〜約６０個の遺伝子の臨床応答遺伝子セットおよび約１０〜約１２個のハウスキーピング遺伝子の正規化遺伝子セットを含み、該臨床応答遺伝子の約９０％は、該抗腫瘍応答と正に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、該臨床応答遺伝子の約１０％は、該抗腫瘍応答と負に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、
    （ｄ）該正規化遺伝子の測定ＲＮＡレベルを用いて、該臨床応答遺伝子の測定生ＲＮＡレベルのそれぞれを各腫瘍サンプルに関して正規化し、
    （ｅ）関心のある遺伝子シグネチャーにおける各腫瘍サンプルおよび各遺伝子に関して、その遺伝子の所定の増倍係数を用いて該正規化ＲＮＡ発現レベルを重み付けし、
    （ｆ）各患者に関して、該重み付けＲＮＡ発現レベルを加えて、該コホートにおける各患者に関する遺伝子シグネチャースコアを得、
    （ｇ）該腫瘍サンプルの全てに関する遺伝子シグネチャースコアと該コホートにおける患者の全てに関する抗腫瘍応答値とを比較して、目標のバイオマーカーの臨床有用性基準を満たすように患者コホートを分類する該遺伝子シグネチャースコアに関するカットオフを選択することを含む方法。
  2. 遺伝子発現プラットフォームが、以下の表１に挙げられている遺伝子からなる、請求項１記載の方法。
    Figure 2018505658
    Figure 2018505658
  3. 選択されたカットオフ以上の遺伝子シグネチャースコアを有する腫瘍型の任意の腫瘍サンプルをバイオマーカー陽性として定め、選択されたカットオフ未満の遺伝子シグネチャースコアを有する腫瘍型の任意の腫瘍サンプルをバイオマーカー陰性として定めることを更に含む、請求項１または２記載の方法。
  4. ＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
  5. 腫瘍型が膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、トリプルネガティブ乳癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、食道癌、卵巣癌または黒色腫である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
  6. 各臨床応答遺伝子に関する所定の増倍係数が、以下の表３Ａに挙げられているスコア化重みセットの群から選択される同じスコア化重みセットのメンバーである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
    Figure 2018505658
    Figure 2018505658
  7. 各臨床応答遺伝子に関する所定の増倍係数が整数１に等しい、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
  8. 特定の腫瘍型を有すると診断された患者から摘出された腫瘍サンプルを、ＰＤ−１アンタゴニストに対する該腫瘍型の抗腫瘍応答の遺伝子シグネチャーバイオマーカーの存在または非存在に関して試験するための方法であって、該方法が、
    （ａ）遺伝子発現プラットフォームにおいて各遺伝子に関して該腫瘍サンプルにおける生ＲＮＡレベルを測定し、ここで、遺伝子発現プラットフォームは約５０〜約６０個の遺伝子の臨床応答遺伝子セットおよび約１０〜約１２個のハウスキーピング遺伝子の正規化遺伝子セットを含み、該臨床応答遺伝子の約９０％は、該抗腫瘍応答と正に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、該臨床応答遺伝子の約１０％は、該抗腫瘍応答と負に相関する腫瘍内ＲＮＡレベルを示し、
    （ｂ）該正規化遺伝子の測定ＲＮＡレベルを用いて、該腫瘍型に関する所定の遺伝子シグネチャーにおける各臨床応答遺伝子に関する測定生ＲＮＡレベルを正規化し、ここで、該所定遺伝子シグネチャーは該臨床応答遺伝子の少なくとも２つからなり、
    （ｃ）所定の増倍係数を用いて各正規化ＲＮＡ値を重み付けし、
    （ｄ）該重み付けＲＮＡ発現レベルを加えて、遺伝子シグネチャースコアを得、
    （ｅ）得られたスコアを該遺伝子シグネチャーおよび腫瘍型に関して基準スコアと比較し、
    （ｆ）バイオマーカー陽性またはバイオマーカー陰性として該腫瘍サンプルを分類することを含み、
    ここで、得られたスコアが該基準スコア以上である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陽性として分類し、得られたスコアが該基準スコア未満である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陰性として分類する、方法。
  9. 遺伝子発現プラットフォームが表１における遺伝子からなる、請求項７記載の方法。
  10. ＰＤ−１アンタゴニストがペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）である、請求項８または９記載の方法。
  11. 腫瘍型が膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、トリプルネガティブ乳癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、食道癌、卵巣癌または黒色腫である、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 所定の遺伝子シグネチャーが表３Ａにおける５７個の遺伝子からなり、重み付け工程が、表３Ａに挙げられている重みセットからスコア化重みセットを選択し、該遺伝子のそれぞれに関する正規化ＲＮＡ値に、選択されたスコア化重みセットにおける対応重みを掛け算することを含む、請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 所定の遺伝子シグネチャーが表３Ａにおける５７個の遺伝子からなり、所定の増倍係数が整数１である、請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法。
  14. 特定の腫瘍型を有すると診断された患者から摘出された腫瘍サンプルをＰＤ−１アンタゴニストに対する該腫瘍型の抗腫瘍応答の遺伝子シグネチャーバイオマーカーの存在または非存在に関して試験するための系であって、該系が、
    （ｉ）臨床応答遺伝子のセットおよび正規化遺伝子のセットからなる遺伝子発現プラットフォームにおける各遺伝子の生ＲＮＡ発現レベルを測定するためのサンプル分析装置、ならびに
    （ｉｉ）（ａ）該正規化遺伝子の測定ＲＮＡレベルを用いて、該腫瘍型に関する所定の遺伝子シグネチャーにおける各臨床応答遺伝子に関する測定生ＲＮＡレベルを正規化し、
    （ｂ）所定の増倍係数を用いて各正規化ＲＮＡ値を重み付けし、
    （ｃ）該重み付けＲＮＡ発現レベルを加えて、遺伝子シグネチャースコアを得、
    （ｄ）得られたスコアを該遺伝子シグネチャーおよび腫瘍型に関して基準スコアと比較し、
    （ｅ）バイオマーカー陽性またはバイオマーカー陰性として該腫瘍サンプルを分類するために、測定されたＲＮＡ発現レベルを受信し、分析するためのコンピュータプログラムを含み、
    ここで、得られたスコアが該基準スコア以上である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陽性として分類し、得られたスコアが該基準スコア未満である場合には、該腫瘍サンプルをバイオマーカー陰性として分類する、系。
  15. 遺伝子発現プラットフォームが表１における遺伝子からなる、請求項１４記載の系。
  16. 所定の増倍係数が、表３Ａに挙げられているスコア化重みセットから選択されるスコア化重みのセットのメンバーである、請求項１４記載の系。
  17. 表１に表されている遺伝子シグネチャーに関する正規化ＲＮＡ発現スコアを得るために腫瘍サンプルをアッセイするためのキットであって、
    （ａ）表１における遺伝子のそれぞれにより発現される転写産物に特異的に結合しうるハイブリダイゼーションプローブのセット、および
    （ｂ）各ハイブリダイゼーションプローブと形成される特異的ハイブリダイゼーション複合体の数を定量するために設計された試薬のセット
    を含むキット。
  18. 遺伝子シグネチャーバイオマーカーに関して腫瘍のサンプルが陽性であるか陰性であるかを決定し、該バイオマーカーに関して腫瘍が陽性である場合には、ＰＤ−１アンタゴニストを患者に投与し、該バイオマーカーに関して腫瘍が陰性である場合には、ＰＤ−１アンタゴニストを含まない癌治療剤を患者に投与することを含む、腫瘍を有する患者の治療方法であって、該遺伝子シグネチャーバイオマーカーが、表１における臨床応答遺伝子の少なくとも２つを含む遺伝子シグネチャーに関するものである、方法、
  19. 遺伝子シグネチャーが表１Ａおよび１Ｂにおける５７個の臨床応答遺伝子または表１Ａにおける５１個の臨床応答遺伝子からなる、請求項１８記載の方法。
  20. 遺伝子シグネチャーが、以下の表２に挙げられている遺伝子シグネチャーから選択される、請求項１８記載の方法。
    Figure 2018505658
  21. ＰＤ−１アンタゴニストに対する抗腫瘍応答と相関する遺伝子シグネチャーに関するシグネチャースコアを得るために患者から摘出された腫瘍サンプルを試験する方法であって、
    （ａ）該遺伝子シグネチャーにおける各遺伝子に関して、及び正規化遺伝子セットにおける各遺伝子に関して、該腫瘍サンプルにおける生ＲＮＡレベルを測定し、ここで、該遺伝子シグネチャーおよび正規化遺伝子セットは、以下の表に記載されている遺伝子からなり、
    Figure 2018505658
     （ｂ）該正規化遺伝子の測定ＲＮＡレベルを用いて、該遺伝子シグネチャーにおける各遺伝子に関して該測定生ＲＮＡレベルを正規化し、
    （ｃ）各正規化ＲＮＡ値に、以下の表に記載されている対応スコア化重みを掛け算して、重み付けＲＮＡ発現値を得、
    Figure 2018505658
     （ｄ）該重み付けＲＮＡ発現値を加えて遺伝子シグネチャースコアを得ることを含む方法。
  22. ＰＤ−１アンタゴニストがニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブバイオシミラーまたはペンブロリズマブ変異体である、請求項２１記載の方法。
  23. 測定工程が、組織サンプルからＲＮＡを単離し、以下の表に挙げられている遺伝子標的領域に特異的にハイブリダイズするように設計されたプローブのセットと共に組織サンプルをインキュベートすることを含む、請求項２１または２２記載の方法。
    Figure 2018505658
  24. 患者が食道癌を有すると診断されている、請求項２１〜２３のいずれか１項記載の方法。
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