TWI531652B - 表現非原生表面蛋白質之嵌合病毒及其用途 - Google Patents

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TWI531652B
TWI531652B TW095144777A TW95144777A TWI531652B TW I531652 B TWI531652 B TW I531652B TW 095144777 A TW095144777 A TW 095144777A TW 95144777 A TW95144777 A TW 95144777A TW I531652 B TWI531652 B TW I531652B
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Description

表現非原生表面蛋白質之嵌合病毒及其用途
本發明提供一種嵌合負股RNA病毒，其容許藉由使用本發明之單一嵌合病毒來使例如禽類之受檢者免疫以抵抗兩種感染因子。詳言之，本發明提供經工程化以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中之嵌合流感病毒，該融合蛋白質包括感染因子之蛋白質之胞外域及流感病毒蛋白質之跨膜域及細胞質域。該等嵌合病毒誘發抵抗流感病毒及該感染因子之免疫反應。本發明亦提供經工程化以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中之嵌合新城病病毒(NDV)，該融合蛋白質包括感染因子之蛋白質之胞外域及NDV蛋白質之跨膜域及細胞質域。該等嵌合病毒誘發抵抗NDV及該感染因子之免疫反應。
大量DNA病毒已經遺傳工程化以直接表現宿主細胞系統中之異源蛋白質(例如，牛痘病毒、桿狀病毒等)。近期，已用正股RNA病毒(例如，脊髓灰白質炎病毒)取得相似進展。該等構築體(亦即，異源基因產物或表現異源基因產物之嵌合病毒)之表現產物被認為係可能適用於疫苗調配物(次單位或全病毒疫苗)。使用諸如牛痘之病毒來建構用於疫苗之重組病毒或嵌合病毒的一缺點為在其主要抗原決定基中缺乏變異。病毒株中之變異性之缺乏對嵌合牛痘的重複使用施加嚴格限制，此係由於多疫苗接種將產生對病毒株之宿主抵抗性以便所接種之病毒不能感染宿主。用嵌合牛痘接種有抵抗力之個體將因此不能誘發免疫刺激。
相反，負股RNA病毒為建構用於疫苗之嵌合病毒的有吸引力之候選者。需要例如流感之負股RNA病毒，因為其寬的遺傳變異性容許建構大量刺激免疫性而無造成耐受性之風險的疫苗調配物。
2.1負股RNA病毒
將含有反義基因組之包膜單股RNA之病毒族群分為具有非分段基因組之群(副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae))或具有分段基因組之彼等群(正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)及沙狀病毒科(Arenaviridae))。副黏液病毒科及正黏液病毒科係詳細描述於下文中且用於本文之實例中。副黏液病毒科含有以下病毒：新城病病毒(NDV)、副流感病毒、仙台病毒(Sendai virus)、猴病毒5(simian virus)及腮腺炎病毒(mumps virus)。正黏液病毒科含有以下病毒：流感A型、B型及C型病毒，以及索哥托(Thogoto)病毒及多理(Dhori)病毒及感染性鮭魚貧血病毒。
2.1.1流感病毒 流感病毒粒子包括一含有單股RNA基因組之內部核糖核蛋白核心(螺旋狀核鞘)及一內部排列有基質蛋白質(M1)之外脂蛋白包膜。流感A病毒之分段基因組係由編碼10種多肽之直鏈、負極性、單股RNA之8個分子(對流感C而言，為7個)組成，其包含：形成核鞘之RNA依賴性RNA聚合酶蛋白質(PB2、PB1及PA)及核蛋白(NP)；基質膜蛋白(M1、M2)；自含脂質包膜突出之兩種表面糖蛋白：血球凝集素(HA)及神經胺酸酶(NA)；非結構蛋白質(NS1)及細胞核輸出蛋白質(NEP)。基因組之轉錄及複製係在核中進行且裝配係經由在質膜上出芽來發生。病毒可在混合感染期間再分配基因。
流感病毒係經由對細胞膜糖蛋白及糖脂中之唾液酸寡糖之HA結合活性而吸附至細胞上。在病毒粒子之內飲作用後，HA分子中之構形改變係在細胞內體中發生，其促進膜融合，由此觸發脫殼。核鞘遷移至轉錄病毒mRNA之核。病毒mRNA係藉由獨特機制來轉錄，在該機制中，病毒核酸內切酶裂解來自細胞異源mRNA之加帽5'－末端，隨後，該等末端係用作藉由病毒轉錄酶轉錄病毒RNA模板之引子。轉錄物係在自其模板之末端的位點第15至22鹼基處終止，其中寡聚(U)序列充當添加聚(A)束之信號。隨後，病毒RNA轉錄物遷移至細胞膜且與新轉錄的跨膜病毒蛋白質結合。NA隨後裂解來自膜結合糖蛋白之碳水化合物部分之唾液酸殘基，造成子代病毒之囊化及細胞釋放。在如此產生之8種病毒RNA分子中，6種為單譯基因訊息物，其經直接轉譯而成為表示HA、NA、NP及病毒聚合酶蛋白質PB2、PB1及PA之蛋白質。另外兩種轉錄物經歷拼接，各自產生兩種以不同閱讀框架來轉譯以產生M1、M2、NS1及NEP之mRNA。換言之，8種病毒RNA區段編碼10種蛋白質：9種結構性的及1種非結構性的。流感病毒及其蛋白質產物之基因的概述係展示於下文表1中。
流感病毒之病原性係由多病毒及宿主因素來調節。在抗擊病毒感染之宿主因素中，I型干擾素(IFNα/β)系統表示在真核生物體進化中相對早期所建立之強大抗病毒先天防禦機制(Garca－Sastre,2002,Microbes Infect 4：647－55)。抗病毒IFNα/β系統包含3個主要步驟：(i)偵測病毒感染及IFNα/β分泌，(ii)將IFNα/β結合至其受體且轉錄誘發IFNα/β－受激基因，及(iii)合成抗病毒酶及蛋白質。然而，大多數病毒已獲得編碼IFNα/β拮抗劑分子之特異性遺傳資訊，該等拮抗劑分子有效地阻礙抗病毒IFNα/β系統之一或多個步驟。流感A病毒表現感染細胞中之非結構蛋白質，即NS1蛋白質(在下文詳細描述)，其對抗細胞IFNα/β反應(Garca－Sastre等人，1998,Virology 252：324－30)。
2.1.1.1高病原性禽流感 近年來，在亞洲及歐洲已報導高病原性禽流感(HPAI)之爆發(Kawaoka等人，2005,Natl.Rev.Microbiol.3：591－600；Koopmans等人，2004,Lancet 363：587－593)。包含流感A、亞型H5N1或H7N7病毒之爆發導致家禽中之致死感染及有限數量之人類的死亡(Tweed等人，2004,Emerg.Infec.Dis.10：2196－2199)。近年來在中國，目前的H5N1病毒一直在家禽中流行(Chen等人，2005,Nature 436：191－192)，且雖然認為候鳥為該等病毒之首要儲集者，但據信自感染家禽傳染回候鳥對其增加之地理分佈有作用。目前，H5N1病毒係自亞洲出現，傳播橫越歐洲及非洲(Enserink,2006,Science,311：932)。1997年在香港及2003年在荷蘭，大批地淘汰家禽已展示為根除H5N1爆發之成功策略(Lipatov等人，2004,J.Virol.78：8951－8959)。由於近期HPAI爆發之人類受害者已與感染家禽密切接觸，因此預防禽流感病毒(AIV)之種間傳染可藉由經由屠宰根除家禽中之AIV來完成。然而，由於經濟及實踐原因，僅毀滅感染家禽不再認為係控制該疾病之精選方法。另外，由於倫理及生態原因，認為淘汰遷移野禽為不可接受之實踐。近期，OIE(世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health))及FAO(聯合國食品與農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations))建議應考慮將疫苗接種家禽用於控制AIV。另外，據報導在實地研究中，用失活H5疫苗來疫苗接種雞成功地中斷病毒傳播(Ellis等人，2004,Avian Pathol.33：405－412)。近期，中國已接受疫苗接種作為其AIV控制程式之部分。
高病原性H5N1病毒株可變得在人類之間可傳播之可能性係以全球大流行為依據，WHO不願估計當H5N1病毒重組至人類形式時之全球死亡率。因此，對在農業儲備中控制H5N1感染之方法的需要係明顯的，據信對人類之大多數傳播係由該等農業儲備而引起。
2.1.2新城病病毒 新城病病毒為含有直鏈單股、非分段、反義RNA基因組之包膜病毒。於下文中所進一步詳細描述，染色體組RNA含有呈3'－N－P－M－F－HN－L次序之基因。染色體組RNA亦在3'末端處含有引導序列。
病毒粒子之結構元素包含為得自細胞質膜之脂質雙層的病毒包膜。糖蛋白、血球凝集素－神經胺酸酶(HN)係自包膜突出，提供血球凝集素活性(例如，受體結合/基因融合)及神經胺酸酶活性。亦與病毒膜相互作用之融合糖蛋白(F)係首先產生而作為失活前驅物，接著經後轉譯裂解以產生兩種經二硫化物連接之多肽。活性F蛋白涉及藉由促進病毒包膜與宿主細胞質膜之融合使NDV穿透至宿主細胞中。基質蛋白質(M)係與病毒裝配有聯繫，且與病毒膜以及核鞘蛋白兩者相互作用。
核鞘之主要蛋白質次單元為在衣殼上賦予螺旋對稱之核鞘蛋白(N)。與核鞘相關的為P蛋白及L蛋白。認為經受磷酸化作用之磷蛋白(P)在轉錄中起調節作用，且其亦可涉及甲基化作用、磷酸化作用及多聚腺嘌呤化作用。編碼RNA依賴性RNA聚合酶之L基因連同P蛋白一起為病毒RNA合成所需要的。佔有病毒基因組之近乎一半編碼容量之L蛋白為病毒蛋白質之最大者，且在轉錄及複製中起重要作用。
包含NDV之所有負股RNA病毒之複製係由複製RNA所需之細胞機器之缺乏而複雜化。另外，負股基因組不能直接轉譯成蛋白質，而必須先轉錄成正股(mRNA)複本。因此，在進入宿主細胞中後，病毒不能合成所需的RNA依賴性RNA聚合酶。L蛋白、P蛋白及N蛋白必須連同處於感染之基因組一起進入細胞。
假設大多數或所有轉錄NDV mRNA之病毒蛋白質亦執行其複製。調節蛋白質之相同補體之交替用途(亦即，轉錄或複製)的機制還未得到清楚地鑑別，但似乎包含大量游離形式之核鞘蛋白之一或多者，尤其為N。在病毒之穿透作用後立即藉由L蛋白，使用核鞘中之反義RNA作為模板來起始轉錄。調節病毒RNA合成以便其在轉錄期間產生單譯基因mRNA。
轉錄後，病毒基因組複製為感染中藉由負股RNA病毒之第二基本事件。如同其他負股RNA病毒一樣，新城病病毒(NDV)中之病毒基因組複製係藉由病毒特異性蛋白質來介導。複製RNA合成之第一產物為NDV基因組RNA之互補複本(亦即，正極性)(cRNA)。該等正股複本(反基因組)在其末端結構上不同於正股mRNA轉錄物。不同於mRNA轉錄物，抗染色體組cRNA在5'末端處未經加帽及甲基化，且在3'末端處未經截短及多聚腺苷酸化。cRNA係與其負股模板共末端且在互補形式之各染色體組RNA區段中含有所有遺傳資訊。cRNA係用作合成NDV負股病毒基因組(vRNA)之模板。
NDV負股基因組(vRNA)及反基因組(cRNA)係藉由核鞘蛋白來殼體化；僅未殼體化之RNA物質為病毒mRNA。對NDV而言，正如細胞質為轉錄之場所一樣，其為病毒RNA複製之場所。病毒組分之裝配似乎係在宿主細胞質膜處發生且成熟病毒係藉由出芽來釋放。
2.2免疫原性組合物
重組DNA技術及"反向基因"工程技術為用於免疫原性組合物之重組病毒的產生提供獨特方法。詳言之，本發明提供一種方法以工程化負股RNA病毒以便其不僅表現或呈現原生病毒抗原，且亦表現或呈現可經設計以結合至病毒蛋白質外殼中之任一抗原。受特別關注者為得自感染生物體之不同於流感之抗原。如此，單一病毒可經工程化而作為適用於非法活化或誘發免疫反應之免疫原性化合物，該免疫反應將給予抵抗至少兩種病原體的保護。當有必要修飾該等嵌合病毒之毒性時，其可經進一步工程化，亦即，以便其可經減毒或經進一步減毒。減毒流感病毒為有益的，因為其為免疫原性的且能複製，但非病原性的。
認為活疫苗誘發經改良之交叉反應細胞介導細胞毒性以及體液性抗體反應，提供比失活疫苗更好之保護(Gorse及Belshe,1990,J.Clin.Microbiol.28：2539－2550；及Gorse等人，1995,J.Infect.Dis.172：1－10)。其次，對病毒疾病之保護免疫性可能包含使用傳統肌肉內投與之疫苗所不能見到之黏膜IgA反應(Nelson等人，1998,Vaccine 16：1306－1313)。最後，活疫苗亦具有鼻內投藥之優點，其避免偶爾與失活輔助疫苗之肌肉內投藥相關之腫脹及肌肉酸痛。據報導該等活疫苗不僅誘發體液性反應抵抗同型流感病毒且亦誘發交叉反應細胞介導細胞毒性。因此，本發明提供開發用於診斷、預防、控制或治療病毒及非病毒病原體之例如，疫苗組合物之新穎及更有效之免疫調配物的可能性。
本發明提供經工程化以表現併入病毒粒子中之融合蛋白質之嵌合負股RNA病毒，用於產生該等嵌合病毒之方法及該等病毒在免疫原性調配物中或在活體外檢定中(例如)作為免疫原之用途。本發明之嵌合病毒之特徵為在病毒粒子表面上不僅呈現與病毒相關之抗原且亦呈現融合蛋白質。
本發明提供嵌合流感病毒及嵌合NDV，其容許藉由投與嵌合流感病毒或嵌合NDV來使例如禽類之受檢者免疫以抵抗兩種感染因子。在一態樣中，單一病毒用於誘發免疫反應之用途降低免疫組合物之投藥頻率。在另一態樣中，單一病毒用於誘發免疫反應之用途降低使受檢者免疫之成本。使受檢者免疫之更低成本增加更多受檢者將能擔負起免疫之可能性且因此，降低與治療遭受感染之受檢者相關之健康成本。
本發明亦係關於本發明之嵌合病毒在用於人類或動物之免疫原性製劑中之用途。詳言之，本發明之嵌合病毒可用作抵抗廣泛範圍之病毒及/或抗原之疫苗。因為嵌合病毒經工程化以表現病毒粒子中之外來抗原決定基，所以包括本發明之嵌合病毒之調配物可經設計用於免疫以抵抗多病毒株變異體、不同病毒或抵抗完全不同的感染因子或疾病抗原(例如，細菌、寄生蟲、真菌或腫瘤特異性抗原)。若干方法可用以向人類或動物受檢者引入活的減毒病毒調配物以誘發免疫反應或適當的細胞激素反應。該等方法包含但不限於鼻內、氣管內、經口、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下路線。
本發明之嵌合病毒使受檢者(例如禽類)能藉由投與嵌合病毒來對兩種感染性疾病免疫。在一特定實施例中，本發明之嵌合病毒使禽類能藉由投與本發明之嵌合病毒來對禽流感病毒及新城病病毒免疫。禽類可容易地藉由用嵌合病毒對其噴射或在諸如其飲用之水之水溶液中來投與嵌合病毒而受到免疫。
本發明係部分基於申請人之發現，即對兩種感染因子之有效免疫反應可藉由將流感病毒工程化以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中來達成，該融合蛋白質包括病毒之至少一種基本糖蛋白之細胞質域及跨膜域及第二感染因子之蛋白質之胞外域，其中融合蛋白質功能性地置換基本糖蛋白。在一態樣中，將融合蛋白質併入病毒粒子中以產生對第二感染因子之胞外域增強之免疫反應。將病毒之基本糖蛋白之細胞質域及跨膜域工程化至融合蛋白質上以使得融合蛋白質併入病毒粒子中。在一特定實施例中，基本糖蛋白為流感病毒HA及/或NA蛋白之一或兩者。在另一實施例中，基本糖蛋白為NDV之HN蛋白或F蛋白之一或兩者。病毒之至少一種基本糖蛋白之功能性置換消除關於病毒基因組(例如，流感病毒基因組)之尺寸限制的顧慮。在某些實施例中，用融合蛋白質來功能性置換病毒之至少一種基本糖蛋白削弱受檢者中之病毒複製。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括融合蛋白質，該融合蛋白質具有(i)不同於流感病毒之感染因子之保護性抗原的胞外域，融合至(ii)藉由流感病毒之基本基因來編碼之糖蛋白的跨膜域及細胞質域，其中融合蛋白質併入禽流感病毒中，在該禽流感病毒中，基本基因之功能係由融合蛋白質或由禽流感病毒原生之糖蛋白來提供。在某些實施例中，流感病毒之基本基因為血球凝集素(HA)基因。在其他實施例中，流感病毒之基本基因為神經胺酸酶(NA)基因。在某些實施例中，嵌合禽流感病毒係經減毒的。根據該等實施例，嵌合禽流感病毒可藉由NS1基因中之突變來減毒。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括融合蛋白質，該融合蛋白質具有(i)NDV HN蛋白之胞外域，融合至(ii)流感病毒NA蛋白之跨膜域及細胞質域，其中該融合蛋白質併入禽流感病毒中，在該禽流感病毒中，NA蛋白之功能係由融合蛋白質或由禽流感病毒原生之糖蛋白來提供。在某些實施例中，嵌合禽流感病毒係經減毒的。根據該等實施例，嵌合禽流感病毒可藉由NS1基因中之突變來減毒。根據本發明，可使用任一禽流感病毒類型、亞型或病毒株。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括編碼神經胺酸酶融合蛋白質之經包裝的流感病毒NA區段，其中NA開放閱讀框架經修飾以使得編碼NA胞外域之核苷酸藉由編碼由N－末端來錨定之不同於流感之感染因子的神經胺酸酶抗原之胞外域的核苷酸來置換，以便表現神經胺酸酶融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括編碼血球凝集素融合蛋白質之經包裝的流感病毒HA區段，其中HA開放閱讀框架經修飾以使得編碼HA胞外域之核苷酸藉由編碼由C－末端來錨定之不同於流感病毒之感染因子的受體結合/基因融合抗原之胞外域的核苷酸來置換，以便表現血球凝集素融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括經包裝之雙譯基因流感病毒HA區段，該區段包括：(a)編碼禽流感病毒血球凝集素蛋白質之第一開放閱讀框架，及(b)編碼血球凝集素融合蛋白質之第二開放閱讀框架，其中編碼血球凝集素胞外域之核苷酸係藉由編碼不同於流感病毒之感染因子之保護性抗原的胞外域之核苷酸，或編碼藉由C－末端來錨定之疾病抗原之核苷酸來置換，以便表現流感病毒血球凝集素及融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。在某些實施例中，嵌合禽病毒之HA區段之第一開放閱讀框架經修飾以移除血球凝集素多鹼基裂解位點。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括經包裝之雙譯基因流感病毒NA區段，該區段包括：(a)編碼禽流感病毒神經胺酸酶蛋白質之第一開放閱讀框架，及(b)編碼神經胺酸酶融合蛋白質之第二開放閱讀框架，其中編碼神經胺酸酶胞外域之核苷酸係藉由編碼不同於流感病毒之感染因子之保護性抗原的胞外域之核苷酸，或編碼藉由N－末端來錨定之疾病抗原之核苷酸來置換，以便表現流感病毒神經胺酸酶及融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。在某些實施例中，嵌合禽流感病毒包括具有經修飾以移除血球凝集素多鹼基裂解位點之開放閱讀框架的HA區段。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括編碼神經胺酸酶融合蛋白質之經包裝之流感病毒NA區段，其中NA開放閱讀框架經修飾以便編碼NA胞外域之核苷酸係藉由編碼NDV之HN抗原之胞外域的核苷酸來置換，以便表現神經胺酸酶融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。神經胺酸酶融合蛋白質為嵌合禽流感病毒供應神經胺酸酶活性。
在某些實施例中，本發明之嵌合禽流感病毒包括編碼降低病毒之細胞干擾素拮抗劑活性之經修飾之NS1蛋白質的包裝NS1基因區段。在產生經修飾之NS1蛋白質之NS1基因中之突變的非限制性實例係提供於下文部分5.1.2中。
本發明提供編碼本發明之嵌合禽流感病毒之NA區段的重組核酸分子(例如，重組DNA分子)。本發明亦提供編碼本發明之嵌合禽流感病毒之HA區段的重組核酸分子(例如，重組DNA分子)。本發明進一步提供編碼本發明之嵌合禽流感病毒之NA區段或HA區段的重組核酸分子(例如，重組RNA分子)。
本發明提供繁殖本發明之嵌合禽流感病毒的方法，其包括在易受禽流感病毒感染之受精卵或細胞株中培養嵌合禽流感病毒。本發明亦提供產生免疫原性組合物之方法，該方法包括：(a)在易受禽流感病毒感染之受精卵或細胞株中繁殖本發明之嵌合禽流感病毒；及(b)收集子代病毒，其中病毒係生長至足夠數量且係處於病毒免受污染之充分條件下以便子代病毒適於調配入免疫原性組合物中。
本發明提供減毒嵌合流感病毒，其包括融合蛋白質，該融合蛋白質具有(i)不同於流感病毒之感染因子之保護性抗原的胞外域，融合至(ii)藉由流感病毒之基本基因來編碼之糖蛋白的跨膜域及細胞質域，其中融合蛋白質係併入減毒流感病毒中，在該減毒流感病毒中，基本基因之功能係由融合蛋白質或由減毒流感病毒原生之糖蛋白來提供。在某些實施例中，流感病毒之基本基因為血球凝集素(HA)基因。在其他實施例中，流感病毒之基本基因為神經胺酸酶(NA)基因。減毒嵌合流感病毒可為流感病毒之任一類型、亞型或病毒株。舉例而言，減毒嵌合流感病毒可為流感A病毒、流感B病毒或流感C病毒。
本發明提供減毒嵌合流感病毒，其包括編碼神經胺酸酶融合蛋白質之經包裝之流感病毒NA區段，其中NA開放閱讀框架經修飾以便編碼NA胞外域之核苷酸係藉由編碼由N-末端來錨定之不同於流感之感染因子的神經胺酸酶抗原之胞外域的核苷酸來置換，以便表現神經胺酸酶融合蛋白質且將其併入減毒嵌合流感病毒中。在某些實施例中，本發明之減毒嵌合流感病毒包括具有經修飾以移除血球凝集素多鹼基裂解位點之開放閱讀框架的HA區段。
本發明提供減毒嵌合流感病毒，其包括編碼血球凝集素融合蛋白質之經包裝之流感病毒HA區段，其中HA開放閱讀框架經修飾以便編碼HA胞外域之核苷酸係藉由編碼由C-末端來錨定之不同於流感之感染因子的血球凝集素抗原之胞外域之核苷酸來置換，以便表現血球凝集素融合蛋白質且將其併入減毒嵌合流感病毒中。
本發明提供減毒嵌合流感病毒，其包括經包裝之雙譯基因流感病毒HA區段，該區段包括：(a)編碼流感血球凝集素蛋白質之第一開放閱讀框架，及(b)編碼血球凝集素融合蛋白質之第二開放閱讀框架，其中編碼血球凝集素胞外域之核苷酸係藉由編碼不同於流感之感染因子之保護性抗原的胞外域之核苷酸，或編碼藉由C-末端來錨定之疾病抗原之核苷酸來置換，以便表現流感血球凝集素及融合蛋白質且將其併入減毒嵌合流感病毒中。在某些實施例中，減毒嵌合流感病毒之HA區段之第一開放閱讀框架經修飾以移除血球凝集素多鹼基裂解位點。
本發明提供減毒嵌合流感病毒，其包括經包裝之雙譯基因流感病毒NA區段，該區段包括：(a)編碼流感神經胺酸酶蛋白質之第一開放閱讀框架，及(b)編碼神經胺酸酶融合蛋白質之第二開放閱讀框架，其中編碼神經胺酸酶胞外域之核苷酸係藉由編碼不同於流感之感染因子之保護性抗原的胞外域之核苷酸，或編碼藉由N－末端來錨定之疾病抗原之核苷酸來置換，以便表現流感神經胺酸酶及融合蛋白質且將其併入減毒嵌合流感病毒中。在某些實施例中，本發明之減毒嵌合流感病毒包括具有經修飾以移除血球凝集素多鹼基裂解位點之開放閱讀框架之HA區段。
在某些實施例中，本發明之減毒嵌合流感病毒包括編碼降低病毒之細胞干擾素拮抗劑活性之經修飾NS1蛋白質的經包裝之NS1基因區段。
本發明提供編碼本發明之減毒嵌合流感病毒之NA區段的重組核酸分子(例如，重組DNA分子)。本發明亦提供編碼本發明之減毒嵌合流感病毒之HA區段的重組核酸分子(例如，重組DNA分子)。本發明進一步提供編碼本發明之減毒嵌合流感病毒之NA區段或HA區段的重組核酸分子(例如，重組RNA分子)。
本發明提供繁殖本發明之減毒嵌合流感病毒之方法，其包括在易受流感病毒感染之受精卵或細胞株中培養減毒嵌合流感病毒。本發明亦提供產生免疫原性組合物之方法，該方法包括：(a)在易受減毒流感病毒感染之受精卵或細胞株中繁殖本發明之減毒嵌合流感病毒；及(b)收集子代病毒，其中病毒係生長至足夠數量且係處於病毒免受污染之充分條件下以便子代病毒適於調配入免疫原性組合物中。
本發明亦提供嵌合NDV病毒。詳言之，本發明提供嵌合NDV，其包括融合蛋白質，該融合蛋白質具有(i)不同於NDV之感染因子之保護性抗原的胞外域，融合至(ii)藉由NDV之基本基因來編碼之糖蛋白的跨膜域及細胞質域，其中融合蛋白質併入NDV中，在該NDV中，基本基因之功能係由融合蛋白質或由NDV所原生之糖蛋白來提供。在某些實施例中，NDV之基本NDV基因為編碼F蛋白之基因。在其他實施例中，NDV之基本NDV基因為編碼HN蛋白之基因。根據本發明，可使用任一NDV類型、亞型或病毒株。
本發明提供嵌合NDV，其包括包含編碼F蛋白－融合蛋白質之核苷酸序列的經包裝之基因組，該F蛋白－融合蛋白質具有F蛋白之跨膜域及細胞質域及不同於NDV之感染因子之抗原的胞外域，或藉由C－末端來錨定之疾病抗原之胞外域以便表現F蛋白－融合蛋白質且將其併入嵌合NDV中。在某些實施例中，嵌合NDV之基因組包括編碼F蛋白之核苷酸序列以便表現除NDVF蛋白－融合蛋白質外之F蛋白且將其併入嵌合NDV中。在其他實施例中，編碼NDVF蛋白－融合蛋白質之核苷酸序列置換編碼NDVF蛋白之核苷酸序列且F蛋白－融合蛋白質為嵌合NDV供應F蛋白之功能。
本發明提供嵌合NDV，其包括包含編碼HN融合蛋白質之核苷酸序列的經包裝之基因組，該HN融合蛋白質具有HN蛋白之跨膜域及細胞質域及不同於NDV之感染因子之抗原的胞外域或藉由N－末端來錨定之疾病抗原之胞外域以便表現HN融合蛋白質且將其併入嵌合NDV中。在某些實施例中，嵌合NDV之基因組包括編碼HN蛋白之核苷酸序列以便表現除NDV HN融合蛋白質外之HN蛋白且將其併入嵌合NDV中。在其他實施例中，編碼HN融合蛋白質之核苷酸序列置換編碼NDV HN蛋白之核苷酸序列且HN融合蛋白質為嵌合NDV供應HN蛋白之功能。本發明提供編碼(encoding)及/或編碼(coding)NDV HN蛋白或F蛋白之重組核酸分子。
本發明提供繁殖本發明之嵌合NDV之方法，其包括在易受NDV感染之受精卵或細胞株中培養嵌合NDV。本發明亦提供產生免疫原性組合物之方法，該方法包括：(a)在易受NDV感染之受精卵或細胞株中繁殖本發明之嵌合NDV；及(b)收集子代病毒，其中病毒係生長至足夠數量且係處於病毒免受污染之充分條件下以便子代病毒適於調配入免疫原性組合物中。
本發明提供包括本發明之嵌合病毒之受精卵。本發明亦提供包括本發明之嵌合病毒之細胞株。本發明進一步提供包括本發明之嵌合病毒之免疫原性組合物。
本發明提供在受檢者中誘發對一種、兩種或兩種以上感染因子之免疫反應的方法，該方法包括投與有效量之本發明之嵌合流感病毒。在某些實施例中，受檢者為人類受檢者。在其他實施例中，受檢者為非人類哺乳動物(例如，豬、馬、狗或貓)。在其他實施例中，受檢者為禽類受檢者。在一特定實施例中，本發明提供在禽類中誘發對一種、兩種或兩種以上感染因子之免疫反應的方法，該方法包括投與有效量之本發明之嵌合禽流感病毒。
本發明提供在受檢者中誘發對在一種、兩種或兩種以上感染因子之免疫反應的方法，該方法包括向受檢者投與有效量之本發明之嵌合NDV。在某些實施例中，受檢者為人類受檢者。在其他實施例中，受檢者為非人類哺乳動物(例如，豬、馬、狗或貓)。在其他實施例中，受檢者為禽類受檢者。在一特定實施例中，本發明提供在禽類中誘發對一種、兩種或兩種以上感染因子之免疫反應的方法，該方法包括向禽類投與有效量之本發明之嵌合NDV。
本發明提供在受檢者中誘發對一種、兩種或兩種以上感染因子之免疫反應的方法，該方法包括向受檢者投與有效量之本發明之減毒嵌合流感病毒。在某些實施例中，受檢者為人類受檢者。在其他實施例中，受檢者為非人類哺乳動物(例如，豬、馬、狗或貓)。在其他實施例中，受檢者為禽類受檢者。在一特定實施例中，本發明提供在人類中誘發對一種、兩種或兩種以上感染因子之免疫反應的方法，該方法包括向需要其之人類投與有效量之本發明之嵌合病毒。
本發明提供誘發對疾病抗原之免疫反應的方法，該方法包括向受檢者投與有效量之本發明之嵌合病毒。在某些實施例中，受檢者為人類。在其他實施例中，受檢者為禽類。
3.1術語
如本文中所使用，術語"動物"包含但不限於伴侶動物(例如，狗及貓)、動物園動物、家畜(例如，反芻動物、非反芻動物、牲畜及家禽)、野生動物及實驗動物(例如，囓齒動物，諸如大鼠、小鼠及天竺鼠及兔)及經選殖或經遺傳修飾或另外修飾之動物(例如，轉殖基因動物)。
如本文中所使用，術語"約"或"大致"當連同數字一起使用時係指在參考數字之1、5或10%內之任一數字。
如本文中所使用，片語NS1之"胺基－末端"係指流感病毒NS1蛋白質之胺基末端胺基酸殘基(胺基酸殘基1)至胺基酸殘基115、胺基酸殘基1至100、胺基酸殘基1至75、胺基酸殘基1至50、胺基酸殘基1至25或胺基酸殘基1至10的胺基酸。
如本文中所使用，片語NS1之"羧基－末端"係指當NS1之胺基末端分別為流感病毒NS1蛋白質之胺基酸殘基1至胺基酸殘基115、胺基酸殘基1至100、胺基酸殘基1至75、胺基酸殘基1至50或胺基酸殘基1至25時，馬流感病毒NS1蛋白質之胺基酸殘基116至羧基末端胺基酸殘基、胺基酸殘基101至羧基末端胺基酸殘基、胺基酸殘基76至羧基末端胺基酸殘基、胺基酸殘基51至羧基末端胺基酸殘基或胺基酸殘基26至羧基末端胺基酸殘基。自羧基末端之缺失可包含由來自NS1之羧基末端之5個，較佳10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、73個、75個、80個、85個、90個、95個、99個、100個、105個、110個、115個、120個、125個、126個、130個、135個、140個、145個、150個、155個、160個、165個、170個或175個胺基酸殘基組成之缺失。
如本文中所使用，術語"疾病"及"病症"可交替地使用以指受檢者中之病狀且其涵蓋但不限於增生性病症(例如，白血病、纖維化、癌瘤(包含惡性癌瘤、非惡性癌瘤、轉移性癌瘤及非轉移性癌瘤)及淋巴瘤)及由感染因子(例如，病毒、細菌、寄生蟲)引起之感染，或與其相關之病狀或症狀。
如本文中所使用，術語"抗原決定基"係指受檢者中具有抗原活性或免疫原活性之分子(例如，多肽或蛋白質)的位點、片段或區域。具有免疫原活性之抗原決定基為在受檢者中引出抗體反應之分子(例如，多肽或蛋白質)的位點、片段或區域。具有抗原活性之抗原決定基為分子之位點、片段或區域，其中如藉由熟習此項技術者所熟知之任一方法，例如藉由免疫檢定所測定，抗體免疫特異性地結合至該分子。
如本文中所使用，在蛋白質試劑之上下文中，術語"片段"係指包括肽、多肽或蛋白質之胺基酸序列之至少2個鄰近胺基酸殘基、至少5個鄰近胺基酸殘基、至少10個鄰近胺基酸殘基、至少15個鄰近胺基酸殘基、至少20個鄰近胺基酸殘基、至少25個鄰近胺基酸殘基、至少40個鄰近胺基酸殘基、至少50個鄰近胺基酸殘基、至少60個鄰近胺基殘基、至少70個鄰近胺基酸殘基、至少80個鄰近胺基酸殘基、至少90個鄰近胺基酸殘基、至少100個鄰近胺基酸殘基、至少125個鄰近胺基酸殘基、至少150個鄰近胺基酸殘基、至少175個鄰近胺基酸殘基、至少200個鄰近胺基酸殘基或至少250個鄰近胺基酸殘基之胺基酸序列的肽或多肽。在一實施例中，全長蛋白質之片段保持全長蛋白質之活性。在另一實施例中，全長蛋白質之片段不保持全長蛋白質之活性。
如本文中所使用，在編碼多肽或蛋白質之核酸的上下文中，術語"片段"係指包括編碼肽、多肽或蛋白質之核酸序列之至少2個鄰近核苷酸、至少5個鄰近核苷酸、至少10個鄰近核苷酸、至少15個鄰近核苷酸、至少20個鄰近核苷酸、至少25個鄰近核苷酸、至少30個鄰近核苷酸、至少35個鄰近核苷酸、至少40個鄰近核苷酸、至少50個鄰近核苷酸、至少60個鄰近核苷酸、至少70個鄰近核苷酸、至少80個鄰近核苷酸、至少90個鄰近核苷酸、至少100個鄰近核苷酸、至少125個鄰近核苷酸、至少150個鄰近核苷酸、至少175個鄰近核苷酸、至少200個鄰近核苷酸、至少250個鄰近核苷酸、至少300個鄰近核苷酸、至少350個鄰近核苷酸或至少380個鄰近核苷酸之核酸序列的核酸。在一較佳實施例中，核酸之片段編碼保持全長蛋白質之活性的肽或多肽。在另一實施例中，全長蛋白質之片段不保持全長蛋白質之活性。
如本文中所使用，在蛋白質試劑之上下文中，術語"異源序列"係指實質上未發現與嵌合病毒骨架或尤其為嵌合病毒糖蛋白相關之分子。在核酸序列或核酸分子之上下文中，術語"異源序列"係指實質上未發現與嵌合病毒骨架之基因組相關之分子。
如本文中所使用，術語"免疫特異性地結合抗原"及類似術語係指特異性地結合至抗原且不特異性地結合至另一分子(例如，包含經修飾之抗體(亦即，包括經修飾IgG(例如，IgG1)恆定域或其FcRn－結合片段(例如，Fc域或鉸鏈－Fc域)之抗體)及未經修飾之抗體(亦即，不包括經修飾之IgG(例如，IgG1)恆定域或其FcRn－結合片段(例如，Fc域或鉸鏈－Fc域)之抗體)之抗原特異性抗體)的分子。特異性地結合一抗原之分子可為與相關抗原交叉反應的。較佳地，特異性地結合一抗原之分子不與其他抗原交叉反應。特異性地結合抗原之分子可(例如)藉由免疫檢定、BIAcore或熟習此項技術者所知之其他技術來識別。如使用諸如放射免疫檢定(RIA)及酶聯免疫吸附檢定(ELISA)之實驗技術所測定，分子特異性地結合一抗原係發生在當其以比結合至任一可交叉反應抗原之親和力更高之親和力結合至該抗原時。參見，例如，Paul，編，1989，Fundamental Immunology第二版， Raven Press,New York，第332－336頁關於抗體特異性之討論。
如本文中所使用，在向受檢者投與(a)療法之上下文中，術語"組合"係指多於一種療法(例如，多於一種預防劑及/或治療劑)之用途。術語"組合"之使用不限制向受檢者(例如，具有流感病毒感染及NDV感染，或與其相關之病狀或症狀之受檢者，或具有另一感染(例如，另一病毒感染)之受檢者)投與療法(例如，預防劑及/或治療劑)之次序。第一療法(例如，第一預防劑或治療劑)可在向受檢者(例如，具有流感病毒感染、NDV感染或與其相關之病狀或症狀，或另一感染(例如，另一病毒感染)之受檢者)投與第二療法(例如，第二預防劑或治療劑)之前(例如，在投與第二療法前5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週)，同時或之後(例如，在投與第二療法後5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週)來投與。
如本文中所使用，片語蛋白質試劑之"干擾素拮抗劑活性"係指降低或抑制細胞干擾素免疫反應之蛋白質或多肽，或其片段、衍生物或類似物。詳言之，具有干擾素拮抗劑活性之蛋白質或多肽，或其片段、衍生物或類似物(例如，流感病毒NS1)降低或抑制干擾素表現及/或活性。在一特定實施例中，片語"干擾素拮抗劑活性"係指降低或抑制細胞干擾素免疫反應之病毒蛋白質或多肽，或其片段、衍生物或類似物(例如流感病毒蛋白質)。具有干擾素拮抗劑活性之病毒蛋白質或多肽可優先地影響干擾素(IFN)之一種或兩種類型之表現及/或活性。在一實施例中，IFN－α之表現及/或活性受影響。在另一實施例中，IFN－β之表現及/或活性受影響。在另一特定實施例中，IFN－γ之表現及/或活性受影響。在某些實施例中，如藉由本文中所描述或熟習此項技術者所知之技術所量測，相對於在不表現或不與蛋白質試劑接觸之對照受精卵或細胞中之IFN－α、IFN－β及/或IFN－γ的表現及/或活性，在受精卵或細胞中之IFN－α、IFN－β及/或IFN－γ之表現及/或活性藉由具有干擾素拮抗劑活性之該蛋白質試劑而降低大致1至大致100倍，大致5至大致80倍，大致20至大致80倍，大致1至大致10倍，大致1至大致5倍，大致40至大致80倍，或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
如本文中所使用，片語"缺IFN之系統"或"缺IFN之受質"係指系統，例如細胞、細胞株及動物，諸如小鼠、雞、火雞、兔、大鼠、馬等等，其不產生一種、兩種或兩種以上類型之IFN，或不產生任一類型之IFN，或產生低含量之一種、兩種或兩種以上類型之IFN，或產生低含量之任一類型之IFN(亦即，當在相同條件下與IFN－勝任系統相比時，任一IFN表現降低率為5－10%、10－20%、20－30%、30－40%、40－50%、50－60%、60－70%、70－80%、80－90%或更大)，不有效地響應或較低有效地響應一種、兩種或兩種以上類型之IFN，或不響應任一類型之IFN，及/或藉由一種、兩種或兩種以上類型之IFN所誘發或藉由任一類型之IFN所誘發之抗病毒基因的活性缺乏。
如本文中所使用，術語"感染"、"流感感染"、"禽流感感染"及"NDV感染"係指在受檢者中流感病毒之生命週期、禽流感病毒之生命週期、NDV之生命週期或另一感染因子(例如，另一病毒性或細菌感染)之生命週期的所有階段(包含但不限於在細胞或身體組織中由流感病毒、禽流感病毒、NDV或其他感染因子之侵入及該等病毒之複製)，以及得自由流感病毒、禽流感病毒或NDV之侵入及該等病毒之複製的病理狀態。由流感病毒、禽流感病毒、NDV或其他感染因子之侵入及該等病毒之增殖包含但不限於以下步驟：使流感病毒、禽流感病毒或NDV粒子靠接至細胞，使病毒與細胞膜融合，將病毒遺傳資訊引入細胞中，表現流感病毒、禽流感病毒或NDV蛋白質，產生新的流感病毒、禽流感病毒或NDV粒子且自細胞釋放流感病毒、禽流感病毒或NDV粒子。呼吸道感染(例如，流感病毒或NDV感染)可為上呼吸道感染(URI)、下呼吸道感染(LRI)或其組合。在特定實施例中，感染為在初次感染(例如病毒性肺炎)發作後出現之繼發性感染(例如繼發性肺炎)。繼發性感染的發生歸因於使受感染之受檢者傾向繼發性感染之初次感染或與其相關之症狀或條件。在特定實施例中，得自由流感病毒、禽流感病毒或NDV之侵入及該等病毒之複製的病理狀態為急性流感病毒、禽流感病毒或NDV疾病。呼吸道感染之急性階段可呈現為肺炎及/或細支氣管炎，其中該等症狀可包含低氧、呼吸暫停、呼吸窘迫、呼吸促迫、喘鳴、發紺等。呼吸道感染(例如，流感病毒及NDV感染)之急性階段需要使受感染個體獲得諸如住院、投與氧、插管及/或換氣之醫學介入治療。
如本文中所使用，在病毒之上下文中，術語"經分離之"係指得自單一親代病毒之病毒。病毒可使用熟習此項技術者所知之包含但不限於彼等基於溶斑菌純化及限制稀釋法之常規方法來分離。
如本文中所使用，術語"控制"係指受檢者由不造成疾病(例如感染)之冶癒之療法(例如，預防劑或治療劑)所得的有益效應。在某些實施例中，投與受檢者一或多種療法(例如，預防劑或治療劑，諸如本發明之抗體)以控制流感病毒感染、禽流感病毒或NDV感染或由另一感染因子引起之感染、其一或多種症狀或與流感病毒感染或NDV感染或由另一感染因子引起之感染相關，藉由其增強，或使其增效之病狀以便預防感染之進展或惡化。
如本文中所使用，片語"病毒感染劑量"或"MOI"為每個受感染細胞的病毒之平均數。MOI係藉由所添加之病毒數(所添加之毫升×Pfu)除以所添加之細胞數(所添加之毫升×細胞/毫升)來確定。
如本文中所使用，片語"NS1基因"係指流感中編碼非結構蛋白質(NS1)之基因。NS1為藉由流感A及其他病毒之分段基因組來編碼之8個分子中之一者。"NS1基因產物"係指藉由NS1基因來編碼之基因產物(例如，RNA或蛋白質)。在蛋白質之狀況下，NS1基因產物為全長的且具有野生型NS1活性(例如，來自病毒株A/WSN/33)。
如本文中所使用，術語"核酸"、"核苷酸序列"及"核酸分子"包含DNA分子(例如，cDNA或染色體組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA及RNA分子或雜交DNA/RNA分子之組合及DNA或RNA分子之類似物。該等類似物可使用(例如)包含但不限於次黃嘌呤核苷或三苯甲基化鹼基之核苷酸類似物來產生。該等類似物亦可包括包含向分子提供諸如核酸酶抵抗性或穿過細胞膜之增強的能力之有益屬性的經修飾主鏈之DNA或RNA分子。核酸或核苷酸序列可為單股、雙股，可含有單股及雙股部分且可含有三股部分，但較佳為雙股DNA。
如本文中所使用，術語"預防"係指由於投與療法(例如，預防劑或治療劑)而在受檢者中預防疾病(例如，病毒感染或其他感染疾病)之一或多種症狀之復發或發作，或減少該等症狀。舉例而言，在向受檢者投與療法用於感染之上下文中，"預防"係指在受檢者中，由於投與療法(例如，預防劑或治療劑)或投與療法之組合(例如，預防劑或治療劑之組合)而抑制或減少感染(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關之病狀或不同於流感病毒或NDV感染之感染或與其相關之病狀)之發展或發作，或預防感染(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關之病狀或不同於流感病毒感染、NDV感染之感染或與其相關之病狀)之一或多種症狀之復發、發作或發展。
如本文中所使用，在感染因子之上下文中，術語"保護性抗原"包含當向受檢者投與時，能夠引出保護性免疫反應之任一分子，該免疫反應係針對感染因子。
如本文中所使用，術語"預防劑"係指可用於預防疾病(例如，感染)或其症狀(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關之病狀或症狀，或不同於NDV感染之流感病毒之感染或與其相關之病狀或症狀)之任一藥劑。較佳地，預防劑為已知適用於，已用於或當前正用於預防或阻止疾病或其症狀(例如，感染或與其相關之病狀或症狀)之發作、發展、進展及/或嚴重性之藥劑。
如本文中所使用，在病毒之上下文中，片語"經純化之"係指大體上不含來自細胞源或組織源(該病毒係自該細胞源或組織源得到)之細胞物質及培養基之病毒。語言"大體上不含細胞物質"包含其中病毒自細胞之細胞組分分離之病毒製劑，該病毒係自該等細胞分離或重組產生。因此，大體上不含細胞物質之病毒包含具有小於細胞蛋白質(在本文中亦稱為"污染蛋白質")之約30%、20%、10%或5%(以乾重計)之蛋白質製劑。病毒亦為大體上不含培養基的，亦即，培養基占小於病毒製劑之體積的約20%、10%或5%。病毒可使用熟習此項技術者所知之包含但不限於層析及離心之常規方法來純化。
如本文中所使用，術語"受檢者"或"患者"可交替地使用。如本文中所使用，術語"受檢者"係指動物(例如，禽類、爬蟲及哺乳動物)。在一些實施例中，受檢者為哺乳動物，其包含非靈長動物(例如，駱駝、驢、斑馬、母牛、馬、貓、狗、大鼠及小鼠)及靈長動物(例如，猴、黑猩猩及人類)。在一些實施例中，受檢者為非人類哺乳動物。在其他實施例中，受檢者為人類。在某些實施例中，哺乳動物(例如，人類)為0至6個月大、6至12個月大、1至5歲、5至10歲、10至15歲、15至20歲、20至25歲、25至30歲、30至35歲、35至40歲、40至45歲、45至50歲、50至55歲、55至60歲、60至65歲、65至70歲、70至75歲、75至80歲、80至85歲、85至90歲、90至95歲或95至100歲。在一特定實施例中，受檢者或患者為禽類。在某些實施例中，禽類為0至3個月大、3至6個月大、6至9個月大、9至12個月大、12至15個月大、15至18個月大或18至24個月大。
如本文中所使用，在投藥或結果或療法之上下文中，術語"協同"係指療法(例如，預防劑或治療劑)之組合，其比任一兩種或兩種以上之單一療法(例如，一或多種預防劑或治療劑)之累加效應更有效。療法之組合(例如，預防劑或治療劑之組合)的協同效應容許使用較低劑量之療法之一或多者(例如，一或多種預防劑或治療劑)及/或更低頻率地向患有疾病(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關之病狀或症狀，或不同於流感病毒感染、NDV感染之感染或與其相關之病狀或症狀)之受檢者投與該等療法。利用較低劑量之療法(例如，預防劑或治療劑)的能力及/或更低頻率地投與該等療法之能力降低與向受檢者投與該等療法相關之毒性，而不降低該等療法預防或治療疾病(例如，流感病毒感染或與其相關之病狀或症狀，或不同於流感病毒感染之感染或與其相關之病狀或症狀)之功效。另外，協同效應可在預防、控制或治療疾病(例如，流感病毒感染、NDV感染或與其相關之病狀或症狀，或不同於流感病毒感染、NDV感染之感染或與其相關之病狀或症狀)中產生療法(例如，預防劑或治療劑)之改良功效。最後，療法(例如，預防劑或治療劑)之組合的協同效應可避免或降低與使用任一單一療法相關之相反或不期望之副作用。
如本文中所使用，術語"療法"可指可用於預防、治療、控制或改善疾病(例如，癌、流感病毒感染、NDV感染或與其相關之病狀或症狀，或不同於流感病毒感染或NDV感染之感染或與其相關之病狀或症狀)之任一方案、方法及/或藥劑。在某些實施例中，術語"療法"係指熟習此項技術者所知之適用於治療、控制、預防或改善疾病、感染或與其相關之病狀或症狀的生物療法、支持性療法及/或其他療法。
如本文中所使用，術語"治療劑"係指可用於預防、治療、控制或改善疾病(例如，感染或其症狀(例如，流感感染、NDV感染或與其相關之病狀或症狀，不同於流感病毒感染、NDV感染之感染或與其相關之病狀或症狀))之任一藥劑。較佳地，治療劑為已知適用於，或已用於或當前正用於預防、治療、控制或改善疾病或與其相關之症狀(例如，流感感染、NDV感染或與其相關之病狀或症狀，或不同於流感病毒感染、NDV感染之感染或與其相關之病狀或症狀)之藥劑。
如本文中所使用，在為了疾病而向受檢者投與療法之上下文中，術語"治療"係指根除、減少或改善該疾病之症狀。關於感染(例如，流感病毒或NDV病毒)，治療係指由於投與一或多種療法(包含但不限於投與一或多種預防劑或治療劑)而根除或控制感染因子(例如，病毒)之複製，降低感染因子數(例如，降低病毒之力價)，降低或改善感染(例如，流感感染、NDV感染或與其相關之病狀或症狀，不同於流感病毒感染、NDV感染之感染或與其相關之病狀或症狀)之進展、嚴重性及/或持續時間，或改善一或多種症狀。關於癌，治療係指由於投與本發明之一或多種治療劑而根除、移除、改善或控制原發性癌，區域性癌或轉移性癌組織。在某些實施例中，該等術語係指由於向患有該疾病之受檢者投與本發明之一或多種治療劑而最小化或延遲癌之傳播。在其他實施例中，該等術語係指消除引起疾病之細胞。
本發明提供經工程化以表現併入病毒粒子中之融合蛋白質的嵌合負股RNA病毒，產生該等嵌合病毒之方法及該等病毒在免疫原性調配物中或在活體外檢定中(例如)作為免疫原之用途。本發明之嵌合病毒之特徵為在病毒粒子表面上不僅呈現與病毒相關之抗原且亦顯示融合蛋白質。
可根據本發明之方法工程化之病毒可為任一包膜病毒。在一特定實施例中，可根據本發明之方法工程化之病毒具有分段基因組或非分段基因組及單股基因組或雙股基因組。根據本發明之方法使用之病毒可選自天然產生之病毒株、變異體或突變體；經誘變處理之病毒(例如，藉由曝露於UV輻射、誘變劑及/或繼代處理)；重配病毒(對於具有分段基因組之病毒而言)；及/或經遺傳工程化之病毒。舉例而言，突變病毒可藉由天然變異、曝露於UV輻射、曝露於化學誘變劑，藉由使非許可之宿主繼代，藉由重配(亦即，藉由減毒分段病毒與具有所要抗原之另一病毒株之共同感染)及/或藉由遺傳工程(例如，使用"反向遺傳")來產生。根據本發明之方法使用之具有分段基因組的病毒之非限制性實例包含來自正黏液病毒科(例如，流感病毒)、布尼亞病毒科(例如，布尼亞病毒(Bunyamwera))、裏奧病毒科(reoviridae)及沙狀病毒科(例如，賴薩熱(Lassa fever))之病毒。根據本發明之方法使用之具有非分段基因組的病毒之非限制性實例包含冠狀病毒科(coronaviridae)(例如，人類冠狀病毒(SARS))、肝炎病毒科(hepadnaviridae)(例如，肝炎A、B或C病毒)、疱疹病毒科(herpesviridae)(例如，疱疹單純型病毒)、痘病毒科(poxviridae)(例如，天花)、彈狀病毒科(例如，水泡性口炎病毒(VSV)、仙台病毒及狂犬病)、副黏液病毒科(例如，麻疹及呼吸道融合性病毒)及線病毒科(filoviridae)(馬堡(Marburg)病毒及伊波拉(Ebola)病毒)。在某些實施例中，分段病毒為流感病毒。在其他實施例中，非分段病毒為NDV。
在某些實施例中，經選擇以用於本發明之病毒係經減毒的及/或具有缺陷IFN拮抗劑活性；亦即，其為感染性的且可在活體內複製，但僅產生造成無症狀性水平之非病原性感染之低力價。病毒可藉由該項技術中已知及/或本文中所例證之任一方法來減毒，例如，將病毒工程化以包括在NS1基因中之突變或包括HA蛋白中之裂解位點前的多鹼基胺基酸序列之修飾。根據本發明來工程化之該等減毒病毒因此為用於(例如)活病毒疫苗之免疫原性組合物的理想候選者。當向受檢者投與時，本發明之減毒、嵌合病毒能夠產生免疫反應且引出對病毒及對非原生或融合蛋白質之免疫性。在一些實施例中，非原生蛋白質係得自病原體。進一步而言，向受檢者投與該嵌合病毒產生對除病毒之外的該病原體之免疫反應及/或免疫性。
本發明亦係關於本發明之嵌合病毒在用於人類或動物(例如，禽類)之免疫原性製劑中的用途。詳言之，經減毒之嵌合病毒可用作抵抗廣泛範圍之病毒及/或疾病之疫苗。因為嵌合病毒經工程化以表現作為病毒粒子中之外來抗原決定基的異源基因序列，所以包括本發明之嵌合病毒的調配物可經設計用於免疫以抵抗多病毒株變異體、不同病毒或抵抗完全不同的感染因子或疾病抗原(例如，細菌、寄生蟲、真菌或腫瘤特異性抗原)，該等異源基因序列係自上述各物得到。若干方法可用以向人類或動物受檢者引入活減毒病毒調配物以誘發免疫反應或適當的細胞激素反應。該等方法包含但不限於鼻內、氣管內、經口、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下途徑。
5.1嵌合流感病毒
5.1.1包括併入其病毒粒子中之融合蛋白質的嵌合禽流感病毒 本發明涵蓋工程化禽流感病毒以便融合蛋白質藉由基因組來編碼且當受表現時，其併入病毒粒子中。可經工程化以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入禽流感病毒粒子中之任一禽流感病毒類型、亞型或病毒株可根據本發明來選擇及使用，其包含但不限於天然產生之病毒株、變異體或突變體、經誘變處理之病毒、重配病毒及/或經遺傳工程化之病毒。在一特定實施例中，本發明之禽流感病毒非天然產生之病毒。在另一特定實施例中，本發明之禽流感病毒為經遺傳工程化之病毒。禽流感病毒之非限制性實例包含流感A亞型H5N1、H6N2、H7N3、H9N2及H10N7。
流感病毒之遺傳操縱需要工程化包括病毒基因組之8個病毒RNA區段之至少一者。基因組之突變可經由"反向工程"技術來達成(參見部分5.4)。然而，流感基因組之可塑性在可穩定地整合入病毒中之區段數及區段長度上係有限的。長插入物之總穩定性為未知的且包括該等插入物或其部分之區段可由於在幾代之後的病毒分離而丟失。因此，在本發明之一較佳實施例中，禽流感病毒經工程化以便其兩種主要表面蛋白質之一者係由融合蛋白質來置換。
因此，本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括至少一種具有不同於流感病毒之感染因子之蛋白質的胞外域(ED)及至少一種基本流感病毒糖蛋白之細胞質(CT)域及跨膜(TM)域或跨膜(TM)域的融合蛋白質，其中至少一種融合蛋白質功能性地置換至少一種基本禽流感病毒糖蛋白。換言之，禽流感病毒係充當"骨架"，其經工程化以表現替代基本禽流感病毒糖蛋白之融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中。包含對應於藉由融合蛋白質來功能性地置換之基本禽流感病毒糖蛋白之流感病毒糖蛋白的TM及CT域或TM域允許融合蛋白質併入禽流感病毒之病毒粒子中。融合蛋白質之TM及CT域或TM域可對應於或得自允許融合蛋白質併入禽流感病毒骨架之病毒粒子中之任一流感病毒。
在某些實施例中，融合蛋白質之TM及CT域或TM域對應於不同於骨架禽流感病毒之禽流感病毒之類型、亞型或病毒株的TM及CT域或TM域。在其他實施例中，融合蛋白質之TM及CT域或TM域對應於不同於禽流感病毒之流感病毒之TM及CT域或TM域。在其他實施例中，融合蛋白質之TM及CT域或TM域對應於禽流感病毒骨架之TM及CT域或TM域。
禽流感病毒粒子包括兩種主要表面糖蛋白：血球凝集素(HA)及神經胺酸酶(N)，兩者皆包括細胞質域、跨膜域及胞外域。因此，在某些實施例中，融合蛋白質之TM及CT域對應於流感病毒之HA蛋白或NA蛋白之TM及CT域。因為HA或NA之CT域對將融合蛋白質併入禽流感病毒病毒粒子中而言可為不必要的，所以在一些實施例中，融合蛋白質經工程化以僅含有HA或NA之TM域。舉例而言，已展示NA之CT域對將該蛋白質適當地包裝至流感A病毒包膜中而言為不必要的(Garcia－Sastre等人，1995,Virus Res.37：37－47，其在此以引用之方式全部併入)。因此，在對應於NA蛋白之彼等者之結構域用於產生融合蛋白質之處，本發明涵蓋將融合蛋白質工程化以僅含有對應於流感病毒NA蛋白之TM域。因此，在本發明之一實施例中，融合蛋白質經工程化以僅含有TM域，該TM域對應於流感病毒NA蛋白之TM域。
流感病毒HA及NA蛋白之TM及CT域在結構上係相異的，因為該等域係位於HA蛋白之C－末端及NA蛋白之N－末端。除表面糖蛋白之每個種類中之兩種域的不同定向外，HA結構域及CT結構域還可包括視其在多肽鏈中之相對位置而定的功能性上之未知差異。因此，當設計經工程化至禽流感病毒中之融合蛋白質時，待融合至流感病毒糖蛋白之TM及CT域或TM域的感染因子之胞外域之定向將指導TM及CT域或TM域之選擇。舉例而言，在感染因子之胞外域藉由N－末端來錨定之處，可使用流感病毒NA蛋白之TM及CT域。
HA及NA分別顯示關於病毒之感染性及繁殖所必需的細胞融合及釋放之競爭活性。HA結合至細胞表面上之N－乙醯神經胺酸(NeuNAc；唾液酸)，導致病毒由宿主細胞來捕捉，而NA裂解來自細胞表面之唾液酸部分從而導致自受感染細胞釋放子代病毒。對該等活性之任一者之破壞導致得到非功能性病毒。因此，為維持病毒能力，在表面糖蛋白經置換之處，其在嵌合病毒中之功能必須由融合蛋白質來供應。在本發明之一實施例中，嵌合禽流感病毒包括顯示神經胺酸酶活性之融合蛋白質。在本發明之另一實施例中，嵌合禽流感病毒包括顯示受體結合活性之融合蛋白質。在本發明之又一實施例中，嵌合禽流感病毒包括兩種融合蛋白質，其一者顯示神經胺酸酶活性，其另一者顯示受體結合活性。在一特定實施例中，嵌合禽流感病毒包括含有新城病病毒(NDV)之HN蛋白之胞外域及流感A/WSN/33之NA蛋白之TM及CT域的表面蛋白質，該HN胞外域顯示神經胺酸酶活性。在其他實施例中，嵌合禽流感病毒包括含有異源流感病毒之HA蛋白(例如，H7HA蛋白或H9HA蛋白)之胞外域的表面蛋白質。HA及NA係由病毒基因組之分離區段來編碼且替代原生蛋白質之全部編碼區消除在編碼所引入之蛋白質之序列上的大多數長度約束。
在某些實施例中，融合蛋白質包括跨膜域加上1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個基本流感病毒糖蛋白之胞外域的直接相鄰殘基。舉例而言，在一特定實施例中，融合蛋白質包括流感病毒NA蛋白之跨膜域，1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個流感病毒NA蛋白之胞外域之直接相鄰殘基及不同於流感病毒之感染因子之胞外域，該融合蛋白質可功能性地置換NA蛋白之功能。在另一特定實施例中，融合蛋白質包括流感病毒NA蛋白之細胞質域及跨膜域，1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個直接相鄰於流感病毒NA蛋白之跨膜域的流感病毒NA蛋白之胞外域之殘基及不同於流感病毒之感染因子之胞外域，該融合蛋白質可功能性地置換NA蛋白之功能。
本發明涵蓋編碼在此部分5.1.1中所述之融合蛋白質之核苷酸序列(亦即，重組區段)。在較佳實施例中，包括編碼在部分5.1.1中所述之融合蛋白質之核酸的重組區段包括適當複製、轉錄及包裝vRNA所需之3'及5'併入信號(Fujii等人，2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：2002－2007；Zheng等人，1996,Virology 217：242－251，兩者皆以引用方式全部併入本文中)。在一較佳實施例中，本發明之重組區段因此使用相同病毒類型或病毒株中之病毒之區段的3'及5'非編碼及/或非轉譯序列作為骨架禽流感病毒。在特定實施例，重組區段包括編碼在此部分5.1.1中所述之融合蛋白質之核酸，該等重組區段包括流感病毒NA vRNA之3'非編碼區，對應於NA蛋白之CT及TM域之NA編碼區，1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個直接相鄰於流感病毒NA蛋白之跨膜域的流感病毒NA蛋白之胞外域之殘基，NA蛋白閱讀框架之未轉譯區及NA vRNA之5'非編碼區。
作為置換禽流感病毒之NA或HA蛋白之替代者，"反向遺傳"及雙譯基因技術可用以產生包括不同於流感病毒之感染因子之胞外域及流感病毒之TM及/或CT域的嵌合流感病毒。參見，例如，美國專利第6,887,699號、美國專利第6,001,634號、美國專利第5,854,037號及美國專利第5,820,871號，其各者在此以引用之方式全部併入。雙譯基因方法包含將融合蛋白質之編碼區插入病毒之必需蛋白質之開放閱讀框架及其終止密碼子中。插入係由IRES及其中插入該IRES之必需蛋白質之任一未轉譯信號序列來側接，且插入必須不破壞必需病毒蛋白質之開放閱讀框架、包裝信號、多聚腺嘌呤或轉錄啟動子。此項技術中熟知或本文中所述之任一IRES可根據本發明來使用(例如，BiP基因之IRES，GenBank資料庫寄存項目HUMGRP78之核苷酸372至592；或腦心肌炎病毒(EMCV)之IRES，GenBank資料庫寄存項目CQ867238之核苷酸1430－2115)。因為當使用雙譯基因方法時，HA或NA之功能未經置換，所以融合蛋白質之胞外域部分不受限於提供經置換之HA或NA蛋白之功能的蛋白質。該融合蛋白質之胞外域可對應於包含但不限於抗原、疾病抗原及得自感染因子之任一蛋白質之抗原(例如，與病毒性感染因子、細菌性感染因子或寄生性感染因子相關之任一保護性抗原)的任一異源分子。根據本發明之方法使用之得自感染因子或與感染因子相關之抗原的非限制性實例係提供於下文之部分5.3中。
置換骨架病毒之必需表面蛋白質或將重組區段引入病毒基因組中可使所得嵌合病毒減毒，亦即，嵌合病毒將顯示相對於野生型之削弱的複製。在本發明之某些實施例中，需要嵌合病毒之減毒以便嵌合病毒至少部分地保留感染性且可在活體內複製，但僅產生造成無症狀水平之非病原性感染之低力價。該等減毒嵌合病毒尤其適用於本發明之實施例，在該等實施例中向受檢者投與病毒以充當例如活疫苗之免疫原。病毒可藉由此項技術中已知及/或本文中所例證之任一方法來減毒，例如將病毒工程化以包括在NS1基因中之突變或包括HA蛋白中之裂解位點前的多鹼基胺基酸序列之修飾(參見美國專利第6,468,544號；美國專利第6,669,943號；Li等人，1999,J.Infect.Dis.179：1132－1138，其各者在此以引用之方式全部併入)。
在一實施例中，本發明之經減毒嵌合禽流感病毒包括包含在禽流感骨架病毒之NS1基因中突變之基因組，已知其在其他流感病毒中減弱NS1基因產物會拮抗細胞干擾素反應之能力。在另一實施例中，本發明之經減毒嵌合禽流感病毒包括包含在禽流感骨架病毒之HA基因中突變之基因組，已知其在其他流感病毒中會減弱或消除細胞蛋白酶將蛋白質裂解成其活性形式之能力且進而降低或消除經HA誘發之融合及感染性。在又一實施例中，本發明之經減毒嵌合禽流感病毒包括包含在禽流感骨架病毒之HA基因及NS1基因中突變之基因組，已知其在其他流感病毒中單獨地或當經組合時會降低或者減小病毒活性。減毒嵌合及野生型禽流感病毒之力價可利用此項技術中熟知或本文中所述之任一技術(例如，血球凝集檢定、溶菌斑檢定、卵感染劑量(EID50)、組織培養感染劑量(TCID50)等)來測定，且病毒可在本文中所述或此項技術中熟知之條件下繁殖(例如，在CEF細胞、MDCK細胞(例如，在37℃下，在5% CO2 增濕恆溫箱中，在MEM、10% v/v胎牛血清(FCS)、1%盤尼西林(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)中)或受精雞卵(例如，在37℃及55%相對濕度下，在穩定恆溫箱中)中繁殖)。或者，病毒可在生長於不含血清或血清降低(例如，TPCK胰蛋白酶)之培養基中的細胞(例如，CEF細胞、MDCK細胞等)中繁殖。
5.1.2包括併入其病毒粒子中之融合蛋白質的嵌合減毒流感病毒 本發明涵蓋經減毒流感病毒之工程化技術，如此融合蛋白質係由基因組編碼且表現時係併入至病毒粒子中。換言之，本發明涵蓋經減毒流感病毒(親代病毒)之用途，該經減毒病毒係作為經工程化以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中的"骨架"。包含但不限於天然產生之病毒株、變異體或突變體，經誘變處理之病毒，重配病毒及/或經遺傳修飾之病毒的任一減毒流感病毒類型或病毒株可用作經工程化以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中之骨架。在一特定實施例中，根據本發明使用之親代流感病毒係非天然產生之病毒。在另一特定實施例中，根據本發明使用之親代流感病毒為經遺傳工程化之病毒。
作為根據本發明之骨架病毒之流感病毒可天然地具有減毒表型或可經工程化以包括與減毒表型相關之突變，其中該突變在此項技術中為已知的或描述於本文中(例如，病毒NS1蛋白或病毒HA蛋白中之突變)。在特定實施例中，減毒病毒為流感A。在其他實施例中，減毒病毒為流感B。在另外其他實施例中，減毒病毒為流感C。可根據本發明來工程化之流感病毒之非限制性實例包含流感A亞型H10N4、亞型H10N5、亞型H10N7、亞型H10N8、亞型H10N9、亞型H11N1、亞型H11N13、亞型H11N2、亞型H11N4、亞型H11N6、亞型H11N8、亞型H11N9、亞型H12N1、亞型H12N4、亞型H12N5、亞型H12N8、亞型H13N2、亞型H13N3、亞型H13N6、亞型H13N7、亞型H14N5、亞型H14N6、亞型H15N8、亞型H15N9、亞型H16N3、亞型H1N1、亞型H1N2、亞型H1N3、亞型H1N6、亞型H1N9、亞型H2N1、亞型H2N2、亞型H2N3、亞型H2N5、亞型H2N7、亞型H2N8、亞型H2N9、亞型H3N1、亞型H3N2、亞型H3N3、亞型H3N4、亞型H3N5、亞型H3N6、亞型H3N8、亞型H3N9、亞型H4N1、亞型H4N2、亞型H4N3、亞型H4N4、亞型H4N5、亞型H4N6、亞型H4N8、亞型H4N9、亞型H5N1、亞型H5N2、亞型H5N3、亞型H5N4、亞型H5N6、亞型H5N7、亞型H5N8、亞型H5N9、亞型H6N1、亞型H6N2、亞型H6N3、亞型H6N4、亞型H6N5、亞型H6N6、亞型H6N7、亞型H6N8、亞型H6N9、亞型H7N1、亞型H7N2、亞型H7N3、亞型H7N4、亞型H7N5、亞型H7N7、亞型H7N8、亞型H7N9、亞型H8N4、亞型H8N5、亞型H9N1、亞型H9N2、亞型H9N3、亞型H9N5、亞型H9N6、亞型H9N7、亞型H9N8，或亞型H9N9；流感B病毒株Aichi/5/88、病毒株Akita/27/2001、病毒株Akita/5/2001、病毒株Alaska/16/2000、病毒株Alaska/1777/2005、病毒株Argentina/69/2001、病毒株Arizona/146/2005、病毒株Arizona/148/2005、病毒株Bangkok/163/90、病毒株Bangkok/34/99、病毒株Bangkok/460/03、病毒株Bangkok/54/99、病毒株Barcelona/215/03、病毒株Beijing/15/84、病毒株Beijing/184/93、病毒株Beijing/243/97、病毒株Beijing/43/75、病毒株Beijing/5/76、病毒株Beijing/76/98、病毒株Belgium/WV106/2002、病毒株Belgium/WV107/2002、病毒株Belgium/WV109/2002、病毒株Belgium/WV114/2002、病毒株Belgium/WV122/2002、病毒株Bonn/43、病毒株Brazil/952/2001、病毒株Bucharest/795/03、病毒株Buenos Aires/161/00)、病毒株Buenos Aires/9/95、病毒株BuenosAires/SW16/97、病毒株Buenos Aires/VL518/99、病毒株Canada/464/2001、病毒株Canada/464/2002、病毒株Chaco/366/00、病毒株Chaco/R113/00、病毒株Cheju/303/03、病毒株Chiba/447/98、病毒株Chongqing/3/2000、臨床分離病毒株SA1 Thailand/2002、臨床分離病毒株SA10 Thailand/2002、臨床分離病毒株SA100 Philippines/2002、臨床分離病毒株SA101 Philippines/2002、臨床分離病毒株SA110 Philippines/2002)、臨床分離病毒株SA112 Philippines/2002、臨床分離病毒株SA113 Philippines/2002、臨床分離病毒株SA114 PhilippineS/2002、臨床分離病毒株SA2 Thailand/2002、臨床分離病毒株SA20 Thailand/2002、臨床分離病毒株SA38 Philippines/2002、臨床分離病毒株SA39 Thailand/2002、臨床分離病毒株SA99 Philippines/2002、病毒株CNIC/27/2001、病毒株Colorado/2597/2004、病毒株Cordoba/VA418/99、病毒株Czechoslovakia/16/89、病毒株Czechoslovakia/69/90、病毒株Daeku/10/97、病毒株Daeku/45/97、病毒株Daeku/47/97、病毒株Daeku/9/97、病毒株B/Du/4/78、病毒株B/Durban/39/98、病毒株Durban/43/98、病毒株Durban/44/98、病毒株B/Durban/52/98、病毒株Durban/55/98、病毒株Durban/56/98、病毒株England/1716/2005、病毒株England/2054/2005)、病毒株England/23/04、病毒株Finland/154/2002、病毒株Finland/159/2002、病毒株Finland/160/2002、病毒株Finland/161/2002、病毒株Finland/162/03、病毒株Finland/162/2002、病毒株Finland/162/91、病毒株Finland/164/2003、病毒株Finland/172/91、病毒株Finland/173/2003、病毒株Finland/176/2003、病毒株Finland/184/91、病毒株Finland/188/2003、病毒株Finland/190/2003、病毒株Finland/220/2003、病毒株Finland/WV5/2002、病毒株Fujian/36/82、病毒株Geneva/5079/03、病毒株Genoa/11/02、病毒株Genoa/2/02、病毒株Genoa/21/02、病毒株Genova/54/02、病毒株Genova/55/02、病毒株Guangdong/05/94、病毒株Guangdong/08/93、病毒株Guangdong/5/94、病毒株Guangdong/55/89、病毒株Guangdong/8/93、病毒株Guangzhou/7/97、病毒株Guangzhou/86/92、病毒株Guangzhou/87/92、病毒株Gyeonggi/592/2005、病毒株Hannover/2/90、病毒株Harbin/07/94、病毒株Hawaii/10/2001、病毒株Hawaii/1990/2004、病毒株Hawaii/38/2001、病毒株Hawaii/9/2001、病毒株Hebei/19/94、病毒株Hebei/3/94)、病毒株Henan/22/97、病毒株Hiroshima/23/2001、病毒株Hong Kong/110/99、病毒株Hong Kong/1115/2002、病毒株Hong Kong/112/2001、病毒株Hong Kong/123/2001、病毒株Hong Kong/1351/2002、病毒株Hong Kong/1434/2002、病毒株Hong Kong/147/99、病毒株Hong Kong/156/99、病毒株Hong Kong/157/99、病毒株Hong Kong/22/2001、病毒株Hong Kong/22/89、病毒株Hong Kong/336/2001、病毒株Hong Kong/666/2001、病毒株Hong Kong/9/89、病毒株Houston/1/91、病毒株Houston/1/96、病毒株Houston/2/96、病毒株Hunan/4/72、病毒株Ibaraki/2/85、病毒株ncheon/297/2005、病毒株India/3/89、病毒株India/77276/2001、病毒株Israel/95/03、病毒株Israel/WV187/2002、病毒株Japan/1224/2005、病毒株Jiangsu/10/03、病毒株Johannesburg/1/99、病毒株Johannesburg/96/01、病毒株Kadoma/1076/99、病毒株Kadoma/122/99、病毒株Kagoshima/15/94、病毒株Kansas/22992/99、病毒株Khazkov/224/91、病毒株Kobe/1/2002、strain、病毒株Kouchi/193/99、病毒株Lazio/1/02、病毒株Lee/40、病毒株Leningrad/129/91、病毒株Lissabon/2/90)、病毒株Los Angeles/1/02、病毒株Lusaka/270/99、病毒株Lyon/1271/96、病毒株Malaysia/83077/2001、病毒株Maputo/1/99、病毒株Mar del Plata/595/99、病毒株Maryland/1/01、病毒株Memphis/1/01、病毒株Memphis/12/97－MA、病毒株Michigan/22572/99、病毒株Mie/1/93、病毒株Milano/1/01、病毒株Minsk/318/90、病毒株Moscow/3/03、病毒株Nagoya/20/99、病毒株Nanchang/1/00、病毒株Nashville/107/93、病毒株Nashville/45/91、病毒株Nebraska/2/01、病毒株Netherland/801/90、病毒株Netherlands/429/98、病毒株New York/1/2002、病毒株NIB/48/90、病毒株Ningxia/45/83、病毒株Norway/1/84、病毒株Oman/16299/2001、病毒株Osaka/1059/97、病毒株Osaka/983/97－V2、病毒株Oslo/1329/2002、病毒株Oslo/1846/2002、病毒株Panama/45/90、病毒株Paris/329/90、病毒株Parma/23/02、病毒株Perth/211/2001、病毒株Peru/1364/2004、病毒株Philippines/5072/2001、病毒株Pusan/270/99、病毒株Quebec/173/98、病毒株Quebec/465/98、病毒株Quebec/7/01、病毒株Roma/1/03、病毒株Saga/S172/99、病毒株Seoul/13/95、病毒株Seoul/37/91、病毒株Shangdong/7/97、病毒株Shanghai/361/2002)、病毒株Shiga/T30/98、病毒株Sichuan/379/99、病毒株Singapore/222/79、病毒株Spain/WV27/2002、病毒株Stockholm/10/90、病毒株Switzerland/5441/90、病毒株Taiwan/0409/00、病毒株Taiwan/0722/02、病毒株Taiwan/97271/2001、病毒株Tehran/80/02、病毒株Tokyo/6/98、病毒株Trieste/28/02、病毒株Ulan Ude/4/02、病毒株United Kingdom/34304/99、病毒株USSR/100/83、病毒株Victoria/103/89、病毒株Vienna/1/99、病毒株Wuhan/356/2000、病毒株WV194/2002、病毒株Xuanwu/23/82、病毒株Yamagata/1311/2003、病毒株Yamagata/K500/2001、病毒株Alaska/12/96、病毒株GA/86、病毒株NAGASAKI/1/87、病毒株Tokyo/942/96，或病毒株Rochester/02/2001；流感C病毒株Aichi/1/81、病毒株Ann Arbor/1/50、病毒株Aomori/74、病毒株California/78、病毒株England/83、病毒株Greece/79、病毒株Hiroshima/246/2000、病毒株Hiroshima/252/2000、病毒株Hyogo/1/83、病毒株Johannesburg/66、病毒株Kanagawa/1/76、病毒株Kyoto/1/79、病毒株Mississippi/80、病毒株Miyagi/1/97、病毒株Miyagi/5/2000、病毒株Miyagi/9/96、病毒株Nara/2/85、病毒株NewJersey/76、病毒株pig/Beijing/115/81、病毒株Saitama/3/2000)、病毒株Shizuoka/79、病毒株Yamagata/2/98、病毒株Yamagata/6/2000、病毒株Yamagata/9/96、病毒株BERLIN/1/85、病毒株ENGLAND/892/8、病毒株GREAT LAKES/1167/54、病毒株JJ/50、病毒株PIG/BEIJING/10/81、病毒株PIG/BEIJING/439/82)、病毒株TAYLOR/1233/47或病毒株STRAINC/YAMAGAT/A10/81。
在一實施例中，根據本發明來使用之減毒流感病毒(親代病毒)具有拮抗細胞干擾素(IFN)之削弱的能力。在一特定實施例中，根據本發明來使用之減毒流感病毒(親代病毒)為包括NS1基因中之突變的流感病毒類型或病毒株，該突變造成病毒對拮抗細胞干擾素反應之削弱的能力。可引入流感病毒NS1基因中之突變類型之實例包含缺失、取代、插入及其組合。一或多種突變可引入遍及NS1基因之任何處(例如，N－末端、C－末端或其間之某處)及/或NS1基因之調節元件處。在一特定實施例中，根據本發明來使用之減毒流感病毒(親代病毒)包括具有在N－末端處突變之流感病毒NS1基因的基因組。在另一實施例中，減毒流感病毒(親代病毒)包括具有在C－末端處突變之流感病毒NS1基因的基因組。在另一實施例中，根據本發明來使用之減毒流感病毒(親代病毒)包括具有流感病毒NS1基因之突變的基因組，該突變造成由自NS1之C－末端之5個、較佳10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、75個、80個、85個、90個、95個、99個、100個、105個、110個、115個、120個、125個、126個、130個、135個、140個、145個、150個、155個、160個、165個、170個或175個胺基酸殘基組成的缺失，或具有自C－末端之5－170個之間、25－170個之間、50－170個之間、100－170個之間、100－160個之間或105－160個之間的胺基酸殘基之缺失。在另一實施例中，根據本發明來使用之減毒流感病毒(親代病毒)包括具有流感病毒NS1基因之突變的基因組，該突變造成除下列胺基酸殘基之外的所有胺基酸殘基之缺失：胺基酸殘基1－126、胺基酸殘基1－120、胺基酸殘基1－115、胺基酸殘基1－110、胺基酸殘基1－100、胺基酸殘基1－99、胺基酸殘基1－95、胺基酸殘基1－85、胺基酸殘基1－80、胺基酸殘基1－75、胺基酸殘基1－73、胺基酸殘基1－70、胺基酸殘基1－65或胺基酸殘基1－60，其中N－末端胺基酸為數字1。
在一實施例中，本發明之減毒流感病毒包括包含流感病毒骨架之NS1基因之突變的基因組，其減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應之能力，且當在相同條件下繁殖時，如大致2至10天、3至7天、3至5天或2、3、4、5、6、7、8、9、10天之後感染所測定，介於0.0005與0.001之間、0.001與0.01之間、0.01與0.1之間或0.1與1之間的病毒感染劑量(MOI)下，或在0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0之MOI下，其允許減毒病毒生長至比細胞(例如，人類、小鼠、大鼠、豬、狗、馬或禽類來源之細胞(例如，HEp－2、A549、293T、Madin－Darby狗腎細胞(MDCK)或雞胚纖維母細胞(CEF)))中野生型流感病毒低大致1至大致100倍之間、大致5至大致80倍之間、大致20至大致80倍之間，或大致40至大致80倍之間、大致1至大致10倍之間、大致1至大致5倍之間、大致1至大致4倍之間、大致1至大致3倍之間、大致1至大致2倍之間，或大致1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍的力價。減毒及野生型流感病毒之力價可利用此項技術中熟知或本文中所述之任一技術(例如，血球凝集檢定、溶菌斑檢定、卵感染劑量(EID50)、組織培養感染劑量(TCID50)等)來測定且病毒可在本文中所述或此項技術中熟知之條件下繁殖(例如，在CEF細胞、MDCK細胞(例如，在37℃下，在5% CO2 增濕恆溫箱中，在MEM、10% v/v胎牛血清(FCS)、1%青黴素/鏈黴素中)或受精雞卵(例如，在37℃及55%之相對濕度下在穩定恆溫箱中)中繁殖)。或者，病毒可在生長於不含血清或血清降低(例如，TPCK胰蛋白酶)之培養基中的細胞(例如，CEF細胞、MDCK細胞等)中繁殖。
在另一實施例中，根據本發明來使用之減毒流感病毒(親代病毒)包括包含在流感骨架病毒之HA基因中突變之基因組，其減弱或消除細胞蛋白酶對將蛋白質裂解成其活性形式之能力。可引入流感HA基因中之突變類型之實例包含缺失、取代、插入或其組合。較佳在HA裂解位點(例如，GenBank寄存項目AY818135之核苷酸1013－1039)引入一或多種突變。一般而言，如藉由在CEF中之標準方法所測定，降低HA蛋白之可裂解性之突變與在活體內檢定中之降低的毒性相關(Horimoto及Kawaoka,1994,68：3120－3128；其在此以引用之方式全部併入)。在一特定實施例中，根據本發明來使用之減毒流感病毒(親代病毒)包括具有在流感病毒HA基因中突變的基因組，該突變導致以單一核苷酸胸嘧啶來取代核苷酸1026－1038。在另一實施例中，本發明之減毒流感病毒包括包含在流感骨架病毒之HA基因中突變的基因組，該突變減弱或消除細胞蛋白酶將蛋白質裂解成其活性形式之能力，且當在相同條件下繁殖時，如大致2至10天、3至7天、3至5天或2、3、4、5、6、7、8、9、10天之後感染所測定，在介於0.0005與0.001之間、0.001與0.01之間、0.01與0.1之間或0.1與1之間的病毒感染劑量(MOI)下，或在0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0之MOI下，允許減毒病毒生長至比細胞(例如，人類、小鼠、大鼠、豬、狗、馬或禽類來源之細胞(例如，HEp－2、A549、293T、Madin－Darby狗腎細胞(MDCK)或雞胚纖維母細胞(CEF)))中之野生型流感病毒低大致1至大致100倍之間、大致5至大致80倍之間、大致20至大致80倍之間，或大致40至大致80倍之間、大致1至大致10倍之間、大致1至大致5倍之間、大致1至大致4倍之間、大致1至大致3倍之間、大致1至大致2倍之間，或大致1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍的力價。包括該突變之HA蛋白並非在抗原性上相異於野生型親代HA蛋白，亦即，所產生之抵抗野生型HA蛋白之所有抗體將與突變HA蛋白交叉反應且所產生之抵抗突變HA蛋白之所有抗體將與野生型HA蛋白交叉反應。減毒及野生型流感病毒之力價可利用此項技術中熟知或本文中所述之任一技術(例如，血球凝集檢定、溶菌斑檢定、卵感染劑量(EID50)、組織培養感染劑量(TCID50)等)來測定且病毒可在本文中所述或此項技術中熟知之條件下繁殖(例如，在CEF細胞、MDCK細胞(例如，在37℃下，在5% CO2 增濕恆溫箱中，在MEM、10% v/v胎牛血清(FCS)、1%青黴素/鏈黴素中)或受精雞卵(例如，在37℃及55%之相對濕度下在穩定恆溫箱中)中繁殖)。或者，病毒可在生長於不含血清或血清降低(例如，TPCK胰蛋白酶)之培養基中的細胞(例如，CEF細胞、MDCK細胞等)中繁殖。
在另一實施例中，根據本發明所使用之減毒流感病毒(親代病毒)包括基因組，其包括：(i)在流感骨架病毒之HA基因中之突變，其減弱或消除細胞蛋白酶將蛋白質裂解成其活性形式之能力，及(ii)在NS1基因中之突變，該突變造成病毒拮抗細胞干擾素反應之能力的削弱。在另一實施例中，本發明之減毒流感病毒包括一包含在流感骨架病毒之HA基因及NS1基因中突變之基因組，當在相同條件下繁殖時，如感染後大致2至10天、3至7天、3至5天或2、3、4、5、6、7、8、9、10天所測定，在介於0.0005與0.001之間、0.001與0.01之間、0.01與0.1之間或0.1與1之間的病毒感染劑量(MOI)下，或在0.0005、0.0007、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0之MOI下，該突變允許減毒病毒生長至比細胞(例如，人類、小鼠、大鼠、豬、狗、馬或禽類來源之細胞(例如，HEp－2、A549、293T、Madin－Darby狗腎細胞(MDCK)或雞胚纖維母細胞(CEF)))中之野生型流感病毒低大致1至大致100倍之間、大致5至大致80倍之間、大致20至大致80倍之間，或大致40至大致80倍之間、大致1至大致10倍之間、大致1至大致5倍之間、大致1至大致4倍之間、大致1至大致3倍之間、大致1至大致2倍之間，或大致1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍的力價。
本發明提供嵌合減毒流感病毒，其包括至少一種具有不同於流感病毒之感染因子之胞外域(ED)及基本流感病毒糖蛋白之細胞質(CT)及跨膜(TM)域或跨膜域的融合蛋白質，其中至少一種融合蛋白質功能性地置換至少一種基本流感病毒糖蛋白。換言之，減毒流感病毒係用作"骨架"，其經工程化以表現至少一種替代基本流感病毒糖蛋白之融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中。包含對應於由融合蛋白質來功能性地置換之基本流感病毒糖蛋白的流感病毒糖蛋白之TM及CT域或TM域允許融合蛋白質併入減毒流感病毒之病毒粒子中。融合蛋白質之TM及CT域或TM域可對應於或得自允許融合蛋白質併入減毒流感病毒骨架之病毒粒子中的任一流感病毒。
在某些實施例中，融合蛋白質之TM及CT域或TM域對應於不同於骨架減毒流感病毒之流感病毒之類型、亞型或病毒株的TM及CT域或TM域。在其他實施例中，融合蛋白質之TM及CT域或TM域對應於不同於骨架減毒流感病毒之流感病毒種之TM及CT域或TM域。在較佳實施例中，融合蛋白質之TM及CT域或TM域對應於減毒流感病毒骨架之TM及CT域或TM域。
在某些實施例中，融合蛋白質之TM及CT域對應於流感病毒之HA蛋白或NA蛋白之TM及CT域。因為HA或NA之CT域對將融合蛋白質併入流感病毒病毒粒子中而言可為不必要的，所以在一些實施例中，融合蛋白質經工程化以僅含有HA或NA之TM域。
流感病毒HA及NA蛋白之TM及CT域在結構上係相異的，因為該等域係位於HA蛋白之C－末端及NA蛋白之N－末端。除表面糖蛋白之每個種類中之兩種域的不同定向外，HA結構域及CT結構域還可包括視其在多肽鏈中之相對位置而定的功能性上之未知差異。因此，當設計經工程化至減毒流感病毒中之融合蛋白質時，待融合至流感病毒糖蛋白之TM及CT域或TM域的感染因子之胞外域之定向將指導TM及CT域或TM域之選擇。
為維持病毒能力，在表面糖蛋白經置換之處，其在嵌合病毒中之功能必須由融合蛋白質來供應。在本發明之一實施例中，嵌合減毒流感病毒包括顯示神經胺酸酶活性之融合蛋白質。在本發明之另一實施例中，嵌合減毒流感病毒包括顯示受體結合活性之融合蛋白質。在本發明之另一實施例中，嵌合減毒病毒包括兩種融合蛋白質，其一者顯示神經胺酸酶活性且其另一者顯示受體結合活性。在一特定實施例中，嵌合減毒流感病毒包括含有新城病病毒(NDV)之HN蛋白之胞外域及流感A/WSN/33之NA蛋白之TM及CT域的表面蛋白質，該HN胞外域顯示神經胺酸酶活性。在其他實施例中，嵌合減毒流感病毒包括含有異源流感亞型或病毒株之HA蛋白之胞外域(例如，H7 HA之胞外域或H9 HA之胞外域)的融合蛋白質。
在此部分5.1.2中所述之融合蛋白質之胞外域可對應於或得自感染因子(包含，病毒性感染因子、細菌性感染因子及寄生性感染因子)之任一糖蛋白。感染因子糖蛋白之非限制性實例係提供於下文之部分5.3中。
在某些實施例中，融合蛋白質包括跨膜域加上1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個基本流感病毒糖蛋白之胞外域之直接相鄰殘基。在另一特定實施例中，融合蛋白質包括流感病毒NA蛋白之細胞質域及跨膜域，1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個直接相鄰於流感病毒NA蛋白之跨膜域的流感病毒NA蛋白之胞外域之殘基及不同於流感病毒之可功能性地置換NA蛋白之活性的感染因子之胞外域。
本發明涵蓋編碼在此部分5.1.2中所述之融合蛋白質之核苷酸序列(亦即，重組區段)。在較佳實施例中，包括編碼在部分5.1.2中所述之融合蛋白質之核酸的重組區段包括適當複製、轉錄及包裝vRNA所需之3'及5'併入信號(Fujii等人，2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：2002－2007；Zheng等人，1996,Virology 217：242－251，兩者皆以引用方式全部併入本文中)。在一較佳實施例中，本發明之重組區段因此使用相同病毒類型或病毒株中之病毒之區段的3'及5'非編碼及/或非轉譯序列作為骨架減毒流感病毒。在特定實施例，重組區段包括編碼在部分5.1.2中所述之融合蛋白質之核酸，該等重組區段包括流感病毒NA vRNA之3'非編碼區，對應於NA蛋白之CT及TM域之NA編碼區，1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個直接相鄰於流感病毒NA蛋白之跨膜域的流感病毒NA蛋白之胞外域之殘基，NA蛋白閱讀框架之未轉譯區及NA vRNA之5'非編碼區。
作為置換減毒流感病毒之NA或HA蛋白質之替代者，"反向遺傳"及雙譯基因技術可用以產生包括不同於流感病毒或疾病抗原之感染因子之胞外域及流感病毒之TM及/或CT域的嵌合流感病毒。參見，例如，美國專利第6,887,699號、美國專利第6,001,634號、美國專利第5,854,037號及美國專利第5,820,871號，其各者在此以引用之方式全部併入。諸如疾病抗原及得自可根據本發明之方法來使用之感染因子的抗原(例如，與疾病或病毒蛋白質相關之抗原)之異源分子之非限制性實例係提供於下文之部分5.3中。
5.1.3包括新城病病毒之HN蛋白之胞外域的嵌合禽流感病毒 本發明涵蓋工程化禽流感病毒以便包括新城病病毒之HN蛋白之胞外域的融合蛋白質由基因組來編碼且當受表現時，其併入病毒粒子中。可經工程化以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入禽流感病毒粒子中之任一禽流感病毒類型或病毒株可根據本發明來選擇及使用，其包含但不限於天然產生之病毒株、變異體或突變體、經誘變處理之病毒、重配病毒及/或經遺傳工程化之病毒。禽流感病毒之非限制性實例包含流感A亞型H5N1、H6N2、H7N3、H9N2或H10N7。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括具有新城病病毒(NDV)HN蛋白之胞外域(ED)及流感病毒NA蛋白之細胞質(CT)域及跨膜(TM)域或跨膜域的融合蛋白質，其中融合蛋白質功能性地置換禽流感病毒NA蛋白。換言之，禽流感病毒係用作"骨架"，其經工程化以表現替代禽流感病毒NA蛋白之融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中。在融合蛋白質中包含流感病毒NA蛋白之TM及CT域或TM域允許融合蛋白質併入禽流感病毒之病毒粒子中。融合蛋白質之TM及CT域或TM域可對應於或得自允許融合蛋白質併入禽流感病毒骨架之病毒粒子中之任一流感病毒。
根據本發明使用之TM及CT域之編碼序列可得自或來源於自任一流感病毒株或亞型之任一NA蛋白之公開序列(例如，GenBank寄存項目AY651447，來自病毒株A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)；GenBank寄存項目AY96877，來自病毒株A/火雞/Canada/63(H6N2)；GenBank寄存項目AY706954，來自病毒株A/鴨/Hainan/4/2004(H6N2)；GenBank寄存項目AY646080，來自病毒株A/雞/British Columbia/GSC_human_B/04(H7N3)；或GenBank寄存項目DQ064434，來自病毒株A/雞/Beijing/8/98(H9N2))。在某些實施例中，融合蛋白質之TM及CT域或TM域對應於不同於骨架禽流感病毒之禽流感病毒之類型或病毒株的TM及CT域或TM域。在其他實施例中，融合蛋白質之TM及CT域或TM域對應於不同於禽流感病毒之流感病毒之TM及CT域或TM域。在較佳實施例中，融合蛋白質之TM及CT域或TM域對應於禽流感病毒骨架之TM及CT域或TM域。在一特定實施例中，融合蛋白質之TM及CT域對應於流感A/WSN/33之NA蛋白之TM及CT域。
在某些實施例中，融合蛋白質包括流感病毒NA蛋白之跨膜域，1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個流感病毒NA蛋白之胞外域之直接相鄰殘基及NDV HN蛋白之胞外域。在另一特定實施例中，融合蛋白質包括流感病毒NA蛋白之細胞質域及跨膜域，1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個直接相鄰於流感病毒NA蛋白之跨膜域的流感病毒NA蛋白之胞外域之殘基及NDV HN蛋白之胞外域。
作為置換禽流感病毒之NA蛋白之替代者，"反向遺傳"及雙譯基因技術可用以產生包括NDV HN蛋白之胞外域及流感病毒之TM及/或CT域的嵌合禽流感病毒。參見，例如，美國專利第6,887,699號、美國專利第6,001,634號、美國專利第5,854,037號及美國專利第5,820,871號，其各者在此以引用之方式全部併入。
本發明涵蓋編碼在此部分5.1.3中所述之融合蛋白質之核苷酸序列(亦即，重組區段)。在較佳實施例中，包括編碼在部分5.1.3中所述之融合蛋白質之核酸的重組區段包括適當複製、轉錄及包裝vRNA所需之3'及5'併入信號(Fujii等人，2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：2002－2007；Zheng等人，1996,Virology 217：242－251，兩者皆以引用方式全部併入本文中)。在一較佳實施例中，本發明之重組區段因此使用相同病毒類型或病毒株中之病毒之區段的3'及5'非編碼及/或非轉譯序列作為骨架禽流感病毒。在特定實施例，重組區段包括編碼在部分5.1.3中所述之融合蛋白質的核酸，該等重組區段包括流感病毒NA vRNA之3'非編碼區，對應於NA蛋白之CT域及TM域之NA編碼區，1至15個、1至10個、1至5個、1至3個、2個或1個直接相鄰於流感病毒NA蛋白之跨膜域的流感病毒NA蛋白之胞外域之殘基，NA蛋白閱讀框架之未轉譯區及NA vRNA之5'非編碼區。在另一特定實施例中，重組區段包括3'至5'順序、WSN NA vRNA之3'非編碼區(19個核苷酸)、編碼NA編碼區之胺基酸殘基1－36之核苷酸(108個核苷酸)、編碼NDV B1 HN蛋白之胺基酸殘基51－568之核苷酸、兩個連續終止密碼子、WSN NA未轉譯閱讀框架之157個核苷酸、及WSN vRNA之5'非編碼區(28個核苷酸)。參見圖1。
置換骨架流感病毒之NA蛋白或將重組區段引入病毒基因組中可使所得嵌合病毒減毒，亦即，嵌合病毒將顯示相對於野生型之削弱的複製。在本發明之某些實施例中，需要嵌合病毒之減毒以便嵌合病毒至少部分地保留感染性且可在活體內複製，但僅產生造成無症狀水平之非病原性感染之低力價。該等減毒嵌合病毒尤其適於本發明之實施例，在該等實施例中向受檢者投與病毒以充當例如活疫苗之免疫原。病毒可藉由此項技術中已知及/或本文中所例證之任一方法來減毒，例如將病毒工程化以包括在NS1基因中之突變或以包括在HA蛋白質之裂解位點前的多鹼基胺基酸序列之修飾(參見美國專利第6,468,544號；美國專利第6,669,943號；Li等人，1999,J.Infect.Dis.179：1132－1138，其各者在此以引用之方式全部併入)。
在一實施例中，本發明之減毒嵌合禽流感病毒包括包含在禽流感骨架病毒之NS1基因中之突變的基因組，已知其在其他流感病毒中減弱NS1基因產物拮抗細胞干擾素反應之能力。在另一實施例中，本發明之減毒嵌合禽流感病毒包括包含在禽流感骨架病毒之HA基因中之突變的基因組，已知其在其他流感病毒中減弱或消除細胞蛋白酶將蛋白質裂解成其活性形式之能力且進而降低或消除經HA誘發之融合及感染性。在又一實施例中，本發明之減毒嵌合禽流感病毒包括包含在禽流感骨架病毒之HA基因及NS1基因中之突變的基因組，已知其在其他流感病毒中單獨地或當經組合時降低或減少病毒活性。減毒嵌合及野生型禽流感病毒之力價可利用此項技術中熟知或本文中所述之任一技術(例如，血球凝集檢定、溶菌斑檢定、卵感染劑量(EID50)、組織培養感染劑量(TCID50)等)來測定且病毒可在本文中所述或此項技術中熟知之條件下繁殖(例如，在CEF細胞、MDCK細胞(例如，在37℃下，在5% CO2 增濕恆溫箱中，在MEM、10% v/v胎牛血清(FCS)、1%盤尼西林/鏈黴素中)或受精雞卵(例如，在37℃及55%相對濕度下，在穩定恆溫箱中)中繁殖)。或者，病毒可在生長於不含血清或血清降低(例如，TPCK胰蛋白酶)之培養基中的細胞(例如，CEF細胞、MDCK細胞等)中繁殖。
5.2嵌合新城病病毒
本發明涵蓋工程化新城病病毒("NSV")以便至少一種融合蛋白質由基因組來編碼且當受表現時，其併入病毒粒子中。可經工程化以表現至少一種融合蛋白質且將該融合蛋白質併入NDV病毒粒子中之任一NDV類型或病毒株可根據本發明來選擇及使用，其包含但不限於天然產生之病毒株、變異體或突變體、經誘變處理之病毒、重配病毒及/或經遺傳工程化之病毒。在一特定實施例中，NDV為天然產生之病毒。在另一特定實施例中，NDV為經遺傳工程化之病毒。舉例而言，如本文中所述，根據本發明之方法可使用重組NDV、rNDV/F2aa及rNDV/F3aa之突變株，其中F蛋白之裂解位點係由含有一或兩個額外精胺酸之一者來置換，使突變裂解位點由弗林科(furin family)之廣泛表現蛋白酶來活化。可根據本發明之方法來使用之NDV之非限制性實例包含B1、LaSota、YG97、MET95及F48E9。在一特定實施例中，本發明之嵌合NDV或rNDV包括含有流感HA蛋白之胞外域的融合蛋白質；在根據該實施例之一特定實例中，流感HA蛋白為來自流感H7之HA蛋白。
本發明提供嵌合NDV，其包括至少一種具有不同於NDV蛋白質之感染因子之蛋白質的胞外域(ED)及基本NDV糖蛋白之細胞質(CT)域及跨膜(TM)域的融合蛋白質。本發明亦提供嵌合NDV，其包括至少一種具有不同於NDV糖蛋白之感染因子的蛋白質之ED及TM域及基本NDV糖蛋白之CT的融合蛋白質。本發明進一步提供嵌合NDV，其包括具有不同於NDV糖蛋白之感染因子之蛋白質的ED及CT域及基本NDV糖蛋白之TM域。換言之，NDV病毒係用作"骨架"，其經工程化以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中。在融合蛋白質中包含基本NDV糖蛋白之TM及/或CT域允許融合蛋白質併入NDV之病毒粒子中。融合蛋白質之TM及/或CT域可對應於或得自允許融合蛋白質併入NDV骨架之病毒粒子中之任一NDV。
在某些實施例中，融合蛋白質之TM及/或CT域對應於不同於骨架NDV之NDV之類型或病毒株的TM及/或CT域。在較佳實施例中，融合蛋白質之TM及/或CT域對應於NDV骨架之TM及/或CT域。
NDV病毒粒子包括兩種主要表面糖蛋白：融合蛋白質(F)及血球凝集素－神經胺酸酶(HN)，兩者皆包括細胞質域、跨膜域及胞外域。因此，在某些實施例中，融合蛋白質之TM及/或CT域對應於NDV之F蛋白或HN蛋白之TM及/或CT域。
NDVF蛋白及HN蛋白之TM及CT域在結構上係相異的，因為該等域係位於F蛋白之C－末端及HN蛋白之N－末端。因此，當設計經工程化至NDV中之融合蛋白質時，待融合至NDV糖蛋白之TM及/或CT域的感染因子之胞外域之定向將指導TM及/或CT域之選擇。
在某些實施例中，NDV表面糖蛋白(亦即，HN或F蛋白)係由供應NDV糖蛋白之所需功能的融合蛋白質來置換。根據該等實施例，融合蛋白質之胞外域必須經選擇以便其將供應經置換之NDV糖蛋白之所需功能。在其他實施例中，表現融合蛋白質且將其併入除原生NDV表面糖蛋白之外的NDV之病毒粒子中。
倘若在此部分5.2中所述之融合蛋白質不需要置換必需病毒糖蛋白之功能，則融合蛋白質之胞外域可對應於或得自包含但不限於任一感染因子抗原(包含，病毒性感染因子抗原、細菌性感染因子抗原及寄生性感染因子抗原)及任一疾病抗原的任一異源分子。感染因子抗原及/或疾病抗原之非限制性實例係提供於下文之部分5.3中。
本發明涵蓋編碼在此部分5.2中所述之融合蛋白質之核苷酸序列。在特定實施例中，核苷酸序列包括核酸，其編碼Kozak序列，接著編碼NDV之F蛋白之基因末端、順反子間核苷酸(T)及基因起始序列，接著編碼H7N2之HA蛋白之5'未轉譯區及ORF。
在較佳實施例中，根據本發明來使用之NDV之病毒株為病毒之弱毒病毒株，亦即，彼等通常在禽類中顯示低毒性或無症狀感染之病毒株，例如，病毒株B1、病毒株LaSota或病毒株Met95。本發明亦涵蓋NDV之高毒性病毒株，例如，YG97或F48E9或已使用此項技術中已知或本文中所例證之方法藉由遺傳重組來修飾之NDV病毒株的用途。在一特定實施例中，本發明涵蓋NDV之用途，其中NDV F蛋白已在裂解位點經遺傳修飾以增加基因融合活性。在根據本發明之一特定實例中，經修飾之F蛋白包括在F裂解位點處之兩個至三個胺基酸突變。置換骨架病毒之必需表面蛋白質或將編碼融合蛋白質之核苷酸序列引入病毒基因組中可減毒或進一步減毒所得嵌合病毒，亦即，嵌合病毒將顯示相對於野生型之削弱的複製。在本發明之某些實施例中，需要嵌合病毒之減毒或進一步減毒以便嵌合病毒至少部分地保留感染性且可在活體內複製，但僅產生造成無症狀水平之非病原性感染之低力價。該等減毒嵌合病毒尤其適用於本發明之實施例，在該等實施例中向受檢者投與病毒以充當例如活疫苗之免疫原。病毒可藉由此項技術中已知之任一方法來減毒。
5.3可經工程化至本發明之嵌合病毒中之抗原
根據本發明，任一異源分子可經工程化至病毒骨架中以引出對該分子之免疫反應。在一特定實施例中，能引出免疫反應之任一感染性病原體或與任一疾病相關之任一抗原可經工程化至NDV及/或流感病毒骨架中。在一特定實施例中，抗原為糖蛋白。在某些較佳實施例中，抗原能夠功能性地置換流感病毒及/或NDV之基本糖蛋白。在特定實施例中，抗原顯示神經胺酸酶或血球凝集素(例如，受體結合/基因融合)活性。在表現抗原之病毒骨架之選擇中，考慮編碼抗原之核苷酸之定向。舉例而言，在抗原經由其胺基末端天然地錨定之處，用於工程化融合蛋白質之TM及CT域或TM域將對應於骨架病毒或相關病毒之必需病毒蛋白質(例如，流感之N蛋白或NDV之HN蛋白)之TM及CT域或TM域，該病毒亦經由其胺基末端來天然地錨定。
在一特定實施例中，病毒抗原經工程化至NDV或流感病毒骨架中。病毒抗原之非限制實例包含來自以下各物之抗原：腺病毒科(adenoviridae)(例如，巨大腺病毒(mastadenovirus)及禽類腺病毒(aviadenovirus))、疱疹病毒科(例如，疱疹單純型病毒1、疱疹單純型病毒2、疱疹單純型病毒5、疱疹單純型病毒6、愛波斯坦－巴爾病毒(Epstein－Barr virus)、HHV6－HHV8及巨細胞病毒(cytomegalovirus))、光滑噬菌體科(leviviridae)(例如，光滑噬菌體屬(levivirus)、腸內細菌(enterobacteria)相MS2、allolevirus)、痘病毒科(poxviridae)(例如、脊椎動物痘病毒亞科(chordopoxvirinae)、副痘病毒屬(parapoxvirus)、禽痘病毒屬(avipoxvirus)、山羊痘病毒屬(capripoxvirus)、野兔痘病毒屬(leporiipoxvirus)、豬痘病毒屬(suipoxvirus)、軟疣痘病毒屬(molluscipoxvirus)及昆蟲痘病毒亞科(entomopoxvirinae))、乳多空病毒科(papovaviridae)(例如，多瘤病毒屬(polyomavirus)及乳頭狀瘤病毒屬(papillomavirus))、副黏液病毒科(例如，副黏病毒、副流感病毒1、麻疹病毒屬(mobillivirus)(例如，麻疹病毒)、腮腺炎病毒屬(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒)、肺病毒亞科(pneumonovirinae)(例如，肺病毒(pneumovirus)、人類呼吸道合胞病毒)、人類呼吸道合胞病毒及間質肺病毒(metapneumovirus)(例如，禽類肺病毒及人類間質肺病毒))、小核醣核酸病毒屬(picornaviridae)(例如，腸病毒、鼻病毒、肝病毒(例如，人類肝炎A病毒)、心病毒及口蹄疫病毒(apthovirus))、呼腸孤病毒科(reoviridae)(例如，正理奧病毒(orthoreovirus)、環狀病毒(orbivirus)、輪狀病毒(rotavirus)、質型多角體病毒屬(cypovirus)、甘蔗斐濟病毐(fijivirus)、水稻萎縮病毒(phytoreovirus)及水稻病毒屬(oryzavirus))、反轉錄病毒科(例如，哺乳動物B型反轉錄病毒、哺乳動物C型反轉錄病毒、禽類C型反轉錄病毒、D型反轉錄病毒群、BLV－HTLV反轉錄病毒、慢病毒(lentivirus)(例如，人類免疫缺乏病毒1及人類免疫缺乏病毒2(例如，HIV gp160)、泡沫反轉錄病毒屬(spumavirus))、黃病毒(flaviviridae)(例如，肝炎C病毒、登革熱病毒(dengue virus)、西尼羅病毒(West Nile virus))、肝炎病毒科(hepadnaviridae)(例如，肝炎B病毒)、披衣病毒科(togaviridae)(例如，甲病毒屬(alphavirus)(例如，辛德畢斯病毒(sindbis virus))及風疹病毒屬(rubivirus)(例如，風疹病毒(rubella virus)))、彈狀病毒科(rhabdoviridae)(例如，水泡病毒屬(vesiculovirus)、狂犬病毒屬(lyssavirus)、短暫熱病毒屬(ephemerovirus)、質型彈狀病毒屬(cytorhabdovirus)及necleorhabdovirus)、沙狀病毒科(arenaviridae)(例如，沙狀病毒(arenavirus)、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、Ippy病毒及拉沙病毒(lassa virus))及冠狀病毒科(例如，冠狀病毒及托羅病毒(torovirus))。在一特定實施例中，病毒抗原為HIV gp120、HIV nef、RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白、流感病毒神經胺酸酶、流感病毒血球凝集素、HTLV tax、疱疹單純型病毒糖蛋白(例如，gB、gC、gD及gE)或肝炎B表面抗原、肝炎C病毒E蛋白或冠狀病毒尖釘蛋白。在某些實施例中，病毒抗原不為gp 41。在某些實施例中，病毒抗原係得自副黏病毒。在其他替代實施例中，病毒抗原非得自副黏病毒。在某些實施例中，病毒抗原係得自人類副流感病毒1型、人類副流感病毒3型、RSV或得自仙台病毒。在其他替代實施例中，病毒抗原非得自人類副流感病毒1型、副流感病毒3型、RSV或不得自仙台病毒。在特定實施例中，病毒骨架為流感病毒且經工程化至流感病毒骨架中之抗原不為流感抗原。在其他特定實施例中，病毒骨架為NDV且工程化至NDV骨架中之抗原不為NDV抗原。
在另一實施例中，細菌性抗原(例如，細菌鞘蛋白或與該細菌相關之保護性抗原)係經工程化至NDV或流感病毒骨架中。細菌性抗原之非限制性實例包含以下各物之細菌之抗原：水生螺旋菌(Aquaspirillum)科、固氮螺旋菌(Azospirillum)科、固氮菌(Azotobacteraceae)科、擬桿菌(Bacteroidaceae)科、巴東體(Bartonella)種、噬食弧菌(Bdellovibrio)科、曲桿菌(Campylobacter)種、披衣菌(Chlamydia)種(例如，肺炎披衣菌(Chlamydia pneumoniae))、梭菌屬(clostridium)、腸內菌(Enterobacteriaceae)科(例如，檸檬酸桿菌(Citrobacter)種、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、產氣桿菌(Enterobacter aerogenes)、伊文氏桿菌(Erwinia)種、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、哈佛尼亞菌(Hafnia)種、克雷伯氏菌(Klebsiella)種、莫根氏桿菌(Morganella) 種、普通變型桿菌(Proteus vulgaris)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙門氏菌(Salmonella)種、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)及弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri))、Gardinella科、流感桿菌(Haemophilus influenzae)、鹽桿菌(Halobacteriaceae)科、螺旋桿菌(Helicobacter)科、Legionallaceae科、李氏菌(Listeria)種、甲基單孢菌(Methylococcaceae)科、分枝桿菌科(mycobacteria)(例如，結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))、奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)科、海洋螺菌(Oceanospirillum)科、巴斯德菌(Pasteurellaceae)科、肺炎球菌(Pneumococcus)種、假單胞菌(Pseudomonas)種、根瘤菌(Rhizobiaceae)科、螺旋菌(Spirillum)科、Spirosomaceae科、葡萄球菌(Staphylococcus)(例如，抗二甲氧苯青黴素金黃素葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus)及釀膿葡萄球菌(Staphylococcus pyrogenes))、鏈球菌(Streptococcus)(例如，腸炎鏈球菌(Streptococcus enteritidis)、膜鏈球菌(Streptococcus fasciae)及肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae))、Vampirovibr Helicobacter科、耶爾森氏菌(Yersinia)科、炭疽桿菌(Bacillus antracis)及黏球菌(Vampirovibrio)科。
在其他實施例中，與寄生蟲(例如，原蟲(protozoan))相關之保護性抗原係經工程化至NDV或流感病毒骨架中。與寄生蟲相關之任一抗原或寄生蟲(例如，原蟲)之保護性抗原可根據本發明之方法來使用。寄生蟲抗原之非限制性實 例包含來自諸如阿米巴原蟲(amoeba)、瘧原蟲(malarial parasite)、瘧原蟲(Plasmodium)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)之寄生蟲的抗原。
在另一實施例中，真菌性抗原係經工程化至NDV或流感病毒骨架中。真菌性抗原之非限制性實例包含來自以下各物之真菌的抗原：棘子鬚黴菌(Absidia)種(例如，傘枝犁頭黴(Absidia corymbifera)及分棘狀棘子鬚黴菌(Absidia ramosa))、麴菌(Aspergillus)種(例如，黃麴菌(Aspergillus flavus)、薰煙色麴菌(Aspergillus fumigatus)、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)、黑色麴菌(Aspergillus niger)及土黴菌(Aspergillus terreus))、蛙糞黴菌(Basidiobolus ranarum)、皮炎芽生黴菌(Blastomyces dermatitidis)、念珠菌(Candida)種(例如，白色念珠菌(Candida albicans)、禿發念珠菌(Candida glabrata)、克爾念珠菌(Candida kerr)、克魯塞念珠菌(Candida krusei)、副口炎念珠菌(Candida parapsilosis)、偽熱帶念珠菌(Candida pseudotropicalis)、Candida quillermondii、皺褶念珠菌(Candida rugosa)、類星形念珠菌(Candida stellatoidea)及熱帶念珠菌(Candida tropicalis))、粗球黴菌(Coccidioides immitis)、耳黴(Conidiobolus)種、新型隱球菌(Cryptococcus neoforms)、小克銀漢黴(Cunninghamella)種、皮癬菌(dermatophytes)、莢膜組織漿菌(Histoplasma capsulatum)、石膏樣小芽胞菌(Microsporum gypseum)、渺小白黴(Mucor pusillus)、巴西副球黴菌(Paracoccidioides brasiliensis)、假性黴 (Pseudallescheria boydii)、西氏鼻芽孢菌(Rhinosporidium seeberi)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、根黴菌(Rhizopus)種(例如，鬚根黴菌(Rhizopus arrhizus)、米根黴(Rhizopus oryzae)及小芽孢酒麴菌(Rhizopus microsporus))、植酵母(Saccharomyces)種、申克氏孢子絲菌(Sporothrix schenckii)、接合菌類(zygomycetes)及諸如接合菌(Zygomycetes)、子囊菌(Ascomycetes)、擔子菌(Basidiomycetes)、半知菌(Deuteromycetes)及卵菌綱(Oomycetes)之種類。
在另一實施例中，腫瘤相關抗原係經工程化至NDV或流感病毒骨架中。此項技術中已知之任一腫瘤相關抗原可根據本發明之方法來使用。腫瘤相關抗原之非限制性實例包含MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙醯胺基葡萄糖基轉移酶-V、p-15 MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、酪胺酸酶、週期素依賴性激酶4、β-索烴素、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人類乳頭狀瘤病毒-E6、人類乳頭狀瘤病毒E7、MUC-1、卡斯蛋白酶-8、CD5、CD20、CEA、黏液素-1、Lewisx、CA-125、表皮生長因子受體、p185HER2、IL-2R、Fap-α、韌黏素、與金屬蛋白酶相關之抗原及CAMPATH-1。
5.4 本發明之嵌合病毒之建構及繁殖
本發明之嵌合病毒可使用反向遺傳技術來產生。反向遺傳技術包含製備含有負股病毒RNA之非編碼區的合成重組病毒RNA，該負股病毒RNA對藉由病毒聚合酶之識別係必不可少的且對產生成熟病毒粒子所必需之包裝信號係必不可少的。重組RNA係自重組DNA模板合成且在活體外由經純化之病毒聚合酶複合物來重建以形成可用以轉染細胞之重組核糖核蛋白(RNP)。若在活體外或活體內轉錄合成RNA期間存在病毒聚合酶蛋白質，則達到更有效之轉染。合成重組RNP可救援成感染性病毒粒子。前述技術係描述於1992年11月24日頒予之美國專利第5,166,057號中；1998年12月29日頒予之美國專利第5,854,037號中；1996年2月20日公開之歐洲專利公開案EP 0702085A1中；美國專利申請案序號第09/152,845中；1997年4月3日公開之國際專利公開案PCT WO 97/12032中；1996年11月7日公開之WO 96/34625；歐洲專利公開案EP A780475中；1999年1月21日公開之WO 99/02657；1998年11月26日公開之WO 98/53078；1998年1月22日公開之WO 98/02530；1999年4月1日公開之WO 99/15672；1998年4月2日公開之WO 98/13501；1997年2月20日公開之WO 97/06270；1997年6月25日公開之EPO 780 475A1，其各者以引用之方式全部併入本文中。
無輔助質體技術亦可用以工程化本發明之嵌合病毒。簡言之，關於流感病毒，病毒區段之全長cDNA使用PCR以包含獨特限制性位點之引子來放大，其容許PCR產物插入質體載體中(Flandorfer等人，2003,J.Virol.77：9116－9123；Nakaya等人，2001,J.Virol.75：11868－11873；兩者皆以引用之方式全部併入本文中)。質體載體經設計以將PCR產物定位於截短人類RNA聚合酶I啟動子與肝炎δ病毒核糖核酸酶序列之間以便精確負性(vRNA義)轉錄物自聚合酶I啟動子產生。包括各病毒區段之分離質體載體以及包括必需病毒蛋白質之表現載體皆轉染至細胞中，導致產生重組病毒粒子。無輔助質體技術之詳細描述係參見，例如國際公開案第WO 01/04333號；美國專利第6,649,372號；Fodor等人，1999,J.Virol.73：9679－9682；Hoffmann等人，2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6108－6113；及Neumann等人，1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：9345－9350,其皆以引用之方式全部併入本文中。類似地，關於NDV之單一區段基因組，建構Hitchner B1病毒株之完整cDNA、將其插入質體載體中且將其工程化以在P基因與M基因之間含有獨特限制性位點。根據本發明來工程化之融合蛋白質可隨後在該獨特限制性位點處插入病毒基因組中。單一區段係定位於T7啟動子與肝炎δ病毒核糖核酸酶之間以自T7聚合酶產生精確負性轉錄物。將質體載體及包括必需病毒蛋白質之表現載體轉染至細胞中，導致產生重組病毒粒子(參見，Swayne等人，2003,Avian Dis.47：1047－1050及Swayne等人，2001,J.Virol.11868－11873，其各者以引用之方式全部併入)。
本發明之嵌合流感病毒可經工程化以含有為雙譯基因之RNA區段。雙譯基因技術容許經由使用IRES序列而將多個蛋白質之編碼序列工程化至單一mRNA中。IRES序列指導核糖核酸酶對RNA分子之內部募集且容許以帽獨立方式之下游轉譯。簡言之，將一個蛋白質之編碼區插入第二個蛋白質之ORF中。插入係由IRES及對適當表現及/或功能而言必要之任一未轉譯信號序列來側接。插入必須不破壞第二個蛋白質之開放閱讀框架、多聚腺嘌呤或轉錄啟動子(參見，例如，Garca－Sastre等人，1994,J.Virol.68：6254－6261及Garca－Sastre等人，1994 Dev.Biol.Stand.82：237－246)，其各者在此以引用之方式全部併入。
5.4.1嵌合病毒之繁殖 本發明之嵌合流感病毒可在容許病毒生長至允許使用本文所述之嵌合病毒之力價的任一受質中繁殖。在一實施例中，受質容許嵌合病毒生長至相當於對相應野生型病毒所測定之彼等力價的力價。在一特定實施例中，本發明之減毒嵌合流感病毒係在缺IFN之受質中繁殖。
本發明之嵌合病毒可在易受由病毒所感染之細胞(例如，禽類細胞、雞細胞等)、受精卵或動物(例如、鳥)中生長。該等方法為熟習此項技術者所熟知。在一特定實施例中，用以繁殖具有降低干擾素拮抗劑活性之減毒流感病毒之細胞為缺IFN的。在一實施例中，本發明之嵌合禽類病毒係在雞細胞或受精卵中繁殖。代表性雞細胞包含但不限於雞胚胎纖維母細胞或雞胚胎腎細胞。
本發明之嵌合病毒可在例如6至14天大之受精卵中繁殖。幼年的或未成熟受精卵可用以繁殖本發明之減毒嵌合流感病毒。未成熟受精卵涵蓋小於10天大之卵的卵，例如6至9天之缺INF之卵。未成熟受精卵亦涵蓋至多，但小於10天大之人工模擬未成熟卵之卵，其係由於生長條件(例如，培育溫度改變；用藥物處理)之改變；或造成卵延遲發育以便與10至12天大之卵相比IFN系統不完全發育之任一其他改變所致。本發明之嵌合病毒可在受精卵之不同位置，例如，尿囊腔中繁殖。對病毒，尤其為具有降低干擾素拮抗劑活性之減毒流感病毒之生長及繁殖的詳細討論係參見(例如)美國專利第6,852,522號及美國專利第6,852,522號，兩者在此以引用之方式全部併入。
對病毒分離而言，嵌合病毒係通常藉由(例如)梯度離心及管柱層析法之熟知淨化程序自細胞培養中移除且自細胞組分分離，且可另外按需要使用(例如)溶菌斑檢定之熟習此項技術者所熟知之程序來純化。
5.5嵌合病毒之用途
本發明之嵌合病毒可用於受檢者之主動免疫中。在一態樣中，本發明之嵌合病毒可用以預防、控制及/或治療一或多種疾病。在一特定態樣中，本發明之嵌合病毒可用以預防、控制及/或治療由兩種感染因子引起之感染。參見部分5.5.1對免疫原性調配物及彼等調配物在受檢者中用於誘發免疫反應之用途的描述。本發明之嵌合病毒亦可用以產生可用於診斷性免疫檢定、被動免疫療法及抗獨特型抗體之產生的抗體。舉例而言，可向受檢者(例如，小鼠、大鼠、豬、馬、驢、鳥或人類)投與包括具有不同於流感病毒之感染因子之胞外域的融合蛋白質之嵌合流感病毒以產生針對流感骨架及感染因子之抗體，隨後可分離該等抗體且將其用於診斷性檢定、被動免疫療法反抗獨特型抗體之產生中。所產生之抗體可藉由此項技術中已知之標準技術(例如，免疫親和層析法、離心、沉澱等)來分離且可用於診斷性免疫檢定、被動免疫療法及抗獨特型抗體之產生中。所分離之抗體在用於被動免疫療法之前可經修飾，例如，抗體可經嵌合或人化。對產生嵌合抗體及人化抗體之論述係參見(例如)美國專利第4,444,887號及第4,716,111號；及國際公開案第WO 98/46645號、第WO 98/50433號、第WO 98/24893號、第WO 98/16654號、第WO 96/34096、第WO 96/33735號及第WO 91/10741號，其各者以引用之方式全部併入本文中。
對藉由嵌合病毒所產生的用於被動免疫法之抗體而言，向受檢者投與之劑量通常為每公斤患者體重0.0001 mg至100 mg。較佳地，向患者投與之劑量係介於每公斤受檢者之體重0.0001 mg與20 mg之間、0.0001 mg與10 mg之間、0.0001 mg與5 mg之間、0.0001與2 mg之間、0.0001與1 mg之間、0.0001 mg與0.75 mg之間、0.0001 mg與0.5 mg之間、0.0001 mg至0.25 mg之間、0.0001至0.15 mg之間、0.0001至0.10 mg之間、0.001至0.5 mg之間、0.01至0.25 mg或0.01至0.10 mg之間。
自投與本發明之嵌合病毒之受檢者分離的抗體亦可用以監控治療及/或疾病進程。此項技術中已知之任一免疫檢定系統可用於該目的，該系統包含但不限於使用諸如以下技術之技術的競爭性及非競爭性檢定系統：放射免疫檢定、ELISA(酶聯免疫吸附檢定)、"夾心"免疫檢定、沉澱素反應、凝膠擴散沉澱素反應、免疫擴散檢定、凝集檢定、互補結合檢定、免疫放射量檢定、螢光免疫檢定、蛋白質A免疫檢定及免疫電泳檢定，略舉數例。
藉由本發明之嵌合病毒所產生之抗體亦可用於製備抗獨特型抗體。抗獨特型抗體可隨後依次用於免疫法以產生結合嵌合流感之原始抗原的抗體之亞群(Jerne,1974,Ann.Immunol.(Paris)125c：373；Jerne等人，1982,EMBO J.1：234)。
在免疫程序中，待使用之免疫原之量及免疫時程將藉由熟習此項技術之醫師來確定且將參考免疫反應及受檢者之抗體力價來投與。
5.5.1免疫原性調配物 本發明亦涵蓋本發明之嵌合病毒在(例如)疫苗調配物之免疫原性調配物中的用途。在免疫原性調配物包括嵌合流感病毒之狀況下，調配物可用於預防、控制、中和、治療及/或改善流感病毒感染及/或由另一感染因子及/或疾病引起之感染的方法中。在免疫原性調配物包括嵌合NDV之狀況下，調配物可用於預防、控制、中和、治療及/或改善NDV感染及/或由另一感染因子及/或疾病引起之感染的方法中。
免疫原性調配物可包括本發明之活嵌合病毒或失活嵌合病毒。可藉由熟習此項技術者所熟知之方法來使嵌合病毒失活。常用方法使用福馬林(formalin)且加熱以失活。參見，例如，美國專利第6,635,246號，其以引用之方式全部併入本文中。其他方法包含在美國專利第5,891,705號；第5,106,619號及第4,693,981號中所述之彼等方法，其以引用之方式全部併入本文中。
活免疫原性調配物可較佳，因為在受檢者中之增殖導致與在自然感染中之彼者相似種類及大小之長期刺激，且因此給予實質上、長期的免疫性。該活重組免疫原性調配物之產生可使用包含在細胞培養中或在受精卵(例如，雞受精卵)中繁殖嵌合病毒，接著純化之習知方法來完成。此外，嵌合病毒可誘發在活體內具有其他生物結果之穩健的IFN反應，提供對後續感染之保護。
在一較佳實施例中，本發明之免疫原性調配物包括有效量之本發明之嵌合病毒及醫藥學上可接受之載劑。術語"醫藥學上可接受的"意謂由聯邦政府或州政府之管理機構所認可的或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他用於動物，且更尤其為人類之公認藥典中。術語"載劑"係指與醫藥調配物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。生理食鹽水溶液及右旋糖及甘油水溶液亦可用作液體載劑，尤其用於可注射之溶液。適合之賦形劑包含澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麥粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。適合之醫藥載劑之實例係由E.W.Martin描述於"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。調配物應適合投藥模式。特定的調配物亦可視嵌合病毒是否為活的或失活的而定。
本發明之免疫原性調配物可投與未處理(nave)之受檢者，亦即，不患有疾病或還未且當前並未由一或兩種感染因子感染之受檢者。在一實施例中，免疫原性調配物係投與未處理之受檢者，亦即，不患有疾病或還未且當前並未由一或兩種感染因子感染，但傾向於獲得該等疾病(例如，病毒感染)之受檢者。在一實施例中，本發明之免疫原性調配物係投與不患有疾病，或還未且並未由感染因子之一者感染的受檢者，其中嵌合病毒誘發對該感染因子之免疫反應。在另一實施例中，本發明之免疫原性調配物係投與還未且並未由感染因子之兩者感染之受檢者，其中嵌合病毒誘發對該等感染因子之免疫反應。本發明之免疫原性調配物亦可投與由感染因子之一或兩者或試劑之另一類型、亞型或病毒株感染及/或已由其感染之受檢者，其中嵌合病毒誘發對該等感染因子或試劑之另一類型、亞型或病毒株之免疫反應。
若干方法可用以引入例如上文所述之疫苗調配物之免疫原性調配物，該等方法包含但不限於鼻內、氣管內、經口、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、結膜及皮下路線。在鳥類中，該等方法可進一步包含鼻後孔接種。作為非經腸投藥之替代者，本發明亦涵蓋用於農業目的之諸如經由飲用水或以噴霧方式之大量投藥路線。可較佳經由野生型病毒之天然感染路線來引入嵌合流感病毒免疫原性調配物。或者，可較佳經由自其得到融合蛋白質之試劑的天然感染路線來引入本發明之嵌合病毒。可有利地使用嵌合病毒誘發強有力的分泌及細胞免疫反應之能力。舉例而言，藉由嵌合病毒之呼吸道之感染可誘發(例如)泌尿生殖系統中之強的分泌免疫反應，且伴隨抵抗特定的引起疾病之試劑的保護。另外，在一較佳實施例中，可需要藉由任一適合之路線將本發明之醫藥調配物引入肺中。亦可使用(例如)藉由使用吸入器或噴霧器及用作噴霧之具有噴霧化藥劑之調配物的肺臟投藥。
在某些實施例中，本發明之免疫原性調配物不造成對感染的完全保護(例如，病毒感染或藉由非病毒性感染因子引起之感染)，但與未治療之受檢者相比，造成更低力價或降低數量之病原體(例如，病毒)。效益包含但不限於感染症狀之嚴重性更小及與感染相關之疾病或病狀之持續時間的減少。
在某些實施例中，本發明之免疫原性調配物係用以保護未處理之受檢者以抵抗疾病(例如，感染)。在一特定實施例中，本發明之免疫原性調配物係用以保護未處理之受檢者以抵抗由流感病毒及/或至少一種不為流感病毒之其他感染因子引起的感染及/或疾病。在其他實施例中，本發明之免疫原性調配物係用以保護未處理之受檢者以抵抗由NDV及/或至少一種其他感染因子引起之感染或疾病。該等其他感染因子之非限制性實例為乳頭狀瘤病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒(例如，HIV)、肝炎病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、NDV、巨細胞病毒、腺病毒、梭菌種(Clostridia sp. )、沙門氏菌種、葡萄球菌種、腸球菌種(Enterococcus sp. )、弧菌種(Vibrio sp. )、大腸桿菌、鏈球菌均等物、人肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae )、肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae )及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )，及沙蚤(Dermatophilus coigolensis)或諸如變形蟲(amobea)、瘧原蟲(malarial parasite)或克氏錐蟲之原蟲。
本發明之免疫原性調配物之預防及/或治療作用係部分基於達成或誘發免疫反應(例如，體液免疫反應)。在一態樣中，免疫原性調配物在受檢者或其動物模型(例如，小鼠、大鼠或狗模型)中誘發抵抗嵌合病毒之抗原的抗體之可偵測血清力價。抗體之血清力價可使用熟習此項技術者已知之技術，例如，諸如ELISA之免疫檢定來測定。在一實施例中，抗體特異性地結合至嵌合病毒之骨架的抗原上。在其他實施例中，抗體特異性地結合至至少一種融合蛋白質之抗原，亦即，與感染因子或疾病相關的所引入蛋白質之胞外域的抗原上。在一特定實施例中，藉由投與本發明之免疫原性調配物所產生之抗體為中和抗體。
在一實施例中，向受檢者或其動物模型投與本發明之嵌合病毒造成特異性地結合至嵌合病毒之骨架之抗原的抗體之約1 μg/ml、約2 μg/ml、約5 μg/ml、約6 μg/ml、約10 μg/ml、約15 μg/ml、約20 μg/ml、約25 μg/ml、約50 mg/ml、約75 mg/ml、約100 mg/ml、約125 mg/ml、約150 mg/ml、約175 mg/ml、約200 mg/ml、約225 mg/ml、約250 mg/ml、約275 mg/ml或約300 mg/ml或更大之血清力價。在其他實施例中，向受檢者或其動物模型投與本發明之嵌合病毒造成特異性結合至融合蛋白質之抗原，亦即，與感染因子或疾病相關的所引入蛋白質之胞外域的抗原之抗體的約1 μg/ml、約2 μg/ml、約5 μg/ml、約6 μg/ml、約10 μg/ml、約15 μg/ml、約20 μg/ml、約25 μg/ml、約50 mg/ml、約75 mg/ml、約100 mg/ml、約125 mg/ml、約150 mg/ml、約175 mg/ml、約200 mg/ml、約225 mg/ml、約250 mg/ml、約275 mg/ml或約300 mg/ml或更大之血清力價。較佳地，在投與第一劑量之本發明之免疫原性調配物且不投與任一其他劑量之調配物後大致20天(較佳25、30、35或40天)，達到該等抗體之約1 μg/ml、約2 μg/ml、約5 μg/ml、約6 μg/ml、約10 μg/ml、約15 μg/ml、約20 μg/ml、約25 μg/ml、約50 mg/ml、約100 mg/ml、約150 mg/ml或約300 mg/ml或更大之血清力價。免疫反應可在受檢者或動物模型中測定，隨後將該反應關聯於或外推至在例如人類之受檢者中之預測反應。
在一實施例中，本發明提供在受檢者中預防至少一種疾病(例如，流感感染及/或由不為流感之另一感染因子引起之感染)之方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量之包括本發明之嵌合流感病毒的免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之骨架之抗原或抗原決定基的抗體之約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。在另一實施例中，本發明提供在受檢者中預防至少一種疾病(例如，流感感染及/或由不為流感之另一感染因子引起之感染)之方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合流感病毒之免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原(亦即，與疾病相關的所引入蛋白質之胞外域的抗原)之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價之量。免疫反應可在受檢者中或動物模型中測定，隨後將該反應關聯於或外推至在例如人類之受檢者中之預測反應。在一實施例中，本發明提供在禽類中預防禽流感感染及/或由不為禽流感之另一感染因子引起之感染的方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之包括本發明之嵌合禽流感病毒的免疫原性調配物，該嵌合禽流感病毒包括含有異源蛋白質序列之融合蛋白質，該免疫原性調配物具有有效量之本發明之嵌合禽類病毒，其中有效量為在第一投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之抗原之抗體及/或免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價之量。在一些實施例中，向受檢者或動物模型投與之嵌合流感病毒之劑量為102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5× 104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu。
在一實施例中，本發明提供在受檢者中治療至少一種疾病(例如，流感感染及/或由不為流感之另一感染因子引起之感染)之方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量之包括本發明之嵌合流感病毒的免疫原性調配物，該嵌合病毒包括具有異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之骨架之抗原或抗原決定基的抗體之約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。在另一實施例中，本發明提供在受檢者中治療至少一種疾病(例如，流感感染及/或由不為流感之另一感染因子引起之感染)之方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合流感病毒的免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原(亦即，與疾病相關的所引入蛋白質之胞外域的抗原)之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價之量。免疫反應可在受檢者中或在動物模型中測定，隨後將該反應關聯於或外推至在例如人類之受檢者中之預測反應。在一實施例中，本發明提供在禽類中治療禽流感感染及/或由不為禽流感之另一感染因子引起之感染的方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之包括本發明之嵌合禽流感病毒的免疫原性調配物，該嵌合禽流感病毒包括含有異源蛋白質序列之融合蛋白質，該免疫原性調配物具有有效量之本發明之嵌合禽類病毒，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之抗原之抗體及/或免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價之量。在一些實施例中，向受檢者或動物模型投與之嵌合流感病毒之劑量為102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu。
在一實施例中，本發明提供在受檢者中控制及/或改善至少一種疾病(例如，流感感染及/或由不為流感之另一感染因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合流感病毒的免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之骨架之抗原或抗原決定基的抗體之約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。在另一實施例中，本發明提供在受檢者中控制及/或改善至少一種疾病(例如，流感感染及/或由不為流感之另一感染因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合流感病毒的免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原(亦即，與疾病相關的所引入蛋白質之胞外域的抗原)之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價之量。免疫反應可在受檢者中或在動物模型中測定，隨後將該反應關聯於或外推至在例如人類之受檢者中之預測反應。在一實施例中，本發明提供在禽類中控制及/或改善禽流感感染及/或由不為禽流感之另一感染因子引起之感染的方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之包括本發明之嵌合禽流感病毒的免疫原性調配物，該嵌合禽流感病毒包括含有異源蛋白質序列之融合蛋白質，該免疫原性調配物具有有效量之本發明之嵌合禽類病毒，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之抗原之抗體及/或免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價之量。在一些實施例中，向受檢者或動物模型投與之嵌合流感病毒之劑量為102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu。
在一實施例中，本發明提供在受檢者中預防至少一種疾病(例如，NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合NDV之免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之骨架之抗原或抗原決定基的抗體之約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。在另一實施例中，本發明提供在受檢者中預防至少一種疾病(例如，NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合NDV之免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原(亦即，與疾病相關的所引入蛋白質之胞外域的抗原)之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價之量。免疫反應可在受檢者中或在動物模型中測定，隨後將該反應關聯於或外推至在例如人類之受檢者中之預測反應。在一實施例中，本發明提供在禽類中預防NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染的方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之包括本發明之嵌合NDV的免疫原性調配物，該嵌合NDV包括含有異源蛋白質序列之融合蛋白質，該免疫原性調配物具有有效量之本發明之嵌合病毒，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之抗原之抗體及/或免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。在一些實施例中，向受檢者或動物模型投與之嵌合流感病毒之劑量為102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu。
在一實施例中，本發明提供在受檢者中治療至少一種疾病(例如，NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合NDV之免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之骨架之抗原或抗原決定基的抗體之約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。在另一實施例中，本發明提供在受檢者中治療至少一種疾病(例如，NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合NDV之免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原(亦即，與疾病相關之所引入蛋白質之胞外域的抗原)之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。免疫反應可在受檢者或在動物模型中測定，隨後將該反應關聯於或外推至在例如人類之受檢者中之預測反應。在一實施例中，本發明提供在禽類中治療NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染的方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之包括本發明之嵌合NDV的免疫原性調配物，該嵌合NDV包括含有異源蛋白質序列之融合蛋白質，該免疫原性調配物具有有效量之本發明之嵌合病毒，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之抗原之抗體及/或免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。在一些實施例中，向受檢者或動物模型投與之嵌合流感病毒之劑量為102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu。
在一實施例中，本發明提供在受檢者中控制及/或改善至少一種疾病(例如，NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合NDV之免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之骨架之抗原或抗原決定基的抗體之約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。在另一實施例中，本發明提供在受檢者中控制及/或改善至少一種疾病(例如，NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與第一劑量之有效量的包括本發明之嵌合NDV之免疫原性調配物，該嵌合病毒包括異源序列之融合蛋白質(例如，疾病抗原)，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原(亦即，與疾病相關的所引入蛋白質之胞外域的抗原)之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。免疫反應可在受檢者中或動物模型中測定，隨後將該反應關聯於或外推至在例如人類之受檢者中之預測反應。在一實施例中，本發明提供在禽類中控制及/或改善NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染的方法，該方法包括向該受檢者投與第一劑量之包括本發明之嵌合NDV的免疫原性調配物，該嵌合NDV包括含有異源蛋白質序列之融合蛋白質，該免疫原性調配物具有有效量之本發明之嵌合病毒，其中有效量為在首次投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天且在任一後續投藥前，造成免疫特異性地結合至嵌合病毒之抗原之抗體及/或免疫特異性地結合至融合蛋白質之抗原之抗體的約10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml或更大之血清力價的量。在一些實施例中，向受檢者或動物模型投與之嵌合流感病毒之劑量為102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu。
本發明亦提供預防、治療及/或控制至少一種疾病之方法，該等方法包括向該受檢者投與有效量之包括本發明之嵌合流感病毒的免疫原性調配物，其中有效量為相對於未投與本發明之免疫原性調配物之受檢者而言，造成死亡率降低、住院減少、疾病嚴重性降低及/或疾病臨床症狀減少之量。在某些實施例中，受檢者為人類。在一些實施例中，向受檢者投與之嵌合流感病毒之劑量為102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu。
在另一實施例中，本發明提供在受檢者(較佳為禽類)中預防、治療及/或控制至少一種疾病(例如，禽流感感染及/或由不為禽流感之另一感染因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與有效量之包括本發明之嵌合禽流感病毒的免疫原性調配物，其中有效量為相對於未投與本發明之免疫原性調配物之受檢者而言，造成感染因子之力價或數量降低、死亡率降低、住院減少、感染嚴重性降低及/或感染臨床症狀減少之量。在一些實施例中，向受檢者投與之嵌合禽流感病毒之劑量為102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu。在某些實施例中，相對於未投與本發明之免疫原性調配物之受檢者而言，如在該投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天，藉由此項技術中已知或本文中所例證之任一方法(例如，病毒力價之測定)所測定的，投與本發明之免疫原性調配物造成感染因子之複製的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%或更大之降低。在其他實施例中，相對於未投與發明之免疫原性調配物之受檢者而言，如在該投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天，藉由此項技術中已知或文中所例證之任一方法(例如，病毒力價或細菌負載及/或濃度之測定)所測定的，投與發明之免疫原性調配物造成感染因子之複製或感染因子之負荷的1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100倍之降低。
在另一實施例中，本發明提供在受檢者(例如，禽類)中預防、治療及/或改善至少一種疾病(例如，NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子因子引起之感染)之方法，該等方法包括向該受檢者投與有效量之包括本發明嵌合NDV病毒的免疫原性調配物，其中有效量為相對於未投與本發明免疫原性調配物之受檢者而言，造成感染因子之力價或數量降低、死亡率降低、住院減少、感染嚴重性降低及/或感染臨床症狀減少之量。在一些實施例中，向受檢者投與之嵌合NDV病毒之劑量為102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu。在某些實施例中，相對於未投與本發明免疫原性調配物之受檢者而言，如在該投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天，藉由此項技術中已知或本文中所例證之任一方法(例如，病毒力價之測定)所測定的，投與本發明免疫原性調配物造成感染因子之複製的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%或更大之降低。在其他實施例中，相對於未投與發明免疫原性調配物之受檢者而言，如在該投藥後2天、5天、10天、15天、20天或較佳30天，藉由此項技術中已知或文中所例證之任一方法(例如，病毒力價之測定)所測定的，投與發明之免疫原性調配物造成感染因子之複製或感染因子之負荷的1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75或100倍之降低。
將在治療、預防及/或改善特定疾病(例如，病毒感染)中有效的本發明免疫原性調配物之量將視疾病之性質而定，且可藉由標準臨床技術來確定。另外，可視情況使用活體外檢定以輔助識別最佳劑量範圍。待使用於調配物中之精確劑量亦將視投藥路線及感染或病症之嚴重性而定，且應根據行醫者之判斷及各受檢者之情況來決定。然而，用於投藥之適合的劑量範圍通常為約102 、5×102 、103 、5×103 、104 、5×104 、105 、5×105 、106 、5×106 、107 、5×107 、108 、5×108 、1×109 、5×109 、1×1010 、5×1010 、1×1011 、5×1011 或1012 pfu，且最佳為約104 至約1012 ，且可以與通常所需一樣之時間間隔向受檢者投與一次、二次、三次或三次以上。有效劑量可由得自活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線來外推。
在各種實施例中，本發明之免疫原性調配物或藉由本發明之嵌合病毒所產生之抗體係與一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合投與受檢者以用於預防至少一種疾病(例如，流感感染及/或由不為流感病毒之另一感染因子引起之感染)。在其他實施例中，本發明之免疫原性調配物或藉由本發明之嵌合病毒所產生之抗體係與一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合投與受檢者以用於治療至少一種疾病(例如，流感感染及/或由不為流感病毒之另一感染因子引起之感染)。在另外其他實施例中，本發明之免疫原性調配物或藉由本發明之嵌合病毒所產生之抗體係與一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合投與受檢者以用於控制及/或改善至少一種疾病(例如，流感感染及/或由不為流感病毒之另一感染因子引起之感染)。在一特定實施例中，本發明之免疫原性調配物或藉由本發明之嵌合病毒所產生之抗體係與一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合投與受檢者以用於預防禽流感感染及/或由不為禽流感病毒之另一感染因子引起之感染。在另一特定實施例中，本發明之免疫原性調配物或藉由本發明之嵌合病毒所產生之抗體係與一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合投與受檢者以用於治療禽流感感染及/或由不為禽流感病毒之另一感染因子引起之感染。在其他實施例中，本發明之免疫原性調配物或藉由本發明之嵌合病毒所產生之抗體係與一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合投與受檢者以用於預防NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染。在又一其他實施例中，本發明之免疫原性調配物或藉由本發明之嵌合病毒所產生之抗體係與一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合投與受檢者以用於治療NDV感染及/或由不為NDV之另一感染因子引起之感染。在某些實施例中，療法(例如，預防劑或治療劑)係相隔小於5分鐘、相隔小於30分鐘、相隔1小時、相隔約1小時、相隔約1至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔約12小時至18小時、相隔18小時至24小時、相隔24小時至36小時、相隔36小時至48小時、相隔48小時至52小時、相隔52小時至60小時、相隔60小時至72小時、相隔72小時至84小時、相隔84小時至96小時或相隔96小時至120小時來投與。在較佳實施例中，兩種或兩種以上療法係在相同患者訪問時投與。
熟習此項技術者所熟知之任一抗病毒劑可用於本發明之組合物及方法中。抗病毒劑之非限制性實例包含抑制及/或降低病毒對其受體之附著，病毒至細胞中之內化、病毒複製或病毒自細胞之釋放的蛋白質、多肽、肽、融合蛋白質、抗體、核酸分子、有機分子、無機分子及小分子。詳言之，抗病毒劑包含但不限於核苷類似物(例如，齊多夫定(zidovudine)、阿昔洛韋(acyclovir)、甘昔洛韋(gangcyclovir)、阿糖腺苷(vidarabine)、碘苷(idoxuridine)、曲氟尿苷(trifluridine)及利巴韋林(ribavirin))、膦甲酸(foscarnet)、三環癸胺(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)、沙喹那韋(saquinavir)、茚地那韋(indinavir)、利托那韋(ritonavir)、α－干擾素及其他干擾素、及AZT。
在特定實施例中，抗病毒劑為對病毒抗原呈免疫特異性的免疫調節劑。如本文中所使用，"病毒抗原"包含但不限於能引出免疫反應之任一病毒肽、多肽及蛋白質(例如，HIV gp120、HIV nef、RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白、流感病毒神經胺酸酶、流感病毒血球凝集素、HTLV tax、疱疹單純型病毒糖蛋白(例如，gB、gC、gD及gE)及肝炎B表面抗原)。適用於本發明以治療病毒性感染疾病之抗體包含但不限於抵抗病原性病毒之抗原的抗體，(例如)包含且不限於：腺病毒科(例如，巨大腺病毒及禽類腺病毒)、疱疹病毒科(例如，疱疹單純型病毒1、疱疹單純型病毒2、疱疹單純型病毒5及疱疹單純型病毒6)、光滑噬菌體科(例如，光滑噬菌體屬、腸內細菌相MS2、allolevirus)、痘病毒科(例如，脊椎動物痘病毒亞科、副痘病毒屬、禽痘病毒屬、山羊痘病毒屬、野兔痘病毒屬、豬痘病毒屬、軟疣痘病毒屬及昆蟲痘病毒亞科)、乳多空病毒科(例如，多瘤病毒屬及乳頭狀瘤病毒)、副黏液病毒科(例如，副黏病毒、副流感病毒1、麻疹病毒屬(例如，麻疹病毒)、腮腺炎病毒屬(例如，腮腺炎病毒)、肺病毒亞科(例如，肺病毒屬、人類呼吸道合胞病毒)及間質肺病毒(例如，禽類肺病毒及人類間質肺病毒))、小核醣核酸病毒屬(例如，腸道病毒、鼻病毒、肝病毒(例如，人類肝炎A病毒)、心病毒及口蹄疫病毒)、呼腸孤病毒科(例如，正理奧病毒、環狀病毒、輪狀病毒、質型多角體病毒屬、甘蔗斐濟病毐、水稻萎縮病毒及水稻病毒屬)、反轉錄病毒科(例如，哺乳動物B型反轉錄病毒、哺乳動物C型反轉錄病毒、禽類C型反轉錄病毒、D型反轉錄病毒群、BLV－HTLV反轉錄病毒、慢病毒(例如，人類免疫缺乏病毒1及人類免疫缺乏病毒2)、泡沫反轉錄病毒屬)、黃病毒(例如，肝炎C病毒、登革熱病毒、西尼羅病毒)、肝炎病毒科(例如，肝炎B病毒)、披衣病毒科(例如，甲病毒屬、狂狗病毒屬、短暫熱病毒屬、質型彈狀病毒屬及necleorhabdovirus)、沙狀病毒科(例如，沙狀病毒、淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒、Ippy病毒及拉沙病毒)及冠狀病毒科(例如，冠狀病毒及托羅病毒)。
熟習此項技術者所熟知之用於預防、治療、控制或改善細菌感染之抗菌劑及療法可用於本發明之組合物及方法中。抗菌劑之非限制性實例包含抑制或降低細菌感染、抑制或降低細菌複製或抑制或減少細菌向其他受檢者傳播之蛋白質、多肽、肽、融合蛋白質、抗體、核酸分子、有機分子、無機分子及小分子。詳言之，抗菌劑之實例包含但不限於盤尼西林、頭孢菌素(cephalosporin)、亞胺培南(imipenem)、氨曲南(axtreonam)、萬古黴素(vancomycin)、環絲胺酸(cycloserine)、枯草菌素(bacitracin)、氯黴素(chloramphenicol)、紅黴素(erythromycin)、氯林可黴素(clindamycin)、四環素(tetracycline)、鏈黴素(streptomycin)、妥布黴素(tobramycin)、建它黴素(gentamicin)、阿米卡星(amikacin)、康黴素(kanamycin)、新黴素(neomycin)、觀黴素(spectinomycin)、甲氧苄啶(trimethoprim)、諾氟沙星(norfloxacin)、利福平(rifampin)、多黏桿菌素(polymyxin)、雙性黴素B(amphotericin B)、耐絲菌素(nystatin)、酮康唑(ketocanazole)、異煙肼(isoniazid)、甲硝噠唑(metronidazole)及噴他脒(pentamidine)。抗菌療法及其劑量、投藥路線及推薦用法在此項技術中係已知的且已描述於諸如thePhysician's Desk Reference (第56版，2002)之文獻中。呼吸道感染及抗菌療法之額外資料可在Cecil Textbook of Medicine (第18版，1988)中得到。
熟習此項技術者所熟知之用於預防、控制、治療及/或改善真菌感染或其一或多種症狀(例如，真菌性呼吸道感染)之抗真菌劑及療法可用於本發明之組合物及方法中。抗真菌劑之非限制性實例包含抑制及/或降低真菌感染、抑制及/或降低真菌複製、或抑制及/或減少真菌向其他受檢者傳播之蛋白質、多肽、肽、融合蛋白質、抗體、核酸分子、有機分子、無機分子及小分子。抗真菌劑之特定實例包含但不限於唑藥物(例如，咪康唑(miconazole)、酮康唑(NIZORAL)、乙酸卡泊芬淨(caspofungin acetate)(CANCIDAS)、咪唑(imidazole)、三唑(triazoles)(例如，氟康唑(fluconazole)(DIFLUCAN))及依曲康唑(itraconazole)(SPORANOX))、多烯(例如，耐絲菌素、雙性黴素B(FUNGIZONE)、雙性黴素B脂質複合物("ABLC")(ABELCET)、雙性黴素B膠體分散液("ABCD")(AMPHOTEC)、脂質雙性黴素B(AMBISONE))、碘化鉀(KI)、嘧啶(例如，氟胞嘧啶(flucytosine)(ANCOBON))及伏立康唑(voriconazole)(VFEND)。抗真菌療法及其劑量、投藥路線及推薦用法在此項技術種係已知的且已描述於諸如Dodds等人，2000 Pharmacotherapy 20(11)1335－1355,thePhysician's Desk Reference (第57版，2003)及theMerk Manual of Diagnosis and Therapy (第17版，1999)之文獻中。
在某些實施例中，本發明之免疫原性調配物係作為單一劑量，接著3至6週後的第二劑量來向受檢者投與。根據該等實施例，加強接種可在第二次接種後，以6至12個月之時間間隔投與受檢者。在一實施例中，受檢者為哺乳動物。在另一實施例中，受檢者為鳥。在又一實施例中，受檢者為人類。在一更佳實施例中，受檢者為冒有接觸NDV或禽流感病毒感染之危險的雞。
在某些實施例中，可重複投與相同的本發明之免疫原性調配物且投藥可以至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月來間隔。
5.6生物檢定
5.6.1活體外檢定 本發明之嵌合病毒之生長可藉由此項技術中已知或本文中所述之任一方法(例如，在細胞培養中(例如，雞胎腎細胞之培養物或雞胚纖維母細胞(CEF)之培養物)來評估。本發明之減毒嵌合病毒之生長可在IFN勝任細胞及缺IFN細胞中評估。在一特定實施例中，CEF細胞係以0.0005及0.001、0.001及0.01、0.01及0.1、0.1及1或1及10之MOI或0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或10之MOI來感染且用以5%尿囊液來補充之無血清培養基來培育。病毒力價係如下文所述藉由成斑於CEF細胞中之HA在上清液中測定。其中可評估病毒力價之其他細胞包含但不限於EFK－2細胞、Vero細胞、初級的人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、H292人類上皮細胞株及HeLa細胞。
融合蛋白質向本發明之嵌合病毒之病毒粒子中的併入可藉由此項技術中已知或本文中所述之任一方法(例如，在細胞培養、動物模型或於受精卵中之病毒培養中)來評估。舉例而言，來自受精卵之尿囊液之細胞培養的病毒粒子可藉由離心經由蔗糖緩衝來純化且隨後藉由西方墨點法使用此項技術中熟知之方法分析融合蛋白質表現。
病毒檢定包含彼等在活體外之培養細胞中使用此項技術中熟知之方法來量測經改變之病毒複製(如(例如)藉由溶菌斑形成來測定)或病毒蛋白質之產生(如(例如)藉由西方墨點分析來測定)或病毒RNAs(如(例如)藉由RT－PCR或北方墨點(northern blotanalysis)來測定)的檢定。
藉由本發明之嵌合病毒或其片段所產生之抗體可以熟習此項技術者熟知之多種方式(例如，ELISA、表面電漿共振顯示(BIAcore)、西方墨點法、免疫螢光法、免疫染色及/或微量中和法檢定)來表徵。詳言之，可檢定藉由本發明之嵌合病毒或其片段所產生之抗體免疫特異性地結合至嵌合骨架病毒之抗原或融合蛋白質之抗原或抗原決定基的能力。該檢定可在溶液中(例如，Houghten,1992,Bio/Techniques 13：412－421)、在珠粒上(Lam,1991,Nature 354：82－84)、在晶片上(Fodor,1993,Nature 364：555－556)、在細菌上(美國專利第5,223,409號)、在孢子(美國專利第5,571,698號；第5,403,484號；及第5,223,409號)、在質體上(Cull等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865－1869)或在噬菌體上(Scott及Smith,1990,Science 249：386－390；Cwirla等人，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378－6382；及Felici,1991,J.Mol.Biol.222：301－310)(該等參考案之各者係以引用之方式全部併入本文)來執行。藉由本發明之嵌合病毒或其片段所產生之抗體已經識別可免疫特異性地結合至嵌合骨架病毒之抗原或融合蛋白質之抗原或抗原決定基，隨後可檢定其對該抗原之特異性。
可藉由此項技術中已知之任一方法來檢定藉由本發明之嵌合病毒或其片段所產生之抗體對本發明之嵌合病毒之抗原的免疫特異性結合(例如，嵌合病毒骨架之抗原或抗原決定基或融合蛋白質之抗原或抗原決定基(例如，與疾病相關之抗原))及與其他抗原之交叉反應性。可用以分析免疫特異性結合及交叉反應性之免疫檢定包含但不限於使用諸如以下技術之技術的競爭性及非競爭性檢定系統：西方墨點法、放射免疫檢定、ELISA(酵素結合免疫吸附檢定)、"夾心"免疫檢定、免疫沉澱檢定、沉澱素反應、凝膠擴散沉澱素反應、免疫擴散檢定、凝集檢定、互補結合檢定、免疫放射量檢定、螢光免疫檢定、蛋白質A免疫檢定，略舉數例。該等檢定為常規的且為此項技術中所熟知的(參見，例如，Ausubel等人，編，1994,Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.,New York，其以引用之方式全部併入本文中)。例示性免疫檢定係簡要描述於下文中(但不欲當作限制)。
免疫沉澱協定通常包括將細胞群溶解於諸如以蛋白質磷酸酶及/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA、PMSF、抗蛋白酶、釩酸鈉)補充之RIPA緩衝液(1% NP－40或Triton X－100，1%去氧膽酸鈉、0.1% SDS、0.15 M NaCl、pH 7.2之0.01 M磷酸鈉，1%抑肽酶)之溶解緩衝液中，向細胞溶胞物中添加相關抗體，在40℃下培育一段時間(例如，1至4小時)，向細胞溶胞物中添加蛋白質A及/或蛋白質G瓊脂糖珠粒，在40℃下培育約1小時或1小時以上，洗滌於溶解緩衝液中之珠粒且將珠粒再懸浮於SDS/樣本緩衝液中。相關抗體對免疫沉澱特定抗原之能力可藉由(例如)西方墨點分析來評估。對可經修改以增加抗體對抗原之結合且降低基底(例如，預清除具有瓊脂糖珠粒之細胞溶胞物)之參數而言，熟習此項技術者將為在行的。關於免疫沉澱協定之進一步討論係參見(例如)Ausubel等人，編，1994,Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.,New York，10.16.1。
西方墨點分析通常包括製備蛋白質樣本，在聚丙烯醯胺凝膠(例如，視抗原之分子量而定的8%－20% SDS－PAGE)中電泳蛋白質樣本，將蛋白質樣本自聚丙烯醯胺凝膠轉移至諸如硝化纖維、PVDF或耐綸之膜，在阻斷溶液(例如，具有3% BSA或脫脂乳之PBS)中培育膜，在洗滌緩衝液(例如，PBS－Tween 20)中洗滌膜，將膜與在阻斷緩衝液中稀釋之第一抗體(相關抗體)一起培育，在洗滌緩衝液中洗滌膜，將膜與在阻斷緩衝液中稀釋之共軛至酵素受質(例如，辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)或放射性分子(例如，32 P或125 I)之第二抗體一起培育，在洗滌緩衝液中洗滌膜，及偵測抗原之存在。對可經修改以增加所偵測之信號且降低基底雜訊之參數而言，熟習此項技術者將為在行的。關於西方墨點協定之進一步討論係參見(例如)Ausubel等人，編，1994,Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.,New York，10.8.1。
ELISA包括製備抗原，用抗原塗佈96孔微量滴定盤之孔，向孔中添加共軛至諸如酵素受質(例如，辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)之可偵測化合物的相關抗體並培育一段時間，及檢測抗原之存在。在ELISA中，相關抗體不必共軛至可偵測化合物；而可向孔中添加共軛至可偵測化合物之第二抗體(其辨識相關抗體)。另外，替代用抗原塗佈孔，可將抗體塗佈於孔。在該狀況下，可在向經塗佈之孔中添加相關抗原後，添加共軛至可偵測化合物之第二抗體。對可經修改以增加所偵測之信號之參數以及此項技術中已知之其他ELISA變化而言，熟習此項技術者將為在行的。在一較佳實施例中，ELISA可藉由用PBS中之2 μg/ml之rhu－IL－9塗佈高結合96孔微量滴定盤(Costar)隔夜來執行。在用PBS洗滌3次後，在25℃下，將盤與三倍連續稀釋之Fab一起培育1小時。在PBS又洗滌3次後，添加1 μg/ml之抗人類－鹼性磷酸酶－共軛物且在25℃下將盤培育1小時。在用PBST洗滌3次後，在50 μl/AMP/PPMP受質中測定鹼性磷酸酶活性。使反應停止且用VMAX微定量盤式讀取器測定在560 nm處之吸光度。關於ELISA之進一步討論係參見(例如)Ausubel等人，編，1994,Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.,New York,11.2.1。
抗體對抗原之結合親和力及抗體－抗原相互作用之截止速率可藉由競爭性結合檢定來測定。競爭性結合檢定之一實例為放射免疫檢定，其包括在漸增量之非標記抗原存在下，將標記抗原(例如，3 H或125 I)與相關抗體一起培育，且偵測結合於標記抗原之抗體。本發明之抗體或其片段對IL－9多肽之親和力及結合截止速率可自根據史卡查墨點分析(scatchard plotanalysis)之資料來確定。與第二抗體之競爭亦可使用放射免疫檢定來測定。在該狀況下，在漸增量之未標記第二抗體存在下，將IL－9多肽與共軛至標記化合物(例如，3 H或125 I)之本發明之抗體一起培育。
在一較佳實施例中，BIAcore動力分析係用以測定本發明之抗體對本發明之嵌合病毒之抗原(例如，嵌合病毒骨架之抗原或抗原決定基或融合蛋白質之抗原或抗原決定基(例如，與疾病相關之抗原))的結合及截止速率。BIAcore動力分析包括分析包括來自晶片之相關抗原的多肽與藉由本發明之嵌合病毒在其表面上所產生的固定抗體之結合及解離。典型BIAcore動力研究包含將250 μL於含有0.005%Tween－20之HBS緩衝液中的以各種濃度之抗體試劑(mAb,Fab)注射於抗原已固定於其上之感應器晶片表面上。流動速率係恆定地維持在75 μL/min。按需要收集解離資料歷時15 min或更久。在各注射/解離週期後，儘管可按情況權證來使用其他再生劑，但是使用簡短，1 min脈衝之稀酸(通常為10－100 mM HCl)自抗原表面移除結合mAb。更具體而言，對量測締合速率kon 及解離速率koff 而言，包括抗原之多肽係經由使用標準胺偶合化學反應，即EDC/NHS方法(EDC＝N－二乙基胺基丙基－碳化二醯亞胺)而直接固定於感應器晶片表面上。簡言之，製備5－100 nM包括抗原之多肽於10 mM NaOAc，pH4或pH5中的溶液且越過EDC/NHS－活化表面直至固定大致30－50 RU值之抗原。此後，以注射1 M Et－NH2來將未反應之活性酯去"帽"。在相同固定條件下，製備不含抗原之空白表面以用於參考目的。一旦已製備適當的表面，就在HBS/Tween－20中製備抗體試劑之各者的適合稀釋系列且使其越過以串連方式連接之抗原及參考細胞表面。所製備之抗體濃度範圍視待估計之平衡結合常數KD 而變化。如上所述，在各注射/解離週期後，使用適當再生劑來移除結合抗體。
亦可使用熟習此項技術者所知之技術來檢定藉由本發明之嵌合病毒或其片段所產生之抗體抑制本發明之嵌合病毒之抗原(例如，嵌合病毒骨架之抗原或抗原決定基或融合蛋白質之抗原或抗原決定基(例如，與疾病相關之抗原))對宿主細胞受體之結合的能力。舉例而言，已知結合該等抗原之細胞表現受體可在藉由本發明之嵌合病毒或其片段所產生之抗體存在或不存在下與抗原接觸且抗體或其片段抑制抗原結合之能力可藉由(例如)流式細胞儀或閃爍檢定來量測。抗原或抗體或抗體片段可用諸如放射性標記(例如，32P、35S及125I)或螢光標記(例如，螢光異硫氰酸鹽、若丹明(rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)、藻藍蛋白(phycocyanin)、別藻藍蛋白(allophycocyanin)、鄰苯二甲醛及螢咔明(fluorescamine))之可偵測化合物來標記以能偵測抗原與細胞受體之間的相互作用。或者，藉由本發明之嵌合病毒或其片段所產生之抗體抑制本發明之嵌合病毒之抗原(例如，嵌合病毒骨架之抗原或抗原決定基或融合蛋白質之抗原或抗原決定基(例如，與疾病相關之抗原))結合至受體的能力可在無細胞檢定中測定。舉例而言，包括抗原之多肽可與抗體或其片段接觸且可測定抗體或抗體片段抑制多肽結合至細胞受體之能力。較佳地，使抗體或抗體片段固定於固體支撐物上且用可偵測化合物來標記多肽。或者，使包括抗原之多肽固定於固體支撐物上且用可偵測化合物來標記抗體或其片段。
5.6.2活體內檢定 本發明之嵌合病毒之毒性可在受檢者中，尤其在禽類或其動物模型中來評估。在一實例中，在病毒感染之動物模型中誘發肺損傷及引起感染之能力係與野生型病毒及模擬病毒相比較。肺損傷可以由目視檢查為健康之肺葉百分比來評估。動物係藉由靜脈內投與戊巴比妥(pentobarbital)5天p.i.來實施安樂死，且將其肺全部移除。目測估計由大體損傷所感染之各肺片之表面的百分比。將百分比平均化以獲得各動物之7個肺葉的平均值。在其他檢定中，可測試鼻液標本以確定病毒負荷或力價。鼻液標本可在驗屍期間取出以測定病毒負荷後感染。
為定量組織樣本中之病毒，在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中將組織樣本均質化，且在37℃下，使澄清勻漿之稀釋液吸附於單細胞層(例如，CEF或MDCK細胞)上歷時1 h。隨後，用含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.01% DEAE－右旋糖聚糖、0.1% NaHCO3 及1%瓊脂之最小基本培養基之溶液覆蓋受感染之單層細胞。將板培育2至3天直至可目測到溶菌斑。滴定來自PR8感染樣本之病毒的組織培養感染劑量(TCID)檢定係如下進行。在培養基中，將於96孔板中之長滿單層細胞(例如，CEF或MDCK細胞)與澄清組織勻漿之對數稀釋液一起培育。接種後2至3天，藉由血球凝集檢定(HA檢定)評估自各孔之0.05－ml等分試樣之病毒生長。在其他檢定中，在感染後執行組織病理學評估。可檢查鼻甲及鼻氣管之上皮改變及上皮下之炎症。可檢查肺之支氣管上皮改變及在大的、中等的及小的或末端細支氣管中之細支氣管周之炎症。亦評價肺泡之發炎性改變。中等細支氣管係以如下之0至3＋之標度來分級：0(正常：由具有纖毛頂端邊緣及基底假複層核之中至高之柱狀上皮細胞排列；最小炎症)；1＋(柱狀上皮層，且甚至在輪廓上僅具有輕微地增殖增強；纖毛在若干細胞上仍可見)；2＋(上皮層之突出改變，自減毒至顯著增殖；細胞打亂且層在路米那邊緣(luminal border)輪廓不規則)；3＋(上皮層顯著地破壞且打亂，同時壞死細胞在內腔中可見；一些細支氣管變薄且其他呈顯著反應性增殖)。
氣管係如下以0至2.5＋之標度來分級：0(正常：藉由具有纖毛頂端邊緣、核基底及假複層之中至高的柱狀上皮細胞來排列。細胞質在頂端邊緣與核之間為明顯的。偶而具有鱗狀細胞之小病灶)；1＋(上皮層之病灶鱗狀化生)；2＋(擴散大部分上皮層之鱗狀化生，纖毛可為病灶明顯的)；2.5＋(擴散鱗狀化生，同時極少纖毛為明顯的)。
病毒免疫組織化學係使用病毒性－特異性單株抗體(例如，NP－、N－或HN特異性單株抗體)來執行。染色係如下分級為0至3＋：0(無感染細胞)；0.5＋(少數感染細胞)；1＋(少數感染細胞，如廣泛分離之個別細胞)；1.5＋(少數感染細胞，如廣泛分離之單一及少量叢集)；2＋(中等數量之感染細胞，通常影響排列細支氣管之上皮層之部分中的相鄰細胞之叢集，或於肺泡中之少量小葉下病灶)；3＋(大量感染細胞，影響細支氣管中之大部分上皮層，或在肺泡中大規模地廣布小葉下病灶)。
5.6.3測定病毒力價 病毒力價係藉由將連續稀釋之嵌合病毒接種至細胞培養(例如，CEF或MDCK)、雞胚或活動物(例如，禽類)中來測定。在培育病毒特定時間後，使用標準方法分離病毒。HA檢定可在V形底96孔板中進行。將各樣本於PBS中之連續兩倍稀釋液與相等體積之雞紅血球於PBS中之0.5%懸浮液一起在冰上培育1 h。正性孔含有紅血球之黏著、均質層；負性孔含有非黏著小球。
病毒力價之物理定量可使用應用於病毒上清液(Quinn & Trevor,1997；Morgan等人，1990)之PCR、血球凝集檢定、組織培養感染劑量(TCID50)或卵感染劑量(EID50)來執行。
5.6.4毒性研究 本發明之組合物之毒性及/或功效可藉由在細胞培養或實驗動物中，(例如)用於測定LD50(50%群體致死之劑量)及ED50(在50%之群體中治療有效之劑量)之標準醫藥程序來測定。毒性效應與治療效應之間的劑量比率為療法指數且其可表達為比率LD50/ED50。顯示大的療法指數之療法較佳。雖然可使用顯示毒性副作用之療法，但是應慎重設計輸送系統，其將受感染組織之位點作為該等藥劑之目標以最小化對未受感染細胞之潛在損壞且進而降低副作用。
得自細胞培養檢定及動物研究之資料可用於調配適用於受檢者之一定範圍之劑量的療法。該等藥劑之劑量較佳係落在包含具有小毒性或無毒性之ED50的循環濃度之一定範圍內。劑量可視所使用之劑型及所利用之投藥路線而在該範圍中變化。對用於本發明之方法中的任一療法而言，治療有效劑量可最初自細胞培養檢定來估計。劑量可在動物模型中調配以達成包含如在細胞培養所測定之IC50(亦即，達到一半－最大之症狀抑制的測試化合物之濃度)之循環血漿濃度。該等資訊可用以在受檢者(例如，馬)中更準確地確定有效劑量。血漿含量可(例如)藉由高效液相層析法來量測。
另外，熟習此項技術者所知之任一檢定可用以評估本文中所揭示之組合物、組合療法用於以下各病之預防效用及/或治療效用：病毒性感染或與其相關之病狀或症狀、不同於病毒性感染之感染或與其相關之病狀或症狀，或其中本發明之減毒嵌合病毒係用作誘發對與病狀相關之抗原的免疫反應之載體的病狀。
5.7本發明之特定實施例
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括融合蛋白質，該融合蛋白質具有(i)包括異源肽序列之胞外域，該異源序列包括至少一種不同於流感之感染因子之保護性抗原的抗原決定基，或至少一種與疾病相關之抗原的抗原決定基，該胞外域融合至(ii)由流感病毒之基本基因編碼之糖蛋白的跨膜域及細胞質域，其中，融合蛋白質併入禽流感病毒中，在該等禽流感病毒中，基本基因之功能係由融合蛋白質或由禽流感病毒原生之糖蛋白來提供。在某些實施例中，流感病毒之基本基因為血球凝集素(HA)基因。在其他實施例中，流感病毒之基本基因為神經胺酸酶(NA)基因。在某些實施例中，嵌合禽流感病毒係經減毒的。根據該等實施例，嵌合禽流感病毒可藉由NS1基因中之突變來減毒。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括融合蛋白質，該融合蛋白質具有(i)NDV HN蛋白之胞外域，其融合至(ii)流感病毒NA蛋白之跨膜域及細胞質域，其中，融合蛋白質併入禽流感病毒中，在該等禽流感病毒中，NA蛋白之功能係由融合蛋白質或由禽流感病毒原生之糖蛋白來提供。在某些實施例中，嵌合禽流感病毒係經減毒的。根據該等實施例，嵌合禽流感病毒可藉由NS1基因中之突變來減毒。
本發明提供減毒嵌合禽流感病毒，其包括融合蛋白質，該融合蛋白質具有(i)包括異源肽序列之胞外域，該異源序列包括至少一種不同於流感之感染因子之保護性抗原的抗原決定基，或至少一種與不同於流感之感染因子之保護性抗原的疾病相關之抗原的抗原決定基，該胞外域融合至(ii)由流感病毒之基本基因編碼之糖蛋白的跨膜域及細胞質域，其中，融合蛋白質併入減毒流感病毒中，在該等減毒流感病毒中，基本基因之功能係由融合蛋白質或由減毒流感病毒原生之糖蛋白來提供。在某些實施例中，流感病毒之基本基因為血球凝集素(HA)基因。在其他實施例中，流感病毒之基本基因為神經胺酸酶(NA)基因。
本發明提供嵌合NDV，其包括融合蛋白質，該融合蛋白質具有(i)包括異源肽序列之胞外域，該異源序列包括至少一種不同於NDV之感染因子之保護性抗原的抗原決定基，或至少一種與疾病相關之抗原的抗原決定基，該胞外域融合至(ii)由NDV之基本基因編碼之糖蛋白的跨膜域及細胞質域，其中，融合蛋白質併入NDV中，在該NDV中，基本基因之功能係由融合蛋白質或由NDV原生之糖蛋白來提供。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括編碼神經胺酸酶融合蛋白質之經包裝的流感病毒NA區段，其中NA開放閱讀框架經修飾以便編碼NA胞外域之核苷酸係由編碼藉由N－末端錨定的不同於流感之感染因子之神經胺酸酶抗原之胞外域的核苷酸來置換，以便表現神經胺酸酶融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括編碼血球凝集素融合蛋白質之經包裝的流感病毒HA區段，其中HA開放閱讀框架經修飾以便編碼HA胞外域之核苷酸係由編碼藉由C－末端錨定的不同於流感之感染因子之血球凝集素抗原之胞外域的核苷酸來置換，以便表現血球凝集素融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括經包裝的雙譯基因流感病毒HA區段，該HA區段包括：(a)編碼禽流感血球凝集素蛋白質之第一開放閱讀框架，及(b)編碼血球凝集素融合蛋白質之第二開放閱讀框架，其中編碼血球凝集素胞外域之核苷酸係由編碼異源肽序列之核苷酸來置換，該異源序列包括至少一種不同於流感之感染因子之保護性抗原的抗原決定基，或至少一種與疾病相關的藉由C－末端錨定之抗原的抗原決定基，以便表現流感血球凝集素及融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括經包裝的雙譯基因流感病毒NA區段，該NA區段包括：(a)編碼禽流感神經胺酸酶蛋白質之第一開放閱讀框架，及(b)編碼神經胺酸酶融合蛋白質之第二開放閱讀框架，其中編碼神經胺酸酶胞外域之核苷酸係由編碼異源肽序列之核苷酸來置換，該異源序列包括至少一種不同於流感之感染因子之保護性抗原的抗原決定基，或至少一種與疾病相關的藉由N－末端錨定之抗原的抗原決定基，以便表現流感神經胺酸酶及融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。
本發明提供嵌合禽流感病毒，其包括編碼神經胺酸酶融合蛋白質之經包裝的流感病毒NA區段，其中NA開放閱讀框架經修飾以便編碼NA胞外域之核苷酸係由編碼NDV之HN抗原之胞外域的核苷酸來置換，以便表現神經胺酸酶融合蛋白質且將其併入嵌合禽流感病毒中。
在某些實施例中，具有第204－206段及第208－212段之嵌合禽流感病毒包括編碼降低病毒之細胞干擾素拮抗劑活性之經修飾NS1蛋白質的包裝NS1基因區段。在其他實施例中，具有第204－206段及第208－212段之嵌合禽流感病毒包括具有經修飾以移除血球凝集素多鹼基裂解位點之開放閱讀框架之HA區段。在其他實施例中，具有第210段之嵌合禽流感病毒，其中第一開放閱讀框架係經修飾以移除血球凝集素多鹼基裂解位點。
本發明提供編碼具有第208段及第211段之NA區段的重組核酸分子(例如，重組DNA分子)。本發明亦提供編碼具有第209－210段之HA區段的重組核酸分子(例如，重組DNA分子)。
本發明提供繁殖具有第204－206段及第208－2l3段之嵌合禽流感病毒的方法，其包括在易受禽流感病毒感染之受精卵或細胞株中培養嵌合禽流感病毒。本發明亦提供產生免疫原性組合物之方法，該方法包括：(a)在易受禽流感病毒感染之受精卵或細胞株中繁殖具有第204－206段及第208－213段之嵌合禽流感病毒；及(b)收集子代病毒，其中，病毒生長至足夠數量且係處於病毒免受污染之充分條件下以便子代病毒適於調配入免疫原性組合物中。
本發明提供減毒嵌合流感病毒，其包括編碼神經胺酸酶融合蛋白質之經包裝的流感病毒NA區段，其中NA開放閱讀框架經修飾以便編碼NA胞外域之核苷酸係由編碼藉由N－末端錨定的不同於流感之感染因子之神經胺酸酶抗原之胞外域的核苷酸來置換，以便表現神經胺酸酶融合蛋白質且將其併入減毒嵌合禽流感病毒中。
本發明提供減毒嵌合流感病毒，其包括編碼血球凝集素融合蛋白質之經包裝的流感病毒HA區段，其中HA開放閱讀框架經修飾以便編碼HA胞外域之核苷酸係由編碼藉由C－末端錨定的不同於流感之感染因子之血球凝集素抗原之胞外域的核苷酸來置換，以便表現血球凝集素融合蛋白質且將其併入減毒嵌合流感病毒中。
本發明提供減毒嵌合禽流感病毒，其包括經包裝的雙譯基因流感病毒HA區段，該HA區段包括：(a)編碼禽流感血球凝集素蛋白質之第一開放閱讀框架，及(b)編碼血球凝集素融合蛋白質之第二開放閱讀框架，其中編碼血球凝集素胞外域之核苷酸係由編碼異源蛋白質之核苷酸置換，該蛋白質含有不同於流感之感染因子之保護性抗原之胞外域的抗原決定基，或與疾病相關之抗原之胞外域的抗原決定基，該融合蛋白質係藉由C－末端來錨定，以便表現流感血球凝集素及融合蛋白質且將其併入減毒嵌合流感病毒中。
本發明提供減毒嵌合流感病毒，其包括經包裝的雙譯基因流感病毒NA區段，該NA區段包括：(a)編碼禽流感神經胺酸酶蛋白質之第一開放閱讀框架，及(b)編碼神經胺酸酶融合蛋白質之第二開放閱讀框架，其中編碼神經胺酸酶胞外域之核苷酸係由編碼異源蛋白質之核苷酸置換，該蛋白質含有不同於流感之感染因子之保護性抗原之胞外域的抗原決定基，或與疾病相關之抗原之胞外域的抗原決定基，該融合蛋白質係藉由N－末端來錨定，以便表現流感神經胺酸酶及融合蛋白質且將其併入減毒嵌合流感病毒中。
在某些實施例中，具有第216－219段之減毒嵌合流感病毒包括編碼降低病毒之細胞干擾素拮抗劑活性之經修飾NS1蛋白質的包裝NS1基因區段。在某些其他實施例中，具有第216－219段之減毒嵌合流感病毒包括具有經修飾以移除血球凝集素多鹼基裂解位點之開放閱讀框架的HA區段。在其他實施例中，具有第218段之減毒嵌合流感病毒，其中第一開放閱讀框架經修飾以移除血球凝集素多鹼基裂解位點。
本發明提供編碼具有第216段及第219段之NA區段的重組DNA分子。本發明亦提供編碼具有第217－218段之HA區段的重組DNA分子。
本發明提供繁殖具有第216－220段之減毒嵌合流感病毒的方法，其包括在易受禽流感病毒感染之受精卵或細胞株中培養減毒嵌合流感病毒。本發明亦提供產生免疫原性組合物之方法，該方法包括：(a)在易受減毒流感病毒感染之受精卵或細胞中繁殖具有第206段及第216－220段之減毒嵌合流感病毒；及(b)收集子代病毒，其中，病毒生長至足夠數量且係處於病毒免受污染之充分條件下以便子代病毒適於調配入免疫原性組合物中。
本發明提供嵌合NDV，其包括包含編碼F蛋白－融合蛋白質之核苷酸序列之經包裝的基因組，該F蛋白－融合蛋白質具有F蛋白之跨膜域及細胞質域及藉由C－末端來錨定之不同於NDV之感染因子的抗原之胞外域以便表現F蛋白－融合蛋白質且將其併入嵌合NDV中。
本發明提供嵌合NDV，其包括包含編碼HN融合蛋白質之核苷酸序列的經包裝之基因組，該融合蛋白質具有HN蛋白之跨膜域及細胞質域及藉由N－末端來錨定之不同於NDV之感染因子的抗原之胞外域以便表現HN融合蛋白質且將其併入嵌合NDV中。
在某些實施例中，具有第207段及第223－224段之嵌合NDV之基因組包括編碼F蛋白之核苷酸序列，以便表現除F蛋白－融合蛋白質之外的F蛋白且將其併入嵌合NDV中。在其他實施例中，編碼NDV F蛋白－融合蛋白質之核苷酸序列置換編碼NDV F蛋白之核苷酸序列且F蛋白－融合蛋白質為具有第223段之嵌合NDV供應F蛋白之功能。
在某些實施例中，具有第207段及第223－224段之嵌合NDV之基因組包括編碼HN蛋白之核苷酸序列，以便表現HN蛋白且將其併入嵌合NDV中。在其他實施例中，編碼HN融合蛋白質之核苷酸序列置換編碼NDV HN蛋白之核苷酸序列且HN融合蛋白質為具有第224段之嵌合NDV供應HN蛋白之功能。
本發明提供繁殖具有第207段及第223－226段之嵌合NDV的方法，其包括在易受NDV感染之受精卵或細胞株中培養嵌合NDV。本發明亦提供產生免疫原性組合物之方法，該方法包括：(a)在受精卵或細胞中繁殖具有第207段及第223－226段之嵌合NDV；及(b)收集子代病毒，其中，病毒生長至足夠數量且係處於病毒免受污染之充分條件下以便子代病毒適於調配入免疫原性組合物中。
本發明提供包括具有第204－205段、第207－213段及第223－224段之嵌合病毒的受精卵。本發明亦提供包括具有第204－205段、第207－213段及第223－224段之嵌合病毒的細胞株。本發明進一步提供包括具有第204－205段、第207－213段及第223－224段之嵌合病毒的免疫原性組合物。
本發明提供包括具有第206段及第216－220段之減毒嵌合病毒的受精卵。本發明亦提供包括具有第206段及第216－220段之減毒嵌合病毒的細胞株。本發明進一步提供包括具有第206段及第216－220段之減毒嵌合病毒的免疫原性組合物。
本發明提供在禽類中誘發對兩種感染因子之免疫反應的方法，該方法包括投與有效量之具有第204－205段及第208－213段之嵌合禽流感病毒。本發明亦提供在禽類中誘發對兩種感染因子之免疫反應的方法，該方法包括投與有效量之具有第207段及第223－224段之嵌合NDV。本發明進一步提供在受檢者中誘發對兩種感染因子之免疫反應的方法，該方法包括投與有效量之具有第206段及第216－220段之減毒嵌合流感病毒。在某些實施例中，受檢者為人類受檢者。在其他實施例中，受檢者為非人類哺乳動物(例如，豬、馬、狗、貓或牛)。在另外其他實施例中，受檢者為禽類受檢者。
6.實例 6.1工程化表現新城病病毒抗原決定基之嵌合禽流感病毒
以下實例描述例示性嵌合禽流感病毒之產生。詳言之，實例描述工程化禽流感病毒、流感A/Vietnam/1203/04(H5N1)以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中，該融合蛋白質包括禽流感病毒NA蛋白之跨膜域及細胞質域及NDVHN蛋白之胞外域。融合蛋白質功能性地置換禽流感病毒NA蛋白。
6.1.1材料及方法6.1.1.1建構質體 用於重組病毒之唯一質體救援中的全部質體構築體係使用相同策略來選殖。病毒區段之全長cDNA使用具有包含Sap I限制性位點之引子的PCR來放大，該等限制性位點容許PCR產物插入pPolI－SapI－Rb質體之Sap 1位點中(Flandorfer等人，2003,J.Virol.77：9116－9123；Nakaya等人，2001,J.Virol.75：11868－11873；兩者皆以引用之方式全部併入本文中)。確認所有PCR插入物之序列(Mount Sinai DNA定序設施，NY)，且當適當時，使用QuickChange XL定點突變套組(Stragene,La Jolla,CA)來校正已藉由PCR引入的核苷酸改變。流感A/Vietnam/1203/04(H5N1)、流感A/WSN/33(WSN)及NDV之GenBank序列係提供於表2中
6.1.1.2建構嵌合病毒區段 使用此項技術中熟知之重組技術來建構編碼NDV B1 HN胞外域及流感A/WSN/33(A/Vietnam/1203/04－A/WSN/33 NA(cT＋TM) －NDV B1 HN(ecto) )之神經胺酸酶之細胞質尾部(CT)及跨膜(TM)域。構築體編碼以下各物：WSN NA vRNA之3'非編碼區的19個核苷酸、編碼NA編碼區之胺基酸1－36(108個核苷酸)的核苷酸(該NA編碼區對應於NA蛋白之細胞質尾部及跨膜域加上NA胞外域之第一胺基酸)、接著編碼NDV B1 HN蛋白(HN胞外域)之胺基酸51－568的核苷酸、兩個連續終止密碼子、WSN NA閱讀框架及WSN vRNA之5'非編碼區的157個未轉譯核苷酸(圖1)。
6.1.1.3建構編碼嵌合H5N1－NDV之質體構築體 藉由唯一質體救援來建立質體構築體以產生以經工程化以表現NDV表面糖蛋白之H5N1(宿主病毒)為主的嵌合病毒。編碼表面糖蛋白NA之H5N1之區段經選擇以用包括編碼NA蛋白之CT及TM域加上A/WSN/33之NA胞外域之第一胺基酸及NDV－B1之HN蛋白之胞外域的核苷酸序列之重組區段來置換。融合蛋白質，A/Vietnam/1203/04－A/WSN/33NA(CT＋TM) －NDV B1 HN(ecto) 為嵌合禽流感病毒供應神經胺酸酶活性。參見嵌合區段之圖解圖1。
將列於表2中之H5N1之剩餘7個區段(NS、M、NP、HA、PA、PB1及PB2)選殖至pPol1中以分別產生pPol1VN1203－NS、pPol1VN1203－M、pPol1VN1203－NP、pPol1VN1203－HA、pPol1VN1203－PA、pPol1VN1203－PB1及pPol1VN1203－PB2。為確保減毒嵌合H5N1病毒，編碼H5N1HA之區段經改變以將在HA裂解位點(H5N1HA編碼序列之核苷酸1013－1039)前之原生多鹼基胺基酸序列直接轉化成基於流感AH5之無毒力禽類病毒株之一致序列。該區域內之胺基酸序列係自QRERRRKK RG(SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：14之胺基酸2－11)改變至QRETRG(SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：16之胺基酸2－7)，用蘇胺酸置換劃線的胺基酸(圖2)。該區域中之密碼子用法經進一步改變以減少腺苷殘基之數量，以最小化在該序列中藉由聚合酶滑動再引入腺苷殘基及所造成之將鹼性氨基酸殘基引入HA裂解位點的幾率。僅將同義突變引入無毒力HA序列中(圖3)。將所得的編碼對應低毒性禽流感A病毒株之經改變HA糖蛋白的區段選殖至如先前所述之pPol1質體，pPol1VN1203－HALO中。除PB1及PB2外，藉由H5N1之區段來編碼之基因產物不自genbank序列改變。PB1及PB2之序列由於引入Sap I限制性位點而改變。在PB1之編碼序列之位置32處具有核苷酸鳥嘌呤之非同義取代物造成離胺酸至精胺酸之突變；在PB2之編碼序列之位置1393處具有核苷酸胸嘧啶之非同義取代物造成脯胺酸至絲胺酸之突變。H5N1之所有基因產物在vRNA之位置4處具有腺苷殘基。
除編碼野生型H5N1 NS，pPol1VN1203－NS之質體構築體外，亦產生3個編碼H5N1 NS基因區段之不同截短形式的pPol1構築體。編碼NS區段之改變形式的其他構築體可用於進一步減毒所得嵌合病毒(參見，例如，美國專利6,669,943，其以引用之方式全部併入本文中)。3個構築體在藉由質體構築體所表現之NS1蛋白質之胺基酸數量(自胺基末端)上變化。因此，按自野生型NS1蛋白質之胺基末端計數，pPol1VN1203 NS1－126、pPol1VN1203 NS1－99及pPol1VN1203 NS1－73分別編碼僅前126個、僅前99個及僅前73個胺基酸。突變以產生截短構築體不影響NEP之開放閱讀框架(圖4)。
6.1.1.4自質體構築體救援感染性病毒 本發明之重組、嵌合病毒係藉由本文中所述或此項技術中已知之任意方式來救援。舉例而言，293T、HEp－2或A549細胞可由8種所述pPol1質體來轉染，經選擇以達到所要水平之病毒減毒且以便表現所有8種區段，亦即，細胞係由pPol1VN WSN－NA(CT＋TM) －NDV B1 HN(ecto) ；pPol1VN1203－HA或pPol1VN1203－HALO；ppol1vn1203－NS、pPol1VN1203 NS1－126、pPol1VN1203 NS1－99或pPol1VN1203 NS1－73；pPol1VN1203－M；pPol1VN1203－NP；pPol1VN1203－PA；pPol1VN1203－PB1及pPol1VN1203－PB2來轉染。細胞係進一步由編碼vRNA之複製及轉錄所需的NA、PA、PB1及PB2至真核表現質體來轉染。隔夜培育後，經轉染之細胞可與雞胚胎纖維母細胞一起共培養以放大所產生之病毒。另外2至3天之培育後，可將共培養物之上清液注入9天或10天大之受精雞卵之尿囊腔中用於繁殖。對減毒病毒而言，可使用不具有勝任干擾素系統之7天大之卵。病毒生長可根據此項技術中已知之標準協定，藉由檢定所收穫尿囊液之血球凝集來確認。
6.2工程化表現外來抗原決定基之嵌合新城病病毒
以下實例描述例示性嵌合NDV之產生。詳言之，實例描述工程化嵌合NDV以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入病毒粒子中，該融合蛋白質包括NDV之必需蛋白質之跨膜域及細胞質域及禽流感病毒之胞外域。實例證實：該嵌合病毒誘發抵抗藉由流感病毒及NDV引起之後續感染的保護。
實例亦描述工程化例示性NDV以表現融合蛋白質且將該融合蛋白質併入其病毒粒子中，該融合蛋白質包括NDV F蛋白之細胞質域及人類角質細胞生長因子受體(KGFR)之胞外域及跨膜域。
6.2.1材料及方法6.2.1.1細胞株 使MDCK、HEp－2及A549細胞在由10%胎牛血清及1%盤尼西林/鏈黴素補充之Dulbecco's Modified Eagle培養基(DMEM)中生長。NDV之Hitchner B1病毒株之全長cDNA已由genbank寄存編號AF375823(Nakaya等人，2001,J.Virol.75：11868－11873，其以引用之方式全部併入本文中)公開。
6.2.1.2建構質體 已描述工程化NDV之重組cDNA以編碼外來蛋白質(Nakaya等人，2001,J.Virol.75：11868－11873)。簡言之，將NDV之全長cDNA引入T7啟動子與肝炎δ病毒(HDV)核糖核酸酶及T7終止子之間的質體中以產生pNDV/B1。NDV cDNA具有工程化於P基因與M基因之間的XbaII位點，其容許將外來序列作為額外轉錄單元引入NDV基因組中(圖5)。所有插入基因經工程化以順序地含有基因末端；5'－TTAGAAAAAA－3'(SEQ ID NO：18)；順反子間核苷酸T；及基因起始序列；5'－ACGGGTAGAA－3'(SEQ ID NO：19)(GE/GS序列)。
rNDV/B1－KGFR、rNDV/B1－KGFR/F－CT及rNDV/B1－H7HA/F－TMCT病毒係藉由反向遺傳學由得自NDV Hitchner B1病毒株之全長cDNA複本來產生。為建構該等病毒，如對其他ORF之描述(Nakaya等人，2001,J.Virol.75：11868－11873及Nakaya等人，2004,J.Virol.78：9366－9375，兩者在此皆以引用之方式全部併入)KGFR或H7 HA(來自流感A亞型H7N2之HA蛋白質)ORF經選殖作為NDV/B1 cDNA之P基因與M基因之間的額外轉錄單元。KGFR及H7 HA皆為各包括TM及CT域之跨膜蛋白質。在KGFR/F－CT構築體中，KGFR蛋白質之CT域係由NDV之F蛋白之CT域來置換。在H7 HA/F－TMCT構築體中，H7 HA蛋白質之TM及CT域係由NDV之F蛋白之TM及CT域來置換。自cDNA救援重組NDV病毒且使用此項技術中熟知之標準技術來使其繁殖(參見，例如，Swayne等人，2003,Avian Dis.47：1047－1053及Nakaya等人，2001，兩者在此皆以引用之方式全部併入)。在重組病毒中插入新轉錄單元係藉由反轉錄PCD接著定序分析來確認。
舉例而言，H5 HA基因之胞外域(ECTO)係藉由PCR，使用以下引子(其包含GE/GS序列)來產生：NheI －H5HA P，5'－CG GCT AGC TTAGAAAAAA T ACGGTAGAA GTGAA ACTAGT CC GCC ACC ATG GAA AGA ATA GTG ATT GCC TTT GCA－3'(SEQ ID NO：20)及HpaI －H5HA P，5'－CG GTT AAC CTG ATA AGC CCC CAT TGA TTC TAA T－3'(SEQ ID NO：21)。用NheI 及HpaI 來消化H5 HAecto PCR片段且將其選殖至pSL1180中(A mersham Pharmacia Biotech)(pSLH5HAecto)。NDV F基因之TM及CT亦藉由PCR，使用以下引子來放大：HpaI －NDVF(TM＋CYTO)P，5'－CG GTT AAC CTC ATT ACC TAT ATC GTT TTG ACT－3'(SEQ ID NO：22)，SacI －NheI －NDVF(TM＋CYTO)M，5'－CG GAG CTC AA GCT AGC TTA TCA CAT TTT TGT AGT GGC TCT CAT CTG－3'(SEQ ID NO：23)。為與H5 HAecto 融合，用HpaI 及SacI 來消化NDV F基因之TM及CT且隨後將其選殖至pSLH5HAecto 中以獲得雜交融合基因。最後，用NheI 來消化含有雜交H5 HA基因之質體且使其選殖於rNDV cDNA之P基因與M基因之間。
6.2.1.3西方墨點及生物分析 來自細胞或尿囊萃取物之病毒係藉由超速離心法經由30%蔗糖緩衝來純化。結合蛋白質之含量係藉由西方墨點分析使用特異性抗體及常規技術來監控。
嵌合NDV在活體內表現非病毒蛋白質KGFR之能力係藉由用3×107 pfu之嵌合病毒經腹膜內使BALB/c小鼠免疫，接著在3週後使用相同劑量之加強免疫來測定。在第二次免疫後兩週，藉由免疫染色由編碼KGFR之質體所轉染之MDCK細胞來測試來自接種動物之血清的針對KGFR之抗體的存在。
活體內系統經設計以評估用包括雜交H7 HA/F－TMCT之rNDV之免疫法是否能提供抵抗由H7或NDV引起之後續感染的保護。藉由滴眼方法，使用100 μl之3種疫苗，rNDV、rNDV－H7 HA/F－TMCT及Sham來使2週大之小雞免疫。在4週齡時，100 μl包括105.1 平均胚胎感染劑量之HP AIV(A/Steele/ACC－10/59[H7N7])係經由鼻後縱裂來投與。觀察鳥之HP AIV感染之徵象及損傷。記錄死亡率且在6週齡時，藉由戊巴比妥鈉(100 mg/kg)使所有存活者安樂死。
6.2.2結果6.2.2.1藉由表現KGFR或KGFR/F－CT嵌合NDV表現KGFR 使嵌合病毒rNDV/B1－KGFR及rNDV/B1－KGFR/F－CT在10天大之雞受精卵之尿囊腔中生長。藉由西方墨點分析使用鼠類抗KGFR抗體來測試純化病毒的KGFD或KGFR/F－CT之存在。在自用rNDV/B1－KGFR/F－CT而非用rNDV/B1－KGFR接種之卵分離的樣本中偵測陽性反應(圖6)。
該等嵌合病毒之各者亦用以使3隻BALB/c小鼠免疫。檢定來自受免疫動物之血清的KGFR抗體之存在。使用該檢定，用rNDV/B1－KGFR病毒來免疫之動物不發展KGFR抗體之可偵測水平。相反，藉由該檢定得知KGFR抗體存在下的所有3隻用rNDV/B1－KGFR/F－CT病毒來免疫之動物為陽性。
6.2.2.2藉由用rNDV－H7 HA/F－TMCT免疫的抵抗H7感染之保護 野生型H7 HA之TM及CT域係由NDVF蛋白之TM及CT域來置換以產生雜交HA蛋白、H7HAecto －NDV/F(TM＋CT) 。在西方墨點分析中，表現H7 HA之完整ORF的對照rNDV，rNDV－H7HA及表現雜交H7HAecto －NDV/F(TM＋CT) 之嵌合rNDV，rNDV－H7HAecto －NDV/F(TM＋CT) ，對H7抗體產生陽性反應；然而，目測來自rNDV－H7HAecto －NDV/F(TM＋CT) 之信號係強若干倍(圖7)。當用rNDV－H7HAecto －NDV/F(TM＋CT) 免疫一次之小雞隨後用致死劑量之H7流感來攻毒時，10隻受免疫小雞中之9隻(90%)存活.當用rNDV－H7HAecto －NDV/F(TM＋CT) 免疫一次之小雞隨後用致死劑量之NDV來攻毒時，10隻受免疫小雞中之10隻(100%)存活。
6.3工程化表現外來抗原決定基之嵌合新城病病毒
以下實例描述嵌合修飾NDV之產生。詳言之，產生重組NDV以改善用於實例6.2中的NDV骨架之毒性。實例證實：rNDV之改良毒性亦改良包括以rNDV為主之嵌合病毒的免疫原性調配物之免疫原性。
6.3.1材料及方法 除非另外規定，否則在該部分中所述之所有材料及方法與在上文實例6.2中所描述及例示之彼等相同。
6.3.1.1在rNDV之F蛋白中產生具有修飾裂解位點之rNDV 在NDV Hitchner B1病毒株之F裂解位點處具有2個或3個胺基酸突變之重組NDV病毒rNDV/F2aa及rNDV/F3aa病毒係藉由反向遺傳學來產生。簡言之，為產生rNDV/F2aa，PCR片段係藉由使用引子，前向：F2aa－1(＋)5'－GGA TCC CGG TTG GCG CCC TCC AGG(SEQ ID NO：24)及反向F2aa－1(－)5'－AAG GCG CCt CTG TCT CCg CC C TCC AGA TGT AGT CAC AG－3'(SEQ ID NO：25)且使用全長NDV B1純系，質體pT7NDV/B1作為模板來產生。下一PCR片段係藉由使用引子，前向F2aa－2(＋)5'－GGc GGA GAC AGa GGC GCC TT A TAG GCG CCA TTA TTG G－3'(SEQ ID NO：26)及反向F2aa－2(－)5'－CCA TAT TCC CAC CAG CTA GAT TGT－3'(SEQ ID NO：27)且使用pT7NDV/B1作為模板來產生。以小寫字體來展示之核苷酸經突變以修飾來自NDV/B1病毒株(GGRQGR↓L)至GRRQR R↓L之F蛋白之裂解位點的胺基酸序列。該兩個重疊PCR片段(在引子序列中，重疊係經下劃線的)係藉由PCR，使用引子F2aa－1(＋)及F2aa－2(－)來組合。將所得的含有全部F基因之PCR片段選殖至pSL1180中(Amersham Pharmacia Biotech)且命名為pSLF2aa。pSLF2aa之StuI －NotI 片段(nt 4646至4952)經切除以置換在pT7NDV/B1質體中之對應片段，使得用以藉由反向遺傳學來產生rNDV/F2aa病毒之pT7NDV/F2aa質體形成。為產生rNDV/F3aa，PCR突變係藉由如上文所述之相同策略使用引子，前向F3aa－1(＋)5'－GGA TCC CGG TTG GCG CCC TCC AGG－3'(SEQ ID NO：28)；反向F3aa－1(－)5'－AAa GCG CCt CTG TCT CCg CC C TCC AGA TGT AGT CAC AG－3'(SEQ ID NO：29)；前向F3aa－2(＋)5'－GGc GGA GAC AGa GGC GCt TT A TAG GCG CCA TTA TTG G－3'(SEQ ID NO：30)；反向F3aa－2(－)5'－CCA TAT TCC CAC CAG CTA GAT TGT－3'(SEQ ID NO：31)(突變核苷酸以小寫字體來指示)且使用pT7NDV/B1作為模板來來執行。該兩個重疊PCR片段(在引子序列中，重疊區係經下劃線的)係藉由PCR使用引子F3aa－1(＋)及F3aa－2(－)來組合，產生自GGRQGR↓L至GR RQR R↓F 之裂解位點的修飾。pSLF3aa之Stu I－Not I片段(nt 4646至4952)經切除以置換在pT7NDV/B1質體中之對應片段，使得用以產生rNDV/F3aa病毒的pT7NDV/F3aa質體之形成。
6.3.1.2表現嵌合H7 HA蛋白之基因融合rNDV載體之產生 為建構作為rNDV/F3aa基因組之額外轉錄單元之嵌合H7 HA基因，含有NDV F基因之跨膜(TM)及細胞質尾部(CYTO)的片段最初係藉由PCR使用引子Hpa NDV F(TM＋CYTO)P，5'－cgGT TAA CCT CAT TAC CTA TAT CGT TTT GAC T－3'(SEQ ID NO：32)及SacNhe NDVF(TM＋CYTO)M，5'－cg GAG CTC AAG CTA GCT TAT CAC ATT TTT GTA GTG GCT CTC ATC TG－3'(SEQ ID NO：33)且使用含有NDV F基因之質體作為模板來產生。用Sac I 及Hpa I 來消化該PCR產物且隨後將其選殖至具有NDV之基因末端及基因起始信號的質體pNhe －NDV－GE/GS中，使得質體pNhe －NDV－GE/GS－NDVF(TM＋CYTO)形成。作為下一步驟，容許含有H7 HA胞外域之片段與NDV F之TM及CYTO區域之片段的連接，H7HA胞外域係藉由PCR使用引子Spe H7(ECTO)P，5'－cgACT AGT CCG CCA CCA TGA ACA CTC AAA TTC TGG CAT TCA T－5'(SEQ ID NO：34)，Hpa H7(ECTO)M，5'－cgG TTA ACG TCT TTG TAT CCA CTA CTC AAT TTC AC－3'(SEQ ID NO：35)且使用含有來自A/雞/NY/13142－5/94(H7N2)之H7 HA之質體作為模板來產生。用Spe I 及Hpa I 來消化該PCR產物且隨後將其插入卡匣質體pNhe －NDV－GE/GS－NDVF(TM＋CYTO)中。在最終步驟中，用Nhe I 來消化卡匣質體pNhe －NDV－GE/GS－NDV F(TM＋CYTO)以切掉嵌合H7 HA基因。將該片段DNA選殖於pT7NDV/F3aa之P基因與M基因之間，形成pT7NDV/F3aa嵌合H7。隨後，使用如上所述之方法，自pT7NDV/F3aa嵌合H7救援表現嵌合H7 HA蛋白質之rNDV/F3aa病毒。
6.3.1.3病毒生長動力學 將rNDV/B1、rNDV/F2aa、rNDV/F3aa、rNDV/B1－H7或rNDV/F3aa嵌合H7病毒(100 PFU/卵)接種至10天大之受精雞卵中。在不同時間點(24hrs、48hrs及72 hrs)收穫尿囊液以測定病毒力價。存在於尿囊液中之各病毒的50%組織培養感染劑量(TCID50 )係藉由免疫螢光檢定(IFA)來測定。為此目的，用連續10倍稀釋之樣本來感染含有Vero細胞96孔板，且藉由IFA來測定NDV蛋白質或嵌合H7 HA蛋白質之存在。
6.3.2免疫螢光檢定6.3.2.1免疫螢光檢定 固定由轉染流感病毒所感染之MDCK細胞且用冰冷的甲醇來滲透。用抗NDV HN單株抗體(7B1)、抗流感H1 HA單株抗體(2G9)及抗流感H5 HA多株血清來偵測病毒抗原。為分析NDV生長及病毒蛋白質表現，用重組病毒來感染長滿Vero細胞且在不同時間點(24、48及72 hrs)收穫。用含有0.1% Triton X－100之2.5%甲醛來固定受感染細胞。用抗兔NDV多株抗體或抗雞AIV H7多株血清來處理經固定之細胞、將其洗滌且用AIV H7 HA蛋白質之經螢光異硫氰酸鹽(FITC)共軛之抗雞免疫球蛋白(DAKO)或NDV病毒蛋白質之經Texas Red共軛之抗兔免疫球蛋白(Molecular Probe)來染色。病毒蛋白質表現係藉由螢光顯微鏡術來檢查。
6.3.2.2平均死亡時間 為核對在受精雞卵中重組病毒之病原性，測定平均死亡時間(MDT)。簡言之，用連續10倍稀釋之病毒來感染5個10天大之受精雞卵。在37℃下培育卵且每天監視兩次歷時7天。記錄殺死胚胎之時間。將殺死全部胚胎之最高稀釋液測定為最小致死劑量。計算MDT作為最小致死劑量殺死胚胎之平均時間。
6.3.2.3雞之免疫及攻毒 藉由於結膜囊中的具有105.7－6.1 平均雞胚胎感染性劑量(EID50 )之rNDV/F3aa嵌合H7的眼藥水疫苗接種白色來亨雞(Leghorn chicken)一或兩次，或在2及4週齡時，藉由具有105.7－6.3 EID50之親代NDV/B1(pNDV)之眼藥水接種兩次，或藉由具有無菌組織培養基(sham)之眼藥水接種兩次。在6週齡時，用強毒NDV(vvNDV)之Fontana病毒株(每隻鳥105.1 EID50 )或A/人類/Steele/59(H7N7)HPAI(每隻鳥105.1 EID50 )經鼻內攻毒。使存活者流血且攻毒後14天實施安樂死。使用標準程序來測定血球凝集抑制(HI)血清力價。
6.3.3結果6.3.3.1基因融合rNDV突變體之產生 為改良rNDV骨架之基因融合特徵，開發兩種rNDV突變體，rNDV/F2aa及rNDV/F3aa病毒，其中F蛋白之裂解位點係由兩種可藉由廣泛表現蛋白酶(例如，弗林蛋白酶(furin protease))來活化之不同多鹼基裂解位點之一者來置換(圖8A)。用rNDV/F2aa及rNDV/F3aa而不用rNDV/B1來感染雞胚胎成纖維細胞(CEF)在缺少外原添加蛋白酶時造成合胞體形成(圖8B)。另外，rNDV/F3aa比rNDV/F2aa更快速地在CEF細胞中誘發合胞體。因此，假定病毒在受免疫動物中之經改良傳播可增強抵抗所插入之外來蛋白質的免疫原性。因此，基因融合rNDV/F3aa經選擇作為骨架載體以發展經設計以保護家禽抵抗AIV及NDV之二價疫苗。
6.3.3.2受精雞卵中之rNDV平臺載體之平均死亡時間分析 NDV可根據其對雞之病原性而分為高度有毒的(強毒的)、中等有毒的(中間毒的)或無毒的(弱毒的)。因為已知具有多鹼基裂解位點之F蛋白之存在為NDV毒性因子，所以吾人在10天大之受精雞卵中評估具有經修飾F蛋白之rNDV的病原性。由NDV感染之雞胚胎之平均死亡時間(MDT)與活體內之毒性相關。弱毒病毒株(在鳥中引起無症狀感染)之特徵為大於90 hrs之MDT，中間毒病毒株(在鳥中引起呼吸道疾病)具有介於60至90 hrs之間的MDT且強毒病毒株(在鳥中引起嚴重疾病)具有60 hrs以下之MDT。rNDV/F2aa之MDT指示弱毒病毒株，而F3aa/rNDV之彼者為典型的中間毒病毒株。該等病毒株無一者具有典型高病原性(強毒的)病毒株(表2)。
基於該等資料，rNDV/F3aa載體將不表示對鳥之威脅且因此適合作為骨架以發展二價疫苗以用於保護家禽抵抗AIV及NDV。
6.3.3.3表現AIV HA蛋白之胞外域的基因融合rNDV載體之產生 如上文所述，將編碼來自A/雞/NY/13142－5/94(H7N2)之H7HA蛋白之基因併入rNDV/F3aa載體中，導致rNDV/F3aa嵌合H7形成(圖9A)將rNDV/F3aa嵌合H7在受精雞卵中之生長動力學與親代rNDV/F3aa之彼者相比較(圖9B)。表現嵌合H7HA蛋白之病毒比無插入物之病毒生長更慢且最大力價為約一個對數值更低。有趣地，該病毒之MDT為弱毒病毒株之MDT(128~140 hrs)(表2)。來自rNDV/F3aa嵌合H7之嵌合H7 HA蛋白之表現係藉由感染後36 hrs的受感染之Vero細胞之西方墨點法來確認(圖9C)。
6.3.3.4 AIV H7 HA蛋白向rNDV病毒粒子中之改良併入 為測定含有NDVF蛋白之異源跨膜及細胞質尾部區域之嵌合H7 HA蛋白質的表現是否與增強向rNDV病毒粒子中之併入相關，如在§6.3中所述來純化rNDV/B1－H7及rNDV/F3aa嵌合H7病毒粒子。來自rNDV/B1－H7或rNDV/F3aa嵌合H7之H7HA蛋白或NDV病毒蛋白之量係藉由西方墨點法使用抗雞AIV H7多株抗體或抗兔NDV多株血清來量測。如所預期的，與wt H7 HA蛋白之彼者相比，嵌合H7 HA蛋白質向rNDV病毒粒子中之併入顯著地增加(圖9D)。該資料提示：NDVF蛋白之跨膜及細胞質尾部區域在外來蛋白質向病毒表面中之改良併入中起主要作用。
6.3.3.5雞之免疫及攻毒 在一或兩次用rNDV/F3aa嵌合H7之疫苗接種後，50－80%之雞具有對H7 AIV之血球凝集抑制(HI)力價且90－100%之雞具有對NDV之HI力價(表3A及B)。雖然所有由親代NDV/B1(pNDV)免疫兩次之雞具有對NDV之HI力價但無一者具有對H7 AIV之力價。所有經無菌組織培養基(sham)感染之鳥缺乏對病毒之任一者之HI力價。當用vvNDV攻毒時，經100%之rNDV/F3aa嵌合H7及pNDV來免疫之雞受保護。相比而言，經90%之rNDV/F3aa嵌合H7疫苗接種之雞受保護而避免HPAI H7病毒，但無一隻經pNDV疫苗接種之雞受保護而避免HPAI H7病毒。相反，當分別由vvNDV及HPAI H7病毒攻毒時，經100%及70%之sham感染之鳥死亡。除3隻在sham－HPAI H7病毒攻毒群中之無受感染之血清學證據的存活者外，存活者由於對各別攻毒病毒之HI力價之四倍或更大升高而出現明顯之健忘性反應。
Sham＝無菌組織培養流體HPAIV＝A/人類/Steele/59(H7N7)病毒HI血清學展示為具有由HI－陽性血清之雞的數量/經疫苗接種之雞的數量；括號中之值為幾何平均力價(GMT)＊ n＝每群10隻鳥，1X＝1次疫苗接種，2X＝2次疫苗接種在PNAS 103：8203－8208(2006)中，藉由Man－Seong Park等人之以"Engineered Viral Vaccine COnstructs with Dual Specificity：Avian Influenza and Newcastle Disease,"為標題之公開案係以引用之方式全部併入本文中。
6.4等效物
本發明並非由所述之特定實施例來限制範疇，該等實施例欲作為本發明之個體態樣之單獨說明，且功能等效方法及組分係在本發明之範疇內。當然，除本文中所展示及描述之彼等外，對熟習此項技術者而言，本發明之各種修改自先前描述及伴隨圖示而變得顯而易見。該等修改意欲落在附加申請專利範圍之範疇內。
在該申請案之通篇中，引用各種公開案。其內容在此以引用之方式全部併入本申請案中以用於所有目的。
圖1. 雜交NAf－HN構築體之圖示 構築體編碼WSN NA vRNA之3'非編碼區、對應於NA蛋白之細胞質尾部及跨膜域加上NA胞外域之第一胺基酸之NA編碼區、NDV B1 HN蛋白(僅胞外域)之編碼區之核苷酸，兩個連續終止密碼子，WSN NA閱讀框架及WSN vRNA之5'非編碼區之未轉譯核苷酸。
圖2. HA之多鹼基胺基酸序列改變之圖示 識別為H5N1 HA之核苷酸序列表示流感A/Vietnam/1203/04(H5N1)之HA表面糖蛋白之開放閱讀框架的核苷酸1013－1045(SEQ ID NO：13；胺基酸序列SEQ ID NO：14)。核苷酸1026－1038係使用切除PCR及定點突變，藉由單一核苷酸胞嘧啶來置換，從而產生無毒力HA之核苷酸序列(SEQ ID NO：15；胺基酸序列SEQ ID NO：16)。序列改變對應於用單一胺基酸蘇胺酸置換5個胺基酸之多鹼基序列。
圖3. HA之核酸序列改變之圖示 識別為無毒力HA之序列表示基於無毒力流感A/Vietnam/1203/04(H5N1)之HA蛋白之一致序列的HA表面糖蛋白之開放閱讀框架之核苷酸1013－1033(SEQ ID NO：15；胺基酸序列SEQ ID NO：16)。劃線之腺苷殘基經置換以便突變為同義的，從而產生核苷酸序列SEQ ID NO：17及胺基酸序列SEQ ID NO：16。
圖4A－D. pPol1VN1203 NS截短突變株之圖解 A.H5N1之NS基因區段之編碼區為833個核苷酸。B.pPol1VN1203 NS1－126構築體自編碼區之核苷酸379－456缺失NS基因，插入3個終止密碼子及Bgl II限制性位點。C.pPol1VN1203 NS1－99構築體自編碼區之核苷酸298－456缺失NS基因，插入4個終止密碼子、Bgl II限制性位點及PacI限制性位點。D .pPol1VN1203 NS1－73構築體自編碼區之核苷酸219－456缺失NS基因，插入4個終止密碼子、Bgl II限制性位點及Pac I限制性位點。
圖5. pNDV/B1之圖解 所描述之序列在3'末端處由T7啟動子側接且在5'末端處由HDV核糖核酸酶及T7終止子側接。在P基因與M基因之間的插入位點包括獨特的XbaI限制性位點。
圖6. 嵌合rNDV病毒中之KGFR表現之西方墨點分析(Western Blot Analysis) 嵌合病毒rNDV(通道1)、rNDV－KGFR(通道2)及rNDV－KGFR/F－CT(通道3)係在10天大之受精雞卵中生長。使用鼠類抗KGFR及抗小鼠HRPO分別作為第一及第二抗體使經純化之病毒經受西方墨點分析。
圖7. 嵌合rNDV病毒中之H7 HA表現之西方墨點分析 嵌合病毒rNDV(通道1)、rNDV－KGFR(通道2)及rNDV－KGFR/F－CT(通道3)係在10天大之受精雞卵中生長。使用鼠類抗KGFR及抗小鼠HRPO分別作為第一及第二抗體使經純化之病毒經受西方墨點分析。
圖8. rNDV之F蛋白之裂解位點的修飾 (A)在其F蛋白之裂解位點中具有兩個或三個胺基酸改變之rNDV/B1基因組之圖示。在F蛋白中裂解之肽鍵係以斜線指示。(B)CEF細胞中之合胞體形成係藉由具有經修飾之F蛋白的rNDV來感染。CEF細胞係用rNDV/B1、rNDV/F2aa及rNDV/F3aa病毒以0.001之病毒感染劑量來感染。每24小時藉由免疫螢光檢定來監視病毒傳播。
圖9. 表現HPAI H7 HA蛋白之基因融合rNDV載體之建構及表徵。
(A)表現GE/GS、Kozak及部分H7 HA序列(SEQ ID NO：36)之rNDV/F3aa嵌合H7 cDNA構築體之圖示。(B)病毒生長動力學之比較，Log TCID相對接種後之時間(hrs)。正方形，rNDV/B1；三角形，rNDV/F3aa；粗體星號，rNDV/B1－H7；星號，rNDV/F3aa嵌合H7。(C)由rNDV感染之細胞中之WT H7 HA蛋白或嵌合H7 HA蛋白之表現。通道1，模擬感染；通道2，rNDV/F3aa；通道3，rNDV/B1－H7；通道4，rNDV/F3aa嵌合H7。列1，α－禽類H7；列2，α－NDV。(D)與WT H7 HA蛋白於rNDV病毒粒子中之結合相比，嵌合H7 HA蛋白質於病毒粒子中之結合增加。通道1，rNDV/B1－H7；rNDV/F3aa嵌合H7。列1，α－禽類h7；列2，α－NDV。
<110> 美國紐約大學西奈山醫學中心<120> 表現非原生表面蛋白質之嵌合病毒及其用途<130> 6923－130－228 <140> 095144777 <141> 2006－12－01 <150> 60/741,833 <151> 2005－12－02 <150> 60/802,864 <151> 2006－05－22 <160> 36 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 823 <212> DNA <213> 流感A病毒<220> <223> 流感A病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))非結構蛋白質2(NS)基因<400> 1<210> 2 <211> 982 <212> DNA <213> 流感A病毒<220> <223> 流感A病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))膜離子通道2及基質蛋白質1(M)基因<400> 2 <210> 3 <211> 1485 <212> DNA <213> 流感A病毒<220> <223> 流感A病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))核鞘蛋白(NP)基因<400> 3<210> 4 <211> 1707 <212> DNA <213> 流感A病毒<220> <223> 流感A病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))血球凝集案HA基因<400> 4<210> 5 <211> 1350 <212> DNA <213> 流感A病毒<220> <223> 流感A病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))神經胺酸酶(NA)基因<400> 5 <210> 6 <211> 2151 <212> DNA <213> 流感A病毒<220> <223> 流感A病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))聚合酶蛋白質PA基因<400> 6<210> 7 <211> 2274 <212> DNA <213> 流感A病毒<220> <223> 流感A病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))聚合酶蛋白質PB1基因<400> 7<210> 8 <211> 2280 <212> DNA <213> 流感A病毒<220> <223> 流感A病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))聚合酶鹼基次單位2(PB2)基因<400> 8 <210> 9 <211> 1409 <212> DNA <213> 流感A病毒<220> <223> 流感A病毒(A/WSN/1933(H1N1))神經胺酸酶基因<400> 9 <210> 10 <211> 15186 <212> DNA <213> 新城病病毒<220> <223> 新城病病毒B1基因組<400> 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 直接在HA裂解位點前之區域中的基於流感A H5之無毒力禽類病毒株之一致序列<400> 11<210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 直接在HA裂解位點前之區域中的基於流感A H5之無毒力禽類病毒株之經改變之一致序列<400> 12<210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 直接在HA裂解位點前之區域中的基於流感A H5之無毒力禽類病毒株之一致序列<400> 13<210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 直接在HA裂解位點前之區域中的基於流感A H5之無毒力禽類病毒株之一致序列<400> 14<210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 直接在HA裂解位點前之區域中的基於流感A H5之無毒力禽類病毒株之經改變之一致序列<400> 15<210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 直接在HA裂解位點前之區域中的基於流感A H5之無毒力禽類病毒株之一致序列<400> 16<210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 直接在HA裂解位點前之區域中的基於流感A H5之無毒力禽類病毒株之經進一步改變的DNA一致序列<400> 17<210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 經工程化成作為額外轉錄單元而插入NDV中之基因的“基因末端”序列<400> 18<210> 19 <211> 10 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 經工程化成作為額外轉錄單元而插入至NDV中之基因的“基因起始”序列<400> 19<210> 20 <211> 74 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生H5 HA基因之胞外域(ECT0)之PCR引子<400> 20<210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生H5 HA基因之胞外域(ECT0)之PCR引子<400> 21<210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以放大NDVF基因之TM及CT之PCR引子<400> 22<210> 23 <211> 46 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以放大NDVF基因之TM及CT之PCR引子<400> 23<210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生rNDV/F2aa之前向引子F2aa－1(＋) <400> 24<210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生rNDV/F2aa之反向引子F2aa－1(－) <400> 25<210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生rNDV/F2aa之前向引子F2aa－2(＋) <400> 26<210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生rNDV/F2aa之反向引子F2aa－2(－) <400> 27<210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生rNDV/F3aa之前向引子F3aa－1(＋) <400> 28<210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生rNDV/F3aa之反向引子F3aa－1(－) <400> 29<210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生rNDV/F3aa之前向引子F3aa－2(＋) <400> 30<210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生rNDV/F3aa之反向引子F3aa－2(－) <400> 31<210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生嵌合H7HA基因之HpaNdv F(TM＋CYT0)P引子<400> 32<210> 33 <211> 46 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生嵌合H7HA基因之SacNheNDVF(TM＋CYT0)M引子<400> 33<210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生嵌合H7HA基因之SpeH7(ECT0)P引子<400> 34<210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用以產生嵌合H7HA基因之HpaH7(ECT0)M引子<400> 35<210> 36 <211> 52 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 具有GE/GS及Kozak序列之粒子H7HA <400> 36

Claims (46)

  1. 一種嵌合NDV(新城病病毒)，其包括一包含以下序列之經包套的基因組：a.編碼F-融合蛋白質之核苷酸序列，該F-融合蛋白質具有NDV之F蛋白之跨膜域及細胞質域及感染因子之保護性抗原的胞外域之至少一個抗原決定基或與疾病相關之藉由C-末端來固定之抗原的胞外域之至少一個抗原決定基，如此該F-融合蛋白質可經表現且可併入至該嵌合NDV中，及其中該抗原不為副黏液病毒抗原；或b.編碼HN-融合蛋白質之核苷酸序列，該HN-融合蛋白質具有NDV之HN蛋白之跨膜域及細胞質域及感染因子之保護性抗原的胞外域之至少一個抗原決定基或與疾病相關之藉由N-末端來固定之抗原的胞外域之至少一個抗原決定基，如此該HN-融合蛋白質可經表現且可併入至該嵌合NDV中，其中該抗原不為副黏液病毒抗原，及其中該HN-融合蛋白質不包含該HN蛋白胞外域之胺基酸殘基或包含該HN蛋白胞外域之片段，其中該片段不保留HN蛋白胞外域活性。
  2. 如請求項1之嵌合NDV，其包含編碼F-融合蛋白質之核苷酸序列，該F-融合蛋白質具有NDV之F蛋白之跨膜域及細胞質域及感染因子之保護性抗原的胞外域之至少一個抗原決定基或與疾病相關之藉由C-末端來固定之抗原的胞外域之至少一個抗原決定基，如此該F-融合蛋白質可經表現且可併入至該嵌合NDV中，及其中該抗原不為副 黏液病毒抗原。
  3. 如請求項1之嵌合NDV，其包含編碼HN-融合蛋白質之核苷酸序列，該HN-融合蛋白質具有NDV之HN蛋白之跨膜域及細胞質域及感染因子之保護性抗原的胞外域之至少一個抗原決定基或與疾病相關之藉由N-末端來固定之抗原的胞外域之至少一個抗原決定基，如此該HN-融合蛋白質可經表現且可併入至該嵌合NDV中，其中該抗原不為副黏液病毒抗原。
  4. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該基因組包括編碼HN蛋白質之核苷酸序列，如此該HN蛋白質可經表現且可併入至該嵌合NDV中。
  5. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該基因組包括一編碼F蛋白之核苷酸序列，如此該F蛋白可經表現且可併入該嵌合NDV中。
  6. 如請求項1或2之嵌合NDV，其中編碼該F-融合蛋白質之該核苷酸序列置換編碼該NDV F蛋白之該核苷酸序列，且該F-融合蛋白質提供該F蛋白之功能。
  7. 如請求項1或3之嵌合NDV，其中該編碼HN-融合蛋白質之核苷酸序列置換該編碼NDV HN蛋白質之核苷酸序列，且該HN-融合蛋白質供應該HN蛋白質之功用。
  8. 如請求項1或2之嵌合NDV，其中該抗原為流感病毒之血球凝集素抗原之胞外域。
  9. 如請求項1或3之嵌合NDV，其中該抗原為流感病毒之神經胺酸酶抗原之胞外域。
  10. 如請求項8之嵌合NDV，其中該流感病毒為禽流感病毒。
  11. 如請求項9之嵌合NDV，其中該流感病毒為禽流感病毒。
  12. 如請求項1或2之嵌合NDV，其中該F-融合蛋白質之跨膜域及細胞質域係來自NDV病毒株LaSota。
  13. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該基因組包含編碼F蛋白之核苷酸序列，其中F蛋白係在裂解位點經遺傳修飾以增加基因融合活性，如此該F蛋白可經表現且可併入至該嵌合NDV中。
  14. 如請求項13之嵌合NDV，其中該經遺傳修飾之裂解位點包含多鹼基裂解位點。
  15. 如請求項1或2之嵌合NDV，其中該F-融合蛋白質不包含該F蛋白胞外域之胺基酸殘基或包含該F蛋白胞外域之片段，其中該片段不保留F蛋白胞外域活性。
  16. 如請求項1或2之嵌合NDV，其中該F-融合蛋白質包括NDV F蛋白之胞外域之1至15個直接相鄰殘基。
  17. 如請求項1或3之嵌合NDV，其中該HN-融合蛋白質包括NDV HN蛋白之胞外域之1至15個直接相鄰殘基。
  18. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該編碼融合蛋白之序列係插入至NDV基因組之P及M基因之間。
  19. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該嵌合NDV為經減毒者。
  20. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該感染因子為 腺病毒科(adenoviridae)成員、疱疹病毒科(herpesviridae)成員、光滑噬菌體科(leviviridae)成員、痘病毒科(poxviridae)成員、小核醣核酸病毒科(picornaviridae)成員、乳多空病毒科(papovaviridae)成員、呼腸孤病毒科(reoviridae)成員、反轉錄病毒科(retroviridae)成員、黃病毒科(flaviviridae)成員、披衣病毒科(togaviridae)成員、肝炎病毒科(hepadnaviridae)成員、彈狀病毒科(rhabdoviridae)成員、沙狀病毒科(arenaviridae)成員或冠狀病毒科(coronaviridae)成員。
  21. 如請求項20之嵌合NDV，其中(a)該腺病毒科成員係巨大腺病毒(mastadenovirus)或禽類腺病毒(aviadenovirus)；(b)該疱疹病毒科成員係疱疹單純型病毒(herpes simplex virus)1、疱疹單純型病毒2、疱疹單純型病毒5、疱疹單純型病毒6、愛波斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、HHV6-HHV8或巨細胞病毒(cytomegalovirus)；(c)該光滑噬菌體科成員係光滑噬菌體屬(levivirus)、腸內細菌(enterobacteria)相MS2或異光滑噬菌體(allolevirus)；(d)該痘病毒科成員係脊椎動物痘病毒亞科(chordopoxvirinae)、副痘病毒屬(parapoxvirus)、禽痘病毒屬(avipoxvirus)、山羊痘病毒屬(capripoxvirus)、野兔痘病毒屬(leporiipoxvirus)、豬痘病毒屬(suipoxvirus)、軟疣痘病毒屬(molluscipoxvirus)或昆蟲痘病毒亞科 (entomopoxvirinae)；(e)該乳多空病毒科成員係多瘤病毒屬(polyomavirus)或乳頭狀瘤病毒屬(papillomavirus)；(f)該小核醣核酸病毒科成員係腸病毒(enterovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、肝病毒(hepatovirus)、心病毒(cardiovirus)或口蹄疫病毒(apthovirus)；(g)該呼腸孤病毒科成員係正理奧病毒(orthoreovirus)、環狀病毒(orbivirus)、輪狀病毒(rotavirus)、質型多角體病毒屬(cypovirus)、甘蔗斐濟病毒(fijivirus)、水稻萎縮病毒(phytoreovirus)或水稻病毒屬(oryzavirus)；(h)該反轉錄病毒科成員係哺乳動物B型反轉錄病毒(mammalian type B retrovirus)、哺乳動物C型反轉錄病毒、禽類C型反轉錄病毒、D型反轉錄病毒群、BLV-HTLV反轉錄病毒或慢病毒(lentivirus)；(i)該黃病毒科成員係肝炎C病毒(hepatitis C virus)、登革熱病毒(dengue virus)或西尼羅病毒(West Nile virus)；(j)該肝炎病毒科成員係肝炎B病毒(hepatitis B virus)；(k)該披衣病毒科成員係甲病毒屬(alphavirus)或風疹病毒屬(rubivirus)；(l)該彈狀病毒科成員係水泡病毒屬(vesiculovirus)、狂犬病毒屬(lyssavirus)、短暫熱病毒屬(ephemerovirus)、質型彈狀病毒屬(cytorhabdovirus)或necleorhabdovirus)；(m)該沙狀病毒科成員係沙狀病毒(arenavirus)、淋巴 球性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、Ippy病毒或拉沙病毒(lassa virus)；或(n)該冠狀病毒科成員係冠狀病毒(coronavirus)或托羅病毒(torovirus)。
  22. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該感染因子為細菌。
  23. 如請求項22之嵌合NDV，其中該細菌係水生螺旋菌(Aquaspirillum)科成員、固氮螺旋菌(Azospirillum)科成員、固氮菌(Azotobacteraceae)科成員、擬桿菌(Bacteroidaceae)科成員、噬食弧菌(Bdellovibrio)科成員、腸內菌(Enterobacteriaceae)科成員、Gardinella科成員、鹽桿菌(Halobacteriaceae)科成員、螺旋桿菌(Helicobacter)科成員、Legionallaceae科成員、甲基單孢菌(Methylococcaceae)科成員、奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)科成員、海洋螺菌(Oceanospirillum)科成員、巴斯德菌(Pasteurellaceae)科成員、根瘤菌(Rhizobiaceae)科成員、螺旋菌(Spirillum)科成員、Spirosomaceae科成員、Vampirovibr Helicobacter科成員、耶爾森氏菌(Yersinia)科成員或黏球菌(Vampirovibrio)科成員。
  24. 如請求項23之嵌合NDV，其中該腸內菌科成員係檸檬酸桿菌(Citrobacter)種、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、產氣桿菌(Enterobacter aerogenes)、伊文氏桿菌(Erwinia)種、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、哈佛尼亞菌 (Hafnia)種、克雷伯氏菌(Klebsiella)種、莫根氏桿菌(Morganella)種、普通變型桿菌(Proteus vulgaris)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙門氏菌(Salmonella)種、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)或弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)。
  25. 如請求項22之嵌合NDV，其中該細菌係炭疽桿菌(Bacillus antracis)、巴東體(Bartonella)種、曲桿菌(Campylobacter)種、披衣菌(Chlamydia)種、梭菌屬(clostridium)、流感桿菌(Haemophilus influenzae)、李氏菌(Listeria)種、分枝桿菌科(mycobacteria)、肺炎球菌(Pneumococcus)種、假單胞菌(Pseudomonas)種、葡萄球菌(Staphylococcus)或鏈球菌(Streptococcus)。
  26. 如請求項25之嵌合NDV，其中(a)該披衣菌種係肺炎披衣菌(Chlamydia pneumoniae)；(b)該分枝桿菌科係結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)；(c)該葡萄球菌係抗二甲氧苯青黴素金黃素葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus)或釀膿葡萄球菌(Staphylococcus pyrogenes)；或(d)該鏈球菌係腸炎鏈球菌(Streptococcus enteritidis)、膜鏈球菌(Streptococcus fasciae)或肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。
  27. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該感染因子為 寄生蟲。
  28. 如請求項27之嵌合NDV，其中該寄生蟲係阿米巴原蟲(amoeba)、瘧原蟲(malarial parasite)、瘧原蟲(Plasmodium)或克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)。
  29. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該感染因子為真菌。
  30. 如請求項29之嵌合NDV，其中該真菌係棘子鬚黴菌(Absidia)種、麴菌(Aspergillus)種、蛙糞黴菌(Basidiobolus ranarum)、皮炎芽生黴菌(Blastomyces dermatitidis)、念珠菌(Candida)種、粗球黴菌(Coccidioides immitis)、耳黴(Conidiobolus)種、新型隱球菌(Cryptococcus neoforms)、小克銀漢黴(Cunninghamella)種、皮癬菌(dermatophytes)、半知菌(Deuteromycetes)、莢膜組織漿菌(Histoplasma capsulatum)、石膏樣小芽胞菌(Microsporum gypseum)、渺小白黴(Mucor pusillus)、卵菌綱(Oomycetes)、巴西副球黴菌(Paracoccidioides brasiliensis)、假性黴(Pseudallescheria boydii)、西氏鼻芽孢菌(Rhinosporidium seeberi)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、根黴菌(Rhizopus)種、植酵母(Saccharomyces)種、申克氏孢子絲菌(Sporothrix schenckii)或接合菌類(zygomycetes)。
  31. 如請求項30之嵌合NDV，其中(a)該棘子鬚黴菌種係傘枝犁頭黴(Absidia corymbifera) 或分棘狀棘子鬚黴菌(Absidia ramosa)；(b)該麴菌種係黃麴菌(Aspergillus flavus)、薰煙色麴菌(Aspergillus fumigatus)、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)、黑色麴菌(Aspergillus niger)或土黴菌(Aspergillus terreus)；(c)該念珠菌種係白色念珠菌(Candida albicans)、禿發念珠菌(Candida glabrata)、克爾念珠菌(Candida kerr)、克魯塞念珠菌(Candida krusei)、副口炎念珠菌(Candida parapsilosis)、偽熱帶念珠菌(Candida pseudotropicalis)、Candida quillermondii、皺褶念珠菌(Candida rugosa)、類星形念珠菌(Candida stellatoidea)或熱帶念珠菌(Candida tropicalis)；或(d)該根黴菌種係鬚根黴菌(Rhizopus arrhizus)、米根黴(Rhizopus oryzae)或小芽孢酒麴菌(Rhizopus microsporus)。
  32. 如請求項1至3中任一項之嵌合NDV，其中該嵌合NDV骨架為NDV病毒株LaSota。
  33. 一種免疫原性調配物，其包括如請求項1至32中任一項之嵌合NDV。
  34. 如請求項33之免疫原性調配物，其用於預防與病毒感染相關之疾病，其中該病毒感染為NDV感染及/或由感染因子引起之病毒感染。
  35. 如請求項34之免疫原性調配物，其中該病毒感染為NDV感染。
  36. 如請求項34或35之免疫原性調配物，其中該病毒感染為流感病毒感染。
  37. 如請求項33之免疫原性調配物，其係用於誘發禽類對NDV及感染因子之抗原或與疾病相關之抗原之免疫反應。
  38. 如請求項33之免疫原性調配物，其係用於誘發人類對感染因子之抗原或與疾病相關之抗原之免疫反應。
  39. 一種如請求項1至32中任一項之嵌合NDV之用途，其係用以製備用於誘發禽類對NDV及感染因子之抗原或與疾病相關之抗原之免疫反應之藥物。
  40. 一種如請求項1至32中任一項之嵌合NDV之用途，其係用以製備用於誘發人類對感染因子之抗原或與疾病相關之抗原之免疫反應之藥物。
  41. 一種如請求項1至32中任一項之嵌合NDV之用途，其係用以製備用於預防與病毒感染相關之疾病之藥物，其中該病毒感染係NDV感染及/或由感染因子引起之病毒感染。
  42. 如請求項41之用途，其中該病毒感染為NDV感染。
  43. 如請求項41或42之用途，其中該病毒感染為流感病毒感染。
  44. 一種產生免疫原性組合物之方法，該方法包括：(a)在一非人類受精卵或在一易受NDV感染之細胞株中繁殖如請求項1至32中任一項之嵌合NDV；及(b)收集子代病毒， 其中，該病毒生長至足夠數量且係處於該病毒免受污染之充分條件下，如此該子代病毒適於調配入免疫原性組合物中。
  45. 如請求項44之方法，其中該受精卵為雞卵。
  46. 一種重組DNA分子，其編碼如請求項1至32中任一項之嵌合NDV。
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