EA016217B1 - Химерные вирусы, представляющие неприродные поверхностные белки, и их применение - Google Patents

Химерные вирусы, представляющие неприродные поверхностные белки, и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA016217B1
EA016217B1 EA200801501A EA200801501A EA016217B1 EA 016217 B1 EA016217 B1 EA 016217B1 EA 200801501 A EA200801501 A EA 200801501A EA 200801501 A EA200801501 A EA 200801501A EA 016217 B1 EA016217 B1 EA 016217B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
virus
chimeric
influenza virus
present
Prior art date
Application number
EA200801501A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801501A1 (ru
Inventor
Питер Пейлиз
Адольфо Гастрия-Састре
Original Assignee
Маунт Синай Скул Оф Медсин
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38092581&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA016217(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Маунт Синай Скул Оф Медсин filed Critical Маунт Синай Скул Оф Медсин
Publication of EA200801501A1 publication Critical patent/EA200801501A1/ru
Publication of EA016217B1 publication Critical patent/EA016217B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • C07K14/125—Newcastle disease virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к химерным вирусам, содержащим негативную нить РНК, которые делают возможной иммунизацию индивида, например птицы, против двух инфекционных агентов, используя один химерный вирус по настоящему изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к химерным вирусам гриппа, разработанным таким образом, что они экспрессируют и встраивают в свои вирионы слитый белок, содержащий эктодомен белка инфекционного агента и трансмембранный и цитоплазматический домены белка вируса гриппа. Такие химерные вирусы индуцируют иммунный ответ против вируса гриппа и инфекционного агента. Настоящее изобретение также относится к химерным вирусам псевдочумы птиц (NDV), разработанным таким образом, что они экспрессируют и встраивают в свои вирионы слитый белок, содержащий эктодомен белка инфекционного агента и трансмембранный и цитоплазматический домены белка NDV. Такие химерные вирусы индуцируют иммунный ответ против NDV и инфекционного агента.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к химерным вирусам, содержащим негативную нить РНК, которые делают возможной иммунизацию индивида, например птицы, против двух инфекционных агентов, используя один химерный вирус по настоящему изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к химерным вирусам гриппа, разработанным таким образом, что они экспрессируют и включают в свои вирионы слитый белок, содержащий эктодомен белка инфекционного агента и трансмембранный и цитоплазматический домены белка вируса гриппа. Такие химерные вирусы индуцируют иммунный ответ против вируса гриппа и инфекционного агента. Настоящее изобретение также относится к химерным вирусам псевдочумы птиц (ΝΏν), разработанным так, что они экспрессируют и включают в свои вирионы слитый белок, содержащий эктодомен белка инфекционного агента и трансмембранный и цитоплазматический домены белка ΝΏν. Такие химерные вирусы индуцируют иммунный ответ против ΝΌν и инфекционного агента.
Предпосылки создания изобретения
Ряд содержащих ДНК вирусов были генетически сконструированы таким образом, что направляют экспрессию гетерологичных белков в системах клеток-хозяев (например, вирус коровьей оспы, бакуловирус и т.п.). Недавно аналогичный прогресс был достигнут с вирусами, содержащими позитивную нить РНК, (например, полиовирусом). Полагают, что продукты экспрессии этих конструкций, т.е. продукт гетерологичного гена или химерный вирус, экспрессирующий продукт гетерологичного гена, могут быть эффективны для композиций вакцин (или субъединичных, или цельно-вирионных вакцин). Одним из недостатков использования вирусов, таких как вирус коровьей оспы, для конструирования рекомбинантных или химерных вирусов для применения в вакцинах является отсутствие вариабельности его основных эпитопов. Отсутствие вариабельности вирусных штаммов сильно ограничивает повторное использование химерного вируса коровьей оспы, поскольку множественные вакцинации создадут устойчивость хозяина к штамму, так что инокулированный вирус не может инфицировать хозяина. Иммунизация устойчивого индивидуума химерным вирусом коровьей оспы, таким образом, не будет индуцировать ответ иммунной системы.
Напротив, вирусы, содержащие негативную нить РНК, являются привлекательными кандидатами для конструирования химерных вирусов, используемых в вакцинах. Вирусы, содержащие негативную нить РНК, например вирус гриппа, являются желательными, поскольку их широкая генетическая вариабельность делает возможным конструирование огромного набора композиций вакцин, которые стимулируют иммунитет без риска развития устойчивости.
2.1. Вирусы, содержащие негативную нить РНК
Семейства вирусов, содержащих покрытую оболочкой однонитевую РНК негативного смыслового генома, классифицируют в группы, имеющие несегментированные геномы (Рататухоушбае, РйаЬбоушбае) или имеющие сегментированные геномы (Оййотухоушбае, Вииуаушбае и Лтеиаушбае). Семейства Рататухоушбае и Оййотухоутбае подробно описаны ниже и используются в примерах по настоящему изобретению. Семейство Рататухоушбае состоит из вируса псевдочумы птиц (ΝΩν), вируса парагриппа, вируса Сендай, обезьяньего вируса 5 и вируса эпидемического паротита. Семейство Оййотухоушбае содержит вирусы гриппа типа А, В и С, а также вирусы Тогото и Дхори и вирус инфекционной анемии семговых.
2.1.1. Вирус гриппа
Вирионы гриппа содержат внутреннее рибонуклеопротеиновое ядро (спиральный нуклеокапсид), содержащий однонитевой РНК-геном, и внешнюю липопротеиновую оболочку с внутренним покрытием из матриксного белка (М1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из восьми молекул (для вируса гриппа С из семи) линейных однонитевых РНК негативной полярности, которые кодируют десять полипептидов, включающих белки РНК-зависимой РНК-полимеразы (РВ2, РВ1 и РА) и нуклеопротеин (ΝΡ), формирующих нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (М1, М2); два поверхностных гликопротеина, выступающих из содержащей липид оболочки: гемаглютинин (НА) и нейраминидаза (ΝΑ), неструктурный белок (Ν81) и белок ядерного экспорта (ΝΕΡ). Транскрипция и репликация генома происходят в ядре, а сборка происходит через почкование в плазматической мембране. Вирусы могут перегруппировывать гены во время смешанной инфекции.
Вирус гриппа адсорбируется на клетках посредством активности связывания НА с сиалилолигосахаридами в гликопротеинах и гликолипидах клеточной мембраны. После эндоцитоза вириона в клеточной эндосоме происходит конформационное изменение молекулы НА, облегчающее мембранное слияние, что, таким образом, запускает декапсидацию. Нуклеокапсид перемещается в ядро, где вирусная мРНК транскрибируется. Вирусная мРНК транскрибируется с помощью уникального механизма, в котором вирусная эндонуклеаза отщепляет кэппированный 5'-конец от клеточных гетерологичных мРНК, которые затем служат в качестве праймеров для транскрипции вирусной матричной РНК с помощью вирусной транскриптазы. Транскрипты терминируются в сайтах 15-22 оснований от концов их матриц, в которых последовательности олиго(И) действуют в качестве сигналов для добавления участков поли(А). Вирусные РНК-транскрипты затем перемещаются в клеточную мембрану и связываются с недавно транскрибированными трансмембранными вирусными белками. Затем ΝΑ отщепляет остатки сиаловой
- 1 016217 кислоты от углеводных составляющих гликопротеинов, связанных с мембранной, что приводит к упаковке и высвобождению из клетки потомства вируса. Из восьми вирусных молекул РНК, полученных таким образом, шесть являются моноцистронными информационными молекулами, которые непосредственно транслируются в белки, представляющие НА, ΝΑ, ΝΡ и вирусные полимеразные белки РВ2, РВ1 и РА. Другие два транскрипта подвергаются сплайсингу, при этом каждый дает две мРНК, которые транслируются с использованием различных рамок считывания с получением М1, М2, N81 и ΝΕΡ. Другими словами, восемь вирусных РНК-сегментов кодируют десять белков: девять структурных и один неструктурный. Краткое изложение генов вируса гриппа и их белковых продуктов представлено ниже в табл. 1.
Таблица 1. РНК-сегменты генома вируса гриппа и распределения кодирования3
Сегмент Длина^ Кодируемый Длина^ Молекул Комментарии (нуклеотиды) полипептид,- (аминокислоты) на вирион
2341
РВ2
759
2341
РВ1
757
2233
РА
716
1778
НА
566
1565
ΝΡ
498
1413
ΝΑ
454
Мх
252
1027
М2
N3!
230
890
Компонент РНК-
транскриптазы;
30-60 связывание кэпа РНК клетки хозяина Компонент РНК-
30-60 30-60 транскриптазы; инициация транскрипции Компонент РНКтранскриптазы Гемаглютинин; тример; гликопротеин
500 оболочки; опосредует прикрепление к клеткам Нуклеопротеин; связанный с
1000 РНК; структурный компонент РНКтранскриптазы Нейраминидаза;
100 тетрамер; гликопротеин оболочки Матриксный белок;
3000 покрывает изнутри оболочку Структурный белок плазматической
? мембраны; подвергаемая сплайсингу мРНК Неструктурный белок Белок ядерного экспорта;
т подвергаемая сплайсингу мРНК
121
МЕР
а Принятые от К.А. ЬатЬ и Р.И. СНорргп (1983), Аппиа1 ΚθνίδΝ о£ В10сИеш1зЬгу, Уо1ите 52, 467-506
Ь Для штамма А/РЕ/8/34
с Определенный с помощью биохимического и генетического подходов
8 Определенная с помощью анализа нуклеотидной последовательности и белкового секвенирования
Патогенность вирусов гриппа модулируется множеством вирусных факторов и факторов хозяина. Среди факторов хозяина, вовлеченных в борьбу с вирусной инфекцией, система интерферона типа I (ΙΡΝα/β) представляет мощный противовирусный врожденный защитный механизм, возникший относительно рано в эволюции эукариотических организмов (Сагаа-Зазбе, 2002, Мктобез 1пГсс( 4: 647-55). Противовирусная система ΙΡΝα/β включает три основных стадии: (ί) обнаружение вирусной инфекции и секрецию ΙΡΝα/β; (ίί) связывание ΙΡΝα/β с его рецепторами и индукцию транскрипции стимулируемых
- 2 016217
ΙΡΝα/β генов и (ίίί) синтез противовирусных ферментов и белков. Большинство вирусов, однако, имеют приобретенную специфическую генетическую информацию, кодирующую молекулы антагонистов ΙΡΝα/β, которые эффективно блокируют одну или несколько стадий противовирусной системы ΙΡΝα/β. Вирусы гриппа А зкспрессируют неструктурный белок в инфицированных клетках, белок N81 (описанный подробно ниже), который противодействует клеточному ΙΡΝα/β-ответу (Сатс1а-8а81те с1 а1., 1998, У1то1оду 252:324-30).
2.1.1.1. Высокопатогенный вирус птичьего гриппа
В последние годы сообщалось об эпидемиях заболевания, вызванного высокопатогенным вирусом птичьего гриппа (ΗΡΑΙ), в Азии и Европе (Ка^аока с1 а1., 2005, №11. Есу. М1сгоЬю1. 3:591-600; Кооршапк с1 а1., 2004, Ьапсс!: 363:587-593). Эпидемии, в которые вовлечен вирус гриппа А, вирусы подтипа Η5Ν1 и Η7Ν7, приводили к летальным инфекциям домашней птицы и смерти ограниченного числа людей (Т\тссб с! а1., 2004, Ешстд. Мсс. Όίδ. 10:2196-2199). Один из последних вирусов Η5Ν1 циркулировал среди домашней птицы в Китае в последние годы (С1сп с! а1., 2005, №1Шгс 436:191-192), и хотя первичными носителями этого вируса считаются мигрирующие птицы, полагают, что в увеличение географического распространения вносит вклад в передачу от инфицированной домашней птицы обратно мигрирующим птицам. В настоящее время вирус Η5Ν1, появившийся из Азии, распространяется по Европе и Африке (Ещсппк. 2006, 8с1спсс, 311:932). Показано, что оптовая выбраковка оказалась успешной стратегией искоренения эпидемий Η5Ν1 в Гонконге в 1997 и Нидерландах в 2003 г. (ЫраЮт с! а1., 2004, 1. Упо1. 78:8951-8959). Поскольку человеческие жертвы недавних эпидемий ΗΡΑΙ имели близкий контакт с инфицированной домашней птицей, из этого следует, что профилактику межвидовой передачи вирусов птичьего гриппа (ΑΙν) можно осуществить путем искоренения ΑΙν у домашней птицы благодаря забою. Однако по экономическим и практическим причинам только уничтожение домашней птицы больше не считается предпочтительным методом контроля этого заболевания. Кроме того, по этическим и экологическим причинам выбраковка мигрирующих диких птиц считается неприемлемой практикой. Недавно ΟΙΕ (Всемирная организация здоровья животных) и РАО (Продовольственная и сельскохозяйственная организация объединенных наций) рекомендовали рассматривать вакцинацию домашней птицы для контроля ΑΙν. Кроме того, сообщалось, что вакцинация цыплят инактивированной Н5-вакциной была успешной для прерывания передачи вируса в полевом исследовании (ЕШк с! а1., 2004, Αν^аη Ра11ю1. 33:405412). Недавно в Китае вакцинация была принята в качестве составной части программы контроля ΑΙν.
Возможность того, что высокопатогенный штамм Η5Ν1 может стать передаваемым от человека к человеку, выражается в терминах глобальной пандемии, при этом νΗΟ не желает оценить общую смертность в случае рекомбинации вируса Η5Ν1 в человеческую форму. Поэтому ясна необходимость в способе контроля инфекции Η5Ν1 у сельскохозяйственного скота, от которого, как полагают, произошло наибольшее количество передач человеку.
2.1.2. Вирус псевдочумы птиц
Вирус псевдочумы птиц представляет собой покрытый оболочкой вирус, содержащий линейный, однонитевой, несегментированный, негативный смысловой РНК-геном. Геномная РНК содержит гены в порядке 3'-Ν-Ρ-Μ-Ρ-ΗΝ-Ε, подробно описанном ниже. Геномная РНК также содержит лидерную последовательность на 3'-конце.
Структурные элементы вириона включают вирусную оболочку, являющуюся липидной двухслойной оболочкой, происходящей из плазматической мембраны клетки. Из оболочки выступает гликопротеин, гемаглютинин-нейраминидаза (ΗΝ), обеспечивающий активность как гемаглютина (например, связывания с рецептором/слияния), так и нейраминидазы. Гликопротеин слияния (Ρ), который также взаимодействует с вирусной мембраной, сначала продуцируется в виде неактивного предшественника, затем подвергается посттрансляционному расщеплению с образованием двух связанных дисульфидными связями полипептидов. Активный белок Р вовлечен в проникновение ΝΏν в клетки хозяина путем облегчения слияния вирусной оболочки с плазматической мембранной клетки хозяина. Матриксный белок (М) вовлечен в сборку вируса и взаимодействует как с вирусной мембраной, так и белками нуклеокапсида.
Основной белковой субъединицей нуклеокапсида является нуклеокапсидный белок (Ν), придающий капсиду симметрию спирали. В ассоциации с нуклеокапсидом находятся белки Р и Ь. Полагают, что подвергаемый фосфорилированию фосфопротеин (Р) играет регуляторную роль в транскрипции и может быть вовлечен в метиллирование, фосфорилирование и полиаденилирование. Ген Ь, кодирующий РНКзависимую РНК-полимеразу, требуется для синтеза вирусной РНК вместе с белком Р. Белок Ь, занимающий почти половину кодирующей способности вирусного генома, является наибольшим из вирусных белков и играет важную роль как в транскрипции, так и репликации.
Репликация всех вирусов, содержащих негативную нить РНК, в том числе ΝΏν, осложнена отсутствием клеточного механизма, требуемого для репликации РНК. Кроме того, геном в виде негативной нити не может транслироваться непосредственно в белок, а должен сначала транскрибироваться в копию в виде позитивной нити (мРНК). Следовательно, после проникновения в клетку хозяина вирус не может синтезировать требуемую РНК-зависимую РНК-полимеразу. При инфицировании вместе с геномом в клетку должны попасть белки Ь, Р и Ν.
- 3 016217
Была выдвинута гипотеза, что большинство или все вирусные белки, транскрибирующие мРНК ΝΏν, также осуществляют их репликацию. Механизм, с помощью которого регулируется альтернативное применение (т.е. транскрипция или репликация) одного и того же состава белков, не точно определен, но, по-видимому, в не него встроен избыток свободных форм одного или нескольких нуклекапсидных белков, в частности Ν.
Непосредственно после проникновения вируса транскрипция инициируется белком Ь с использованием в качестве матрицы негативной нити РНК в нуклеокапсиде. Синтез вирусной РНК регулируется так, что во время транскрипции продуцируются моноцистронные мРНК.
После транскрипции вторым существенным событием при инфицировании вирусами, содержащими негативную нить РНК, является репликация вирусного генома. Как и в случае других вирусов, содержащих негативную нить РНК, репликация генома вируса псевдочумы птиц (ΝΏν) опосредуется специфичными в отношении вируса белками. Первыми продуктами репликативного синтеза РНК являются комплементарные копии (т.е. позитивной полярности) РНК генома ΝΏν (кРНК). Эти плюс-нитевые копии (антигеномы) отличаются от транскриптов в виде плюс-нитевых мРНК по структуре их концов. В отличие от транскриптов в виде мРНК антигеномные кРНК не являются кэппированными и метиллированными на 5'-конце и не являются усеченными и полиаденилированными на З'-конце. кРНК являются концевыми с их негативно-нитевыми матрицами и содержат всю генетическую информацию каждого сегмента геномной РНК в комплементарной форме. кРНК служат в качестве матриц для синтеза вирусных геномов в виде негативных нитей ΝΏν (νΡΗΚ).
Геномы в виде негативных нитей ΝΏν(νΡΗΚ), так и антигеномы (кРНК) заключаются в капсид с помощью нуклеокапсидных белков; единственными не заключенными в капсиды разновидностями РНК являются вирусные мРНК. Для ΝΏν местом репликации вирусной РНК является цитоплазма, которая также является местом транскрипции. Сборка вирусных компонентов, по-видимому, происходит в плазматической мембране клетки хозяина, и зрелый вирус высвобождается с помощью почкования.
2.2. Иммуногенные композиции
Технология рекомбинантных ДНК и способы конструирования с использованием обратной генетики предоставляют уникальный подход к получению рекомбинантных вирусов, используемых в иммуногенных композициях. В частности, настоящее изобретение относится к способу конструирования содержащего негативную нить РНК вируса так, что он экспрессирует, или представляет не только природные вирусные антигены, то также любой антиген, который можно сконструировать так, чтобы он включался в белковую оболочку вируса. Особый интерес представляют антигены инфекционных организмов, отличных от вируса гриппа. Таким образом, можно разработать один вирус в качестве иммуногенного компонента, используемого для стимуляции, активации или индукции иммунного ответа, который бы предоставил защиту против по крайней мере двух патогенов. Такой химерный вирус можно подвергнуть дополнительной разработке, если необходимо модифицировать его вирулентность, т. е. так, чтобы он мог быть аттенуированным или дополнительно аттенуированным.
Аттенуированные вирусы гриппа могут быть эффективны, поскольку являются иммуногенными и способны реплицироваться, но не являются патогенными.
Считают, что живые вакцины индуцируют повышенную перекрестную клеточную цитотоксичность, а также гуморальный ответ, что обеспечивает лучшую защиту, чем инактивированные вакцины (Сотке апб Ве1кйе, 1990, 1. Сйп. М1стоЫо1. 28:2539-2550; и Сотке е! а1., 1995, 1. 1иГес1. Ώίκ. 172:1-10). Вовторых, вероятно, что в защитный иммунитет против вирусных заболеваний вовлечен 1дА-ответ слизистых оболочек, который не отмечается при традиционных внутримышечных вакцинах (№1кои е! а1., 1998, να^ΐηο 16:1306-1313). Наконец, живые вакцины также имеют преимущество интраназального введения, которое исключает опухание и болезненность мышцы, иногда сопровождающих внутримышечное введение инактивированной вакцины, дополненной адъювантом. Сообщалось, что живые вакцины индуцируют не только гуморальные ответы против гомотипического вируса гриппа, но также перекрестную клеточную цитотоксичность. Таким образом, настоящим изобретением предлагается возможность разработки новых и более эффективных иммунных композиций, например композиций вакцин, для диагностики, профилактики, регулирования или лечения как вирусных, так и невирусных патогенов.
3. Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к химерным вирусам, содержащим негативную нить РНК, разработанным для экспрессии слитых белков, которые включаются в вирион, к способам получения таких химерных вирусов и к применению таких вирусов, например в качестве иммуногенов, в иммуногенных композициях или в ίη ν 11го анализах. Химерные вирусы по настоящему изобретению характеризуются тем, что на поверхности вириона презентированы не только антигены, связанные с вирусом, но также слитых белков.
Настоящее изобретение относится к химерным вирусам гриппа и химерным ΝΏν, которые делают возможной иммунизацию индивида, например птицы или человека, против двух инфекционных агентов путем введения химерного вируса гриппа или химерного ΝΏν. В одном из аспектов использование одного вируса для индукции иммунного ответа уменьшает частоту введения иммунизирующей компози
- 4 016217 ции. В другом аспекте использование одного вируса для индукции иммунного ответа снижает стоимость иммунизации индивидов. Более низкая стоимость иммунизации индивидов увеличивает вероятность того, что больше индивидов смогут иметь возможность подвергнуться иммунизации, и, следовательно, снижает затраты, связанные с лечением индивидов, страдающих инфекцией.
Настоящее изобретение также относится к применению химерного вируса по настоящему изобретению в композициях (например, иммуногенных композициях) для людей или животных. В частности, химерные вирусы по настоящему изобретению можно использовать в качестве вакцин против широкого ряда вирусов и/или антигенов. Поскольку химерный вирус разрабатывается с целью экспрессии чужеродного эпитопа в вирионе, то композиции (например, композиции вакцин), содержащие химерный вирус по настоящему изобретению, могут быть предназначены для иммунизации против множества штаммовых вариантов, различных вирусов или против совершенно различных инфекционных агентов или связанных с заболеванием антигенов (например, бактерий, паразитов, грибов или специфичных в отношении опухолей антигенов). Можно использовать большое разнообразие способов введения композиций живых аттенуированных вирусов человеку или животному для индуцирования иммунного ответа или ответа с соответствующей продукцией цитокинов. К таким способам относятся, но ими не ограничиваются, интраназальный, интратрахиальный, пероральный, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный способы.
Химерные вирусы по настоящему изобретению делают возможной иммунизацию индивида (например, птиц) против двух инфекционных заболеваний путем введения химерных вирусов. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения химерные вирусы по настоящему изобретению делают возможной иммунизацию птиц против вируса птичьего гриппа и вируса псевдочумы птиц путем введения химерного вируса по настоящему изобретению. Птиц можно легко иммунизировать опрыскиванием химерным вирусом или введением химерного вируса в водном растворе, таком как вода, которую они пьют.
Настоящее изобретение основано отчасти на обнаружении, сделанном заявителями, что эффективный иммунный ответ против двух инфекционных агентов можно получить путем разработки вируса гриппа, экспрессирующего и включающего в свой вирион слитый белок, содержащий цитоплазматический и трансмембранный домены по крайней мере одного основного гликопротеина вируса и эктодомен белка второго инфекционного агента, причем слитый белок функционально замещает основной гликопротеин. В одном из аспектов встраивание слитого белка в вирион приводит к увеличению иммунного ответа на эктодомен второго инфекционного агента. Конструирование цитоплазматического и трансмембранного доменов основного гликопротеина вируса в слитом белке делает возможным встраивание слитого белка в вирион. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения основной гликопротеин представляет собой один из белков НА и/или ΝΑ вируса гриппа или оба эти белка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения основной гликопротеин представляет собой один из белков ΗΝ и Б ΝΏν, или оба эти белка. Функциональное замещение по крайней мере одного основного гликопротеина вируса исключает необходимость ограничивать размер вирусного генома (например, генома вируса гриппа). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения функциональное замещение по крайней мере одного основного гликопротеина вируса слитым белком ослабляет репликацию вируса у индивидов.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему слитый белок, имеющий (ί) эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, слитый с (и) трансмембранным и цитоплазматическим доменами гликопротеина, кодируемого основным геном вируса гриппа, где слитый белок содержится в вирусе птичьего гриппа, в котором функция основного гена обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным вирусу птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген гемаглютинина (НА). В других вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген нейраминидазы (ΝΑ). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа является аттенуированным. В соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа может быть аттенуирован мутацией в гене N81.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему слитый белок, имеющий (ί) эктодомен белка ΗΝ ΝΏν, слитый с (и) трансмембранным и цитоплазматическим доменами белка ΝΑ вируса гриппа, где слитый белок содержится в вирусе птичьего гриппа, в котором функция белка ΝΑ обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным вирусу птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа является аттенуированным. В соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа может быть аттенуирован мутацией в гене Ν81. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой тип, подтип или штамм вируса птичьего гриппа.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный сегмент ΝΑ вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка
- 5 016217 считывания ΝΑ модифицирована так, что кодирующие эктодомен ΝΑ нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена нейраминидазы инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется Ν-концом, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный сегмент НА вируса гриппа, кодирующий слитый с гемаглютинином белок, в котором открытая рамка считывания НА модифицирована так, что кодирующие эктодомен НА нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен способного к слиянию/связывающегося с рецептором антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется С-концом, так что слитый с гемаглютинином белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент НА вируса гриппа, включающий (а) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок гемаглютинин вируса птичьего гриппа, и (Ь) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с гемаглютинином белок, в которой кодирующие эктодомен гемаглютинина нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или кодирующими связанный с заболеванием антиген, который прикрепляется Сконцом, так что и гемаглютинин вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и включаются в химерный вирус птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения первую открытую рамку считывания сегмента НА химерного вируса птичьего гриппа модифицируют, удаляя содержащееся множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент ΝΑ вируса гриппа, включающий: (а) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок нейраминидазу вируса птичьего гриппа, и (Ь) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с нейраминидазой белок, в которой кодирующие эктодомен нейраминидазы нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или кодирующими связанный с заболеванием антиген, который прикрепляется Νконцом, так что и нейраминидаза вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и включаются в химерный вирус птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа включает сегмент НА, имеющий открытую рамку считывания, модифицированную удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный сегмент ΝΑ вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка считывания ΝΑ модифицирована так, что кодирующие эктодомен ΝΑ нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена ΗΝ ΝΏν, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа. Слитый с нейраминидазой белок обеспечивает химерный вирус птичьего гриппа активностью нейраминидазы.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению содержит упакованный сегмент гена Ν81, кодирующий модифицированный белок Ν81, который уменьшает антагонистическую в отношении клеточного интерферона активность вируса. Неограничивающие примеры мутаций в гене Ν81, приводящих к модифицированному белку Ν81, представлены в разделе 5.1.2. ниже.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным ДНК-молекулам), кодирующим сегмент ΝΑ химерных вирусов птичьего гриппа по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным ДНК-молекулам), кодирующим сегмент НА химерных вирусов птичьего гриппа по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным РНК-молекулам), кодирующим сегмент ΝΑ или сегмент НА химерных вирусов птичьего гриппа по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к способам размножения химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению, включающим культивирование химерного вируса птичьего гриппа в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию вирусом птичьего гриппа. Настоящее изобретение также относится к способам получения иммуногенной композиции, включающим (а) размножение химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию вирусом птичьего гриппа; и (Ь) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адекватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так что потомство вируса пригодно для применения в иммуногенных композициях, например композициях вакцин.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему слитый белок, имеющий (ί) эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, слитый с (ίί) трансмембранным и цитоплазматическим доменами гликопротеина, кодируемого основным геном вируса гриппа, причем слитый белок содержится в аттенуированном вирусе гриппа, в котором
- 6 016217 функция основного гена обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным аттенуированному вирусу гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген гемаглютинина (НА). В других вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген нейраминидазы (ΝΑ). Аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа может быть любым типом, подтипом или штаммом вируса гриппа. Например, аттенуированный химерный вирус гриппа может быть вирусом гриппа А, вирусом гриппа В или вирусом гриппа С.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный сегмент ΝΑ вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка считывания ΝΑ модифицирована так, что кодирующие эктодомен ΝΑ нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена нейраминидазы инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется Ν-концом, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус гриппа по настоящему изобретению содержит сегмент НА, имеющий открытую рамку считывания, модифицированную удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный сегмент НА вируса гриппа, кодирующий слитый с гемаглютинином белок, в котором открытая рамка считывания НА модифицирована так, что кодирующие эктодомен НА нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена гемаглютинина инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется С-концом, так что слитый с гемаглютинином белок экспрессируется и встраивается в аттенуированный химерный вирус гриппа.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент НА вируса гриппа, содержащий (а) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок гемаглютинин вируса гриппа, и (Ь) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с гемаглютинином белок, в которой кодирующие эктодомен гемаглютинина нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или кодирующими связанный с заболеванием антиген, который прикрепляется С-концом, так что и гемаглютинин вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и включаются в аттенуированный химерный вирус гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения первую открытую рамку считывания сегмента НА аттенуированного химерного вируса гриппа модифицируют с удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент ΝΑ вируса гриппа, содержащий (а) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок нейраминидазу вируса гриппа, и (Ь) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с нейраминидазой белок, в которой кодирующие эктодомен нейраминидазы нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или кодирующими связанный с заболеванием антиген, который прикрепляется Ν-концом, так что и нейраминидаза вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и содержатся в аттенуированном химерном вирусе гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус гриппа по настоящему изобретению содержит сегмент НА, имеющий открытую рамку считывания, модифицированную удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус гриппа по настоящему изобретению содержит упакованный сегмент гена Ν81, кодирующий модифицированный белок Ν81, который уменьшает антагонистическую, в отношении клеточного интерферона, активность вируса.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным ДНК-молекулам), кодирующим сегмент ΝΑ аттенуированных химерных вирусов гриппа по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным ДНК-молекулам), кодирующим сегмент НА аттенуированных химерных вирусов гриппа по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным РНКмолекулам), кодирующим сегмент ΝΑ или сегмент НА аттенуированных химерных вирусов гриппа по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к способам размножения аттенуированного химерного вируса гриппа по настоящему изобретению, содержащим культивирование аттенуированного химерного вируса гриппа в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию вирусом гриппа. Настоящее изобретение также относится к способам получения иммуногенной композиции, включающим: (а) размножение аттенуированного химерного вируса гриппа по настоящему изобретению в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию аттенуированным вирусом гриппа; и (Ь) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адек
- 7 016217 ватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так что потомство вируса пригодно для применения в иммуногенных композициях, например композициях вакцин.
Настоящее изобретение также относится к химерным вирусам ΝΏν. В частности, настоящее изобретение относится к химерным ΝΏν, включающим слитый белок, имеющий (ί) эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от ΝΏν, слитый с (ίί) трансмембранным и цитоплазматическим доменами гликопротеина, кодируемого основным геном ΝΏν, где слитый белок содержится в ΝΏν, в котором функция основного гена обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным ΝΏν. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном ΝΏν является ген, кодирующий белок Р. В других вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном ΝΏν является ген, кодирующий белок ΗΝ. В соответствии с этим изобретением можно использовать любой тип, подтип или штамм ΝΏν.
Настоящее изобретение относится к химерному ΝΏν, включающему упакованный геном, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, слитый с белком Р, имеющий трансмембранный и цитоплазматический домены белка Р и эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от ΝΏν, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется С-концом, так что белок, слитый с белком Р, экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения геном химерного ΝΏν содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Р, так что белок Р экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν помимо белка, слитого с белком Р ΝΏν. В других вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, слитый с белком Р ΝΏν, заменяет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Р ΝΏν, и белок, слитый с белком Р, обеспечивает функцию белка Р в химерном ΝΏν.
Настоящее изобретение относится к химерному ΝΏν, содержащему упакованный геном, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, слитый с ΗΝ, имеющий трансмембранный и цитоплазматический домены белка ΗΝ и эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от ΝΏν, или связываемого с заболеванием антигена, который прикрепляется Ν-концом, так что белок, слитый с ΗΝ, экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения геном химерного ΝΏν содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΗΝ, так что белок ΗΝ экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν помимо белка, слитого с ΗΝ ΝΏν. В других вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, слитый с ΗΝ, заменяет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΗΝ ΝΏν, и белок, слитый с ΗΝ, обеспечивает функцию белка ΗΝ в химерном ΝΏν. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим белок Р или белок ΗΝ ΝΏν.
Настоящее изобретение относится к способам размножения химерного ΝΏν по настоящему изобретению, содержащим культивирование химерного ΝΏν в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию ΝΏν. Настоящее изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции, включающему: (а) размножение химерного ΝΏν по настоящему изобретению в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию ΝΏν; и (Ь) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адекватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так чтобы потомство вируса могло бы использоваться в иммуногенных композициях, например композициях вакцин.
Настоящее изобретение относится к яйцам с эмбрионами, включающим химерные вирусы по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к клеточным линиям, содержащим химерные вирусы по настоящему изобретению. Настоящее изобретение, кроме того, относится к иммуногенным композициям, содержащим химерные вирусы по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к способам индуцирования у индивида иммунного ответа на один, два или более инфекционных агента, содержащим введение эффективного количества химерного вируса гриппа по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является не являющееся человеком млекопитающее (например, свинья, лошадь, собака или кошка). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом является птица. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа у птицы на один, два или более инфекционных агента, содержащему введение эффективного количества химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к способам индуцирования у индивида иммунного ответа на один, два или более инфекционных агентов, включающим введение индивиду эффективного количества химерного ΝΏν по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является не являющееся человеком млекопитающее (например, свинья, лошадь, собака или кошка). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом является птица. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования им
- 8 016217 мунного ответа у птицы на один, два или более инфекционных агента, включающим введение птице эффективного количества химерного ΝΏν по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к способам индуцирования у индивида иммунного ответа на один, два или более инфекционных агента, включающим введение индивиду эффективного количества аттенуированного химерного вируса гриппа по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является не являющееся человеком млекопитающее (например, свинья, лошадь, собака или кошка). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом является птица. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования у человека иммунного ответа на один, два или более инфекционных агента, содержащим введение больному эффективного количества химерного вируса по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к способам индуцирования иммунного ответа на связанный с заболеванием антиген, включающим введение индивиду эффективного количества химерного вируса по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является птица.
3.1. Терминология
Используемый в настоящем описании термин животное включает, но ими не ограничиваются, домашних животных (например, собак и кошек), животных зоопарка, животных ферм (например, жвачных, нежвачных, крупный рогатый скот и домашнюю птицу), диких животных и лабораторных животных (например, грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки, и кроликов) и животных, которых клонировали или модифицировали либо генетическим, либо другим способом (например, трансгенных животных).
Используемый в настоящем описании термин приблизительно при использовании в отношении числа относится к любому числу в пределах 1, 5 и 10% указанного числа.
Используемое в настоящем описании выражение аминоконец N81 относится к аминокислотам Νконцевого аминокислотного остатка (аминокислотного остатка 1) по аминокислотный остаток 115, аминокислотные остатки с 1 по 100, аминокислотные остатки с 1 по 75, аминокислотные остатки с 1 по 50, аминокислотные остатки с 1 по 25 или аминокислотные остатки с 1 по 10 белка N81 вируса гриппа. Делеции амино-конца могут включать делеции, состоящие из 5, предпочтительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 или 175 аминокислотных остатков с Ν-конца N81.
Используемое в настоящем описании выражение карбоксильный конец N81 относится к аминокислотам со 116 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток, аминокислотам со 101 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток, аминокислотам с 76 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток, аминокислотам с 51 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток или аминокислотам с 26 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток белка N81 вируса гриппа лошадиных, когда аминоконец N81 представляет собой аминокислоты с 1 по аминокислотный остаток 115, аминокислоты с 1 по 100, аминокислоты с 1 по 75, аминокислоты с 1 по 50 или аминокислоты с 1 по 25, соответственно, белка N81 вируса гриппа. Делеции карбоксиконца могут включать делеции, состоящие из 5, предпочтительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 или 175 аминокислотных остатков с карбоксиконца N81.
Используемые в настоящем описании взаимозаменяемо термины заболевание или нарушение относятся к состоянию индивида и охватывают, но ими не ограничиваются, пролиферативные заболевания (например, лейкоз, фиброз, карциному (в том числе злокачественную, незлокачественную, метастатическую и неметастатическую карциномы) и лимфому) и инфекции, вызванные инфекционным агентом (например, вирусом, бактерией, паразитом) и сопровождающие их состояние или симптом.
Используемый в настоящем описании термин эпитоп относится к сайтам, фрагментам или району молекулы (например, полипептида или белка), имеющим антигенную или иммуногенную активность индивида. Эпитоп, имеющий иммуногенную активность, представляет собой сайт, фрагмент или район молекулы (например, полипептида или белка), который вызывает гуморальный ответ у индивида. Эпитоп, имеющий антигенную активность, представляет собой сайт, фрагмент или район молекулы, с которым антитело иммуноспецифически связывается, что можно определить любым способом, хорошо известным квалифицированному в данной области специалисту, например, с помощью иммунологических анализов.
Используемый в настоящем описании термин фрагмент в контексте агента, подобного белку, относится к пептиду или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность по крайней мере из 2 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 5 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 10 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 15 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 20 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 25 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 40 непрерывных амино- 9 016217 кислотных остатков, по крайней мере из 50 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 60 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 70 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 80 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 90 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 100 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 125 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 150 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 175 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 200 непрерывных аминокислотных остатков или по крайней мере из 250 непрерывных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности пептида, полипептида или белка. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фрагмент полноразмерного белка сохраняет активность полноразмерного белка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент полноразмерного белка не сохраняет активность полноразмерного белка.
Используемый в настоящем описании термин фрагмент в контексте нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид или белок, относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по крайней из 2 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 5 непрерывных нуклеотидов, по крайней 10 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 15 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 20 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 25 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере крайней мере крайней мере крайней мере крайней мере крайней мере крайней мере крайней мере по крайней мере из 380 непрерывных нуклеотидов последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, полипептид или белок. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент нуклеиновой кислоты кодирует пептид или полипептид, который сохраняет активность полноразмерного белка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент полноразмерного белка не сохраняет активность полноразмерного белка.
Термин гетерологичная последовательность, используемый в контексте агента, подобного белку, относится к молекуле, которая не встречается в природе в виде молекулы, связанной с основой химерного вируса или, в частности, гликопротеином химерного вируса. Термин гетерологичная последовательность в контексте последовательности нуклеиновой кислоты или молекулы нуклеиновой кислоты относится к молекуле, которая не встречается в природе в виде молекулы, связанной с геномом основы хи
из 30
из 40
из 60
из 80
из 100
из 150
из 200
из 300
крайней мере крайней мере крайней мере крайней мере непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по крайней мере непрерывных нуклеотидов, по крайней мере непрерывных нуклеотидов, по крайней мере непрерывных нуклеотидов, по крайней мере
из 35
из 50
из 70
из 90
из 125
из 175
из 250
из 350
непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов, по непрерывных нуклеотидов или мерного вирусы.
Используемый в настоящем описании термин иммуноспецифически связывает антиген и аналогичные термины относятся к молекулам, которые специфически связываются с антигеном и не специфически связываются с другой молекулой (например, специфичные в отношении антигена антитела содержат как модифицированные антитела (т.е. антитела, которые содержат модифицированный константный домен 1дС (например, 1дС1), или их РсКи-связывающий фрагмент (например, Ре-домен или шарнирная область - Рс-домен)) и немодифицированные антитела (т.е. антитела, которые не содержат модифицированный константный домен 1дС (например, 1дС1), или их РсКп-связывающий фрагмент (например, Рсдомен или шарнирная область - Рс-домен)). Молекулы, специфически связывающие один антиген, могут перекрестно реагировать с родственными антигенами.
Предпочтительно, чтобы молекула, специфически связывающая один антиген, не реагировала перекрестно с другими антигенами. Молекулу, специфически связывающую антиген, можно идентифицировать, например, с помощью иммунологического анализа, В1Асоге и других методов, хорошо известных специалистам в данной области. Молекула, специфически связывает антиген, если она связывает указанный антиген с большим сродством, чем любой другой перекрестно реагирующий антиген, что определяется с использованием экспериментальных методов, таких как радиоиммуноанализы (К1А) и твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А). Смотри, например, Раи1, еб., 1989, Рипбатеи1а1 1ттиио1оду 8есоиб Ебйюи, Катеи Рге88, №\ν Уогк а! раде8 332-336, в отношении обсуждения, касающегося специфичности антител.
Используемый в настоящем описании термин в комбинации в контексте назначения индивиду терапии(й) относится к применению более одного вида терапии (например, более одного профилактического средства и/или терапевтического средства). Использование термина в комбинации не ограничивает порядок, в котором терапию (например, профилактические и/или терапевтические средства) назначают индивиду (например, индивиду с инфекцией, вызванной вирусом гриппа, и вызванной ΝΏν инфекцией или с сопровождающим их симптомом или состоянием или индивиду с другой инфекцией (например, другой вирусной инфекцией). Первый вид терапии (например, первое профилактическое или терапевтическое средство) можно назначать перед (например, за 5, 15, 30, 45 мин, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96
- 10 016217 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 12 недель) назначением второго вида терапии, одновременно с назначением второй терапии или после (например, через 5, 15, 30, 45 мин, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 12 недель) назначения второй терапии (например, второго профилактического или терапевтического агента) индивиду (например, индивиду с инфекцией, вызванной вирусом гриппа, вызванной ΝΌν инфекцией или с сопровождающим их симптомом или состоянием, или с другой инфекцией (например, другой вирусной инфекцией)).
Используемое в настоящем описании выражение антагонистическая в отношении интерферона активность агента, подобного белку, относится к белку или полипептиду или их фрагменту, производному или аналогу, которые уменьшают или ингибируют иммунный ответ, в который вовлечен клеточный интерферон. В частности, белок или полипептид или их фрагмент, производное или аналог (например, N81 вируса гриппа), обладающие антагонистической в отношении интерферона активностью, снижают или ингибируют экспрессию и/или активность интерферона. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения выражение антагонистическая в отношении интерферона активность относится к вирусному белку или полипептиду или его фрагменту, производному или аналогу (например, белку вируса гриппа), которые уменьшают или ингибируют иммунный ответ, в который вовлечен клеточный интерферон. Вирусный белок или полипептид с антагонистической в отношении интерферона активностью может предпочтительно влиять на экспрессию и/или активность одного или двух типов интерферона (ΙΡΝ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения влияние происходит на экспрессию и/или активность ΙΡΝ-α. В другом из вариантов осуществления настоящего изобретения влияние происходит на экспрессию и/или активность ΙΡΝ-β. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения влияние происходит на экспрессию и/или активность ΙΡΝ-γ. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессия и/или активность ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β и/или ΙΡΝ-γ в яйце с эмбрионом или клетке уменьшается от приблизительно 1 до приблизительно 100 раз, от приблизительно 5 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 20 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 40 до приблизительно 80 раз или в 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 раз с помощью агента, подобного белку, с антагонистической в отношении интерферона активностью относительно экспрессии и/или активности ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β и/или ΙΡΝ-γ в контрольном яйце с эмбрионом или клетке, не экспрессирующих или не приводимых в контакт с таким агентом, подобным белку, что определяется методами, описанными в настоящем описании или известных специалисту в данной области.
Используемое в настоящем описании выражение системы с недостатком ΙΡΝ или субстраты с недостатком ΙΡΝ относится к системам, например клеткам, линиям клеток и животным, таким как мыши, куры, индейки, кролики, крысы, лошади и т.п., в которых не продуцируется один, два или более типов ΙΡΝ, или вообще не продуцируется какой-либо тип ΙΡΝ, или продуцируются низкие уровни одного, двух или более типов ΙΡΝ, или продуцируются низкие уровни любого ΙΡΝ (т.е. снижена экспрессия ΙΡΝ на 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% или более по сравнению с компетентной в отношении ΙΡΝ системой при одних и тех же условиях), которые не отвечают или отвечают менее эффективно на один, два или более типов ΙΡΝ, или не отвечают на любой тип ΙΡΝ, и/или в которых имеется недостаток активности противовирусных генов, индуцируемых одним, двумя или более типами ΙΡΝ или индуцируемых любым типом ΙΡΝ.
Используемые в настоящем описании термины инфекция, вызванная вирусом гриппа инфекция, вызванная вирусом птичьего гриппа инфекция и вызванная ΝΏν инфекция относятся ко всем стадиям жизненного цикла вируса гриппа, вируса птичьего гриппа, ΝΏν или другого инфекционного агента (например, вирусной или бактериальной инфекции) у индивида (в том числе инвазии и репликации вируса гриппа, вируса птичьего гриппа, ΝΏν или другого инфекционного агента в клетке или ткани организма), а также патологическому состоянию, являющемуся следствием инвазии и репликации вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или ΝΏν. Инвазия и размножение вируса гриппа, вируса птичьего гриппа, ΝΏν или другого инфекционного агента содержат, без ограничения, следующие стадии: присоединение вируса (например, частицы вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или ΝΏν) к клетке, слияние вируса с клеточной мембраной, ввод генетической информации вируса в клетку, экспрессию вирусных белков (например, белков вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или ΝΏν), продукцию новых вирусных частиц (т.е. частиц вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или ΝΏν) и высвобождение вируса (например, частиц вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или ΝΏν) из клетки. Инфекция дыхательных путей (например, вызванная вирусом гриппа или ΝΏν инфекция) может быть инфекцией верхних дыхательных путей (υΚΙ), инфекцией нижних дыхательных путей (ЬК1) или их комбинацией. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения инфекция является вторичной инфекцией (например, вторичной пневмонией), которая проявляется после возникновения первичной инфекции (например, вирусной пневмонии). Вторичные инфекции возникают благодаря первичной инфекции или симптома или состояния, сопровождающего ее, которые провоцируют у инфицированного индивида такую вторичную инфекцию. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения патологическое состояние, являющееся
- 11 016217 следствием инвазии и репликации вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или ΝΏν, является острым заболеванием, вызванным вирусом гриппа, вирусом птичьего гриппа или ΝΏν. Острые стадии инфекций дыхательных путей могут проявляться в виде пневмонии и/или бронхиолита, симптомы которых могут включать гипоксию, асфиксию, дистресс-синдром, быстрое дыхание, стерторозное дыхание, цианоз и т.п. В острой стадии инфекций дыхательных путей (например, вызванных вирусом гриппа и ΝΏν инфекций) необходимо, чтобы подвергнуть индивидуума медицинскому вмешательству, такому как госпитализация, введение кислорода, интубация и/или вентиляция.
Используемый в настоящем описании термин выделенный в контексте вирусов относится к вирусу, происходящему из одного родительского вируса. Вирус можно выделить, используя обычные способы, известные специалисту в данной области, содержащие, но ими не ограничиваясь, способы, основанные на очистке из бляшки и серийном разведении.
Используемый в настоящем описании термин выделенный в контексте молекул нуклеиновых кислот относится к молекуле нуклеиновой кислоты, отделенной от других молекул нуклеиновых кислот, присутствующих в природном источнике молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может быть, по существу, свободна от другого клеточного материала, или культуральной среды при получении рекомбинантными методами, или по существу свободна от химических предшественников или других химических продуктов при химическом синтезе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вирусный белок, является выделенной.
Используемые в настоящем описании термины регулировать, регулирование и регулировка относятся к положительным эффектам, которые индивид получает от терапии (например, профилактического или терапевтического средства), которая не приводит к излечению заболевания (например, инфекции). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивиду назначают один или несколько видов терапии (например, профилактических или терапевтических средств, таких как антитело по настоящему изобретению) для регулирования инфекции, вызванной вирусом гриппа, инфекции, вызванной вирусом птичьего гриппа или ΝΏν, или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, одного или нескольких ее симптомов или состояния, сопровождающего инфекцию, вызванную вирусом гриппа, или вызванную ΝΏν инфекцию, или инфекцию, вызванную другим инфекционным агентом, усиленного такой инфекцией или усиливающего такую инфекцию, для профилактики прогрессирования или ухудшения инфекции.
Используемое в настоящем описании выражение множественность заражения или ΜΟΙ - это среднее число вирусов на инфицированную клетку. ΜΟΙ определяют делением числа добавленных вирусов (мл добавленные х бляшкообразующие единицы) на число добавленных клеток (мл добавленные х клетки/мл).
Используемое в настоящем описании выражение ген Ν81 относится к гену, кодирующему неструктурный белок (Ν81) вируса гриппа. Ν81 является одной из восьми молекул, кодируемых сегментированным геномом вируса гриппа А и других вирусов. Продукт гена Ν81 относится к продукту гена (например, РНК или белку), кодируемому геном Ν81. В случае белка продукт гена Ν81 является полноразмерным и обладает активностью Ν81 дикого типа (например, из штамма Ά/^δΝ/33).
Используемые в настоящем описании термины нуклеиновые кислоты, нуклеотидные последовательности и молекулы нуклеиновых кислот содержат молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), комбинации молекул ДНК и РНК или гибридные молекулы ДНК/РНК и аналоги молекул ДНК или РНК. Такие аналоги можно создать с использованием, например, нуклеотидных аналогов, которые содержат, но ими не ограничиваются, инозин или тритилированные основания. Такие аналоги могут включать молекулы ДНК или РНК, содержащие модифицированные остовы, которые придают молекулам полезные свойства, такие как, например, устойчивость к нуклеазам или увеличенная способность пересекать клеточные мембраны. Нуклеиновые кислоты или нуклеотидные последовательности могут быть однонитевыми, двунитевыми, могут содержать и однонитевые, и двунитевые части и могут содержать трехнитевые части, но предпочтительной является двунитевая ДНК. Используемые в настоящем описании термины профилактика и предотвращение относятся к предотвращению рецидива или возникновения одного или нескольких симптомов заболевания (например, вирусной инфекции или другого инфекционного заболевания) или уменьшению таких симптомов у индивида в результате назначения терапии (например, профилактического или терапевтического средства). Например, в контексте назначения индивиду терапии инфекции профилактика и предотвращение относятся к ингибированию или уменьшению развития или возникновения инфекции (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа, вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающего ее состояния, или инфекции, отличной от инфекции, вызванной вирусом гриппа или ΝΏν, или сопровождающего ее состояния) или предотвращению рецидива, возникновения или развития одного или нескольких симптомов инфекции (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа, вызванной ΝΏν инфекции или сопровождающего их состояния, или инфекции, отличной от инфекции, вызванной вирусом гриппа, вызванной ΝΏν инфекции или сопровождающего ее состояния) у индивида в результате назначения терапии (на
- 12 016217 пример, профилактического или терапевтического средства) или назначения комбинации терапии (например, комбинации рофилактических и терапевтических средств).
Используемый в настоящем описании термин протективный антиген в контексте инфекционного агента включает любую молекулу, которая при введении индивиду способна вызывать защитный иммунный ответ против инфекционного агента.
Используемые в настоящем описании термины профилактическое средство и профилактические средства относятся к любому средству (средствам), которые можно использовать для профилактики заболевания (например, инфекции) или его симптома (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа, вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающего их состояния или симптома, или инфекции, отличной от инфекции, вызванной вирусом гриппа или ΝΏν, или сопровождающего ее состояния или симптома). Предпочтительно профилактическое средство представляет собой средство, которое, как известно, можно использовать, было использовано или используется в текущий момент времени для профилактики или профилактики возникновения, развития, прогрессирования и/или тяжести заболевания или его симптома (например, инфекции или состояния или симптома, сопровождающего ее) .
Используемое в настоящем описании выражение очищенный в контексте вирусов относится к вирусу, который, по существу, свободен от клеточного материала и культуральных сред источника в виде клетки или ткани, из которого вирус получают. Формулировка по существу свободен от клеточного материала включает препараты вируса, в которых вирус отделен от компонентов клеток, из которых его выделяют или в которых его рекомбинантно продуцируют. Таким образом, вирус, который по существу свободен от клеточного материала, включает препараты белка, имеющие менее приблизительно 30, 20, 10 или 5% (по сухому весу) клеточного белка (на который в данном описании также приводится ссылка в виде загрязняющий белок). Вирус также по существу свободен от культуральной среды, т.е. культуральная среда представляет менее приблизительно 20, 10 или 5% объема препарата вируса. Вирус можно очистить с использованием традиционных способов, известных специалисту в данной области, содержащих, но ими не ограничиваются, хроматографию и центрифугирование.
Используемые в настоящем описании термины индивид или пациент используются взаимозаменяемо. Используемые в настоящем описании термины индивид или индивиды относятся к животному (например, птицам, рептилиям и млекопитающим). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является млекопитающее, включая не являющееся приматом млекопитающее (например, верблюда, осла, зебру, корову, лошадь, кошку, собаку, крысу и мышь) и примата (например, обезьяну, шимпанзе и человека). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является не являющееся человеком млекопитающее. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения возраст млекопитающего (например, человека) составляет 0-6 месяцев, 6-12 месяцев, 1-5 лет, 5-10 лет, 10-15 лет, 15-20 лет, 20-25 лет, 25-30 лет, 30-35 лет, 35-40 лет, 40-45 лет, 45-50 лет, 5055 лет, 55-60 лет, 60-65 лет, 65-70 лет, 70-75 лет, 75-80 лет, 80-85 лет, 85-90 лет, 90-95 лет или 95-100 лет. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом или пациентом является птица. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения возраст птицы составляет 0-3 месяца, 3-6 месяцев, 6-9 месяцев, 9-12 месяцев, 12-15 месяцев, 15-18 месяцев или 18-24 месяца.
Используемый в настоящем описании термин синергический в контексте назначения или результата терапии относится к комбинированной терапии (например, комбинирование профилактических или терапевтических средств), которая более эффективна, чем аддитивные эффекты любых двух или более отдельных терапий (например, одного или более профилактических или терапевтических агентов). Синергический эффект комбинированной терапии (например, комбинирование профилактических или терапевтических средств) делает возможным использование более низких доз одной или нескольких видов терапии (например, одного или нескольких профилактических или терапевтических средств) и/или более редкое назначение указанной терапии индивиду с заболеванием (например, вызванной вирусом гриппа инфекцией, вызванной ΝΏν инфекцией или сопровождающим их состоянием или симптомом, или инфекцией, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающим ее состоянием или симптомом). Возможность использовать более низкие дозы терапии (например, профилактических или терапевтических средств) и/или назначать указанную терапию реже снижает токсичность, связанную с назначением указанной терапии индивиду, не снижая эффективность указанных видов терапии для профилактики или лечения заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции или сопровождающего ее состояния или симптома, или инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома). Кроме того, синергический эффект может привести к увеличению эффективности терапии (например, профилактических или терапевтических средств) для профилактики, регулирования или лечения заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции или сопровождающего их состояния или симптома, или инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома). Наконец, синергический эффект комбинированной терапии (например, профилактических или терапевтических средств) может
- 13 016217 исключить или уменьшить неблагоприятные или нежелательные побочные эффекты, связанные с применением любой терапии по отдельности.
Используемые в настоящем описании термины терапии и виды терапии могут относиться к любому протоколу(ам), способу(ам) и/или средству(ам), которые можно использовать для профилактики, лечения, регулирования или уменьшения интенсивности заболевания (например, рака, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающего их состояния или симптома, или инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции или вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения термины терапия и виды терапии относятся к биологической терапии, поддерживающей терапии и/или другим видам терапии, используемым для лечения, регулирования, профилактики или уменьшения интенсивности заболевания, инфекции или сопровождающего их состояния или симптома, известным специалисту в данной области.
Используемые в настоящем описании термины терапевтическое средство и терапевтические средства относятся к любому средству(ам), которое можно использовать для профилактики, лечения, регулирования или уменьшения интенсивности заболевания (например, инфекции или ее симптома (например, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции или сопровождающего их состояния или симптома, инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома).
Предпочтительно терапевтическим средством является средство, которое, как известно, можно использовать, или которое использовали или используется в текущий момент времени для профилактики, лечения, регулирования или уменьшения интенсивности заболевания или сопровождающего его симптома (например, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции или сопровождающего их состояния или симптома, инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома).
Используемые в настоящем описании термины лечить и лечение в контексте назначения индивиду терапии относится к исключению, уменьшению или уменьшению интенсивности симптомов заболевания, на которое направлена терапия. Что касается инфекций (например, вызванных вирусом гриппа или вирусом ΝΏν) лечение относится к исключению или контролю репликации инфекционного агента (например, вируса), уменьшению числа инфекционных агентов (например, снижению титра вируса), уменьшению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности инфекции (например, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции или сопровождающих их состояния или симптомов, инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной ΝΏν инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома) или уменьшению интенсивности одного или нескольких симптомов, являющихся следствием назначения одной или нескольких терапий (в том числе, но ими не ограничиваются, введения одного или нескольких профилактических или терапевтических средств). Что касается рака, лечение относится к исключению, удалению, модификации или контролю первичной, региональной или метастатической раковой ткани, являющихся следствием введения одного или нескольких терапевтических средств по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такие термины относятся к минимизации или отсрочке распространения рака, являющихся следствием введения одного или нескольких терапевтических средств по настоящему изобретению индивиду с таким заболеванием. В других вариантах осуществления настоящего изобретения такие термины относятся к исключению вызывающих заболевание клеток.
Описание фигур
Фиг. 1. Схематическое представление гибридной конструкции ΝΑί-ΗΝ
Конструкция содержит нуклеотиды 3' некодирующей области вирусной РНК ΝΑ νδΝ, нуклеотиды кодирующей ΝΑ области, соответствующие цитоплазматическому хвостовому и трансмембранному доменам белка ΝΑ плюс первая аминокислота эктодомена ΝΑ, за которой следуют нуклеотиды кодирующей области белка ΗΝ ΝΏν В1 (эктодомен ΗΝ), два последовательных стоп-кодона, нетранслируемые нуклеотиды рамки считывания ΝΑ νδΝ и 5' некодирующая область вирусной РНК νδΝ.
Фиг. 2. Схематическое представление изменения последовательности с множеством основных аминокислот НА
Нуклеотидная последовательность, определяемая как НА Η5Ν1, представляет нуклеотиды 10131045 (8ЕО ΙΏ ΝΟ:13; аминокислотная последовательность 8ЕО ΙΏ ΝΟ:14) открытой рамки считывания поверхностного гликопротеина НА 1пПиепха Л/У1с1пат/1203/04 (Η5Ν1). Нуклеотиды 1026-1038 заменили одним нуклеотидом цитозином, используя удаляющую ПЦР и сайт-направленный мутагенез, что привело к получению нуклеотидной последовательности невирулентного НА (8ЕО ΙΏ ΝΟ:15; аминокислотная последовательность 8ЕО ΙΏ ΝΟ:16). Изменения в последовательности соответствуют замене последовательности из 5 основных аминокислот одной аминокислотой треонином.
Фиг. 3. Схематическое представление изменения последовательности нуклеиновой кислоты НА
Последовательность, определяемая как невирулентный НА, представляет нуклеотиды 1013-1033 открытой рамки считывания поверхностного гликопротеина НА, основанных на консенсусных последо
- 14 016217 вательностях белков НА невирулентного 1пДиеп7а А/У|е1пат/1203/04 (Η5Ν1) (8Е0 ΙΌ ΝΟ:15; аминокислотная последовательность 8Е0 ΙΌ ΝΟ:16). Подчеркнутые остатки аденозина заменены так, что мутации были синонимичными, что привело к получению нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ ΝΟ:17 и аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ ΝΟ:16.
Фиг. 4. Схема усеченных мутантов ρΡο11νΝ1203 Ν8
A. Кодирующая область сегмента гена Ν8 Η5Ν1 представляет собой 833 нуклеотида.
B. Конструкция ρΡο11νΝ1203 Ν81-126 имеет делецию в гене Ν8 из нуклеотидов 379-456 кодирующей области, вставку 3 стоп-кодонов и рестрикционного сайта для ВдШ.
C. Конструкция ρΡο11νΝ1203 Ν81-99 имеет делецию в гене Ν8 из нуклеотидов 298-456 кодирующей области, вставку 4 стоп-кодонов, рестрикционного сайта для ВдШ и рестрикционного сайта для Рас1.
Ό. Конструкция ρΡο11νΝ1203 Ν81-73 имеет делецию в гене Ν8 из нуклеотидов 219-456 кодирующей области, вставку 4 стоп-кодонов, рестрикционного сайта для Вд111 и рестрикционного сайта для Ρ;·κΙ.
Фиг. 5. Схема ρΝΏν/Β1
Изображенная последовательность фланкирована на 3'-конце промотором Т7 и на 5'-конце рибозимом ΗΌν и терминатором Т7. Сайт встраивания между генами Р и М включает уникальный рестрикционный сайт для ХЬа1.
Фиг. 6. Анализ Вестерн-блоттингом экспрессии КСБР в химерных вирусах τΝΏν
Химерные вирусы τΝΏν (линия 1), τΝΏν-КСБК (линия 2) и τΝΏν-КСБК/Р-СТ (линия 3) выращивали в куриных яйцах с эмбрионами возрастом 10 дней. Очищенные вирусы подвергали анализу Вестерн-блоттингом с использованием крысиного антитела против КОБР, и антимышиного ΗΚΡΟ в качестве первого и второго антител, соответственно.
Фиг. 7. Анализ Вестерн-блоттингом экспрессии НА Н7 в химерных вирусах τΝΏν
Химерные вирусы τΝΏν (линия 1), τΝΏν-КСБК (линия 2) и τΝΏν-КСБК/Р-СТ (линия 3) выращивали в куриных яйцах с эмбрионами возрастом 10 дней. Очищенные вирусы подвергали анализу Вестерн-блоттингом с использованием крысиного антитела против НА Н7 и антимышиного ΗΚΡΟ в качестве первого и второго антител, соответственно.
Фиг. 8. Модификация сайта расщепления белка Б τΝΏν (А) Схематическое представление генома τΝΏν/Β1 с двумя или тремя аминокислотными заменами в сайте расщепления белков Б. Пептидная связь, подвергаемая расщеплению, в белке Б показана с использованием косой черты. (В) Образование соклетий в клетках СЕБ, инфицированных τΝΏν с модифицированными белками Б. Клетки СЕБ инфицировали при множественности заражения, составляющей 0,001, вирусами τΝΏν/Β1, ιΝΏν/Ε2αα и ιΝΏν/Ε3αα. Распространение вирусов контролировали каждые 24 часа с помощью иммунофлуоресцентного анализа.
Фиг. 9. Конструирование и характеристика способного к слиянию вектора τΝΏν, экспрессирующего белок НА ΗΡΑΙ Η7 (A) Схематическое представление кДНК-конструкции ^N^V/Б3аа-сЫте^^сΗ7 с представленными последовательностями ОЕ/О8, ΕοζαΕ и частичной последовательностью НА Н7 (8ЕО ΙΏ ΝΟ: 36).
(B) Сравнение кинетик роста вирусов, Бод ТСГО против времени после инокуляции (ч). Квадрат, τΝΏν/Β1; треугольник τΝΏνΤ3αα; выделенная жирным звездочка τΝΏν/Β1-Η7; звездочка τΝΏν/Ρ3ααсЫтепсЮ.
(C) Экспрессия белка НА Н7 дикого типа или химерного белка НА Н7 в клетках, инфицированных τΝΏν. Линия 1: ложно инфицированные; линия 2: τΝΏν/Ρ3αα; линия 3: ΓΝΏν/Β1-47; линия 4: ^N^V/Ρ3аа-сЫте^^сΗ7. Ряд 1: Н7 α-птичьего гриппа; ряд 2: α-ΝΏν.
(Ώ) Встраивание химерного белка НА Н7 в вирионы ιΝΏν увеличено по сравнению с встраиванием белка НА Н7 дикого типа. Линия 1: τΝΏν/Β1-Η7; линия 2: ^N^V/Ρ3аа-сЫте^^сΗ7. Ряд 1: Н7 α-птичьего гриппа; ряд 2: α-ΝΏν.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к химерным вирусам, содержащим негативную нить РНК, сконструированным с целью экспрессии слитых белков, которые встраиваются в вирион, к способам получения таких химерных вирусов и применению таких вирусов, например, в качестве иммуногенов, в иммуногенных композициях или в ίη νίίτο анализах. Химерные вирусы по настоящему изобретению характеризуются наличием на поверхности вириона не только антигенов, связанных с вирусом, но также слитого белка.
Вирусы, которые могут быть сконструированы в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут представлять собой любой покрытый оболочкой вирус. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вирусы, которые могут быть сконструированы в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут быть сегментированными или несегментированными геномами, однонитевыми или двунитевыми геномами и экспрессировать по крайней мере один основной гликопро
- 15 016217 теин (например, ΝΑ, НА, ΗΝ или Р), который включается в оболочку вируса. Вирусы, используемые в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут быть выбраны из природных штаммов, вариантов или мутантов; подвергнутых мутагенезу вирусов (например, с помощью воздействия УФоблучением, мутагенов и/или пассирования); гибридных вирусов, содержащих части геномов двух различных вирусов (для вирусов с сегментированными геномами); и/или генетически сконструированных вирусов. Например, мутантные вирусы можно получить с помощью природной изменчивости, воздействия УФ-облучением, воздействия химическими мутагенами, с помощью пассирования в не факультативных хозяевах, с помощью формирования гибридных вирусов, содержащих части геномов двух различных вирусов (т.е. с помощью коинфицирования аттенуированного сегментированного вируса с другим штаммом, имеющим желаемые антигены) и/или с помощью генной инженерии (например, с использованием обратной генетики).
Неограничивающие примеры вирусов с сегментированными геномами, используемых в соответствии со способами по настоящему изобретению, содержат вирусы семейства ОйРотухоушбае (например, вирусы гриппа), Випуаушбае (например, Випуатетега), Веоушбае и Лгепаутбае (например, вирус лихорадки Ласса). Неограничивающие примеры вирусов с несегментированными геномами, используемых в соответствии со способами по настоящему изобретению, содержат вирусы семейства Согопаушбае (например, коронавирус человека (8ΑΡ8)). Нерабпаушбае (например, вирус гепатита А, В или С), Негрекушбае (например, вирус простого герпеса), Рохушбае (например, вирус натуральной оспы), ВРаЬбоушбае (например, вирус везикулярного стоматита (У8У), вирус Сендай и вирус бешенства), Рагатухоушбае (например, вирус кори и респираторно-синцитиальный вирус) и Рбоушбае (например, вирусы Марбург и Эбола). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения сегментированным вирусом является вирус гриппа. В других вариантах осуществления настоящего изобретения несегментированным вирусом является ΝΏν.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вирусы, выбираемые для применения в настоящем изобретении, являются аттенуированными и/или имеют недостаток антагонистической в отношении ΙΡΝ активности, т.е. они являются инфекционными и могут реплицироваться ίπ у1уо, но дают лишь низкие титры, приводящие к субклиникическим уровням инфекции, которые не являются патогенными. Такие вирусы можно аттенуировать любым способом, известным в данной области и/или приведенным в качестве примера в настоящем описании, например, созданием вируса, содержащего мутацию в гене Ν81 или содержащего модификацию в аминокислотной последовательности с множеством основных аминокислот перед сайтом расщепления в белке НА. Такие аттенуированные вирусы, разработанные в соответствии с настоящим изобретением, являются, следовательно, идеальными кандидатами для иммуногенных композиций, например, живых противовирусных вакцин. При введении индивиду аттенуированные химерные вирусы по настоящему изобретению способны вызывать иммунный ответ и индуцировать иммунитет как к вирусу, так и к неприродному или слитому белку. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения неприродный белок происходит из патогена. Вдобавок, введение индивиду такого химерного вируса вызывает иммунный ответ и/или иммунитет к указанному патогену помимо вируса.
Настоящее изобретение также относится к применению химерного вируса по настоящему изобретению в композициях (например, иммуногенных композициях) для людей или животных (например, птиц). В частности, химерные вирусы, которые являются аттенуированными, можно использовать в качестве вакцин против широкого ряда вирусов и/или заболеваний. Поскольку химерный вирус конструируется для экспрессии гетерологичных генных последовательностей в качестве чужеродных эпитопов в вирионе, композиции, содержащие химерный вирус по настоящему изобретению, (например, композиции вакцин) могут быть предназначены для иммунизации против множества штаммовых вариантов, различных вирусов или против совершенно различных инфекционных агентов или связанных с заболеванием антигенов (например, бактерий, паразитов, грибов или специфичных в отношении опухолей антигенов), из которых происходят гетерологичные генные последовательности. Можно использовать большое число различных способов введения композиций живых аттенуированных вирусов индивиду, являющемуся человеком или животным, для индуцирования иммунного ответа или ответа, в который вовлечены соответствующие цитокины. К ним относятся, но ими не ограничиваются, интраназальный, интратрахиальный, пероральный, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный способы.
5.1. Химерные вирусы гриппа
5.1.1. Химерный вирус птичьего гриппа, содержащий слитый белок, встраиваемый в его вирион
Настоящее изобретение относится к конструированию такого вируса птичьего гриппа, когда слитый белок кодируется геномом и при его экспрессии встраивается в вирион. Можно выбрать и использовать в соответствии с настоящим изобретением любой тип, подтип или штамм вируса птичьего гриппа, который можно сконструировать для экспрессии и встраивания слитого белка в вирион птичьего гриппа, в том числе, но ими не ограничиваясь, природные штаммы, варианты или мутанты, подвергнутые мутагенезу вирусы, гибридные вирусы, содержащие части геномов двух различных вирусов, и/или генетически сконструированных вирусов. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вирусы
- 16 016217 птичьего гриппа по настоящему изобретению представляют собой неприродные вирусы. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вирусы птичьего гриппа по настоящему изобретению представляют генетически сконструированные вирусы. Неограничивающие примеры вирусов птичьего гриппа содержат подтипы Η5Ν1, Η6Ν2, Η7Ν3, Η9Ν2 и Η10Ν7 вируса гриппа А.
Для генетического манипулирования вирусом гриппа требуется сконструировать по крайней мере один из восьми сегментов вирусной РНК, которые составляют вирусный геном. Мутагенез генома можно получить благодаря методам обратного конструирования (см. раздел 5.4). Однако гибкость генома вируса гриппа ограничена как числом сегментов, так и длиной сегментов, которые можно стабильно интегрировать в вирус. Общая стабильность длинных вставок неизвестна, и сегменты, содержащие такие вставки, или их части, могут быть потеряны благодаря образованию гибридных вирусов, содержащих части геномов двух различных вирусов, через несколько поколений. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вирус птичьего гриппа конструируют таким образом, что один из его основных поверхностных белков замещается слитым белком.
Соответственно, настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему по крайней мере один слитый белок, включающий эктодомен (ΕΌ) белка инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, и цитоплазматический (СТ) и трансмембранные (ТМ) домены или трансмембранный (ТМ) домен по крайней мере одного основного гликопротеина вируса гриппа, причем по крайней мере один слитый белок функционально замещает по крайней мере один основной гликопротеин вируса птичьего гриппа. Другими словами, вирус птичьего гриппа служит в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в ее вирион слитого белка вместо основного гликопротеина вируса гриппа. Встраивание ТМ и СТ доменов или ТМ домена гликопротеина вируса гриппа, соответствующего основному гликопротеину вируса птичьего гриппа, функционально замещаемого слитым белком, делает возможным встраивание слитого белка в вирион вируса птичьего гриппа. ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка могут соответствовать или происходить из любого вируса гриппа, который позволяет встраивать слитый белок в вирион вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену типа, подтипа или штамма вируса птичьего гриппа, отличного от вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса гриппа, отличного от вируса птичьего гриппа. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы.
Вирион вируса птичьего гриппа содержит два основных поверхностных гликопротеина, гемаглютинин (НА) и нейраминидазу (ΝΑ), каждый из которых содержит цитоплазматический домен, трансмембранный домен и эктодомен. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или белка НА, или белка ΝΑ вируса гриппа. Поскольку СТ домен НА или ΝΑ может не требоваться для встраивания слитого белка в вирион вируса птичьего гриппа, то в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок конструируют таким образом, что он содержит только ТМ домен НА или ΝΑ. Например, показано, что СТ домен ΝΑ не требуется для правильной упаковки этого белка в оболочки вируса гриппа А (6агс1а-8ак!ге е! а1., 1995, Уйик Кек. 37:37-47, который включен в качестве ссылки в полном объеме). Следовательно, если при создании слитого белка используются структурные домены, соответствующие доменам белка ΝΑ, то настоящее изобретение относится к конструированию слитого белка, содержащего только ТМ домен, соответствующий белку ΝΑ вируса гриппа. Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конструируют слитый белок, содержащий только ТМ домен, соответствующий ТМ домену белка ΝΑ вируса гриппа.
ТМ и СТ домены белков НА и ΝΑ вируса гриппа структурно отличаются тем, что домены находятся на С-конце белка НА и на Ν-конце белка ΝΑ. Помимо различной ориентации двух доменов в каждом классе поверхностного гликопротеина ТМ и СТ структурные домены могут включать еще неизвестные различия в функциональные группы, зависящие от их относительного расположения в пределах полипептидной цепи. Поэтому при конструировании слитого белка в вирусе птичьего гриппа ориентация эктодомена инфекционного агента, сливаемого с ТМ и СТ доменами или ТМ доменом гликопротеина вируса гриппа, будет определяться выбором ТМ и СТ доменов или ТМ домена. Например, если эктодомен инфекционного агента прикрепляется Ν-концом, то можно использовать ТМ и СТ домены белка ΝΑ вируса гриппа.
НА и ΝΑ проявляют конкурирующую активность в отношении слияния с клеткой и высвобождения из клетки, соответственно, которые необходимы для инфективности и размножения вируса. НА связывается с Ν-ацетилнейраминовой кислотой (№πΝΑό; сиаловой кислотой) на поверхности клетки, что приводит к поглощению вируса клеткой хозяином, в то время как ΝΑ отщепляет составляющие сиаловой кислоты с поверхности клетки, что приводит к высвобождению потомства вируса из инфицированной
- 17 016217 клетки. Нарушение любой из этих двух видов активности приводит к нефункциональному вирусу. Соответственно, для сохранения компетентности вируса при замещении поверхностного гликопротеина его функция в химерном вирусе должна обеспечиваться слитым белком. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа включает слитый белок, проявляющий нейраминидазную активность. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит слитый белок, проявляющий активность связывания с рецептором. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит два слитых белка, один из которых проявляет нейраминидазную активность, а другой - активность связывания с рецептором. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит слитый белок, содержащий эпитоп гетерологичного инфекционного агента, при этом слитый белок проявляет нейраминидазную активность или активность связывания с рецептором. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит слитый белок, проявляющий активность связывания с рецептором. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит поверхностный белок, содержащий эктодомен белка ΗΝ вируса псевдочумы птиц (ΝΏν) и ТМ и СТ домены белка ΝΑ вируса гриппа Α/Ψ8Ν/33, при этом эктодомен ΗΝ проявляет нейраминидазную активность. В других вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит поверхностный белок, содержащий эктодомен белка НА гетерологичного вируса гриппа (например, белка НА Н7 или белка НА Н9). НА и ΝΑ кодируются отдельными сегментами вирусного генома, и замена всей кодирующей области природного белка устраняет большинство ограничений длины последовательности, кодирующей встроенный белок.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен плюс 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков(а) эктодомена основного гликопротеина вируса гриппа.
Например, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка ΝΑ вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков(а) эктодомена белка ΝΑ вируса гриппа и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может замещать функцию белка ΝΑ. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка ΝΑ вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков(а) эктодомена белка ΝΑ вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка ΝΑ вируса гриппа, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально заместить белок ΝΑ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен или цитоплазматический и трансмембранный домены белка ΝΑ, полный домен ножки, или его фрагмент, белка ΝΑ, который предшествует его глобулярной головке, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально заместить белок ΝΑ. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка НА вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков(а) эктодомена белка НА вируса гриппа и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально заместить белок НА. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка НА вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков(а) эктодомена белка НА вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка НА вируса гриппа, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально заместить белок НА.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере один слитый белок химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению не содержит полноразмерный эктодомен гетерологичного белка (например, содержит антигенный фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента) и может содержать или может не содержать, кроме того, один или несколько фрагментов эктодомена природного основного гликопротеина. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может содержать фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомена слитого белка может содержать фрагменты и природного основного гликопротеина, и белка гетерологичного инфекционного агента. В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых слитый белок замещает основной поверхностный гликопротеин, функцию поверхностного гликопротеина должен обеспечивать слитый белок, т.е. слитый белок должен проявлять функциональность поверхностного гликопротеина, которого он замещает.
Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям (т.е. рекомбинантным сегментам), кодирующим слитые белки, описанные в разделе 5.1.1. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.1, содержат 3' и 5' сигналы встраивания, которые необхо
- 18 016217 димы для правильной репликации, транскрипции и упаковки вирусной РНК (ЕиЩ е! а1., 2003, Ргос. ИаИ. Асаб. 8с1. И8А 100: 2002-2007; 2йеид е! а1., 1996, У1го1оду 217:242-251, каждый из которых включены в описание в качестве ссылки в полном объеме). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в рекомбинантных сегментах по настоящему изобретению, следовательно, используются 3' и 5' некодирующие и/или нетранслируемые последовательности сегментов вирусов внутри одного и того же типа или штамма вируса, что и используемый в качестве основы вирус птичьего гриппа. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.1, которые содержат 3' некодирующую область РНК ΝΑ вируса гриппа, кодирующую ΝΑ область, соответствующую СТ и ТМ доменам белка ΝΑ, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 и 1 остатков (остаток) эктодомена белка ΝΑ вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка ΝΑ вируса гриппа, нетранслируемые области рамки считывания белка ΝΑ и 5' некодирующую область вирусной РНК ΝΑ.
В качестве альтернативы замещению белков ΝΑ или НА вируса птичьего гриппа для получения химерного вируса гриппа, содержащего эктодомен, или его фрагмент, белка инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, и ТМ и/или СТ домены вируса гриппа, можно использовать «обратную генетику» и бицистронные методы. См., например, патент США № 6887699, патент США № 6001634, патент США № 5854037 и патент США № 5820871, каждый из которых, таким образом, включены в качестве ссылки в полном объеме. Бицистронные подходы содержат встраивание кодирующей области слитого белка в открытую рамку считывания необходимого белка вируса и его стоп кодона. Вставка фланкируется ΙΚΕ8 и любыми нетранслируемыми сигнальными последовательностями необходимого белка, в который она встраивается, и не должна нарушать открытую рамку считывания, сигнал упаковки, полиаденилирования или промоторы транскрипции необходимого вирусного белка. Любые ΙΡΕ8. хорошо известные в данной области или описанные в настоящем изобретении, можно использовать в соответствии с настоящим изобретением (например, ΙΒΕ8 гена В1Р, нуклеотиды 372-592 НиМСВР78-данных, введенных в базу данных СеиВаик; или ΙΒΕ8 вируса энцефаломиокардита (ЕМСУ), нуклеотиды 1430-2115 СО867238-данных, введенных в базу данных СепВапк). Поскольку при бицистронном подходе функция НА или ΝΑ не замещается, то часть эктодомена слитого белка не ограничивается белком, который обеспечивает функцию замещаемого белка НА или ΝΑ. Эктодомен такого слитого белка может соответствовать любой гетерологичной молекуле или включать фрагмент любой гетерологичной молекулы, содержащей, но ими не ограничиваются, антигены, связанные с заболеванием антигены и антигены любого белка инфекционного агента (например, любого протективного антигена, связанного с вирусными, бактериальными или паразитарными инфекционными агентами). Неограничивающие примеры антигенов, информационных агентов или связанных с ними, для применения в соответствии со способами по настоящему изобретению представлены в разделе 5.3 ниже.
Замещение необходимого поверхностного белка вируса-основы или введение рекомбинантного сегмента в вирусный геном может аттенуировать получаемый в результате химерный вирус, т.е. химерный вирус будет проявлять сниженную репликацию относительного дикого типа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения желательна аттенуация химерного вируса, так что химерный вирус остается, по крайней мере частично, инфекционным и может реплицироваться ίη у1уо, но только образует низкие титры, что приводит к субклиническим уровням инфекции, которые не являются патогенными. Такие аттенуированные химерные вирусы особенно эффективны для таких вариантов осуществления настоящего изобретения, в которых вирус вводят индивиду для действия в качестве иммуногена, например, для живой вакцины. Вирусы можно аттенуировать любым способом, известным в данной области и/или приведенным в качестве примера, например, разработки вируса, содержащего мутацию в гене Ν81 или содержащего модификацию в аминокислотной последовательности с множеством основных аминокислот перед сайтом расщепления в белке НА (см. патент США № 6468544; патент США № 6669943; Ь1 е! а1., 1999, I. 1пГес1. Όίδ. 179: 1132-1138, каждый из которых, таким образом, включен в качестве ссылки в полном объеме).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене Ν81 вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которая, как известно, в других вирусах гриппа уменьшает способность продукта гена Ν81 служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене НА вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которая, как известно, в других вирусах гриппа уменьшает способность клеточных протеаз расщеплять белок в ее активную форму и, таким образом, уменьшает или исключает индуцируемое НА слияние и инфективность. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию как в гене НА, так и в гене Ν81 вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которые, как известно, в других вирусах гриппа уменьшают вирусную активность или по отдельности, или при объединении. Титры аттенуированных химерных вирусов птичьего гриппа и вирусов птичьего гриппа дикого типа можно определить с помощью любого
- 19 016217 метода, хорошо известного в данной области или описанного в настоящем описании (например, анализов гемаглютинации, анализа бляшкообразования, инфекционных доз для яйца (ЕШ50), инфекционных доз для культуры тканей (ТСГО50) и т.п.), и вирусы можно размножить в условиях, описанных в данном описании или хорошо известных в данной области (например, в клетках СЕР, клетках МОСК (например, в МЕМ, 10% объем/объем фетальной телячьей сыворотки (РС8), 1% пенициллин/стрептомицин при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 и увлажнением) или куриных яйцах с эмбрионами (например, в стационарном инкубаторе при 37°С с 55% относительной влажностью). Альтернативно, вирусы можно размножить в клетках (например, клетках СЕР, клетках МОСК и т.п.), которые выращивают в бессывороточной среде или среде с уменьшенным содержанием сыворотки (например, ТРСК трипсин).
5.1.2. Химерный аттенуированный вирус гриппа, содержащий слитый белок, встроенный в его вирион
Настоящее изобретение относится к конструированию аттенуированного вируса гриппа, у которого слитый белок кодируется геномом и при экспрессии встраивается в вирион. Другими словами, настоящее изобретение относится к применению аттенуированного вируса гриппа (родительского вируса) в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в его вирион слитого белка. В качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в вирусный вирион слитого белка, можно использовать любой тип или штамм аттенуированного вируса гриппа, содержащий, но ими не ограничивающийся, природные штаммы, варианты или мутанты, подвергнутые мутагенезу вирусы; гибридные вирусы, содержащие части геномов двух различных вирусов, и/или генетически модифицированные вирусы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения родительские вирусы гриппа, используемые в соответствии с настоящим изобретением, не являются природными вирусами. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения родительские вирусы гриппа, используемые в соответствии с настоящим изобретением, являются генетически сконструированными ви русами.
Вирусы гриппа, используемые в качестве основы по настоящему изобретению, могут естественным образом иметь аттенуированный фенотип, или их можно сконструировать с встраиванием связанной с аттенуированным фенотипом мутации, известной в данной области или описанной в настоящем описании (например, мутации в вирусном белке N81 или вирусном белке НА). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированным вирусом является вирус гриппа А. В других вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированным вирусом является вирус гриппа В. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированным вирусом является вирус гриппа С. Неограничивающие примеры вирусов гриппа, которые можно сконструировать в соответствии с настоящим изобретением, содержат подтип Н10Ш. подтип Н10№. подтип Н10У. подтип Н10Ж. подтип Н10Ж. подтип Н1Ш1, подтип Н1Ш13, подтип Н1Ш2, подтип Н1Ш4, подтип Н1Ш6, подтип Н1Ш8, подтип Н1Ш9, подтип Н12№, подтип Н12Ш. подтип Н12Ж5. подтип Н12Ж. подтип Н13Ш. подтип Н13Ж. подтип Н13Ж. подтип Н13Ж. подтип Н14Ж5. подтип Н14Ж. подтип Н15Ж. подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип
Н2№, №N2,
Н4М,
Н4Ж.
Н5Ж.
Н6Ж,
Н7Ш.
Н9М, подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип
Н2Ж. №N3, Н4№,
Н5М,
Н5Ж.
Н6Ж, Н7Ж5. №N2, подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип №N5, №N4,
Н4Ж.
Н5№,
Н6М, №N8,
Н7Ж, №N3, подтип Н2Ж, подтип №N5, подтип Н4Ш. подтип Н5Ж. подтип Н6№, подтип Н6Ж. подтип Н7Ж. подтип Н9Ж5.
подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип №N8,
Н3Ж, Н4Ж5. Н5Ш. Н6Ж.
Н7М, Н7Ж.
Н9Ж, подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип №N9, №N8,
Н4Ж,
Н5Ж, №N4,
Н7№,
Н8Ш.
№N7, подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип подтип
Н15Ж. подтип Н16Ж. подтип НШ1, подтип НШ2, подтип НШ3, подтип НШ6, подтип НЖ9, Н2М,
Н3М, №N9, Н4Ж.
Н5Ж, Н6Ж5.
Н7Ж, Н8Ж5.
Н9Ж или подтип Н9Ж вируса гриппа А; штамм АюЫ/5/88, штамм Акйа/27/2001, штамм Акйа/5/2001, штамм А1акка/16/2000. штамм А1акка/1777/2005. штамм АгдепОпа/69/2001. штамм Апхопа/146/2005, штамм Апкопа/148/2005. штамм Вапдкок/163/90, штамм Вапдкок/34/99, штамм Вапдкок/460/03, штамм Вапдкок/54/99, штамм Вагсе1опа/215/03, штамм Вещпд/15/84, штамм Веутд/184/93, штамм Ве1|1пд/243/97. штамм Ве|)т§/43/75. штамм Ве(|1пд/5/76, штамм Ве(|1пд/76/98, штамм Ве1д^ит/VV106/2002, штамм Ве1β^ит/\VV 107/2002. штамм Ве1β^ит/\VV109/2002, штамм Ве1βЦ1т/\VV114/2002, штамм Ве18ίι.ιιη/\νν122/2002. штамм Вопп/43, штамм ВгахП/952/2001. штамм ВисРагек!/795/03, штамм Виепок А1гек/161/00, штамм Виепок Аиек/9/95. штамм Виепок ΑίΐΌκ/8\ν 16/97, штамм Виепок Апек/У518/99, штамм СапаФа/464/2001, штамм СапаФа/464/2002, штамм Скасо/366/00, штамм Скасо/В 113/00. штамм С’кещ/303/03. штамм СЫЬа/447/98, штамм Скопдц1п§/3/2000. штамм - клинический изолят 8А1 Ткан 1апФ/2002, штамм - клинический изолят 8А10 ТРа11апФ/2002, штамм - клинический изолят 8А100 ΡΗίΙίρртек/2002, штамм - клинический изолят 8А101 РЫ11рртек/2002, штамм - клинический изолят 8А110 РЫ11рр1пек/2002, штамм - клинический изолят 8А112 РЫ11рртек/2002, штамм - клинический изолят 8А113 РЫ11рртек/2002, штамм - клинический изолят 8А114 РЫ11рртек/2002, штамм - клинический изолят 8А2 ТРа11апФ/2002, штамм - клинический изолят 8А20 ТкаПапФ/2002. штамм - клинический изолят 8А38 РЫ11рртек/2002, штамм - клинический изолят 8А39 ТРа11апФ/2002, штамм - клинический изолят
- 20 016217
8Α99 РЫ11рртс8/2002, штамм СМС/27/2001, штамм Со1огабо/2597/2004, штамм Со^боЬа/VΑ418/99, штамм Схсс1ю51оуак1а/16/89, штамм С7ссйо81оуак1а/69/909, штамм Эаски/10/97, штамм Паски/45/97, штамм Паски/47/97, штамм Паски/9/97, штамм В/Ли/4/78, штамм В/ОигЬап/39/98, штамм В/ПигЬаи/43/98, штамм В/ПигЬап/44/98, штамм В/ПигЬаи/52/98, штамм ПигЬап/55/98, штамм ПигЬап/56/98, штамм Епд1апб/1716/2005, штамм Епд1апб/2054/2005, штамм Епд1апб/23/04, штамм Р1п1апб/154/2002, штамм Рш1апб/159/2002, штамм Рш1апб/160/2002, штамм Р1п1апб/161/2002, штамм Р1п1апб/162/03, штамм Рш1апб/162/2002, штамм Р1п1апб/162/91, штамм Р1п1апб/164/2003, штамм Рш1апб/172/91, штамм Рш1аиб/173/2003, штамм Рш1аиб/176/2003, штамм Р1п1апб/184/91, штамм Рш1апб/188/2003, штамм Рш1апб/190/2003, штамм Рш1апб/220/2003, штамм Р1и1апб/^У5/2002, штамм Рицап/36/82, штамм 6спсуа/5079/03, штамм 6споа/11/02, штамм 6споа/2/02, штамм 6споа/21/02, штамм 6споуа/54/02, штамм 6споуа/55/02, штамм 6иапдбопд/05/94, штамм 6иапдбопд/08/93, штамм 6иапдбопд/5/94, штамм Оиапдбопд/55/89, штамм 6иапдбопд/8/93, штамм 6иапд7Йои/7/97, штамм 6иапд7Йои/86/92, штамм 6иапд7Йои/87/92, штамм 6усопдд1/592/2005, штамм ^ΗΜν^^^, штамм Ηа^Ь^п/07/94, штамм Иаνίί/10/2001, штамм 43^36/1990/2004, штамм 43^36/38/2001, штамм 43^36/9/2001, штамм ΗΛα/19/94, штамм ΗΛ^/3/94, штамм Непап/22/97, штамм Ηπό81^3/23/2001, штамм ^пд Копд/110/99, штамм ^пд Копд/1115/2002, штамм ^пд Копд/112/2001, штамм ^пд Копд/123/2001, штамм ^пд Копд/1351/2002, штамм ^пд Копд/1434/2002, штамм ^пд Копд/147/99, штамм ^пд Копд/156/99, штамм ^пд Копд/157/99, штамм ^пд Копд/22/2001, штамм ^пд Копд/22/89, штамм ^пд Копд/3 36/2001, штамм ^пд Копд/666/2001, штамм ^пд Копд/9/89, штамм Ηои8ΐоπ/1/91, штамм Ηои8ΐоп/1/96, штамм ^^!оп/2/96, штамм Ыипап/4/72, штамм !Ь3Г3к1/2/85, штамм Nс11соη/297/2005. штамм ИШа/Л^Л штамм Ιιι613/7727 6/2001, штамм Ι§Γ3^/95/03, штамм Ι5Πΐ6/\νν187/2002, штамм 1арап/1224/2005, штамм Лапд§и/10/03, штамм 4ойаппс8Ьигд/1/99, штамм 1об3ппс5Ьигд/96/01, штамм Кабота/1076/99, штамм Кабота/122/99, штамм Кадоки та/15/94, штамм Кап8а§/22992/99, штамм К11ахко\7224/91, штамм КоЬс/1/2002, штамм КоисЫ/193/99, штамм Ьа71о/1/02, штамм Ьсс/40, штамм Ьсшпдгаб/129/91, штамм Ь188аЬоп/2/90, штамм Ьо§ Α^^δ/1/02, штамм Ьи8ак3/270/99, штамм Ьуоп/1271/96, штамм Ма1ау513/83077/2001, штамм Мари!о/1/99, штамм Маг бс1 Р1а!а/595/99, штамм Магу 1апб/1/01, штамм МстрЬ18/1/01, штамм ΜстрЬ^8/12/97-ΜΑ, штамм М1сЫдап/22572/99, штамм М1с/1/93, штамм М11апо/1/01, штамм Мш§к/318/90, штамм Моксо^/3/03, штамм №доуа/20/99, штамм ^^13^/1/00, штамм №8ЙуШс/107/93, штамм Ν3δ1νί11Α45/91, штамм №Ьга8ка/2/01, штамм №Исг1апб/801/90, штамм №Исг1апб/429/98, штамм №\ν Уогк/1/2002, штамм МВ/48/90, штамм №пдх1а/45/83, штамм ^013171/84, штамм Отап/16299/2001, штамм О§ак3/1059/97, штамм О5ака/983/97-У2, штамм О§1о/1329/2002, штамм О§1о/1846/2002, штамм Рапата/45/90, штамм Рап 5/3 29/90, штамм Рагта/23/02, штамм РсгИ/211/2001, штамм Рсги/1364/2004, штамм Р1н11рртс5/5072/2001, штамм Ри§ап/270/99, штамм ОисЬсс/173/98, штамм ОисЬсс/465/98, штамм ОисЬсс/7/01, штамм Еот3/1/03, штамм 8ада/8172/99, штамм 8сои1/13/95, штамм 8сои1/37/91, штамм 81апдбопд/7/97, штамм 81апд1а1/361/2002, штамм 8Ыда/Т30/98, штамм 81с1иап/379/99, штамм 8шдарогс/222/79, штамм 8ра1п/^У27/2002, штамм 81оскЛо1т/10/90, штамм 8\\ίΙхсг1апб/5441/90, штамм Татап/0409/00, штамм Татап/0722/02, штамм Та61ап/97271/2001, штамм ТсЬгап/80/02, штамм Токуо/6/98, штамм Тпс51с/28/02, штамм И1ап ибс/4/02, штамм Ипбсб К1пдбот/34304/99, штамм и88В/100/83, штамм ^с1опа/103/89, штамм ^сппа/1/99, штамм ^и1ап/356/2000, штамм νν194/2002, штамм Хиап1и/23/82, штамм Уатада1а/1311/2003, штамм Уатада!3/К500/2001, штамм Α13563/12/96, штамм 6Α/86, штамм NΑ6Α8ΑКI/1/87, штамм Токуо/942/96 или штамм К.ос11с51сг/02/2001 вируса гриппа В; штамм Ακ1ί/1/81, штамм ΑΐΗ! Α^Ьо^/1/50, штамм Αото^^/74, штамм СаШогша/78, штамм Епд1апб/83, штамм 6гсссс/79, штамм Шго5Ыт3/246/2000, штамм Ηπό51^3/252/2000, штамм Ыуодо/1/83, штамм 4оЬаппс8Ьигд/66, штамм Капада13/1/76, штамм Куо!о/1/79, штамм М1551551рр1/80, штамм М1уад1/1/97, штамм М1уад1/5/2000, штамм М1уад1/9/96, штамм Ν3Ιώ/2/85, штамм №\ν 4сг8су/76, штамм Р1д/Всушд/115/81, штамм 8абата/3/2000, штамм 8Ь17иока/79, штамм Уатада!а/2/98, штамм Уатада1а/6/2000, штамм Уатада1:3/9/96, штамм ВЕВЬШ/1/85, штамм ΕN6^ΑN^/8 92/8, штамм ΟΠΙ/ΑΊ' I ./\КЕ8/1167/54, штамм Л/50, штамм РЮ/ВЕПШ6/10/81, штамм РЮ/ВЕиШ6/439/82, штамм ТΑΥ^ΟΚ71233/47 или штамм С/ΥΑΜΑ6ΑТΑ/10/81 вируса гриппа С.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, имеет сниженную способность служить антагонистом клеточного интерферона (ΙΕΝ). В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, является типом или штаммом вируса гриппа, содержащим мутацию в гене Ν81, что приводит к снижению способности вируса служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон. Примеры типов мутаций, которые могут быть встроены в ген Ν81 вируса гриппа, содержат делеции, замены, вставки и их комбинации. Одну или несколько мутаций можно ввести гделибо в гене Ν81 (например, Ν-конце, С-конце или где-нибудь между этими концами) и/или в регуляторном элементе гена Ν81. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает геном, имеющий ген Ν81 вируса гриппа с мутацией на Ν-конце. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус) включает геном,
- 21 016217 имеющий ген Ν81 вируса гриппа с мутацией на С-конце. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает геном, имеющий мутацию в гене Ν81 вируса гриппа, приводящую к делеции, состоящей из 5, предпочтительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 или 175 аминокислотных остатков с С-конца Ν81 или делеции между 5-170, 25-170, 100-170, 100-160, или 105-160 аминокислотными остатками с С-конца. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает геном, содержащий мутацию в гене Ν81 вируса гриппа, приводящую к делеции всех аминокислотных остатков за исключением аминокислотных остатков 1-126, аминокислотных остатков 1-120, аминокислотных остатков 1-115, аминокислотных остатков 1-110, аминокислотных остатков 1-100, аминокислотных остатков 1-99, аминокислотных остатков 1-95, аминокислотных остатков 1-85, аминокислотных остатков 1-80, аминокислотных остатков 1-75, аминокислотных остатков 1-73, аминокислотных остатков 1-70, аминокислотных остатков 1-65, аминокислотных остатков 1-60, причем Ν-концевая аминокислота соответствует номеру 1.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа по настоящему изобретению содержит геном, содержащий мутацию в гене Ν81 вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая уменьшает способность продукта гена Ν81 служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон, и позволяет при множественности заражения (ΜΟΙ) между 0,0005 и 0,001, 0,001 и 0,01, 0,01 и 0,1 или 0,1 и 1 или ΜΟΙ, составляющей 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 или 6,0, аттенуированному вирусу расти до титров, более низких от приблизительно 1 до приблизительно 100 раз, от приблизительно 5 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 20 до приблизительно 80 раз или от приблизительно 40 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 4 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 3 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 2 раз или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 раз по сравнению с титрами вируса гриппа дикого типа, в клетках (например, клетках, происходящих от человека, мыши, крысы, свиньи, собаки, лошади или птицы (например, НЕр-2, А549, 293Т, клетках почки собаки Мабт-ОагЬу (МОСК) или фибробластах куриных эмбрионов (СЕР)), что определяется через приблизительно 2-10 дней, 3-7 дней, 3-5 дней или 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10 дней после инфицирования при размножении в одних и тех же условиях. Титры аттенуированных вирусов гриппа и вирусов гриппа дикого типа можно определить с использованием любого метода, хорошо известного в данной области или описанного в настоящем описании (например, анализов гемаглютинации, анализа бляшкообразования, инфекционных доз для яйца (ΕΙΌ50), инфекционных доз для культуры тканей (ТСГО50) и т.п.), и вирусы можно размножить в условиях, описанных в настоящем описании или хорошо известных в данной области (например, в клетках СЕР, клетках МОСК (например, в МЕМ, 10% объем/объем фетальной телячьей сыворотки (РС8), 1% пенициллин/стрептомицин при 37°С в термостате с 5% СО2 и увлажнением) или в куриных яйцах с эмбрионами (например, в стационарном термостате при 37°С с 55% относительной влажностью). Альтернативно, вирусы можно размножить в клетках (например, клетках СЕР, клетках МОСК и т.п.), которые выращивают в бессывороточной среде или среде с уменьшенным содержанием сыворотки (например, ТРСК трипсин).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает геном, содержащий мутацию в гене НА вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая уменьшает или исключает способность клеточных протеаз расщеплять белок в его активную форму. Примеры типов мутаций, которые можно ввести в ген НА вируса гриппа, содержат делеции, замены, вставки или их комбинации. Одну или несколько мутаций предпочтительно вводят в сайт расщепления НА (например, нуклеотиды 1013-1039 АУ818135-данных, введенных в базу данных СепВапк). Как правило, мутации, уменьшающие расщепляемость белка НА, определяемую с помощью стандартных способов в СЕР, коррелируют со снижением вирулентности в ίη νίνο анализах (НопшоЮ апб Ка^аока, 1994, 68: 3120-3128; который таким образом полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки). В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает геном, имеющий мутацию в гене НА вируса гриппа, приводящую к замене нуклеотидов 1026-1038 единственным нуклеотидом с основанием в виде тимина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене НА вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая уменьшает или исключает способность клеточных протеаз расщеплять белок в его активную форму и позволяет при множественности заражения (МОГ) между 0,0005 и 0,001, 0,001 и 0,01, 0,01 и 0,1 или 0,1 и 1 или МОЕ составляющей 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 или 6,0, аттенуированному вирусу расти до титров, более низких от приблизительно 1 до приблизительно 100 раз, от приблизительно 5 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 20 до приблизительно 80 раз или от приблизительно 40 до приблизительно 80 раз, от приблизи
- 22 016217 тельно 1 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 4 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 3 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 2 раз или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 раз по сравнению с титрами вируса гриппа дикого типа, в клетках (например, клетках, происходящих от человека, мыши, крысы, свиньи, собаки, лошади или птицы (например, НЕр-2, А549, 293Т, клетках почки собаки Мабт-ЭагЬу (МОСК) или фибробластах куриных эмбрионов (СЕЕ)), что определяется через приблизительно 2-10 дней, 3-7 дней, 3-5 дней или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней после инфицирования при размножении в одних и тех же условиях. Белок НА, содержащий такую мутацию, антигенно не отличается от родительского белка НА дикого типа, т.е. все антитела, направленные против белка НА дикого типа, будут перекрестно реагировать с мутантным белком НА, и все антитела против мутантного белка НА будут перекрестно реагировать с белком НА дикого типа. Титры аттенуированных вирусов гриппа и вирусов гриппа дикого типа можно определить с использованием любого метода, хорошо известного в данной области или описанного в данном описании (например, анализов гемаглютинации, анализов бляшкообразования, инфекционных доз для яйца (ЕШ50), инфекционных доз для культуры тканей (ТСГО50) и т.п.), и вирусы можно размножить в условиях, описанных в данном описании или хорошо известных в данной области (например, в клетках СЕЕ, клетках МОСК (например, в МЕМ, 10% объем/объем фетальной телячьей сыворотки (ЕС8), 1% пенициллин/стрептомицин при 37°С в термостате с 5% СО2 и увлажнением) или в куриных яйцах с эмбрионами (например, в стационарном термостате при 37°С с 55% относительной влажностью). Альтернативно, вирусы можно размножить в клетках (например, клетках СЕЕ, клетках МОСК и т.п.), которые выращивают в бессывороточной среде или среде с уменьшенным содержанием сыворотки (например, ТРСК трипсин).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, содержит геном, содержащий (ί) мутацию в гене НА вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая уменьшает или исключает способность клеточных протеаз расщеплять белок в его активную форму, и (ίί) мутацию в гене Ν81, которая приводит к уменьшению способности вируса служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию и в гене НА, и в гене Ν81 вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая позволяет при множественности заражения (МО1) между 0,0005 и 0,001, 0,001 и 0,01, 0,01 и 0,1 или 0,1 и 1 или МО1, составляющей 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 или 6,0, аттенуированному вирусу расти до титров, более низких от приблизительно 1 до приблизительно 100 раз, от приблизительно 5 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 20 до приблизительно 80 раз или от приблизительно 40 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 4 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 3 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 2 раз или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 раз по сравнению с титрами вируса гриппа дикого типа, в клетках (например, клетках, происходящих от человека, мыши, крысы, свиньи, собаки, лошади или птицы (например, НЕр-2, А549, 293Т, клетках почки собаки Мабт-ЭагЬу (МОСК) или фибробластах куриных эмбрионов (СЕЕ)), что определяется через приблизительно 2-10 дней, 3-7 дней, 3-5 дней или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней после инфицирования при размножении в одних и тех же условиях.
Настоящее изобретение относится к химерному аттенуированному вирусу гриппа, содержащему по крайней мере один слитый белок, имеющий эктодомен (ЕО), или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, и цитоплазматический (СТ) и трансмембранный (ТМ) домены или трансмембранный (ТМ) домен основного гликопротеина вируса гриппа, причем по крайней мере один слитый белок функционально замещает по крайней мере один основной гликопротеин вируса птичьего гриппа. Другими словами, аттенуированный вирус гриппа служит в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в ее вирион по крайней мере одного слитого белка вместо основного гликопротеина вируса гриппа. Встраивание ТМ и СТ доменов или ТМ домена гликопротеина вируса гриппа, соответствующего основному гликопротеину вируса гриппа, функционально замещаемого слитым белком, делает возможным встраивание слитого белка в вирион аттенуированного вируса гриппа. ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка могут соответствовать или происходить из любого вируса гриппа, который делает возможным встраивание слитого белка в вирион аттенуированного вируса гриппа, используемого в качестве основы.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену типа, подтипа или штамма вируса гриппа, отличного от аттенуированного вируса гриппа, используемого в качестве основы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса гриппа разновидности, отличной от аттенуированного вируса гриппа, используемого в качестве основы. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам
- 23 016217 или ТМ домену аттенуированного вируса гриппа, используемого в качестве основы.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или белка НА, или белка ΝΑ вируса гриппа. Поскольку СТ домен НА или ΝΑ может быть необходим для встраивания слитого белка в вирион вируса гриппа, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок конструируют так, что он содержит только ТМ домен НА или ΝΑ.
ТМ и СТ домены белков НА и ΝΑ вируса гриппа структурно отличаются по тому, что домены находятся на С-конце белка НА и на Ν-конце белка ΝΑ. Помимо различного расположения двух доменов в каждом классе поверхностного гликопротеина ТМ и СТ структурные домены могут содержать еще неизвестные различия в функциональных группах, зависящих от их относительного расположения в пределах полипептидной цепи. Поэтому при конструировании слитого белка в аттенуированном вирусе гриппа расположение эктодомена, или его фрагмента, инфекционного агента, сливаемого с ТМ и СТ доменами или ТМ доменом гликопротеина вируса гриппа, будет определяться выбором ТМ и СТ доменов или ТМ домена.
Для сохранения компетентности вируса при замещении поверхностного гликопротеина его функция в химерном вирусе должна обеспечиваться слитым белком. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа содержит слитый белок, проявляющий нейраминидазную активность. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа содержит слитый белок, проявляющий активность связывания с рецептором. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус содержит два слитых белка, один из которых проявляет нейраминидазную активность, а другой активность связывания с рецептором. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа содержит слитый белок, содержащий фрагмент белка гетерологичного инфекционного агента, при этом слитый белок проявляет нейраминидазную активность или активность связывания с рецептором. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа содержит поверхностный белок, содержащий эктодомен белка ΗΝ вируса псевдочумы птиц (ΝΏν) и ТМ и СТ домены белка ΝΑ вируса гриппа Α/^δΝ/33, при этом эктодомен ΗΝ проявляет нейраминидазную активность. В других вариантах осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа включает слитый белок, содержащий эктодомен белка НА гетерологичного подтипа или штамма вируса гриппа (например, эктодомен НА Н7 или эктодомен НА Н9).
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере один слитый белок химерного аттенуированного вируса гриппа по настоящему изобретению не содержит весь эктодомен гетерологичного белка (например, включает антигенный или протективный фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента) и может содержать или может не содержать, кроме того, один или несколько фрагментов эктодомена природного основного гликопротеина. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может включать фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может включать фрагменты и природного основного гликопротеина, и белка гетерологичного инфекционного агента. В вариантах осуществления настоящего изобретения, когда слитый белок замещает основной поверхностный гликопротеин, функцию поверхностного гликопротеина должен обеспечивать слитый белок, т.е. слитый белок должен проявлять функциональность поверхностного гликопротеина, который он замещает.
Эктодомен слитых белков, описанных в разделе 5.1.2, может соответствовать или происходит из любого гликопротеина, или его фрагмента, инфекционного агента (в том числе вирусных, бактериальных или паразитарных инфекционных агентов). Неограничивающие примеры гликопротеинов инфекционных агентов представлены в разделе 5.3 ниже.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен плюс 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена основного гликопротеина вируса гриппа. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка ΝΑ вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 13, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белка ΝΑ вируса гриппа и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально замещать белок ΝΑ. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка ΝΑ вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка ΝΑ вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка ΝΑ вируса гриппа, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально замещать белок ΝΑ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен или цитоплазматический и трансмембранный домены белка ΝΑ, полный домен ножки, или его фрагмент, белка ΝΑ, который предшествует его глобулярной головке, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок мо
- 24 016217 жет функционально замещать белок ΝΑ. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка НА вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белка НА вируса гриппа и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может замещать функцию белка НА. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка НА вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка НА вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка НА вируса гриппа, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально замещать белок НА.
Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям (т.е. рекомбинантным сегментам), кодирующим слитые белки, описанные в разделе 5.1.2. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.2., содержат 3' и 5' сигналы встраивания, которые необходимы для правильной репликации, транскрипции и упаковки вирусной РНК (РиЩ с! а1., 2003, Ргос. №11. Асаб. 8с1. υ8Α 100:2002-2007; е! а1., 1996, Уйо1оду 217:242-251, каждый из которых полностью включен в настоящее описании в качестве ссылки). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в рекомбинантных сегментах по настоящему изобретению, следовательно, используются 3' и 5' некодирующие и/или нетранслируемые последовательности сегментов вирусов внутри одного и того же типа или штамма вируса, что аттенуированный вирус гриппа, используемый в качестве основы. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.2, которые содержат 3' некодирующую область РНК ΝΑ вируса гриппа, кодирующую ΝΑ область, соответствующую СТ и ТМ доменам белка ΝΑ, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 и 1 остатков (остаток) эктодомена белка ΝΑ вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка ΝΑ вируса гриппа, нетранслируемые области рамки считывания белка ΝΑ и 5' некодирующую область вирусной РНК ΝΑ. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.2, которые содержат полноразмерный домен ножки, или его фрагмент, белка ΝΑ, который предшествует его глобулярной головке.
В качестве альтернативы замещению белков ΝΑ или НА аттенуированного вируса гриппа для получения химерного вируса гриппа, содержащего эктодомен инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанный с заболеванием антиген и ТМ и/или СТ домены вируса гриппа, можно использовать обратную генетику и бицистронные методы. См., например, патент США № 6887699, патент США № 6001634, патент США № 5854037 и патент США № 5820871, каждый из которых таким образом включен в качестве ссылки в настоящее описании в полном объеме. Неограничивающие примеры гетерологичных молекул, таких как связанные с заболеванием антигены и антигены, происходящие из инфекционного агента, которые можно использовать в соответствии со способами по настоящему изобретению, (например, связанные с заболеванием антигены или вирусные белки) представлены в разделе 5.3 ниже.
5.1.3. Химерные вирусы птичьего гриппа, содержащие эктодомен белка ΗΝ вируса псевдочумы птиц
Настоящим изобретением охватывается конструирование вируса птичьего гриппа, в котором слитый белок, содержащий эктодомен белка ΗΝ вируса псевдочумы птиц, кодируется геномом и при экспрессии встраивается в вирион. Можно выбрать и использовать в соответствии с настоящим изобретением любой тип или штамм вируса птичьего гриппа, который можно сконструировать для экспрессии и встраивания в вирион вируса птичьего гриппа слитого белка, включая, но ими не ограничиваясь, природные штаммы, варианты или мутанты, подвергнутые мутагенезу вирусы; гибридные вирусы, содержащие части геномов двух различных вирусов, и/или генетически сконструированные вирусы.
Неограничивающие примеры вирусов птичьего гриппа содержат подтип Η5Ν1, Η6Ν2, Η7Ν3, Η9Ν2 или Η10Ν7 вируса гриппа А.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему слитый белок, имеющий эктодомен (ΕΌ) белка ΗΝ вируса псевдочумы птиц (ΝΏν) и цитоплазматический (СТ) и трансмембранный (ТМ) домены или трансмембранный (ТМ) домен белка ΝΑ вируса гриппа, причем слитый белок функционально замещает белок ΝΑ вируса птичьего гриппа. Другими словами, вирус птичьего гриппа служит в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в ее вирион слитого белка вместо белка ΝΑ вируса птичьего гриппа. Встраивание ТМ и СТ доменов или ТМ домена белка ΝΑ вируса гриппа в слитый белок делает возможным встраивание слитого белка в вирион вируса птичьего гриппа. ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка могут соответствовать или происходить из любого вируса гриппа, который делает возможным встраивание слитого белка в вирион вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы.
Кодирующие последовательности ТМ и СТ доменов, используемые в соответствии с настоящим
- 25 016217 изобретением, могут быть получены или происходить из опубликованной последовательности любого белка ΝΑ любого штамма или подтипа вируса гриппа (например, АУ651447-данных, введенных в базу данных СепВапк, из штамма Α/ΥίοΙ Nат/1203/2004(Η5N1); АУ96877-данных, введенных в базу данных СепВапк, из штамма А1игкеу/Саиаба/63(Н6№); АУ706954-данных, введенных в базу данных СепВапк, из штамма Абиск/Нашап/4/2004(Н6№); АУ646080-данных, введенных в базу данных СепВапк, из штамма А/сЫскеп/ВпШй Со1итЫа/С8С_йитап_В/04(Н7№); или 00064434-данных, введенных в базу данных СепВапк, из штамма А/сЫскеп/Веутд/8/98 (Η9Ν2)). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену типа или штамма вируса птичьего гриппа, отличного от вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса гриппа, отличного от вируса птичьего гриппа. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам белка NΑ АЛУ8Ш33 вируса гриппа.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка NΑ вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белка NΑ вируса гриппа и эктодомен белка ΗΝ ΝΟν. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка NΑ вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка NΑ вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка NΑ вируса гриппа, и эктодомен белка ΗΝ ΝΟν. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит полноразмерный домен ножки, или его фрагмент, белка NΑ, который предшествует его глобулярной головке, и эктодомен белка ΗΝ ΝΏν. В других конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен или цитоплазматический и трансмембранный домены белка NΑ и, кроме того, включает полный домен ножки, или его фрагмент, белка NΑ, который предшествует его глобулярной головке, и эктодомен белка ΗΝ ΝΏν.
В качестве альтернативы замещению белка NΑ вируса птичьего гриппа для получения химерного вируса гриппа, содержащего эктодомен белка ΗΝ ΝΏν и ТМ и/или СТ домены вируса гриппа, можно использовать обратную генетику и бицистронные методы. См., например, патент США № 6887699, патент США № 6001634, патент США № 5854037 и патент США № 5820871, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям (т.е. рекомбинантные сегменты), кодирующим слитые белки, описанные в разделе 5.1.3. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.3, содержат 3' и 5' сигналы встраивания, которые необходимы для правильной репликации, транскрипции и упаковки вирусной РНК (Рцщ е1 а1., 2 0 03, Ргос. Асаб. 8ск И8А 100:2002-2007; 2йепд е1 а1., 1996, Уйо1оду 217:242-251, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в рекомбинантных сегментах по настоящему изобретению, следовательно, используются 3' и 5' некодирующие и/или нетранслируемые последовательности сегментов вирусов внутри одного и того же типа или штамма вируса, что используемый в качестве основы вирус птичьего гриппа. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантный сегмент включает нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.3, которые содержат 3' некодирующую область РНК NΑ вируса гриппа, кодирующую NΑ область, соответствующую СТ и ТМ доменам белка NΑ, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 и 1 остатков (остаток) эктодомена белка NΑ вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка NΑ вируса гриппа, нетранслируемые области рамки считывания белка NΑ и 5' некодирующую область вирусной РНК NΑ. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантный сегмент включает, в направлении от 3' к 5', 3' некодирующую область РНК NΑ вируса \ν8Ν (19 нуклеотидов), нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки 1-36 (108 нуклеотидов) кодирующей NΑ области, нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки 51-568 белка ΗΝ ΝΏν В1, два последовательных стоп-кодона, 157 нуклеотидов нетранслируемой области рамки считывания белка NΑ νδΝ и 5' некодирующую область РНК вируса νδΝ (28 нуклеотидов). Смотри фиг. 1.
Замещение белка NΑ вируса гриппа, используемого в качестве основы, или введение рекомбинантного сегмента в вирусный геном может аттенуировать получаемый в результате химерный вирус, т.е. химерный вирус будет проявлять сниженную репликацию относительного дикого типа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения желательна аттенуация химерного вируса, так что химерный вирус остается, по крайней мере частично, инфекционным и может реплицироваться ш νίνο, но образует только низкие титры, что приводит к субклиническим уровням инфекции, которые не явля
- 26 016217 ются патогенными. Такие аттенуированные химерные вирусы особенно подходят для таких вариантов осуществления настоящего изобретения, в которых вирус вводят индивиду для того, чтобы он действовал в качестве иммуногена, например, для живой вакцины. Вирусы можно аттенуировать с помощью любого способа, известного в данной области и/или приведенного в качестве примера в данном описании, например конструирования вируса, содержащего мутацию в гене Ν81 или содержащего модификацию в аминокислотной последовательности с множеством основных аминокислот перед сайтом расщепления в белке НА (см. патент США № 6468544; патент США № 6669943; Ь1 е1 а1., 1999, I. 1пГес1. Ώίδ. 179:1132-1138, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене Ν81 вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которая, как известно, в других вирусах гриппа уменьшает способность продукта гена Ν81 служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене НА вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которая, как известно, в других вирусах гриппа уменьшает или исключает способность клеточных протеаз расщеплять белок в ее активную форму и, таким образом, уменьшает или исключает индуцируемое НА слияние и инфективность. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению содержит геном, содержащий мутацию и в гене НА, и в гене Ν81 вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которые, как известно, в других вирусах гриппа уменьшают или исключают вирусную активность или по отдельности, или при объединении. Титры аттенуированных химерных вирусов птичьего гриппа и вирусов птичьего гриппа дикого типа можно определить с использованием любого метода, хорошо известного в данной области или описанного в данном описании (например, анализов гемаглютинации, анализов бляшкообразования, инфекционных доз для яйца (ЕШ50), инфекционных доз для культуры тканей (ТСШ50) и т.п.), и вирусы можно размножить в условиях, описанных в данном описании или хорошо известных в данной области (например, в клетках СЕТ, клетках МОСК (например, в МЕМ, 10% объем/объем фетальной телячьей сыворотки (РС8), 1% пенициллин/стрептомицин при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 и увлажнением) или куриных яйцах с эмбрионами (например, в стационарном инкубаторе при 37°С с 55% относительной влажностью). Альтернативно, вирусы можно размножить в клетках (например, клетках СЕТ, клетках МОСК и т.п.), которые выращивают в бессывороточной среде или среде с уменьшенным содержанием сыворотки (например, ТРСК трипсин).
5.2. Химерный вирус псевдочумы птиц
Настоящее изобретение относится к конструированию вируса псевдочумы птиц (ΝΏν), в котором по крайней мере один слитый белок кодируется геномом и при экспрессии содержится в вирионе. Можно выбрать и использовать в соответствии с настоящим изобретением любой тип или штамм ΝΏν, который можно сконструировать для экспрессии и встраивания в вирион ΝΏν по крайней мере одного слитого белка, содержащий, но ими не ограничиваясь, природные штаммы, варианты или мутанты, подвергнутые мутагенезу вирусы; гибридные вирусы, содержащие части геномов двух различных вирусов, и/или генетически сконструированные вирусы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения ΝΏν является встречающимся в природе вирусом. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения ΝΏν является генетически сконструированным вирусом. Например, как описано в настоящем описании, в соответствии со способами по настоящему изобретению можно использовать мутантные штаммы рекомбинантного ΝΏν, ΓΝ0ν/Ε2;·ι;·ι и ΓΝ0ν/Ε3αα, в которых сайт расщепления белка Р заменен сайтом, содержащим один или два дополнительных остатков аргинина, что делает возможной активацию мутантного сайта расщепления с помощью повсеместно экспрессируемых протеаз семейства фуринов. Неограничивающие примеры ΝΏν, которые можно использовать в соответствии со способами по настоящему изобретению, содержат В1, Ьа8о!а, ΥΟ97, МЕТ95 и Р48Е9. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения химерный ΝΏν или τΝΏν по настоящему изобретению включает слитый белок, содержащий эктодомен белка НА вируса гриппа; в конкретном примере в соответствии с эти вариантом осуществления белком НА вируса гриппа является белок НА вируса гриппа Н7.
Настоящее изобретение относится к химерному ΝΏν, содержащему по крайней мере один слитый белок, имеющий эктодомен (ΈΟ), или его фрагмент, белка инфекционного агента, отличного от белка ΝΏν, и цитоплазматический (СТ) и/или трансмембранный (ТМ) домены основного гликопротеина ΝΏν. Настоящее изобретение также относится к химерному ΝΏν, содержащему по крайней мере один слитый белок, имеющий ЕЭ, или его фрагмент, и ТМ домен белка инфекционного агента, отличного от гликопротеина ΝΏν, и СТ домен основного гликопротеина ΝΏν. Настоящее изобретение, кроме того, относится к химерному ΝΏν, содержащему слитый белок, имеющий ЕЭ, или его фрагмент, и СТ домен белка инфекционного агента, отличного от гликопротеина ΝΏν, и ТМ домен основного гликопротеина ΝΏν. Другими словами, вирус ΝΏν служит в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в ее вирион слитого белка. Встраивание ТМ и/или СТ доменов основного гликопротеина
- 27 016217
ΝΏν в слитый белок делает возможным встраивание слитого белка в вирион ΝΏν. ТМ и/или СТ домены слитого белка могут соответствовать или происходить из любого ΝΏν, который делает возможным встраивание слитого белка в вирион ΝΏν, используемого в качестве основы.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и/или СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и/или СТ доменам типа или штамма ΝΏν, отличного от ΝΏν, используемого в качестве основы. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и/или СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и/или СТ доменам ΝΏν, используемого в качестве основы.
Вирион ΝΏν включает два основных поверхностных гликопротеина, белок слияния (Т) и гемаглютинин-нейраминидазу (ΗΝ), оба из которых содержат цитоплазматический домен, трансмембранный домен и эктодомен. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и/или СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и/или СТ доменам или белка Р, или белка ΗΝ ΝΏν.
ТМ и СТ домены белков Р или ΗΝ ΝΏν структурно отличаются по тому, что домены находятся на С-конце белка Р и на Ν-конце белка ΗΝ. Поэтому при конструировании слитого белка в ΝΏν ориентация эктодомена инфекционного агента, сливаемого с ТМ и/или СТ доменами гликопротеина ΝΏν, будет определяться выбором ТМ и/или СТ доменов.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере один слитый белок химерного ΝΏν включает ТМ домен и 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена основного гликопротеина ΝΏν. Например, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка Р ΝΏν, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белка Р ΝΏν и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от ΝΏν, так что слитый белок может функционально замещать белок Р. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка Р ΝΏν, 1-15, 1-10, 15, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка Р ΝΏν, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка Р ΝΏν, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от ΝΏν, так что слитый белок может функционально замещать белок Р. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка ΗΝ ΝΏν, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белка ΗΝ ΝΏν и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от ΝΏν, так что слитый белок может замещать функцию белка ΗΝ. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка ΗΝ ΝΏν, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка ΗΝ ΝΏν, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка ΗΝ ΝΏν, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от ΝΏν, так что слитый белок может функционально замещать белок ΗΝ.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения поверхностный гликопротеин ΝΏν (т.е. белок ΗΝ или Р) замещен слитым белком, который обеспечивает требуемую функцию(и) гликопротеина ΝΏν. В соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка должен выбираться так, чтобы он обеспечивал требуемую функцию(и) замещенного гликопротеина ΝΏν. В других вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок экспрессируется и встраивается в вирион ΝΏν помимо природных поверхностных гликопротеинов ΝΏν.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере один слитый белок химерного ΝΏν по настоящему изобретению не включает полный эктодомен гетерологичного белка (например, включает антигенный фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента) и может содержать или может не содержать, кроме того, один или несколько фрагментов эктодомена природного основного гликопротеина. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может включать фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может включать фрагменты и природного основного гликопротеина, и белка гетерологичного инфекционного агента. В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых слитый белок замещает основной поверхностный гликопротеин, функцию поверхностного гликопротеина должен обеспечивать слитый белок, т.е. слитый белок должен проявлять функциональность поверхностного гликопротеина, которого он замещает.
При условии, что слитый белок, описанный в разделе 5.2, не требуется для замещения функции необходимого вирусного гликопротеина, эктодомен слитого белка может соответствовать или происходить из любой гетерологичной молекулы, содержащей, но ими не ограничиваются, любой антиген инфекционного агента (в том числе антигены вирусных, бактериальных и паразитарных инфекционных агентов) и любой связанный с заболеванием антиген. Неограничивающие примеры антигенов инфекционных агентов и/или связанных с заболеванием антигенов представлены в разделе 5.3 ниже.
Настоящим изобретением охватываются нуклеотидные последовательности, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.2. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность включает нуклеиновые кислоты, кодирующие последовательность Кохак.
- 28 016217 за которой следует конец гена, межцистронный нуклеотид (Т), и последовательность начала гена белка Р ΝΏν, за которым следует 5' нетранслируемая область и ОКР белка НА Η7Ν2.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения штаммы ΝΏν, используемые в соответствии с настоящим изобретением, являются штаммами вируса со сниженной вирулентностью, т.е. такие штаммы, которые обычно проявляют низкую вирулентность или бессимптомную инфекцию у птиц, например, штамм В1, штамм Ба8о1а или штамм Ме!95. Настоящее изобретение также относится к применению высоковирулентных штаммов ΝΏΑ, например, ΥΟ97 или Р48Е9, или штаммов ΝΏν, которые были модифицированы с помощью генетической рекомбинации с использованием способов, известных в данной области или приведенных в качестве примера в данном описании. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению ΝΏν, в котором белок Р ΝΏν был генетически модифицирован в сайте расщепления для того, чтобы увеличить активность слияния. В конкретном примере в соответствии с настоящим изобретением модифицированный белок Р включает две-три аминокислотных мутаций в сайте расщепления Р. Замещение необходимого поверхностного белка вируса, используемого в качестве основы, или введение нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок, в вирусный геном может привести к аттенуации, или дополнительной аттенуации, получаемого в результате химерного вируса, т. е. химерный вирус будет проявлять сниженную репликацию относительно дикого типа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения желательна аттенуация, или дополнительная аттенуация, химерного вируса, так что химерный вирус остается, по крайней мере частично, инфекционным и может реплицироваться ш угуо, но образует только низкие титры, что приводит к субклиническим уровням инфекции, которые не являются патогенными. Такие аттенуированные химерные вирусы особенно подходят для таких вариантов осуществления настоящего изобретения, в которых вирус вводят индивиду для того, чтобы он действовал в качестве иммуногена, например, для живой вакцины. Вирусы можно аттенуировать с помощью любого способа, известного в данной области.
5.3. Антигены, которые можно сконструировать в химерных вирусах по настоящему изобретению
В соответствии с настоящим изобретением можно сконструировать любую гетерологичную молекулу в вирусе, используемом в качестве основы, для вызова иммунного ответа на указанную молекулу. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения любой антиген любого инфекционного патогена или любой антиген, связанный с каким-либо заболеванием, который способен вызывать иммунный ответ, можно сконструировать в ΝΏν и/или вирусе гриппа, используемом в качестве основы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения антигеном является гликопротеин. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антиген способен функционально заместить основной гликопротеин вируса гриппа и/или ΝΏν. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения антиген проявляет активности нейраминидазы или гемаглютинина (например, слияния/связывания с рецептором). При выборе используемого в качестве основы вируса для экспрессии антигена принимается во внимание ориентация нуклеотидов, кодирующих антиген. Например, если антиген в природе прикрепляется аминоконцом, ТМ и СТ домены или ТМ домен, используемые при конструировании слитого белка, будут соответствовать ТМ и СТ доменам или ТМ домену необходимого вирусного белка вируса, используемого в качестве основы, или родственного вируса, который также в природе прикрепляется через его аминоконец, например, белка ΝΑ вируса гриппа или белка ΗΝ ΝΏν.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения вирусный антиген конструируют в ΝΏν или вирусе гриппа в качестве основы. Неограничивающие примеры вирусных антигенов содержат антигены Абеиоушбае (например, мастаденовируса и авиаденовируса), Негре^тпбае (например, вируса 1 простого герпеса, вируса 2 простого герпеса, вируса 5 простого герпеса, вируса 6 простого герпеса, вируса Эпштейна-Барра, ΗΗν6-ΗΗν8 и цитомегаловируса), Беугушбае (например, левивируса, энтеробактерий фазы М82, аллолевивируса), Рохушбае (например, поксвирусов позвоночных, парапоксивируса, авипоксвируса, каприпоксвируса, лепорипоксвируса, суипоксвируса, вируса контагиозного моллюска и поксвирусов насекомых), Рароуаутбае (например, полиомавируса и папилломавируса), Рагату.хоутбае (например, парамиксовируса, вируса 1 парагриппа, МоЬШМгик (например, вируса кори), КиЬи1ау1ги5 (например, вируса эпидемического паротита), Риеитоиоушиае (например, пневмовируса, респираторно-синцитиального вируса), респираторно-синцитиального вируса человека и метапневмовируса (например, пневмовируса птиц и метапневмовируса человека)), Рюогиаушбае (например, энтеровируса, риновируса, гепатовируса (например, вируса гепатита А человека), кардиовируса и артровируса), Кеоушбае (например, ортореовируса, орбивируса, ротавируса, циповируса, фидживируса, фитореовируса и оризавируса), Кейоушбае (например, ретровирусов типа В млекопитающих, ретровирусов типа С млекопитающих, ретровирусов типа С птиц, группы ретровирусов типа Ό, ретровирусов ВБУ-БТБУ, лентивируса (например, вируса 1 иммунодефицита человека и вируса 2 иммунодефицита человека (например, др160 ВИЧ), спумавируса), Р1ау|утбае (например, вируса гепатита С, вируса денге, вируса Западного Нила), ^рабиа-утбие (например, вируса гепатита В), Тодаушбае (например, альфавируса (например, вируса Синдбис) и КиЬгуиик (например, вируса краснухи), КйаЬбоушбае (например, везикуловируса, лиссавируса, вируса эфемерной лихорадки, циторабдовируса и нуклеорабдовируса), Агеиаушбае (например, аренавируса, вируса лимфоцитарного хориоменингита, иппи-вируса и вируса Ласа) и Сого
- 29 016217 паушбае (например, коронавируса и торовируса). В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вирусный антиген представляет собой др120 ВИЧ, ие£ ВИЧ, гликопротеин Р Κδν, гликопротеин С Κδν, нейраминидазу вируса гриппа, гемаглютинин вируса гриппа, белок Тах ΗΊΈν, гликопротеин вируса простого герпеса (например, дВ, дС, дИ и дЕ) или поверхностный антиген вируса гепатита В, белок Е вируса гепатита С или белок шипа коронавируса. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вирусный антиген не является др41. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вирусный антиген происходит из парамиксовируса. В других альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения вирусный антиген не происходит из парамиксовируса. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вирусный антиген происходит из вируса типа 1 парагриппа человека, вируса типа 3 парагриппа - человека, К.8У или вируса Сендай. В других альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения вирусный антиген не происходит из вируса типа 1 парагриппа человека, вируса типа 3 парагриппа человека, К.8У или вируса Сендай. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения вирус, используемый в качестве основы, представляет собой вирус гриппа, а антиген, конструируемый в вирусе гриппа, используемом в качестве основы, не является антигеном вируса гриппа. В других конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения вирус, используемый в качестве основы, представляет собой ΝΏν, а антиген, конструируемый в ΝΏν, используемом в качестве основы, не является антигеном ΝΏν.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения бактериальный антиген (например, белок бактериальной оболочки или антиген, связанный с указанной бактерией) конструируют в ΝΏν или вирусе гриппа, используемом в качестве основы. Неограничивающие примеры бактериальных антигенов содержат антигены бактерий семейства ЛсцтртПит. семейства Αζοφίπΐΐιιιη. семейства Л/о1оЬае(егаееае. семейства Вас!его1басеае, рода ВайоиеНа, семейства Вбе11оу1Ьпо, рода Сатру1оЬас!ег, рода СЬ1атуб1а (например, СЫатуб1а рпеитошае), рода С1ок!пбшт, семейства Еи!егоЬас!епасеае (например, рода СбгоЬас!ег, Еб\уагбк1е11а, Еи!егоЬас!ег аегодепек, рода Егоша, ЕкскейсЫа сой, рода Ηаίша, рода К1еЬк1е11а, рода Могдапе11а, Рго!еик уи1дапк, Ргоу1бепаа, рода 8а1топе11а, 8еггайа тагсексепк и 8Ыде11а Пехпеп), семейства Сагбше11а, ИаеторНПик тПиеи/ае, семейства Ηа1οЬасΐеπасеае, семейства Ηе1^сοЬасΐе^, семейства Ьедюпа11асеае, рода Ык!епа, семейства Ме!ку1ососсасеае, микобактерий (например, МусоЬас!епит !иЬегси1ок1к), семейства №1ккепасеае, семейства Осеапокрш11ит, семейства Рак!еиге11асеае, рода Рпеитососсик, рода Ркеиботопак, семейства ВЫ/оЫасеае, семейства 8рш11ит, семейства 8риокотасеае, рода 81ар11у1ососсик (например, устойчивого к метициллину 81арНу1ососсик аигеик и 81арНу1ососсик ругодепек), рода 8!гер!ососсик (например, 8!гер!ососсик еп!егШб1к, 8!гер!ососсик Еакаае и 8!гер!ососсик рпеитошае), семейства ШИ^Ьа^т, семейства Уегыша, ВасШик ап!гас1к и семейства Уатрио\зЬпо.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения антиген, связанный с паразитом (например, простейших) конструируют в ΝΏν или вирусе гриппа, используемом в качестве основы. В соответствии со способами по настоящему изобретению можно использовать любой антиген, связанный с паразитом, или антиген паразита. Неограничивающие примеры антигенов паразитов содержат антигены паразита, такого как амеба, малярийного паразита, Р1актобшт, Тгурапокота сги/ί.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антиген гриба конструируют в ΝΏν или вирусе гриппа, используемом в качестве основы. Неограничивающие примеры антигенов грибов содержат антигены грибов рода (например, ΑЬк^б^а согутЫЕега и ΑЬк^б^а гатока), рода Α^^^ (например, Α^^^ йауик, £ит1да!ик, Α^^^ шби1апк, Α^^^ шдег и 1еггеик), Вак1бюЬо1ик гапагит, В1акЮтусек бегтайббк, рода Сапб1ба (например, Сапб1ба а1Ь1сапк, Сапб1ба д1аЬга!а, Сапб1ба кегг, Сапб1ба кгике1, Сапб1ба рагаркйокк, Сапб1ба ркеибойорюайк, Сапб1ба диШегтопби, Сапб1ба гидока, Сапб1ба к!е11а!о1беа и Сапб1ба йорюайк), Сосс1бю1бек 1тт1йк, рода СошбюЬо1ик, Сгур!ососсик пеоГогтк, рода Сиип^пдкате11а, дерматофитов, И|кЮр1акта сарки1а!ит, Мюгокрогит дуркеит, Мисог рикШик, Рагасосабю1бек ЬгакШепйк, Ркеиба11ексйепа Ьоубп, ВЫпокройбшт кееЬеп, Рпеитосукбк саппл, рода Βΐιί/орик (например, Βΐιί/орик аггЫ/ик, Βΐιί/орик огу/ае и Βΐιί/орик ткгокрогик), рода 8асскаготусек, 8рогоШпх ксйепски, зигомицетов и классов, таких как 2удотусе!ек, Αксοтусеΐек, Ваыбютусе!ек, Эеи1еготусе1ек и Оотусе1ек.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения связанный с опухолью антиген конструируют в ΝΏν или вирусе гриппа, используемом в качестве основы. В соответствии со способами по настоящему изобретению можно использовать любой связанный с опухолью антиген, известный в данной области. Неограничивающие примеры связанных с опухолью антигенов содержат антигены МЛСЕ1, МΑ6Е-3, ВΑ6Е, 6Α6Е-1, 6Α6Е-2, №ацетилглюкозаминилтрансферазу^, Р-15, МΑΚТ-1/Ме1аηΑ, ТВР-1 (др75), тирозиназу, циклинзависимую киназу 4, β-катенин, МИМ-1, СЭК4, ΗЕΚ-2/пеи, папилломавирус-Е6 человека, папилломавирус-Е7 человека, МИС-1, каспазу-8, СЭ5, СЭ20, СЕА, муцин-1, Ье^1кх, СА-125, рецептор эпидермального фактора роста, р 185Η№2, 1Ь-2К, Рар-α, тенасцин, антигены, связанные с металлопротеиназой, и САМРАТН-1.
5.4. Конструирование и размножение химерных вирусов по настоящему изобретению
Химерные вирусы по настоящему изобретению можно создать, используя метод обратной генетики. Метод обратной генетики включает приготовление синтетических рекомбинантных вирусных РНК, ко
- 30 016217 торые содержат некодирующие области негативной нити РНК вируса, которые важны для узнавания вирусными полимеразами и упаковки сигналов, необходимых для получения зрелого вириона. Рекомбинантные РНК синтезируют из рекомбинантных ДНК-матриц и восстанавливают ш уйго с использованием очищенного вирусного полимеразного комплекса с образованием рекомбинантных рибонуклеопротеинов (РНР), которые можно использовать для трансфекции клеток. Более эффективная трансфекция достигается, если вирусные полимеразные белки присутствуют во время транскрипции синтетической РНК или 1п У11го. или ш у1уо. Синтетические рекомбинантные РНР можно восстановить в инфекционные вирусные частицы. Вышеизложенные методы описаны в патенте США № 5166057, выданном 24 ноября 1992, в патенте США № 5854037, выданном 29 декабря 1998, в публикации Европейского патента ЕР 0702085А1, опубликованной 20 февраля 1996, в заявке на патент США № 09/152845, в публикации международной заявки на патент РСТ \УО 97/12032, опубликованной 3 апреля 1997, и \УО 96/34625, опубликованной 7 ноября 1996, в публикации Европейского патента ЕР А780475, в заявке \¥О 99/02657, опубликованной 21 января 1999, в заявке XVО 98/53078, опубликованной 26 ноября 1998, в заявке ^О98/02530, опубликованной 22 января 1998, в заявке VО 99/15672, опубликованной 1 апреля 1999, в заявке VО 98/13501, опубликованной 2 апреля 1998, в заявке VО 97/06270, опубликованной 20 февраля 1997, и ЕРО 780475А1, опубликованной 25 июня 1997, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Для конструирования химерного вируса по настоящему изобретению можно также использовать плазмидную технологию без фага-помощника. Вкратце, что касается вируса гриппа, полноразмерные кДНК вирусных сегментов амплифицируют, используя ПЦР с использованием праймеров, содержащих уникальные рестрикционные сайты, которые позволяют встраивать ПЦР-продукт в плазмидный вектор (ПапбогГег е1 а1., 2003, I. νπΌΐ. 77:9116-9123; Nакауа е1 а1., 2001, I. νΐΐΌΐ. 75:118 68-11873, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки). Плазмидный вектор предназначен для позиционирования ПЦР-продукта между усеченным промотором РНКполимеразы Ι человека и последовательностью рибозима вируса гепатита дельта, так что с промотора полимеразы I продуцируется точный негативный (смысловая вирусная РНК) транскрипт. Отдельные плазмидные векторы, содержащие каждый из вирусных сегментов, а также экспрессирующие векторы, содержащие необходимые вирусные белки, трансфицируют в клетки, что приводит к продукции рекомбинантных вирусных частиц. В отношении подробного описания плазмидной технологию без фагапомошника смотри, например, публикацию международной заявки VО 01/04333, патент США № 6649372, Робог е1 а1., 1999, I. νΐΐΌΐ. 73:9679-9682; Нойтапп е1 а1., 2000, Ргос. №11. Αсаб. δα. υδΑ 97:61086113; №итапп е1 а1., 1999, Ргос. №11. Αсаб. 8с1. υδΑ 96:9345-9350, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки. Аналогично, что касается генома ΝΏν в виде одного сегмента, полную кДНК штамма Нйсйпег В1 конструируют, встраивают в плазмидный вектор и разрабатывают с содержанием уникального рестрикционного сайта между генами Р и М. Слитый белок, сконструированный в соответствии с настоящим изобретением, можно затем встроить в вирусный геном в уникальном рестрикционном сайте. Единственный сегмент помещают между промотором Т7 и рибозимом вируса гепатита дельта с получением точного негативного транскрипта с помощью полимеразы Т7. Плазмидный вектор и экспрессирующие векторы, содержащие необходимые вирусные белки, трансфицируют в клетки, что приводит к продукции рекомбинантных вирусных частиц (см., 8\\'аупе е1 а1., 2003, Αν^аπ Ώίδ. 47:1047-1050; 8\\'аупе е1 а1., 2001, I. νπΌ1. 11868-11873, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки).
Химерные вирусы гриппа по настоящему изобретению можно разработать так, что они будут содержать сегменты РНК, которые являются бицистронными. Бицистронные методы позволяют конструировать кодирующие последовательности множества белков в единственной мРНК благодаря использованию последовательностей ΙΚΕδ. Последовательности ΙΚΕδ руководят внутренним рекрутментом рибосом на молекуле РНК и делают возможной трансляцию в направлении 3' независимым от кэпгруппировки образом. Вкратце, кодирующую область одного белка встраивают в ОКЕ второго белка. Вставка фланкирована ΙΚΕδ и любыми нетранслируемыми сигнальными последовательностями, необходимыми для правильной экспрессии и/или функционирования. Вставка не нарушает открытую рамку считывания, полиаденилирование или промоторы транскрипции второго белка (см., например, Сагс1аδа81^е е1 а1., 1994, I. νπΌ1. 68:6254-6261; СагааХайге е1 а1., 1994, Эеу. Вю1. δΡΗκΙ. 82:237-246, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки).
5.4.1. Размножение химерных вирусов
Химерные вирусы по настоящему изобретению можно размножать в любом субстрате, позволяющем вирусу расти до титров, которые делают возможным применения химерных вирусов, описанных в данном описании. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения субстрат позволяет химерным вирусам расти до титров, сравнимых с титрами, определяемыми для соответствующих вирусов дикого типа. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированные химерные вирусы по настоящему изобретению размножают в субстратах с недостатком ΙΡΝ.
Химерные вирусы по настоящему изобретению можно выращивать в клетках (например, клетках птиц, клетках кур и т.п.), которые являются чувствительными к инфицированию вирусами, в яйцах с эм
- 31 016217 брионами или животных (например, птицах). Такие способы хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки, используемые для размножения аттенуированных вирусов со сниженной антагонистической в отношении интерферона активностью, являются клетками с недостатком ΙΡΝ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения химерные вирусы птиц по настоящему изобретению размножают в клетках кур или яйцах с эмбрионами. Примеры клеток кур содержат, но ими не ограничиваются, фибробласты куриных эмбрионов или клетки почки куриных эмбрионов.
Химерные вирусы по настоящему изобретению можно размножать в яйцах с эмбрионами, например, возрастом 6-14 дней. Яйца с молодыми или недоразвившимися эмбрионами можно использовать для размножения аттенуированных химерных вирусов гриппа по настоящему изобретению. Яйца с недоразвившимися эмбрионами содержат яйца возрастом менее десяти дней, например яйца возрастом 6-9 дней, с недостатком ΙΡΝ. Яйца с недоразвившимися эмбрионами также содержат яйца, которые искусственно имитируют яйца с недоразвившимися эмбрионами возрастом вплоть до, но менее десяти дней в результате изменений условий роста, например, изменения температур инкубации, обработки лекарственными средствами или любых других изменений, которые приводят к замедлению развития яйца, так что система ΙΡΝ не полностью развивается по сравнению с яйцами возрастом 10-12 дней. Химерные вирусы по настоящему изобретению можно размножать в различных местах яйца с эмбрионом, например в аллантоисной полости. В отношении подробного обсуждения роста и размножения вирусов, в частности аттенуированных вирусов гриппа со сниженной антагонистической в отношении интерферона активностью, смотри, например, патент США № 6852522 и патент США № 6852522, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Для выделения вирусов химерный вирус извлекают из клеточной культуры и отделяют от клеточных компонентов, обычно с помощью хорошо известных процессов очистки, например, таких как центрифугирование в градиенте и колоночная хроматография, и, кроме того, очищают с использованием процессов, хорошо известных квалифицированным в данной области специалистам, например, анализов бляшкообразования.
5.5. Применение химерных вирусов
Химерные вирусы по настоящему изобретению можно использовать для активной иммунизации индивида. В одном аспекте химерные вирусы по настоящему изобретению можно использовать для профилактики, регулирования и/или лечения одного или нескольких заболеваний. В конкретном аспекте химерные вирусы по настоящему изобретению можно использовать для профилактики, регулирования и/или лечения инфекций, вызванных двумя инфекционными агентами. См. раздел 5.5.1 в отношении описания иммуногенной композиции и применения таких композиций для индуцирования у индивида иммунного ответа. Химерные вирусы по настоящему изобретению можно также использовать для продуцирования антител, которые можно использовать для диагностических иммуноанализов, пассивной иммунотерапии и образования антиидиотипических антител. Например, химерный вирус гриппа, содержащий слитый белок, имеющий эктодомен инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, можно вводить индивиду (например, мыше, крысе, свинье, лошади, ослу, птице или человеку) для образования антител против как вируса гриппа, используемого в качестве основы, так и инфекционного агента, которые затем выделяют и используют для диагностических анализов, пассивной иммунотерапии и образования антиидиотипических антител. Образованные антитела можно выделить с использованием стандартных методов, известных в данной области (например, иммуноаффинной хроматографии, центрифугирования, преципитации и т. п.) и использовать для диагностических иммуноанализов, пассивной иммунотерапии и образования антиидиотипических антител. Выделенные антитела до использования для пассивной иммунотерапии можно модифицировать, например, антитела можно подвергнуть химеризации или гуманизации. См., например, патенты США № 4444887 и 4716111 и публикации международных заявок АО 98/46645, АО 98/50433, АО 98/24893, АО 98/16654, АО 96/34096, АО 96/33735 и АО 91/10741, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки, для обзора в отношении образования химерных и гуманизированных антител.
Для антител, продуцируемых с использованием химерных вирусов, используемых для пассивной иммунизации, вводимая индивиду доза, как правило, составляет 0,0001 - 100 мг/кг веса тела пациента. Предпочтительно вводимая индивиду доза составляет 0,0001 - 20 мг/кг, 0,0001 - 10 мг/кг, 0,0001 - 5 мг/кг, 0,0001 - 2 мг/кг, 0,0001 - 1 мг/кг, 0,0001 - 0,75 мг/кг, 0,0001 - 0,5 мг/кг, 0,0001 - 0,25 мг/кг, 0,0001 - 0,15 мг/кг, 0,0001 - 0,1 мг/кг, 0,001 - 0,5 мг/кг, 0,01 - 0,25 мг/кг или 0,01 - 0,1 мг/кг веса тела индивида. Охватываемые настоящим изобретением антитела можно вводить с другими профилактическими или терапевтическим композициями для иммунизации вновь или лечения, регулирования или предотвращения инфекционного заболевания или состояния, или его симптома. Введение доз антител по настоящему изобретению может быть с помощью болюсной инъекции, или оно может осуществляться более медленно внутривенно (например, на протяжении приблизительно 5 мин, приблизительно 15 мин, приблизительно 30 мин, приблизительно 45 мин, приблизительно 1 ч, приблизительно 2 ч, приблизительно 4 или приблизительно 6 ч). Введение доз антител по настоящему изобретению можно также повторять (например, каждый день, каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждую неделю, каждые 2 недели, каждые 3 недели, каждые 6
- 32 016217 недель, каждые 9 недель, каждые 12 недель, каждые 4 месяца, каждые 6 месяцев, каждые 12 месяцев, каждые 18 месяцев или каждые 2 года) на протяжении курса лечения (например, 2 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 4 месяцев, 6 месяцев, 8 месяцев, 10 месяцев, 12 месяцев, 16 месяцев, 20 месяцев и 24 месяцев или дольше). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антитела, продуцируемые с использованием химерных вирусов, можно вводить парентерально, например, внутривенно, внутримышечно или подкожно, или в альтернативном случае вводить орально или интраназально. Охватываемые настоящим изобретением антитела можно также вводить в виде композиций с непрерывным высвобождением.
Антитела, выделенные из индивида, которому вводили химерный вирус по настоящему изобретению, можно также использовать для контролирования лечения и/или прогрессирования заболевания. Для этой цели можно использовать любую систему иммуноанализа, известную в данной области, содержащую, но ими не ограничиваются, конкурентную и неконкурентную системы анализа с использованием методов, таких как радиоиммуноанализы, ЕЫ8А (твердофазные иммуноферментные анализы), сэндвич-иммуноанализы, реакции преципитации, реакции встречной диффузии и преципитации в геле, реакции иммунодиффузии, анализы агглютинации, реакции связывания комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с использованием белка А и иммуноэлектрофоретические анализы, с указанием только небольшого числа.
Антитела, образуемые при использовании химерных вирусов по настоящему изобретению, можно также использовать для продукции антиидиотипического антитела. Антиидиотипическое антитело можно затем, в свою очередь, использовать для иммунизации, для получения субпопуляции антител, которые связываются с первоначальным антигеном химерного вируса гриппа (1егие, 1974, Апп. 1ттипо1. (РагЩ 125с:373; 1егпе е! а1., 1982, ЕМВО 1. 1:234).
В процессах иммунизации количество иммуногена, которое должно использоваться, и схема иммунизации определяются квалифицированным в данной области врачом и вводится в соответствии с иммунным ответом и титром антител у индивида.
5.5.1. Иммуногенные композиции
Настоящим изобретением также охватывается применение химерных вирусов по настоящему изобретению в иммуногенных композициях, например композициях вакцин. В случаях, когда иммуногенные композиции содержат химерный вирус гриппа, композиции можно использовать в способах предотвращения, регулирования, нейтрализации, лечения и/или уменьшения интенсивности вызванной вирусом гриппа инфекции, и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, и/или заболевания. В случаях, когда иммуногенные композиции содержат химерный ΝΏν, композиции можно использовать в способах предотвращения, регулирования, нейтрализации, лечения и/или уменьшения интенсивности вызванной ΝΏν инфекции, инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, и/или заболевания.
Иммуногенные композиции могут включать или живой, или инактивированный химерный вирус по настоящему изобретению. Химерный вирус можно инактивировать с помощью способов, хорошо известных квалифицированным в данной области специалистам. В обычных способах используются формалин и нагревание для инактивации. См., например, патент США № 6635246, который полностью включен в данное описание в качестве ссылки. Другие методы содержат методы, описанные в патентах США № 5891705, 5106619 и 4693981, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Живая иммуногенная композиция может быть предпочтительной, поскольку усиление в индивиде приводит к пролонгированному стимулу вида и величины, схожими с теми, которые наблюдаются при естественных инфекциях, и, следовательно, обеспечивает значительный, длительно сохраняемый иммунитет. Приготовление таких живых рекомбинантных иммуногенных композиций можно осуществить с использованием традиционных способов, содержащих размножение химерного вируса в культуре клеток или в яйцах с эмбрионами (например, куриных яйцах с эмбрионами) с последующей очисткой. Кроме того, химерные вирусы могут индуцировать сильный ответ, в который вовлечен ΙΕΝ, который имеет другие биологические результаты ίη νίνο, что обеспечивает защиту против последующих инфекций.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуногенная композиция по настоящему изобретению содержит эффективное количество химерного вируса по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Термин фармацевтически приемлемый означает разрешенный федеральным контрольным органом или контрольным органом правительства штата или приведенный в списке фармакопеи США или других общепризнанных фармакопеях для использования для животных и, особенно, человека. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю и растворителю, с которыми вводится фармацевтическая композиция (например, иммуногенная или композиция вакцин). В качестве жидких носителей можно также использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, особенно для инъецируемых растворов. Подходящие наполнители содержат крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, углекислый кальций, силикагель, стеарат натрия, глицеролмоностеарат, тальк, хлорид натрия, снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, спирт и т.п. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны Ееттд1оп'5
- 33 016217
Рйагтасеийса1 8с1епсе8 Ьу Е.У. Майш. Композиция должна соответствовать способу введения. Конкретная композиция может также зависеть от того, является ли химерный вирус живым или инактивированным.
Иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно вводить не подвергавшемуся воздействию индивиду, т.е. индивиду, у которого нет заболевания или не было, и он не инфицирован в текущий момент одним или обоими инфекционными агентами. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции вводят не подвергавшемуся воздействию индивиду, т.е. индивиду, у которого нет заболевания или не было, и он не инфицирован в текущий момент одним или обоими инфекционными агентами, но подвержен риску приобретения такого заболевания (например, вирусной инфекции). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции по настоящему изобретению вводят индивиду, у которого нет заболевания или не было, и он не инфицирован одним из инфекционных агентов, против которых химерный вирус индуцирует иммунный ответ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции по настоящему изобретению вводят индивиду, который не был инфицирован и не инфицирован в текущий момент обоими инфекционными агентами, против которых химерный вирус индуцирует иммунный ответ. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно также вводить индивиду, который инфицирован и/или был инфицирован одним или обоими инфекционными агентами или другим типом, подтипом или штаммом агентов, против которых химерный вирус индуцирует иммунный ответ.
Для введения иммуногенных композиций, например композиций вакцин, описанных выше, можно использовать многие способы, которые содержат, но ими не ограничиваются, интраназальный, интратрахеальный, пероральный, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, коъюнктивальный и подкожный способы. Для птиц способы могут, кроме того, включать инокуляцию в хоаны. В качестве альтернативы парентеральному введению настоящим изобретением также охватываются способы массового назначения для сельскохозяйственных целей, такие как через питьевую воду или в аэрозоле. Может быть предпочтительным введение иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус гриппа, через природный путь инфицирования вирусом дикого типа. Альтернативно может быть предпочтительным введение химерного вируса по настоящему изобретению через природный путь инфицирования агентом, из которого происходит слитый белок. Способность химерного вируса индуцировать сильный секреторный и клеточный иммунный ответ можно выгодным образом использовать. Например, инфицирование дыхательных путей химерными вирусами может индуцировать сильный секреторный иммунный ответ, например, в мочеполовой системе, с сопутствующей защитой против вызывающего конкретное заболевание агента. Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения может быть желательным введение фармацевтических композиций по настоящему изобретению в легкие с помощью любого подходящего способа. Можно также использовать введение в легкие, например, с помощью использования ингалятора или распылителя и приготовления вместе с агентом для аэрозоляции для использования в виде аэрозоля.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенная композиция по настоящему изобретению не приводит к полной защите от инфекции (например, вирусной инфекции или инфекции, вызываемой невирусным инфекционным агентом), но приводит к более низким титрам или уменьшенному числу патогена (например, вируса) по сравнению с не подвергшимся обработке индивидом. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения введение иммуногенных композиций по настоящему изобретению приводит к снижению титра патогена в 0,5 раз, 1 раз, 2 раза, 4 раза, 6 раз, 8 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз, 50 раз, 75 раз, 100 раз, 125 раз, 150 раз, 175 раз, 200 раз, 300 раз, 400 раз, 500 раз, 750 раз или 1000 раз или больше по сравнению с подвергшимся обработке индивидом. Выгоды от снижения титра, числа и общей нагрузки патогена содержат, но ими не ограничиваются, меньшую тяжесть симптомов инфекции и уменьшение продолжительности заболевания и состояния, сопровождающего инфекцию.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенную композицию по настоящему изобретению используют для защиты от заболевания (например, инфекции) у не подвергавшихся воздействию индивидов. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения иммуногенную композицию по настоящему изобретению используют для защиты от инфицирования вирусом гриппа и/или по крайней мере одним другим инфекционным агентом, который не является вирусом гриппа, и/или защиты от заболевания или симптома, сопровождающего инфекцию, у не подвергавшихся воздействию индивидов. В других вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенную композицию по настоящему изобретению используют для защиты от инфицирования ΝΏν и/или по крайней мере одним другим инфекционным агентом, и/или защиты от заболевания или симптома, сопровождающего инфекцию, у не подвергавшихся воздействию индивидов. Неограничивающие примеры таких других инфекционных агентов содержат вирус папилломы, вирус герпеса, ретровирус (например, ВИЧ), вирус гепатита, риновирус, респираторно-синцитиальный вирус, ΝΏν, цитомегаловирус, аденовирус, род С1ойпб1а, род 8а1топе11а, род 8!арйу1ососси8, род Еп!егососси8, род УЬпо, Е. сой, 81гер1ососси8 есцы, Мусор1а8та рпеитошае, К1еЬые11а рпеитошае, Ркеиботопак аегидшо8а, ЭегтаЮрййих сопдо1еп818 или простейшее, такое как амеба, малярийный паразит или Тгурапозота сги/ί.
- 34 016217
Профилактические и/или терапевтические эффекты иммуногенных композиций по настоящему изобретению основаны отчасти на достижении или индуцировании иммунного ответа (например, гуморального иммунного ответа). В одном аспекте иммуногенные композиции индуцируют определяемые титры в сыворотке антител против антигенов химерного вируса или у индивида, или в модели на животном (например, мышиной, крысиной или собачей модели). Титры в сыворотке антитела можно определить с использованием методов, известных специалисту в данной области, например, иммуноанализа, такого как ЕЫ8А. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела специфически связываются с антигеном основы химерного вируса. В других вариантах осуществления настоящего изобретения антитела специфически связываются с антигеном по крайней мере одного слитого белка, т.е. антигеном эктодомена введенного белка, связанного с инфекционным агентом или заболеванием. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения антитела, образуемые при введении имуногенной композиции по настоящему изобретению, являются нейтрализующими антителами.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение химерного вируса по настоящему изобретению индивиду или модели на животном приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, приблизительно 6 мкг/мл, приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 15 мкг/мл, приблизительно 20 мкг/мл, приблизительно 25 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 75 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 125 мкг/мл, приблизительно 150 мкг/мл, приблизительно 175 мкг/мл, приблизительно 200 мкг/мл, приблизительно 225 мкг/мл, приблизительно 250 мкг/мл, приблизительно 275 мкг/мл или приблизительно 300 мкг/мл или более антител, которые специфически связываются с антигеном основы химерного вируса. В других вариантах осуществления настоящего изобретения введение химерного вируса по настоящему изобретению индивиду или модели на животном приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, приблизительно 6 мкг/мл, приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 15 мкг/мл, приблизительно 20 мкг/мл, приблизительно 25 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 75 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 125 мкг/мл, приблизительно 150 мкг/мл, приблизительно 175 мкг/мл, приблизительно 200 мкг/мл, приблизительно 225 мкг/мл, приблизительно 250 мкг/мл, приблизительно 275 мкг/мл или приблизительно 300 мкг/мл или более антител, которые специфически связываются с антигеном слитого белка, т.е. антигеном эктодомена введенного белка, связанного с инфекционным агентом или заболеванием. Предпочтительно титр в сыворотке, составляющий приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, приблизительно 6 мкг/мл, приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 15 мкг/мл, приблизительно 20 мкг/мл, приблизительно 25 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 150 мкг/мл или приблизительно 300 мкг/мл или более таких антител, достигается через приблизительно 20 дней (предпочтительно 25, 30, 35 или 40 дней) после введения первой дозы иммуногенной композиции по настоящему изобретению и без введения каких-либо других доз этой композиции. У индивида или в модели на животном можно определить иммунный ответ, который затем сопоставляют или экстраполируют на предсказываемый ответ у индивида или в модели на животном.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам предотвращения у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом гриппа), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус гриппа по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10 л, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше, антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном или эпитопом основы химерного вируса, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам предотвращения у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом гриппа), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус гриппа по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка (т.е. антигеном эктодомена введенного белка, связанным с заболеванием), через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. У индивида или в модели на животном можно определить иммунный ответ, который затем сопоставляют или экстраполируют на предсказываемый ответ у индивида, например человека. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам предотвращения у птицы вызванной вирусом птичьего гриппа инфекции и/или инфекций, вызванных другим ин
- 35 016217 фекционным агентом, не являющимся вирусом птичьего гриппа, содержащим введение первой дозы иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению, который включает слитый белок, содержащий гетерологичную последовательность белка, указанному индивиду в эффективном количестве химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению, причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном химерного вируса, и/или антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза химерного вируса гриппа, вводимая индивиду или моделе на животном, составляет 102, 5х102, 103, 5х103, 104, 5х104, 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х1010, 5х1010, 1х1041, 5х10п или 1012 бляшкообразующих единиц.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом гриппа), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус гриппа по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном или эпитопом основы химерного вируса, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом гриппа), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус гриппа по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка (т.е. антигеном эктодомена введенного белка, связанным с заболеванием), через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. У индивида или в модели на животном можно определить иммунный ответ, который затем сопоставляют или экстраполируют на предсказываемый ответ у индивида, например человека. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения у птицы вызванной вирусом птичьего гриппа инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом птичьего гриппа, содержащим введение первой дозы иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению, который включает слитый белок, содержащий гетерологичную последовательность белка, указанному индивиду в эффективном количестве вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению, причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше, антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном химерного вируса, и/или антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза химерного вируса гриппа, вводимая индивиду или модели на животном, составляет 102, 5х102, 103, 5х103, 104, 5х104, 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х1010, 5х1010, х 1011, 5х10п или 1012 бляшкообразующих единиц.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам регулирования и/или уменьшения интенсивности у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом гриппа), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус гриппа по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном или эпитопом основы химерного вируса, через дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам регулирования и/или уменьшения интенсивности у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным
- 36 016217 агентом, не являющимся вирусом гриппа), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус гриппа по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка (т. е. антигеном эктодомена введенного белка, связанным с заболеванием), через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. У индивида или в модели на животном можно определить иммунный ответ, который затем сопоставляют или экстраполируют на предсказываемый ответ у индивида, например человека. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам регулирования и/или уменьшения интенсивности у птицы вызванной вирусом птичьего гриппа инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом птичьего гриппа, содержащим введение первой дозы иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению, который включает слитый белок, содержащий гетерологичную последовательность белка, указанному индивиду в эффективном количестве химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению, причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном химерного вируса, и/или антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза химерного вируса гриппа, вводимая индивиду или модели на животном, составляет 102, 5х102, 103, 5х103, 104, 5х104, 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х1010, 5х1010, 1х1031, 5х10п или 1012 бляшкообразующих единиц.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам предотвращения у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной ΝΌν инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΌν), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный ΝΌν по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40 мкг/мл, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном или эпитопом основы химерного вируса, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам предотвращения у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной ΝΌν инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΌν), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный ΝΌν по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка (т. е. антигеном эктодомена введенного белка, связанным с заболеванием), через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. У индивида или в модели на животном можно определить иммунный ответ, который затем сопоставляют или экстраполируют на предсказываемый ответ у индивида, например человека. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам предотвращения у птицы вызванной ΝΌν инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΌν, содержащим введение первой дозы иммуногенной композиции, содержащей химерный ΝΌν по настоящему изобретению, который включает слитый белок, содержащий гетерологичную последовательность белка, указанному индивиду в эффективном количестве химерного вируса по настоящему изобретению, причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном химерного вируса, и/или антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза химерного вируса гриппа, вводимая индивиду или модели на животном, составляет 102, 5х102, 103, 5х103, 104, 5х104, 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х1010, 5х1010, 1х1031, 5х10п или 1012 бляшкообразующих единиц.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной ΝΌν инфекции и/или инфекций, вы
- 37 016217 званных другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΏν), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный ΝΏν по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60 мкг/мл, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном или эпитопом основы химерного вируса, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной ΝΏν инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΏν), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный ΝΏν по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка (т.е. антигеном эктодомена введенного белка, связанным с заболеванием) через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. У индивида или в модели на животном можно определить иммунный ответ, который затем сопоставляют или экстраполируют на предсказываемый ответ у индивида, например человека. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения у птицы вызванной ΝΏν инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΏν, содержащие введение первой дозы иммуногенной композиции, содержащей химерный ΝΏν по настоящему изобретению, который включает слитый белок, содержащий гетерологичную последовательность белка, указанному индивиду в эффективном количестве химерного вируса по настоящему изобретению, причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30 мкг/мл, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном химерного вируса, и/или антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза химерного вируса гриппа, вводимая индивиду или модели на животном, составляет 102, 5х102, 103, 5х103, 104, 5х104, 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х1010, 5х1010, 1х1013, 5х101! или 1012 бляшкообразующих единиц.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам регулирования и/или уменьшения интенсивности у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной ΝΏν инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΏν), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный ΝΏν по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше, антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном или эпитопом основы химерного вируса, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам регулирования и/или уменьшения интенсивности у индивида по крайней мере одного заболевания (например, вызванной ΝΏν инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΏν), содержащим введение указанному индивиду первой дозы эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный ΝΏν по настоящему изобретению, содержащий слитый белок гетерологичной последовательности (например, связанный с заболеванием антиген), причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 мкг/мл или больше антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка (т.е. антигеном эктодомена введенного белка, связанным с заболеванием), через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. У индивида или в модели на животном можно определить иммунный ответ, который затем сопоставляют или экстраполируют на предсказываемый ответ у индивида, например человека. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам регулирования и/или уменьшения интенсивности у птицы вызванной ΝΏν инфекции и/или инфекций, вызванных другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΏν, содержащим введение первой дозы иммуногенной композиции, содержащей химерный ΝΏν по настоящему изобретению, который включает слитый белок, содержащий гетерологичную последовательность белка, указанному индивиду в эффективном количестве химерного вируса по настоящему изобретению, причем эффективное количество
- 38 016217 представляет собой количество, которое приводит к титру в сыворотке, составляющему приблизительно 10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 30 мкг/мл, 40 мкг/мл, 50 мкг/мл, 60 мкг/мл, 70 мкг/мл, 80 мкг/мл, 100 мкг/мл или больше, антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном химерного вируса, и/или антител, которые иммуноспецифически связываются с антигеном слитого белка, через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после первого введения и до любого последующего введения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза химерного вируса гриппа, вводимая индивиду или модели на животном, составляет 102, 5х102, 103, 5х103, 104, 5х104, 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х1010, 5х1010, 1Х1011, 5х10п или 1012 бляшкообразующих еди ниц.
Настоящее изобретение также относится к способам предотвращения, лечения и/или регулирования у индивида по крайней мере одного заболевания, содержащим введение указанному индивиду эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус гриппа по настоящему изобретению, причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к снижению смертности, снижению случаев госпитализации, уменьшению тяжести заболевания и/или уменьшению клинических симптомов заболевания по сравнению с индивидом, которому не вводили иммуногенную композицию по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобре2 2 3 3 4 4 тения доза химерного вируса гриппа, вводимая индивиду, составляет 10 , 5х10 , 10 , 5х10 , 10 , 5х10 , 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х1010, 5х1010, 1х1013, 5х10п или 1012 бляшкообразующих единиц.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам предотвращения, лечения и/или регулирования у индивида (предпочтительно птицы) по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом птичьего гриппа и/или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом птичьего гриппа), содержащим введение указанному индивиду эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению, причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к снижению титра или числа инфекционных агентов, снижению смертности, снижению случаев госпитализации, уменьшению тяжести инфекции и/или уменьшению клинических симптомов инфекции по сравнению с индивидом, которому не вводили иммуногенную композицию по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза химерного вируса птичьего гриппа, вводимая индивиду, составляет 102, 5х102, 103, 5х103, 104, 5х104, 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х 1010, 5х1010, 1х 1011, 5х10п или 1012 бляшкообразующих единиц. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения введение иммуногенной композиции по настоящему изобретению приводит к уменьшению репликации инфекционного агента на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% или больше по сравнению с индивидом, которому не вводили иммуногенную композицию по настоящему изобретению, что определяется через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после указанного введения с помощью любого способа, известного в данной области или приведенного в качестве примера в данном описании (например, определения титра вирусов). В других вариантах осуществления настоящего изобретения введение иммуногенной композиции по настоящему изобретению приводит к уменьшению репликации инфекционного агента или нагрузки инфекционного агента в 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75 или 100 раз по сравнению с индивидом, которому не вводили иммуногенную композицию по настоящему изобретению, что определяется через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после указанного введения с помощью любого способа, известного в данной области или приведенного в качестве примера в данном описании (например, определения титра вирусов или бактериальной нагрузки и/или концентрации).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам предотвращения, лечения и/или регулирования у индивида (например, птицы) по крайней мере одного заболевания (например, вызванной ΝΏν и/или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΏν), содержащим введение указанному индивиду эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей химерный вирус ΝΏν по настоящему изобретению, причем эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к снижению титра или числа инфекционных агентов, снижению смертности, снижению случаев госпитализации, уменьшению тяжести инфекции и/или уменьшению клинических симптомов инфекции по сравнению с индивидом, которому не вводили иммуногенную композицию по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза химерного вируса ΝΏν, вводимая индивиду, составляет 102, 5х102, 103, 5х103, 104, 5х104, 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х1010, 5х1010, 1х1031, 5х10п или 1012 бляшкообразующих единиц. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения введение иммуногенной композиции по настоящему изобретению приводит к уменьшению репликации инфекционного агента на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% или больше по сравнению с индивидом, которому не вводили иммуногенную композицию по настоящему изобретению, что определяется через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после указанного введения с помощью лю
- 39 016217 бого способа, известного в данной области или приведенного в качестве примера в данном описании (например, определения титра вирусов). В других вариантах осуществления настоящего изобретения введение иммуногенной композиции по настоящему изобретению приводит к уменьшению репликации инфекционного агента или нагрузки инфекционного агента в 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75 или 100 раз по сравнению с индивидом, которому не вводили иммуногенную композицию по настоящему изобретению, что определяется через 2 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 20 дней или предпочтительно 30 дней после указанного введения с помощью любого способа, известного в данной области или приведенного в качестве примера в данном описании (например, определения титра вирусов).
Количество иммуногенной композиции по настоящему изобретению, которое будет эффективным для лечения, предотвращения и/или снижения интенсивности конкретного заболевания (например, вирусной инфекции), будет зависеть от природы заболевания, и его можно определить с помощью стандартных клинических методов. Кроме того, чтобы помочь идентификации оптимальных интервалов доз, можно необязательно использовать ш νίίτο анализы. Точная доза, используемая в композиции, будет также зависеть от способа введения и серьезности инфекции или нарушения и должна окончательно определяться согласно оценке практикующего врача и случаю каждого индивида. Однако, подходящие интервалы доз для введения, как правило, составляют приблизительно 102, 5х102, 103, 5х103, 104, 5х104, 105, 5х105, 106, 5х106, 107, 5х107, 108, 5х108, 1х109, 5х109, 1х1010, 5х1010, 1х1031, 5х10п или 1012 бляшкообразующих единиц и наиболее предпочтительно приблизительно 104 - приблизительно 10 бляшкообразующих единиц, и дозу можно вводить индивиду один, два, три или большее число раз с интервалами, настолько частыми, насколько это требуется. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых дозаответ, полученных в системах проверки ш νίίτο или в модели на животном.
В различных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции по настоящему изобретению или антитела, образованные с использованием химерных вирусов по настоящему изобретению, вводят индивиду в комбинации с одной или несколькими другими терапиями (например, противовирусными или иммуномодулирующими терапиями) для профилактики по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции и/или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом гриппа). В других вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции по настоящему изобретению или антитела, образованные с использованием химерных вирусов по настоящему изобретению, вводят индивиду в комбинации с одной или несколькими другими терапиями (например, противовирусными или иммуномодулирующими терапиями) для лечения по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции и/или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом гриппа). В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции по настоящему изобретению или антитела, образованные с использованием химерных вирусов по настоящему изобретению, вводят индивиду в комбинации с одной или несколькими другими терапиями (например, противовирусными или иммуномодулирующими терапиями) для управления и/или ослабления интенсивности по крайней мере одного заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции и/или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом гриппа). В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции по настоящему изобретению или антитела, образованные с использованием химерных вирусов по настоящему изобретению, вводят индивиду в комбинации с одной или несколькими другими терапиями (например, противовирусными или иммуномодулирующими терапиями) для профилактики вызванной вирусом птичьего гриппа инфекции и/или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом птичьего гриппа. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции по настоящему изобретению или антитела, образованные с использованием химерных вирусов по настоящему изобретению, вводят индивиду в комбинации с одной или несколькими другими терапиями (например, противовирусными или иммуномодулирующими терапиями) для лечения вызванной вирусом птичьего гриппа инфекции и/или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, не являющимся вирусом птичьего гриппа. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции по настоящему изобретению или антитела, образованные с использованием химерных вирусов по настоящему изобретению, вводят индивиду в комбинации с одной или несколькими другими терапиями (например, противовирусными или иммуномодулирующими терапиями) для профилактики вызванной ΝΏν инфекции и/или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΏν. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенные композиции по настоящему изобретению или антитела, образованные с использованием химерных вирусов по настоящему изобретению, вводят индивиду в комбинации с одной или несколькими другими терапиями (например, противовирусными или иммуномодулирующими терапиями) для лечения вызванной ΝΏν инфекции и/или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, не являющимся ΝΏν. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения терапии (например, профилактические или терапевтические агенты) назначают разделенными менее 5, 30 мин, 1 ч, приблизительно 1 ч, приблизительно 1-2 ч, приблизительно 2-3 ч, приблизительно 3-4 ч, приблизительно 4-5 ч, приблизительно 5-6 ч, приблизительно
- 40 016217
6-7 ч, приблизительно 7-8 ч, приблизительно 8-9 ч, приблизительно 9-10 ч, приблизительно 10-11 ч, приблизительно 11-12 ч, приблизительно 12-18 ч, 18-24 ч, 24-36 ч, 36-48 ч, 48-52 ч, 52-60 ч, 60-72 ч, 72-84 ч, 84-96 ч или 96-120 ч. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения две или более терапии назначаются в пределах одного и того же посещения больного.
Любой противовирусный агент, хорошо известный квалифицированному специалисту в данной области, можно использовать в композициях (например, композициях вакцин) и способах по настоящему изобретению. Неограничивающие примеры противовирусных агентов включают белки, полипептиды, пептиды, слитые белки, антитела, молекулы нуклеиновых кислот, органические молекулы, неорганические молекулы и небольшие молекулы, ингибирующие и/или уменьшающие присоединение вируса к его рецептору, интернализацию вируса в клетку, репликацию вируса и высвобождение вируса из клетки. В частности, противовирусные агенты включает, но ими не ограничиваются, аналоги нуклеозидов (например, зидовудин, ацикловир, гангцикловир, видарабин, идоксуридин, трифлуридин и рибавирин), фоскарнет, амантадин, римантадин, саквинавир, индинавир, ритонавир, альфа-интерфероны и другие интерфероны, и А2Т.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения противовирусный агент представляет собой иммуномодулирующий агент, который является иммуноспецифическим в отношении вирусного антигена. Используемый в настоящем описании термин вирусный антиген включает, но ими не ограничиваются, любой вирусный пептид, полипептид или белок (например, др120 ВИЧ, пеГ ВИЧ, гликопротеин Р Κδν, гликопротеин С Κδν, нейраминидазу вируса гриппа, гемаглютинин вируса гриппа, белок Тах ΗΊΈν, гликопротеин вируса простого герпеса (например, дВ, дС, дИ и дБ) и поверхностный антиген вируса гепатита В), которые способны индуцировать иммунный ответ. Антитела, используемые в этом изобретении для лечения вирусной инфекционной болезни, содержат, но ими не ограничиваются, антитела против антигенов патогенных вирусов, содержащих в качестве примеров и без ограничения: Абепо\зпбае (например, мастаденовирус и авиаденовирус), Ηе^ре8ν^^^бае (например, вирус 1 простого герпеса, вирус 2 простого герпеса, вирус 5 простого герпеса и вирус 6 простого герпеса), Ре\з\зпбае (например, левивирус, энтеробактерии фазы М82, аллолевивирус), Роху1Г1бае (например, поксвирусы позвоночных, парапоксивирус, авипоксвирус, каприпоксвирус, лепорипоксвирус, суипоксвирус, вирус контагиозного моллюска и поксвирусы насекомых), Рарονаν^^^бае (например, полиомавирус и папилломавирус), Ра^атуxον^^^бае (например, парамиксовирус, вирус 1 парагриппа, МоЬШМгик (например, вирус кори), КиЬи1ау1ги8 (например, вирус эпидемического паротита), Рηеитοηον^^^ηае (например, пневмовирус, респираторно-синцитиальный вирус) и метапневмовирус (например, пневмовирус птиц и метапневмовирус человека)), Рюотаушбае (например, энтеровирус, риновирус, гепатовирус (например, вирус гепатита А человека), кардиовирус и артровирус), Кеον^^^бае (например, ортореовирус, орбивирус, ротавирус, циповирус, фидживирус, фитореовирус и оризавирус), КеЦоттбае (например, ретровирусы типа В млекопитающих, ретровирусы типа С млекопитающих, ретровирусы типа С птиц, группа ретровирусов типа Ό, ретровирусы ΕΓν-ΗΤΟν, лентивирус (например, вирус 1 иммунодефицита человека и вирус 2 иммунодефицита человека, спумавирус), Патпзпбае (например, вирус гепатита С, вирус денге, вирус Западного Нила), ^ιχ^ικινίι^^ (например, вирус гепатита В), Тодаушбае (например, альфавирус (например, вирус Синдбис) и КиЬМгик (например, вирус краснухи), К11аЬбо\зпбае (например, везикуловирус, лиссавирус, вирус эфемерной лихорадки, циторабдовирус и нуклеорабдовирус), Агепаушбае (например, аренавирус, вирус лимфоцитарного хориоменингита, иппи-вирус и вирус Ласа) и С'огопюзпбае (например, коронавирус и торовирус).
В композициях (например, иммуногенных композициях) и способах по настоящему изобретению можно использовать антибактериальные агенты и терапии, хорошо известные специалисту в данной области, для профилактики, лечения, регулирования или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции. Неограничивающие примеры антибактериальных агентов включают белки, полипептиды, пептиды, слитые белки, антитела, молекулы нуклеиновых кислот, органические молекулы, неорганические молекулы и небольшие молекулы, ингибирующие или уменьшающие бактериальную инфекцию, ингибирующие или уменьшающие репликацию бактерий или ингибирующие или уменьшающие распространение бактерий на других индивидов. В частности, примеры антибактериальных агентов включают, но ими не ограничиваются, пенициллин, цефалоспорин, имипенем, акстреонам, ванкомицин, циклосерин, бацитрацин, хлорамфеникол, эритромицин, клиндамицин, тетрациклин, стрептомицин, тобрамицин, гентамицин, амикацин, канамицин, неомицин, спектиномицин, триметоприм, норфлоксацин, рифампин, полимиксин, амфотерицин В, нистатин, кетоканазол, изониазид, метронидазол и пентамидин. Антибактериальные терапии и их дозы, способы введения и рекомендуемое применение известны в данной области и описаны в такой литературе, как Рйуыаап'к Иекк КеГегепсе (564Ь еб., 2002). Дополнительная информация в отношении инфекций дыхательных путей и антибактериальных терапий описана в Сесб Тех!Ьоок оГ Мебюте (184Ь еб., 1988).
В композициях (например, иммуногенных композициях) и способах по настоящему изобретению можно использовать противогрибковые агенты и терапии, хорошо известные специалисту в данной области, для профилактики, управления, лечения и/или уменьшения интенсивности грибковой инфекции или одного или нескольких ее симптомов (например, грибковой инфекции дыхательных путей). Неогра
- 41 016217 ничивающие примеры противогрибковых агентов включают белки, полипептиды, пептиды, слитые белки, антитела, молекулы нуклеиновых кислот, органические молекулы, неорганические молекулы и небольшие молекулы, ингибирующие и/или уменьшающие грибковую инфекцию, ингибирующие и/или уменьшающие репликацию грибов или ингибирующие и/или уменьшающие распространение грибов на других индивидов. Конкретные примеры противогрибковых агентов включают, но ими не ограничиваются, азольные лекарственные средства (например, миконазол, кетоконазол (ИЕОКЛЬ®), каспофунгина ацетат (ΟΆΝΟΊΩΑδ®). имидазол, триазолы (например, флуконазол (ΌΙΡΕυϋΑΝ®)) и итраконазол (8РОΚΑNОX®), полиен (например, нистатин, амфотерицин В (РиХ612ОХЕ®), липидный комплекс амфотерицина В (ΑΒΡΟ) (ΑΒΕΕΡΕΤ®), коллоидная дисперсия амфотерицина В (ΑΒΡΌ) (ΑΜРΗОΤΕС®), липосомальный амфотерицин В (ЛЫВКОХЕ®), иодид калия (ΚΙ), пиримидин (например, флуцитозин ( ^КРОВОМ®) и вориконазол (νΡΕΝΏ®).
Противогрибковые терапии и их дозы, способы введения и рекомендуемое применение известны в данной области и описаны в такой литературе, как Όοάάδ с1 а1., 2000 Р11агтасо111сгару 20(11) 1335-1355, Рку81С1аи'8 Эезк ВеГегепсе (56'1' ей., 2002) и Мегк Мапиа1 οί Οίηβηοδίδ аий Ткегару (17Л ей., 1999).
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуногенную композицию по настоящему изобретению вводят индивиду в виде одной дозы с последующей второй дозой спустя 3-6 недель. В соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения повторные иммунизации могут назначаться индивиду с интервалами в 6-12 месяцев после второй иммунизации. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения индивидом является млекопитающее. В другом варианте осуществления настоящего изобретения индивидом является птица. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом является курица, подверженная риску контактирования с вызванной ΝΏν или вирусом птичьего гриппа инфекцией.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения введение одних и тех же иммуногенных композиций по настоящему изобретению можно повторять, и введения могут быть разделены по крайней мере 1 днем, 2 днями, 3 днями, 5 днями, 10 днями, 15 днями, 30 днями, 45 днями, 2 месяцами, 75 днями, 3 месяцами или по крайней мере 6 месяцами.
5.6. Биологические анализы
5.6.1. Ιη νίΐτο анализы
Рост химерных вирусов по настоящему изобретению можно определить с помощью любого способа, известного в данной области или описанного в данном описании (например, в клеточной культуре (например, культурах клеток почки куриных эмбрионов или культурах фибробластов куриных эмбрионов (СЕР)). Рост аттенуированных химерных вирусов по настоящему изобретению можно определить в ΙΡΝ-компетентных клетках или в клетках с недостатком ΙΡΝ. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки ΡΕΡ инфицируют при множественности заражения (МОЦ между 0,0005 и 0,001, 0,001 и 0,01, 0,01 и 0,1, 0,1 и 1 или 1 и 10 или МОф составляющей 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 или 10, и инкубируют в бессывороточной среде, дополненной 5% аллантоисной жидкости. Титры вирусов определяют в супернатанте по слою в анализе НА в клетках ΡΕΡ, как описано ниже. Другие клетки, в которых можно определить титры вирусов, содержат, но ими не ограничиваются, клетки ΕΡΚ-2, клетки Уего, первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НиУЕС), линию эпителиальных клеток человека Н292 и клетки НеЬа.
Встраивание слитого белка в вирион химерных вирусов по настоящему изобретению можно определить с помощью любого способа, известного в данной области или описанного в данном описании (например, в клеточной культуре, модели на животном или вирусной культуре в яйцах с эмбрионами). Например, вирусные частицы из клеточной культуры аллантоисной жидкости яиц с эмбрионами можно очистить с помощью центрифугирования через сахарозную подушку и впоследствии проанализировать на экспрессию слитого белка с помощью Вестерн-блоттинга, используя хорошо известные в данной области способы.
Вирусные анализы содержат анализы, с помощью которых определяются измененная репликация вирусов (определяемая, например, с помощью образования бляшек) или продукция вирусных белков (определяемая, например, с помощью Вестерн-блоттинга), или вирусные РНК (определяемые, например, с помощью ОТ-ПЦР или Нозерн-блоттинга) в культивируемых клетках ίη νίΐτο, используя способы, которые хорошо известны в данной области.
Антитела, образуемые при использовании химерных вирусов по настоящему изобретению, или их фрагменты можно охарактеризовать множеством способов, хорошо известных специалисту в данной области (например, ΕΟδΑ, отображением резонанса на поверхностных плазмонах (ΒΙΑ^κ), Вестернблоттингом, иммунофлуоресценцией, иммуноокрашиванием и/или анализом микронейтрализации). В частности, антитела, образуемые при использовании химерных вирусов по настоящему изобретению, или их фрагменты можно проанализировать на их способность иммуноспецифически связываться с антигеном основы химерного вируса или антигеном или эпитопом слитого белка. Такой анализ можно выполнить в растворе (например, ^идШеи, 1992, Вю/Тескитдиез 13:412-421), с использованием шариков
- 42 016217 (Ьат, 1991, №11иге 354:82-84), чипов ^ούοη 1993, №11иге 364:555-556), бактерий (патент США № 5223409), спор (патенты США № 5571698, 5403484 и 5223409), плазмид (Си11 е! а1., 1992, Ρϊοο. Ναίΐ. Асаб. 8с1. И8А 89:1865-1869) или фагов (8^ΐΙ апб 8тЦк 1990, 8с1епсе, 249:386-390; С^1г1а е1 а1., 1990, Ρτο^ №И. Асаб. 8с1. И8А 87:6378-6382; и БеНа, 1991, 1. Μο1. Βίο1. 222:301-310) (каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки). Антитела, образуемые при использовании химерных вирусов по настоящему изобретению, или их фрагменты, которые, как определено, иммуноспецифически связываются с антигеном основы химерного вируса или антигеном или эпитопом слитого белка, можно затем проанализировать на их специфичность в отношении указанного антигена.
Антитела, образуемые при использовании химерных вирусов по настоящему изобретению, или их фрагменты можно проанализировать на иммуноспецифическое связывание с антигеном химерного вируса по настоящему изобретению (например, антигеном или эпитопом основы химерного вируса или антигеном или эпитопом слитого белка (например, антигеном, связанным с заболеванием)) и перекрестную реактивность с другими антигенами с помощью любого способа, известного в данной области. Иммуноанализы, которые можно использовать для анализа иммуноспецифического связывания и перекрестной реактивности, содержат, но ими не ограничиваются, конкурентную и неконкурентную системы анализа с использованием методов, таких Вестерн-блотттинг, радиоиммуноанализы, ЕЫ8А (твердофазные иммуноферментные анализы), «сэндвич»-иммуноанализы, реакции иммунопреципитации, реакции преципитации, реакции встречной диффузии и преципитации в геле, реакции иммунодиффузии, анализы агглютинации, реакции связывания комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с использованием белка А, с указанием только небольшого числа. Такие анализы являются обычными анализами, и они хорошо известны в данной области (см., например, Аи8иЬе1 е1 а1., еб§., 1994, Сштей Ρτοΐο^Η ίη ΜοΚαιΕίΓ Βίοίοβν. νοί. 1, ίοΐιη \Убеу & 8οη§, Ιικ.. №\ν ΥογΕ. который таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки). Примеры иммуноанализов описываются кратко ниже (но не с целью ограничения).
Протоколы иммунопреципитации, как правило, содержат лизис популяции клеток в буфере для лизиса, таком как буфер КША (1% ΝΡ-40 или ΤπΙοη Х-100, 1% дезоксихолат натрия, 1% 8Ό8, 0,15 М №С1, 0,01 М фосфат натрия при рН 7,2, 1% ТгакуЫ), дополненном белком фосфатазой и/или ингибиторами протеаз (например, ЕОТА, ΡΜ8Б, апротинином, ванадатом натрия), добавление представляющего интерес антитела к клеточному лизату, инкубацию в течение периода времени (например, 1-4 ч) при 40°С, добавление к клеточному лизату шариков сефарозы с белком А и/или белком О, инкубацию в течение приблизительно часа или более при 40°С, промывку шариков в буфере для лизиса и ресуспендирование шариков в буфере для образцов с 8Ό8. Способность представляющего интерес антитела иммунопреципитировать конкретный антиген можно оценить с помощью, например, Вестерн-блоттинга. Квалифицированному в данной области специалисту известны параметры, которые можно модифицировать, чтобы увеличить связывание антитела с антигеном и уменьшить фон (например, с помощью предварительной очистки клеточного лизата с помощью сефарозных шариков). Для дальнейшего обсуждения, касающегося протоколов иммунопреципитации, см., например, Аи8иЬе1 е1 а1., еб§, 1994, Ситтей Ρτοΐο^Η ίη ΜοΕαι1аг Βίο1ο§ν, νο1. 1, ίοΐιη ^11еу & 8οη§, Шс., №\ν ΥογΕ в 10.16.1.
Анализы Вестерн-блоттингом, как правило, содержат приготовление образцов белка, электрофорез образцов белка в полиакриламидном геле (например, 8-20% 8Э8-ПААГ в зависимости от молекулярной массы антигена), перенос образца белка из полиакриламидного геля на мембрану, такую как нитроцеллюлоза, ΡV^Б или нейлон, инкубацию мембраны в блокирующем растворе (например, ΡΒ8 с 3% В8А или обезжиренного молока), промывку мембраны в буфере для промывки (например, ΡΒ8-Τνееη 20), инкубацию мембраны с первым антителом (представляющим интерес антителом), разведенном в блокирующем буфере, промывку мембраны в буфере для промывки, инкубацию мембраны со вторым антителом (которое узнает первое антитело, например, античеловеческим антителом), конъюгированным с ферментативным субстратом (например, пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой) или радиоактивной молекулой (например, Р или Ι), разведенным в блокирующем буфере, промывку мембраны в буфере для промывки и обнаружение присутствия антигена. Квалифицированному в данной области специалисту известны параметры, которые можно модифицировать, чтобы увеличить обнаруживаемый сигнал и уменьшить фоновые помехи. Для дальнейшего обсуждения, касающегося протоколов Вестернблоттинга, смотри, например, Аи8иЬе1 е1 а1., еб§, 1994, Ситтей Ρτοΐο^1δ ίη ΜοΚαιΕπ Вю^ду, νο1. 1, ίοΐιη ^11еу & 8οη§, Шс., №\ν ΥογΕ в 10.8.1.
ЕЫ8А включает приготовление антигена, покрытие антигеном лунки 96-луночного микротитрационного планшета, добавление в лунку представляющего интерес антитела, конъюгированного с определяемым компонентом, таким как ферментативный субстрат (например, пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой), и инкубацию в течение периода времени, и обнаружение присутствия антигена. В ЕЫ8А не требуется, чтобы представляющее интерес антитело было конъюгировано с определяемым компонентом, а вместо этого в лунку можно добавить второе антитело (которое узнает представляющее интерес антитело), конъюгированное с определяемым компонентом. Кроме того, вместо покрытия лунки антигеном она может быть покрыта антителом. В этом случае второе антитело, конъюгированное с опре
- 43 016217 деляемым компонентом, можно добавить после добавления представляющего интерес антигена в покрытую лунку. Квалифицированному в данной области специалисту известны параметры, которые можно модифицировать, чтобы увеличить обнаруживаемый сигнал, а также другие переменные ЕЫ8А, известные в данной области. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ЕБ18Л можно выполнить с помощью покрытия 96-луночного микротитрационного планшета с высоким связыванием (Сойаг) 2 мкг/мл рекомбинантного 1Ь-9 человека в РВ8 в течение ночи. После трех промывок РВ8 планшет инкубируют с трехкратными серийными разведениями ЕаЬ при 25°С в течение 1 часа. После других трех промывок РВ8 добавляют 1 мкг/мл конъюгата антитело против каппа человека - щелочная фосфатаза, и планшет инкубируют при 25°С в течение 1 ч. После трех промывок РВ8Т активность щелочной фосфатазы определяют в 50 мкл/АМР/РРМР субстрата. Реакции останавливают и оптическую плотность при 560 нм определяют с использованием считывающего устройства для микропланшетов VМАX. Для дальнейшего обсуждения, касающегося ЕЫ8А, см., например, Аи8иЬе1 е! а1., еЩ, 1994, Сиггей РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, νοί. 1, 1оЬп \УПеу & 8оп§, 1пс., Νονν Уогк в 11.2.1.
Аффинность связывания антитела с антигеном и скорость диссоциации взаимодействия антителоантиген можно определить с помощью конкурентных анализов связывания. Одним из примеров конкурентного анализа связывания является радиоиммуноанализ, содержащий инкубацию меченого (например, 3Н или 125Ι) антигена с представляющим интерес антителом в присутствии увеличивающихся количеств немеченого антигена и обнаружение антитела, связанного с меченым антигеном. Аффинность антитела по настоящему изобретению или его фрагмента к полипептиду 1Ь-9 и скорости диссоциации можно определить из данных с помощью построения графиков Скэтчарда. Конкуренцию со вторым антителом можно также определить с использованием радиоиммуноанализов. В этом случае полипептид 1Ь-9 инкубируют с антителом по настоящему изобретению, конъюгированным с меченым (например, 3Н или 125Ι) компонентом в присутствии увеличивающихся количеств немеченого второго антитела.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кинетический анализ В1Асоге используют для определения скоростей связывания антител по настоящему изобретению с антигеном химерного вируса по настоящему изобретению (например, антигеном или эпитопом основы химерного вируса или антигеном или эпитопом слитого белка (например, связанным с заболеванием антигеном)) и диссоциации таких комплексов. Кинетический анализ В1Асоге включает анализ связывания и диссоциации полипептида, содержащего представляющий интерес антиген, с чипов с иммобилизованными антителами, образованными при использовании химерных вирусов по настоящему изобретению, на своей поверхности. Типичное кинетическое исследование В1Асоге включает инъекцию 250 мкл реагента антитела (мАт, ЕаЬ) в различной концентрации в буфере НВ8, содержащем 0,005% Ттееп-20, на поверхность сенсорного чипа, на которой иммобилизован антиген. Скорость потока сохраняют постоянной при 75 мкл/мин. Данные по диссоциации собирают в течение 15 мин или больше, если необходимо. После каждого цикла инъекции/диссоциации связанное мАт удаляют с поверхности антигена с использованием кратковременных, 1 мин, импульсов разбавленной кислоты, обычно 10-100 мМ НС1, хотя другие регенерирующие агенты используются согласно предписанию обстоятельств. Более конкретно, для измерения скоростей ассоциации, коп, и диссоциации, ко££, полипептид, содержащий антиген, непосредственно иммобилизуют на поверхности сенсорного чипа благодаря использованию стандартных химий сопряжения аминов, а именно метода ЕОС/ΝΗδ (ЕОС=№диэтиламинопропил)карбодиимид). Вкратце, 5100 нМ раствора полипептида, содержащего антиген, в 10 мМ №1ОАс. рН 4 или рН 5, готовят и пропускают над ЕОС/ИНЗ-активированной поверхностью до тех пор, пока не будет иммобилизована реакционная способность приблизительно 30-50 РЕ антигена. После этого не прореагировавшие активные сложные эфиры покрывают с помощью инъекции 1 М ΗΙ-ΝΗ2. Пустую поверхность, не содержащую антиген, готовят при идентичных условиях иммобилизации в целях приготовления эталона. После приготовления соответствующей поверхности готовят подходящие серии разведений каждого реагента антитела в НВ8/Т\уееп-20 и пропускают над поверхностями как антигена, так и эталона, которые соединены в ряд. Диапазон концентраций антитела, который готовят, зависит от оценки константы равновесного связывания, Кс. Как описано выше, связанное антитело удаляют после каждого цикла инъекции/диссоциации с использованием соответствующего регенерирующего агента.
Антитела, образованные при использовании химерных вирусов по настоящему изобретению, или их фрагменты можно также проанализировать на их способность ингибировать связывание антигена химерного вируса по настоящему изобретению (например, антигена или эпитопа основы химерного вируса или антигена или эпитопа слитого белка (например, связанного с заболеванием антигена) с рецептором клетки хозяина с использованием методов, известных квалифицированным в данной области специалистам. Например, клетки, экспрессирующие рецепторы, которые, как известно, связывают указанные антигены, можно привести в контакт с антигеном в присутствии или отсутствие антитела, образованного при использовании химерных вирусов по настоящему изобретению, или их фрагменты и способность антитела или его фрагмента ингибировать связывание антигена можно определить, например, с помощью проточной цитометрии и сцинтилляционного анализа. Антиген или антитело или фрагмент антитела можно пометить определяемым компонентом, таким как радиоактивная метка (например, 32Р, 35δ и 125Ι) или флуоресцентная метка (например, флуоресцинизотиоционат, родамин, фикоэритрин, фикоциа
- 44 016217 нин, аллофикоцианин, о-фталдегид и флуорескамин) для того, чтобы сделать возможным обнаружение взаимодействия между антигеном и клеточным рецептором. Альтернативно, способность антител, образованных при использовании химерных вирусов по настоящему изобретению, или их фрагментов ингибировать связывание антигена химерного вируса по настоящему изобретению (например, антигена или эпитопа основы химерного вируса или антигена или эпитопа слитого белка (например, связанного с заболеванием антигена) с рецептором можно определить в бесклеточных анализах. Например, полипептид, содержащий антиген, можно привести в контакт с антителом или его фрагментом и можно определить способность антитела или фрагмента антитела ингибировать связывание полипептида с рецептором клетки. Предпочтительно антитело или фрагмент антитела иммобилизуют на твердой подложке, а полипептид метят определяемым компонентом. Альтернативно, полипептид, содержащий антиген, иммобилизуют на твердой подложке, а антитело или его фрагмент метят определяемым компонентом.
5.6.2. Ιη νίνο анализы
Вирулентность химерных вирусов по настоящему изобретению можно определить у индивида, в частности птиц, или на модели на животном. В одном примере способность индуцировать повреждение легкого или вызвать инфекцию в модели вирусной инфекции на животном сравнивают с вирусом дикого типа и ложным вирусом. Повреждение легких можно оценить как процент долей легких, которые являются здоровыми по визуальной оценке. Животных подвергают эвтаназии через 5 дней после инфицирования с помощью внутривенного введения пентобарбитала, и их легкие удаляют целиком. Процент поверхности каждой доли легкого с макроскопическими повреждениями оценивают визуально. Проценты усредняют с получением средней величины для 7 долей легких каждого животного. В других анализах можно проверить мазки со слизистой оболочки носа с определением нагрузки или титра вируса. Мазки со слизистой оболочки носа можно получать во время вскрытия трупа для определения нагрузки вируса после инфекции.
Для количественного определения вируса в образцах ткани образцы ткани гомогенизируют в забуференном фосфатом солевом растворе (РВ8), и разведения осветленных гомогенатов адсорбируют в течение 1 ч при 37°С на монослоях клеток (например, клеток СЕР или МОСК). Инфицированные монослои затем покрывают раствором минимальной необходимой среды, содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина (Β8Α), 0,01% ΌΕΑΕ-декстран, 0,1% Ν;·ιΗίΌ3 и 1% агар. Планшеты инкубируют в течение 2-3 дней до тех пор, пока не будут видны бляшки. Анализы инфекционной для культуры тканей дозы (ТСГО) для титрации вируса из РВ8-инфицированных образцов проводят следующим образом. Конфлюэнтные монослои клеток (например, клеток СΕΡ или МОСК) в 96-луночных планшетах инкубируют с 1од-разведения осветленного гомогената ткани в средах. Через 2-3 дня после инокуляции 0,05-мл аликвоты из каждой лунки оценивают в отношении роста вирусов с помощью анализа гемаглютинации (анализа НА).
В еще одних анализах после инфицирования проводят гистопатологические оценки. Носовые раковины и трахею можно проверить на наличие изменений эпителия и субэпителиального воспаления. Легкие можно проверить на наличие изменений эпителия бронхиол и перибронхиолярного воспаления в больших, средних и маленьких или конечных бронхиолах. Альвеолы также оценивают на наличие воспалительных изменений. Средние бронхиолы оценивают по шкале 0-3+ следующим образом: 0 (нормальные: выстланные столбчатыми от средних до высоких эпителиальными клетками с реснитчатыми апикальными краями, базальными ядрами и псевдомногорядными; минимальное воспаление); 1+ (эпителиальный слой столбчатый и даже в контуре только с незначительно увеличенной пролиферацией; реснички еще видны на многих клетках); 2+ (значительные изменения эпителиального слоя, простирающиеся от истощения до значительной пролиферации; клетки дезорганизованные и контур слоя неправильный на люминальной границе); 3+ (эпителиальный слой, значительно нарушенный и дезорганизованный, с некротическими клетками, видимыми в просвете; некоторые бронхиолы истощены, а другие со значительной реактивной пролиферацией).
Трахею оценивают по шкале 0-2,5+ следующим образом: 0 (нормальная: выстланная столбчатыми от средних до высоких эпителиальными клетками с реснитчатыми апикальными краями, базальными ядрами и псевдомногорядными; видимая между апикальным краем и ядром цитоплазма; редкий небольшой очаг сквамозных клеток); 1+ (фокальная сквамозная метаплазия эпителиального слоя); 2+ (диффузная сквамозная метаплазия большей части эпителиального слоя; реснички могут быть видны фокально); 2,5+ (диффузная сквамозная метаплазия с очень незначительным числом видимых ресничек).
Иммуногистохимию вируса проводят с использованием специфичного в отношении вируса моноклонального антитела (например, специфичных в отношении ΝΡ, Ν или ΗΝ моноклональных антител). Окрашивание оценивают по шкале 0-3+ следующим образом: 0 (нет инфицированных клеток); 0,5+ (незначительное число инфицированных клеток); 1+ (незначительное число инфицированных клеток, в виде в большой степени разделенных индивидуальных клеток); 1,5+ (незначительное число инфицированных клеток, в виде в большой степени разделенных индивидуальных клеток или в небольших кластерах); 2+ (умеренные числа инфицированных клеток, обычно пораженные кластеры соседних клеток в частях эпителиального слоя, выстилающего бронхиолы, или в небольших субдольковых очагах в альвеолах); 3+ (многочисленные инфицированные клетки, поражение большей части эпителиального слоя в бронхиолах
- 45 016217 или широкое распространение в больших субдольковых очагах в альвеолах).
5.6.3. Определение титра вируса
Титр вируса определяют с помощью инокуляции серийных разведений химерного вируса в клеточные культуры (например, СЕЕ или МОСК), куриные эмбрионы или живых животных (например, птиц). После инкубации вируса в течение точно определенного времени вирус выделяют с использованием стандартных способов.
Анализ НА можно выполнять в планшетах с 96 лунками с ν-образным дном. Серийные двукратные разведения каждого образца в РВ8 инкубируют в течение 1 ч на льду с равным объемом 0,5% суспензии эритроцитов кур в РВ8. Положительные лунки содержат гомогенный слой слипшихся эритроцитов; отрицательные лунки содержат не слипшийся осадок.
Физическое определение титра вируса можно осуществить с использованием ПЦР, в которой используются вирусные супернатанты (Цшпп & Тгеуог, 1997; Могдап е! а1., 1990), анализов гемаглютинации, инфекционных для культуры тканей доз (ТСГО50) или инфекционных для яиц доз (ЕШ50).
5.6.4. Исследование токсичности
Токсичность и/или эффективность композиций (например, иммуногенных композиций по настоящему изобретению) можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур в культурах клеток или экспериментальных животных, например, для определения ΕΏ50 (дозы, приводящей к смерти 50% популяции) и ЕЭ50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Дозовое соотношение между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс, и его можно выразить в виде отношения ЕЭ50/Е050. Предпочтительными являются терапии, демонстрирующие высокие терапевтические индексы. Несмотря на то, что можно использовать терапии, демонстрирующие токсические побочные эффекты, следует позаботиться о разработке системы доставки, которая нацеливает такие агенты в место пораженной ткани, для того, чтобы минимизировать возможное поражение неинфицированных клеток и, следовательно, уменьшить побочные эффекты.
Данные, полученные от анализов в культуре клеток или исследований на животных, можно использовать для определения диапазона доз терапии, используемого для индивида. Доза таких агентов находится предпочтительно в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые содержат ЕЭ50 с незначительной токсичностью или без нее. Доза может варьировать в пределах этого диапазона в зависимости от используемой формы дозы и используемого способа введения. Для любой терапии, используемой в способе по настоящему изобретению, терапевтически эффективную дозу можно первоначально определить из анализов в культуре клеток. Дозу можно определить в моделях на животных для получения диапазона циркулирующих концентраций в плазме, который включает 1С50 (т.е. концентрацию проверяемого соединения, с помощью которой достигается половина от максимального ингибирования симптомов), определяемую в культуре клеток. Такая информация может быть использована для более точного определения применимых для индивидов (например, лошадей). Уровни в плазме можно определить, например, с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения.
Кроме того, любые анализы, известные квалифицированным в данной области специалистам, можно использовать для оценки профилактической и/или терапевтической пригодности композиции (например, композиции вакцин), комбинации терапии, раскрытой в данном описании, для вирусной инфекции или состояния или симптомов, сопровождающих ее, инфекции, отличной от вирусной инфекции, или состояния или симптомов, сопровождающих ее, или состояния, при котором аттенуированный химерный вирус по настоящему изобретению используется в качестве вектора для индукции иммунного ответа на антиген, связанный с этим состоянием.
5.7. Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему слитый белок, имеющий:
(ί) эктодомен, содержащий гетерологичную пептидную последовательность, содержащую по крайней мере один эпитоп антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанного с заболеванием антигена, слитый с (ίί) трансмембранным и цитоплазматическим доменами гликопротеина, кодируемого основным геном вируса гриппа, причем слитый белок содержится в вирусе птичьего гриппа, в котором функция основного гена обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным вирусу птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген гемаглютинина (НА). В других вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген нейраминидазы (ΝΑ). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа является аттенуированным. В соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа может быть аттенуирован с помощью мутаций в гене Ν81.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему слитый белок, имеющий:
(ί) эктодомен белка ΗΝ ΝΏν, слитый с
- 46 016217 (ίί) трансмембранным и цитоплазматическим доменом белка ΝΑ вируса гриппа, причем слитый белок содержится в вирусе птичьего гриппа, в котором функция белка ΝΑ обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным вирусу птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа является аттенуированным. В соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа может быть аттенуирован с помощью мутаций в гене Ν81.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему слитый белок, имеющему:
(ί) эктодомен, содержащий гетерологичную пептидную последовательность, содержащую по крайней мере один эпитоп антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанного с заболеванием антигена антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, слитый с (ίί) трансмембранным и цитоплазматическим доменами гликопротеина, кодируемого основным геном вируса гриппа, причем слитый белок содержится в аттенуированном вирусе гриппа, в котором функция основного гена обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным аттенуированному вирусу гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген гемаглютинина (НА). В других вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген нейраминидазы (ΝΑ).
Настоящее изобретение относится к химерному ΝΌν, содержащему слитый белок, имеющий:
(ί) эктодомен, содержащий гетерологичную пептидную последовательность, содержащую по крайней мере один эпитоп антигена инфекционного агента, отличного от ΝΌν, или связанного с заболеванием антигена, слитый с (ίί) трансмембранным и цитоплазматическим доменами гликопротеина, кодируемого основным геном ΝΌν, причем слитый белок содержится в ΝΌν, в котором функция основного гена обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным ΝΌν.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный сегмент ΝΑ вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка считывания ΝΑ модифицирована так, что кодирующие эктодомен ΝΑ нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена нейраминидазы инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется Ν-концом, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный сегмент НА вируса гриппа, кодирующий слитый с гемаглютинином белок, в котором открытая рамка считывания НА модифицирована так, что кодирующие эктодомен НА нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена гемаглютинина инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется С-концом, так что слитый с гемаглютинином белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент НА вируса гриппа, содержащий:
(a) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок гемаглютинин вируса птичьего гриппа, и (b) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с гемаглютинином белок, в которой кодирующие эктодомен гемаглютинина нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими гетерологичную пептидную последовательность, содержащую по крайней мере один эпитоп антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется С-концом, так что и гемаглютинин вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и содержатся в химерном вирусе птичьего гриппа.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент ΝΑ вируса гриппа, содержащий:
(a) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок нейраминидазу вируса птичьего гриппа, и (b) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с нейраминидазой белок, в которой кодирующие эктодомен нейраминидазы нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими гетерологичную пептидную последовательность, содержащую по крайней мере один эпитоп антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется Ν-концом, так что и нейраминидаза вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и содержатся в химерном вирусе птичьего гриппа.
Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный сегмент ΝΑ вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка считывания ΝΑ модифицирована так, что кодирующие эктодомен ΝΑ нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена ΗΝ ΝΌν, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессиру
- 47 016217 ется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, описанному на стр. 123 строки 22-36, стр. 124 строки 1-35, стр. 125 строки 11-36 и стр. 126 строки 1-28, который включает упакованный сегмент гена Ν81, кодирующий модифицированный белок Ν81, уменьшающий антагонистическую в отношении клеточного интерферона активность вируса. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, описанному на стр. 123 строки 22-36, стр. 124 строки 1-35, стр. 125 строки 11-36 и стр. 126 строки 1-28, который включает сегмент НА, имеющий открытую рамку считывания, модифицированную с удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина. В еще одних вариантах осуществления настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, описанному на странице 125 со строки 29 по страницу 126 строка 6, в котором первая открытая рамка считывания модифицирована с удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантные ДНК-молекулы), кодирующим сегмент NΑ химерных вирусов птичьего гриппа описанных на стр. 125 строки 11-18 и стр. 126 строки 7-31. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантные ДНК-молекулы), кодирующим сегмент НА химерных вирусов птичьего гриппа, описанных на стр. 125 со строки 20 до стр. 126 строки 1-6.
Настоящее изобретение относится к способам размножения химерного вируса птичьего гриппа описанного на стр. 123 строки 22-36, стр. 124 строки 1-35, стр. 125 строки 11-36 и стр. 126 строки 1-28 и со стр. 125 строка 11 по стр. 127 строка 11, содержащим культивирование химерных вирусов птичьего гриппа в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию вирусом птичьего гриппа. Настоящее изобретение также относится к способам получения иммуногенной композиции, содержащим:
(a) размножение химерного вируса птичьего гриппа, описанного на стр. 123 строки 22-36, стр. 124 строки 1-35, стр. 125 строки 11-36 и стр. 126 строки 1-28 и со стр. 125 строка 11 по стр. 127 строка 11, в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию вирусом птичьего гриппа; и (b) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адекватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так что потомство вируса пригодно для применения в иммуногенной композиции, например композиции вакцин.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный сегмент NΑ вируса гриппа, кодирующему слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка считывания NΑ модифицирована так, что кодирующие эктодомен NΑ нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена нейраминидазы инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется Ν-концом, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный сегмент НА вируса гриппа, кодирующему слитый с гемаглютинином белок, в котором открытая рамка считывания НА модифицирована так, что кодирующие эктодомен НА нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена гемаглютинина инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется С-концом, так что слитый с гемаглютинином белок экспрессируется и встраивается в аттенуированный химерный вирус гриппа.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент НА вируса гриппа, содержащему:
(a) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок гемаглютинин вируса птичьего гриппа, и (b) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с гемаглютинином белок, в которой кодирующие эктодомен гемаглютинина нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими гетерологичный белок, содержащий эпитоп эктодомена антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется С-концом, так что и гемаглютинин вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и содержатся в аттенуированном химерном вирусе гриппа.
Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент NΑ вируса гриппа, содержащему:
(a) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок нейраминидазу вируса птичьего гриппа, и (b) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с нейраминидазой белок, в которой кодирующие эктодомен нейраминидазы нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими гетерологичный белок, содержащий эпитоп эктодомена антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется Ν-концом, так что и нейраминидаза вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и содержатся в аттенуи
- 48 016217 рованном химерном вирусе гриппа.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу, описанному со стр. 128 строка 5-13 до стр. 129 строка 2-16, который включает упакованный сегмент гена Νδ1, кодирующий модифицированный белок Νδ1, уменьшающий антагонистическую в отношению клеточного интерферона активность вируса. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, описанному со стр. 128 строка 5-13 до стр. 129 строка 2-16, который включает сегмент НА, имеющий открытую рамку считывания, модифицированную с удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина. В еще одних вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, описанному со стр. 128 строка 23 по стр. 129 строка 1, в котором первая открытая рамка считывания модифицирована с удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным ДНК-молекулам, кодирующим сегмент ΝΑ аттенуированных химерных вирусов гриппа, описанных на стр. 128 строка 5-13 и стр. 129 строка 2-16. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным ДНК-молекулам, кодирующим сегмент НА аттенуированных химерных вирусов гриппа, описанных со стр. 128 строка 14 по стр. 129 строка 1.
Настоящее изобретение относится к способам размножения аттенуированных химерных вирусов гриппа, описанным со стр. 128 строка 5 по стр. 129 строка 34, содержащим культивирование аттенуированных химерных вирусов гриппа в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию вирусом птичьего гриппа. Настоящее изобретение также относится к способам получения иммуногенной композиции, содержащим:
(a) размножение аттенуированного химерного вируса гриппа, описанного на стр. 124 строка 19-35 и со стр. 128 строка 5 по стр. 129 строка 34 в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию аттенуированным вирусом гриппа; и (b) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адекватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так что потомство вируса пригодно для применения в иммуногенной композиции, например композиции вакцин.
Настоящее изобретение относится к химерному ΝΏν, содержащему упакованный геном, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый с белком Р белок, имеющий трансмембранный и цитоплазматический домены белка Р и эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от ΝΏν, который прикрепляется С-концом, так что слитый с белком Р белок экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν.
Настоящее изобретение относится к химерному ΝΏν, содержащему упакованный геном, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый с ΗΝ белок, имеющий трансмембранный и цитоплазматический домены белка ΗΝ и эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от ΝΏν, который прикрепляется Ν-концом, так что слитый с ΗΝ белок экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения геном химерного ΝΏν, описанный на стр. 125 строки 11-19 и на стр. 130 строках 23-36, включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Р, так что белок Р экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν помимо слитого с белком Р белка. В других вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый с белком Р белок ΝΏν, заменяет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Р ΝΏν, и слитый с белком Р белок обеспечивает функцию белка Р в химерном ΝΏν, описанном на стр. 130 строки 23-29.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения геном химерного ΝΏν, описанный со стр. 124 строка 36 по стр. 125 строка 10 и со стр. 128 строка 23 по стр. 129 строка 16, включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΗΝ, так что белок ΗΝ экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν. В других вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый с ΗΝ белок, заменяет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΗΝ ΝΏν, и слитый с ΗΝ белок обеспечивает функцию белка ΗΝ в химерном ΝΏν, описанном на стр. 130 строки 30-36.
Настоящее изобретение относится к способам размножения химерных ΝΏν, описанным со стр. 124 строка 36 по стр. 125 строка 10 и на стр. 130 строках 23-36, содержащим культивирование химерных ΝΏν в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию ΝΏν. Настоящее изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции, содержащему:
(a) размножение химерных ΝΏν, описанных со стр. 124 строка 36 по стр. 125 строка 10 и на стр. 130 строках 23-36, в яйце с эмбрионом или клетке; и (b) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адекватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так что потомство вируса пригодно для применения в иммуногенной композиции, например композиции вакцин.
- 49 016217
Настоящее изобретение относится к яйцам с эмбрионами, содержащим химерные вирусы, описанные со стр. 123 строка 22 по стр. 124 строка 18 по стр. 124 строка 36 по стр. 127 строка 11 и на стр. 130 строках 23-36. Настоящее изобретение также относится к клеточным линиям, содержащим химерные вирусы, описанные со стр. 123 строка 22 по стр. 124 строка 18 и на стр. 130 строках 23-36. Настоящее изобретение, кроме того, относится к иммуногенным композициям, содержащим химерные вирусы, описанные со стр. 123 строка 22 по стр. 124 строка 18, со стр. 124 строка 36 по стр. 127 строка 11 и на стр. 130 строках 23-36.
Настоящее изобретение относится к яйцам с эмбрионами, содержащим аттенуированные химерные вирусы, описанные на стр. 124 строка 19-35 и со стр. 128 со строки 5 по стр. 129 строка 34. Настоящее изобретение также относится к клеточным линиям, содержащим аттенуированные химерные вирусы описанные на стр. 124 строка 19-35 и со стр. 128 со строки 5 по стр. 129 строка 34. Настоящее изобретение, кроме того, относится к иммуногенным композициям, содержащим аттенуированные химерные вирусы, описанные на стр. 124 строка 19-35 и со стр. 128 со строки 5 по стр. 129 строка 34.
Настоящее изобретение относится к способам индуцирования у птицы иммунного ответа на два инфекционных агента, содержащим введение эффективного количества химерного вируса птичьего гриппа описанного со стр. 123 строка 22 по стр. 124 строка 18 и со стр. 125 строка 11 по стр. 127 строка 11. Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования у птицы иммунного ответа на два инфекционных агента, содержащим введение эффективного количества химерного ΝΏν, описанного со стр. 124 строка 36 по стр. 125 строка 10 и на стр. 130 строках 23-36. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам индуцирования у индивида иммунного ответа на два инфекционных агента, содержащим введение эффективного количества аттенуированного химерного вируса гриппа, описанного на стр. 124 строка 19-35 и со стр. 128 со строки 5 по стр. 129 строка 34. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является не являющееся человеком млекопитающее (например, свинья, лошадь, собака, кошка или бык). В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является птица.
6. Примеры
6.1. Разработка химерного вируса птичьего гриппа, представляющего эпитоп вируса псевдочумы птиц
В следующем примере описывается получение примера химерного вируса птичьего гриппа. В частности, в примере описывается разработка вируса птичьего гриппа ОтПиепха Л/У|с1паш/1203/04 (Η5Ν1) для экспрессии и встраивания в его вирион слитого белка, содержащего трансмембранный и цитоплазматичекий домены белка ΝΑ вируса птичьего гриппа и эктодомен белка ΗΝ ΝΏν. Слитый белок функционально замещает белок ΝΑ вируса птичьего гриппа.
6.1.1. Материалы и методы
6.1.1.1. Конструирование плазмид
Все плазмидные конструкции, используемые при восстановлении рекомбинантных вирусов с использованием только плазмид, клонировали, используя одну и ту же стратегию. Полноразмерные кДНК вирусных сегментов амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, которые включали рестрикционные сайты для 8ар1, которые делали возможным встраивание ПЦР-продукта в 8ар1-сайты плазмиды рРо11-8ар1-КЬ (ИапйогГег е! а1., 2003, 1. νίτοί. 77:9116-9123; Nакауа е! а1., 2001, 1. νίτοί. 75:118 68-11873; каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки). Подтверждали последовательности всех ПЦР-вставок (оборудование для секвенирование ДНК Моип! 81па1, ΝΥ), и нуклеотидные замены, введенные с помощью ПЦР, корректировали с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза ОшекСйапде ХЬ (81гадепе, Ьа 1о11а, СА), когда уместно. В табл. 2 представлены последовательности СепВапк для 1пГ1иепха А/У1е1пат/1203/04 (Η5Ν1), ИтПиепха Α/νδΝ/33 (νδΝ) и ΝΏν.
Таблица 2. Номера доступа в СепВапк вирусных сегментов
Вирус Сегмент Νε доступа в СепВапк
Η5Ν1 N8 ΑΥ651553 (5ЕЦ ГО N0:1)
М ΑΥ651388 (8Е0 1Ώ N0:2)
ΝΡ ΑΥ651499 (ЗЕф ΙΏΝΟ:3)
НА ΑΥ818135 (8Ε0ΙΏΝΟ:4)
ΝΑ ΑΥ651447 (8ЕЦ ΙΏΝΟ:5)
РА ΑΥ818132 (8Е0 ГО N0:6)
РВ1 ΑΥ818129 (8ЕЦ ГО N0:7)
РВ2 ΑΥ651719 (8Е0 ГО N0:8)
ΑΥ8Ν ΝΑ Ь25817 (8Е0 ГО N0:9)
ΝΏΥΒ1 ΗΝ АР309418 (8ЕЦΙΏ N0:10)
6.1.1.2. Конструирование сегмента химерного вируса кДНК, кодирующую эктодомен ΗΝ ΝΏν В1 и цитоплазматический хвостовой (СТ) и трансмембранный (ТМ) домены нейраминидазы (ΝΑ) ОтПиепха Α/\ν8Ν/33 (А/У1е1пат/1203/04-Α/\ν8Ν/33
- 50 016217
ΝΑ,·,;Τ.·|Μ-Νθν В1 ΗΝ(6σ1ο)), конструировали с использованием рекомбинантных методов, хорошо известных в данной области. Конструкция включает 19 нуклеотидов 3' некодирующей области вирусной РНК ΝΑ νδΝ, нуклеотиды, кодирующие аминокислоты 1-38 (108 нуклеотидов) кодирующей ΝΑ области, соответствующие цитоплазматическому хвостовому и трансмембранному доменам белка ΝΑ плюс первая аминокислота эктодомена ΝΑ, за которой следуют нуклеотиды, кодирующие аминокислоты 51-586 белка ΗΝ ΝΏν В1 (эктодомен ΗΝ), два последовательных стоп-кодона, 157 нетранслируемых нуклеотидов рамки считывания ΝΑ \ν8Ν и 5' некодирующая область вирусной РНК \ν8Ν (фиг. 1).
6.1.1.3. Конструирование плазмидных конструкций, кодирующих химерные Η5Ν1-ΝΏν
Плазмидные конструкции создавали для продуцирования, с помощью восстановления с использованием только плазмид, химерного вируса, основанного на Η5Ν1 (вирусе-хозяине), конструируемого для представления поверхностного гликопротеина ΝΏν. Сегмент Η5Ν1, кодирующий поверхностный гликопротеин ΝΑ, был выбран для замены рекомбинантным сегментом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую СТ и ТМ домены белка ΝΑ плюс первая аминокислота эктодомена ΝΑ Α/\ν8Ν/33 и эктодомен белка ΗΝ ΝΏν-Β1. Слитый белок, Α/V^еΐηат/1203/04-Α/V8N/33
ΝΑ(στ+ΊΜ)~ΝΏν В1 ΗΝ^), обеспечивает нейраминидазную активность для химерного вируса птичьего гриппа. Смотри фиг. 1 для схематического представления химерного сегмента.
Остальные семь сегментов Η5Ν1, перечисленных в табл. 2 (Ν8, М, ΝΡ, НА, ΡΑ, РВ1 и РВ2), клонировали в рРо11 с получением рРо11У№203-Н8, рРо11У№203-М, рРо11УШ203-№, ρΡο11VN1203-ΗΑ, рΡο11VN1203-ΡΑ, рРо11 νΝ 1203-РВ1 и рРо11УШ203-РВ2, соответственно. Для гарантии аттенуации химерного вируса Η5Ν1 сегмент, кодирующий НА Η5Ν1, изменили с превращением природной последовательности с множеством основных аминокислот, находящейся непосредственно перед сайтом расщепления НА (нуклеотиды 1013-1039 кодирующей последовательности НА Η5Ν1) в консенсусную последовательность, основанную на невирулентных птичьих штаммах вируса гриппа А Н5. Аминокислотная последовательность в этой области изменена с рКЕККККККС (8ΕΟ ΙΏ ΝΟ:11; аминокислоты 2-11 8ΕΟ ΙΏ ΝΟ:14) на ОКЕТКС (8ЕО ΙΏ ΝΟ:12; аминокислоты 2-7 8ЕО ΙΏ ΝΟ:16), заменяя подчеркнутые аминокислоты треонином (фиг. 2). Кроме того, было изменено использование кодонов в этой области с уменьшением числа остатков аденозина для того, чтобы минимизировать вероятность введения вновь остатков аденозина в эту последовательность при проскальзывании полимеразы и результирующего введения остатков основных аминокислот в сайт расщепления НА. Только синонимичные мутации были введены в последовательность невирулетного НА (фиг. 3). Получаемый в результате сегмент, кодирующий измененный гликопротеин НА, соответствующий штаммам вируса птичьего гриппа А с низкой вирулентностью, клонировали в плазмиду рРо11, как ранее описано, рΡο11VN1203-ΗΑ^Ο. За исключением РВ1 и РВ2 генные продукты, кодируемые сегментами Η5Ν1, не были изменены по сравнению с последовательностями в СеиВаик.
Последовательности РВ1 и РВ2 изменяли в результате встраивания рестрикционных сайтов для 8ар1. Несинонимичная замена нуклеотидом с основанием в виде гуанина в положении 32 кодирующей последовательности РВ1 привела к замене лизина на аргинин; несинонимичная замена нуклеотидом с основанием в виде Тимина в положении 1393 кодирующей последовательности РВ2 привела к замене пролина на серин. Все генные продукты Η5Ν1 имели остаток аденозина в положении 4 вирусной РНК.
Помимо плазмидной конструкции, кодирующей Ν8 Η5Ν1 дикого типа, рРо11 νΝ1203-Ν8, были также созданы три конструкции рРо11, кодирующие по-разному усеченные варианты сегмента гена Ν8 Η5Ν1. Дополнительные конструкции, кодирующие измененные варианты сегмента Ν8, можно использовать при дальнейшей аттенуации получаемого в результате химерного вируса (см., например, патент США № 6669943, который полностью встраивали сюда посредством ссылки). Три конструкции отличались по числу аминокислот белка Ν81 (от аминоконца), которые экспрессировались плазмидной конструкцией. Таким образом, рРо11УЮ203 Ν81-126, рРо11УШ203 Ν81-99 и рРо11УШ203 Ν81-73 кодируют только первые 126, только первые 99 и только первые 73 аминокислоты, отсчитываемые с амино-конца белка Ν8 дикого типа, соответственно. Мутагенез, используемый при создании усеченных конструкций, не оказывал влияние на открытую рамку считывания КЕР (фиг. 4).
6.1.1.4. Восстановление инфекционного вируса из плазмидных конструкций
Рекомбинантные, химерные вирусы по настоящему изобретению восстанавливают с помощью любого способа, описанного в данном описании или известного в данной области. Например, клетки 293Т, НЕр-2 или А549 можно трасфицировать восьмью описанными плазмидами рРо11, выбираемыми для достижения желаемого уровня аттенуации вируса и так, чтобы все восемь сегментов были представлены, т.е. клетки трасфицируют рΡο11VN ν8Ν-ΝΑι(;·Ί.·ΊΜ,-Ν0ν В1 ΗΝ^); рΡο11VN1203-ΗΑ или рΡο11VN120311ΑΙ.Ο; рРо11УМ203-Н8, рРо11УМ203-Н81-126, рΡο11VN1203-N81-99 или рРо11УМ203-Ы81-73; рРо11УШ203-М; рΡο11VN1203-NΡ; рΡο11VN1203-ΡΑ; рРо11УМ203-РВ1 и рРо11УМ203-РВ2. Клетки, кроме того, трансфицировали эукариотическими экспрессирующими плазмидами, кодирующими ΝΑ, ΡΑ, РВ1 и РВ2, которые требуются для репликации и транскрипции вирусных РНК. После инкубации в течение ночи трансфицированные клетки можно сокультивировать с фибробластами куриных эмбрионов для амплификации продуцируемых вирусов. После дополнительных 2-3 дней инкубации супернатант сокультуры можно инъецировать в аллантоисные полости куриных яиц с эмбрионами возрастом 9 или 10
- 51 016217 дней для размножения. Для аттенуированных вирусов можно использовать яйца возрастом 7 дней, которые не имеют компетентную в отношении интерферона систему. Рост вируса можно подтвердить путем анализа гемаглютинации с использованием собранной аллантоисной жидкости в соответствии со стандартными протоколами, известными в данной области.
6.2. Разработка химерного вируса псевдочумы птиц, представляющего чужеродный эпитоп
В следующем примере описывается получение примера химерных ΝΏν. В частности, в примере описывается конструирование химерного ΝΏν для экспрессии и встраивания в его вирион слитого белка, содержащего трансмембранный и цитоплазматический домены необходимого белка ΝΏν и эктодомен вируса птичьего гриппа. В примере демонстрируется, что такой химерный вирус индуцирует защиту против последующего инфицирования как вирусом гриппа, так и ΝΏν.
В примере также описывается разработка примера ΝΏν для экспрессии и встраивания в его вирион слитого белка, содержащего цитоплазматический домен белка Р ΝΏν и эктодомен и трансмембранный домен рецептора фактора роста кератиноцитов человека (КОРК).
6.2.1. Материалы и методы
6.2.1.1. Линии клеток
Клетки МЭСК, НЕр-2 и А549 выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой и 1% пенициллина/стрептомицина. Полноразмерная кДНК штамма Ш^йпет В1 ΝΏν опубликована под номером доступа в ОепВапк ΑΡ375823 (№1кауа е! а1., 2001, I. νίτοί. 75: 11868-11873, который полностью встраивали сюда посредством ссылки).
6.2.1.2. Конструирование плазмид
Конструирование рекомбинантной кДНК ΝΏν, кодирующей чужеродный белок, описано (№1кауа е1 а1. , 2001, I. Υίτοί. 75: 11868-11873). Вкратце, полноразмерные кДНК ΝΏν встраивали в плазмиду между промотором Т7 и рибозимом вируса гепатита дельта (ΗΏν) и терминатором Т7 с созданием ρΝθν/61. кДНК ΝΏν имеет рестрикционный сайт для ХЬа1, сконструированный между генами Р и М, который делает возможным встраивание чужеродных последовательностей в виде дополнительной транскрипционной единицы в геном ΝΏν (фиг. 5). Все встраиваемые гены конструировали так, чтобы они последовательно содержали конец гена; 5'-ΤΤΑΟΑΑΑΑΑΑ-3' (8ЕО ΙΏ ΝΟ: 18); межцистронный нуклеотид Т и последовательность начала гена; 5'-ΑССССΤΑСΑΑ-3' (8ЕО ΙΏ ΝΟ: 19) (последовательность ОЕ/О8).
Вирусы ^N^V/В1-КОΡК, гНОУ/В1-КСРК/Р-СТ и ^N^V/В1-Η7ΗΛ/Ρ-ТМСТ создавали с помощью обратной генетики с использованием полноразмерных копий кДНК, происходящих из штамма ΗίΐΗιικΓ В1 ΝΏν. Для конструирования этих вирусов ΟΚΡ КОРК или НА Н7 (белка НА из подтипа Η7Ν2 вируса гриппа А) клонировали в дополнительную транскрипционную единицу между генами Р и М кДНК ΝΏν/ВД как описано для других ΟΚΡ (№1кауа е! а1., 2001, I. Υίτοί. 75: 11868-11873; Nакауа е! а1., 2004, I. νίτοί. 78: 93 66-9375, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки). КОРК и НА Н7 являются трансмембранными белками, каждый из которых включает ТМ и СТ домены. В конструкции КОРК/Р-СТ СТ домен белка КОРК замещен СТ доменом белка Р ΝΏν. В конструкции Η7ΗЛ/Ρ-ΤМСΤ ТМ и СТ домены белка НА Н7 замещены ТМ и СТ доменами белка Р ΝΏν. Рекомбинантные вирусы ΝΏν восстанавливали из кДНК и размножали с использованием стандартных методов, хорошо известных в данной области (см., например, 8\уаупе е! а1., 2003, Αν^аπ Ώίδ. 47: 1047-1053; №кауа е! а1, 2001, оба из которых таким образом полностью встроены посредством ссылки). Вставку новых транскрипционных единиц в рекомбинантных вирусах подтверждали с помощью обратной транскрипции ΡίΏ с последующим секвенированием.
Например, эктодомен (ЕСТО) гена НА Н5 получали с помощью ПЦР с использованием следующих праймеров (которые содержат последовательность ОЕ/О8): ΝΙκΙ-Η5ΗΑ Р, 5'-СООСΤΑОС ΤΤΑОΑΑΑΑΑΑΤΑСООΤΑОΑΑОΤОΑΑΑСΤΑОΤССОССΑССΑΤООΑΑΑОΑΑΤΑОΤОΑΤΤОССΤΤΤОС Α-3' (8ЕС) ΙΏ ΝΟ: 20) и ΗρаI-Η5ΗΑ Р, 5'-СООΤΤΑΑССΤОΑΤΑΑОСССССΑΤΤОΑΤΤСΤΑΑΤ-3' (8ЕО ΙΏ ΝΟ: 21). ПЦР-фрагмент Н5 ΗΑ^ω расщепляли с помощью ΝΙκΙ и ΗρаI и клонировали в р8Ь1180 (Αιηο 511аш Рйагтас1а Вю1есй) (ρδΕ^ΗΑ^). ТМ и СТ гена Р ΝΏν также амплифицировали с помощью ПЦР с использованием следующих праймеров: ΗρаI-N^VΡ(ΤМ+СΥΤΟ)Р, 5'-СООΤΤΑΑССΤСΑΤΤΑССΤΑΤ АТ^^^^СТЗ' (8ЕО ΙΏ ΝΟ: 22), δасI-NйеI-N^VΡ(ΤМ+СΥΤΟ)М, 5'-СООΑОСΤСΑΑОСΤΑОСΤΤΑ ΤСΑСΑΤΤΤΤΤОΤΑОΤООСΤСΤСΑΤСΤО-3' (8ЕО ΙΏ ΝΟ: 23). Для слияния с Н5 ΗΑ^ω ТМ и СТ гена Р ΝΏν расщепляли с помощью Ηρ;·ιΙ и 8;·1Η и затем клонировали в ρδΕ^ΗΑ^ с получением гибридного слитого гена. Наконец, плазмиду, содержащую гибридный ген Н5 НА, расщепляли с помощью ΝΙκΙ и клонировали между генами Р и М кДНК τΝΏν.
6.2.1.3. Вестерн-блоттинг и биологический анализ
Вирусы из экстрактов клеток или аллантоисной жидкости очищали с помощью ультрацентрифугирования через 30% сахарозные подушки. Уровень встраиванного белка контролировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием специфического антитела и стандартных методов.
Способность химерного ΝΏν представлять невирусный белок КОРК ш νίνο определяли с помощью иммунизации мышей ΡΑΕΡΑ 3х107 бляшкообразующих единиц химерного вируса внутрибрюшинно с последующей повторной иммунизацией с использованием той же самой дозы тремя неделями позже. Через две недели после второй иммунизации сыворотку от иммунизированных животных проверяли на
- 52 016217 присутствие антител против КОРЯ с помощью иммуноокрашивания клеток МОСК, трансфицированных плазмидой, кодирующей КОРЯ.
Была разработана ίη νίνο система для оценки того, способна ли иммунизация τΝΌν, содержащим гибридную конструкцию Н7 НА/Р-ТМСТ, обеспечить защиту против последующего инфицирования Н7 или ΝΏν. Цыплят возрастом две недели иммунизировали с помощью способа закапывания в глаза 100 мкл трех вакцин, τΝΟν, ιΝθν-Η7 НА/Р-ТМСТ и фикции. В возрасте 4 недели через хоаны в форме щели вводили 100 мкл, содержащих 105,1 средней инфекционной для эмбрионов дозы ΗΡ ΑΙν (А/81ее1е/АСС10/59 [Η7Ν7]). Птиц наблюдали на наличие признаков и повреждений, вызванных инфицированием ΗΡ ΑΙν. Регистрировали смертность и всех оставшихся в живых птиц подвергали эвтаназии с помощью пентобарбитала натрия (100 мг/кг) в возрасте 6 недель.
6.2.2. Результаты
6.2.2.1. Представление КОРЯ химерным ΝΏν, экспрессирующим КОРЯ или КОРЯ/Р-СТ
Химерные вирусы ^N^V/В1-КОΡЯ и ^N^V/В1-КОΡЯ/Ρ-СТ выращивали в аллантоисной полости куриных яиц с эмбрионами возрастом 10 дней. Очищенные вирусы проверяли на присутствие КОРЯ или КОРЯ/Р-СТ с помощью Вестерн-блоттинга с использованием крысиного антитела против КОРЯ. Положительный ответ обнаружили в образцах, выделенных из яиц, инокулированных τΝθν/В 1-КОРЯ/Р-СТ, но не ΓΝΏν/ΒΙ-КОРЯ (фиг. 6).
Каждый из трех химерных вирусов также использовали для иммунизации трех мышей ВАЬВ/с. Сыворотку от иммунизированных животных исследовали на присутствие антител против КОРЯ. У животных, иммунизированных вирусом ^N^V/В1-КОΡЯ, не вырабатывались определяемые с использованием этого анализа уровни антител против КОРЯ. Напротив, все животные, иммунизированные τΝ0ν/Β1КОРЯ/Р-СТ, были положительными в отношении присутствия антител против КОРЯ в этом анализе.
6.2.2.2. Защита против инфицирования Н7 с помощью иммунизации ^N^V-Η7ΗΑ/Ρ-ТΜСТ
ТМ и СТ домены НА Н7 дикого типа замещали ТМ и СТ доменами белка Р ΝΏν с образованием гибридного белка НА, ^ΗΑ^-ΝΟν^τ^^. При анализе Вестерн-блоттингом как с контрольным τΝΟν, экспрессирующим полную ОЯР НА Н7, ΓΝ0ν-Η7ΗΑ, так и с химерным τΝΟν, экспрессирующим гибрид Η7ΗΑес1ο-N^V/Ρ(ТΜ+СТ), ^N^V-Η7ΗΑес1ο-N^V/Ρ(ТΜ+СТ), обнаруживалась положительная реакция с антителом против Н7; однако сигнал от ^N^V-Η7ΗΑес1ο-N^V/Ρ(ТΜ+СТ) был заметно во много раз сильнее (фиг. 7). Когда цыплятам, иммунизированным один раз ^N^V-Η7ΗΑес1ο-N^V/Ρ(ТΜ+СТ), впоследствии ввели летальную дозу ΝΏν, 10 из 10 (100%) иммунизированных цыплят выжили.
6.3. Разработка химерного вируса псевдочумы птиц, представляющего чужеродный эпитоп
В следующем примере описывается получение химерных модифицированных ΝΏν. В частности, рекомбинантный ΝΏν получали для увеличения вирулентности ΝΏν, используемого в качестве основы, используемой в примере 6.2. В этом примере демонстрируется, что увеличенная вирулентность τΝΟν также увеличивала иммуногенность иммуногенной композиции, содержащей химерные вирусы, основанные на τΝΟν.
6.3.1. Материалы и методы
Если только не указано иное, все материалы и методы, описанные в этом разделе, идентичны материалам и методам, описанным и приведенным в качестве примера в примере 6.2, выше.
6.3.1.1. Создание τΝΟν с модифицированным сайтом расщепления в их белках Р
Рекомбинантные вирусы ΝΏν ^ЭУ/Р2аа и ^N^V/Ρ3аа, которые имеют две или три аминокислотных мутаций в сайте расщепления белка Р штамма Шк^пет В1 ΝΏν, создавали с помощью обратной генетики. Вкратце, для конструирования ^ЭУ/Р2аа ПЦР-фрагмент получали с использованием праймеров: прямого Ρ2аа-1(+)5'-ООΑТСССООТТООСОСССТССΑОО (8ЕО ΙΌ ΝΟ:24) и обратного Р2аа-1(-)5'ΑΑССССССιСТСТСТССβСССТССΑСΑТСТΑСТСΑСΑС-3' (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 25) и полноразмерного клона ΝΌν В1, плазмиды рТ7N^V/В1, в качестве матрицы. Следующий ПЦР-фрагмент получали с использованием праймеров: прямого Ρ2аа-2(+)5'-ООсООΑОΑСΑОаООСОССТТΑТΑООСССΑТТΑТТОО-3' (8 ЕС) Ш ΝΟ:26) и обратного Ρ2аа-2(-)5'-ССΑТΑТТСССΑССΑОСТАОΑТТОТ-3' (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ: 25) и рТ7N^У/В1 в качестве матрицы. Нуклеотиды, представленные прописными буквами, мутированы для модификации аминокислотной последовательности сайта расщепления белка Р от сайта штамма Νθν/Β1 (ООЯфОЯ^Ь) до ОЯЯфЯЯ^Ь. Эти два перекрывающихся ПЦР-фрагмента (перекрывание подчеркнуто в последовательностях праймеров) объединяли с помощью ПЦР с использованием праймеров Р2аа-1(+) и Р2аа-2(-). Получаемый в результате ПЦР-фрагмент, содержащий полный ген Р, клонировали в р8Ь1180 (Лшегейат Рйагташа Вю1ес11) и обозначили р8ЬР2аа. 8ΐиI-NοίI-фрагменτ (нуклеотиды 4646-4952) р8ЬР2аа вырезали для замены соответствующего фрагмента в плазмиде рТ7N^V/В1, что приводило к созданию плазмиды рТ7N^V/Ρ2аа, которую использовали для создания вируса ιΝϋν^αα с помощью обратной генетики. Для конструирования ^ЭУ/Р^щз ПЦР-мутагенез осуществляли с использованием той же стратегии, описанной выше, используя праймеры: прямой Р3аа-1(+)5'ООΑТСССООТТООСОСССТССΑОО-3' (8 ЕС) ΙΌ ΝΟ:28); обратный Р3аа-1(-)5'ААаСССССιСТСТСТССβСССТССЛСЛТСТЛСТСЛСЛС-3' (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 29); прямой Р3аа-2(+)5'ООсООΑОΑСΑОаООСОСίТТΑТΑООСОССΑТТΑТТОО-3' (8ЕС) Ш ΝΟ:30) и обратный Ρ3аа-2(-)5'-ССΑ ТΑТТСССΑССΑОСТАОΑТТОТ-3' (8Еф ΙΌ ΝΟ: 31) (мутированные нуклеотиды показаны прописными
- 53 016217 буквами) и ρΤ7ΝΏν/Β1 в качестве матрицы. Эти два перекрывающихся ПЦР-фрагмента (перекрывающийся район подчеркнут в последовательностях праймеров) объединяли с помощью ПЦР с использованием праймеров Е3аа-1(+) и Р3аа-2(-). что приводило к модификации сайта расщепления от ООКрОКГь до ΟΚΚρΚΚίΡ. 8ΐиI-NοΐI-фрагмент (нуклеотиды 4646-4952) р8ЬР3аа вырезали для замены соответствующего фрагмента в плазмиде ρΤ7ΝΏν/Β1, что приводило к созданию плазмиды ρΤ7Ν0ν/Ε3αα, которую использовали для создания вируса ιΝ0ν/Ρ3;·ι;·ι.
6.3.1.2. Создание способного к слиянию вектора τΝΏν, экспрессирующего химерный белок НА Н7
Для конструирования химерного гена НА Н7 в качестве дополнительной транскрипционной единицы генома ιΝ0ν/Ρ3;·ι;·ι фрагмент, содержащий трансмембранный домен (ТМ) и цитоплазматический хвост (СУТО) гена Ρ ΝΏν, первоначально получали с помощью ПЦР с использованием праймеров ΗρаN^VΡ(ΤМ+СΥΤО) Р, 5'-сё6ΤΤΑΑССΤСΑΤТАССТАТАТС6ΤΤΤΤ6ΑСТ-3' (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 32) и 8ίκΝНеМЛ'ЕПМ-(ΎΤΟ)\Ε 5'-сё6Α6СΤСΑΑ6СТА6СΤΤΑΤСΑСΑΤΤΤΤΤ6ΤΑ6Τ66СΤСТСАТСΤ6-3' (8Е0 Ш ΝΟ: 33) и плазмиды, содержащей ген Ρ ΝΏν, в качестве матрицы. ПЦР-продукт расщепляли с помощью 8аО и ΗραΙ и клонировали в плазмиду ρΝ1^-Ν0ν-0Ε/08, обладающую концом гена и сигналом начала гена ΝΏν, что привело к созданию плазмиды ρNйе-N^V-6Ε/68-N^VΡ(ΤМ+СΥΤΟ). На следующей стадии, делая возможным соединение фрагмента, содержащего эктодомен НА Н7, с фрагментом области ТМ и СΥΤΟ Ρ ΝΏν, эктодомен НА Н7 получали с помощью ПЦР с использованием праймеров 8ρеΗ7(ЕСТО)Р, 5'-сёΑСΤΑ6ΤСС6ССАССΑΤ6ΑАСАСТСАААТТСΤ66СΑΤΤСΑΤ-5' (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 34), НраН7 (ЕСТО)М, 5'-сё6ΤΤΑΑС6ΤСΤΤΤ6ТАТССАСТАСТСААТТТСАС-3' (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 35) и плазмиды, содержащей ген НА Н7 от Α/сЫскеη/NΥ/13142-5/94(Η7N2) в качестве матрицы. ПЦР-продукт расщепляли с помощью 8ρеI и ΗραΙ и затем встраивали в кассетную плазмиду ρΝ1κ-ΝΩν-6Ε/68ΝΩνΕ(ΤΜ+ί.ΎΤΟ). На конечной стадии кассетную плазмиду ρΝ1κ-Νθν-6Ε/68-ΝθνΕ(ΤΜ+ί.ΎΤΟ) расщепляли с помощью Ν1 е1 для вырезания химерного гена НА Н7. Этот фрагмент ДНК клонировали между генами Р и М ρΤ7Ν0ν/Ε3;·ι;·ι с образованием ρΤ7N^У/Ρ3аа-сЫте^^с7. Вирус ΓΝ0ν/Ε3αα, экспрессирующий химерный белок НА Н7, восстанавливали из ρΤ7N^V/Ρ3аа-сЫте^^сΗ7, используя способы, описанные выше.
6.3.1.3. Кинетики роста вирусов
Вирусы ΓΝΏν/Β1, ΓΝΩν/ΕΣαα, ΓΝ0ν/Ε3αα, ΓΝΏν/Β1-Η7 или ιΝ0ν/Ε3;·ι;·ι-0ιίιικι·ΚΗ7 (100 бляшкообразующих единиц/яйцо) инокулировали в куриные яйца с эмбрионами возрастом 10 дней. Аллантоидные жидкости собирали для определения титров вирусов в различные моменты времени (24, 48 и 72 ч). 50% инфекционную для культуры ткани дозу (ΤΟΙΩ50) каждого вируса, присутствующего в аллантоисной жидкости, определяли с помощью иммунофлуоресцентного анализа (ΙΡΑ). С этой целью 96-луночные планшеты, содержащие клетки Уего, инфицировали серийными 10-кратными разведениями образцов, и присутствие белков ΝΏν или химерного белка НА Н7 определяли с помощью ΙΡΑ.
6.3.2. Иммунофлуоресцентные анализы
6.3.2.1. Иммунофлуоресцентные анализы
Клетки МЭСК, инфицированные трансфектантом вирусом гриппа, фиксировали и нарушали проницаемость их клеточной мембраны с помощью охлажденного на льду метанола. Вирусные антигены определяли с помощью моноклонального антитела против ΗΝ ΝΏν (7В1), моноклонального антитела против НА вируса гриппа Н7 (209) и поликлональной сыворотки против НА вируса гриппа Н5. Для анализа роста ΝΏν и экспрессии вирусных белков конфлюэнтные клетки Уего инфицировали рекомбинантными вирусами и собирали в различные моменты времени (24, 48 и 72 ч). Инфицированные клетки фиксировали с помощью 2,5% формальдегида, содержащего 0,1% Τήΐοη Х-100. Фиксированные клетки обрабатывали поликлональным антителом против ΝΌν кролика или поликлональной сывороткой против ΑΙν Η7 кур, промывали и окрашивали антикуриными иммуноглобулинами (ΌΑΚΟ), конъюгированными с флуоресцинизотиоционатом (ΡΙΤΟ) на белок НА ΑΙν Η7, или антикроличьими иммуноглобулинами, конъюгированными с Τеxа8 Кеб (Мо1еси1аг |эгоЬе) на белки вируса ΝΌν. Экспрессию вирусных белков проверяли с помощью флуоресцентной микроскопии.
6.3.2.2. Среднее время смерти
Для проверки патогенности рекомбинантных вирусов для куриных яиц с эмбрионами определяли среднее время смерти (МЭЕ). Вкратце, куриные яйца с эмбрионами возрастом 10 дней инфицировали серийными 10-кратными разведениями вирусов. Яйца инкубировали при 37°С и проверяли дважды в день на протяжении 7 дней. Регистрировали время гибели эмбрионов. Определили, что наибольшее разведение, которое приводило к гибели всех эмбрионов, представляет собой минимальную летальную дозу. ΙΠΩΤ рассчитывали в виде среднего времени для того, чтобы минимальная летальная доза привела к гибели эмбрионов.
6.3.2.3. Иммунизация и проверка иммунитета цыплят
Белых цыплят ЬедЬот в возрасте 2 и 4 недели вакцинировали один раз или дважды путем закапывания в конъюнктивальный мешок 105,7-6,1 средних инфекционных для куриных эмбрионов доз (ЕШ50) ^N^У/Ρ3аа-сЫте^^сΗ7 или дважды 105,7-6,3 ЕШ50 родительского ΝΏν/Β1 (ρΝΏν), или дважды стерильной средой для культуры тканей (фикция). В возрасте 6 недель цыплятам вводили интраназально штамм
- 54 016217 высокой вирулентности Еоп!апа ΝΏν (ννΝΏν) (105,1 ЕГО50 на птицу) или Α/Ηитаη/§ΐее1е/59 (Η7Ν7)№ΑΙ (105,1 ЕГО50 на птицу). У оставшихся в живых птиц брали кровь, и их подвергали эвтаназии на 14 день после интраназального введения. Серологические титры ингибирования гемаглютинации (ΗΙ) определяли с использованием стандартных процедур.
6.3.3. Результаты
6.3.3.1. Создание способных к слиянию мутантов τΝΟν
Для увеличения способности к слиянию основы τΝΟν разработали два мутанта, вирусы ΓΝΩν/ΕΣπη и тКОУ/Е3аа, в которых сайт расщепления белка Е замен одним из двух вариантных содержащих множество основных аминокислот сайтов расщепления, которые можно активировать с помощью повсеместно экспрессируемых протеаз (например, протеаз фуринов) (фиг. 8А). Инфицирование клеток фибробластов куриных эмбрионов (СЕЕ) гЯОУ/Е2аа и гЯОУ/Е3аа, но не ΓΝΏν/β1, приводило к образованию соклетий в отсутствие экзогенно добавленной протеазы (фиг. 8В). Кроме того, 1НОУ/Е3аа индуцировал соклетия более быстро в клетках СЕЕ, чем тЫОУ/Е2аа. Поэтому был выдвинут постулат, что увеличенное распространение вируса в иммунизированных животных может увеличить иммуногенность против встроенного чужеродного белка. Таким образом, способный к слиянию тЫОУ/Е3аа был выбран в качестве вектораосновы для разработки двухвалентной вакцины, предназначенной для защиты домашней птицы от ΑΙν и ΝΏν.
6.3.3.2. Анализ с использованием среднего времени гибели векторов-основ τΝΟν в куриных яйцах с эмбрионами
ΝΏν можно разделить на классы вирусов высокой вирулентности, средней вирулентности или невирулентных вирусов на основе их патогенности для цыплят. Поскольку известно, что присутствие белка Е с содержащим множество основных аминокислот сайтом расщепления является фактором вирулентности ΝΏν, авторы по настоящему изобретению определили патогенность τΝΟν с модифицированным белком Е для куриных яиц с эмбрионами возрастом 10 дней. Среднее время гибели (МОТ) куриных эмбрионов, инфицированных ΝΏν, коррелирует с вирулентностью ш νί\Ό. Невирулентные штаммы (вызывающие бессимптомные инфекции у птиц) характеризуются МОТ, составляющим более 90 ч, штаммы средней вирулентности (вызывающие респираторное заболевание у птиц) имеют МОТ между 60 и 90 ч, и штаммы высокой вирулентности (вызывающие серьезное заболевание у птиц) имеют МОТ меньше 60 ч. МОТ гЯОУ/Е2аа было показателем невирулентного штамма, в то время как МОТ тЯОУ/Е3аа было типичным для штамма средней вирулентности. Ни один из этих штаммов не имел МОТ, типичного для штамма высокой патогенности (табл. 3) .
Таблица 3. МОТ τΝΟν в куриных яйцах с эмбрионами
Вирус Потребность в трипсине (культура клеток) ИнокуляцияЕЮзо ΜΌΤ, ч
ΓΝϋν/ΒΙ Да 10 113
1 122
гЦОТ/Г2аа Нет 10 100
1 104
гНОУ/ЕЗаа Нет 10 80
1 84
τΝϋν/Β1-Η7 Да 10 Живые
1 Живые
гЦЦУ/Заа- сЬ1тег1сН7 Нет 10 128
1 140
На основе этих данных вектор гЦОУ/Е3аа должен представлять опасность для птиц и, следовательно, он подходит в качестве основы для разработки двухвалентной вакцины для защиты домашней птицы от ΑΙν и ΝΟν.
6.3.3.3. Создание способного к слиянию вектора τΝΟν, экспрессирующего эктодомен белка НА ΑΙν
Ген, кодирующий белок НА Н7 из ΑΑΙιχΙ^π/ΝΥ/Π 142-5/94(Η7Ν2), встраивали в вектор гЯОУ/Е3аа, как описано выше, что привело к получению гНОУ/Е3аа-с1итепсН7 (фиг. 9А). Кинетику роста гКОУ/Е3аа-сй1тег1сН7 в куриных яйцах с эмбрионами сравнивали с кинетикой роста родительского гЯОУ/Е3аа (фиг. 9В). Вирус, экспрессирующий химерный белок НА Н7, рос медленнее, чем вирус без вставки, и его максимальные титры были приблизительно 1од ниже. Интересно, что МОТ этого вируса было МВТ невирулентного штамма (128-140 ч) (табл. 3) . Экспрессию химерного белка НА Н7 из тКОУ/Е3аа-сЫтепсН7 подтверждали с помощью Вестерн-блоттинга инфицированных клеток Уего через 36 ч после инфицирования (фиг. 9С).
- 55 016217
6.3.3.4. Увеличенное встраивание белка НА Ату Η7 в вирионы γΝΩΥ
Для определения того, сопровождается ли экспрессия химерного белка НА Н7, содержащего гетерологичные трансмембранный и цитоплазматический хвостовой районы белка Р ΝΏν, увеличенным встраиванием в вирионы τΝΏν, вирионы гНЭУ/В1-Н7 и ^N^V/Р3аа-сй^те^^сΗ7 очищали, как описано в разделе 6.3. Количество белка НА Н7 или вирусного белка ΝΏν из τΝΏν/Β1-Η7 или 1ПОУ/Г3аасЫтепсЮ определяли с помощью Вестерн-блоттинга с использованием поликлонального антитела против А1У Η7 курицы или поликлональной сыворотки против ΝΏν кролика. Как и ожидалось, встраивание химерного белка НА Н7 в вирионы τΝΏν было значительно увеличено по сравнению с встраиванием белка НА Н7 дикого типа (фиг. 9Ώ). Эти данные говорят о том, что трансмембранный и цитоплазматический хвостовой районы белка Р ΝΏν играют основную роль в увеличении встраивания чужеродного белка на поверхность вируса.
6.3.3.5. Иммунизация и проверка иммунитета цыплят
После одной или двух вакцинаций ^N^V/Р3аа-сЫте^^сΗ7 50-80% цыплят имели титры ингибирования гемаглютинации (ΗΙ), вызываемой А1У Η7, и 90-100% цыплят имели титры ΗΙ, вызываемой ΝΏν (таблица 4А и В). Хотя все цыплята, иммунизированные дважды родительским ΝΏν/Β1 (ρΝΏν), имели титры ΗΙ, вызываемой ΝΏν, ни один из них не имел титра для АГУ Η7. Все птицы, инфицированные стерильной средой для культуры тканей (фикция), не имели ΗΙ-титров для любого из двух вирусов. При заражении ννΝΏν были защищены 100% цыплят, подвернутых иммунизации ^N^V/Р3аа-сЫте^^сΗ7 и ρΝΏν. При сравнении 90% цыплят, вакцинированных ^N^V/Р3аа-сЫте^^сΗ7, были защищены от вируса ΗРΑI Η7, но ни один из цыплят, вакцинированных ρΝΏν, не был защищен от вируса №А1 Η7. Напротив, 100 и 70% фиктивно иммунизированных птиц умерли при заражении вирусом ννΝΏν и №А1 Η7, соответственно. У оставшихся в живых птиц возникал очевидный амнестический ответ в виде четырехкратного или большего возрастания ΗΙ-титра для соответствующего используемого для заражения вируса, за исключением трех оставшихся в живых фиктивно иммунизированных птиц в группе заражения вирусом ΗРΑI Η7, у которых не обнаруживалось серологическое доказательно инфицирования.
Таблица 4А. ΗΙ-серология цыплят, иммунизированных химерными вирусами, до заражения
Группа вакцинации* Άΐν/Η7 антиген Νϋν антиген
гЫОУ/ГЗаа-сМтег1сН7, IX 8/10 (11) 10/10 (49)
гЫОУ/ГЗаа-сЫтег1сН7, IX 7/10 (10) 10/10 (49)
гНОУ/ЕЗаа-сН1тегд.сН7, 2Х 8/10 (13) 9/10 (56)
гИОУ/ГЗаа-сЫтега-сН?, 2Х 5/10 (9) 9/10 (60)
ρΝΟΥ, 2Х 0/10 10/10 (34)
ρΝ07, 2Х 0/10 10/10 (56)
Фикция, 2Х 0/10 0/10
Фикция, 2Х 0/10 0/10
Таблица 4В. ΗΙ-серология цыплят, иммунизированных химерными вирусами, после заражения (14 дней после заражения)
Группа вакцинации* Исполь зуемый для заражения вирус Число оставшихся в живых Αΐν/Η7 антиген Νϋν антиген
гИОУ/ЕЗаасЫтег!сН7, IX νΝΏΫ 10/10 9/10 (15) 10/10 (416)
гЫБУ/ГЗаа- сЫшег1сН7, IX ΗΡΆϊν 9/10 9/9 (2,048) 9/9 (37)
- 56 016217
гЫОУ/ГЗаа- сЫтег1сН7, 2Х νΝϋν 10/10 7/10 (17) 10/10 (315)
гНОУ/ЕЗаасЫтег1сН7, 2Х ΗΡΆϊν 9/10 8/8 (955) 8/8 (30)
рНОУ, 2Х νΝϋν 10/10 0/10 10/10 (294)
рМОУ, 2Х ΗΡΑϊν 0/10 ΝΑ ΝΑ
Фикция, 2Х νΝΟν 0/10 ΝΑ ΝΑ
Фикция, 2Х ΗΡΑϊν 3/10 0/3 0/3
Фикция = стерильная жидкость для культуры тканей №Αΐν = вирус Л/11итаη/διее1е/59 (Η7Ν7)
ΗΙ-серология представлена в виде числа цыплят с ΗΙ-положительной сывороткой/число вакцинированных цыплят; числа в скобках представляют среднее геометрическое титра *п=10 птиц на группу; 1Х=одна вакцинация, 2Х=2 вакцинации
Публикация, озаглавленная Епщпеегеб νίη1 Уассте Сопйгисй \νί(1ι Эна1 δрес^Γ^с^(у: Αν^аπ ИтПиепха апб ЫеетсакИе О^еаке, МапХеопд Рагк е1 а1. , РNΑδ 103: 8203-8203 (2006), полностью включена в данное описание в качестве ссылки.
6.4. Эквиваленты
Объем по настоящему изобретению не ограничивается описанными конкретными вариантами осуществления, которые предназначены в качестве отдельных иллюстраций индивидуальных аспектов по настоящему изобретению, и функционально эквивалентные способы и соединения находятся в пределах объема настоящего изобретения. Действительно, различные модификации настоящего изобретения, помимо тех, которые в данном описании показаны и описаны, будут очевидны квалифицированным в данной области специалистам из вышеприведенного описания и сопровождающих фигур. Имеется в виду, что такие модификации находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.
По всей настоящей заявке приводятся ссылки на различные публикации. Их содержание таким образом полностью включается в настоящую заявку для всех целей.

Claims (4)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1 5 <210> 17 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> дополнительно измененная консенсусная
ДНК-последовательность, основанная на невирулентных птичьих штаммах вируса гриппа А Н5, в области, находящейся непосредственно перед сайтом расщепления НА <400> 17 ссСсадсддд адасдсдддд а 21 <210> 18 <211> 10 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> последовательность «конца гена», сконструированная в генах, которые встроены в ΝΟν в виде дополнительных транскрипционных единиц <400> 16
11Ёадаааааа 10 <210> 19 <211> 10 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 74 016217 <223> последовательность «начала гена», сконструированная в генах, которые встроены в Μ ВУ в виде дополнительных транскрипционных единиц <400 19 асдддЬадаа <210> 20 <211> 74 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦ₽-праймер, используемый для получения эктодомена (ЕСТО) гена НА Н5 <400> 20 сддсЬадс’Ь'Ь адаааааала сдд^адаадС дааасГад^с сдссассагд дааадааСад 60
ГдаЛСдссЛГ. Гдса 74 <210> 21 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер, используемый для получения эктодомена (ЕСТО) гена НА Н5 <400 21 сддОЬаассЬ даЬаадсссс саОдаОО ааС <210 22 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер, используемый для амплификации
ТМ и СТ гена Е ΜΟΥ <400 22 сддСЛаассС саелассгал агсдлсллда се 32 <210 23 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <22 3> ПЦР-праймер, используемый для амплификации
ТМ и СТ гена Г НВТ <400 23 сддадсВсаа дсОадсВВаВ сасаШйд ЬадЪддсЮ саВсЬд <210> 24 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> прямой праймер Е2аа-1(+), используемый для создания гМ0У/Р2аа
- 75 016217 <400> 24 ддаРсссддб РддсдсссЬс садд 24 <210> 25 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> обратный праймер Е2аа-1(-), используемый для создания гйОУ/Р2аа <400> 25 ааддсдссРс ^дрсбссдсс сРссадаРдР адРсасад 38 <210> 26 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> прямой праймер Г2аа-2( + ), используемый для создания гЫ07/Е2аа <400> 26 ддсддадаса даддсдссЬЬ а^аддсдсса ЬТаКТдд 37 <210> 27 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> обратный праймер Р2аа-2(+), используемый для создания гИОУ/Е2аа <400> 27 ссаРаЕЕссс ассадсСада 24 <210> 28 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> прямой праймер ГЗаа-1(+), используемый для создания гЫОУ/ЕЗаа <400> 28 ддаСсссддР ЕддсдсссЁс садд 24 <210> 29 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> обратный праймер ЕЗаа-1(+), используемый для создания гЫ07/РЗаа
- 76 016217 <400> 29 ааадсдссЬс ЬдСсЬссдсс с^ссадаЬдД адОсасад 38 <210> 30 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> прямой праймер ЕЗаа-2(+), используемый для создания ΓΝϋν/ГЗаа <400 30 ддсддадаса даддсдсЬЬО аЪаддсдсса Ъ1:а1:£дд 37 <210> 31 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> обратный праймер ГЗаа-2(+), используемый для создания гМОУ/ЕЗаа <400> 31 ссабабРссс ассадсбада Обдб 24 <210 32 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> праймер НраЫОУ Г(ТМ+СУТО)Р, используемый для создания химерного гена Η7ΗΆ <400 32 сддЬЬаассб саЬрасс^аР аЬсдббббда сО 32 <210> 33 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер $асЫЬеМОУ Г(ТМ+СУТО)М, используемый для создания химерного гена Н7НА <400 33 сддадс^саа дсеадсъ^аЪ сасаеьь^'Ьд СадЪддсСсй саИсьд 46 <210> 34 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер 5реН7(ЕСТО)₽, используемый для создания химерного гена Н7НА <400> 34 сдасСадГсс дссассагда асасСсаааО ОсОддсаббс аб 42 <210> 35
- 77 016217 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> праймер НраН7(ЕСТО)М, используемый для создания химерного гена Н7НА <400 35 сдд£Даасд£ с^ЪЪдЪаЪсс асСасЛсааЛ СЛсас 35 <210 36 <211> 52 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> частичная последовательность Н7НА с ' последовательностями 6Е/С5 и Козак <400 36 дс^адс^Иад ааааааСасд ддСадаасас Ъад£ссдсса ссаИддИсад οί 52
1 5 <210> 16 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Консенсусная последовательность, основанная на невирулентных птичьих штаммах вируса гриппа А Н5, в области, находящейся непосредственно перед сайтом расщепления НА <400> 16
Рго 01п Агд 61и Тйг Агд С1у
1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Консенсусная последовательность, основанная на невирулентных птичьих штаммах вируса гриппа А Н5, в области, находящейся непосредственно перед сайтом расщепления НА <400> 14
Рго 61п Агд 61и Агд Агд Агд Ьуз Ьуз Агд 61у
15 10 <210> 15 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 73 016217 <220>
<223> измененная консенсусная последовательность, основанная на невирулентных птичьих штаммах вируса гриппа А Н5, в области, находящейся непосредственно перед сайтом расщепления НА <400> 15 ссО саа ада дад асд ада дда 21
Рго С1п Агд С1а ТЬг Агд С1у
1 5 <210> 13 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Консенсусная последовательность, основанная на мевирулентных птичьих штаммах вируса гриппа А Н5, в области, находящейся непосредственно перед сайтом расщепления НА <400> 13 ссЪ саа ада дад ада ада ада ааа аад ада дда
Рго С1п Агд С1и. Агд Агд Агд Ьуз Ьуз Агд <31у
1: Очищенные вирионы ΓΝ0ν-Η7
1: гМ)У
1. Химерный вирус птичьего гриппа, содержащий:
(a) упакованный сегмент ΝΑ вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой (ΝΑ) белок, в котором открытая рамка считывания ΝΑ модифицирована так, что кодирующие эктодомен ΝΑ нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена, обладающего нейраминидазной активностью, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется Ν-концом, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа;
(b) упакованный сегмент НА вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка считывания ΝΑ модифицирована так, что кодирующие эктодомен ΝΑ нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен НА антигена вируса болезни Ньюкасла (ΝΏν), так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа;
(c) упакованный сегмент НА вируса гриппа, кодирующий слитый с гемаглютинином белок, в котором открытая рамка считывания НА модифицирована так, что кодирующие эктодомен НА нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен способного к слиянию/связывающегося с рецептором антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется С-концом, так что слитый с гемаглютинином белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа;
(б) упакованный бицистронный сегмент НА вируса гриппа, содержащий:
ί) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок гемаглютинин вируса птичьего гриппа, и ίί) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с гемаглютинином белок, в которой кодирующие эктодомен гемаглютинина нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен протективного антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется с помощью С-конца, так что и гемаглютинин вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и встраиваются в химерный вирус птичьего гриппа; или (е) упакованный бицистронный сегмент ΝΑ вируса гриппа, содержащий:
ί) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок нейраминидазу вируса птичьего гриппа, и ίί) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с нейраминидазой белок, в которой
- 57 016217 кодирующие эктодомен нейраминидазы нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен протективного антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется Νконцом, так что и нейраминидаза вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и встраиваются в химерный вирус птичьего гриппа.
2 акдадСсСЛс ааадссдада дсЬс^саСдд ддаСЛЛдРаб садааЬдссс аадаадсСда ассддкдсао даад^ддсбб ъс^сасадас
ЛаассдаддЛ Ьсдсасадаа адСддсГааа СсасдсЬсас кааакддааа ааададаааС ИЪдссадЪЬд ЬЪддссЬадЬ адабддсаас сдааасдкас асссдаадак дасаадаоса едбдсссадб 1ддада1рс;са ааса^Лссак саГдддИскс дбдбдссасТ: ба^сассаас дкСсбсбсба дксЬкбдсад аЬссИд^сас дадсдаддас аа^аакабдд ддддс^аадд а^аСасааса ЬдСдадсада ссасбаа^са
ЛсаксссдСс дааадаасас сЬсСдасПаа сдсадсдбад аЬадддсадИ аддЬсдсасС ддаЬдддаас ЬЛдсадаЬЬс дасаЬдадаа аддсссссЬс сдаЬсЬсдад аддда£Ь££д асдсбгХдИс каадсЪака!: садсбаскса ддСдасЬасд асадсабсдд садааСдд^д
120
180
240
300
360
420
480
540
- 63 016217 сбддссадса даадссабдд асбсаЪссСа садааасдаа СаТсаСОддд ЕСаРсдСсдс Сагдадддаа ед£саасаРа сЪасадсЬаа адаЪсдсЪаа ас7.с1адЪдс
Сдддадбдса абсбедсасЕ сР^аааСасд дадОассддс даабЕддадЬ ддсЬаЬддад Всаддсбадд ЬддрсЬдада даОдсадсда 1даСа(:6д1д дССбдаааад аддаасадса аа садарддсдд садабддбдс да1ааРсГЬс бОсаадОда!: дабЬс^Сдаб адддссбдсЬ дадОдсбдЬд дабсаадбда аддсаардад Пдаааай! ссГадОд^-Сд сдВсРбРРсЬ асддсадддд дабдЫдасд дсаддсадсд дасааЫддд дсаддсс^ас (Хдссдсааа РсаааОдсаР ГассЬдадОс а-ЬддЬса-ЫХ
600
660
720
780
840
900
960
982 <210>
<211>
<212>
<213>
1485
ДНК
Вирус гриппа А <220>
<223>
Вирус гриппа Α (Α/νίεί Ыаш/1203/2004(Η5Ν1)) ген белка нуклеокапсида (ΝΡ) <400>
а^ддсдСсЪс ааЪдсХасбд аГасада'ЬдЪ аНаасаа^ад даасасссса дасдддаааЬ сдСсаадсда ОссааОсбаа ссааддаидЪ дсадсадбаа а^саасдасс адаабдСдса саадЕдсдад сддСсЬдсас СасддасдСд а!адабссСС аабссадсас сббададСсЕ ададдддСЕс сСдадаадса дсаЬсЬдсад дааададсда аддасбдааа сддддадбсР абдаабааЪд ааддсассаа адаесадддс дсасадаасс ададааЪддЪ дбдсдддааа дддЬдадада асаа1:ддада аНдаЬдссас де1:с£ссдаЪ адддддЬадд ддаа^ССсОд асаСссбсаа ададсадааа ЬсаСссВдад сад^ддссад ЪссдссрдсС абаададбса саадС^ссаС аааСГдсССс даЬаИ1.дддс дасада'Ьсад ссаИаЬддс ЬсаОаадааС РсдадсбсРс ааддаЪсЫза асда^сЬЪаЪ абсСд^Сдда сааасрсадр асдс-ЬсСдса ддасссдаад дсСааЪИсГд ддасдсаасЬ абаЬсадада дсаадддГса дасаайддбд дададдсдаа адддаааГ1:с ЪссСдддаан аддаСсадСд бдда^абдас Ссаааасадс абГад^дЬдд сададддаса ааабдадаас РаЬаадаасс сдССсадссс адса'ЬЪ'Ьаса даб.ддааадб. ддасдаааад ЫСсКбсдда даасадаСдд адааРддРСа дасРаЬдаад ьсЪдабдааа аадасСддад Сасдасааад дсбддЬсОЬа асдададсЬс асбсЛсссда а!ддадс1да ааОддаадаа сааасадсад дсСдаааССд дсссаСаадб сдбдададад саддбсСОСа аЕддсабдсс ададСддСсс а^ддаддсаа адаадсддад асСРСсСсдд ддааа^асВд дссадассад дсаасдаасс дасаабдсад ааас'Ьдд'Ьдд дСддсаСЬдд ддаддегдас дааддаасад дСссааСССа аддадаЪсад сссассбдаС ЬсдЬдсд'Ьас ддада£с1дд С1сдда1даО даасааддаб сасааададс аадаЕсссаб сссдсегдсс ааддд£асЬс дГсСсаОСад асСсСдсадс саададдаса бддасСссаа дааасассаа Сссададааа адддсадаас аадаЪдбдЬс сдабсдбдсс аддад ддаасдссад даддГХсбас ссадаасадс а-Ьассбддаа ьсддаддада даддаб.Сгдд дабаЬддса! СддааЬддас адсЪдссдд^ аааасдаддд ЪдсаСа'Ьдад аа^дабддаг гсессбддса ЬдсСВдОдСд ВсбддСбдда ассааа1дад аС£1;даддас дсбабссасс сасСсбОдаа ссадсададд ссЬСсссЬСс дбсГдасаГд а'Ьдссадддд ЪбссШдас
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1000
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1485 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
1707
ДНК
Вирус гриппа А
Вирус гриппа Α (Α/νΐε6 Ыат/1203/2004(Η5Ν1)) ген гемаглютинина (НА) <400>
аСддадаааа а^ддС^асс асбдббасас дабддадСда ссаабдСдбд ссадЕсааСд б'Ьдадсадаа саСдаадссС
ВадСдсЪ-есс а!.дсааасаа а^дсссаада адссСсСааЕ асдааССсаЬ ассбсгдЪба Сааасса^СВ саСЕаддддЕ
СЬССдсааеа сСсдасадад са^асбддаа гъсдададаг. сааВдСдссд сссаддддаС бдадааааН дадсСсадса дСсадРсСОд садд'ЬГдаса аадааасаса ^дСадсдеад даабддРсСР ЕСсааЪдасЪ садаОсаСсс рдЕссаСасс
СГаааадСда саа^аандда асдддаадсС сСддарддсе асаСадГдда аВдаадааСС ссаааадббс адддааадсе
ОсадаССкдс ааадаасдМ: сЬдсдаКсба ссбсддааас дааддссааС дааасассСа
С1;ддОссад(: сСссСЕСидс
120
180
240
300
360
420
480
- 64 016217 адаааЬдбдд аа1:аа^асса дсададсада сбааассада аддабддадс ддаааЫХса абдаааадЦд а6.ааасЪсЦа 1:а£д1гдаааГ адаадаадаа садддааЪдд дс^дсадаса а^саЪЪдапа аддадаа1:ад аа^дсЪдаас д'Ьсаадаасс аасддЪ^д^С ддаасдЪа^д ддадГаааа'С. адМзессЬад Ьсд^^асаа!:
саасааЪааа ЪЪсассаЦсс СШссдД Ьдд аад^ааасдд саа^саасСЁ адааадддда дбсааасЪсс ссаЪЪдддда дааа^адссс д^ГЁЁаГада аСдадсаддд ЬсассааЪаа дддаа^ЪЪаа 1сс£адаДд£ ЪадасЧЪса аЪааЪдсааа дЪаЪддааад Ъааааадада сааЪЪЪаЪЪс ЬаЪддаЪдЪд
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
12 60
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1707 <210 <211>
<212>
<213>
5 ·
1350
ДНК
Вирус гриппа А <220>
<223>
Вирус гриппа А (А/УхеЬ Мат/1203/2004(Η5Ν1)) ген нейраминидазы (ΝΑ) <400>
5 а1:дааЬссаа адс££аа£д1: дддаа^саас дс^ИсадСаа ад^ааддаса Ъ6саЪс£са£ аабдасаадс Ёд’ЬссЬд^дд дсаад£дс££ ддддсгд^дд аасааса^ас д£аа£дас£д дддааадСдд Ъдб^аСсеба сддссаГддд дЪ’СГ^сддад аасддддса£ адаассэааа ас1:дааасдд ддагагадсд Ъдб^сСддд адсадса^а^ дссдадъьдс а£садаада£ £асааа1:12дд ассаа1:сЪда аа£±адсддд асадГаЬаад дсЪсссас^С. асЪссааНдд дЬдаддсЪсс дссаЪдаЪдд сЬд^а^Ъдаа Гдадаас^са асддассаад СЪаааНсадИ аЪдссддада Са^сЬТГсаа асаа1:ссасд аЬдддд^ааа дсасДаа££с асадЪадс6.Ъ ддадЪЪБбдЪ ^дадИИдаС сЬЪЪЪ-ЬдЪдд са1:0сассаб аа^аасса^с даасаЬда^с ассаа^садс саа££саСс£ да^сддСХсс ддааНдсада дасСдСсааа еЪссссаиа^ сассадЪЪдд аъасаа^ддс адад£с1:даа £аа£дд!:сад сдаа£С.дда11 ааЪсасаЪдЪ бсааааЬЬЬд ссссаа£да12 адддЬСЛСса саддадсддс Цсадбдааа ссадсабсса сададддсдд ЁдИаааЪад!: ^дасаадСад дда'Ьсаа'Ьс^ £сааЪа1ддд аа^ас^аа·!:!: сЁ'СЛдсссса ааддддда^д асИНЁс^иь дасадаадсс аасЪсааддб Ъ£дасда£Ъд а1:аа1:аасад ЬдС.дсаЪд'Ьд дсаДсасаЪа дс^ссГааГИ дбдбдсаддд дад^аЪсааа ддаасадд1:а ЁСЬааа^асд С^ЪдаааНда саада1а1сд даас^дасад сссааадада дасас^дбдд д'ЬаЪдд'Ьаас £сад£саЁ£с ДИсДЪасДда ЬЪаасддаСд Ъд^ГЁд^ГаИ ИдасСсаддд сЬсасадаас ЪЪдадЪсДдЪ даа1Л1:сЪдд асас£а£саа ЬаааЪддсЪс адаЪсЪЪсаа аДсас^аЪда аЪааСЪддса баддаЬаЪаб дЪЪдЪддЪсс дсаа£дд£д£ ЪГЛдддаЪсс ЪадсааЪаас дасЪадаббд дсасааГЫд дМ:ддЦсЪ1:д
Еддаа^ад'Ы: ааСЬсасаса дааадс^дЪд ддсСдСа^ас аадададссд адссЪ£дс1:д а^Иаабдад!: бдсСЬддЪса сссадасааС дадЪ^ддадд 1£дсееЪас£ аа^ддааааа ддааСдс±сс £ддсЪсааа1: а^дсадЬдда дд^дСссЬсС сИддаСсддд аааЪддд1:дд бда^ьддЪса са^аадассО дасИадИддд дссадасддЪ
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1350 <210>
<211>
<212>
<213>
2151
ДНК
Вирус гриппа А <220>
<223> Вирус гриппа Α (Ά/νίεΐ. Мат/1203/2004 (Η5Ν1) )
- 65 016217 ген полимеразного белка РА <400> 6 аОддаадасЕ СОдЕдсдаса аЕдсЕЕсааО ссааЕдаЕЕд ЕсдадсЕЕдс ддааааддса60 аЕдааадааЕ абддддаада ОссдааааЕс дааасдааса адОЕЕдсЕдс ааЕабдсаса120 сасЕЕддадд ЕсЕдЕЕЕсаЕ дОаЕЕсддаЕ ОЕЕсасЕОЕа ЕЕдаОдаасд дадЕдааЕса180 абааЕЕдбад аабсЕддада ОссдааЕдса ОЕаЕЕдааас ассдаОЕЕда ааЬаабрдаа240 ддаададасс даасдабддс сОддасЕдбд дЕдаабадЕа ЕсОдсаасас сасаддадОЕ300 дадааассЕа ааЕЕЕсЕссс адаЕЕЕдЕаЕ дасЕасааад адаассдаЕЕ саЕсдаааЕЕ360 ддадЕдасас ддадддаадЕ ЕсабасаЕас ЕаЕсЕддада аадссаасаа даЕааааЕсс420 даддадасас аЕаЕЕсасаЕ аЕЕсЕсаЕЕс асаддддадд аааЕддссас сааадсддас480
ЕасасссЕЕд аСдаададад садддсаада аЕЕаааасса ддсЕдЕЕсас саЕааддсад540 даааЕддсса дЕаддддЕсЕ аЕдддаЕЕсс ЕЕЕсдЕсааЕ ссдадададд сдаададаса600 аЕЕдаадааа ааЕЕЕдаааЕ сасЕддаасс аЕдсдсадас ЕЕдсадасса аадЕсЕссса660 ссдаасЕЕсЕ ссадссЕЕда ааасЕЕЕада дссЕаЕдЕдд аЕддаЕЕсда ассдаасддс720
ЕдсаЕЕдадд дсаадсЕЕЕс ЕсаааЕдЕса ааадаадЕда аЕдсЕадааЕ ЕдадссаЕЕЕ780
Есдаадасаа сдссасдссс ЕсЕсадасЕа ссЕдаЕдддс сЕссЕЕдсЕс ЕсадсддЕсд640 аадЕЕсЕЕдс ЕдаЕддаЕдс ссЕЕаааЕЕа адсаЕсдаад асссдадЕса Едадддддад900 дддаЕассас ЕаЕаодаЕдс ааЕсаааЕдс аЕдаадасаЕ ЕЕЕЕсддсЕд дааададссс960 аасаЕсдЕда аассасаЕда ааааддЕаЕа аассссааЕЕ ассЕссЕддс ЕЕддаадсаа1020 дЕдсЕддсад аасЕссаада ЕаЕЕдааааЕ даддадаааа Есссааааас ааадаасаЕд1080 ааааааасаа дссадЕЕдаа дЕдддсасЕс ддЕдадааса Еддсассада дааадЪадас1140
ЕЕЕдаддасЕ дсааадаЕдЕ ЕадсдаЕсЕа адасадЕаЕд асадЕдаЕда ассададЕсЕ1200 адаЕсасЕад саадсЕддаЕ ЕсададЕдаа ЕЕсаасаадд саЕдЕдааЕЕ дасадаЕЕсд1260 аЕЕЕддаЕЕд аасЕсдаЕда ааЕаддадаа дасдЕадсЕс сааЕЕдадса саЕЕдсаадЕ1320 аЕдадаадда асЕаЕЕЕЕас адсддаадЕа ЕсссаЕЕдса дддссасЕда аЕасаЕааЕд1380 аадддадЕдЕ асаЕааасас адсссЕдЕЕд ааЕдсаЕссЕ дЕдсадссаЕ ддаЕдасЕЕЕ1440 саасЕдаЕЕс сааЕдаЕаад саааЕдсада ассааадаад даадасддаа аасбааЕсОд1500
ЕаЕддаЕЕса ЕЕаЕаааадд дадаЕсссас ЕЕдаддааЕд аЕассдаЕдб ддЕаааЕЕЕЕ1560 дЕдадЕаЕдд ааЕЕсЕсЕсЕ ЕасЕдаЕссд аддсЕддадс сасасаадЕд ддаааадЕас1620
ЕдЕдЕссЕсд адаЕаддада саЕдсЕссЕс сддасЕдсад ЕаддссаадЕ ЕЕсдаддссс1680 абдЕЕссЕдЕ аЕдЕаадаас сааЕддаасс ЕссаадаЕса аааЕдаааЕд дддсаЕддаа1740 аЕдаддсдаЕ дссЕЕсЕЕса аЕсссЕЕсаа саааЕЕдааа дсаЕдаЕЕда адссдадЕсЕ1800
ЕсЕдЕсааад адааддасаЕ дассааадаа ЕЕсЕЕЕдааа асаааЕсада аасаЕддссд1860 аЕЕддададЕ сссссааддд адСддаддаа ддсЕссаЕсд даааддбдбд садаассЕЕд1920 сбддсдаадб сбдЕдЕЕсаа садЕЕЕаЕаЕ дсаЕсЕссас аасЕсдаддд дЕЕЕЕсадсб1980 дааЕсаадаа ааЕЕдсЕЕсЕ саЕЕдсЕсад дсасЕЕаддд асаассЕдда ассЕдддасс2040
СОедаОс16д дадддсЕаЕа ЕдаадсааЕЕ даддадЪдсс ЕдаЕЕаасда ЕсссЕдддЕЕ2100
ЕЕдсЕЕааЕд сдЕсЕЕддЕЕ саасЕссЕЕс сЕсдсасаЕд сасЕдаааба д2151 <210> 7 <211> 2274 <212> ДНК <213> Вирус гриппа А <220> .
<223> Вирус гриппа А (А/УДеЕ Иат/1203/2004(Η5Ν1) ) ген полимеразного белка ₽В1 <400> 7 аОддаЕдЕса ассЕЕсссЕЕ дасасадЕса асЕддадсас дддЕасдсас дддаЕсЕЕЕд ааасЕдассс асЕдсЕЕЕдд ддасддсЕаа аЕаасаасас асасааадаа дсасЕдасас аЕссдасЕЕЕ аЕасЕддада асадаасаса сссаасЕсаа ааасадаЕЕд аааасЕсдЕд ааддЕсдсса ссаасасЕаЕ ЕадаЕЕЕссЕ аЕЕЕссадад сааЕадддаа ЕдаасасааЕ асЕЕЕЕсЕЕд сссЕссаЕас ссааЕаЕЕса сссдаЕЕдаЕ ЕдЕаЕЕддаа ЕсЕЕдааасд дассЕаЕдас адаааЕсЕЕс сааддаЕдЕд ааададаадд даааааасаа дасаааадаЕ ааадЪассад адссаЕддаа даааадддда ддассасЕас дсааЕддсЕЕ аЕддаааЕЕд ЕддасаЕЕда адаЕсдаасд аЕддадЕсаа дбдадддаса аддсЕдааса дсадааадад
ЕдсааааЕдс садддасадд адЕддасаас сЕдаддаЕаа ЕссЕЕдаада ЕЕсаасааас аЕадааасса дЕсЕаасадс ЕддаЕаадда асаЕдассаа аааададсба дсаааЕЕдаа
ЕаЕаадЕасс аЕасассаЕд ааасасадад ЕдадсссадЕ аЕсссассса аададЕддаЕ ассддсЕдса сааЕдааЕсд адаааЕддад дааааЕддЕс ссЕдабаада даддсдадсд
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
- 66 016217 аЕЕдсаасас ссддааЕдса ааЕсададда ЕЕсдЕдЕасЕ ЕЕдЕЕдааас асЕадсдадд180 адЕаЕсЕдЕд адааасЕЕда дсааЕсЕдда сЕсссадЕсд дадддааЕда даадааддсЕВ 40 аааЕЕддсаа асдЕсдЕдад даадаЕдаЕд асЕаасЕсас аадаЕасСда асЕсЕссЕЕЕ900 асааЕЕасЕд дадасааЕас саааЕддааЕ дадааЕсада аЕссЕаддаЕ дЕЕЕсЕддса960 аЕдаУаасдЕ асаУсасаад даассадсса дааЕддУУУс ддааЕдЕсЕЕ аадсаЕадсЕ1020 ссЕаУааУдУ ЕсЕсааасаа ааУддсдада сЕаддаааад даЕасаРдУУ сдааадУаад1000 адсаЕдаадУ Еасдаасаса ааУассадса даааЕдсЕЕд сааасаУУда ЕсЕУаааУас1140
ЕУсааЕдааЕ Еаасдааааа дааааЕУдад ааааЕааддс сУсЕаУУааУ адаУддУаса1200 дссУсаУУда дсссУддааЕ даЕдаЕдддс аЕдУУсааса УдсЕдадУас адУссУадда1260 дЕЕУсааУсс УдааУсУУдд асадаааадд Уасассаааа ссасаЕаЕЕд дЕдддасдда1320 сЕссааУссЕ сЕдаЕдаЕЕУ сдсЕсУсаЕс дУаааУдсас сдааЕсаУда дддааЕасаа1380 дсаддадУдд аЕаддУУУУа ЕаддасУУдУ ааасЕадЕЕд дааУсааУаЕ дадсаадаад144 0 аадУсЕУаса УаааУсддас адддасаУЕУ дааЕУсасда дсУУУЕЕсУа ссдсЕаЕдда1500
ЕЕЕдУадсса аУУУсадУаЕ ддадсУдссс адЕЕУУддад ЕдЕсЕддааУ УааЕдааЕсд1560 дссдасагда дсаУЕддЕдУ УасадЕдаЕа ааааасааЕа ЕдаЕааасаа сдассУУддд1620 ссадсаасад сЕсадаЕддс ЕсЕЕсадУУа УУсаУсаадд асУасадаУа сасаУассда1680
Едссасадад дддаУасдса ааУссаааса аддадаУсаУ УсдадсУдаа даадсЕдЕдд1740 дадсааассс дЕЕсаааддс аддасУдЕЕд дЕЕЕсадаУд даддассааа ЕсЕаЕасааЕ1800 аЕссдааасс ЕссаЕаЕЕсс ЕдаадЕсЕдс ЕУааааЕддд ааЕЕдаУдда ЕдаадаУУас1860 садддсадас ЕдЕдУааЕсс УсЕдааЕсса ЕЕсдЕсадсс аЕааддаааУ ЕдааЕсУдЕс1920 аасааЕдсЕд ЕадЕааУдсс адсЕсаЕддс ссддссаада дУаУддааЕа УдаУдссдУУ1980 дсаасЕасас аУУсаЕддаЕ ЕссУаааадд аассдУУсса УЕсЕсааЕас дадУсааадд2040 ддааУЕсЕЕд аддаЕдааса даЕдУассад аадУдсУдса аУсЕаГЕсда даааЕЕсУЕс2100 сссадсадЕЕ саЕаЕсддад дссадЕЕдда аЕЕЕссадса УддЕддаддс саУддЕдЕсУ2160 адддсссдаа ЕЕдасдсасд ааУсдаУУЕс дадЕсУддаа ддаЕЕаадаа адаададУУЕ2220 дссдадагса ЕдаадаУсЕд УЕссассаГЕ даадаасУса дасддсаааа аУад2274 <210> 8 <211> 2280 <212> ДНК <213> Вирус гриппа Ά <220>
<223> Вирус гриппа Α (Α/νίβΕ Мат/1203/2004(Η5Ν1)) ген основной субъединицы 2 полимеразы [РВ2) <400> 8 аУддададаа ЕаааадааЕУ асдадаУсУа аУдУсасадУ сссдсасЕсд сдадаЕасЕа60 асааааасса сЕдЕддасса ЕаЕддссаЕа аЕсаадаааЕ асасаЕсадд аадасаадад120 аадаасссЕд сЕсЕсадааЕ даааУддаУд аЕддсааЕда ааУаУссааУ сасадсддас180 аададааЕаа УададаЕдаЕ ЕссЕдааадд ааЕдаасаад ддсадасдсЕ сЕддадсаад240 асаааЕдаЕд сЕддаЕсдда садддЕдаЕд дЕдЕсЕсссс ЕадсЕдЕаас ЕЕддЕддааЕ300 аддааЕдддс сддсдасаад ЕдсадЕЕсаЕ ЕаЕссааадд ЕЕЕасаааас аЕасЕЕЕдад360 ааддЕЕдааа даЕЕааааса ЕддаассЕЕс ддЕсссдЕЕс аЕЕЕссдааа ссаддЕЕааа420 аЕасдссдсс дадЕЕдаЕаЕ аааЕссЕддс саЕдсадаЕс ЕсадЕдсЕаа адаадсасаа480 даЕдЕсаЕса ЕддаддЕсдЕ ЕЕЕсссаааЕ даадЕдддад сЕадааЕаЕЕ дасаЕсадад540
ЕсдсааЕЕда сааЕаасдаа ададаадааа даададсЕсс аадаЕЕдЕаа даЕУдсЕссс600
ЕЕааЕддЕЕд саЕасаЕдЕЕ ддааадддаа сЕддЕсодса ааассадаЕЕ ссЕассддЕа660 дсаддсддаа саадЕадЕдЕ дЕасаЕЕдад дЕаЕЕдсаЕЕ ЕдасЕсаадд дассЕдсЕдд720 даасадаЕдЕ асасЕссадд сддадаадЕд адаааЕдасд аЕдЕЕдасса дадУЕЕдаЕс780 аЕЕдсЕдсса дааасаЕЕдЕ Еаддададса асадЕаЕсад сддаЕссасЕ ддсаЕсасЕд840 сЕддадаЕдЕ дЕсасадсас асаааЕЕддУ дддаЕаадда УддУддасаУ ссУУаддсаа900 ааЕссаасЕд аддаасаадс УдЕддаЕаЕа Едсааадсад сааЕдддЕсЕ ЕаддаСсадЕ960
ЕсЕЕссЕЕЕа дсЕЕЕддадд сЕЕсасЕЕЕс аааадаасаа дЕддаЕсаЕс сдЕсаадаад1020 даададдаад УдсУУасадд саассЕссаа асаЕЕдаааа УаададУаса ЕдаддддЕаЕ1080 даддааЕЕса сааЕддЕЕдд дсддадддса асадсЕаЕсс Едаддааадс аасЕадаадд1140 сУдаУУсадЕ ЕдаЕадЕаад Еддаададас саасааЕсаа ЕсдсЕдаддс ааУсаУУдЕа1200 дсааУддУдУ УсУсасадда ддаЕЕдсаЕд аУаааддсад Уссдаддсда УсУдааУЕЕс1260 дЕааасадад сааассааад аУУааасссс аЕдсаУсаас ЕссЕдадаса ЕЕЕЕсаааад1320 дасдсаааад ЕдсЕаУУЕса дааЕЕдддда аЕЕдаассса ЕЕдаЕааЕдЕ саЕддддаЕд1380 аУсддааЕаУ ЕассЕдасаЕ дасЕсссадс асадаааЕдЕ сасУдададд адЕаададЕЕ1440 адЕааааЕдд дадЕддаЕда аЕаЕЕссадс асЕдададад ЕадЕУдУаад ЕаЕЕдассдЕ1500
ЕЕсЕЕааддд ЕЕсдадаЕса дсдддддаас дУасЕсЬУаУ сЕсссдаада ддЕсадсдаа1560 асссадддаа сададаааЕЕ дасааЕааса ЕаЕЕсаЕсаЕ сааЕдаЕдЕд ддаааЕсаас1620
- 67 016217 ддОссДдадО. аадаООсааО сааОссИОдд садсаааОдс ОООдсадсад ададдсОсад дсаассаааа даадддасад дасааааддО ааадсОаа^д ДсЪадсаЪас садОдсООдО ддОсОсаада Ьасссааадс дОдасдТасг. ссссассдаа дааСдадаа1: ддсЬЪассд! ссддадОдда аОддассадс ^дс^даОадд ^асОдасад
ОаасассОаО ссссасда^д Гдссададдъ ддддасаОХО дсададсада асОсдОаадд ссООддааад дОсОдсадТа аООдадсаЬс дсааддадас ссадасадсд садОддаЬса сОдОасааОа сааОасадЬд даАасОдЬсс аОдсадОАОО ддсааОЬссс дасдсаддОд сСдаддддаО ааОдаасЬда дГддГдГИдд ассаааадаа
5садааас0д адаЬддадОЪ даОЬДдЬдад ада£аа£ааа сШсОсОаас сСдОдООсаа саОЪаасада ЬсООааАООО дсааЬсС^дс СааОдааасд ООсддаЬддс ддадас^дЬд ЬдаассдООс аасаДСаОЪс дсЪдс^асса ЬдДдааОдОд сОасааНаад дда^ссддаО аддсааддад даадддддад аааасдддас саОсааООад
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280 <210 <211>
<212>
<213>
1409
ДНК
Вирус гриппа А <220 <223>
Вирус гриппа А (Α/1Ν3Ν/1933 (Η1Ν1) ) ген нейраминидазы <400
9 адсдааадса ОаКддОадОс ОадссаСОса ЪассЬаЬааа ОсОЪЬдЬссс саааддадас дассООСООО. ддасадаадс сааООсаадд дсОаасааОс саИаа^аасО а^д^ассОдЬ ддссЁсддас ^дсассЬаа^. ОдОдОдсада адаОЁ-аЪааа 1:ддаасаддс аЬаОаадОаН дЪ'Ыдада^д асаада^дЬТ. ОдадсОааса ассИдаддад ТдаЬасЬдЬа дООЬдООсаа ддад^^Ьааа ддзаОааООа аОЛсааассд дЪСд^Ьдс^д аЬссдГдддТ дООООИдСса с±дасСсаад сс£1:асаддд ЮСдааТсдд ддааСССсСд дааассаОаа дДаааОддОО ааааХЬООса ЪсСсасЬасд дасааС^ддс аСадда^аса адседОддсс ддсааЬддТд аЪЬОдддаЬс д£ддсаа£да дддсЬадасО дасдсааЬсЬ даЪДддОсОО аааасСссСС
ЬдааОссааа дссОааЬаОО дааассаааа ддсаддасЪс дддс^аЬаса Оаадададсс дсдссООасЪ сс£0.аа£дад 1:1:дс01:дд0с д^ссадаЬда ааадОЬддад саОдОЬЫас адаОсдадаа аддааЬдООс асддОЬсдаа ЪсЪдсадОдд садЪдЪсЪдс ЬГГддаХадд сОаакддаЬд сОдаОсддСс дОаОдаддсс ддасОадИдд ддссадасдд дСПОсОасО ссадааааЬа дсаааОадда ссаОасЬдда аасСОсадОд садсааадас ОООсаОООса даа^дасаад съдсссъдъс адсаадОдса ^ддадсадОд даадааНаОа саЪааОдасс ддддааддОО сЬдЪОасссО. ссдассаОдд дд^ЬТАсддО. Сда^ддадса ааддас1сааа дасададасО адддсасадс ООдсТЕсГдд дадсаОсаЬЬ ЬдсЪдадСЪд аЬаассаО^д аа^аОаа^сЬ аТаОдсаасс аЪаООаассд ааСддса£.аа ЬдЬЪсЬсасЪ саССсааддд ддСдаадсОс ^дСсаЛдаСд дсОдОаГОаа ГСдадааеас даЪддсссаа асЕаааОсаа даГассддса дЬдЬссЬЬсд дасаасссдс аасддадСаа адОдасадОО даЬад1:аддС ддаадЪЪО-сд дООдааТОаа ОсОЕОООдОд ссдООсассз ддС.саа£с±д саа£а£.дда£ ааддсадсаО дсааО'ЬсаОс дааСЬддЬЬс Ьддаа^дсад ддассСИСаа сд0ссссд£а дааЬдддс^д ааЬасаасдд аададИсЬда дьда^дддс! ЬададЬСдаа аадОдаТд^д ассаааассЬ дЬессааада адддаОЛО^с ссадасаОдд ЬсЬсЬаЬдад £0сааса5сс ^садддддсО дОдОдааОдд гЛдасаадЬа
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1409 <210>
<211>
<212>
<213>
15186
ДНК
Вирус псевдочумы птиц <220>
<223>
Геном вирус псевдочуълы птиц В1 < 40 0>
ассааасада ОадааддОдО саСдгсООсс адсЪсаОдда ЬаасадОдаД СадсдаадаО сОсасаддОа сдОдсИОдад дааЬсддЬда дааОсОсдад дЪаСЬсдасд дддддддада дасссадаад дссаасааас а^даддаасс аСЛдаоддсо дШасда^аа Одсдадсссд адОасдааса аадддадЪас аОаддОддад сасЬсаддса аОдЬЬдсссО ООдссаасдд ааддсдаадд аадсасааас дсСссИсдсд сЬЪаааадОа сРООд^ддОа аддДдсОсОс Одсадддааа сасдссссад дЪсдсасддд сООсОдссаа дссссааОдд СаОЬсас^сС ддаОдсГдС ОаОдсОссса ссасаОЬддс ддад^ддадб
120
180
240
300
360
420
480
- 68 016217 дЕсЕдаадад ададсасада даЕЕЕдсдаЕ даЕадсадда ЕсЕсЕсссЕс дддсаЕдсад540 саасддсасс ссдЕЕсдЕса садссддддс ЕдаадаЕдаЕ дсассадаад асаЕсассда600
ЕасссЕддад аддаЕссЕсЕ сЕаЕссаддс ЕсаадЕаЕдд дЕсасадЕад саааадссаЕ660 дасЕдсдЕаЕ дадасЕдсад аЕдадЕсдда аасааддсда аЕсааЕаадЕ аЕаЕдсадса720 аддсадддЕс саааадаааЕ асаЕссЕсЕа ссссдЕаЕдс аддадсасаа ЕссаасЕсас780 даЕсадасад ЕсЕсЕЕдсад ЕссдсаЕсЕЕ ЕЕЕддЕЕадс дадсЕсаада даддссдсаа840 сасддсаддЕ ддЕассЕсЕа сЕЕаЕЕаЕаа ссЕадЕаддд дасдЕадасЕ саЕаЕаЕсад900 дааЕассддд сЕЕасЕдсаЕ ЕсЕЕсЕЕдас асЕсаадЕас ддааЕсааса ссаадасаЕс960 адсссЕЕдса сЕЕадЕадсс ЕсЕсаддсда саЕссадаад аЕдаадсадс ЕсаЕдсдЕЕЕ1020 дЕаЕсддаЕд аааддадаЕа аЕдсдссдЕа саЕдасаЕЕа сЕЕддЕдаЕа дЕдассадаЕ1080 дадсЕЕЕдсд ссЕдссдадЕ аЕдсасаасЕ ЕЕасЕссЕЕЕ дссаЕдддЕа ЕддсаЕсадЕ1140 ссЕадаЕааа ддЕасЕддда ааЕассааЕЕ Едссааддас ЕЕЕаЕдадса саЕсаЕЕсЕд1200 дадасЕЕдда дЕададЕасд сЕсаддсЕса дддаадЕадс аЕЕаасдадд аЕаЕддсЕдс1260 сдадсЕааад сЕаассссдд садсааддад дддссЕддса дсЕдсЕдссс аасдадЕсЕс1320 сдаддЕдасс адсадсаЕад асаЕдссЕас ЕсаасаадЕс ддадЕссЕса сЕдддсЕЕад1380 сдадддддда Есссаадссс Еасааддсдд аЕсдааЕада Есдсаадддс аассадаадс1440 сддддаЕддд дадасссааЕ ЕссЕддаЕсЕ даЕдададсд дЕадсаааЕа дсаЕдаддда1500 ддсдссааас ЕсЕдсасадд дсасЕсссса аЕсддддссЕ сссссаасЕс сЕдддссаЕс1560 ссаадаЕаас дасассдасЕ дддддЕаЕЕд аЕЕдасаааа сссадссЕдс ЕЕсЕасаада1620 асаЕсссааЕ дсЕсЕсассс дЕадЕсдасс ссЕсдаЕЕЕд сддсЕсЕаЕа Едассасасс1630 сЕсааасааа саЕсссссЕс ЕЕЕссЕсссЕ сссссЕдсЕд ЕасаасЕссд сасдсссЕад1740 дсаасададд сасааЕдсдд сЕсасЕааса аЕсаааасад адссдаддда аЕЕадааааа1800 адЕасдддЕа даададддаЕ аЕЕсададаЕ садддсаадЕ сЕсссдадЕс ЕсЕдсЕсЕсЕ1860 ссЕсЕассЕд аЕадассадд асааасаЕдд ссассЕЕЕас адаЕдсадад аЕсдасдадс1920
ЕаЕЕЕдадас аадЕддаасЕ дЕсаЕЕдаса асаЕааЕЕас адсссадддЕ ааассадсад1980 адасЕдЕЕдд ааддадЕдса аЕсссасаад дсаадассаа ддЕдсЕдадс дсадсаЕддд2040 адаадсаЕдд дадсаЕссад ссассддсса дЕсаадасаа ссссдаЕсда саддасадаЕ2100 сЕдасаааса ассаЕссаса сссдадсааа сдассссдса Едасадсссд ссддссасаЕ2160 ссдсЕдасса дссссссасс саддссасад асдаадссдЕ сдасасасад сЕсаддассд2220 дадсаадсаа сЕсЕсЕдсЕд ЕЕдаЕдсЕЕд асаадсЕсад сааЕаааЕсд ЕссааЕдсЕа2230 аааадддссс аЕддЕсдадс ссссаададд ддааЕсасса асдЕссдасЕ саасадсадд2340 ддадЕсаасс садЕсдсдда аасадЕсадд ааадассдса даассаадЕс ааддссдссс2400 сЕддааасса дддсасадас дЕдаасасад саЕаЕсаЕдд асааЕдддад дадЕсасаас2460
ЕаЕсадсЕдд ЕдсаассссЕ саЕддЕсЕсс даЕсааадса дадссаааас ааЕассссЕд2520
ЕЕЕсЕдсдда ЕсаЕЕЕссас ссассЕдЕад асЕЕЕдЕдса адсдаЕдаЕд ЕсЕаЕЕаЕдд2580 аддддаЕЕЕс ссааададЕа адЕааддЕЕд ссЕаЕсаддЕ адаЕсЕЕдЕЕ ЕЕЕааасада2640 саЕссЕссаЕ сссЕаЕдаЕд дддЕссдааа ЕссаасадсЕ даааасаЕЕЕ дЕЕдсадЕса2700
Еддаадссаа сЕЕдддааЕд аЕдаадаЕЕЕ ЕддаЕсссдд ЕЕдЕдссаас аЕЕЕсаЕсЕЕ2760
ЕдадЕдаЕсЕ асдддсадЕЕ дсссдаЕсЕс асссддЕЕЕЕ адЕЕЕсаддс ссЕддадасс2820 саЕсЕсссЕа ЕдЕдаЕасаа ддаддсдааа ЕддсасЕЕаа ЕааасЕЕЕсд саассадЕдс28ВО сасаЕссаЕс ЕдааЕЕдаЕЕ ааасссдсса сЕдсаЕдсдд дссЕдаЕаЕа ддадЕддада2940 дддасасЕдЕ ссдЕдсаЕЕд аЕсаЕдЕсас дсссааЕдса сссдадЕЕсЕ Есадссаадс3000
ЕссЕаадсаа дЕЕадаЕдса дссдддЕсда ЕсдаддаааЕ саддааааЕс аадсдссЕЕд3060 сЕсЕаааЕдд сЕааЕЕасЕа сЕдссасасд ЕадсдддЕсс сЕдЕссасЕс ддсаЕсасас3120 ддааЕсЕдса ссдадЕЕссс ссссдсадас ссааддЕсса асЕсЕссаад сддсааЕссЕ3180 сЕсЕсдсЕЕс сЕсадсссса сЕдааЕдаЕс дсдсаассдс ааЕЕааЕсЕа дсЕасаЕЕаа3240 ддаЕЕаадаа ааааЕасддд ЕадааЕЕдда дЕдссссааЕ ЕдЕдссаада ЕддасЕсаЕс3300
ЕаддасааЕЕ дддсЕдЕасЕ ЕЕдаЕЕсЕдс ссаЕЕсЕЕсЕ адсаассЕдЕ ЕадсаЕЕЕсс3360 даЕсдЕссЕа саадасасад дадаЕдддаа даадсаааЕс дссссдсааЕ аЕаддаЕсса3420 дсдссЕЕдас ЕЕдЕддасЕд аЕадЕаадда адасЕсадЕа ЕЕсаЕсасса ссЕаЕддаЕЕ3480 саЕсЕЕЕсаа дЕЕдддааЕд аадаадссас ЕдЕсддсаЕЕ аЕсдаЕдаЕа аасссаадсд3540 сдадЕЕасЕЕ ЕссдсЕдсда ЕдсЕсЕдссЕ аддаадсдЕс ссаааЕассд дадассЕЕаЕ3600
ЕдадсЕддса адддссЕдЕс ЕсасЕаЕдаЕ ддЕсасаЕдс аадаададЕд саасЕааЕас3660
ЕдададааЕд дЕЕЕЕсЕсад ЕадЕдсаддс ассссаадЕд сЕдсааадсЕ дЕадддЕЕдЕ3720 ддсааасааа ЕасЕсаЕсад ЕдааЕдсадЕ саадсасдЕд ааадсдссад адаадаЕссс3780 сдддадЕдда асссЕадааЕ асааддЕдаа сЕЕЕдЕсЕсс ЕЕдасЕдЕдд Еассдаадаа3840 ддаЕдЕсЕас аадаЕсссад сЕдсадЕаЕЕ даадаЕЕЕсЕ ддсЕсдадЕс ЕдЕасааЕсЕ3900
ЕдсдсЕсааЕ дЕсасЕаЕЕа аЕдЕддаддЕ адасссдадд адЕссЕЕЕдд ЕЕаааЕсЕсЕ3960 дЕсЕаадЕсЕ дасадсддаЕ асЕаЕдсЕаа ссЕсЕЕсЕЕд саЕаЕЕддас ЕЕаЕдассас4020 сдЕадаЕадд ааддддаада аадЕдасаЕЕ ЕдасаадсЕд даааадаааа ЕааддадссЕ4080
ЕдаЕсЕаЕсЕ дЕсдддсЕса дЕдаЕдЕдсЕ сдддссЕЕсс дЕдЕЕддЕаа аадсаададд4140
ЕдсасддасЕ аадсЕЕЕЕдд сассЕЕЕсЕЕ сЕсЕадсадЕ дддасадссЕ дсЕаЕсссаЕ4200 адсаааЕдсЕ ЕсЕссЕсадд ЕддссаадаЕ асЕсЕддадЕ сааассдсдЕ дссЕдсддад4260
- 69 016217 сд^Баааа^с аЬЬаЬссаад саддЬассса асдсдсЬдЬс дсадЪдассд сХдассасда 4320 дд^БассЬсС асЬаадсЬдд адааддддса сасссЬЬдсс аааБасааБс сЬСБЬаадаа 4380 аГаадсЬдсд БсЬсЬдадаЬ БдсдсЬссдс ссасБсассс адаЬсаЬсаС дасасааааа 4440 асЬааЪсЪдЪ сЬЪдаЬЬаЪЬ СасадЬЬадЬ ЪЪассЬдЬсс аЬсаадИ^ад аааааасасд 4500 дд^адаадас Ь.с^дда'С.ссс дд^Ьддсдсс сЬссадд^дс аддаБдддсЬ ссадасс^ИБ 4560 Бассаадаас ссадсассЬа ЬдаЬдсБдас ЬаЬссдддБс дсдсБддЬаЬ ЬдадББдсаИ 4620 сЬд^ссддса аас1:ссаЬЬд аЬддсаддсс ЬСИСдсадсБ дсаддааЬБд БддСБасадд 4680 адасааадса дЬсаасаБаЬ асассЬсаЬс ссадасадда ЬсааБсаБад БСаадсЪссЬ 4740 сссдааЬсБд сссааддаЬа аддаддсаЬд Ьдсдааадсс сссБбддаЬд саЬасаасад 4800 дасаЬБдасс ассЬИдсЪса ссссссББдд ЬдасБсЬаЬс сдЬаддаЬас аадад^с^дБ 4860 дасХасаЬсХ ддадддддда дасаддддсд ссИБаБаддс дссаБЬаБЬд дсддЬдЬддс 4920 ЬсЫ.дддд£Х дсаасЬдссд саааааБаас адсддссдса дсЬсБдаЬас аадссаааса 4980 аааЬдсЬдсс аасаЬссБсс дас^Ьааада дадсаЬЬдсс дсаассааЬд аддсБдБдса 5040 ЬдаддБсасБ дасддаББаБ сссаасЬадс адЬддсадЫ: дддаадаЬдс адсад^ЬЬдЬ 5100 Ьаа^дассаа ^ЬЬааЬаааа садсЬсадда а^бадас^дс аЬаааааЬЬд сасадсаадЬ 5160 Ьдд^дсадад сБсаассСдБ ассЬаассда аСЬдасСаса дЬаЬАсддас сасаааЬсас 5220 ЬЬсассЬдсс -ЬБааасаадс БдасЬаГИса ддсасП^ас аа^сЬадсЬд дЬдддааЬаЪ 5280 ддаСХасСБа БИдасБаадБ БаддБа^адд дааеааБсаа сБсадсБсаЬ ГааЬсддБад 5340 сддсЬБааЬс ассддБаасс сСаЫзсЬаЬа сдасБсасад асЁсаасБсЪ ЪдддЬаЬаса 5400 ддЬаасЬсЬа ссББсадЬсд ддаассЬааа ЬааЬаЁдсдЬ десассЬасЪ Ьддааасс^Ь 5460 аЬссдБаадс асаассаддд даБББдссЬс ддсасЬЬдЬс ссаааадЬдд БдасасаддБ 5520 сддЬБсЬдЬд аБадаадаас ИСдасассЬс аЬасБдЬаЬа дааасЬдасЬ ЬадаЬЬЬаЬа 5580 ЬЬдЬасаада аЪадЬаасдС. ЬсссСаЬдЬс сссЬддЬаЫ ЬасБссЬдсЬ Бдадсддсаа 5640 ЬасаЬсддсс ЬдЬаЬдЬас^ сааадассда аддсдсасЁЬ ас^асассаС. аНаБдасБаБ 5700 саааддсСса дЁсаЬсдсЬа асЬдсаадаБ дасаасаБдЬ адаИд^дЬаа ассссссддд 5760 ЪаЬсаЬаЬсд саааас1:аЬд дадаадссдЬ дЬсБсЬааБа даЬааасааЬ саЬдсааЬд’Ь 5820 Ыз^аЬссЬ^а ддсдддаГаа с£Ь5ааддс£ садЬддддаа ЬЬсдаБдЬаа сСЪаЬсадаа 5880 дааЬаЪсСса аЬасаадаЬБ с^саадЪааЬ ааЬаасаддс ааЬсНЬдаБа ЪсЬсаасЬда 5940 дсБ^дддааТ. дссаасаас£ сдаЬсадЬаа ЬдсЬСИдааС. аадБСададд ааадсаасад 6000 аааасБадас ааадЬсааЬд £сааас1:дас садсаса^сС. дсБсБсаЬБа ссЬаБаЬсдЬ 6060 ББИдасБаБс аЬаЪсЬсЪЬд £14:ЬЪдд1:а1: асЬЬадссБд аЬЬсЬадсаЬ дсБассЬааЬ 6120 дЬасаадсаа ааддсдсаас аааадассЫз аЬНа^ддсЫ дддааБааБа сссИадаЬса 6180 дагдададсс асгасааааа гдгдаасаса дагдаддаас дааддггссс сЬаагадгаа 6240 БЬЬдЬдЬдаа адЬБсЬддЬа дЬсБдЬсадБ ЬсддададПЬ аадаааааас БассддЬСд^ 6300 адаБдассаа аддасдаЬаЬ асдддЬадаа сддБаадада ддссдссссС сааЬЬдсдад 6360 ссадасЫ:са саассБссдЪ ЬсЬассдсБЬ сассдасаас адЬссЪсааЬ саБддассдс 6420 дссдЫхадсс аад£Ьдсд££ ададааЬдаС дааадададд сааааааЬас аБддсдсЬЬд 6480 аБаБЬссдда ББдсааЬсСЬ а^БсББааса дСадБдассБ ЁддсБаИа^с БдИадссЬсс 6540 сЬЁ-ЬЬаЁаЁа дсаьдддддс ЬадсасассЬ адсдаБсСЛд ЬаддсаБасс дасБаддаЬБ 6600 Ьссадддсад аадаааадаГ БаеаБсЬаса сСЛддБЬсса аБсаадаГдБ адЬадаЪадд 6660 аЬа^аЬаадс аадСддсссЬ ЬдадЬсЬсса ЪЬддсаЬЬдЬ Сааа^асЬда дассасааЬЬ 6720 аЬдаасдсаа ЬаасаЬсЬсЬ сБсББаЬсад аСХаа^ддад сЬдсааасаа садсдддБдд 6780 ддддсассЬа Ь’ЬсаЬдассс адаББаЬаНа ддддддаБад дсааадаасЬ саЬЬд^адаЬ 6840 даЬдсЬадЬд аЬдБсасаЬс аСЬс^аЬссс ^сЬдсаЬЬЪс аадаасаЬсЬ даа^ЬБЬаЬс 6900 ссддсдссЬа сБасаддаЬс аддБидсасБ сдааЬасссБ сасг-сдасао дадгдсБасс 6960 саЬБасБдсБ асассса1:аа Бд^ааБаЬХд ‘СсБддаЬдса дадаБсасИс асасОсаИаЁ 7020 садЬаЬЬЬад сасЬ^дд^дЬ дсБссддаса ЬсЬдсаасад ддадддБа^Ь сЫхБЬсЬасЬ 7С80 сЬдсдЬЬсса Бсаасс^дда сдасасссаа ааБсддаадГ сЁЬдсадЬдС дадБдсаас!: 7140 ссссБдддЬЬ д^да^аЬдсЬ дЬдсБсдааа дссасддада сададдаада адаБЬаЬаас 7200 ^садсБдЬсс сСасдсддаЁ ддГаса^ддд аддЬЬадддЬ Бсдасддсса аБаБсасдаа 7260 ааддассЬад а£дЬсасаас аБЬаБЬсддд дасЬдддЬдд ссаасБассс аддадГаддд 7320 ддЬддаЬ.с1:Ь ЬБаЫдасад ссдсдЬаЪдд ЪЬсЬсадЬсЬ асддадддСХ аааасссааЁ 7380 БсасссадЬд асасидЬаса ддаадддааа ЪаБдСда^аИ асаадсдаЬа сааБдасаса 7440 СдсссадаЬд адсаадасБа ссадаСИсда аБддссаадИ сБЬсдЬаБаа дссБддасдд 7500 БББддЬддда эасдсаЬаеа дсаддсБаЬс ГЬаЬсБа^са аадЬдЬсаас а^ссБЬаддс 7560 даадасссдд •ЬасЬдасБдБ ассдсссаас асадЬсасас ЬсаЬдддддс сдааддсада 7620 аЬЬсЬсасад ЬадддасаЬс ссаЬБЬсЬБд ЬаЬсадсдад дд^саБсаБа сССсЬсЬссс 7680 дсдЬБа-ЬЬаЬ аЬссБаЬдас адБсадсаас аааасадсса сЬсЬБса1:ад БссЬБаБаса 7740 ИБсааЬдссС ЬсасБсддсс аддЪадЬаБс ссЬЁдссадд сЬЬсадсаад аБдссссаас 7800 ссдЬдЬдЬСа с^ддадЬсЬа БасадаЬсса БаПссссСаа СсБСсБаБад ааассасасс 7860 СЪдсдадддд БаЬСсдддас ааБдсДБдаС. ддБдаасаад саадасБСаа сссБдсдБсБ 7920 дсадЬаБЬсд аЬадсаса1:с ссдсадЬсдс аЬаасЬсдад ЬдадЪЬсаад садсаГсааа 7980 дсадсаБаса саасаХсаас БЬдБЬЬЬааа дБддЬсаада ссаа1:аадас с^аЬ^дЬсБс 8040 адса’ЬЬдс'Ьд аааЬаБсБаа ЬасЬсЬсБЬс ддадаа^-Ьса дзаБсдЬссс дЬЬас^адЪЬ 8100
- 70 016217 дадаТссТса аадаТдасдд ддЪТададаа дссаддЪс^д дсХадТТдад аададГТдда аада1ддса1: ЬдЬаЬсассЬ аЬсТТсГдсд асаЬсаадаа Тдссддсдсд ЪдсСсдааЪС сса^дтсдсс ад^Хдассас ааЬсадссад аЬсадаЬЬаа дсс££д1:саа Ъад^сХсЬЬд аЪ^аадаааа ааСд^аадЬд асааддсааа асадсЬсаГд дГаааГааЬа сдддтаддас аьддсдадст аадддсадад саЬсадаЫа бссЬассада дЬсасассЪд ЬсЫсассаЬ сааасТасХс ЬаЪ^аТТдда ааЪТаасХдд дстассдстГ ссЬдаЪдаа^ ссассТсаТТ сТсадссдас ааЬддааааа ааТасИЪдаа ЬсддссХсТс дадаа£да£а ааасСсддаа дддсад^аса ссааасЪсЪЪ аассасааСХ сддадбасХс сассссаддь д£££адаада асбддсТааТ аСЬдаддЬсс саасаааТ^И сддаадаГТд адаадаадаТ ссаааТГсас аасасдадаг дТ^сасаадд сТдЬдТасдс аТаТададаа дааасЬдсЬд дддТсаЬсТТ ТдГсссссдд ТсададдадИ ТсадсадсаТ ИсдТасддаЬ ссддсаТЬсТ ааааТддЪсс асадссаадЬ ЬТдсаГддс!: сса^аЬаааа садаТссада ЪдТддсадсЛ аддасааддЬ сЬдсддссаа сааа^ЪддХд аЬдсЬаассс ссаадЁсТТТ дСсасИссХд аас±£дСХд£ ТдЁдасдсаИ асдааТдада а£д£с££асс саддаасХЬд ЬаЪЪдаЪдЪа д.дсадаТаТд аТддадддса саасаТааТа Исаассасдд сддГдсаТсХ садаадсТГа Ьсададаааа ЫХдсддЫта аТадасдсХс Ьддсаааада сТТдддИаа11 саадЬсХасд асТааТддад дда£ТЬдса£ асддадсХдЪ ссадсЬасЪс дадссдТсад дддадаЬЬЬс ЬЛсдса£6са ассгЬдсадда дсЪЪааадас аЬЬсЬаа^Тд саа^даИаИа дсадааНссд ГдасСсаЬдс ааЬсдсТасг дгаГГсТсГд дааЬсаадса дсХдадаИдб ИдИдссбдЬЬ. дсдЪсХдЬдд ддесасссас ссдТаТТдса дсаааддсад Ьсаддадсса ааНдТдсдса ссдааааСдд СаТдаОсссО саддИасИдИ сХ^ИсЫгсаа дддаасааНс аГсаасддаИ даа^дсаддЪ дЬд^ддссдс дадТсааадЁ ддаЁасаа!.а ТаЬдддаадд асЬасаЬдса даЪЬсадсад адаТЬЬсаса сдаЬаЬсаЬд ЬЬдадададТ аЬсХдсасГХ даа^ТЬдадс саТдЬаТада аТасдасссЬ дТсасЪаасс ссиаааадас ааддсаа^сд сасассссаа сдатаа^гдд сСИдсс^сдб ссПзсЪсЪсс даадассада адааасаТдТ аааддаадсд асСХсдасТа даТададТТТ ТТададЬсаа аТдаСХТТда ТссаЬаЬааа дадаТддааб ссГХдадЪас сСЪададаЪд асаа^дЬддс адИаСсаЕас ^.сдсХсааад дааадЪЪааЪ ддасддаЪсС ЬсдсЬаадсХ дасааадаад ЪЪааддаасХ ддсддааддд аТссТадссд аТсада££дс ассЬТЬсЪТТ садддаааТд ддаЪадсаЪа ЪссХСдасса ададИа^дсХ адсда^дадЬ саасХдИсХ^ ЪаадааасдЬ а^сасХдас!: дЬааадааад адТаТсХЬса аассдсааЪс аадсаадаас сдЬсддадад ЫхдсаассЪЬ саЪаасаасЪ дассЬдсааа £аа£Ъддада Ъа^садасда Ъсааа^СдТЬ сдсХса^дсс а£сааЬсад£ ассГса^ТТс ТТсдадТдда ТТсассСаад асХдаТддас асТасдаТдС есссхтсааь ссСссаадТд асссХасЁда сТдГдассТс ЬсаададТсс σ3ΐ.3ΐΣ3.ΐΣαίΣ·ΐΣ дЪсадТдсса дадддддТаХ сдаадда'ЬГ.а С.дссадаадс да£с1сааЪ£ дсЪдсааТсс аасТТдсСдс адсТадаЬсд саЫгдЪсдТд ддЬасадддЬ даТааЬсаад ЬааЬадсад! аасдададад дТаадаЬсад ддада^дд^д {ХдасасадТ Тдса^саадс садИдаТаа!: 1ХсС{:саадд ТдИсааТсаС. ТХдаТуддсс аСааЫСдаа ддаЬсдЬдаа ассаЬсаддС сЬТсаЬаЬас адсааасдаа ИсИТсааада ЬддадсааТс сТсадИсаад ЫзсаТсХааа ЬТадТдсТад ^дТсаддТда ЪсСсадЪдаа аасассдЪаа саасаЬТдсс ЬсЬасХдТад сасддсХаЬд сдадаасддд сЬТсссааад сХаНЪЬааас ТаЬаТааЁда дСХдИдСдса дасаТасЫН: дасХсХдадС саасааЪЪсд сассссдаЬс ГЬааТсадГс дЬддаТТдад дасаЬсЬсЬЬ аТаИдИСсСд асСссИдссс ааСХаддддд асЪдадТаас сТЁсааТасС сасЪадааа^ аЬсдд^дасс сддддасХас ЪдсХ^ХТхдеа дада^саадс адЬдддасЬа с1дадТссЬа асаЬЪаЬдас ЬааЬаГсЬТа асТаддссдс адаСХдддсс адТсТд^дса асдасссаСа сЬсЕТЬсааЬ. ТЬТдадасХд ааа£а££д£Ъ с^хаадааас аТасдсааад ад^ссГаТТТ дааасГХдСТ аНТдТсТдда дтдсасасад аддаТааТда ддсадаадад ааддсаСТдд дсТТааТсаа даддЬдаТ'Ьс аТссссдсдТ ЬдсдсаЬдсс а£са!:ддадд адд^аддада аадсааа'Ь^с аадддс££д£ Сдасасааса аасасТдЬаа дсТТасТадд аддссаТТад дсаСсаадад дсТдаСдсдд аНадИсааГТ дсаТдсааТд сЬдТЬЬадад асдаЬдЬТссХсАадЬ адаЬссаасс сЪсЪЪсИааЪ аЬд^д^ИсСс £дасас£ддс адасТаТдса сддаатадаа ТТТдасддда ддсаддаааа ^асХдддТд! аТсТааГссС. даИасдаТад ^дд^ст-адаГЪ сЬТадГдТаа дсддаддд^д ЬасаадаЪдЬ дасадсддад НасИИддъИс саГсИИссаа дсааНаГада аНТдассдаЕ дасассадса
ЪсаасТаСда 8160 Ьсааассдаа 8220 ИдсХсаИдсд 8280 дсааЬдадаЬ 8340 ссддГссХда 8400 ТддТсаадса 8460 дЪдасТЬсда 8520 сТдаТасТда 8580 ссадааЬаас 8640 сЁдаТЬсаас 8700 аИддадаасТ 8760 ддТсТаасаа 8820 ддЬТТсасЪс 8880 ддсаГсЬдаТ 8940 аОааддОадд 9000 асаадТИсас 9060 дадага£дд£ 9120 ГХдаТдасаТ 9180 аТдОСдТаОс 9240 дТасаТТ^дс 9300 дссЁссГссс 9360 дТСИадааса 9420 ЪдсХ^дадЬс 9480 ТадасГГХда 9540 асадааадаа 9600 Тсаидддса 9660 аОаададЬ-ЬТ 9720 ТдадсаЬдТТ 9780 ЪЪаддсддаа 9840 ассдссЬсТТ 9900 аГсТдасдас 9960 адааддаад£10020 дЪсаддЬда^ 10080 дадТсаОТса 10140 ООаасадсаа 10200 аЪдаСссдаа 10260 адОасОдОсО 10320 ЬдаОдддссХ 10380 ТсдТаддада 10440 сТааЬдаТда 10500 ЬаЪддасааЪ 10560 ЬТдссЬдОаТ 10520 аОдасОсОсс 10680 ааЪЬааксеа 10740 садасасаЬЬ 10800 ^ссХсааааа 10860 ТдТссТдТдс 10920 асЬТсТдЫа 10980 ТсГссаГсас 11040 ЬЬдЬдсасХс 11100 сааддсИсха 11160 дасХадаадс 11220 сЬдддааЬдд 11280 ТЬдсаадссс 11340 саааТсссТ1: 11400 сТдааТТсТТ 11460 саадсТсТдТ 11520 СГаадаСбдс 11580 аТТсТадсаС 11540 ассссТТадЬ 11700 дсС.ддГсасс 11760 аасТсдТада 11820 аЬдаасааТТ 11880 адааТссХсс 11940
- 71 016217 да£дадддЪа ссаСаЬсЬсд дд^сааадас асаддададд ададсЬдссЬ. сасгьдсдаа 12000 ааЬадсЬсаЬ аЬд!сдссас аЪдГдааддс СдсссЬаадд дсаЬсабссд ЬдЪСдаЬсЬд 12060 ддсггагддд даСааЬдаад ЬаааЬЬддас ГдсГдсЬсЬс асдаЬЬдсаа ааНсЬсддЬд 12120 ЬааЬдбааас ЬЬададЬаЬс ЬЬсддЬЬасЬ дЬссссЬЬЬа сссасддсЬд ддааЬсГГса 12180 асаЬадасЬа даЬдаСддТа ЬаасТ.сада'Е дасаЬЬсасс ссЬдсаГсТс ЬсЬасаддСд 12240 ЬсассЬЬаса ЬСсасабаЬс сааЬдаЬЬсь саааддсЬдЬ ЬсасЬдаада аддадЬсааа 12300 даддддааЬд ЬддСЛЬасса асададЬсаЬ дсЬсЬЬдддЪ ЬЪаЪсЪсЬаа ЬсдааЬсдаЬ 12360 сЬЬЬссааЬд асаасаасса дааса^а^да СдадаЕсаса сЬдсассЬас аЬадЬаааЫ 12420 ЬадЬЬдсЬдЬ аЬсадддаад сассИдЬЬдс ддЫссЪЫс дадсЬасЬЬд дддЬддсасс 12480 ддаасЬдадд асадЬдассЬ саааЬаадЬЪ ЬаЬдЬаЬдаЪ ссеадссс1д ЬаЪсддаддд 12540 адасЬЬЬдсд адасЬЬдасЬ ЬадсЬаЬсгЬ саададЬЬаЬ дадсббааЬс ЬддадЬсаСа 12600 ЬсссасдаЬа дадсСааЬда асаЪЬсЬЬЬс ааТаТссадс дддаадЬЬда ЬЬддссадЬс 12660 ЬдЬддЬЬЬсЬ ЬаЬдаЬдаад аСассхссаЬ ааадааЬдаЬ дссаЬааЬад ИдЬаЬдасаа 12720 ЬасссдаааЬ ЬддабсадЬд аадсбсадаа ЬЬсадаЬдЬд дТссдссЬаЬ. ЬЬдааСаСдс 12780 адсасЬЬдаа дЬдсЬсеЬсс ассдЬЬсЬОа ссаасЬсЬаЬ СассЬдадад ЬаададдссЬ 12840 адасааЬаЬЬ дЬс^ЬаЬаЬа ЬдддЬдаЬЫ: аЬасаадааЬ аЬдссаддаа ЫсЬасЫЬс 12900 саасаЬЪдса дсХасааЪа-С. сЬсаЪссЬдЬ саИИсаЬИса аддЬЬасаЬд садЬдддссЬ 12960 ддбсаассаЬ дасддаЬсас ассаасббдс адаЬасддаЬ ЫЬаЬсдааа ЬдЬсЬдсааа 13020 асЬдЪТадЬа ЪсЬГдсассс дасдИдЬда^ сЬссддс^Уа СаСИсаддаа аЬаадСабда 13080 ЪсЬдсЬдьТс ссаЬсЬдЬсЬ. ЪадаЬдаЬаа ссЬдааЬдад аадаЬдсЬЬс адсЬдабаЬс 13140 ссддИНабдс ИдИсЬдЬаса сддЬасСсС.1: ИдсХасааса ададаааЬсс сдааааЬаад 13200 аддсЕЪаас! дсадаадада ааЬдЬЬсааЬ ас£сас£дад ЬаТЁгасчдЬ сддаСдсЬдТ 13260 дааассаЬЬа сСЬадссссд аЬсаадЪдад сЬсЬаЬсаЬд ЬсЬссТ.ааса ЬааСЬасаЫ: 13320 сссадс^ааЬ сЬдЬасЬаса ЬдЬсЬсддаа дадссЬсааЬ ЬЬдаХсаддд ааадддадда 13380 садддаЬасЬ аЬссЬддсдЬ ЬдЬЬдЬЬссс ссаададсса ЬЬаЬЬададЬ ЬсссСЬсЬдЬ 13440 дсаадаЬа1:1. ддЬдсЬсдад ЬдааадаЬсс аЬЬсасссда саассЬдсдд 03ξί:ΐ:ΐ:ΐ:9Ό3 13500 ададЬЬадаЬ ь^дадЬдсьс садсааддга ЬдасдсаЬЬс асасЬЬадЬс адаь^саЬсс 13560 ЬдаасЬсаса ЬсЬссаааГс сддаддаада сЬасЬЬадЬа сдаЬасЬЬд1: ЬсададддаЬ 13620 адддасЬдса ЬсЬЬссЬсЬХ ддбаЬааддс аЬсссаЬс^с сЬЬЁсгЬд’С.ас ссдаддЬаад 13680 аЬдЬдсаада сасдддаасб. ссйЬаЬаскЬ ддсЬдаадда адеддадсса ЬсаЬдадЬсЬ 13740 ЬсЬЬдаасЬд саЬдЬассас аЬдааасГаЬ сЪаЪЪасаа!: асдсЬс1ЬЬЬ. саааСдадаЪ 13800 даассссссд саасдасаЬЬ Ьсдддссдас сссаасЬсад ЫЬстдааЬС сддСЪдЬЬ-ка 13860 гаддаагсга саддсддадд гаасасдсаа ддагддассь дЬссаададЬ ьссдбссаьь 13920 аЬддададаа ааЬасададд ааадЬдассЬ дасс^садаС ааадсадЪдд дд^аС.аЬЬас 13980 аЬсЬдсадЬа сссЬасадаЬ сЬдЬаЬсаЬЬ дсЬдсаЬЬд(: дасаЬХдааа ЬЬссЬссадд 14040 дЬссааЬсаа адсЬЬас^ад аЪсаасЬадс ЬаЬсааЬЬЪа ЬсЬсЬдаГЬд ссаСдсаГТс 14100 ЬдЬаадддад ддсддддЬад ЬааЬсаЬсаа адЬдЬЬдЬаЬ дсааьдддаь асЬасЬЬЬса 14160 ЬсЬасЬсаЬд аасЬЬдЬЬОд сЬссдЬдЬЬс сасаааадда -ЬаЬаЬЪсЬсЬ сЬааЬддЫа 14220 ЬдсаЪдЬсда ддддаЬа^дд адСдСЬассЬ ддЪаЪЬЪдЬс аЬдддЬЬасс Ьдддсдддсс 14280 ЬасаЬЬЬдСа сабдаддЬдд ТдаддаЬддс ааааасСсЬд дЬдсадсддс асдд^асдсх. 14340 сТЛдЬсЬааа ЬсадаЬдада ЬсасасЬдас саддЬЬакЛс ассЪсасадс ддсадсдЬдЬ 14400 дасадасаСс сИа^ссадЬс сЬЪЪассаад абЬаа^ааад ЬасЪЪдадда адааЬаЬЛда 14460 сасГдсдсГд аГГдаадссд ддддасадсс сдГссдГсса ^гьЬдбдсдд ааадСЬИддЬ 14520 дадсасдсба дсдаасаЬаа сГсадаЬаас ссадаЬЬаЬс дсбадЬсаса ЬЬдасасадЪ 14580 саЬссддЬсЬ дСда^аЬаЬа СддаадсГда дддЬдаЬсЬс дсХдасасад ЬаЬГЛс^аГС 14640 ЬассссЬЬас ааЬсьсЬсЬа сЬдасдддаа ааададдаса ЬсасЬ'Ьааас адЬдсасдад 14700 асадаЬссЬа даддЬЬасаа СасЪаддЪсЬ Ъадад^сдаа ааЬсЬсааТа аааЪаддсда 14760 ЬабааЬсадс сЬадЬдсЬСа ааддса-СдаЬ сЬссабддад дассЬЬаЬсс сасЬааддас 14820 аЬасЬЬдаад сабадЬассЬ дсссЬаааЬа ЬЬЬдааддсЬ дЬссбаддЪа ЪЪассааас£ 14880 сааадаааЬд ЬЬНасадаса с^ТсЬдИасЬ дбасЬСдасЪ сдЬдсЬсаас аааааЫсЬа 14 940 саЬдаааасЬ аЬаддсааЬд садЬсааадд аЪаЫасадЬ аасЬдЬдасС ссЬаасдааа 15000 аЬсасаЬаЬЬ ааЬаддсЬсс ЬЕЬЫзЬддсс ааЫдЬаЬЬс ЬЬдЬЬдаГЬС ааЬЪаЬаЬЬа 15060 ЬдЫадаааа аадЬЬдаасС. сбдасСссЬЬ аддасЬсдаа ЬЬсдаасЬса ааЬаааЬдЪс 15120 ИЬНаааааад дНЬдсдсаса аЪЪаЪЪсЪЪд адЬдЬадЬсЬ сдБсаЬСсас сааа^сЫЬд 15180 ЬЫдд! 15185 <210> 11 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 72 016217 <223> Консенсусная последовательность, основанная на невирулентных птичьих штаммах вируса гриппа А Н5, в области, находящейся непосредственно перед сайтом растепления НА <400> 11
С1п Агд С1и Агд Агд Агд Ьуз Ьуз Агд <31у
15 10 <210> 12 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> измененная консенсусная последовательность, основанная на невирулентных птичьих штаммах вируса гриппа А Н5, в области, находящейся непосредственно перед сайтом расщепления НА;
<400> 12 <31п Агд С1и ТЬг Агд С1у
2: Очищенные вирионы гИОУ-Н7/Е-(ТМ+С)
Фиг. 7 гНОТ/В1 ι I-5'
112С-К-0-6-К-Дц7 γΝ09/Ε2οο ί Р жоу/гам 3-ΗΞΖΟ£ΣΕΣΗΣΙΞΙ-^23ΟΕΉΣΞΞΞΞΞΕΞΞΞΞΣ]-5, ]12к-в-о-к-р-/г)17
Фиг. 8А
ΓΝϋν/Β1 гЫОУ/Р2аа ΓΝϋν/РЗаа
Фиг. 8В
- 61 016217 гНОУ/ГЗаа- химерный Н7
ЙН7 НА(ЕСТО)^
I Е: трансмембранный и цитоплазматический хвостой домены Р ., .^!?С|ПАЕАААЩ|Т|АС6С6Т№АА1ЖТ«Т сссссасс атсстсасст ... КЬе I Конец гена Начало гена Коик Н7 НА
Фиг. 9А
Время после инокуляции (ч)
Фиг. 9В
- 62 016217
Список последовательностей <110>
МЬ. 51па1 Зспоо! о£ МесИсхпе о£ Ыеи Уогк ΌηίνβΓ5ίί.γ <120>
ХИМЕРНЫЕ ВИРУСЫ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЕ НЕПРИГОДНЫЕ
ПОВЕРХНОСТНЫЕ БЕЛКИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130>
6923-135-228 <150>
<151>
60/741,833
2005-12-02 <150>
< 151>
60/802,364
2006-05-22 <160>
<170>
ЕазИЗЕЙ £ог ΐΐιηάον/з Уегздоп 4.0 <210>
<211>
<212>
<213>
823
ДНК
Вирус гриппа А <220>
<223>
Вирус гриппа Α (Α/νϊβ1ζ №ат/1203/2004 (Η5Ν1) ) ген неструктурного белка 2 (N3) <400>
аЬддаС^сса сдабСХдсад аадПссскаа ддааадсада дск^сасдсЕ абдсссаадс аааассаЬса сЬасЪбадад с^Сссаддас даабддааПд адЬдаЬдадд аЫздадбсад ааккасадаа адЬддадсаа асасЬдЬдЬс ассаадаасС даддаададд ^ад^ддадсд ассЪаасЪда адааадиддс ЬаЬЬдааадс с^Ы^сасада аЬасЬддЬда абаасасадб а^дддадаск аад1:Ъ±.даад аасадсЕксд дадаЬаадад дкадас^дсЪ ссаЪСссббд дд£с1:ддаса ддддад^скд даадааа^дЪ £дса1:саааа дЕда^Е^Ъд а^сдЬдддад аа£дсаа£Сд дааасЬаСас ссааа£сада дсбда^даа дЕЕбабдсаа ЬсадсЪЬаЬЬ ^Ъскккддса ассддсРСсд Ьсдааасадс аЬааддсасЬ саадддаскд Ъддассаддс ассддЫдда аааЬс^сасс дсдЬсс^саС ададаЫзсдс аасддЬаааЬ даадкаадас дсс1касаас Ьаа ^дкссдсааа ссдадаЬсад Насксдсдса ЪааааЪдссд д^бса^дсЪс ааЬааьддас аасссЬааЬа аккассЬ^сС сддаддасьх Ыддадааас ддсдадааса акадаЬЬдаа СаскдоСбда
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
823 <210>
<211>
<212>
<213>
982
ДНК
Вирус гриппа А <220>
<223>
Вирус гриппа Α (А/7аеб Цаш/1203/2004 (Η5Ν1) ) ген белка 1 мембранного ионного канала и матрикса (И) < 4 00>
2: гКЬУ-КСГВ.
2. Аттенуированный химерный вирус гриппа, содержащий:
(a) упакованный сегмент ΝΑ вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка считывания ΝΑ модифицирована так, что кодирующие эктодомен ΝΑ нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен ΗΝ антигена ΝΏν, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в аттенуированный химерный вирус гриппа;
(b) упакованный сегмент НА вируса гриппа, кодирующий слитый с гемаглютинином белок, в котором открытая рамка считывания НА модифицирована так, что кодирующие эктодомен НА нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен способного к слиянию/связывающегося с рецептором антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется С-концом, так что слитый с гемаглютинином белок экспрессируется и встраивается в аттенуированный химерный вирус гриппа;
(c) упакованный бицистронный сегмент НА вируса гриппа, содержащий:
ί) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок гемаглютинин вируса птичьего гриппа, и ίί) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с гемаглютинином белок, в которой кодирующие эктодомен гемаглютинина нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими белок, содержащий по крайней мере один эпитоп эктодомена протективного антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется с помощью С-конца, так что и гемаглютинин вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и встраиваются в аттенуированный химерный вирус гриппа; или (й) упакованный бицистронный сегмент ΝΑ вируса гриппа, содержащий:
ί) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок нейраминидазу вируса птичьего гриппа, и ίί) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с нейраминидазой белок, в которой кодирующие эктодомен нейраминидазы нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими белок, содержащий по крайней мере один эпитоп эктодомена протективного антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется Ν-концом, так что и нейраминидаза вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и встраиваются в аттенуированный химерный вирус гриппа.
3: ΓΝθν-КСРК/Г-СТ
Фиг. 6
3 сигнап встраивания
Фиг. 1
Η5Ν1 НА
РОКЕ (К Р К К К) К / О ССТ САА АСА САЕ Α(ΕΑ АЕА АЕА ААА АА)Е АСА / ЕЕА
Невирулентный НА
РЕКЕ ( ССТ САА АЕА ЕАЕ А( Удаляющая ПЦР +
I сайт-направленный ▼ мутагенез
Т ) К I Е
С )ЕАЕА /ЕЕА / е Сайт расщепления
Фиг. 2
Невирулентный РОКЕ (
НА ССТ САА АСА САС А(
Сайт-направленный I I I мутагенез 11 1
РОКЕ (
ССТ САЕ СЕЕ ЕАЕ А( ) К / С )С АСА /ССА п ) К I Е )ЕСЕЕ /ЕВА / = Сайт расщепления
Фиг. 3
Фиг. 5
- 60 016217
3. Химерный вирус гриппа по любому из пп.1 или 2, содержащий упакованный сегмент гена Ν81, кодирующий модифицированный белок Ν81, который снижает антагонистическую в отношении клеточного интерферона активность вируса.
4. Химерный вирус гриппа по любому из пп.1 или 2, содержащий сегмент НА, модифицированный удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина.
5. Химерный вирус гриппа по любому из пп.1-4, где химерный вирус гриппа является аттенуированным.
6. Химерный вирус гриппа по любому из пп.1-5, где антигеном является антиген ΝΏν.
7. Химерный вирус гриппа по любому из пп.1-5, где слитый с НА белок либо не содержит аминокислотных остатков эктодомена белка НА, или содержит фрагмент эктодомена белка НА, который не сохраняет активности эктодомена белка НА; или где слитый с ΝΑ белок либо не содержит аминокислотных остатков эктодомена белка ΝΑ, либо содержит фрагмент эктодомена белка ΝΑ, который не сохраняет активности эктодомена белка ΝΑ.
8. Химерный вирус гриппа по любому из пп.1-5, где слитый с НА белок содержит 1-15 остатков эктодомена белка НА вируса гриппа, которые находятся непосредственно рядом с трансмембранным доменом белка НА; или где слитый с ΝΑ белок содержит 1-15 остатков эктодомена белка ΝΑ вируса гриппа, которые непосредственно рядом с трансмембранным доменом белка ΝΑ.
9. Химерный вирус гриппа по любому из пп.1-8, где протективный антиген представляет собой эктодомен ΗΝ антигена ΝΏν.
10. Рекомбинантная ДНК-молекула, кодирующая сегмент ΝΑ или сегмент НА вируса по любому из пп.1-9.
11. Способ получения иммуногенной композиции, включающий следующие стадии:
(a) размножение химерного вируса гриппа по любому из пп.1-9 в яйце с эмбрионом или в клеточной линии, которая чувствительна к инфицированию вирусом гриппа; и (b) сбор потомства вируса, где вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, подходящих для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так что потомство вируса может использоваться для получения иммуногенной композиции.
- 58 016217
12. Химерный вирус псевдочумы птиц (ΝΏν), содержащий упакованный геном, содержащий:
(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый с белком Р белок, имеющий трансмембранный и цитоплазматический домены белка Р и по крайней мере один эпитоп эктодомена протективного антигена инфекционного агента, отличного от ΝΏν, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется С-концом, так что слитый с белком Р белок экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν; или (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый с ΗΝ белок, имеющий трансмембранный и цитоплазматический домены белка ΗΝ и по крайней мере один эпитоп эктодомена протективного антигена инфекционного агента, отличного от ΝΏν, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется Ν-концом, так что слитый с ΗΝ белок экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν, и где инфекционный агент является инфекционным патогеном или антиген не является антигеном парамиксовируса.
13. Химерный ΝΏν по п.12, в котором:
(a) геном содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Р, так что белок Р экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν;
(b) в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый с белком Р белок, заменяет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Р ΝΏν, и слитый с белком Р белок обеспечивает функцию белка Р;
(c) геном содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΗΝ, так что белок ΗΝ экспрессируется и встраивается в химерный ΝΏν; или (б) в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый с ΗΝ белок, заменяет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ΗΝ ΝΏν, и слитый с ΗΝ белок сохраняет функцию белка ΗΝ.
14. Химерный ΝΏν по п.12 или 13, где антиген является эктодоменом антигена гемагглютинина вируса гриппа или эктодоменом антигена нейраминидазы вируса гриппа.
15. Химерный ΝΏν по п.14, в котором вируса гриппа является вирусом птичьего гриппа.
16. Химерный ΝΏν по любому из пп.12-15, в котором трансмембранный и цитоплазматический домен белка слитого с белком Р или слитого с ΗΝ белка происходит из штамма ΝΏν Ьа8о1а.
17. Химерный ΝΏν по любому из пп.12-16, в котором Р белок является генетически модифицирован на сайте расщепления так, что повышается фузогенная активность.
18. Химерный ΝΏν по п.17, в котором генетически модифицированный сайт расщепления включает несколько основных сайтов расщепления.
19. Химерный ΝΏν по любому из пп.12-18, в котором слитый с ΗΝ белок либо не содержит аминокислотных остатков эктодомена белка ΗΝ, либо содержит фрагмент эктодомена белка ΗΝ, который не сохраняет активность эктодомена белка ΗΝ; или где слитый с белком Р белок либо не содержит аминокислотные остатки эктодомена белка Р, либо содержит фрагмент эктодомена белка Р, который не сохраняет активность эктодомена белка Р.
20. Химерный ΝΏν по п.19, где слитый с ΗΝ белок содержит 1-15 остатков эктодомена белка ΗΝ ΝΏν, которые расположены непосредственно рядом с трансмембранным доменом белка ΗΝ; или где слитый с белком Р белок содержит от 1-15 остатков эктодомена белка Р ΝΏν, которые расположены непосредственно рядом с трансмембранным доменом белка Р.
21. Химерный ΝΏν по любому из пп.12-20, в котором последовательность, которая кодирует слитый белок, встроена между генами Р и М в геноме ΝΏν.
22. Химерный ΝΏν по любому из пп.12-21, в котором химерный ΝΏν аттенуирован.
23. Химерный ΝΏν по любому из пп.12-22, в котором остов химерного ΝΏν происходит из ΝΏν штамма Ьа8о1а.
24. Способ получения иммуногенного состава, включающий следующие стадии:
(a) размножение химерного ΝΏν по любому из пп.12-23 в яйце с эмбрионом или в клеточной линии, которая чувствительна к инфицированию ΝΏν; и (b) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адекватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так что потомство вируса может использоваться для получения иммуногенной композиции.
25. Химерный вирус по любому из пп.1-9 или 12-23, где инфекционный агент является инфекционным патогеном.
26. Химерный вирус по любому из пп.1-9, 12-23 или 25, где антиген не является антигеном парамиксовируса.
27. Химерный вирус по любому из пп.1-9, 12-23, 25 или 26, где антиген не является антигеном вируса Сендай.
28. Применение химерного вируса по любому из пп.1-9, 12-23 или 25-27 для получения лекарственного средства для индукции иммунной реакции на один, два или более инфекционных агентов у птиц или человека.
- 59 016217
29. Иммуногенный состав, содержащий химерный вирус по любому из пп.1-9, 12-23 или 25-28.
30. Рекомбинантная молекула ДНК, кодирующая химерный ΝΏν по любому из пп.12-23 или 25-28.
31. Способ индукции иммунного ответа на один, два или более инфекционных агента у птиц или человека, включающий введение птице или человеку иммуногенного состава, содержащего химерный вирус по любому из пп.1-9, 12-23 или 25-28, так что индуцируется иммунный ответ на один, два или более инфекционных агентов.
Шнуклеотидов 10бнуклеотмдов
157 нуклеотидов 28 нуклеотидов
ΝΑ-ΗΝ вирусная РНК « » Химерный белок ΝΑ-ΗΝ 5. сигнап встраивания
4^) Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
EA200801501A 2005-12-02 2006-12-01 Химерные вирусы, представляющие неприродные поверхностные белки, и их применение EA016217B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74183305P 2005-12-02 2005-12-02
US80286406P 2006-05-22 2006-05-22
PCT/US2006/045859 WO2007064802A1 (en) 2005-12-02 2006-12-01 Chimeric viruses presenting non-native surface proteins and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801501A1 EA200801501A1 (ru) 2009-04-28
EA016217B1 true EA016217B1 (ru) 2012-03-30

Family

ID=38092581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801501A EA016217B1 (ru) 2005-12-02 2006-12-01 Химерные вирусы, представляющие неприродные поверхностные белки, и их применение

Country Status (27)

Country Link
US (2) US9387242B2 (ru)
EP (3) EP2251034B1 (ru)
JP (1) JP5603012B2 (ru)
KR (1) KR101492643B1 (ru)
CN (1) CN101365479B (ru)
AP (1) AP2911A (ru)
AU (1) AU2006320490A1 (ru)
CA (1) CA2631812C (ru)
CL (1) CL2006003348A1 (ru)
CR (1) CR10064A (ru)
EA (1) EA016217B1 (ru)
EC (1) ECSP088599A (ru)
ES (2) ES2668464T3 (ru)
GB (1) GB2447187C (ru)
GE (1) GEP20135924B (ru)
HK (1) HK1127731A1 (ru)
HU (2) HUE037460T2 (ru)
IL (1) IL191835A (ru)
MX (1) MX2008007056A (ru)
MY (1) MY147379A (ru)
NO (1) NO20082743L (ru)
NZ (1) NZ595736A (ru)
PL (2) PL2251034T3 (ru)
PT (2) PT2529747T (ru)
SG (1) SG176468A1 (ru)
TW (1) TWI531652B (ru)
WO (1) WO2007064802A1 (ru)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2400445T3 (es) * 1998-06-12 2013-04-09 Mount Sinai School Of Medicine Virus atenuados con cadena de polaridad negativa con actividad antagonista de interferón alterada para uso como vacunas y productos farmacéuticos
WO2006083286A2 (en) 2004-06-01 2006-08-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Genetically engineered swine influenza virus and uses thereof
HUE037460T2 (hu) 2005-12-02 2018-08-28 Icahn School Med Mount Sinai Nem-natív felületi fehérjéket prezentáló kiméra Newcastle disease vírusok és alkalmazásuk
CL2008000747A1 (es) * 2007-03-16 2008-04-25 Wyeth Corp Composicion de vacuna que comprende una primera y una segunda cepa inactivada del virus de la influenza aviar; metodo para vacunar un ave.
CN101801410A (zh) * 2007-09-10 2010-08-11 英特威国际有限公司 预防犬、猫和马流感传染的组合物和方法
MX2011005231A (es) * 2008-11-19 2011-07-29 Avi Mex S A De C V Lab Vacuna recombinante de vector viral inactivado.
EP2987856B1 (en) 2009-02-05 2018-07-25 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
JP2012521786A (ja) 2009-03-30 2012-09-20 モウント シナイ スクール オフ メディシネ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
AU2010254136B2 (en) 2009-05-26 2016-09-29 Mount Sinai School Of Medicine Monoclonal antibodies against influenza virus generated by cyclical administration and uses thereof
US8828406B2 (en) * 2009-07-30 2014-09-09 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza viruses and uses thereof
ATE539148T1 (de) 2009-11-30 2012-01-15 United Cancer Res Inst Neuer klon des geflügelpestvirus, herstellung und anwendung bei der medizinischen behandlung von krebs
JP2013520172A (ja) 2010-02-18 2013-06-06 モウント シナイ スクール オフ メディシネ インフルエンザウイルス疾患の予防及び治療で用いるためのワクチン
US9708373B2 (en) 2010-03-30 2017-07-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccine and uses thereof
EA201490659A1 (ru) 2011-09-20 2014-11-28 Маунт Синай Скул Оф Медсин Вакцины против вируса гриппа и их применения
JP2016508133A (ja) 2012-12-18 2016-03-17 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
NZ711946A (en) 2013-03-14 2020-05-29 Icahn School Med Mount Sinai Newcastle disease viruses and uses thereof
CN107073099B (zh) 2014-02-27 2022-09-27 默沙东公司 用于治疗癌症的联合方法
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
CA2955154C (en) 2014-07-21 2023-10-31 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
MX2017001011A (es) 2014-07-21 2018-05-28 Novartis Ag Tratamiento de cancer de usando un receptor quimerico de antigeno anti-bcma.
US20170209492A1 (en) 2014-07-31 2017-07-27 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
EP3180359A1 (en) 2014-08-14 2017-06-21 Novartis AG Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
ES2791248T3 (es) 2014-08-19 2020-11-03 Novartis Ag Receptor antigénico quimérico (CAR) anti-CD123 para su uso en el tratamiento del cáncer
AU2015317608B2 (en) 2014-09-17 2021-03-11 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
PE20171067A1 (es) 2014-10-14 2017-07-24 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
CA2974699A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
MX2017010908A (es) 2015-02-26 2017-12-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vacuna bivalente contra el virus de gripe porcina.
RU2752918C2 (ru) 2015-04-08 2021-08-11 Новартис Аг Cd20 терапия, cd22 терапия и комбинированная терапия клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (car) k cd19
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
EP3317301B1 (en) 2015-07-29 2021-04-07 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to lag-3
JP6878405B2 (ja) 2015-07-29 2021-05-26 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子を含む組み合わせ治療
BR112018010503A2 (pt) * 2015-11-24 2018-11-13 Commw Scient Ind Res Org ovo de ave, método para replicar um vírus, vírus, método para produzir uma composição de vacina, composição de vacina, ave transgênica, e método para produzir uma ave
KR20180081615A (ko) 2015-11-24 2018-07-16 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 세포 배양물에서의 바이러스 생산
JP2019503349A (ja) 2015-12-17 2019-02-07 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子およびその使用
EP3423482A1 (en) 2016-03-04 2019-01-09 Novartis AG Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
WO2017218624A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
CA3031542A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 University Of Utah Research Foundation Cd229 car t cells and methods of use thereof
TW202340473A (zh) 2016-10-07 2023-10-16 瑞士商諾華公司 利用嵌合抗原受體之癌症治療
JP2020500020A (ja) 2016-11-14 2020-01-09 ノバルティス アーゲー 融合誘導性タンパク質ｍｉｎｉｏｎに関連する組成物、方法、および治療上の使用
WO2018092887A1 (ja) * 2016-11-17 2018-05-24 国立感染症研究所長が代表する日本国 非感染性パラミクソウイルス粒子を用いた感染症ワクチン
US10196616B2 (en) 2017-02-15 2019-02-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Altered avian virus for in-ovo inoculation and methods of use thereof
WO2018170147A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 The Regents Of The University Of California Genome-wide identification of immune evasion functions in a virus
US20200024351A1 (en) 2017-04-03 2020-01-23 Jounce Therapeutics, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Cancer
CA3058652A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
JP7493940B2 (ja) * 2017-05-31 2024-06-03 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 鳥類における形質選択
CN108048476B (zh) * 2017-11-21 2020-09-08 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种制备区分免疫和感染动物h9亚型禽流感疫苗株的方法及应用
CN108018300B (zh) * 2017-11-21 2020-08-28 浙江迪福润丝生物科技有限公司 区分免疫和感染动物h7亚型禽流感疫苗株及其制备方法和应用
WO2019152660A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
SG11202011830SA (en) 2018-06-13 2020-12-30 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2020041309A1 (en) * 2018-08-21 2020-02-27 The Regents Of The University Of Michigan Materials and methods for inhibiting flavivirus infection
WO2020069405A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Novartis Ag Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2020069409A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Novartis Ag Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
EP3938396A1 (en) 2019-03-11 2022-01-19 Jounce Therapeutics, Inc. Anti-icos antibodies for the treatment of cancer
KR102154795B1 (ko) * 2019-10-18 2020-09-22 주식회사 바이오포아 조류 인플루엔자 바이러스 h5n6의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
KR102154794B1 (ko) * 2019-10-18 2020-09-22 주식회사 바이오포아 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
CN114787188A (zh) 2019-11-05 2022-07-22 震动疗法股份有限公司 用抗pd-1抗体治疗癌症的方法
US11975026B2 (en) 2019-11-26 2024-05-07 Novartis Ag CD19 and CD22 chimeric antigen receptors and uses thereof
CN111117970B (zh) * 2020-01-20 2020-11-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种识别n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体及其应用
JP2023524990A (ja) * 2020-05-07 2023-06-14 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する組換えニューカッスル病ウイルス及びその使用
WO2021229270A1 (es) 2020-05-13 2021-11-18 Laboratorio Avi-Mex, S.A. De C.V. Vacuna recombinante contra covid-19 en vector viral
CN112326963B (zh) * 2020-11-09 2024-02-06 扬州大学 真核表达的A型流感病毒PB2cap蛋白的应用
US20240033358A1 (en) 2020-11-13 2024-02-01 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
PE20210318A1 (es) * 2021-01-08 2021-02-16 Farm Veterinarios S A C Composicion inmunogenica viva recombinante que comprende el virus de la enfermedad de newcastle (ndv) que expresa la subunidad s1 y el rbd de la proteina spike del sars-cov-2
CN113069540B (zh) * 2021-03-15 2022-02-22 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种基于流感病毒载体的新型冠状病毒疫苗及其制备方法
TW202307210A (zh) 2021-06-01 2023-02-16 瑞士商諾華公司 Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途
AU2023231285A1 (en) * 2022-03-10 2024-07-25 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Recombinant newcastle disease viruses and immunogenic compositions for use in preventing covid-19

Family Cites Families (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4693981A (en) 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
US5106619A (en) 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
GB8703696D0 (en) 1987-02-18 1987-03-25 Oxford J S Influenza vaccine
DE3922444A1 (de) 1988-03-01 1991-01-10 Deutsches Krebsforsch Virusmodifizierte tumorvakzine fuer die immuntherapie von tumormetastasen
DE3806565A1 (de) 1988-03-01 1989-09-14 Deutsches Krebsforsch Virusmodifizierte tumorvakzinen fuer die immuntherapie von tumormetastasen
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US6001634A (en) 1989-08-28 1999-12-14 Palese; Peter Recombinant negative strand RNA viruses
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6887699B1 (en) 1990-05-22 2005-05-03 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
DE69333856T2 (de) 1992-04-14 2006-05-18 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Gentechnologisch abgeschwächter Virus
PT1314431E (pt) 1993-04-30 2008-10-24 Wellstat Biologics Corp Composições purificadas de vírus da doença de newcastle
PT702085E (pt) 1994-07-18 2004-04-30 Karl Klaus Conzelmann Virus de arn de cadeia negativa nao segmentada infeccioso recombinante
US6300090B1 (en) 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
US5716821A (en) 1994-09-30 1998-02-10 Uab Research Foundation Prevention and treatment of respiratory tract disease
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
EP1709970A1 (en) 1995-04-27 2006-10-11 Abgenix, Inc. Human antibodies against EGFR, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
ATE181112T1 (de) 1995-08-09 1999-06-15 Schweiz Serum & Impfinst Dem genom von minussträngigen rna-viren entsprechende cdna und verfahren zur herstellung von infektiösen minussträngigen rna-viren
CA2230033C (en) 1995-09-27 2010-01-26 Peter L. Collins Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
US6190901B1 (en) 1995-10-17 2001-02-20 Wayne State University Chicken interleukin-15 and uses thereof
BR9710363A (pt) 1996-07-15 2000-01-11 Us Gov Health & Human Serv "vìrus sincicial respirátorio recombinante infeccioso isolado, partìcula do mesmo, processos para estimular o sistema imunológico de um indivìduo para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório e para produzir uma partìcula de vìrus sincicial respiratório recombinante, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante composição e ceta de vìrus sincicial respiratório recombinante"
AU4427897A (en) 1996-09-27 1998-04-17 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for att enuation in viruses of the order designated mononegavirales
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
US5891705A (en) 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
TR199902553T2 (xx) 1997-04-14 2000-03-21 Micromet Gesellschaft F�R Biomedizinische Forschung Mbh �nsan v�cuduna kar�� antijen resept�rlerinin �retimi i�in yeni metod ve kullan�mlar�.
US6884414B1 (en) 1997-04-30 2005-04-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CA2291216A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences
PT1012244E (pt) 1997-07-11 2007-08-21 Univ Yale ''rabdovírus com revestimentos remanipulados''
AU9389998A (en) 1997-09-19 1999-04-12 American Cyanamid Company Attenuated respiratory syncytial viruses
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
ATE371372T1 (de) 1997-10-09 2007-09-15 Wellstat Biologics Corp Behandlung von neoplasmen mit interferon- empfindlichen, klonalen viren
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
CA2334857C (en) 1998-06-12 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Interferon inducing genetically engineered attenuated viruses
ES2400445T3 (es) 1998-06-12 2013-04-09 Mount Sinai School Of Medicine Virus atenuados con cadena de polaridad negativa con actividad antagonista de interferón alterada para uso como vacunas y productos farmacéuticos
EP0974660A1 (en) 1998-06-19 2000-01-26 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
US7052685B1 (en) 1998-10-15 2006-05-30 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for treatment of cutaneous T-cell lymphoma
AT407958B (de) 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
EP1035209A1 (en) 1999-03-06 2000-09-13 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Stable recombinant influenza viruses free of helper viruses
DK1185615T3 (da) 1999-04-06 2007-11-05 Wisconsin Alumni Res Found Rekombinante influenzavirus til vacciner og genterapi
HUP0302278A3 (en) 1999-04-15 2011-01-28 Pro Virus Treatment of neoplasms with viruses
US20030224017A1 (en) 2002-03-06 2003-12-04 Samal Siba K. Recombinant Newcastle disease viruses useful as vaccines or vaccine vectors
US7244558B1 (en) 1999-05-05 2007-07-17 University Of Maryland Production of novel Newcastle disease virus strains from cDNAs and improved live attenuated Newcastle disease vaccines
US7820182B2 (en) * 1999-07-09 2010-10-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated, human-bovine chimeric respiratory syncytial viruses for use in immunogenic compositions
ATE353370T1 (de) 1999-07-14 2007-02-15 Sinai School Medicine In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren
AU7607900A (en) 1999-09-22 2001-04-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Therapeutic methods and compositions using viruses of the recombinant paramyxoviridae family
US6896881B1 (en) 1999-09-24 2005-05-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Therapeutic methods and compositions using viruses of the recombinant paramyxoviridae family
JP2003525222A (ja) 2000-01-20 2003-08-26 ウニベルジテート チューリッヒ インスティチュート フューア メディツィニーチェ ビロロギー Ｉｌ−１２をコードする核酸分子の腫瘍内投与
WO2001064860A2 (en) 2000-03-02 2001-09-07 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Recombinant influenza a viruses
AU2001257001A1 (en) 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
ES2295175T3 (es) 2000-06-23 2008-04-16 Wyeth Holdings Corporation Ensamblaje de particulas similares al virus (vlp) de la gripe de tipo salvaje y quimericas.
US20040241139A1 (en) 2000-07-20 2004-12-02 Gerd Hobom Recombinant influenza viruses with bicistronic vRNAs coding for two genes in tandem arrangement
US6818444B2 (en) 2000-08-04 2004-11-16 Heska Corporation Canine and feline proteins, nucleic acid molecules and uses thereof
CA2427578C (en) 2000-11-02 2011-09-06 Akzo Nobel N.V. A recombinant newcastle disease virus nucleoprotein mutant as a marker vaccine
FR2823222B1 (fr) 2001-04-06 2004-02-06 Merial Sas Vaccin contre le virus de la fievre du nil
WO2002102404A1 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Institut National De La Recherche Agronomique Uses of cytokines
JP2005518209A (ja) 2002-02-21 2005-06-23 マウント シナイ スクール オブ メディシン 組換えマイナス鎖ウイルスｒｎａ発現系およびワクチン
AU2003223089A1 (en) 2002-04-29 2003-11-17 Hadasit Medical Research Services And Development Company Ltd. Compositions and methods for treating cancer with an oncolytic viral agent
CA2488270A1 (en) 2002-06-03 2003-12-11 Dnavec Research Inc. Paramyxoviral vectors encoding antibodies, and uses thereof
AU2003250575A1 (en) 2002-08-07 2004-02-25 Mmagix Technology Limited Apparatus, method and system for a synchronicity independent, resource delegating, power and instruction optimizing processor
SE0203159D0 (sv) 2002-10-25 2002-10-25 Electrolux Ab Handtag till ett motordrivet handhållet verktyg
US9068234B2 (en) 2003-01-21 2015-06-30 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression
US20040197312A1 (en) 2003-04-02 2004-10-07 Marina Moskalenko Cytokine-expressing cellular vaccine combinations
WO2005085282A1 (en) 2004-02-27 2005-09-15 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Il-15 binding site for il15-ralpha and specific il-15 mutants having agonists/antagonists activity
AU2005248377B2 (en) 2004-05-25 2011-03-24 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
NZ581958A (en) 2004-11-12 2011-01-28 Bayer Schering Pharma Ag Recombinant newcastle disease virus comprising a transgene encoding a prodrug-converting enzyme or protease for use in the treatment of cancer
PL3263581T3 (pl) 2005-05-17 2021-05-04 University Of Connecticut Kompozycje i sposoby immunomodulacji w organizmie
US20090214590A1 (en) 2005-07-08 2009-08-27 Wayne State University Virus Vaccines Comprising Envelope-Bound Immunomodulatory Proteins and Methods of Use Thereof
EP1777294A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
HUE037460T2 (hu) 2005-12-02 2018-08-28 Icahn School Med Mount Sinai Nem-natív felületi fehérjéket prezentáló kiméra Newcastle disease vírusok és alkalmazásuk
AU2007207785B2 (en) 2006-01-13 2013-11-14 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Codon optimized IL- 15 and IL- 15R-alpha genes for expression in mammalian cells
MX2008011728A (es) 2006-03-15 2008-12-10 Intervet Int Bv Virus de enfermedad de newcastle recombinante que expresa hemaglutinina h5 de virus de influenza aviar.
EP2007423A2 (en) 2006-04-05 2008-12-31 Pfizer Products Incorporated Ctla4 antibody combination therapy
US20090175826A1 (en) 2006-06-05 2009-07-09 Elankumaran Subbiah Genetically-engineered newcastle disease virus as an oncolytic agent, and methods of using same
CA2658584A1 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Ottawa Health Research Institute Staged immune-response modulation in oncolytic therapy
ES2654303T3 (es) 2007-05-04 2018-02-13 University Health Network Inmunoterapia de IL-12 contra el cáncer
EP3305805A1 (en) 2007-05-11 2018-04-11 Altor BioScience Corporation Fusion molecules and il-15 variants
NZ600758A (en) 2007-06-18 2013-09-27 Merck Sharp & Dohme Antibodies to human programmed death receptor pd-1
NZ599338A (en) 2007-06-27 2013-11-29 Marinepolymer Tech Inc Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
EP2085092A1 (en) 2008-01-29 2009-08-05 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Attenuated oncolytic paramyxoviruses encoding avian cytokines
EA023148B1 (ru) 2008-08-25 2016-04-29 Эмплиммьюн, Инк. Композиции на основе антагонистов pd-1 и их применение
WO2010042433A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of cd137 antibody and ctla-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
CN101787373B (zh) 2009-01-23 2013-06-19 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种携带外源基因在包装细胞中高效生产的重组病毒载体、其构建方法及其用途
EP2987856B1 (en) 2009-02-05 2018-07-25 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
US20100297072A1 (en) 2009-05-19 2010-11-25 Depinho Ronald A Combinations of Immunostimulatory Agents, Oncolytic Virus, and Additional Anticancer Therapy
AU2010282280B2 (en) 2009-08-14 2016-06-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of IL-15 to increase thymic output and to treat lymphopenia
PL2482849T3 (pl) 2009-09-30 2018-11-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Skojarzona immunoterapia w leczeniu nowotworu
WO2011119628A2 (en) 2010-03-23 2011-09-29 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for self-adjuvanting vaccines against microbes and tumors
WO2012000188A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Tot Shanghai Rd Center Co., Ltd. Recombinant tumor vaccine and method of producing such
KR102070098B1 (ko) 2010-09-21 2020-01-28 알토 바이오사이언스 코포레이션 다량체성 아이엘 15 용해성 융합 분자 및 그의 제조 및 사용 방법
WO2012142529A2 (en) 2011-04-15 2012-10-18 Genelux Corporation Clonal strains of attenuated vaccinia viruses and methods of use thereof
EP2537933A1 (en) 2011-06-24 2012-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) An IL-15 and IL-15Ralpha sushi domain based immunocytokines
PL3351261T3 (pl) 2011-10-11 2021-12-06 Universität Zürich Lek złożony zawierający IL-12 i środek do blokowania cząsteczek hamujących komórki T w terapii nowotworów
AU2013211871B2 (en) 2012-01-25 2017-12-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Biomarkers and combination therapies using oncolytic virus and immunomodulation
EP2669381A1 (en) 2012-05-30 2013-12-04 AmVac AG Method for expression of heterologous proteins using a recombinant negative-strand RNA virus vector comprising a mutated P protein
WO2014047350A1 (en) 2012-09-20 2014-03-27 Morningside Technology Ventures Ltd. Oncolytic virus encoding pd-1 binding agents and uses of the same
NZ630790A (en) 2012-10-24 2016-11-25 Admune Therapeutics Llc Il-15r alpha forms, cells expressing il-15r alpha forms, and therapeutic uses of il-15r alpha and il-15/il-15r alpha complexes
NZ711946A (en) 2013-03-14 2020-05-29 Icahn School Med Mount Sinai Newcastle disease viruses and uses thereof
KR20150145260A (ko) 2013-04-19 2015-12-29 싸이튠 파마 감소된 혈관 누출 증후근에 대한 사이토카인 유도체 치료
HRP20212023T1 (hr) 2013-08-08 2022-04-01 Cytune Pharma Modulokini temeljeni na il-15 i il-15ralpha sushi domeni
PL3030262T3 (pl) 2013-08-08 2020-07-27 Cytune Pharma Złożona kompozycja farmaceutyczna
US10519426B2 (en) 2013-09-03 2019-12-31 Medimmune Limited Compositions featuring an attenuated Newcastle disease virus and methods of use for treating neoplasia
CN107073099B (zh) 2014-02-27 2022-09-27 默沙东公司 用于治疗癌症的联合方法
EP2915569A1 (en) 2014-03-03 2015-09-09 Cytune Pharma IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method
EP3174974B1 (en) 2014-07-29 2020-05-20 Novartis AG Il-15 and il-15ralpha heterodimer dose escalation regimens for treating conditions
SG11201702295UA (en) 2014-09-22 2017-04-27 Intrexon Corp Improved therapeutic control of heterodimeric and single chain forms of interleukin-12
WO2016094377A1 (en) 2014-12-09 2016-06-16 Merck Sharp & Dohme Corp. System and methods for deriving gene signature biomarkers of response to pd-1 antagonists
CN106166294A (zh) 2015-05-18 2016-11-30 国科丹蓝生物科技（北京）有限公司 一种用于术前介入放疗治疗肿瘤的化合物
EP3317301B1 (en) 2015-07-29 2021-04-07 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to lag-3
JP6878405B2 (ja) 2015-07-29 2021-05-26 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子を含む組み合わせ治療
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
CA3001590A1 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12
BR112018008911A2 (pt) 2015-11-09 2018-11-27 Immune Design Corp composições compreendendo vetores lentivirais que expressam il-12 e métodos de uso das mesmas
JP7038065B2 (ja) 2016-01-08 2022-03-17 レプリミュン リミテッド 腫瘍溶解性ウイルス株
CN109069624A (zh) 2016-01-15 2018-12-21 瑞美控股有限责任公司 癌症的免疫治疗
US10344067B2 (en) 2016-02-25 2019-07-09 Deutsches Krebsforschungszentrum RNA viruses expressing IL-12 for immunovirotherapy

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Maeda et al., Live Bivalent Vaccine for Parainfluenza and Influenza Virus Infections, Journal of Virology, June 2005, Vol. 79, No. 11, pages 6674-6679. *
Peeters et al., Generation of a recombinant chimeric Newcastle disease virus vaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals, Vaccine, 2001, Vol. 19, pages 1616-1627. *
Schickli et al., Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates, Phil. Trans. R. Soc. Lond., 2001, Vol. 356, pages 1965-1973. *
Zimmer et al., A Chimeric Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein Functionally Replaces the F and HN Glycoproteins in Recombinant Sendai Virus, Journal of Virology, August 2005, Vol. 79, No. 16, pages 10467-10477. *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2631812C (en) 2023-08-29
PT2529747T (pt) 2018-05-09
TWI531652B (zh) 2016-05-01
MX2008007056A (es) 2008-11-12
PT2251034T (pt) 2018-05-22
GB2447187A8 (en) 2008-09-10
IL191835A0 (en) 2008-12-29
CN101365479B (zh) 2013-06-26
AP2008004504A0 (en) 2008-06-30
PL2251034T3 (pl) 2018-07-31
ES2668464T3 (es) 2018-05-18
CL2006003348A1 (es) 2008-02-22
EP1962893A4 (en) 2010-04-21
EA200801501A1 (ru) 2009-04-28
HUE037460T2 (hu) 2018-08-28
JP5603012B2 (ja) 2014-10-08
GB2447187B (en) 2011-04-27
BRPI0619133A2 (pt) 2011-09-13
AP2911A (en) 2014-05-31
CN101365479A (zh) 2009-02-11
KR101492643B1 (ko) 2015-02-12
GB0811526D0 (en) 2008-07-30
US20120122185A1 (en) 2012-05-17
GB2447187A (en) 2008-09-03
PL2529747T3 (pl) 2018-08-31
EP2529747B1 (en) 2018-02-14
CR10064A (es) 2008-09-08
KR20080098359A (ko) 2008-11-07
NZ595736A (en) 2013-05-31
IL191835A (en) 2015-09-24
WO2007064802A1 (en) 2007-06-07
ECSP088599A (es) 2008-08-29
US10308913B2 (en) 2019-06-04
SG176468A1 (en) 2011-12-29
EP1962893A1 (en) 2008-09-03
ES2668018T3 (es) 2018-05-16
US20170037379A1 (en) 2017-02-09
CA2631812A1 (en) 2007-06-07
US9387242B2 (en) 2016-07-12
EP2251034B1 (en) 2018-02-14
EP2251034A1 (en) 2010-11-17
EP2529747A3 (en) 2013-01-23
AU2006320490A1 (en) 2007-06-07
HK1127731A1 (en) 2009-10-02
HUE037464T2 (hu) 2018-08-28
GB2447187C (en) 2015-02-04
TW200801187A (en) 2008-01-01
MY147379A (en) 2012-11-30
EP2529747A2 (en) 2012-12-05
GEP20135924B (en) 2013-10-10
NO20082743L (no) 2008-08-12
JP2009518007A (ja) 2009-05-07
EP2251034A8 (en) 2011-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016217B1 (ru) Химерные вирусы, представляющие неприродные поверхностные белки, и их применение
JP2022091775A (ja) インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
JP4430942B2 (ja) インフルエンザウイルスベクターのパッケージングのためのシグナル
JP2019141062A (ja) インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
JP2018166515A (ja) インフルエンザウイルス疾患の予防及び治療で用いるためのワクチン
US20230310583A1 (en) Recombinant newcastle disease virus expressing sars-cov-2 spike protein and uses thereof
Qin et al. Identification of novel T-cell epitopes on infectious bronchitis virus N protein and development of a multi-epitope vaccine
JP2018531578A (ja) 感染性疾患の予防及び／又は処置並びに腫瘍性疾患の処置のための弱毒化インフルエンザベクター
JP2021536228A (ja) ヘマグルチニン（ｈａ）タンパク質内の非ドミナントエピトープに対する免疫応答を誘起するためのベクター
JP6975233B2 (ja) 組換えウイルス、それを含む組成物、及びその使用
Le et al. Induction of influenza-specific mucosal immunity by an attenuated recombinant Sendai virus
EA024262B1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА ГРИППА, СТАБИЛЬНОГО ПРИ НИЗКИХ pH
Yang et al. Appropriate amount of W protein of avian avulavirus 1 benefits viral replication and W shows strain-dependent subcellular localization
WO2023196759A2 (en) Recombinant newcastle disease viruses and immunogenic compositions for use in immunizing against sars-cov-2 omicron variant
JP2013535214A (ja) 改変された伝染性喉頭気管炎ウイルス（ｉｌｔｖ）およびその使用
US20240199705A1 (en) Chimeric newcastle disease virus expressing apmv hn and f proteins
KR102154795B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 h5n6의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
JP4456169B2 (ja) インフルエンザウイルスベクターのパッケージングのためのシグナル
US20220133876A1 (en) Novel recombinant influenza virus having immune and therapeutic responses to heterologous influenza a virus, and genetic vector and therapeutic vaccine comprising same
KR101484305B1 (ko) Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스
US10973903B2 (en) NS1 truncated virus for the development of canine influenza vaccines
Sun et al. Protective efficacy of a novel recombinant influenza virus carrying partial human metapneumovirus F protein epitopes
PENG MURINE MODELS TO STUDY IMMUNITY AND IMMUNISATION AGAINST RESPIRATORY VIRAL PATHOGENS
BRPI0619133B1 (pt) Vírus quimérico da doença de newcastle, composição imunogênica, método para produzir uma formulação imunogênica, e, uso de um vírus quimérico