KR101484305B1 - Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스 - Google Patents

Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스 Download PDF

Info

Publication number
KR101484305B1
KR101484305B1 KR20060022670A KR20060022670A KR101484305B1 KR 101484305 B1 KR101484305 B1 KR 101484305B1 KR 20060022670 A KR20060022670 A KR 20060022670A KR 20060022670 A KR20060022670 A KR 20060022670A KR 101484305 B1 KR101484305 B1 KR 101484305B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
ser
leu
ile
virus
Prior art date
Application number
KR20060022670A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070092474A (ko
Inventor
크리스토퍼 더블류. 올슨
가브리엘 에이. 랜돌트
알렉산더 아이. 캐러신
Original Assignee
위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 filed Critical 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority to KR20060022670A priority Critical patent/KR101484305B1/ko
Publication of KR20070092474A publication Critical patent/KR20070092474A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101484305B1 publication Critical patent/KR101484305B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03B—APPARATUS OR ARRANGEMENTS FOR TAKING PHOTOGRAPHS OR FOR PROJECTING OR VIEWING THEM; APPARATUS OR ARRANGEMENTS EMPLOYING ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ACCESSORIES THEREFOR
    • G03B17/00—Details of cameras or camera bodies; Accessories therefor
    • G03B17/56—Accessories
    • G03B17/561—Support related camera accessories
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F16—ENGINEERING ELEMENTS AND UNITS; GENERAL MEASURES FOR PRODUCING AND MAINTAINING EFFECTIVE FUNCTIONING OF MACHINES OR INSTALLATIONS; THERMAL INSULATION IN GENERAL
    • F16M—FRAMES, CASINGS OR BEDS OF ENGINES, MACHINES OR APPARATUS, NOT SPECIFIC TO ENGINES, MACHINES OR APPARATUS PROVIDED FOR ELSEWHERE; STANDS; SUPPORTS
    • F16M11/00—Stands or trestles as supports for apparatus or articles placed thereon Stands for scientific apparatus such as gravitational force meters
    • F16M11/20—Undercarriages with or without wheels
    • F16M11/24—Undercarriages with or without wheels changeable in height or length of legs, also for transport only, e.g. by means of tubes screwed into each other
    • F16M11/26—Undercarriages with or without wheels changeable in height or length of legs, also for transport only, e.g. by means of tubes screwed into each other by telescoping, with or without folding
    • F16M11/32—Undercarriages for supports with three or more telescoping legs
    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03B—APPARATUS OR ARRANGEMENTS FOR TAKING PHOTOGRAPHS OR FOR PROJECTING OR VIEWING THEM; APPARATUS OR ARRANGEMENTS EMPLOYING ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ACCESSORIES THEREFOR
    • G03B37/00—Panoramic or wide-screen photography; Photographing extended surfaces, e.g. for surveying; Photographing internal surfaces, e.g. of pipe
    • G03B37/02—Panoramic or wide-screen photography; Photographing extended surfaces, e.g. for surveying; Photographing internal surfaces, e.g. of pipe with scanning movement of lens or cameras
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N23/00—Cameras or camera modules comprising electronic image sensors; Control thereof
    • H04N23/50—Constructional details

Abstract

본 발명은 단리된 H3 말 인플루엔자 A 바이러스 및, 바이러스 및 유전자 또는 그들의 단백질의 제조 및 사용방법을 제공한다.
말 인플루엔자, 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 핵산 절편

Description

Ｈ3 말 인플루엔자 Ａ 바이러스{H3 EQUINE INFLUENZA A VIRUS}
도 1. A/말/위스콘신/1/03의 서열. 서열 1-8, 17 및 18은 A/말/위스콘신/1/03의 각각 HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M1, NS1, M2 및 NS2에 대한 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 9-16은 A/말/위스콘신/1/03의 각각 HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M1, NS1, M2 및 NS2에 대한 mRNA 센스 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 2. A/말/뉴욕/99 (서열 19) 및 A/말/위스콘신/1/03 (서열 20)의 HA-1의 서열 정렬.
정부의 권리 성명
본 발명은 적어도 부분적으로, 미 합중국 정부로부터의 보조금으로 제작되었다 (미 합중국 농무부 보조금 2001-35204-10184). 미 합중국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 가질 수 있다.
인플루엔자는 말을 비롯한 몇몇 포유류의 주요 호흡기 질병이며, 매년 실질적인 질병률 및 경제적 손실을 초래한다. 또한, 인플루엔자 바이러스 감염은 몇몇 조류에 있어 죽음에 이르는 전신성 질병을 유발할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 게놈의 절편 특성으로, 2종 이상의 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포 내에서의 바이러스 복제 중 절편의 재배열이 고려된다. 유전자의 돌연변이 및 표류를 수반하는 절편의 재배열은 시간에 따라 인플루엔자 바이러스의 무수한 분기 균주를 발생시킬 수 있다. 신규 균주는 헤마글루티닌 (HA) 및(또는) 뉴라미니다제 (NA) 단백질 내의 항원성 변종을 나타내며, 특히 HA 단백질에 관한 유전자 코딩은 높은 비율의 변이성을 가진다. 현재 인플루엔자를 막는 지배적인 실천 방법은 백신 접종이다. 가장 일반적으로는, 바이러스 백신 전체가 사용된다. 인플루엔자 HA 단백질이 숙주의 바이러스에 대한 방어적 면역 반응을 위한 주된 표적 항원이며 고도로 변이적이므로, 최근 발발한 것들과 결합된 바이러스 내 HA 항원의 인플루엔자 바이러스의 단리 및, 식별 및 특징 규명은 백신 제조에 있어 중요하다. 유행 및 예측에 기반하여, 백신은 지배적이고도 예상되는 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 방어적 면역 반응을 자극하도록 설계된다 (Park et al., 2004).
3종의 인플루엔자 바이러스의 일반 유형인 유형 A, 유형 B 및 유형 C가 있는데, 이들은 그들의 내부 단백질간의 혈청학상 교차반응성의 부재에 의해 정의된다. 인플루엔자 유형 A 바이러스는 그들의 당단백질인 HA 및 NA 단백질의 항원적 및 유전적 차이에 기반하여, 아형으로 더욱 분류된다. 알려진 모든 HA 및 NA 아형 (H1 내지 H15 및 N1 내지 N9)는 물새로부터 단리되었는데, 물새는 인플루엔자의 천연 저장소로 작용하는 것으로 여겨진다. H7N7 및 H3N8 유형 A 바이러스가 말 인플루엔자의 가장 일반적인 원인이며, 이들 아형은 일반적으로 말 인플루엔자 백신 내로 혼입된다.
그러므로, 예를 들면 백신 제조를 위해 새로운 인플루엔자 바이러스 단리물을 단리할 계속적인 필요성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 치명적인 폐렴으로 죽은 망아지로부터 단리된 H3 말 유래 인플루엔자 유형 A 바이러스를 제공하며, 상기 바이러스는 HA의 78번 및 159번 잔기에서의 특징적인 치환을 가지는데 (위치의 번호매김은 15개의 아미노산 신호 펩티드가 부족한 성숙 단백질에서 행해짐), 즉, HA의 78번 위치의 잔기는 발린이 아니며, 159번 위치의 잔기는 아스파라긴이 아니다. 일실시태양에서, 본 발명의 단리된 H3 인플루엔자 A 바이러스는 78번 잔기에서의 보존성 치환과 (예를 들면 발린을 알라닌으로 치환) 159번 잔기에서의 비-보존성 치환 (예를 들면 아스파라긴을 세린으로 치환)을 가진다. 일실시태양에서, 본 발명의 단리된 H3 인플루엔자 A 바이러스는 29번 위치에 메티오닌이 아닌 잔기를 (예를 들면, 비-보존성 치환), 54번 위치에 리신이 아닌 잔기를 (예를 들면, 비-보존성 치환), 83번 위치에 세린이 아닌 잔기를 (예를 들면, 비-보존성 치환), 92번 위치에 아스파라긴이 아닌 잔기를 (예를 들면, 비-보존성 치환), 222번 위치에 루이신이 아닌 잔기를 (예를 들면, 비-보존성 치환), 272번 위치에 알라닌이 아닌 잔기를 (예를 들면, 비-보존성 치환), 및(또는) 328번 위치에 트레오닌이 아닌 잔기를 (예를 들면, 비-보존성 치환) 가진다. 보존성 아미노산 치환은 유사 측쇄를 가진 잔기의 상호 교환성과 관련되어 있다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 일군의 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신이며; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 일군의 아미노산은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 일군의 아미노산은 아스파라긴 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 갖는 일군의 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기 측쇄를 갖는 일군의 아미노산은 리신,아르기닌 및 히스티딘이며; 황-함유 측쇄를 갖는 일군의 아미노산은 시스테인 및 메티오닌이다. 일실시태양에서, 보존성 아미노산 치환 군은 트레오닌-발린-루이신-이소루이신-알라닌; 페닐알라닌-티로신; 리신-아르기닌; 알라닌-발린; 글루타믹-아스파르틱; 및 아스파라긴-글루타민이다.
일실시태양에서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는, HA가 78번 및 159번 잔기에서 특징적인 치환을 갖는 한, 서열 1 내지 8, 17, 및(또는) 18 중 하나와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 바이러스성 단백질 (폴리펩티드)를 포함한다. 참조 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은, 참조 서열에 대해 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 절단, 예를 들면 상응하는 전장(full-length) 성숙 바이러스성 단백질과 실질적으로 동일한 활성을 갖거나 실질적으로 동일한 수준으로 발현될 수 있는 절단된 바이러스성 단백질을 유발하는 것들, 삽입, 예를 들면 상응하는 전장 성숙 바이러스성 단백질과 실질적으로 동일한 활성을 갖거나 실질적으로 동일한 수준으로 발현될 수 있는 변형 바이러스성 단백질을 유발하는 것들, 및(또는) 치환, 예를 들면 참조 서열과 실질적으로 동일한 활성을 갖거나 실질적으로 동일한 수준으로 발현될 수 있는 바이러스성 단백질을 유발하는 것들을 수반하는 서열을 포함할 수 있다. 일실 시태양에서, 참조 서열의 것들과 일치하지 않는 하나 이상의 잔기가, 하나 이상의 치환이 그 치환을 수반하는 단백질의 발현 수준 또는 활성, 및(또는) 그 단백질을 갖는 바이러스로 감염된 세포로부터 얻어지는 바이러스의 수준을 실질적으로 개조하지 않는 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 동일한 발현 수준 또는 활성"은 약 80%, 90% 이상인 검출 가능한 단백질 수준, 약 30%, 50%, 90% 이상, 예를 들면 최대 100% 이상인 단백질 수준 또는 측정 가능한 활성, 서열 1 내지 8, 17 및 18 중 하나에 상응하는 전장 성숙 폴리펩티드의 활성을 포함한다. 일실시태양에서, 바이러스는 하나 이상, 예를 들면 2, 5, 10, 15, 20 이상의 아미노산 치환, 예를 들면 서열 1 내지 8, 17 및 18을 갖는 전장 성숙 형태의 폴리펩티드의 최대 5%의 잔기의 보존성 치환을 수반하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 단리된 바이러스는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 바이러스 단리물, 예를 들면 백신 내의 다른 인플루엔자 바이러스 단리물과 함께 사용되어 유전자 치료 및(또는) 진단에 있어서의 바이러스-특이적 항혈청을 키울 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 본 발명의 바이러스에 감염된 숙주 세포 및, 그 바이러스에 특이적인 단리된 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 하나 이상의 바이러스의 단백질에 상응하는 핵산 절편, 서열 1 내지 8, 17 및 18 중 하나에 의해 코딩되는 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 수준 또는 활성을 갖는 바이러스성 단백질의 핵산 절편의 일부, 또는 핵산 분자의 상보체(complement)를 포함하는 단리된 핵산 분자 (폴리뉴클레오티드)를 제공한다. 일실시태양에서, 단리된 핵산 분자는 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 예를 들면 서열 1 내지 8, 17 및 18 중 하나를 갖는 폴리펩티드에 대해 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98% 또는 99%의 인접 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 일실시태양에서, 단리된 핵산 분자는 서열 9 내지 16 중 하나와 실질적으로 동일한, 예를 들면 50% 이상, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 인접 핵산 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그들의 상보체를 포함하며, 서열 1 내지 8, 17 및 18 중 하나를 갖는 폴리펩티드에 대해 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98% 또는 99%의 인접 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는, 인플루엔자 단백질을 발현하기 위해 (예를 들면 재조합 단백질 백신 제조를 위해, 또는 항혈청을 키우기 위해), 진단 또는 vRNA 제조를 위한 핵산 백신으로서, 키메라 유전자 제조를 위해 (예를 들면 다른 인플루엔자 바이러스 유전자를 비롯한 다른 바이러스성 유전자와 함께), 및(또는) 재조합 바이러스 제조를 위해 (예를 들면 본원에 참조로 포함된 Neumann et al. (1999) 참조) 벡터 내에서 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 단리된 바이러스성 폴리펩티드, 재조합 바이러스 및 본 발명의 핵산 분자 및(또는) 재조합 바이러스와 접촉하는 숙주 세포, 또한 예를 들면 바이러스에 감염되거나, 단리된 바이러스성 폴리펩티드 또는 하나 이상의 바이러스성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 면역화된 포유류로부터 얻어지는 단리된 바이러스-특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 하기의 단리된 벡터들 중의 하나 이상을 제공하는데, 예를 들어, 하나 이상의 단리된 인플루엔자 바이러스 벡터, 또는 하나 이상의 벡터를 함유하는 조성물을 제공한다: 전사 종결 서열에 연결된 서열 5와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 PA에 대한 인플루엔자 바이러스 PA DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터; 전사 종결 서열에 연결된 서열 3과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 PB1에 대한 인플루엔자 바이러스 PB1 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터; 전사 종결 서열에 연결된 서열 4와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 PB2에 대한 인플루엔자 바이러스 PB2 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터; 전사 종결 서열에 연결된 서열 1과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 HA에 대한 인플루엔자 바이러스 HA DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터; 전사 종결 서열에 연결된 서열 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 NP에 대한 인플루엔자 바이러스 NP DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터; 전사 종결 서열에 연결된 서열 2와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 NA에 대한 인플루엔자 바이러스 NA DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터; 전사 종결 서열에 연결된 서열 7 (M1) 및(또는) 서열 17 (M2)와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 M에 대한 인플루엔자 바이러스 M DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터; 전사 종결 서열에 연결된 서열 8 (NS1) 및(또는) 서열 18 (NS2)와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 NS에 대한 인플루엔자 바이러스 NS DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터. 임의로, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터 대신에 두 개의 벡터, 예를 들어 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M1 DNA에 작동가능하 게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M2 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터가 채택될 수 있다. 임의로, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터 대신에 두 개의 벡터, 예를 들어 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS1 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS2 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 벡터가 채택될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 벡터는 적어도 5' 및 3' 비-코딩 인플루엔자 바이러스 서열들을 갖는 것이다.
따라서, 본 발명은 벡터, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 단백질 및(또는) 인플루엔자 vRNA(천연 및 재조합 vRNA)를 코딩하는 플라스미드를 제공한다. 따라서, 본 발명의 벡터는 인플루엔자 바이러스 단백질 (센스) 또는 vRNA (안티센스)를 코딩할 수 있다. 임의의 적절한 프로모터 또는 전사 종결 서열이 단백질 또는 펩티드 (예: 바이러스성 단백질 또는 펩티드, 비바이러스성 병원체의 단백질 또는 펩티드, 또는 치료성 단백질 또는 펩티드)를 발현시키기 위하여 채택될 수 있다. 일실시태양에서, vRNA를 발현시키기 위하여, 상기 프로모터는 RNA 중합효소 I 프로모터, RNA 중합효소 II 프로모터, RNA 중합효소 III 프로모터, T3 프로모터, 또는 T7 프로모터이다. 임의로, 상기 벡터는 RNA 중합효소 I 전사 종결 서열, RNA 중합효소 II 전사 종결 서열, RNA 중합효소 III 전사 종결 서열, 또는 리보자임과 같은 전사 종결 서열을 함유한다.
본 발명의 조성물은 또한 관심 대상이 되는 유전자 또는 개방 해독틀 (예: 백신으로서 유용한 면역원성의 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 외래 유전자)를 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시태양은 상기 벡터들의 인플루엔자 바이러스 유전자들 중 하나가 외래 유전자로 치환된, 상기 설명된 본 발명의 조성물, 또는 상기 모든 인플루엔자 바이러스 유전자들에 더하여 추가적으로 전사 종결 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 원하는 핵산 서열 (예: 관심 대상이 되는 cDNA)에 연결된 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 함유하는 벡터를 포함하는 조성물을 포함하며, 이들은 인플루엔자 바이러스 복제를 허용하는 숙주 세포와 접촉하는 경우, 임의로 재조합 바이러스를 생성한다. 일실시태양에서, 관심 대상이 되는 DNA는 안티센스 방향이다. 관심 대상이 되는 DNA는 vRNA 또는 단백질 생산을 위한 벡터에서 암치료 또는 백신에 있어서 유용한 에피토프, 또는 유전자 치료에 유용한 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 면역원성의 에피토프를 코딩할 수 있다.
본 발명의 복수개의 벡터들은 물리적으로 연결되어 있을 수 있으며, 또는 각 벡터가 개개의 플라스미드 또는 기타, 예를 들어 선형 핵산 전달체 상에 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 예를 들어 감염성 인플루엔자 바이러스를 생성하기에 효과적인 양으로 복수개의 벡터를 함유하는 조성물을 사용하여, 세포 (예: 조류 또는 포유류 세포)를 본 발명의 단리된 바이러스 또는 본 발명의 복수개의 벡터와 예를 들어 순차적으로 또는 동시에 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 바이러스로 감염되거 나 상기 벡터 및(또는) 조성물과 접촉한 세포로부터 바이러스를 단리하는 것을 포함한다. 본 발명은 나아가 본 발명의 바이러스로 감염되거나 본 발명의 조성물 또는 벡터와 접촉한 숙주 세포를 제공한다. 일실시태양에서, 한냉-적응(cold-adapted)된 생 바이러스 백신으로서 유용한 한냉-적응된 재배열(reassortant) 바이러스를 제조하기 위하여, 숙주 세포는 약독화시킨 (예를 들어 한냉-적응된) 공여자 바이러스 및 본 발명의 바이러스로 감염된다.
본 발명은 또한 포유류에서 면역 반응을 유발하기 위한 방법, 예를 들어 하나 이상의 병원체, 예를 들어 본 발명의 바이러스 및 임의로 박테리아, 다른 바이러스, 또는 기생충 또는 다른 항원에 대하여 포유류를 면역시키는 방법을 제공한다. 조성물 또는 백신에 대한 면역학적 반응은 바이러스성 폴리펩티드, 예를 들어 투여된 바이러스성 제제, 폴리펩티드 또는 투여된 핵산 분자에 의해 코딩된 것에 대한 숙주 유기체 내에서의 세포 및(또는) 항체-매개된 면역 반응의 전개이며, 이는 그러한 바이러스 또는 (구조적으로) 가깝게 관련된 바이러스에 대한 감염을 방지하거나 억제할 수 있다. 통상, 그러한 반응은 관심 대상이 되는 조성물 또는 백신에 포함된 항원(들)에 특이적으로 관련된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포 및(또는) 시토톡식 T 세포를 생산하는 환자로 구성된다. 상기 방법은 숙주 유기체 (예: 포유류)에 본 발명의 유효량의 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 임의로 아쥬반트 및(또는) 담체와 조합된 약독화된 생 바이러스를 포유류와 같은 동물의 상기 바이러스 또는 항원적으로 가깝게 연관되는 바이러스에 의한 감염을 예방하거나 개선하기 위한 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 일실시태양에서, 상기 바이러스는 근육내로 주사되며, 다른 실시태양에서는 상기 바이러스가 비강내로 투여된다. 특정 용량 프로토콜에서, 모든 용량이 근육내 또는 비강내로 투여될 수 있으며, 다른 용량 프로토콜에서는 근육내 및 비강내 투여의 조합이 채택된다. 예를 들어 다가(multivalent) 백신을 형성하기 위하여, 백신은 재조합 인플루엔자 바이러스, 기타 병원체(들), 추가의 생물학적 제제 또는 세균적 성분을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 기타 단리물들을 추가로 포함할 수 있다. 일실시태양에서, 비활성화된 말의 인플루엔자 바이러스 및 점막성 아쥬반트 (예: 콜레라 독소의 비독성 B 사슬)를 사용한 비강내 백신화는 혈청 IgG 뿐만 아니라 비인두(nasopharynx)에서의 바이러스-특이적 IgA 및 중화 항체를 야기할 수 있다.
상기 말의 인플루엔자 바이러스는 다른 항-바이러스 제제, 예를 들어 아만타딘, 리만타딘 및(또는) 뉴라미니다제 억제제와 함께 사용될 수 있으며, 예를 들어 사전에, 도중에 및(또는) 사후에 투여되는 상기 항-바이러스 제제와 연관되어 별도로, 상기 말의 인플루엔자 바이러스가 투여될 수 있다.
추가로 제공되는 것은 본 발명의 바이러스, 그에 의해 코딩되는 단리된 바이러스 단백질 또는 상기 바이러스 또는 단백질에 특이적인 항혈청을 사용하여 바이러스 특이적인 항체 또는 바이러스 특이적인 단백질을 검출하는 진단 방법이다.
정의
본원에서 사용된 용어 "단리된"은 시험관내 제조물 및(또는) 핵산 분자 (예: 벡터 또는 플라스미드, 펩티드 또는 폴리펩티드(단백질), 또는 본 발명의 바이러스)의 단리물을 지칭하며, 그것은 생체내 물질과 관련되지 않거나, 시험관내 물질로부터 실질적으로 정제된다. 단리된 바이러스 제조물은 일반적으로 시험관내 배양 및 번식에 의해 얻어지고, 다른 감염성원이 실질적으로 존재하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "실질적으로 정제된"은 대상 종이 우세한 것, 예를 들어 몰 기준으로 조성물 중의 다른 어떤 종에 비해서도 많고, 바람직하게는 존재하는 종의 약 80 % 이상, 임의로 90 % 이상, 예를 들어, 95 %, 98 %, 99% 이상인 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "실질적으로 존재하지 않는"은 특정 감염성원에 대하여 표준 검출 방법을 사용하는 경우 검출 수준 이하인 것을 의미한다.
"재조합" 바이러스는, 바이러스 게놈에 변화를 도입하기 위하여 예를 들어 재조합 DNA 기술을 이용하여 시험관내에서 조작된 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 핵산" 또는 "재조합 DNA 서열 또는 절편"는 핵산, 예를 들어 DNA를 지칭하며, 이들은 특정 소스로부터 유래하거나 단리된 것이며, 후속하여 시험관내에서 화학적으로 변화되어, 그의 서열이 천연적으로 발생하지 않거나, 또는 원래의(native)의 게놈에서의 위치와 다른 위치를 갖는 천연적으로 발생하는 서열에 상응한다. 특정 소스로부터 "유래한" DNA의 예는 유용한 단편으로서 확인된 DNA 서열이며, 이는 본질적으로 순수한 형태로 화학적으로 합성된다. 특정 소스로부터 "단리된" 그러한 DNA의 예는 화학적 수단, 예를 들어 제한 내핵산분해효소(restriction endonuclease)를 사용하여 상기 소스로부터 잘려지거 나 제거되어, 유전공학의 방법에 의하여 본 발명의 용도를 위하여 추가로 조작 (예: 증폭)될 수 있는 유용한 DNA 서열일 수 있다.
인플루엔자 바이러스 타입 A 구조 및 증식
인플루엔자 A 바이러스는 적어도 10개의 단백질을 코딩하는 8개 단일 가닥 음성-센스 바이러스 RNA(vRNA)의 게놈을 보유한다. 상기 인플루엔자 바이러스의 생활환(life cycle)은 숙주 세포의 표면 상에 시알산-함유 수용체에 대한 헤마글루티닌(HA)의 결합으로 개시되어, 수용체 매개 세포내이입이 뒤따른다. 후기 엔도솜에서의 낮은 pH는 HA에서의 형태 이동(conformational shift)를 유발하여, HA2 서브유닛(소위 융합 펩티드)의 N-말단을 노출시킨다. 융합 펩티드는 바이러스 및 엔도솜 막의 융합을 개시하고, 기질 단백질(M1) 및 RNP 복합체가 세포질 내로 방출된다. RNP는 vRNA를 인캡시데이션(encapsidation)하는 핵단백질(NP), 및 PA, PB1 및 PB2 단백질에 의해 형성되는 바이러스 중합효소 복합체로 이루어진다. RNP는 핵 내로 전송되는데, 여기서 전사 및 복제가 일어난다. RNA 중합효소 복합체는 3개의 상이한 반응들을 촉매한다: 5'캡 및 3'폴리A 구조를 갖는 mRNA의 합성, 전장 상보적 RNA(cRNA)의 합성, 및 주형으로서 cRNA를 이용하는 게놈 vRNA의 합성. 이어서, 새로이 합성된 vRNA, NP 및 중합효소 단백질들은 RNP로 조립되고, 핵으로부터 방출되고, 원형질막으로 전송되는데, 여기서 신생 바이러스(progeny virus)의 발아가 일어난다. 뉴라미니다제(NA) 단백질은 시알릴올리고당으로부터 시알산을 제거하여, 세포 표면으로부터 새로이 결집된 비리온을 방출시키고, 바이러스 입자의 자가 응집을 막음으로써, 감염에서 뒤늦게 중요한 역할을 한다. 바이러스 응집체가 단 백질-단백질 및 단백질-vRNA 상호작용과 관련이 있지만, 이들 상호작용의 본질은 별로 알려져 있지 않다.
임의의 세포, 예를 들어 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 밍크와 같은 조류 또는 포유류의 세포, 예를 들어 MvLu1 세포, 또는 인플루엔자 바이러스의 효율적 복제를 지지하는, 돌연변이 세포를 포함한 비인간 영장류 세포가 인플루엔자 바이러스를 단리시키고(시키거나) 증식시키는데 이용될 수 있다. 단리된 바이러스는 재배열된 바이러스, 예를 들어 약독화된 바이러스를 제조하는데 사용될 수 있다. 일실시태양에서는, 백신 생산을 위한 숙주 세포는 조류의 알에서 발견되는 것들이다. 또 다른 실시태양에서는, 백신 생산을 위한 숙주 세포는 무한증식 포유류 또는 조류 세포선(cell line) 또는 세포주(cell strain)이다. 사용될 세포의 완전한 특성화를 확립하는 것이, 최종 생성물의 순도를 위한 적절한 시험이 포함될 수 있도록 하기 위하여 바람직하다. 세포의 특성화를 위해 사용될 수 있는 데이터는 (a) 그 기원, 유도체화 및 계대사에 대한 정보; (b) 그 성장 및 형태학적 특성에 대한 정보; (c) 부정 물질(adventitious agent)의 시험 결과; (d) 세포가 다른 세포선 중에서 명백하게 인식될 수 있게 하는 생화학적, 면역학적 및 세포유전학적 패턴과 같은 구분되는 특징들; 및 (e) 종양발생 가능성(tumorigenicity)에 대한 시험 결과를 포함한다. 사용된 숙주 세포의 계대 수준 또는 개체수 배증기(doubling)가 가능하면 낮을수록 바람직하다.
숙주 세포에 의해 생성된 바이러스가 백신 또는 유전자 요법 제형화 이전에 고도로 정제되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 정제 절차는 세포 DNA, 기타 세포 성분 및 부정 물질의 광범위한 제거를 가져온다. DNA를 광범위하게 붕괴 또는 변성시키는 절차도 이용될 수 있다.
말 인플루엔자 바이러스 검출
질병을 유발하는 말 인플루엔자 바이러스는 일반적으로 H7N7 (equi-1) 및 H3N8 (equi-2) 아형의 타입 A 인플루엔자 바이러스들이다. 이들은 일반적으로 인간에게서 감염을 일으키는 아형들(H1N1, H2N2 및 H3N2)과 다르다. 말 인플루엔자는 호흡 또는 살아있는 바이러스를 함유하는 감염체(예를 들어 생리학적 유체)와의 접촉에 의해 걸리게 된다. 상기 바이러스는 상하 기도의 상피세포를 감염시키고, 4 내지 6일 내에 넓은 면적의 호흡기관의 데실리에이션(deciliation)을 일으킨다. 결과적으로, 점막섬모 청소 기전(mucociliary clearance mechanism)이 손상되고 도관 청소율이 감염 후 32일까지의 기간 동안 감소할 수 있다. 울혈, 부종 및 백혈구 침윤을 수반하는 간질성 폐렴에 이어서, 기관지염 및 세기관지염이 발현된다. 일반적으로, H3N8 바이러스는 H7N7 바이러스보다 더 중증의 질병을 유발하고; H3N8 아형의 바이러스들은 더 폐친화성이며 또한 심근염과도 관련이 있다.
사전에 인플루엔자 경력이 없는 동물에게서의 임상적 징후는 쉽게 인식가능하다. 인플루엔자는 1 내지 3일의 인큐베이션 기간과 함께 갑작스런 발병에 특징이 있다. 첫번째 징후는 체온의 상승(41℃ 까지)인데, 이것은 일반적으로 이상성(biphasic)이다. 종종 심한 콧물을 수반하면서 대기 중에 다량의 바이러스를 방출하는 깊고 건조한 기침이 뒤따르는데, 이것은 2차 세균 감염으로 인하여 점액 농즙성일 수 있다. 기타 가장 일반적으로 관찰되는 임상적 징후는 근육통, 식욕부진 및 하악림프절 종대이다. 다리 및 음낭의 부종이 매우 드물게 관찰된다. 상기 질환의 중증도는 말의 면역 상태 및 바이러스 양 및 종에 따라 변한다.
전에는 건강하고 면역능력이 좋았던 성체 말들은, 비록 기침은 더 길게 지속될 수 있지만, 합병증을 수반하지 않는 인플루엔자로부터는 일반적으로 10일 내에 회복된다. 2차 세균 감염이 일어난다면, 회복 기간이 더 연장될 수 있다. 그러나, 상대적으로 높은 치사율이 망아지, 불량한 조건의 동물들 및 당나귀에게서 기록되었다. 노출시 모체의 항체가 없다면, 어린 망아지는 바이러스성 폐렴을 진전시켜 사망에 이를 수 있다. 성체 동물 중에서의 사망은 일반적으로 늑막염, 화농성 폐렴 또는 드물게는 출혈성 자반으로 가는 2차 세균 감염의 결과이다. 말 인플루엔자의 후유증은 말의 폐기종, 및 2차 루(sinus) 및 후낭(guttural pouch) 감염의 원인일 수 있는, 만성 인두염, 만성 세기관지염, 심근염 및 폐포기종을 포함할 수 있다.
백신 접종 또는 사전 감염의 결과로서 부분적으로 면역화된 동물에게서의 임상적 징후는 기침 또는 발열이 없거나 거의 없기 때문에 인식이 더 어렵다. 경력이 없는 동물군을 통한 감염 확산은 항상 빠른 반면, 백신 접종된 말들에게서는 인식가능한 임상적 징후가 유도되기 전 18일 동안 감염이 무증상적으로 퍼졌던 동발 상황이 있었다.
감염성 호흡기 질환의 발발은 말 헤르페스 바이러스, 리노바이러스, 아데노바이러스 및 동맥염 바이러스, 스트렙토코커스 에쿠이(Streptococcus equi) 또는 S. 주에피데미쿠스(zooepidemicus)를 포함하는 다양한 물질에 의해 일어날 수 있 다. 임상적 징후에 기초한 인플루엔자의 추정적 진단은 바이러스 단리 또는 검출에 의하거나 혈청학 시험에 의해 확인되어야 한다. 임상적 진단의 실험실 확인은 비인후 도말로부터의 바이러스의 전통적 단리 또는 혈청전환을 보여주는 혈청학에 의하거나, 바이러스성 항원, 바이러스성 핵산 또는 호흡기 분비물에서의 바이러스 감염 세포의 존재를 검출하는 빠른 진단 시험에 의할 수 있다. 빠른 진단 시험은, 이들의 이용 편의성 및 용이성에도 불구하고, 바이러스 감염 균주의 유전적 또는 항원적 특징에 대한 정보를 제공하지 않거나 거의 제공하지 않고, 바이러스의 단리를 허용하지 않는다.
바이러스 단리 또는 검출을 위한 비인후 도말은 가능하면 바로 취해야한다. 실험적 도전 연구의 결과들은, 발열의 초기 24 내지 48시간 동안에, 감염후 2일 또는 3일에 최고점 바이러스 적정이 얻어지고, 바이러스 발산 지속이 일반적으로 4 또는 5일 이하인 것을 제시한다. 비강 면봉 샘플은 호흡기 분비물을 흡수하기 위하여 배쪽 길(ventral meatus)을 통한 말의 비인두 안으로 가능하면 멀리 면봉을 관통시켜 취한다. 면봉은 즉각적으로 바이러스 전송 매질을 갖는 용기로 옮겨져야 하고, 얼음 상에서 바이러스의 생존력을 유지시키면서 수송되어야 한다. 건조 면봉을 취하면 바이러스는 생존하지 못할 것이며, 세균 전송 매질이 사용되면 오염의 확률이 증가한다. 비강 면봉 샘플은 9 내지 11일령 발육 계란의 요막(또는 양막) 안으로 접종될 수 있다. 33-35℃에서 3일간 인큐베이션 후, 요막 유체를 수거하고 응집 활성을 시험하였다. 별법으로는, 세포 배양물을 바이러스 단리에 사용할 수 있다. 인플루엔자 감염은, 임상적 징후의 개시 후 가능하면 빨리 취해진 급성기 혈청과 2 내지 4주 후에 취해진 회복기 혈청의 혈청학 시험의 결과의 비교에 의해 진단될 수도 있다.
적혈구응집반응 억제(HI) 시험은 바이러스에 의한 적혈구 세포의 응집을 억제하는, 혈청 샘플에 존재하는 인플루엔자-특이적 항체의 능력을 측정한다. 혈청을 열비활성화(heat-inactivated)시키고 예비처리하여 비특이적 반응을 감소시키고, U자형 바닥 마이크로티터 플레이트에서 바이러스의 표준 용량으로 인큐베이션 전에 연속적으로 희석하였다. 적혈구의 현탁액을 가하고 추가 인큐베이션 기간 후에, 응집을 검사하였다. 바이러스-특이적 항체의 4배 상승은 감염을 나타낸다. H7N7의 경우 전체 바이러스 항원이 사용될 수 있지만, H3N8 바이러스에 대한 분석의 감도를 향상시키기 위해서는 일반적으로 트윈 80-에테르 분열된 항원이 필요하다. 반복적으로 백신 접종된 말에게서는, 감염이 HI 적정에서 4배의 증가가 일어나도록 자극하지 못할 수 있다.
단일-방사성 용혈(single-radial haemolysis, SRH) 시험이 비록 균주-특이성이 덜하지만, 더 재현성이 좋으며, HI 시험보다 오류가 덜 발생하고, 선형 시험이기 때문에 더 감도가 커서, 과도하게 백신 접종된 말에게서 감염에 의해 유도된 항체의 더 작은 증가에 대한 검출을 가능하게 한다. SRH 시험은 보체의 존재 하에 바이러스 코팅된 적혈구 세포를 용혈시키는, 인플루엔자-특이적 항체의 능력에 기초한다. 시험 혈청을 코팅된 적혈구 및 보체 함유 아가로스의 펀칭된 웰에 가하여, 아가로스를 통하여 20시간 동안 확산되게 한다. 웰 둘레에 용혈이 없는 구역의 면적은 혈청 샘플에 존재하는 인플루엔자 항체의 농도에 비례한다.
말이 감염 상태에서 백신 접종되면, HI 및 SRH 분석을 이용하여, 항체 수준에서의 임의의 증가가 백신 접종에 의한 것인지, 또는 감염으로 인한 것인지를 결정하는 것이 가능하지 못할 수 있다.
인플루엔자 백신
본 발명의 백신은 본 발명의 단리된 인플루엔자 바이러스 및 임의로, 다른 단리된 인플루엔자 바이러스, 서부 나일강 바이러스, 말 헤르페스 바이러스, 말 동맥염 바이러스, 말 감염성 빈혈 렌티바이러스, 광견병 바이러스, 동부 및(또는) 서부 및(또는) 베네주엘라 말 뇌염 바이러스를 비롯한 하나 이상의 다른 단리된 바이러스, 하나 이상의 면역원성 단백질 또는 하나 이상의 단리된 인플루엔자 바이러스의 당단백질 또는 하나 이상의 다른 병원체, 예를 들어, 하나 이상의 세균, 비-인플루엔자 바이러스, 효모 또는 진균으로부터의 면역원성 단백질, 또는 본 발명의 단리된 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 면역원성 단백질을 비롯한 하나 이상의 바이러스 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 (예, DNA 백신)을 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 또는 다른 병원체에 대한 백신 벡터일 수 있다.
완전한 비리온 백신은 초여과에 의해 농축된 다음, 구역 원심분리 또는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이것은 정제 전 또는 후에, 예를 들어 포르말린 또는 베타-프로피오락톤을 사용하여 비활성화된다.
서브유닛 백신은 정제된 당단백질을 포함한다. 그러한 백신은 다음과 같이 제조될 수 있다: 계면활성제로 처리함으로써 단편화된 바이러스 현탁액을 사용하 여, 표면 항원을 예를 들어 초원심분리에 의해 정제한다. 따라서, 서브유닛 백신은 주로 HA 단백질, 및 NA를 또한 함유한다. 사용된 계면활성제는 헥사데실 트리메틸 암모늄 브롬화물(Bachmeyer, 1975)과 같은 양이온성 계면활성제, 암모늄 데옥시콜레이트(Laver & Webster, 1976)와 같은 음이온성 계면활성제, 또는 트리톤 엑스100 (TRITON X100)이라는 명칭 하에 상업화된 것과 같은 비이온성 계면활성제일 수 있다. 또한, 비리온을 브로멜린과 같은 프로테아제로 처리한 후에 적혈구응집소가 단리된 다음, 그랜드 및 스케헬(Grand and Skehel (1972))에 의해 기재된 것과 같은 방법으로 정제될 수 있다.
분할 백신은 지질을 용해시키는 작용제로 처리된 비리온을 포함한다. 분할 백신은 다음과 같이 제조될 수 있다: 비활성되거나 그렇지 않은, 상기와 같이 얻어진 정제된 바이러스의 수성 현탁액을 계면활성제와 함께 에틸 에테르 또는 클로로포름과 같은 지질 용매로 교반하에 처리한다. 바이러스 외피 지질의 용해는 바이러스 입자의 단편화를 초래한다. 원래의 지질 환경이 제거된 적혈구응집소와 뉴라미니다제로 주로 이루어진 분할 백신, 및 코어 또는 이의 분해 산물을 함유하는 수성상을 회복한다. 이어서, 이미 비활성화되지 않았을 경우, 남은 감염성 입자를 비활성화시킨다.
비활성화 백신 포르말린 또는 베타-프로피오락톤 처리와 같은 공지의 방법을 사용하여 복제된 바이러스를 비활성화시킴으로써, 비활성화 인플루엔자 바이러스 백신이 제공된다. 본 발명에 사용될 수 있는 비활성화 백신 유형은 전체 바이러스(WV) 백신 또는 서브비리온(SV) (분할) 백신을 포함할 수 있다. WV 백신은 온 전한 비활성화 백신을 함유하는 반면, SV 백신은 지질 함유 바이러스 외피를 가용화하는 계면활성제로 파열시킨 다음 남은 바이러스를 화학적으로 비활성화시킨 정제된 바이러스를 함유한다.
또한, 사용될 수 있는 백신은, 표면 항원 또는 서브유닛 백신으로도 지칭되는 단리된 HA 및 NA 표면 단백질을 함유하는 것들을 포함한다.
생 약독화된 바이러스 백신 생 약독화된 인플루엔자 바이러스 백신이 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 약독화는 공지된 방법에 따라 약독화된 공여자 바이러스로부터의 약독화된 유전자를 복제된 단리물 또는 재배열된 바이러스에 전달함으로써 일 단계로 달성될 수 있다 (예를 들어, Murphy, 1993 참조). 인플루엔자 A 바이러스에 대한 저항은 일차적으로 HA 및(또는) NA 당단백질에 대한 면역 반응의 발달에 의해 매개되므로, 상기 표면 항원들을 코딩하는 유전자는 재배열된 바이러스 또는 임상 단리물로부터 유래되어야 한다. 약독화된 유전자는 약독화된 부모로부터 유래된다. 이 방법에서, 약독화를 부여하는 유전자는 바람직하게는 HA 및 NA 당단백질을 코딩하지 않는다.
인플루엔자 바이러스를 재현가능하게 약독화시킬 수 있는 바이러스 (공여자 인플루엔자 바이러스)가 이용가능하며, 예를 들어, 저온 적응(ca) 공여자 바이러스가 약독화된 백신 생산에 사용될 수 있다. 생 약독화된 재배열 바이러스 백신은 ca 공여자 바이러스를 독성 복제된 바이러스와 짝짓기함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 약독화된 ca 공여자 바이러스의 표면 항원을 갖는 바이러스의 복제를 억제하는 적당한 항혈청의 존재 하에, 25℃(독성 바이러스의 복제에 제한됨)에서 재배 열 자손을 선택한다. 유용한 재배열 자손은 (a) 감염성이고, (b) 음성혈청반응 비성숙 포유동물 및 면역학적으로 초회 감작된 성숙 포유동물에 약독화되고, (c) 면역원성이고, (d) 유전학적으로 안정하다. ca 재배열 자손의 면역원성은 그의 복제 수준과 유사하다. 따라서, 새로운 야생형 바이러스에 의한 ca 공여자 바이러스의 6개 전달가능한 유전자의 획득은 성숙 및 비성숙 감수성 포유동물을 백신접종하는데 사용하기 위한 상기 백신을 재현가능하게 약독화시켰다.
다른 약독화 돌연변이가 부위 지정 돌연변이형성에 의해 인플루엔자 바이러스 유전자에 도입되어, 돌연변이 유전자를 갖는 감염성 바이러스를 구출할 수 있다. 약독화 돌연변이는 게놈의 코딩 영역뿐만 아니라, 비코딩 영역에도 도입될 수 있다. 그러한 약독화 돌연변이는 HA 또는 NA 이외의 유전자, 예를 들어, PB2 중합효소 유전자에 도입될 수도 있다(Subbarao et al., 1993). 따라서, 부위 지정 돌연변이형성에 의해 도입된 약독화 돌연변이를 갖는 새로운 공여자 바이러스가 생성될 수 있고, 그러한 새로운 공여자 바이러스는 ca 공여자 바이러스에 대해 전술된 바와 유사한 방식으로 약독화된 재배열 백신 후보물질의 생산에 사용될 수 있다. 유사하게, 다른 공지의 적합한 약독화 공여자 균주가 인플루엔자 바이러스와 재배열되어, 포유동물의 백신접종에 사용하기에 적합한 약독화된 백신을 수득할 수 있다(문헌 [Enami et al., 1990; Muster et al., 1991; Subbarao et al., 1993]).
상기 약독화된 바이러스가 원래 임상 단리물의 것과 실질적으로 유사한 항원성 결정자를 코딩하는 바이러스로부터의 유전자를 유지하는 것이 바람직하다. 이는 약독화된 바이러스의 목적이 바이러스의 원래 임상 단리물과 실질적으로 동일한 항원성을 제공하는 동시에, 백신이 백신접종된 포유동물에서 심각한 질환을 유도할 가능성이 최소화될 정도로 병원성이 결여되어야 하기 때문이다.
따라서, 상기 바이러스는 동물, 예를 들어 포유동물에서 면역반응을 유도하기 위한 백신으로서, 공지의 방법에 따라 약독화되거나 비활성화되고, 제제화되고, 투여될 수 있다. 상기 약독화되거나 비활성화된 백신이 임상 단리물 또는 그로부터 유래된 고 성장 균주와 유사한 항원성을 유지하는지를 결정하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 공지된 방법은 공여자 바이러스의 항원성 결정자를 발현하는 바이러스를 제거하는 항혈청 또는 항체의 사용; 화학적 선택 (예, 아만타딘 또는 리만티딘); HA 및 NA 활성 및 억제; 및 항원성 결정자(HA 또는 NA 유전자)를 코딩하는 공여자 유전자가 약독화된 바이러스에 존재하지 않는 것을 확인하는 핵산 스크리닝(예, 프로브 혼성화 또는 PCR)을 포함한다. 문헌 [Robertson et al., 1988; Kilbourne, 1969; Aymard-Henry et al., 1985; Robertson et al., 1992]을 참고하라.
제약 조성물
접종, 예를 들어 코, 비경구 또는 경구 투여에 적합한 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 단리물, 예를 들어 하나 이상의 약독화되거나 비활성화된 인플루엔자 바이러스, 그의 서브유닛, 그의 단리된 단백질(들) 및(또는) 그의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하며, 임의로, 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유제를 더 포함한다. 상기 조성물은 당업계에 공지된 보조제 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 문헌[Berkow et al., 1987; Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980]을 참고하라. 본 발명의 조성물은 일반적으로 개별 용량(단위 용량)의 형태로 제공된다.
종래의 백신은 일반적으로, 그의 조성물에 도입되는 균주 각각으로부터의 HA약 0.1 내지 200 ㎍, 예를 들어 30 내지 100 ㎍을 함유한다. 본 발명의 백신 조성물의 주 구성성분을 형성하는 백신은 단일 인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스의 조합, 예를 들어, 하나 이상의 재배열 바이러스(들)을 비롯하여 적어도 2개 또는 3개의 인플루엔자 바이러스를 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제는 당업계에 공지된 보조제 또는 부형제를 함유할 수 있는, 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및(또는) 유제를 더 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유, 예를 들어 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레인산염이다. 피부 침투성을 증가시키고 항원 흡수를 향상시키기 위해 담체 또는 밀봉 드레싱이 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 지질 투여 형태는 일반적으로 지질 투여 형태를 함유하는 리포솜 용액을 포함할 수 있다. 리포솜을 현탁시키는데 적합한 형태는, 정제수와 같이 당업계에 통상적으로 사용되는 비활성 희석제를 함유하는 유제, 현탁제, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 비활성 희석제 이외에, 상기 조성물은 아쥬반트, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 또는 감미료, 향미료 또는 향료를 포함할 수 있다. 문헌[Berkow et al., 1992; Avery's, 1987; Osol, 1980]을 참고하라.
본 발명의 조성물이 개체에 투여하는데 사용될 경우, 이것은 염, 완충액, 아쥬반트, 또는 조성물의 효능을 향상시키는데 바람직한 기타 물질을 더 포함할 수 있다. 백신의 경우, 특정 면역 반응을 증대시킬 수 있는 물질인 아쥬반트가 사용될 수 있다. 보통, 아쥬반트와 조성물은 면역계에 제공되기 전에 혼합되거나, 면역화시킬 유기체의 동일한 부위에 개별적으로 제공된다. 백신 조성물에 사용하기에 적합한 물질의 예가 문헌[Osol, 1980]에 제공되어 있다.
백신의 이질성은 적어도 2개의 인플루엔자 바이러스 균주, 예를 들어 2 내지 20개의 균주 또는 임의의 범위 또는 그 범위 내의 수치에 대해 복제된 인플루엔자 바이러스를 혼합함으로써 제공될 수 있다. 현대 항원성 조성을 갖는 인플루엔자 A 바이러스 균주가 바람직하다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 단일 인플루엔자 바이러스 균주의 변화가 백신에 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 하나 이상의 화학요법 화합물, 예를 들어, 유전자 요법의 경우, 면역억제제, 소염제 또는 면역 증강제, 백신의 경우, 감마 글로불린, 아만타딘, 구아니딘, 히드록시벤즈이미다졸, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자-알파, 티오세미카바존, 메티사존, 리팜핀, 리바비린, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 포스카넷, 포스포노아세트산, 아시클로버, 디데옥시뉴클레오시드, 프로테아제 억제제 또는 간시클로버를 비롯한 화학요법제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 또한, 변화가능하나 소량인 내독소-무함유 포름알데히드, 및 조성물이 투여될 유기체에서 안정하고 바람직하지 못한 효과에 기여하지 않은 것으로 밝혀진 보존제를 함유할 수 있다.
제약적 목적
본 조성물 (또는 이에 의해 유발된 항혈청)의 투여는 "예방적" 또는 "치료적" 목적 중 하나일 수 있다. 예방적으로 제공될 경우, 백신인 본 발명의 조성물을 병원체 감염의 어떤 징후 또는 임상적 조짐이 명백해지기 전에 제공한다. 위 조성물의 예방적 투여는 어떠한 뒤따르는 감염을 방지 또는 약독화하는 역할을 한다. 예방적으로 제공될 경우, 질병의 어떠한 징후 또는 임상적 조짐이 명백해지기 전에 본 발명의 유전자 치료 조성물을 제공한다. 위 조성물의 예방적 투여는 질병과 관련된 하나 이상의 징후 또는 임상적 조짐을 방지 또는 약독화하는 역할을 한다.
치료적으로 제공되는 경우, 실제 감염의 징후 또는 임상적 조짐이 감지되면 약독화 또는 비활성화 바이러스 백신을 제공한다. 상기 화합물(들)의 치료적인 투여는 실제 감염을 약독화하는 역할을 한다. 참고로, 예를 들어 버코우(Berkow) 등 1992; 에이버리(Avery) 1987를 참조한다. 치료적으로 제공될 경우, 질병의 징후 또는 임상적 조짐이 감지되면 유전자 치료 조성물을 제공한다. 본 화합물(들)의 치료적 투여는 질병의 징후 또는 임상적 조짐을 약독화하는 역할을 한다.
이처럼, 본 발명의 약독화 또는 비활성화 백신 조성물을 감염의 발병 전에 제공될 수 있거나(그 결과 예상되는 감염을 방지하거나 약독화한다), 실제 감염의 개시 후에 제공될 수 있다. 이와 유사하게, 유전자 치료에 대하여, 질환 또는 질병의 임의의 징후 또는 임상적 조짐이 나타나기 전에 또는 하나 이상의 징후가 감지된 후에 본 조성물을 제공할 수 있다.
수용자 포유류가 본 조성물의 투여를 인용할 수 있다면, 이 조성물은 "약리 적으로 용인(허용)가능"하다고 말한다. 투여량이 생리적으로 현저하다면, 이러한 제제는 "치료 유효량으로" 투여된다고 말한다. 본 조성물의 존재가 수용 환자의 생리적으로 감지가능한 변화를 가져온다면, 예를 들어 감염성 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 균주에 대해 하나 이상의 일차 또는 이차적 체액 또는 세포 면역 반응을 증대시킨다면, 본 발명의 조성물은 생리적으로 현저하다.
제공하는 "보호"란 절대적일 필요는 없다. 즉, 포유류의 대조 집단 또는 집합과 비교하여 통계적으로 현저한 개선이 있다면 인플루엔자 감염이 완전히 방지되거나 근절될 필요까지는 없다. 보호는 인플루엔자 바이러스 감염의 징후 또는 임상적 조짐의 발병의 급속함 또는 혹독함을 완화하는 것까지로 한정될 수 있다.
제약적 투여
본원 발명의 조성물은 수동적 면역화 또는 능동적 면역화에 의하여 하나 이상의 병원체, 예를 들어 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 내성을 부여한다. 능동적 면역화에서는, 비활성화 또는 약독화된 살아있는 백신 조성물을 숙주(예를 들어 포유류)에게 예방적으로 투여하고, 위 투여에 대한 숙주의 면역 반응이 감염 및(또는) 질병에 대하여 보호한다. 수동적 면역화에 대하여는, 유발된 항혈청을 되찾고, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 의하여 야기된 감염을 갖는 것으로 의심되는 수용자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 유전자 치료 조성물은 능동적 면역화에 의하여 예방적 또는 치료적 수준의 원하는 유전자 산물을 산출할 수 있다.
일실시형태로, 여성 및 태아 또는 갓태어난 아이 모두를 보호하는 역할을 하 는 면역 반응을 생성하도록 야기하는 데에 충분한 시간 및 수량 조건 하에서, 포유류 여성 (임신전 또는 분만 전에 있는 여성)에게 본 백신을 제공한다 (태반을 통하여 또는 모유에 피동적 결합을 통하여).
이처럼, 본원 발명은 질환 또는 질병 예를 들어 하나 이상의 병원체에 의한 감염을 방지 또는 약독화하는 방법을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 백신의 투여가 질병의 임상적 조짐 또는 증상을 전체적 약독화 또는 부분적인 약독화(즉 억제)한다면, 또는 개체에게 질병에 대한 전체적 또는 부분적 면역을 제공한다면, 백신이 질병을 예방 또는 약독화한다고 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 치료 조성물의 투여가 질병의 임상적 조짐 또는 증상의 전체적 약독화 또는 부분적인 약독화(즉 억제)한다면, 또는 개체에게 질병에 대한 전체적 또는 부분적 면역을 제공한다면, 유전자 치료 조성물은 질병을 예방 또는 약독화한다고 말한다.
비활성화 또는 약독화한 것, 이들의 하나 이상을 단리한 바이러스 단백질, 이들의 하나 이상의 바이러스 단백질을 코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는 본 발명의 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 단리물을 의도하는 목적을 수행하는 임의의 수단에 의하여 투여할 수 있다.
예를 들어, 이러한 조성물의 투여는 다양한 비장관 경로, 예컨대 피하, 정맥내, 피부내, 근육내, 복막내, 비강내, 경구 또는 경피 경로에 의하여 투여될 수 있다. 시간에 걸쳐 점진적인 관류(perfusion)에 의해 또는 볼루스(bolus) 주입에 의하여 장관내 투여도 수행될 수 있다.
인플루엔자 관련 병상을 예방, 억제, 치료하기 위한 전형적인 처방은 1주 내지 약 24개월을 포함하는 기간 동안, 본원에서 기술되거나, 단일 치료로서 투여되거나 또는 증가한 용량 또는 효능촉진 용량으로 반복하면서 백신 조성물의 유효량 또는 그 이내의 범위 또는 수치로 투여하는 것을 포함한다.
본원 발명에 따르면, 조성물의 "유효량"이란 원하는 효과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효 용량은 수용자의 종, 연령, 성별, 건강 및 체중, 만일 존재한다면 수반되는 치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 특성에 좌우될 수 있다고 이해된다. 아래에 제공되는 유효 용량의 범위는 본원 발명을 제한하고자 함이 아니며 용량 범위를 대표하고자 함이다.
포유류 성체 조직체와 같은 동물에 대한 살아있는, 약독화한 또는 사멸시킨 바이러스 백신의 용량은 약 102 - 1015, 예를 들어 103-1012 플라크 형성 단위 (PFU)/kg, 또는 그 이내의 임의의 범위 또는 값이 될 수 있다. 비활성화된 백신의 용량은 HA 단백질을 약 0.1 내지 1000㎍, 예를 들어 30 내지 100 ㎍일 수 있다. 그러나, 그 용량은 시작점으로서 존재하는 백신을 사용하는 통상적인 방법에 의하여 결정한 안전하면서 유효한 양이어야 한다.
복제된 바이러스 백신의 각 용량에서의 면역반응성 HA의 용량을 적당한 양 예를 들어 30 내지 100㎍ 또는 그 이내의 임의의 범위 또는 값, 또는 정부 기관에 의하여 권장되거나 전문 단체에 의하여 인정되는 양을 함유하도록 표준화할 수 있다. 또한 NA의 양도 표준화할 수 있다. 그러나, 이 당단백질은 정제 및 보관 동 안에 불안정할 수 있다.
말 인플루엔자 백신에 대한 조성물 및 용량
말(Equine) 인플루엔자 백신은 일반적으로 비활성화된 전체 바이러스 또는 이들의 서브유닛 중 하나로서, 대표적 균주인 H7N7 및 H3N8 아형을 포함한다. 이들은 항체가 표면 당단백질, 특히 HA의 인플루엔자에 대한 보호를 제공한다. HA는 바이러스 부착 및 세포로의 진입 및(또는) 다른 바이러스 단백질에 대한 잠재적으로 중요한 세포 매개 면역 반응에 필수적이다. 백신 접종은 인플루엔자를 예방하는 데에 도움이 되나 보호는 단기간이어서 (통상적인 비활성화 바이러스 백신을 사용하면 3-4달), 백신 접종의 빈도는 얼마나 자주 말이 바이러스에 접촉할 것인가에 따라 다르다 (표 1 참조). 일차 과정에 대한 보통의 방법은 단일 투여량으로 한 후 3 내지 6주 후에 제2 용량으로 백신 접종하는 것이다. 백신 제조자는 효능촉진(booster) 백신 접종이 그후 6 내지 12달 간격에 행해지는 것을 권장한다. 이와 별법으로, 말은 일차로 1 내지 2ml 용량으로 근육내(IM) 주사를 통하여, 제2차로 1 내지 2ml 용량으로 다른 주사 위치에 3 내지 4주 후에 근육내 주사를 통하여, 임의로 제3차로 1 내지 2ml 용량으로 예를 들어 근육내 또는 비강내(IN) 투여를 통하여 투여된다. 백신의 각 1 내지 2ml 용량은 약 1-500 ×10억 바이러스 입자, 바람직하게 100×10억 입자를 함유할 수 있다. 예를 들어 마구간, 훈련 센터, 경마장, 쇼우 장 및 기타 이같은 공연장에서와 같이 다수의 말과 접촉하는 말은 종종 매 2-3달마다 백신접종한다. 연령과 관계없이, 3차례 용량 일차 시리즈의 경우 권장된 2차례 용량 시리즈의 경우보다 더 높고 더 지속되는 면역도를 유발하는 것으로 관 찰되었다.
통상적인 백신을 사용하면, 젊은 말들, 특히 경주마들 및 기타 경쟁 말들을 백신 접종하는 일차 과정 후에 수년 동안은 4 내지 6달 간격으로 백신접종하는 것이 바람직하다. 백신 제조자에 의하여 권장되는 2차 및 3차 백신 접종 사이의 추가의 효능촉진 접종을 포함하는 것이 젊은 말들에게 이롭다는 것이 증명되었다. 정기적으로 백신접종을 받아온 쇼우 점프마와 같이 나이가 더든 말들 및 품종 암말과 같은 말들에게는 품종마이기 때문에 매년마다의 효능촉진 접종으로 충분할 것이다. 진행중인 발병에 대한 백신접종이 때때로 행해지나, 갓 백신접종한 말들이 감염에 노출되기 전 적어도 7 내지 10일의 간격이 아니면 효과적이지 않을 것이다. 말 인플루엔자 발발은 사람과 같이 계절적이지 않고, 다른 지역으로부터 온 말들이 모이고 섞이는 거래 또는 경주 모임과 빈번히 관련있다. 따라서, 이러한 사건 이전에 추가의 효능촉진 백신 접종의 시간을 맞추는 것이 유리할 수 있다.
망아지에 대한 좋은 초유 항체를 공급을 보장하기 위하여, 임신 후반기 및 망아지를 낳기 전 적어도 2주 전에 품종 암말은 백신접종받아야 한다. 망아지 백신 접종은 연령 3-6개월에 시작하고, 4-7개월 및 다시 5-8개월에 효능촉진 접종을, 그리고 망아지가 노출의 위험이 아주 높으면 매 석달마다 효능촉진 접종을 받아야 한다.
백신접종받은 암말로부터의 망아지 및 젖을 갓땐 망아지 백신접종받지 않은 암말로부터의 망아지 및 젖을 갓땐 망아지 한살된 말 공연 말 일하는 말 품종 암컷
비활성화된
주사가능한
인플루엔자		 첫번째 투여:
9 개월
두번째 투여:
10 개월
3번째 투여:
11-12 개월,
이후 3개월 간격으로 		첫번째 투여: 6개월,
두번째 투여: 7개월,
세번째 투여: 8개월,
이후 3개월 간격으로 		매 3-4 개월마다 매 3-5 개월마다 가능한 노출이전에 효능촉진 접종을 매년마다 적어도 반년에 한번, 분만전 4-6주에 첫번째 효능촉진 접종을,
비강내 투입
추위 적응된 살아있는
인플루엔자
 첫번째 투여: 12개월,
11개월 미만의 망아지에게 안전하게 투여됨		 첫번째 투여: 12개월, 11개월 미만의 망아지에게 안전하게 투여됨 매 4-6 개월마다 매 4-6개월마다 매
4-6개월 마다		 분만전 일년에 한번
인플루엔자 백신을 파상풍 또는 헤르페스바이러스 항원 및 다른 병원체, 예를 들어 말 병원체와 조합할 수 있다. 파상풍 변성독소에 의해 유발된 면역반응은 인플루엔자 항원에 의해 유발된 것보다 더욱 더 영속적이다. 이와 같이, 집중적 인플루엔자 백신접종 프로그램에서, 인플루엔자만을 함유하는 백신이 바람직하다.
말 보호에 요구되는 항체의 수준 (SRH 분석법에 의해 측정)은 백신유발 및 면역유발 연구 및 업계 데이터를 통해 확인되어 왔다. 말에서의 HA에 대한 백신-유도 항체 반응은 현저하게 단기간적이고, 수산화 알루미늄 또는 카르보머(carbomer)와 같은 아쥬반트는 전체 바이러스 백신에 대한 면역 반응 기간 및 정도를 향상시키기 위해 보통 포함된다. 면역 자극 복합체 (ISCOMs)를 함유하는 서브유닛 말 인플루엔자 백신도 또한 면역원성이다.
역사적으로, 비활성화 백신내 항원 함량은 HA의 병아리 세포 응집(CCA) 단위로서 표현되고 효능은 기니아 피그 및 말 중에서 유도된 HI 항체 반응으로서 표현되는데, 둘 다 재생가능한 결과를 보이지 않는다. 단일 방사 확산 (single radial diffusion; SRD) 분석법은 면역학적으로 활성인 HA (HA의 마이크로그램으로 표현)의 농도를 측정하는 개선된 시험관내 효능 실험이고 아쥬반트의 첨가 전에 과정 중 실험에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 기술될 것이다.
<실시예>
대략 36-시간된 모르간/프리시안 (Morgan/Friesian) 망아지를 출생 직후 처음으로 인지되는 변화된 정신작용 (정신 상태)를 평가하기 위해 위스콘신 대학의 대규모 동물 병원에 위탁했다. 분만은 관찰되지 않았으나, 수 시간 후에 망아지는 암말로부터 분리되었다. 망아지는 처음 발견되었을 때 보행이 가능하고 양육이 가능하였으나, 진행성 방향성상실, 명백한 시각 손실 및 방향성 없는 헤맴을 뒤의 36시간의 기간 동안 보였다. 24시간 된 때 SNAP 면역글로불린 G (IgG) 분석법 (이덱스 래보라토리즈 (Idexx Laboratories, 메인주 웨스트브룩 소재)은 IgG 농도 > 800 mg/dL을 보였고, 이 때 실시된 CBC은 정상이었다. 망아지는 위탁 전에 5% 덱스트로스로 희석된 디메틸 술폭시드 1 g/kg IV로 두 번 처리되었다.
제시시, 망아지는 방향 없이 헤매고, 물건들에 부딪치고 느리나 온전한 동공반사 광 반응을 보이는 시력상실을 보였다. 암말 밑에 놓였을 때, 망아지는 성공적으로 양육되었다. 체력 검사는 주목할 만하지 않았다. CBC 및 혈청 생화학은 방사선면역확산에 의해 측정시 혈청 IgG 농도가 937 mg/dL인 것을 포함하여 정상이었다.
추정되는 저산소혈증(hypoxemic), 허혈성 뇌병증(ischemic encephalopathy)의 초기 치료는 1시간 동안의 250 mL 로딩 용량의 20% 황산 마그네슘, 그 후 일정 투여 속도 42 mL/h에서의 티아민 히드로클로라이드 2.2 mg/kg IV q24h를 포함했다. 항균 요법은 아미카신 20 mg/kg IV q24h 및 프로케인 페니실린 G 22,000 U/kg IM q12h로 이루어졌다. 오메프라졸 1 mg/kg PO q24h을 또한 위궤양의 발병을 예방하기 위해 망아지에 투여하였다.
망아지의 정신 상태는 그 다음의 24시간 동안 정적이었고, 만니톨 1 g/kg IV q24h 및 덱사메타손 소듐 포스페이트 0.1 mg/kg IV q24h를 입원 2 및 3 일째에 추가 처리하였으나 개선은 보이지 않았다. 3일째에, 머리 및 인접 척수의 전산화 단층 촬영을 위해 망아지는 일반 마취되었고, 이들은 정상이었다. 뇌척수액 샘플을 요추골천골공간으로부터 얻고 이는 세포학적 평가상에서 정상이고 정상 단백질 농도를 가졌다.
입원 4일째에, 망아지는 우측 머리에 기울어짐을 보였으나, 그외에는 입원 5일째까지 정적이었다. 황산 마그네슘 요법은 5일째에 중지했으나, 나머지 치료 요법은 바뀌지 않았다. 6일째에, 망아지는 2번의 짧고 일반적 발작을 보여 미다졸람 0.05 mg/kg IV로 조절했다. 발작 중에, 망아지는 여전히 쾌활하고 열이 없으며 양육이 가능했다.
입원 7일째에, 망아지는 열이 나기 시작했고 (40℃) 점액농성 비액 분비 및 진행성 기관지염과 함께 청진시에 미만성 우발성 악설음 및 천명을 보였다. 지난 7일간 신생아 보호 유닛에서 열, 점액농성 비액 분비 및 기침은 다수의 다른 암말 및 망아지에서 주목되었다. 항균 요법을 티카르실린/클라불란산 50 mg/kg IV q8h 및 젠타마이신 6.6 mg/kg IV q24h으로 바꾸었고, 망아지를 (아직 양육 중이나) 다가이온 용액으로 치료했다. 8-10일째, 망아지의 머리 기울어짐 해결 및 신경 상태 회복과 함께 망아지의 신경 상태는 계속 개선되었으나, 기관지염, 호흡곤란 및 우발성 폐 소리는 악화되었다. 상기 시점에서의 기관지 방사선 촬영은 중증 미만성 기관지 간질성 패턴을 보였다. 느린 투여에 의한 아미노필린 0.5 mg/kg IV q12h 및 산소의 비내 주입을 입원 9 및 10일째에 시작했다. 연속적 동맥혈 기체 분석은 10일째의 만료 시점에 중증 저산소증 (PaO2 , 52 mm Hg), 고탄산증 (PaCO2 , 68.4 mm Hg), 및 감소된 산소 포화 (76%)를 확인해주었다. 결론적으로, 망아지는 기계적 환기 설비에 넣어졌다. 동맥혈 기체 수치가 100% 산소로 정상화될 때까지 환기 보조 및 총 비경구 영양공급을 48시간 동안 계속했다. 항균 요법을 전처럼 계속했다. 13일째에 환기 보조를 제거하자, 망아지는 중증 저산소증 및 치아노제를 보였고 소유자의 요청에 따라 안락사되었다. 13일째에 얻어진 경기관 흡인액(transtracheal aspirate)의 유산소 배양물은 티카르실린/클라불란산 및 젠타마이신에 내성인 클레브시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pneumoniae) 및 에쉐르키아 콜라이 (Escherichia coli)을 성장시켰다.
완전 총체적 및 조직학적 사후 검사를, 비액 분비 샘플 중의 말 포진 바이러스 (EHV)-1 및 EHV-4의 존재에 대한 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(PCR) 평가, 말 동맥염 바이러스에의 노출이 있었는지를 결정하기 위한 혈액 검사 및 디렉티젠 (Directigen) Flu A 분석법 (벡틴 디킨슨 앤드 코 (Bectin Dickinson and Co., 뉴저지주 프랭클린 소재) 및 인플루엔자 바이러스의 존재를 실험하기 위한 비액 분비 샘플 유래의 바이러스 단리와 함께 실시했다. 비액 분비 샘플은 다크론 면봉 ( Dacron swab)로 수집하고 인산 완충 식염수, 0.5% 소 혈청 알부민 및 페니실린 G, 스트랩토마이신, 니스타틴 및 젠타마이신을 함유하는 바이러스 이동 배지 2 mL에 일련적으로 넣었다. 비액 면봉 샘플을 입원 8일째에 수집했다. 인플루엔자 바이러스에 대한 사후 평가는 인플루엔자 핵단백질(NP) 발현 존부에 대한 스냅-냉동 및 포르말린-고정 폐, 내장기관 및 중추신경계 조직에 대한 면역조직화학적 검사, 냉동된 폐 조직 유래의 바이러스 단리 및 바이러스 서열 분석을 포함했다. 총체적 사후 검사는 중증 미만성 간질성 폐렴 및 뇌하수체 주위의 뇌의 미측 복면 상의 경막하 출혈을 확인해주나, 다른 기관에서의 패혈증 또는 병리는 나타나지 않았다. 폐의 조직병리학적 검사는 괴사성 기관지염 및 관지염(brochiolitis), 미만성 편평화생, 다병소성 간질성 폐렴을 확인했다. 약한 단핵 침윤물이 저층 기도부, 경우에 따라서는 웅혈 및 삼출물과 관련된 폐포 붕괴 영역을 덮었다. 뇌 조직의 검사는 특히 소뇌에서의 미만성 백질 액포조직과 함께 정맥계의 약한 확장을 보여주었다. 미엘린의 존재에 대한 크레실 바이올렛 염색을 다수의 단면에 실시하고, 병행하여 염색된 연령이 매치되는 대조군 유래 조직과 비교시 뇌 및 척수를 통해 미엘린이 존재하나 감소됨을 보여주었다. 중추 신경계의 추가의 조직병리학적 비정상은 소뇌내의 분자층의 명백한 부재를 포함했다. 말 바이러스성 동맥염에 대한 혈액 실험 및 EHV-1 및 EHV-4 DNA에 대한 실시간 PCR 분석은 음성이었다.
비액 분비물 중의 인플루엔자 바이러스의 존재를 초기에 양성 디렉티젠 분석에 의해 확인하였다. 이전 연구들은 말 비액 분비 샘플에 적용될 때의 상기 분석법의 감도 및 특이성을 보고했다 (문헌 [Morely et al., 1995 and Chambers et al., 1994]). 비액 면봉 이동 배지 샘플을 또한 배아 계란의 요막강 및 24-웰 세포 배양 플레이트에서 성장중인 마딘-다비 개 신장 (Madin-Darby canine kidney (MDCK)) 세포에 접종했다. 인플루엔자 바이러스 성장과 일치하는 세포병리 효과를 접종 MDCK 세포에서 관찰하고, 닭 적혈구 세포의 적혈구응집반응을 유발하는 약제를 접종 계란으로부터 단리했다 (Palmar et al., 1975). MDCK 세포 배양물 중의 인플루엔자 바이러스의 존재는 접종 세포를 항-NP 모노클로날 항체 (Mab) 68D2 (위스콘신 대학 수의학과 요시히로 카와오카 박사의 기증)로 면역세포화학적 염색(Landolt et al., 2003)하여 확인하고 양성 (접종된 돼지 인플루엔자 바이러스) 및 음성 (접종 가장) 대조군 세포를 동일한 플레이트에 포함했다. H3-아형 말 인플루엔자 바이러스로서의 바이러스의 확인은 단리물 유래의 헤마글루티닌 (HA) 유전자를 올센 등 (Olsen et al. (1997))에 기재된 프라이머를 사용해 역전사-PCR 증폭하여 확인한 후, HA 유전자의 전장 단백질 코딩 영역의 주기 서열화 및 진뱅크 (DNASTAR 소프트웨어, Win32의 버젼 4.0, 베스트피트, 위스콘신 매디슨 소재)에서 이용가능한 바이러스 서열의 쌍별 비교에 의해 확인했다. 1,000 부츠스트랩 복제물의 빠른 발견 검색으로 참조 바이러스 균주와 비교하여 HA 서열의 최대 파리시모니 부츠스트랩 (maximum parsimony bootstrap) 분석법 (PAUP 소프트웨어, 버젼 4.0b6; 데이비드 스워포드 (David Swofford), 워싱턴 디씨, 스미쓰소니안 인스티튜트)을 사용하는 계통발생적 분석법에 의해 H3 말 인플루엔자 바이러스의 북미 계통으로부터 바이러스가 유래됨을 보였다. 비구조 단백질 유전자 (544개 뉴클레오티드 서열) 및 NP 유전자 (885개 뉴클레오티드 서열)의 뉴클레오티드 서열 일부의 유사한 분석이 북미-계통 말 인플루엔자 바이러스로서의 바이러스 정체를 추가로 확인해주었다. 상기 바이러스는 A/말/위스콘신/1/03로 정의된다. 도 1은 상기 바이러스의 각 유전자의 코딩 영역 서열을 제공한다.
인플루엔자 바이러스의 존재를 또한 망아지의 폐 및 기타 조직에서 검사했다. 구체적으로, Mab 68D2로의 면역조직화학적 분석은 냉동된 것뿐만 아니라 포르말린-고정 폐 조직 샘플 중의 흩어진, 널리 분산된 영역에 걸친 인플루엔자 바이러스 NP 발현 (주로 기도 주위에 국소화)을 보여주었다. NP 발현은 기타 내장 또는 중추 신경계에서는 발견되지 않았다. 또한, 인플루엔자 바이러스를 냉동 폐 조직 샘플 유래 MDCK 세포에서 (면역조직화학적 분석 및 HA 유전자 서열화로 확인) 단리하였다.
신생 망아지의 급성호흡곤란증후군 (ARDS)은 박테리아성 패혈증(Wilkins, 2003; Hoffman et al., 1993), 주산기 EHV-1 (Frymus et al., 1986; Gilkerson et al., 1999) 및 EHV-4 (Gilkerson et al., 1999), 및 말 바이러스 동맥염 감염 (Del Piero et al., 1997)의 결과로서 보고되어 왔다. 덜 중증인 저층 기도 질환은 때때로 아데노바이러스 및 EHV-2 감염, 특히 면역능감소된 환자 (Webb et al., 1981; Murray et al., 1996)에서 보고된다. 기관지 간질성 폐렴 및 ARDS는 박테리아 및 바이러스 감염을 비롯한 심각한 잠재적 원인과 함께 나이 든 망아지의 고-사망률 호흡기 질환이다 (Lakritz et al., 1993). 패혈증 쇼크를 경험하는 신생 말 또는 미만성 기관지 간질성 폐렴을 갖는 나이 든 망아지에서 발생하든, ARDS는 급성-발병, 신속한 진행성 중증 빈호흡으로 특징지워진다. ARDS와 자주 동반되는 증가된 호흡 노력, 악화되는 치아노제, 저산소증 및 탄산과잉증은 적극적 요법에 불량하게 반응한다 (Wilkins, 2003; Lakritz et al., 1993). 항균제, 산소, 소염제, 기관지 확장제 및 열조절제로 적극적으로 치료해도 종종 30% 초과의 사망률 및 다수의 잠재적 병인을 갖는 호흡기 질환의 분류에 속한다. 말 인플루엔자는 세계적으로 말의 상층 호흡기 질환의 널리 공지된 원인이나 (Wilkins, 2003; Van Maanen et al., 2002; Wilson, 1993), 신생 말에서의 상기 질환의 발현 정보는 문헌에 거의 존재하지 않는다. 단일 보고에서 7일 된 망아지의 기관지 간질성 폐렴이 기술되었고, 상기 망아지에서 말 인플루엔자 A가 단리되었고 (Britton et al., 2002); 상기 망아지는 상기 본원에 기재된 망아지와 유사했다.
본 연구에서 상술한 망아지는 몇몇 치료된 2- 또는 3-주 동안 열, 점액농성 콧물, 및 기침을 나타낸 말들 중 하나였다. 고위험 신생아를 비롯하여 영향을 받은 다른 말들의 임상적 징후는, 열 및 식욕 부진의 가벼운(mild) 전신 징후를 제외하고, 일반적으로 상부 기도에 제한되었다. 이 망아지에 있어서의 폐 부전증의 심각성의 이유는 불명확하다. 치료는 잠재적 면역억제제 덱사메타손 및 진단 절차를 위한 일반적인 마취를 포함하지 않았는데, 둘 모두는 망아지가 폐렴에 걸리기 쉽게 할 수 있다. 망아지의 신경 질환의 호흡기 질환의 발병 및 진행에 대한 영향 역시 불명확하다. 광범위 공포형성(vacuolization)의 조직학적 발견이 중추 신경계 전체에 걸쳐 미엘린을 감소시켰고, 소뇌 내의 결핍된 분자 층은 어떠한 특이적인 임상적 또는 조직 병리학적 진단에도 맞지 않는다. 호흡기 조절과 관련된 뇌의 영역(교뇌 및 연수)이 광범위 공포형성을 나타내고 미엘린 염색을 손상시켰기 때문에, 망아지는 호흡기의 손상된 중추 조절을 가질 수 있었다. 치료 후 며칠까지 정상 환기 기능이 부여된다면, 임의의 후속하는 환기의 손상은 최종적인 사건일 것 같았다. 그러나, 태어날 때부터의 비정상적인 정신 작용, 공포형성, 중추 신경계 내의 감소한 수초 형성, 및 소뇌 비정상은 동시에 발생하는 선천적인 신경 비정상을 암시하며, 이는 망아지의 악화하는 호흡 기능에 반응하는 능력을 손상시킬 수 있다. 뇌의 꼬리 배쪽 면(caudal ventral aspect)에서 관찰되는 국소 출혈은 가벼운(mild) 정도였으며 망아지가 경험한 발작들 중 하나 동안의 외상의 결과일 가능성이 있었다.
암말은 지난 2년 동안 사멸된 제품으로 인플루엔자에 대해 반년마다 백신 접종을 받아왔고 임신 말기에 백신 추가 접종을 받았다. 이 망아지에 있어서의 적절한 수동적 전달의 증거를 고려하면, 이들 항체는 명백하게 망아지에 대한 적절한 보호를 부여하지 않았다. 또한, 망아지로부터 수득한 단리물의 계통발생학적 분석은 그것을 H3N8 아형으로 간주하며, 임신 말기의 암말을 백신 접종하는데 사용되는 상업 제품은 동일한 아형의 인플루엔자 바이러스주를 함유하며, 이는 수동적 전달이 특정 환경하에서의 자연 감염으로부터의 보호를 보장할 수 없다는 것을 암시한다. 이 백신 효능의 결핍은 상업적으로 이용가능한 H7N7 및 H3N8 말 인플루엔자 바이러스 백신이 성인을 특정 H3N8 바이러스주에 의한 자연 감염으로부터 초래된 임상적 호흡기 질환으로부터 보호하는데 실패하였다고 기술하는 뭄포드(Mumford) 등의 최근의 연구(2003년)와 일관된다. 사망시의 적소에 항균 요법에 대한 내성을 지닌 박테리아 2종의 경기관 회복이 인플루엔자가 사망의 유일한 원인이었다는 결론을 교란시킨다. 그러나, 부검이 패혈증의 육안적 또는 조직 병리학적 증거를 확인하지 못했고, 인플루엔자 바이러스와 일부 박테리아 병원체 사이에 상승작용이 발생하여, 조합하여 사망률이 높은 폐렴을 발생시킨다(McCullers et al., 2003; Simonsen et al., 1999). 또한, 바이러스가 처음에 코인두 면봉법에 의해 회복된지 6일 후 부검에 의해 얻어진 폐 조직으로부터의 감염 바이러스의 단리 및 바이러스 항원의 면역조직화학적 증거는 이 망아지의 호흡 부전에 있어서의 인플루엔자 바이러스로부터의 병리학적 기여의 강한 증거를 제공한다.
제1기 개 호흡 상피 세포 내에서의 조류, 말, 인간, 및 돼지 계통 바이러스의 성장 특성을 비교하기 위해, 그리고 그 성장 특성에 대한 종의 영향을 조사하기 위해, 배양된 세포를 3 MOI에서 A/말/위스콘신/1/03을 포함하는 바이러스로 감염시키고 최대 10시간 동안 인큐베이션하였다. 다른 바이러스는 여섯 개의 인간 및 돼지 인플루엔자 A 바이러스 단리물(A/필리핀/08/98, A/파나마/2002/99, A/코스타리카/07/99; A/돼지/노스캐롤라이나/44173/00, A/돼지/미네소타/593/99, A/돼지/온타리오/00130/97), 및 두 개의 말 인플루엔자 바이러스(A/말/켄터키/81 및 A/말/켄터키/91)를 포함했다. 실험의 마지막에, 면역세포화학 및 유속 세포 분석을 위해 세포를 포르말린으로 고정하였다.
상기 언급된 여섯 개의 인간 및 돼지 인플루엔자 바이러스 단리물은 실질적으로 모든(80 내지 90%) 개 호흡 상피 세포들을 손쉽게 감염시켰고 그 세포들 내에서 높은 역가(105.3-107 TCID50/㎖)까지 성장하였다. A/말/켄터키/81 및 A/말/켄터키/91은 검출 가능한 바이러스 성장이 적거나(A/말/켄터키/81에 대해 101.7 TCID50/㎖) 없으면서(A/말/켄터키/91에 대해) 그들의 감염성에 있어서 고도로 제한되었다(감염된 세포의 10% 미만). 대조적으로, A/말/위스콘신/1/03은 보다 큰 퍼센트(약 30%)의 제1기 개 호흡 상피 세포들을 감염시켰고 그 세포들 내에서 실질적으로 보다 높은 역가(약 104.8 TCID50/㎖)까지 성장하였다. 이 결과는 시험된 모든 인플루엔자 A 바이러스가 개 제1기 호흡 상피 세포들을 감염시킬 수 있음을 입증하였다. 그러나, 바이러스의 감염성 및 복제 특성은 계통에 강하게 의존하였다.
두보비(Dubovi) 등은 2004년에 플로리다의 경주용 켄넬(kennel)에서의 그레이하운드 개의 기침 및 열을 특징으로 하는 심한 호흡기 질환의 재발성 발발을 언급하였다. 대부분의 영향 받은 개들은 회복되었으나, 일부는 치명적인 출혈성 폐렴으로 죽었다. 출혈성 폐렴 증후군에 의해 죽은 다섯 마리의 개의 폐 조직에 대해 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포(Vero), 마딘-다비(Madin-Darby) 개 신장 상피 세포(MDCK), 제1기 개 신장 상피 세포, 제1기 개 폐 상피 세포, 제1기 소 고환 상피 세포, 개 종양 섬유모세포(A-72), 및 인간 직장 샘암종 상피 세포(HRT-18)로 바이러스 단리 연구를 하였다(Dubovi et al., 2004). MDCK 세포 내의 세포병리학이 개들 중 한 마리로부터의 폐 균질화의 제1 경로에 대해 주목되었고, 배양 상청액 내의 혈구 응집 활성의 존재와 결부된 트립신 없이 배양된 세포에 대한 후속 경로에 대한 세포병리학의 소실은 인플루엔자 바이러스의 존재를 암시하였다(Dubovi et al., 2004). 바이러스는 처음에 매트릭스 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 인플루엔자 바이러스로 확인되었다. 개 인플루엔자 바이러스는 A/개/플로리다/43/04주로 명명되었다. 폐로부터의 바이러스 단리, 면역조직화학에 의한 폐 조직 내의 바이러스 항원의 존재, 및 혈청전환 데이터에 기초하여, 두보비 등은 2004년에 단리된 인플루엔자 바이러스가 잭슨빌 2004 발발 동안의 경주용 그레이하운드의 치명적인 출혈성 폐렴의 원인이 되는 가장 가능성 있는 원인체라고 결론지었고, 이것을 개의 호흡기 질환과 관련된 말 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 보고로 결론지었다(두보비 등, 2004). 개 단리물의 HA 단백질은 A/말/위스콘신/1/03주와 단지 여섯 개의 아미노산에 있어서만 상이하다.
참고문헌
문헌[Avery's Drug Treatment : Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987)].
문헌[Aymard-Henry et al., Virology : A Practical Approach, Oxford IRL Press, Oxford, 119-150 (1985)].
문헌[Bachmeyer, Intervirology, 5:260 (1975)].
문헌[Berkow et al., eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck & Co., Rahway, NJ (1992)].
문헌[Britton et al., Can . Vet . J., 43:55 (2002)].
문헌[Chambers et al., Vet . Rec ., 135:275 (1994)].
문헌[Daly and Mumford, In　: Equine Respiratory Diseases Lekeux (ed.) International Veterinary Information Science, Ithaca, NY (2001)].
문헌[Del Piero et al., Equine Vet . J., 29:178 (1997)].
문헌[Dubovi et al., Proceedings of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnostics, p. 158 (2004)].
문헌[Enami et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 87:3802 (1990)].
문헌[Frymus et al., Pol . Arch . Med . Wewn, 26:7 (1993)].
문헌[Gilkerson et al., Vet . Microbiol ., 68:27 (1999)].
문헌[Grand and Skehel, Nature , New Biology, 238:145 (1972)].
문헌[Hoffman et al., Am . J. Vet . Res ., 54:1615 (1993)].
문헌[Kilbourne, Bull . M2 World Health Org ., 41: 653 (1969)].
문헌[Lakritz et al., J. Vet . Intern . Med ., 7:277 (1984-1989)].
문헌[Landolt et al., J. Clin . Microbiol ., 41:1936 (2001)].
문헌[Laver & Webster, Virology, 69:511 (1976)].
문헌[Marriott et al., Adv . Virus Res ., 53:321 (1999)].
문헌[McCullers et al., J. Infect . Dis ., 187:1000 (2003)].
문헌[Morley et al., Equine Vet . J., 27:131 (1995)].
문헌[Mumford et al., Equine Vet . J., 35:72 (2003)].
문헌[Murphy, Infect . Dis . Clin . Pract ., 2: 174 (1993)].
문헌[Murray et al., Equine Vet . J., 28:432 (1996)].
문헌[Muster et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 88: 5177 (1991)].
문헌[Neumann et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A, 96:9345 (1999)].
문헌[Ogra et al., J. Infect . Dis ., 134: 499 (1977)].
문헌[Olsen et al., Vaccine, 15:1149 (1997)].
문헌[Osol (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 1324-1341 (1980)].
문헌[Palmar et al., Madison WI　: University of Wisconsin Department of Health, Education and Welfare Immunology Series (1975)].
문헌[Park et al., Proc . R. Soc . London B., 271:1547 (2004)].
문헌[Robertson et al., Biologicals, 20:213 (1992)].
문헌[Robertson et al., Giornale di Igiene e Medicina Preventiva, 29:4 (1988)].
문헌[Simonsen, Vaccine, 17:S3 (1999)].
문헌[Subbarao et al., J. Virol ., 67:7223 (1993)].
문헌[Van Maanen et al., Vet . Q., 24:79 (2002)].
문헌[Webb et al., Aust . Vet . J., 57:142 (1981)].
문헌[Wilkins, Vet . Clin . North Am . Equine Pract ., 19:19 (2003)].
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 도입된다. 앞의 명세서에서 본 발명이 그것의 특정 바람직한 실시태양과 관련하여 기술되었고, 많은 상세한 설명들이 예시의 목적으로 설명되었지만, 본 발명은 부가적인 실시태양도 받아들일 수 있으며 본원에 기술된 특정 상세한 설명은 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않으면서 상당히 변경될 수 있다는 점은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명은 인플루엔자 감염에 대해 예방적 또는 치료적 반응을 유도하는, 단리된 H3 말 인플루엔자 A 바이러스 및, 바이러스 및 유전자 또는 그들의 단백질의 제조 및 사용방법을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> Olsen, Chris Landolt, Gabriele Karasin, Alexander WARF - Wisconsin Alumni Research <120> H3 Equine Influenza A Virus <130> 800.045US1 <160> 20 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 565 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 1 Met Lys Thr Thr Ile Ile Leu Ile Leu Leu Thr His Trp Ala Tyr Ser 1 5 10 15 Gln Asn Pro Ile Ser Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His 20 25 30 His Ala Val Ala Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Ser Asp Asp Gln 35 40 45 Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ile Ser Met Gly 50 55 60 Lys Ile Cys Asn Asn Ser Tyr Arg Ile Leu Asp Gly Arg Asn Cys Thr 65 70 75 80 Leu Ile Asp Ala Met Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Ala Phe Gln Tyr 85 90 95 Glu Asn Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Ser Ala Phe Ser Asn Cys 100 105 110 Tyr Pro Tyr Asp Ile Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val Ala 115 120 125 Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Thr Ala Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly 130 135 140 Val Thr Gln Asn Gly Arg Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Ser Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Ser Ser Tyr 165 170 175 Pro Thr Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys Leu 180 185 190 Tyr Ile Trp Gly Ile His His Pro Ser Ser Asn Gln Glu Gln Thr Lys 195 200 205 Leu Tyr Ile Gln Glu Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser 210 215 220 Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg Gly 225 230 235 240 Gln Ser Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp 245 250 255 Ile Leu Met Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Gly Tyr 260 265 270 Phe Lys Leu Lys Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Val Pro 275 280 285 Ile Asp Ile Cys Val Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Ser 290 295 300 Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Val Thr Tyr Gly Lys Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Ile Arg Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg 325 330 335 Asn Val Pro Glu Lys Gln Ile Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe 355 360 365 Arg Tyr Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile 385 390 395 400 Glu Arg Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu 405 410 415 Val Glu Arg Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys 420 425 430 Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn 435 440 445 Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ala Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu 450 455 460 Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Gly Gly 465 470 475 480 Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile 485 490 495 Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Tyr Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn 500 505 510 Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp 515 520 525 Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Ile Cys Val 530 535 540 Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg 545 550 555 560 Cys Asn Ile Cys Ile 565 <210> 2 <211> 470 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 2 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Ile Gly Phe Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ile Leu Ile Ile Asn Val Ile Leu His Val Val Ser Ile Ile Val Thr 20 25 30 Val Leu Val Leu Asn Asn Asn Arg Thr Asp Leu Asn Cys Lys Gly Thr 35 40 45 Ile Ile Arg Glu Tyr Asn Glu Thr Val Arg Val Glu Lys Ile Thr Gln 50 55 60 Trp Tyr Asn Thr Ser Thr Ile Lys Tyr Ile Glu Arg Pro Ser Asn Glu 65 70 75 80 Tyr Tyr Met Asn Asn Thr Glu Pro Leu Cys Glu Ala Gln Gly Phe Ala 85 90 95 Pro Phe Ser Lys Asp Asn Gly Ile Arg Ile Gly Ser Arg Gly His Val 100 105 110 Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Val Ser Cys Ser Pro Ser Glu Cys Arg 115 120 125 Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ser Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn 130 135 140 Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Val Lys 145 150 155 160 Ile Gly Gln Ser Pro Asn Val Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Ser Val Ala 165 170 175 Trp Ser Ala Thr Ala Cys His Asp Gly Lys Lys Trp Met Thr Val Gly 180 185 190 Val Thr Gly Pro Asp Asn Gln Ala Ile Ala Val Val Asn Tyr Gly Gly 195 200 205 Val Pro Val Asp Ile Ile Asn Ser Trp Ala Gly Asp Ile Leu Arg Thr 210 215 220 Gln Glu Ser Ser Cys Thr Cys Ile Lys Gly Asp Cys Tyr Trp Val Met 225 230 235 240 Thr Asp Gly Pro Ala Asn Arg Gln Ala Lys Tyr Arg Ile Phe Lys Ala 245 250 255 Lys Asp Gly Arg Val Ile Gly Gln Thr Asp Ile Ser Phe Asn Gly Gly 260 265 270 His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asn Glu Gly Lys Val Glu Cys 275 280 285 Ile Cys Arg Asp Asn Trp Thr Gly Thr Asn Arg Pro Ile Leu Val Ile 290 295 300 Ser Ser Asp Leu Ser Tyr Thr Val Gly Tyr Leu Cys Ala Gly Ile Pro 305 310 315 320 Thr Asp Thr Pro Arg Gly Glu Asp Ser Gln Phe Thr Gly Ser Cys Thr 325 330 335 Ser Pro Leu Gly Asn Lys Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe Arg 340 345 350 Gln Gly Thr Asp Val Trp Ala Gly Arg Thr Ile Ser Arg Thr Ser Arg 355 360 365 Ser Gly Phe Glu Ile Ile Lys Ile Arg Asn Gly Trp Thr Gln Asn Ser 370 375 380 Lys Asp Gln Ile Arg Arg Gln Val Ile Ile Asp Asp Pro Asn Trp Ser 385 390 395 400 Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Thr Leu Pro Val Glu Leu Thr Lys Lys Gly 405 410 415 Cys Leu Val Pro Cys Phe Trp Val Glu Met Ile Arg Gly Lys Pro Glu 420 425 430 Glu Thr Thr Ile Trp Thr Ser Ser Ser Ser Ile Val Met Cys Gly Val 435 440 445 Asp His Lys Ile Ala Ser Trp Ser Trp His Asp Gly Ala Ile Leu Pro 450 455 460 Phe Asp Ile Asp Lys Met 465 470 <210> 3 <211> 757 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 3 Met Asp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Val Pro Ala Gln Asn 1 5 10 15 Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Asp Pro Pro Tyr Ser His 20 25 30 Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Thr Met Asp Thr Val Asn Arg Thr His Gln 35 40 45 Tyr Ser Glu Lys Gly Lys Trp Thr Thr Asn Thr Glu Ile Gly Ala Pro 50 55 60 Gln Leu Asn Pro Ile Asp Gly Pro Leu Pro Glu Asp Asn Glu Pro Ser 65 70 75 80 Gly Tyr Ala Gln Thr Asp Cys Val Leu Glu Ala Met Ala Phe Leu Glu 85 90 95 Glu Ser His Pro Gly Ile Phe Glu Asn Ser Cys Leu Glu Thr Met Glu 100 105 110 Val Ile Gln Gln Thr Arg Val Asp Lys Leu Thr Gln Gly Arg Gln Thr 115 120 125 Tyr Asp Trp Thr Leu Asn Arg Asn Gln Pro Ala Ala Thr Ala Leu Ala 130 135 140 Asn Thr Ile Glu Val Phe Arg Ser Asn Gly Leu Thr Ser Asn Glu Ser 145 150 155 160 Gly Arg Leu Met Asp Phe Leu Lys Asp Val Met Glu Ser Met Asn Lys 165 170 175 Glu Glu Met Glu Ile Thr Thr His Phe Gln Arg Lys Arg Arg Val Arg 180 185 190 Asp Asn Met Thr Lys Arg Met Val Thr Gln Arg Thr Ile Gly Lys Lys 195 200 205 Lys Gln Arg Leu Asn Arg Lys Ser Tyr Leu Ile Arg Thr Leu Thr Leu 210 215 220 Asn Thr Met Thr Lys Asp Ala Glu Arg Gly Lys Leu Lys Arg Arg Ala 225 230 235 240 Ile Ala Thr Pro Gly Met Gln Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu 245 250 255 Thr Leu Ala Arg Arg Ile Cys Glu Lys Leu Glu Gln Ser Gly Leu Pro 260 265 270 Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val Val Arg Lys 275 280 285 Met Met Thr Asn Ser Gln Asp Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ile Thr Gly 290 295 300 Asp Asn Thr Lys Trp Asn Glu Asn Gln Asn Pro Arg Ile Phe Leu Ala 305 310 315 320 Met Ile Thr Tyr Ile Thr Arg Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Val 325 330 335 Leu Ser Ile Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Tyr Met Phe Glu Ser Lys Ser Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile 355 360 365 Pro Ala Gly Met Leu Ala Ser Ile Asp Leu Lys Tyr Phe Asn Asp Pro 370 375 380 Thr Lys Lys Lys Ile Glu Lys Ile Arg Pro Leu Leu Val Asp Gly Thr 385 390 395 400 Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser 405 410 415 Thr Val Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Arg Lys Tyr Thr 420 425 430 Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala 435 440 445 Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp 450 455 460 Arg Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Val Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys 465 470 475 480 Lys Ser Tyr Ile Asn Arg Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe 485 490 495 Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro Ser Phe 500 505 510 Gly Val Ser Gly Ile Asn Glu Ser Ala Asp Met Ser Ile Gly Val Thr 515 520 525 Val Ile Lys Asn Asn Met Ile Asn Asn Asp Leu Gly Pro Ala Thr Ala 530 535 540 Gln Met Ala Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg 545 550 555 560 Cys His Arg Gly Asp Thr Gln Ile Gln Thr Arg Arg Ser Phe Glu Leu 565 570 575 Lys Lys Leu Trp Glu Gln Thr Arg Ser Lys Thr Gly Leu Leu Val Ser 580 585 590 Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Asn Ile Arg Asn Leu His Ile Pro Glu 595 600 605 Val Cys Leu Lys Trp Glu Leu Met Asp Glu Asp Tyr Lys Gly Arg Leu 610 615 620 Cys Asn Pro Leu Asn Pro Phe Val Ser His Lys Glu Ile Glu Ser Val 625 630 635 640 Asn Ser Ala Val Val Met Pro Ala His Gly Pro Ala Lys Ser Met Glu 645 650 655 Tyr Asp Ala Val Ala Thr Thr His Ser Trp Ile Pro Lys Arg Asn Arg 660 665 670 Ser Ile Leu Asn Thr Ser Gln Arg Gly Ile Leu Glu Asp Glu Gln Met 675 680 685 Tyr Gln Lys Cys Cys Asn Leu Phe Glu Lys Phe Phe Pro Ser Ser Ser 690 695 700 Tyr Arg Arg Pro Val Gly Ile Ser Ser Met Val Glu Ala Met Val Ser 705 710 715 720 Arg Ala Arg Ile Asp Ala Arg Ile Asp Phe Glu Ser Gly Arg Ile Lys 725 730 735 Lys Asp Glu Phe Ala Glu Ile Met Lys Ile Cys Ser Thr Ile Glu Glu 740 745 750 Leu Arg Arg Gln Lys 755 <210> 4 <211> 759 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 4 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Leu Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met 50 55 60 Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Ile His Tyr Pro 100 105 110 Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Val Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr 210 215 220 Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp 225 230 235 240 Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Ile Asp 245 250 255 Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Thr Val 260 265 270 Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln 275 280 285 Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Lys Gln Asn Pro Thr Glu 290 295 300 Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Met Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu 340 345 350 Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg 355 360 365 Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu 370 375 380 Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 385 390 395 400 Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly 405 410 415 Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His 420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 435 440 445 Trp Gly Ile Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu 450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Val Arg Val 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Ile Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr 515 520 525 Ile Ile Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser 530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Ile Val 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Ile Glu 565 570 575 Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Arg Ala Thr Arg Ser Gln Tyr 580 585 590 Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly 595 600 605 Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala 610 615 620 Pro Pro Glu Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val 625 630 635 640 Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe 645 650 655 Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala 660 665 670 Gly Ala Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser 675 680 685 Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asn Lys Arg Tyr 690 695 700 Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Lys Leu Ala Lys Gly Glu 705 710 715 720 Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys 725 730 735 Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys 740 745 750 Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn 755 <210> 5 <211> 716 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 5 Met Glu Asp Phe Val Arg Gln Cys Phe Asn Pro Met Ile Val Glu Leu 1 5 10 15 Ala Glu Lys Ala Met Lys Glu Tyr Gly Glu Asp Pro Lys Ile Glu Thr 20 25 30 Asn Lys Phe Ala Ala Ile Cys Thr His Leu Glu Val Cys Phe Met Tyr 35 40 45 Ser Asp Phe His Phe Ile Asn Glu Leu Ser Glu Ser Val Val Ile Glu 50 55 60 Ser Gly Asp Pro Asn Ala Leu Leu Lys His Arg Phe Glu Ile Ile Glu 65 70 75 80 Gly Arg Asp Arg Thr Met Ala Trp Thr Val Val Asn Ser Ile Cys Asn 85 90 95 Thr Thr Arg Ala Glu Lys Pro Lys Phe Leu Pro Asp Leu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Lys Glu Asn Arg Phe Val Glu Ile Gly Val Thr Arg Arg Glu Val His 115 120 125 Ile Tyr Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Ile Lys Ser Glu Lys Thr His 130 135 140 Ile His Ile Phe Ser Phe Thr Gly Glu Glu Met Ala Thr Lys Ala Asp 145 150 155 160 Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Ser Arg Ala Arg Ile Lys Thr Arg Leu Phe 165 170 175 Thr Ile Arg Gln Glu Met Ala Ser Arg Gly Leu Trp Asp Ser Phe Arg 180 185 190 Gln Ser Glu Arg Gly Glu Glu Thr Ile Glu Glu Arg Phe Glu Ile Thr 195 200 205 Gly Thr Met Arg Lys Leu Ala Asn Tyr Ser Leu Pro Pro Asn Phe Ser 210 215 220 Ser Leu Glu Asn Phe Arg Val Tyr Val Asp Gly Phe Glu Pro Asn Gly 225 230 235 240 Cys Ile Glu Ser Lys Leu Ser Gln Met Ser Lys Glu Val Asn Ala Arg 245 250 255 Ile Glu Pro Phe Ser Lys Thr Thr Pro Arg Pro Leu Lys Met Pro Gly 260 265 270 Gly Pro Pro Cys His Gln Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu 275 280 285 Lys Leu Ser Ile Glu Asp Pro Ser His Glu Gly Glu Gly Ile Pro Leu 290 295 300 Tyr Asp Ala Ile Lys Cys Met Lys Thr Phe Phe Gly Trp Lys Glu Pro 305 310 315 320 Ser Ile Val Lys Pro His Glu Lys Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Leu Gln 325 330 335 Thr Trp Lys Gln Val Leu Ala Glu Leu Gln Asp Leu Glu Asn Glu Glu 340 345 350 Lys Asp Pro Lys Thr Lys Asn Met Lys Lys Thr Ser Gln Leu Lys Trp 355 360 365 Ala Leu Ser Glu Asn Met Ala Pro Glu Lys Val Asp Phe Glu Asp Cys 370 375 380 Lys Asp Ile Ser Asp Leu Lys Gln Tyr Asp Ser Asp Glu Pro Glu Thr 385 390 395 400 Arg Ser Leu Ala Ser Trp Ile Gln Ser Glu Phe Asn Lys Ala Cys Glu 405 410 415 Leu Thr Asp Ser Ser Trp Ile Glu Leu Asp Glu Ile Gly Glu Asp Val 420 425 430 Ala Pro Ile Glu Tyr Ile Ala Ser Met Arg Arg Asn Tyr Phe Thr Ala 435 440 445 Glu Val Ser His Cys Arg Ala Thr Glu Tyr Ile Met Lys Gly Val Tyr 450 455 460 Ile Asn Thr Ala Leu Leu Asn Ala Ser Cys Ala Ala Met Asp Glu Phe 465 470 475 480 Gln Leu Ile Pro Met Ile Ser Lys Cys Arg Thr Lys Glu Gly Arg Arg 485 490 495 Lys Thr Asn Leu Tyr Gly Phe Ile Val Lys Gly Arg Ser His Leu Arg 500 505 510 Asn Asp Thr Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met Glu Phe Ser Leu Thr 515 520 525 Asp Pro Arg Phe Glu Pro His Lys Trp Glu Lys Tyr Cys Val Leu Glu 530 535 540 Ile Gly Asp Met Leu Leu Arg Thr Ala Val Gly Gln Val Ser Arg Pro 545 550 555 560 Met Phe Leu Tyr Val Arg Thr Asn Gly Thr Ser Lys Ile Lys Met Lys 565 570 575 Trp Gly Met Glu Met Arg Arg Cys Leu Leu Gln Ser Leu Gln Gln Ile 580 585 590 Glu Ser Met Ile Glu Ala Glu Ser Ser Val Lys Glu Lys Asp Met Thr 595 600 605 Lys Glu Phe Phe Glu Asn Lys Ser Glu Thr Trp Pro Ile Gly Glu Ser 610 615 620 Pro Lys Gly Val Glu Glu Gly Ser Ile Gly Lys Val Cys Arg Thr Leu 625 630 635 640 Leu Ala Lys Ser Val Phe Asn Ser Leu Tyr Ala Ser Pro Gln Leu Glu 645 650 655 Gly Phe Ser Ala Glu Ser Arg Lys Leu Leu Leu Ile Val Gln Ala Leu 660 665 670 Arg Asp Asn Leu Glu Pro Gly Thr Phe Asp Ile Gly Gly Leu Tyr Glu 675 680 685 Ser Ile Glu Glu Cys Leu Ile Asn Asp Pro Trp Val Leu Leu Asn Ala 690 695 700 Ser Trp Phe Asn Ser Phe Leu Thr His Ala Leu Lys 705 710 715 <210> 6 <211> 498 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 6 Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met 20 25 30 Val Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Val Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys 35 40 45 Leu Asn Asp His Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu 50 55 60 Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile 85 90 95 Tyr Arg Arg Lys Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu His Asp 100 105 110 Lys Glu Glu Ile Met Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160 Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 180 185 190 Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 195 200 205 Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp 225 230 235 240 Gln Val Arg Glu Gly Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu 245 250 255 Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270 Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Thr Ser Gly 275 280 285 Tyr Asp Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe 290 295 300 Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ile Phe Ser Leu Ile Arg Pro Lys Glu 305 310 315 320 Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala 325 330 335 Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Asn Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val 340 345 350 Ile Pro Arg Gly Gln Leu Thr Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn 355 360 365 Glu Asn Met Glu Thr Ile Asp Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Lys 370 375 380 Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Ser Gln Gln Arg 385 390 395 400 Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg 405 410 415 Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn 420 425 430 Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met 435 440 445 Glu Asn Ala Lys Ser Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe 450 455 460 Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp 465 470 475 480 Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Phe 485 490 495 Asp Ser <210> 7 <211> 252 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 7 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Val Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Ser Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Arg 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys 245 250 <210> 8 <211> 230 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 8 Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe 20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser 35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr His Ala Gly Lys Gln Ile 50 55 60 Val Glu Gln Ile Leu Glu Lys Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Ile Ala Ser Val Pro Thr Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Asp 85 90 95 Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Thr 100 105 110 Gly Ser Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile 115 120 125 Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Glu Arg Leu Glu Thr Leu 130 135 140 Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Val Val Gly Glu Ile 145 150 155 160 Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Asn Glu Asp Val Lys Asn 165 170 175 Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Lys Trp Asn Asp Asn Thr Val 180 185 190 Arg Ile Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser His Glu 195 200 205 Asn Gly Arg Pro Ser Phe Pro Ser Lys Gln Lys Arg Lys Met Glu Arg 210 215 220 Thr Ile Lys Pro Lys Ile 225 230 <210> 9 <211> 1701 <212> DNA <213> Influenza A Virus <400> 9 tcatgaagac aaccattatt ttgatactac tgacccattg ggcttacagt caaaacccaa 60 tcagtggcaa caacacagcc acattgtgtc tgggacacca tgcagtagca aatggaacat 120 tggtaaaaac aataagtgat gatcaaattg aggtgacaaa tgctacagaa ttagttcaaa 180 gcatttcaat ggggaaaata tgcaacaact catatagaat tctagatgga agaaattgca 240 cattaataga tgcaatgcta ggagaccccc actgtgacgc ctttcagtat gagaattggg 300 acctctttat agaaagaagc agcgctttca gcaattgcta cccatatgac atccctgact 360 atgcatcgct ccgatccatt gtagcatcct caggaacatt ggaattcaca gcagagggat 420 tcacatggac aggtgtcact caaaacggaa gaagtggagc ctgcaaaagg ggatcagccg 480 atagtttctt tagccgactg aattggctaa caaaatctgg aagctcttac cccacattga 540 atgtgacaat gcctaacaat aaaaatttcg acaagctata catctggggg attcatcacc 600 cgagctcaaa tcaagagcag acaaaattgt acatccaaga atcaggacga gtaacagtct 660 caacaaaaag aagtcaacaa acaataatcc ctaacatcgg atctagaccg tgggtcagag 720 gtcaatcagg taggataagc atatactgga ccattgtaaa acctggagat atcctaatga 780 taaacagtaa tggcaactta gttgcaccgc ggggatattt taaattgaaa acagggaaaa 840 gctctgtaat gagatcagat gtacccatag acatttgtgt gtctgaatgt attacaccaa 900 atggaagcat ctccaacgac aagccattcc aaaatgtgaa caaagttaca tatggaaaat 960 gccccaagta tatcaggcaa aacactttaa agctggccac tgggatgagg aatgtaccag 1020 aaaagcaaat cagaggaatc tttggagcaa tagcgggatt catcgaaaac ggctgggaag 1080 gaatggttga tgggtggtat gggttccgat atcaaaactc tgaaggaaca gggcaagctg 1140 cagatctaaa gagcactcaa gcagccatcg accagattaa tggaaagtta aacagagtga 1200 ttgaaagaac caatgagaaa ttccatcaaa tagagaagga attctcagaa gtagaaagaa 1260 gaattcagga cttggagaaa tatgtagaag acaccaaaat agacctatgg tcctacaatg 1320 cagaattgct ggtggctcta gaaaatcaac atacaattga cttaacagat gcagaaatga 1380 ataaattatt tgagaagact agacgccagt taagagaaaa cgcagaagac atgggaggtg 1440 gatgtttcaa gatttaccac aaatgtgata atgcatgcat tggatcaata agaaatggga 1500 catatgacca ttacatatac agagatgaag cattaaacaa ccgatttcag atcaaaggtg 1560 tagagttgaa atcaggctac aaagattgga tactgtggat ttcattcgcc atatcatgct 1620 tcttaatttg cgttgttcta ttgggtttca ttatgtgggc ttgccaaaaa ggcaacatca 1680 gatgcaacat ttgcatttga g 1701 <210> 10 <211> 1413 <212> DNA <213> Influenza A Virus <400> 10 atgaatccaa atcaaaagat aatagcaatt ggatttgcat cattggggat attaatcatt 60 aatgtcattc tccatgtagt cagcattata gtaacagtac tggtcctcaa taacaataga 120 acagatctga actgcaaagg gacgatcata agagagtaca atgaaacagt aagagtagaa 180 aaaattactc aatggtataa taccagtaca attaagtaca tagagagacc ttcaaatgaa 240 tactacatga acaacactga accactttgt gaggcccaag gctttgcacc attttccaaa 300 gataatggaa tacgaattgg gtcgagaggc catgtttttg tgataagaga accttttgta 360 tcatgttcgc cctcagaatg tagaaccttt ttcctcacac agggctcatt actcaatgac 420 aaacattcta acggcacagt aaaggaccga agtccgtata ggactttgat gagtgtcaaa 480 atagggcaat cacctaatgt atatcaagct aggtttgaat cggtggcatg gtcagcaaca 540 gcatgccatg atggaaaaaa atggatgaca gttggagtca cagggcccga caatcaagca 600 attgcagtag tgaactatgg aggtgttccg gttgatatta ttaattcatg ggcaggggat 660 attttaagaa cccaagaatc atcatgcacc tgcattaaag gagactgtta ttgggtaatg 720 actgatggac cggcaaatag gcaagctaaa tataggatat tcaaagcaaa agatggaaga 780 gtaattggac agactgatat aagtttcaat gggggacaca tagaggagtg ttcttgttac 840 cccaatgaag ggaaggtgga atgcatatgc agggacaatt ggactggaac aaatagacca 900 attctggtaa tatcttctga tctatcgtac acagttggat atttgtgtgc tggcattccc 960 actgacactc ctaggggaga ggatagtcaa ttcacaggct catgtacaag tcctttggga 1020 aataaaggat acggtgtaaa aggtttcggg tttcgacaag gaactgacgt atgggccgga 1080 aggacaatta gtaggacttc aagatcagga ttcgaaataa taaaaatcag gaatggttgg 1140 acacagaaca gtaaagacca aatcaggagg caagtgatta tcgatgaccc aaattggtca 1200 ggatatagcg gttctttcac attgccggtt gaactaacaa aaaagggatg tttggtcccc 1260 tgtttctggg ttgaaatgat tagaggtaaa cctgaagaaa caacaatatg gacctctagc 1320 agctccattg tgatgtgtgg agtagatcat aaaattgcca gttggtcatg gcacgatgga 1380 gctattcttc cctttgacat cgataagatg taa 1413 <210> 11 <211> 2277 <212> DNA <213> Influenza A Virus <400> 11 atggatgtca atccgactct acttttctta aaggtgccag cgcaaaatgc tataagcaca 60 acatttcctt atactggaga tcctccctac agtcatggaa cagggacagg atacaccatg 120 gatactgtca acagaacaca ccaatattca gaaaaaggga aatggacaac aaacactgag 180 attggagcac cacaacttaa tccaatcgat ggaccacttc ctgaagacaa tgaaccaagt 240 gggtacgccc aaacagattg tgtattggaa gcaatggctt tccttgaaga atcccatccc 300 ggaatctttg aaaattcgtg tcttgaaacg atggaggtga ttcagcagac aagagtggac 360 aaactaacac aaggccgaca aacttatgat tggaccttga ataggaatca acctgccgca 420 acagcacttg ctaatacgat tgaagtattc agatcaaatg gtctgacttc caatgaatcg 480 gggagattga tggacttcct caaagatgtc atggagtcca tgaacaagga agaaatggaa 540 ataacaacac acttccaacg gaagagaaga gtaagagaca acatgacaaa gagaatggta 600 acacagagaa ccatagggaa gaaaaaacaa cgattaaaca gaaagagcta tctaatcaga 660 acattaaccc taaacacaat gaccaaggac gctgagagag ggaaattgaa acgacgagca 720 atcgctaccc cagggatgca gataagaggg tttgtatatt ttgttgaaac actagcccga 780 agaatatgtg aaaagcttga acaatcagga ttgccagttg gcggtaatga gaaaaaggcc 840 aaactggcta atgtcgtcag aaaaatgatg actaattccc aagacactga actctccttc 900 accatcactg gggacaatac caaatggaat gaaaatcaga acccacgcat attcctggca 960 atgatcacat acataactag aaaccagcca gaatggttca gaaatgttct aagcattgca 1020 ccgattatgt tctcaaataa aatggcaaga ctggggaaag gatatatgtt tgaaagcaaa 1080 agtatgaaat tgagaactca aataccagca ggaatgcttg caagcattga cctgaaatat 1140 ttcaatgatc caacaaaaaa gaaaattgaa aagatacgac cacttctggt tgacgggact 1200 gcttcactga gtcctggcat gatgatggga atgttcaaca tgttgagcac tgtgctaggt 1260 gtatccatat taaacctggg ccagaggaaa tacacaaaga ccacatactg gtgggatggt 1320 ctgcaatcat ccgatgactt tgctttgata gtgaatgcgc ctaatcatga aggaatacaa 1380 gctggagtag acagattcta taggacttgc aaactggtcg ggatcaacat gagcaaaaag 1440 aagtcctaca taaatagaac tggaacattc gaattcacaa gctttttcta ccggtatggt 1500 tttgtagcca atttcagcat ggaactaccc agttttgggg tttccggaat aaatgaatct 1560 gcagacatga gcattggagt gacagtcatc aaaaacaaca tgataaataa tgatctcggt 1620 cctgccacgg cacaaatggc actccaactc ttcattaagg attatcggta cacataccgg 1680 tgccatagag gtgataccca gatacaaacc agaagatctt ttgagttgaa gaaactgtgg 1740 gaacagactc gatcaaagac tggtctactg gtatcagatg ggggtccaaa cctatataac 1800 atcagaaacc tacacatccc ggaagtctgt ttaaaatggg agctaatgga tgaagattat 1860 aaggggaggc tatgcaatcc attgaatcct ttcgttagtc acaaagaaat tgaatcagtc 1920 aacagtgcag tagtaatgcc tgcgcatggc cctgccaaaa gcatggagta tgatgctgtt 1980 gcaacaacac attcttggat ccccaagagg aaccggtcca tattgaacac aagccaaagg 2040 ggaatactcg aagatgagca gatgtatcag aaatgctgca acctgtttga aaaattcttc 2100 cccagcagct catacagaag accagtcggg atttctagta tggttgaggc catggtgtcc 2160 agggcccgca ttgatgcacg aattgacttc gaatctggac ggataaagaa ggatgagttc 2220 gctgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagagctca gacggcaaaa atagtga 2277 <210> 12 <211> 2281 <212> DNA <213> Influenza A Virus <400> 12 atggagagaa taaaagaact gagagatctg atgttacaat cccgcacccg cgagatacta 60 acaaaaacta ctgtggacca catggccata atcaagaaat acacatcagg aagacaagag 120 aagaaccctg cacttaggat gaaatggatg atggcaatga aatacccaat tacagcagat 180 aagaggataa tggagatgat tcctgagaga aatgaacagg gacaaaccct ttggagcaaa 240 acgaacgatg ctggctcaga ccgcgtaatg gtatcacctc tggcagtgac atggtggaat 300 aggaatggac caacaacaag cacaattcat tatccaaaag tctacaaaac ttattttgaa 360 aaggttgaaa gattgaaaca cggaaccttt ggccccgttc attttaggaa tcaagtcaag 420 ataagacgaa gagttgatgt aaaccctggt cacgcggacc tcagtgccaa agaagcacaa 480 gatgtgatca tggaagttgt tttcccaaat gaagtgggag ccagaattct aacatcggaa 540 tcacaactaa caataaccaa agagaaaaag gaagaacttc aggactgcaa aattgctccc 600 ttgatggtag catacatgct agaaagagag ttggtccgaa aaacaaggtt cctcccagta 660 gcaggcggaa caagcagtgt atacattgaa gtgttgcatc tgactcaggg aacatgctgg 720 gagcaaatgt acaccccagg aggagaagtt agaaacgatg atattgatca aagtttaatt 780 attgcagccc ggaacatagt gagaagagca acagtatcag cagatccact agcatcccta 840 ctggaaatgt gccacagtac acagattggt ggaataagga tggtagacat ccttaagcag 900 aatccaacag aggaacaagc tgtggatata tgcaaagcag caatgggatt gagaattagc 960 tcatcattca gctttggtgg attcaccttc aagagaacaa gtggatcatc agtcaagaga 1020 gaagaagaaa tgcttacggg caaccttcaa acattgaaaa taagagtgca tgagggctat 1080 gaagaattca caatggtcgg aagaagagca acagccattc tcagaaaggc aaccagaaga 1140 ttgattcaat tgatagtaag tgggagagat gaacagtcaa ttgctgaagc aataattgta 1200 gccatggtgt tttcgcaaga agattgcatg ataaaagcag ttcgaggcga tttgaacttt 1260 gttaatagag caaatcagcg cttgaacccc atgcatcaac tcttgaggca tttccaaaag 1320 gatgcaaaag tgcttttcca aaattggggg attgaaccca tcgacaatgt aatgggaatg 1380 attggaatat tgcctgacat gaccccaagc accgagatgt cattgagagg agtgagagtc 1440 agcaaaatgg gagtggatga gtactccagc actgagagag tggtggtgag cattgaccgt 1500 tttttaagag ttcgggatca aaggggaaac atactactgt cccctgaaga agtcagtgaa 1560 acacaaggaa cggaaaagct gacaataatt tattcgtcat caatgatgtg ggagattaat 1620 ggtcccgaat cagtgttggt caatacttat caatggatca tcaggaactg ggaaattgta 1680 aaaattcagt ggtcacagga ccccacaatg ttatacaata agatagaatt tgagccattc 1740 caatccctgg tccctagggc taccagaagc caatacagcg gtttcgtaag aaccctgttt 1800 cagcaaatgc gagatgtact tggaacattt gatactgctc aaataataaa actcctccct 1860 tttgccgctg ctcctccgga acagagtagg atgcagttct cttctttgac tgttaatgta 1920 agaggttcgg gaatgaggat acttgtaaga ggcaattccc cagtgttcaa ctacaataaa 1980 gccactaaaa ggctcacagt cctcggaaag gatgcaggtg cgcttactga ggacccagat 2040 gaaggtacgg ctggagtaga atctgctgtt ctaagagggt ttctcatttt aggtaaagaa 2100 aataagagat atggcccagc actaagcatc aatgaactaa gcaaacttgc aaaaggggag 2160 aaagccaatg tactaattgg gcaaggggac gtagtgttgg taatgaaacg gaaacgtgac 2220 tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagga ttcggatggc catcaattag 2280 t 2281 <210> 13 <211> 2209 <212> DNA <213> Influenza A Virus <400> 13 atggaagact ttgtgcgaca atgcttcaat ccaatgatcg tcgagcttgc ggaaaaggca 60 atgaaagaat atggagagga cccgaaaatc gaaacaaaca aatttgcagc aatatgcact 120 cacttggaag tctgcttcat gtactcggat ttccacttta ttaatgaact gagtgagtca 180 gtggtcatag agtctggtga cccaaatgct cttttgaaac acagatttga aatcattgag 240 gggagagatc gaacaatggc atggacagta gtaaacagca tctgcaacac cacaagagct 300 gaaaaaccta aatttcttcc agatttatac gactataagg agaacagatt tgttgaaatt 360 ggtgtgacaa ggagagaagt tcacatatac tacctggaga aggccaacaa aataaagtct 420 gagaaaacac atatccacat tttctcattt acaggagagg aaatggctac aaaagcggac 480 tatactcttg atgaagagag tagagccagg atcaagacca gactattcac tataagacaa 540 gaaatggcca gtagaggcct ctgggattcc tttcgtcagt ccgagagagg cgaagagaca 600 attgaagaaa gatttgaaat cacagggacg atgcgcaagc ttgccaatta cagtctccca 660 ccgaacttct ccagccttga aaattttaga gtctatgtgg atggattcga accgaacggc 720 tgcattgaga gtaagctttc tcaaatgtcc aaagaagtaa atgccagaat cgaaccattt 780 tcaaagacaa caccccgacc actcaaaatg ccaggtggtc caccctgcca tcagcgatct 840 aaattcctgc taatggatgc tctgaaactg agcattgagg acccaagtca cgagggagag 900 ggaataccac tatatgatgc catcaaatgc atgaaaactt tctttggatg gaaagagccc 960 agtattgtta aaccacatga aaagggtata aacccgaact atctccaaac ttggaagcaa 1020 gtattagcag aattacaaga ccttgagaac gaagaaaagg accccaagac caagaatatg 1080 aaaaaaacaa gccaattgaa atgggcactt agtgaaaata tggcaccaga gaaagtggat 1140 tttgaggatt gtaaagacat cagtgattta aaacagtatg acagtgatga gccagaaaca 1200 aggtctcttg caagttggat tcaaagtgag ttcaacaaag cttgtgaact gacagattca 1260 agctggatag agctcgatga aattggggag gatgttgccc caatagaata cattgcgagc 1320 atgaggagaa attattttac tgctgaggtt tcccattgta gagcaacaga atatataatg 1380 aagggagtgt acatcaacac tgctctactc aatgcatcct gtgctgcgat ggatgaattc 1440 caattaattc cgatgataag taaatgcagg accaaagaag ggagaaggaa gacaaattta 1500 tatggattca tagtaaaggg aaggtcccat ttaagaaatg atactgacgt ggtgaacttt 1560 gtaagtatgg aattttctct cactgatcca agatttgagc cacacaaatg ggaaaaatac 1620 tgcgttctag aaattggaga catgcttcta agaactgctg taggtcaagt gtcaagaccc 1680 atgtttttgt atgtaaggac aaatggaacc tctaaaatta aaatgaaatg gggaatggaa 1740 atgaggcgct gcctccttca gtctctgcaa cagattgaaa gcatgatcga agctgagtcc 1800 tcagtcaaag aaaaggacat gaccaaagaa ttttttgaga acaaatcaga gacatggcct 1860 ataggagagt cccccaaagg agtggaagag ggctcaatcg ggaaggtttg caggacctta 1920 ttagcaaaat ctgtgtttaa cagtttgtat gcatctccac aactggaagg gttttcagct 1980 gaatctagga aattacttct cattgttcag gctcttaggg ataacctgga acctggaacc 2040 tttgatattg gggggttata tgaatcaatt gaggagtgcc tgattaatga tccctgggtt 2100 ttgcttaatg catcttggtt caactccttc cttacacatg cactgaagta gttgtggcaa 2160 tgctactatt tgctatccat actgtccaaa aaagtacctt gtttctact 2209 <210> 14 <211> 1498 <212> DNA <213> Influenza A Virus <400> 14 atggcgtctc aaggcaccaa acgatcctat gaacagatgg aaactgatgg ggaacgccag 60 aatgcaactg aaatcagagc atctgtcgga aggatggtgg gaggaatcgg ccggttttat 120 gttcagatgt gtactgagct taaactaaac gaccatgaag ggcggctgat tcagaacagc 180 ataacaatag aaaggatggt actttcggca ttcgacgaaa gaagaaacaa gtatctcgag 240 gagcatccca gtgctgggaa agaccctaag aaaacaggag gcccgatata cagaaggaaa 300 gatgggaaat ggatgaggga actcatcctc catgataaag aagaaatcat gagaatctgg 360 cgtcaggcca acaatggtga agacgctact gctggtctta ctcatatgat gatctggcac 420 tccaatctca atgacaccac ataccaaaga acaagggctc ttgttcggac tgggatggat 480 cccagaatgt gctctctgat gcaaggctca accctcccac ggagatctgg agccgctggt 540 gctgcagtaa aaggtgttgg aacaatggta atggaactca tcagaatgat caaacgcgga 600 ataaatgatc ggaatttctg gagaggtgaa aatggtcgaa gaaccagaat tgcttatgaa 660 agaatgtgca atatcctcaa agggaaattt cagacagcag cacaacgggc tatgatggac 720 caggtgaggg aaggccgcaa tcctggaaac gctgagattg aggatctcat tttcttggca 780 cgatcagcac ttattttgag aggatcagta gcccataaat catgcctacc tgcctgtgtt 840 tatggccttg cagtaaccag tgggtatgac tttgagaagg aaggatactc tctggttgga 900 attgatcctt tcaaactact ccagaacagt caaattttca gtctaatcag accaaaagaa 960 aacccagcac acaagagcca gttggtgtgg atggcatgcc attctgcagc atttgaggac 1020 ctgagagttt taaatttcat tagaggaacc aaagtaatcc caagaggaca gttaacaacc 1080 agaggagttc aaatagcttc aaatgaaaac atggagacaa tagattctag cacacttgaa 1140 ctgagaagca aatattgggc aataaggacc agaagcggag gaaacaccag tcaacagaga 1200 gcatctgcag gacagataag tgtgcaacct actttctcag tacagagaaa tcttcccttt 1260 gagagagcaa ccattatggc tgcattcact ggtaacactg aagggaggac ttccgacatg 1320 agaacggaaa tcataaggat gatggaaaat gccaaatcag aagatgtgtc tttccagggg 1380 cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcaacgaacc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440 atgagcaatg aagggtctta tttcttcgga gacaatgctg aggagtttga cagttaaa 1498 <210> 15 <211> 982 <212> DNA <213> Influenza A Virus <400> 15 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcgtaccatc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcgcagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120 gcactcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggatttta 180 ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 caaaatgccc ttagtggaaa cggagatcca aacaacatgg acagagcagt aaaactgtac 300 aggaagctta aaagagaaat aacattccat ggggcaaaag aggtggcact cagctattcc 360 actggtgcac tagccagctg catgggactc atatacaaca gaatgggaac tgttacaacc 420 gaagtggcat ttggcctggt atgcgccaca tgtgaacaga ttgctgattc ccagcatcgg 480 tctcacaggc agatggtgac aacaaccaac ccattaatca gacatgaaaa cagaatggta 540 ttagccagta ccacggctaa agccatggaa cagatggcag gatcgagtga gcaggcagca 600 gaggccatgg aggttgctag tagggctagg cagatggtac aggcaatgag aaccattggg 660 acccacccta gctccagtgc cggtttgaaa gatgatctcc ttgaaaattt acaggcctac 720 cagaaacgga tgggagtgca aatgcagcga ttcaagtgat cctctcgtta ttgcagcaag 780 tatcattggg atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtcttttct tcaaattcat 840 ttatcgtcgc cttaaatacg ggttgaaaag agggccttct acggaaggag tacctgagtc 900 tatgagggaa gaatatcggc aggaacagca gaatgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960 tgtcaacata gagctggagt aa 982 <210> 16 <211> 838 <212> DNA <213> Influenza A Virus <400> 16 atggattcca acactgtgtc aagctttcag gtagactgtt ttctttggca tgtccgcaaa 60 cgattcgcag accaagaact gggtgatgcc ccattccttg accggcttcg ccgagaccag 120 aagtccctaa ggggaagagg tagcactctt ggtctggaca tcgaaacagc cactcatgca 180 ggaaagcaga tagtggagca gattctggaa aaggaatcag atgaggcact taaaatgacc 240 attgcctctg ttcctacttc acgctactta actgacatga ctcttgatga gatgtcaaga 300 gactggttca tgctcatgcc caagcaaaaa gtaacaggct ccctatgtat aagaatggac 360 caggcaatca tggataagaa catcatactt aaagcaaact ttagtgtgat tttcgaaagg 420 ctggaaacac taatactact tagagccttc accgaagaag gagcagtcgt tggcgaaatt 480 tcaccattac cttctcttcc aggacatact aatgaggatg tcaaaaatgc aattggggtc 540 ctcatcggag gacttaaatg gaatgataat acggttagaa tctctgaaac tctacagaga 600 ttcgcttgga gaagcagtca tgagaatggg agaccttcat tcccttcaaa gcagaaacga 660 aaaatggaga gaacaattaa gccaaaaatt tgaagaaata agatggttga ttgaagaagt 720 gcgacataga ttgaaaaata cagaaaatag ttttgaacaa ataacattta tgcaagcctt 780 acaactattg cttgaagtag aacaagagat aagaactttc tcgtttcagc ttatttaa 838 <210> 17 <211> 97 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 17 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15 Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Ile Ala Ala Ser Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe 35 40 45 Lys Phe Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser 50 55 60 Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln 65 70 75 80 Gln Asn Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu 85 90 95 Glu <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 18 Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Leu Met Arg Met Ser Lys 1 5 10 15 Met Gln Leu Gly Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Met Ile Ile Arg 20 25 30 Leu Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala Val Met 35 40 45 Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Ser Arg Asn Glu Lys Trp Arg 50 55 60 Glu Gln Leu Ser Gln Lys Phe Glu Glu Ile Arg Trp Leu Ile Glu Glu 65 70 75 80 Val Arg His Arg Leu Lys Asn Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln Ile Thr 85 90 95 Phe Met Gln Ala Leu Gln Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu Ile Arg 100 105 110 Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile 115 <210> 19 <211> 344 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 19 Met Lys Thr Thr Ile Ile Leu Ile Leu Leu Thr His Trp Ala Tyr Ser 1 5 10 15 Gln Asn Pro Ile Ser Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His 20 25 30 His Ala Val Ala Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Ser Asp Asp Gln 35 40 45 Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ile Ser Met Gly 50 55 60 Lys Ile Cys Asn Asn Ser Tyr Arg Ile Leu Asp Gly Arg Asn Cys Thr 65 70 75 80 Leu Ile Asp Ala Met Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Ala Phe Gln Tyr 85 90 95 Glu Asn Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Ser Ala Phe Ser Asn Cys 100 105 110 Tyr Pro Tyr Asp Ile Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val Ala 115 120 125 Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Thr Ala Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly 130 135 140 Val Thr Gln Asn Gly Arg Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Ser Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Ser Ser Tyr 165 170 175 Pro Thr Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys Leu 180 185 190 Tyr Ile Trp Gly Ile His His Pro Ser Ser Asn Gln Glu Gln Thr Lys 195 200 205 Leu Tyr Ile Gln Glu Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser 210 215 220 Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg Gly 225 230 235 240 Gln Ser Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp 245 250 255 Ile Leu Met Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Gly Tyr 260 265 270 Phe Lys Leu Lys Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Val Pro 275 280 285 Ile Asp Ile Cys Val Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Ser 290 295 300 Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Val Thr Tyr Gly Lys Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Ile Arg Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg 325 330 335 Asn Val Pro Glu Lys Gln Ile Arg 340 <210> 20 <211> 344 <212> PRT <213> Influenza A Virus <400> 20 Met Lys Thr Thr Ile Ile Leu Ile Leu Leu Thr His Trp Ala Tyr Ser 1 5 10 15 Gln Asn Pro Ile Ser Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His 20 25 30 His Ala Val Ala Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Ser Asp Asp Gln 35 40 45 Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ile Ser Met Gly 50 55 60 Lys Ile Cys Asn Asn Ser Tyr Arg Ile Leu Asp Gly Arg Asn Cys Thr 65 70 75 80 Leu Ile Asp Ala Met Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Val Phe Gln Tyr 85 90 95 Glu Asn Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Ser Ala Phe Ser Asn Cys 100 105 110 Tyr Pro Tyr Asp Ile Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val Ala 115 120 125 Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Thr Ala Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly 130 135 140 Val Thr Gln Asn Gly Arg Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Ser Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Asn Ser Tyr 165 170 175 Pro Thr Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys Leu 180 185 190 Tyr Ile Trp Gly Ile His His Pro Ser Ser Asn Gln Glu Gln Thr Lys 195 200 205 Leu Tyr Ile Gln Glu Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser 210 215 220 Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg Gly 225 230 235 240 Gln Ser Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp 245 250 255 Ile Leu Met Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Gly Tyr 260 265 270 Phe Lys Leu Lys Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Ala Pro 275 280 285 Ile Asp Ile Cys Val Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Ser 290 295 300 Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Val Thr Tyr Gly Lys Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Ile Arg Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg 325 330 335 Asn Val Pro Glu Lys Gln Ile Arg 340

Claims (62)

  1. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1의 78번 위치에서의 보존성 치환 및 159번 위치에서의 비보존성 치환을 갖는 서열 1의 HA(헤마글루티닌) 또는 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 98% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체에 대한 서열의 HA 유전자 절편을 포함하는, 단리된 H3 말(equine) 인플루엔자 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 서열 2의 NA(뉴라미니다제) 또는 서열 2와 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 NA 변이체에 대한 서열의 유전자 절편; 서열 3의 PB1 또는 서열 3과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 PB1 변이체에 대한 서열의 유전자 절편; 서열 4의 PB2 또는 서열 4와 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 PB2 변이체에 대한 서열의 유전자 절편; 서열 5의 PA 또는 서열 5와 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 PA 변이체에 대한 서열의 유전자 절편; 서열 6의 NP(핵산단백질) 또는 서열 6과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 NP 변이체에 대한 서열의 유전자 절편; 서열 7의 M1 또는 서열 7과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 M1 변이체에 대한 서열의 유전자 절편; 서열 17의 M2 또는 서열 17과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 M2 변이체에 대한 서열의 유전자 절편; 서열 8의 NS1 또는 서열 8과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 NS1 변이체에 대한 서열의 유전자 절편; 또는 서열 18의 NS2 또는 서열 18과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 NS2 변이체에 대한 서열의 유전자 절편 중 하나 이상의 유전자 절편을 포함하는 단리된 말 인플루엔자 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 서열 1 내지 8, 17 및 18 중 하나 이상을 코딩하는 핵산 서열에 상응하는 음성 가닥 핵산을 포함하는 단리된 말 인플루엔자 바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 서열 1의 HA 및 서열 2의 NA를 갖는 단리된 말 인플루엔자 바이러스.
  5. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1의 78번 위치에서의 보존성 치환 및 159번 위치에서의 비보존성 치환을 갖는 서열 1의 인플루엔자 바이러스 HA, 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 98% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체, 또는 이들의 HA-1 부분에 대한 핵산 절편을 포함하는, 단리된 재조합 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 절편이 서열 9 또는 그의 상보체(complement)를 갖는 것인 단리된 재조합 벡터.
  7. 제5항에 있어서, 작동가능하게 연결된 프로모터, 전사 종결 서열, 또는 둘다를 추가로 포함하는 단리된 재조합 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 핵산 절편이 센스(sense) 방향인 단리된 재조합 벡터.
  9. 제7항에 있어서, 상기 핵산 절편이 안티센스(antisense) 방향인 단리된 재조합 벡터.
  10. 제5항에 있어서, 상기 핵산 절편의 말단에서 5' 및 3' 인플루엔자 바이러스 서열을 포함하는 단리된 재조합 벡터.
  11. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1의 78번 위치에서의 보존성 치환 및 159번 위치에서의 비보존성 치환을 갖는 서열 1의 단리된 HA 폴리펩티드, 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 98% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체, 또는 이들의 HA-1 부분을 포함하는, 면역원성 조성물.
  12. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1에서 78번 위치의 알라닌 및 159번 위치의 세린을 갖는 것인, 서열 1과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 인플루엔자 바이러스 HA 또는 그의 HA-1 부분에 대한 핵산 절편을 포함하고, 여기서 서열 1과 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 또는 그의 HA-1 부분은 하나 이상의 보존성 치환을 갖는 HA 변이체인 단리된 재조합 벡터.
  13. 인플루엔자 vRNA에 대한 하나 이상의 벡터, 인플루엔자 바이러스 단백질의 생산을 위한 하나 이상의 벡터, 또는 이들의 조합을 포함하고, 여기서 상기 벡터 중 하나 이상이 전사 종결 서열에 연결될 수 있는 제5항 또는 제12항의 단리된 재조합 벡터의 핵산 절편에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 상기 재조합 벡터에 의해 코딩되는 HA-1은 면역원성인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 각각 서로 다른 핵산 절편을 갖는 둘 이상의 벡터를 포함하는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, HA(헤마글루티닌), NA(뉴라미니다제), PB1, PB2, PA, NP(핵산단백질), M1, M2, NS1 및 NS2로 이루어진 군으로부터 선택된 인플루엔자 바이러스 단백질을 위한 벡터를 포함하는 조성물.
  16. 제13항에 있어서, HA(헤마글루티닌), NA(뉴라미니다제), PB1, PB2, PA, NP(핵산단백질), M1, M2, NS1 및 NS2 중 하나를 제외한 모두에 대해서 기능적인 인플루엔자 바이러스 단백질의 개방 해독틀을 갖는 벡터를 포함하는 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 관심 대상 DNA를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 관심 대상 DNA를 포함하는 벡터가 인플루엔자 바이러스 벡터인 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 각 벡터가 인플루엔자 바이러스 벡터인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 관심 대상 DNA를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 관심 대상 DNA를 포함하는 벡터가 인플루엔자 바이러스 벡터인 조성물.
  22. 제18항에 있어서. 관심 대상 DNA가 병원체의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 치료적 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 개방 해독틀을 포함하는 것인 조성물.
  23. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1에서 78번 위치의 알라닌 및 159번 위치의 세린을 갖는 서열 1의 HA 또는 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체에 대한 서열의 유전자 절편을 포함하는, 단리된 H3 말 인플루엔자 바이러스.
  24. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1에서 78번 위치의 알라닌 및 159번 위치의 세린을 갖는 것인, 서열 1과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 HA 폴리펩티드 또는 그의 HA-1 부분을 포함하고, 여기서 서열 1과 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 또는 그의 HA-1 부분은 하나 이상의 보존성 치환을 갖는 HA 변이체인 면역원성 조성물.
  25. 조류 또는 포유류 세포를 제1항 또는 제23항의 바이러스와 접촉시키는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 시험관내(in vitro) 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서, 바이러스를 단리하는 것을 추가로 포함하는 제조 방법.
  27. 제26항의 방법에 의해 수득되는 단리된 바이러스.
  28. 제1항 또는 제23항의 바이러스로 감염된 세포.
  29. 유효량의 제1항 또는 제23항의 바이러스, 제5항 또는 제12항의 재조합 벡터, 또는 제11항 또는 제24항의 면역원성 조성물을 비인간 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자에 대해 상기 비인간 포유류를 면역시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 포유류가 개 또는 말인 방법.
  31. 인플루엔자 감염에 대해 예방적 또는 치료적 반응을 유도하기에 유효한 양으로 제1항 또는 제23항의 바이러스, 제5항 또는 제12항의 재조합 벡터, 또는 제11항 또는 제24항의 면역원성 조성물을 포함하는 백신.
  32. 제31항에 있어서, 다른 단리된 인플루엔자 바이러스를 추가로 포함하는 백신.
  33. 제31항에 있어서, 단리된 말 인플루엔자 바이러스가 약독화된 바이러스인 백신.
  34. 제31항에 있어서, 단리된 말 인플루엔자 바이러스가 재배열된 바이러스인 백신.
  35. 제31항에 있어서, 말 인플루엔자 바이러스가 화학적, 물리적 또는 분자적 수단들에 의해 변형된 것인 백신.
  36. 제31항에 있어서, 아쥬반트를 추가로 포함하는 백신.
  37. 제31항에 있어서, 제약학상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 백신.
  38. 제37항에 있어서, 담체가 비강내 또는 근육내 투여를 위한 것인 백신.
  39. 제31항에 있어서, 냉동건조된 형태인 백신.
  40. 인플루엔자 바이러스 감염을 진단하기 위해 항-인플루엔자 바이러스 항체를 함유하는 것으로 의심되는 동물의 생리학적 샘플을 제1항 또는 제23항의 바이러스와 접촉시켜 상기 샘플로부터 상기 바이러스에 특이적인 항체를 검출하는 시험관내(in vitro) 방법.
  41. 인플루엔자 바이러스 감염을 진단하기 위해 항-인플루엔자 바이러스 항체를 함유하는 것으로 의심되는 동물의 생리학적 샘플을 제11항 또는 제24항의 조성물 중의 단리된 폴리펩티드와 접촉시켜 상기 샘플로부터 상기 단리된 폴리펩티드에 특이적인 항체를 검출하는 시험관내(in vitro) 방법.
  42. (a) 하나 이상의 단리된 인플루엔자 바이러스를 초기(primary) 비인간 포유류 호흡기 상피 세포와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 바이러스 중 하나 이상이 상기 세포내에서 효율적으로 복제되는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 종-특이적 복제를 검출하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 세포가 개과(canine)의 세포인 방법.
  44. 제21항에 있어서. 관심 대상 DNA가 병원체의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 치료적 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 개방 해독틀을 포함하는 것인 조성물.
  45. 제1항에 있어서, 서열 1과 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA를 가지고, 78번 위치의 발린 또는 159번 위치의 아스파라긴을 가지지 않는 것인 단리된 말 인플루엔자 바이러스.
  46. 제12항에 있어서, 서열 1의 HA-1 부분과 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA-1을 가지고, 78번 위치의 발린 또는 159번 위치의 아스파라긴을 가지지 않는 것인 재조합 벡터.
  47. 제11항에 있어서, 서열 1의 HA-1 부분과 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA-1을 가지고, 78번 위치의 발린 또는 159번 위치의 아스파라긴을 가지지 않는 것인 면역원성 조성물.
  48. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1의 78번 위치에서의 보존성 치환 및 159번 위치에서의 비보존성 치환을 갖는 서열 1의 HA 또는 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 98% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체에 대한 서열의 유전자 절편을 포함하는 단리된 H3 인플루엔자 바이러스를 인플루엔자 감염에 대해 예방적 또는 치료적 반응을 유도하기에 유효한 양으로 포함하는 백신.
  49. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1에서 78번 위치의 알라닌 및 159번 위치의 세린을 갖는 서열 1의 HA 또는 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체에 대한 서열의 유전자 절편을 포함하는 단리된 H3 인플루엔자 바이러스를 인플루엔자 감염에 대해 예방적 또는 치료적 반응을 유도하기에 유효한 양으로 포함하는 백신.
  50. 제49항에 있어서, 상기 바이러스가 서열 1과 98% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체에 대한 서열의 유전자 절편을 포함하는 것인 백신.
  51. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1에서 78번 위치의 알라닌 및 159번 위치의 세린을 갖는 것인, 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 폴리펩티드 또는 그의 HA-1 부분을 인플루엔자 감염에 대해 예방적 또는 치료적 반응을 유도하기에 유효한 양으로 포함하는 백신.
  52. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1의 78번 위치에서의 보존성 치환 및 159번 위치에서의 비보존성 치환을 갖는 서열 1의 HA 또는 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 98% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체에 대한 서열의 HA 유전자 절편을 포함하는, 단리된 H3 인플루엔자 바이러스.
  53. 제52항에 있어서, 상기 유전자 절편이 서열 1과 99% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 HA에 대한 서열을 가지고 78번 위치의 발린 또는 159번 위치의 아스파라긴을 가지지 않는 것인 단리된 인플루엔자 바이러스.
  54. 제52항에 있어서, 상기 유전자 절편이, 78번 위치의 알라닌 및 159번 위치의 세린을 갖는, 서열 1의 HA 또는 서열 1과 98% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA에 대한 서열을 갖는 것인 단리된 인플루엔자 바이러스.
  55. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1에서 78번 위치의 알라닌 및 159번 위치의 세린을 갖는 서열 1의 HA 또는 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체에 대한 서열의 유전자 절편을 포함하는, 단리된 H3 인플루엔자 바이러스.
  56. 각각 서열 20의 93번 위치 및 174번 위치와 비교하여, HA-1에서 78번 위치의 알라닌 및 159번 위치의 세린을 갖는 서열 1의 HA 또는 서열 1과 하나 이상의 보존성 치환에 의해 98% 이상 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는 HA 변이체에 대한 서열의 유전자 절편을 포함하는, 단리된 H3 말 인플루엔자 바이러스.
  57. 항-인플루엔자 바이러스 항체를 함유하는 것으로 의심되는 비-인간 동물의 생리학적 샘플을 제1항 또는 제23항의 바이러스와 접촉시키는 단계; 및 상기 샘플이 상기 바이러스에 특이적인 항체를 포함하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는 진단 방법.
  58. 항-인플루엔자 바이러스 항체를 함유하는 것으로 의심되는 비-인간 동물의 생리학적 샘플을 제11항 또는 제24항의 조성물 중의 단리된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및 상기 샘플이 상기 단리된 폴리펩티드에 특이적인 항체를 포함하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는 진단 방법.
  59. 제40항에 있어서, 동물이 비-인간 동물인 방법.
  60. 제41항에 있어서, 동물이 비-인간 동물인 방법.
  61. 제52항에 있어서, 비활성화된 것인 바이러스.
  62. 제55항에 있어서, HA 변이체가 서열 1과 96% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 바이러스.
KR20060022670A 2006-03-10 2006-03-10 Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스 KR101484305B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20060022670A KR101484305B1 (ko) 2006-03-10 2006-03-10 Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20060022670A KR101484305B1 (ko) 2006-03-10 2006-03-10 Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20130128074A Division KR101493613B1 (ko) 2013-10-25 2013-10-25 Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070092474A KR20070092474A (ko) 2007-09-13
KR101484305B1 true KR101484305B1 (ko) 2015-01-19

Family

ID=38689821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20060022670A KR101484305B1 (ko) 2006-03-10 2006-03-10 Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101484305B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220092744A (ko) 2020-12-24 2022-07-04 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 말 인플루엔자 바이러스 h3n8형에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 말인플루엔자 바이러스 검출용 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060016095A (ko) * 2003-05-28 2006-02-21 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 백신 및 유전자 요법을 위한 고 역가 재조합 인플루엔자바이러스
KR20060035602A (ko) * 2003-05-15 2006-04-26 더 보드 오브 리전츠 포 오클라호마 스테이트 유니버시티 말-２인플루엔자 바이러스의 ｈａ1을 발현하는 ｄｎａ 백신

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060035602A (ko) * 2003-05-15 2006-04-26 더 보드 오브 리전츠 포 오클라호마 스테이트 유니버시티 말-２인플루엔자 바이러스의 ｈａ1을 발현하는 ｄｎａ 백신
KR20060016095A (ko) * 2003-05-28 2006-02-21 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 백신 및 유전자 요법을 위한 고 역가 재조합 인플루엔자바이러스

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220092744A (ko) 2020-12-24 2022-07-04 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 말 인플루엔자 바이러스 h3n8형에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 말인플루엔자 바이러스 검출용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070092474A (ko) 2007-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10369212B2 (en) H3 influenza A virus
CA2626489C (en) Materials and methods for respiratory disease control in canines
JP2019510481A (ja) ワクチン開発のための改善されたｂ型インフルエンザウイルス複製
KR20170122786A (ko) 2가 돼지 인플루엔자 바이러스 백신
KR20190021334A (ko) 감염성 기관지염 바이러스에 대한 백신
JP2023116544A (ja) 異種スパイクタンパク質を有するｈ５２ ｉｂｖワクチン
KR101484305B1 (ko) Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스
AU2017203547B2 (en) H3 equine influenza a virus
JP6560056B2 (ja) Ｈ３型ウマａ型インフルエンザウイルス
AU2013219230B2 (en) H3 equine influenza a virus
KR101493613B1 (ko) Ｈ3 말 인플루엔자 ａ 바이러스
JP2007259758A (ja) Ｈ３型ウマａ型インフルエンザウイルス
JP2017038622A (ja) Ｈ３型ウマａ型インフルエンザウイルス
JP2020094054A (ja) ユニバーサルインフルエンザワクチン
CA2535127C (en) H3 equine influenza a virus
RU2802222C2 (ru) Вирус гриппа, способный инфицировать собачьих, и его применение
JP2018088928A (ja) Ｈ３型ウマａ型インフルエンザウイルス
MXPA06001355A (es) Virus h3 de la influenza a equina.
JP2013099339A (ja) Ｈ３型ウマａ型インフルエンザウイルス

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171219

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181226

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191217

Year of fee payment: 6