MXPA06001355A - Virus h3 de la influenza a equina. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un virus de influenza A equina H3 aislado, así como también métodos para preparar y usar los virus, y genes o proteínas del mismo.

Description

VIRUS H3 DE LA INFLUENZA A EQUINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La influenza es una enfermedad respiratoria en algunos mamíferos incluyendo a los caballos y es responsable de la morbilidad substancial y pérdidas económicas cada año. Además, las infecciones por el virus de influenza pueden provocar enfermedad sistémica severa en algunas especies aviarias, llevándolas a la muerte. La naturaleza segmentada del genoma del virus de la influenza permite la reclasificación de segmentos durante la replicación del virus en células infectadas con dos o más virus de la influenza. La reclasificación de segmentos, combinada con la mutación y cambios genéticos, puede dar origen a una miríada de cepas divergentes del virus de la influenza al paso del tiempo. Las nuevas cepas exhiben variación antigénica en sus proteínas hemaglutinina (HA por sus siglas en inglés) y/o neuraminidasa (NA por sus siglas en inglés) y en particular la codificación genética para la proteína HA tiene una alta proporción de variabilidad. La práctica actual predominante para la prevención de la influenza es la vacunación. Más comúnmente, se usan vacunas de virus enteros . Ya que la proteína HA de la influenza es el antígeno objetivo principal para las respuestas inmunes protectoras de un huésped al virus y es altamente variable, el aislamiento del virus de la influenza y REF:170022 la identificación y caracterización del antigeno de HA en virus asociados con descubrimientos recientes es importante para la producción de vacunas . En base a la prevalencia y predicción, se diseña una vacuna para estimular una respuesta inmune protectora contra las cepas del virus de la influenza predominante y esperada (Park et al., 2004) . Hay tres tipos generales de virus de influenza. Tipo A, Tipo B y Tipo C, las cuales se caracterizan por la ausencia de reactividad cruzada serológica entre sus proteínas internas . Los virus de influenza tipo A son colectados además en subtipos basados en diferencias antigénicas y genéticas de sus glicoproteínas, las proteínas H y NA. Todos los subtipos de HA y NA conocidos (Hl a H15 y NI a N9) han sido aislados a partir de pájaros acuáticos, los cuales son pensados para actuar como una reserva natural para la influenza. Los virus del tipo A H7N7 y H3N8 son las causas más comunes de la influenza equina, y aquellos subtipos son incorporados generalmente en vacunas de influenza equina. De esta forma, hay una necesidad continua para aislar los aislados de virus de influenza nuevos, por ejemplo, para la producción de vacunas . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona el virus del tipo A de influenza derivado de equino H3 aislado que se aisló de un potro que sucumbió a una neumonía fatal, el virus tiene substituciones características en los residuos 78 y 159 de HA (la numeración de posiciones ya que la proteína madura la cual carece de un péptido de señal de 15 aminoácidos) , es decir, el residuo en la posición 78 de HA no es valina y el residuo en la posición 159 no es asparagina. En una modalidad, el virus de la influenza H3 aislado de la invención tiene una substitución conservativa en el residuo 78, por ejemplo, una substitución de valina a alanina y una substitución no conservativa en el residuo 159, por ejemplo una substitución de asparagina a serina. En una modalidad, el virus de la influenza A H3 aislado de la invención tiene un residuo diferente a la metionina en la posición 29, por ejemplo una substitución no conservativa, un residuo diferente a la lisina en la posición 54, por ejemplo una substitución no conservativa, un residuo diferente a la serina en la posición 83, por ejemplo una substitución no conservativa, un residuo diferente a la asparagina en la posición 92, por ejemplo una substitución no conservativa, un residuo diferente a la leucina en la posición 222, por ejemplo una substitución no conservativa, un residuo diferente a la alanina en la posición 272, por ejemplo una substitución conservativa, y/o un residuo diferente a la treonina en la posición 328, por ejemplo una substitución conservativa. Las substituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadena lateral que contiene azufre es cisteína y metionina. En una modalidad, los grupos de substitución de aminoácidos conservativa son: treonina-valina-leucina-isoleucina-alanina; fenilalanina-tirosina; lisina-arginina; alanina-valina; glutámico-aspártico; y asparagina-glutamina . En una modalidad, el virus de la influenza de la invención incluye una o más proteínas virales (polipéptidos) que tienen substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como una de la SEQ ID NO: 1-8, 17 y/o 18, siempre y cuando la HA tenga las substituciones características en los residuos 78 y 159. Una secuencia de aminoácidos la cual es substancialmente la misma como una secuencia de referencia tiene por lo menos 95%, por ejemplo 96%, 97%, 98% ó 99%, de identidad de secuencia de aminoácidos a aquella secuencia de referencia, y puede incluir secuencias con supresiones, por ejemplo aquellas que resultan en una proteína viral eliminada que tiene substancialmente la misma actividad o es capaz de ser expresada en substancialmente el mismo nivel como la proteína viral madura, de longitud completa correspondiente, inserciones, por ejemplo, aquellas que resultan de una proteína viral modificada que tiene substancialmente la misma actividad o es capaz de ser expresada en substancialmente el mismo nivel como la proteína viral madura, de longitud completa correspondiente, y/o substituciones, por ejemplo, aquellas que resultan de una proteína viral que tiene substancialmente la misma actividad o es capaz de ser expresada en substancialmente el mismo nivel como la proteína de referencia. En una modalidad, uno o más residuos los cuales no son idénticos a aquellos en la secuencia de referencia pueden tener substituciones conservadores o no conservadoras en las cuales una o más substituciones no alteran substancialmente el nivel expresado o actividad de la proteína con las substituciones, y/o el nivel de virus obtenido a partir de una célula infectada con un virus que tiene esa proteína. Como se usa en la presente, "substancialmente el mismo nivel expresado o actividad" incluye un nivel de proteína detectable que es aproximadamente 80%, 90% o más, el nivel de proteína, o una actividad medible que es aproximadamente 30%, 50%, 90%, por ejemplo, hasta 100% o más, la actividad, de una polipéptido maduro de longitud completa que corresponde a una de las SEQ ID NO: 1-8, 17 ó 18. En una modalidad, el virus comprende un polipéptido con una o más, por ejemplo, 2, 5, 10, 15, 20 ó más, substituciones de aminoácidos, por ejemplo, substituciones conservadoras de hasta 5% de los residuos de la forma madura de longitud completa de un polipéptido que tiene las SEQ ID NO: 1-8, 17 ó 18. El Virus aislado de la invención puede ser empleado solo o con uno o más aislados de virus diferentes, por ejemplo otros aislados de virus de influenza, en una vacuna, para originar los antisueros específicos a virus, en terapia de genes, y/o en diagnósticos. Por consiguiente, la invención proporciona células hospederas infectadas con el virus de la infección, y anticuerpos aislados específicos para el virus. La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislado (polinucleótido) la cual comprende un segmento de ácido nucleico el cual corresponde a por lo menos una de las proteínas del virus de la invención, una porción del segmento de ácido nucleico para una proteína viral que tiene substancialmente el mismo nivel o actividad como un polipéptido correspondiente codificado por una de las SED ID NO: 1-8, 17 ó 18, o el complemento de la molécula de ácido nucleico. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislado codifica un polipéptido el cual tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos, por ejemplo, tiene por lo menos 95%, por ejemplo 96%, 97%, 98% o 99%, de identidad de secuencia de aminoácidos contiguos a un polipéptido que tiene una de las SEQ ID NO: 1-8, 17 ó 18. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos la cual es substancialmente la misma ya que, por ejemplo, tiene por lo menos 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80% ó 90% o más, identidad de secuencia de ácidos nucleicos contiguos a, una de las SEQ ID NO: 9-16, ó el complemento de la misma, y codifica un polipeptido que tiene por lo menos 95%, por ejemplo 96%, 97%, 98% ó 99%, de identidad de secuencia de aminoácidos contiguos a un polipéptido que tiene una de las SEQ ID NO: 1-8, 17 ó 18. La molécula de ácido nucleico aislada de la invención puede ser empleada en un vector para expresar las proteínas de la influenza, por ejemplo, para producción de vacuna de proteína recombinante o para incrementar el antisuero, como una vacuna de ácido nucleico, para uso en diagnósticos o, para producción de ARNv, para preparar genes quiméricos, por ejemplo, con otros genes virales incluyendo otros genes de virus de influenza, y/o para preparar virus recombinante, por ejemplo, ver Neumann et al. (1999) la cual se incorpora para referencia en la presente. De esta forma, la invención también proporciona polipéptidos virales aislados, virus recombinantes, . y células hospederas puestos en contacto con la molécula de ácido nucleico y/o virus recombinante de la invención, así como también anticuerpos específicos a virus, por ejemplo, obtenidos de mamíferos infectados con el virus o inmunizados con un polipéptido viral aislado o polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos virales. La invención además proporciona por lo menos uno de los siguientes vectores aislados, por ejemplo, uno o más vectores del virus de la influenza aislados, o una composición la cual comprende uno o más vectores, un vector comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza PA DNA para un PA que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 5 enlazada a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende un promotor enlazado operablemente al virus de influenza PBl DNA para un PBl que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 3 enlazada a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de la influenza PB2 DNA para un PB2 que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 4 enlazada a una secuencia de terminación de transcripción, un vector el cual comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza HA DNA para una HA que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 1 enlazada a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de la influenza NP DNA para un NP que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO : 6 enlazada a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza NA DNA para NA que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 2 enlazada a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza M DNA para una M que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID N0:7 (MI) y/o la SEQ ID N0:17 (M2) , enlazada a una secuencia de terminación de transcripción, y/o un vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza NS DNA para un NS que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 8 (NS1) y/o SEQ ID NO: 18 (NS2) , enlazada a una secuencia de terminación de transcripción. Opcionalmente, pueden ser empleados dos vectores en lugar del vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza M DNA enlazado a una secuencia de terminación de transcripción, por ejemplo, un vector el cual comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza MI DNA enlazado a una secuencia de terminación de transcripción y un vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza M2 DNA enlazado a una secuencia de terminación de transcripción. Opcionalmente, pueden ser empleados dos vectores en lugar del vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza NS DNA enlazado a una secuencia de terminación de transcripción, por ejemplo, un vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza NS1 DNA enlazado a una secuencia de terminación de transcripción y un vector que comprende un promotor enlazado operablemente a un virus de influenza NS2 DNA enlazado a una secuencia de terminación de transcripción. Un vector de virus de influenza es uno el cual incluye por lo menos secuencias del virus de influenza no codificantes 5 " y 3". Por lo tanto, la invención proporciona vectores, por ejemplo, plásmidos, los cuales codifican las proteínas del virus de influenza, y/o codifican el ARNv de influenza, tanto ARNv nativo y recombinante . De esta forma, un vector de la invención puede codificar una proteina del virus de la influenza (con sentido) o ARNv (antisentido) . Cualquier promotor adecuado o secuencia de terminación de transcripción pueden ser empleados para expresar una protezna o péptido, por ejemplo, una proteína o péptido viral, una proteína o péptido de un patógeno no viral, o una proteína o péptido terapéuticos. En una modalidad, para expresar ARNv, el promotor es un promotor de la ARN polimerasa I, un promotor de la ARN polimerasa II, un promotor de la ARN polimerasa III, un promotor T3 o un promotor T7. Opcionalmente el vector comprende una secuencia de terminación de transcripción tal como una secuencia de terminación de transcripción de ARN polimerasa I, una secuencia de terminación de transcripción de la ARN polimerasa II, una secuencia de terminación de transcripción de la ARN polimerasa III o una ribozima. Una composición de la invención puede comprender también un gen o cuadro de lectura abierto de interés, por ejemplo, un gen extraño que codifica un péptido o proteína inmunogénicos útiles como una vacuna. De esta forma, otra modalidad de la invención comprende una composición de la invención como se describe anteriormente en la cual uno de los genes del virus de la influenza en los vectores es reemplazado con un gen extraño, o la composición además comprende, además de todos los genes del virus de la influenza, un vector el cual comprende un promotor enlazado a una de las secuencias del virus de la influenza 5" enlazadas a una secuencia de ácido nucleico deseada, por ejemplo, un ADNc de interés, enlazado a una de las secuencias del virus de influenza 3' enlazadas a una secuencia de terminación de transcripción, la cual, cuando se pone en contacto con una célula huésped permisiva para la replicación del virus de la influenza opcionalmente resulta en un virus recombinante . En una modalidad, el ADN de interés está en una orientación antisentido. El ADN de interés, ya sea si es un vector para ARNv o producción de proteína, puede codificar un epitopo inmunogénico, tal como un epitopo útil en terapia de cáncer o vacuna, o un péptido o polipéptido útil en terapia genética. Una pluralidad de los vectores de la invención puede ser enlazado físicamente o cada vector puede estar presente en un plásmido individual u otro, por ejemplo, vehículo de suministro de ácido nucleico, lineal. La invención también proporciona un método para preparar el virus de la influenza. El método comprende poner en contacto una célula, por e emplo, una célula de ave o mamífero, con el virus aislado de la invención o una pluralidad de los vectores de la invención, por ejemplo, secuencial o simultáneamente, por ejemplo, empleando una composición la cual comprende una pluralidad de los vectores, en una cantidad efectiva para producir el virus de la influenza infeccioso. La invención también incluye el aislar virus a partir de una célula infectada con el virus o puesto en contacto con los vectores y/o la composición. La invención además proporciona una célula huésped infectada con el virus de la invención o puesto en contacto con la composición o vectores de la invención. En una modalidad, se infecta una célula huésped con un virus donador atenuado (por ejemplo adaptado al frío) y un virus de la invención para preparar un virus recolectado adaptado al frío útil como una vacuna de virus vivo adaptado al frío. La invención también proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un mamífero, por ejemplo, para inmunizar un mamífero, contra uno o más patógenos, por ejemplo, contra un virus de la invención y opcionalmente una bacteria, un virus diferente, o un parásito u otro antígeno. Una respuesta inmunologica para una composición o vacuna es el desarrollo en el organismo huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a un polipéptido viral, por ejemplo, una preparación viral administrada, un polipéptido o uno codificado por una molécula de ácido nucleico administrado, el cual puede prevenir o inhibir la infección para aquel virus o un virus cercanamente relacionado (estructuralmente) . Usualmente, tal respuesta consiste del sujeto que produce anticuerpos, células B, células auxiliadoras T, células T supresoras, y/o células T citotóxicas dirigidas específicamente a un antígeno o antigenos incluidos en la composición o vacuna de interés . El método incluye administrar al organismo huésped, por ejemplo, un mamífero, una cantidad efectiva del virus de la influenza de la invención, por ejemplo, un virus vivo, atenuado, opcionalmente en combinación con un adyuvante y/o portador, por ejemplo, en una cantidad efectiva para prevenir o mejorar la infección de un animal tal como un mamífero por ese virus o un virus antagónicamente relacionado cercanamente. En una modalidad, el virus es administrado intramuscularmente mientras que en otra modalidad, el virus es administrado intranasalmente . En algunos protocolos de dosificación, todas las dosis pueden ser administradas intramuscularmente o intranasalmente, mientras que en otros se emplea una combinación de administración intramuscular e intranasal . La vacuna puede además contener otros aislados del virus de la influenza incluyendo virus de la influenza recombinante, otros patógenos, agentes biológicos o componentes microbianos adicionales, por ejemplo, para formar una vacuna multivalente . En una modalidad, la vacunación intranasal con el virus de la influenza equina inactivada y un adyuvante mucosal , por ejemplo, la cadena B no tóxica de la toxina del cólera, puede inducir a IgA específico a virus y anticuerpo de neutralización en la nasofaringe así como también otra IgG sérica . La vacuna de la influenza equina puede ser empleada con otros antivirales, por ejemplo, amantadina, rimantadina, y/o inhibidores de neuraminidasa, por ejemplo, pueden ser administrados separadamente junto con aquellos antivirales, por ejemplo, administrados antes, durante y/o después. Además se proporciona un método de diagnóstico el cual emplea un virus de la invención, una proteína viral aislada por el mismo, o antisuero especifico para el virus o proteína, para detectar los anticuerpos específicos virales o proteínas específicas virales. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1. Secuencias de A/Equino/Wisconsin/1/03 , las SEQ ID NO: 1-8, 17 y 18 representan la secuencia de aminoácidos deducida para HA, NA, PB1, PB2 , PA, NP, MI, NS1, M2 y NS2, respectivamente, de A/Equino/Wisconsin/l/03. Las SEQ ID NO: 9-16 representan la secuencia de nucleótidos con sentido ARNm para HA, NA, PB1, PB2 , PA, NP, M (MI y M2) y NS (NS1 y NS2) , respectivamente, de A/Equino/Wisconsin/l/3. La Figura 2. Alineación de secuencia de HA-1 de A/Equino/New York/99 (SEQ ID NO: 19) y A/lisina/Wisconsin/l/03 (SEQ ID NO: 20) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones : Como se usa en la presente, el término "aislado" se refiere a una preparación in vitro y/o aislamiento de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector o plásmido, péptido o polipéptido (proteína) , o virus de la invención, de tal forma que no se asociada con substancias in vivo, o es purificado substancialmente a partir de substancias in vitro. Se obtiene generalmente una preparación de aislado de virus por cultivo in vitro y propagación, y es substancialmente libre de otros agentes infecciosos . Como se usa en la presente, "substancialmente purificado" significa las especies objeto es la especie predominante, por ejemplo, en una base molar es más abundante que cualesquiera otras especies individuales en una composición, y preferentemente es por lo menos aproximadamente 80% de las especies presentes, y opcionalmente 90% ó más, por ejemplo 95%, 98%, 99% ó más, de las especies presentes en la composición. Como se usa en la presente, "substancialmente libre" significa abajo del nivel de detección para un agente infeccioso particular usando métodos de detección estándar para ese agente. Un virus "recombinante" es uno el cual ha sido manipulado in vitro, por ejemplo usando técnicas de ADN recombinantes , para introducir cambios al genoma viral. Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico recombinante" , o "secuencia o segmento de ADN recombinante" se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo, a ADN, que ha sido derivado o aislado de una fuente, que puede ser subsecuentemente alterada químicamente in vitro, de tal forma que su secuencia no ocurre naturalmente, o corresponde a secuencias que ocurren en forma neutral que no son posicionadas ya que pueden ser posicionadas en el genoma nativo. Un ejemplo de ADN "derivado" de una fuente, puede ser una secuencia de ADN que es identificada como un fragmento útil, y la cual es sintetizada químicamente en forma esencialmente pura. Un ejemplo de tal ADN "aislado" a partir de una fuente puede ser una secuencia de ADN útil que se escinde o remueve de la fuente por medios químicos, por ejemplo, por el uso de endonucleasas de restricción, de tal forma que puede además ser manipulada, por ejemplo, amplificada, para uso en la invención, por la metodología de modificación genética. Estructura y propagación virus de la influenza tipo A Los virus de la influenza A poseen un genoma de ocho ARN virales de sentido negativo de ocho cadenas sencillas (ARNv) codifican por lo menos diez proteínas . El ciclo de vida del virus de la influenza empieza con enlace de la hemaglutinina (HA) a receptores que contienen ácido siálico en la superficie de la célula huésped, seguido por endocitosis mediada por el receptor. El pH bajo en endosomas tardíos acciona un cambio conformacional en la HA, por lo que expone la terminación N de la subunidad HA2 (el así llamado péptido de fusión) . El péptido de fusión inicia la fusión de la membrana viral y endosomal, y los complejos de proteína de matriz (MI) y RN1" son liberados en el citoplasma. Los RN1' consisten de la nucleoproteína (NP) , la cual encapsula en la cápside al ARNv, y el complejo de polimerasa viral, el cual se forma por las proteínas PA, PB1 y PB2. los RNP son transportados en los núcleos, donde toma lugar la transcripción y replicación. El complejo de ARN polimerasa cataliza tres reacciones diferentes: la síntesis de un ARNm con una terminación 5' y la poli A estructura 3" , de un ARN complementario de longitud completa (ARNc) , y de ARNv genómico usando el ARNc como un templado. Los ARNv recientemente sintetizados, NP, y proteínas de polimerasa son entonces ensambladas en RNO, exportados desde el núcleo, y transportados a la membrana plasmática, donde ocurre la hiemación de partículas de virus de progenie. La proteína neuraminidasa (NA) juega un papel crucial tardío en la infección por remover el ácido siálico de los sialiloligosacáridos, de esta forma liberando los viriones recientemente ensamblados a partir de la superficie celular y prevenir la auto agregación de partículas de virus. Aunque el ensamble del virus implica interacciones de proteína-proteína y proteína-ARNv, la naturaleza de estas interacciones es bastante desconocida. Cualquier célula, por ejemplo, cualquier célula aviaria o mamífera, tal como de humano, canino, bovino, equino, felino, porcino, ovino, mink, etc, células de MVLU1, o célula de primate no humano, incluyendo células imitantes, las cuales soportan replicación eficiente del virus de la influenza puede ser empleado para aislar y/o propagar los virus de influenza. Los virus aislados pueden ser usados para preparar un virus recolectado, por ejemplo, un virus atenuado. En una modalidad, las células hospederas para producción de vacunas son aquellas encontradas en huevos de aves . En otra modalidad, las células hospederas para producción de vacunas son líneas celulares o cepas celulares de mamíferos o aviarias continuas. Se prefiere establecer una caracterización completa de las células a ser usadas, de tal forma que las pruebas apropiadas para pureza del producto final pueden ser incluidas . Los datos que pueden ser usados para la caracterizado de una célula incluye (a) información en su origen, derivación, e historia de paso; (b) información en su crecimiento y características morfológicas; (c) resultados de pruebas de agentes adventicios; (d) características de distinción, tales como patrones bioquímicos, inmunológicos y citogénicos los cuales permiten a las células ser reconocidas claramente entre otras líneas celulares; y e) resultados de pruebas para tumorigenicidad. Preferentemente, el nivel de paso, o duplicación de población, de la célula huésped usada es tan bajo como sea posible. Se prefiere que el virus producido por la célula huésped sea altamente purificada antes a la formulación de la vacuna o terapia de genes. Generalmente, los procedimientos de purificación resultan en la remoción extensiva de ADN celular, otros componentes celulares, y agentes adventicios. Los procedimientos que degradan o desnaturalizan extensivamente el ADN pueden ser usados también. Detección del virus de la influenza equina Los virus de influenza equina que provocan enfermedad son generalmente los virus de la influenza del tipo A de los subtipos H7N7 (equi-1) y H3N8 (equi-2) . Estos generalmente difieren de los subtipos que provocan la infección en hombres (H1N1, H2N2 y H3N2) , la influenza equina se contrae por ya sea inhalación o contacto con secreciones (por ejemplo, fluido fisiológico) que contienen el virus vivo. El virus infecta las células epiteliales de las vías respiratorias superior e inferior y pueden provocar la eliminación de cilios de grandes áreas del tracto respiratorio dentro de 4 a 6 días. Como un resultado, el mecanismo de limpieza mucociliar se compromete y pueden ser reducidas las proporciones de limpieza de la tráquea por hasta 32 días después de la infección. Se desarrolla bronquitis y bronquiolitis seguido por la neumonía intersticial acompañada por congestión, edema e infiltración de leucocitos. En general, los virus H3N8 provocan enfermedad más severa que los virus H7N7, los virus del subtipo H3N8 son más neumotrópicos y han sido asociados también con la miocarditis . Los signos clínicos en animales anteriores con influenza simple son fácilmente reconocibles. La influenza se caracteriza por su inicio rápido con un periodo de incubación de 1 a 3 días. El primer signo es una elevación de la temperatura corporal (hasta 41°C) , lo cual es usualmente bifásico. Esto es seguido por una tos seca profunda que libera bastantes cantidades de virus en la atmósfera con frecuencia acompañado por una descarga nasal severa, la cual puede llegar a ser mucupurulenta debido a la infección bacteriana secundaria. Los otros signos clínicos más comúnmente observados son mialgia, inapetencia y nodulos linfáticos submandibulares agrandados . El edema de las extremidades inferiores y escroto se observa muy raramente. La severidad de la enfermedad varia con la dosis y cepa del virus y el estado inmune del caballo. Caballos adultos inmunocompetentes, previamente saludables usualmente se recuperan de influenza no complicada dentro de 10 días, aunque la tos puede persistir más tiempo. Si ocurre una infección bacteriana secundaria, ésta puede prolongar el periodo de recuperación. Sin embargo, se han registrado proporciones relativamente altas de mortalidad en potros, animales en condiciones pobres y burros. Si el anticuerpo maternal está ausente en el momento de la exposición, los potros jóvenes pueden desarrollar una neumonía viral la cual lleva a la muerte. Las muertes entre animales adultos son usualmente una consecuencia de infección bacteriana secundaria la cual lleva a la pleuritis, neumonía supurativa o raramente, hemorragia púrpura. Las secuelas de la influenza equina pueden incluir faringitis crónica, bronquiolitis crónica, miocarditis, y enfisema alveolar, lo cual puede contribuir a náuseas, y sinusitis secundaria e infecciones de perforación gutural . Los signos clínicos en animales parcialmente inmunes como un resultado de la vacunación o infección previa son más difíciles de reconocer ya que puede haber poco o ninguna os o pirexia. Mientras la dispersión de la infección en todo un grupo de animales simples es siempre rápida, ha habido brotes en los cuales la infección circula subclí icamente en caballos vacunados por 18 días antes de inducir los signos clínicos reconocibles . Los brotes de enfermedad respiratoria infecciosa pueden ser provocados por varios agentes, los cuales incluyen virus de herpes equina, rinovirus, adenovirus, y virus de arteritis, Streptococcus equi o S. Zooepidemicus. Un diagnóstico presuntivo de la influenza en base a los signos clínicos debe ser confirmado por aislamiento o detección del virus, o por prueba serológica. La confirmación de laboratorio de un diagnóstico clínica puede ser por aislamiento tradicional de virus a partir de frotis nasofaríngeos o serologia para demostrar la seroconversión, o por pruebas de diagnóstico rápido las cuales detectan la presencia de antígenos virales, ácido nucleico viral, o células infectadas viralmente en secreciones respiratorias . Las pruebas de diagnóstico rápido, a pesar de su conveniencia y facilidad de uso, proporcionan poca o ninguna información acerca de las características antigénicas de la cepa de infección de virus y no permiten aislamiento del virus . Los frotis nasofaríngeos para aislamiento o detección del virus deben ser tomados tan pronto como sea posible . Los resultados de estudios de retos experimentales sugieren que los títulos virales pico son obtenidos durante las 24 a 48 horas iniciales de fiebre, en el segundo o tercer día después de la infección, y la duración de la dispersión viral no es usualmente más de 4 ó 5 días . Las muestras de frotis nasales son tomadas al pasar un cotonete tan lejos como sea posible en la via nasofaríngea del caballo por medio de meatus ventral para absorber las secreciones respiratorias . Los cotonetes deben ser transferidos inmediatamente a un recipiente con medio de transporte de virus y se transportan en hielo para mantener la viabilidad de los virus . Los virus no tienen la probabilidad de sobrevivir si los cotonetes secos son tomados y hay una oportunidad incrementada de contaminación si se usa el medio de transporte bacteriano. Las muestras de cotonetes nasales pueden ser inoculadas en la cavidad alantoica (o amniótica) de huevos de gallinas embrionarias de 9 a 11 días de edad. Después de la incubación en 33-35°C por 3 días, se cosecha el fluido alantoico y se prueba para actividad de hemaglutinación. Alternativamente, puede ser usado el cultivo celular para aislar los virus. La infección de influenza puede también ser diagnostico por comparación de los resultados de la prueba serológica de una muestra de suero aguda tomada tan pronto como sea posible después del inicio de signos clínicos y una muestra de suero convalescente tomada 2 a 4 semanas más tarde . La prueba de inhibición de hemaglutinación (HI) mide la capacidad del anticuerpo especifico a influenza presente en muestras de suero para inhibir la aglutinación de glóbulos rojos por virus. Los sueros son inactivados por calor, pretratados para reducir las reacciones no especificas y diluidas en serie antes a la incubación con una dosis estándar de virus en una placa de microtxtulo de fondo en U. Se agrega una suspensión de glóbulos rojos y, después de un periodo de incubación adicional, se examinan para aglutinación. Un incremento de cuatro veces en anticuerpos específicos a virus indica una infección. El antígeno de virus completo puede ser usado para los virus H7N7, pero el antígeno alterado con Tween 80-éter es usualmente requerido para incrementar la sensibilidad del ensayo para los virus H3N8. En caballos repetidamente vacunados, la infección puede fallar para estimular un incremento de cuatro veces en título de HI . La prueba de hemolisis radial sencilla (SRH) , aunque menos específica a la cepa, es más reproducible y menos tendiente al error que la prueba HI y, como es una prueba lineal, es más sensible, lo cual permite la detección de incrementos más pequeños en anticuerpo inducido por infección en caballos vacunados pesadamente. La prueba de SRH se basa en la capacidad de los anticuerpos específicos a influenza para lisar los glóbulos rojos recubiertos por el virus en la presencia de complemento . Se agregan los sueros de prueba a pozos perforados en agarosa que contiene glóbulos rojos recubiertos y complemento y se permite que se difundan a través de la agarosa por 20 horas. Las arcas de zonas claras de hemolisis alrededor de los pozos son proporcionales al nivel de anticuerpo de influenza presente en las muestras séricas . Si se vacuna los caballos en la cara de infección, puede no ser posible, usar los ensayos HI y SRH, para determinar si cualquier incremento en los niveles de anticuerpo son debido a la vacunación o infección. Vacunas de Influenza Una vacuna de la invención incluye un virus de influenza aislada de la invención, y opcionalmente uno o más virus aislados los cuales incluyen otros virus de influenza aislados, virus West Nile, virus de herpes equina, virus de arteritis equina, lentivirus de anemia infecciosa equina, virus de conejos, virus de encefalitis equina de Eastern y (o Western y/o Venezuela, una o más proteínas inmunogénicas o glicoproteínas de uno o más virus de influenza aislados o una o más patógenos diferentes, por ejemplo, una proteína inmunogénica de una o más bacterias, virus no de influenza, levadura u hongos, o ácido nucleico aislado que codifica una o más proteínas virales (por ejemplo, vacunas de ADN) incluyendo una o más proteínas inmunogénicas del virus de influenza aislado de la invención. En una modalidad, los virus de influenza de la invención pueden ser vectores de vacunas para virus de influenza u otros patógenos . Una vacuna de virión completa puede ser concentrada por ultrafiltración y después purificada por centrifugación zonal o por cromatografía. Por ejemplo, se inactiva antes o después de la purificación usando formalina o beta-propiolactona. Una vacuna de subunidad comprende glicoproteínas purificadas. Tal vacuna puede ser preparada como sigue: usando suspensiones virales fragmentadas por tratamiento con detergente, se purifican los antigenos superficiales, por ultracentrifugacion por ejemplo. Las vacunas de subunidades de esta forma contienen principalmente la proteína HA, y también NA. El detergente usado puede ser detergente catiónico por ejemplo, tal como bromuro de hexadeciltrimetilamonio (Bachmeyer, 1975) , un detergente aniónico tal como deoxicolato de amonio (Laver & Webster, 1975) ; o un detergente no iónico tal como aquel comercializado bajo el nombre de TRITON X100. La hemaglutinina puede también ser aislada después de tratamiento de los viriones con una proteasa tal como bromelina, después se purifica por un método tal como aquel descrito por Gruñid and Skehel (1972) . Una vacuna dividida comprende viriones los cuales han sido sometidos a tratamiento con agentes que disuelven lípidos. Una vacuna dividida puede ser preparada como sigue: una suspensión acuosa del virus purificado obtenido como anteriormente, inactivo o no, es tratada, bajo agitación, por solventes lípidos tales como éter etílico o cloroformo, asociados con detergentes. La disolución de los lípidos de la cubierta viral resulta en fragmentación de las partículas virales. La fase acuosa es recuperada la cual contiene la vacuna de división, principalmente constituida de hemaglutinina y neuraminidasa con su ambiente lípido original removido, y el núcleo o sus productos de degradación. Después se inactivan las partículas infecciosas residuales si esto no ha sido ya hecho . Vacunas inactivadas Se proporcionan vacunas del virus de la influenza inactivado por inactivar virus replicados usando métodos conocidos, tales como, pero no limitados a, tratamiento con formalina o ß-propiolactona . Los tipos de vacuna inactivados que pueden ser usados en la invención pueden incluir vacunas de virus enteros (WV por sus siglas en inglés) o vacunas de subviriones (SV por sus siglas en inglés) (divididas) . La vacuna WV contiene virus intactos, inactivados, mientras que la vacuna SV contiene virus purificados alterados con detergentes que solubilizan la cubierta viral que contiene lípidos, seguido por inactivación química de virus residuales. Además, las vacunas que pueden ser usadas incluyen aquellas que contienen las proteínas superficiales HA y NA aisladas, las cuales son referidas como vacunas de antígeno superficial o subunidades .

Vacunas de virus atenuados vivos Las vacunas de virus de influenza, vivos, atenuados pueden ser usadas para prevenir o tratar la infección por virus de influenza. La atenuación puede ser lograda en una etapa sencilla por transferencia de genes atenuados a partir de un virus de donador atenuado a un aislado replicado o virus recolectado de acuerdo a métodos conocidos (ver por ejemplo, Murphy, 1993) . Ya que la resistencia al virus de influenza A es mediada principalmente por el desarrollo de una respuesta inmune a las glicoproteínas HA y/o NA, los genes que codifican para estos antígenos superficiales deben venir de virus recolectados o aislados clínicos, los genes que confieren atenuación preferentemente no codifican para las glicoproteínas HA y NA. Los virus (virus de influenza donadores) están disponibles que son capaces de atenuar en forma reproducible los virus de influenza, por ejemplo, un virus donador adaptado a frío (ca por sus siglas en inglés) puede ser usado para producción de vacuna atenuada. Las vacunas de virus recolectados atenuados, vivos pueden ser generadas por acoplar el virus donador ca con un virus replicado virulento. La progenie reclasificada es entonces seleccionada en 25°C (restrictivo para la replicacion de virus virulentos) , en la presencia de un antisuero apropiado, lo cual inhibe la replicacion de los virus que portan los antígenos superficiales de los virus donadores ca atenuados . Los recolectados útiles son: (a) infecciosos, (b) atenuados para mamíferos no adultos seronegativos y mamíferos adultos inmunológicamente cebados, (c) estables inmunogénicamente y (d) genéticamente. La inmunogenicidad de los recolectados ca es paralela a su nivel de replicación. De esta forma, la adquisición de los seis genes transíeribles del virus donador de ca por nuevos virus del tipo silvestre tiene atenuados reproduciblemente estos virus para uso en mamíferos susceptibles a vacunación tanto adultos y no adultos . Otras mutaciones de atenuación pueden ser introducidas en genes de virus de influenza por mutagénesis dirigida a sitio para rescatar virus infecciosos que portan estos genes mutantes . Las mutaciones de atenuación pueden ser introducidas en regiones no codificantes del genoma, así como también en regiones de no codificación. Tales mutaciones de atenuación pueden ser- introducidas también en genes diferentes a HA o NA, por ejemplo, el gen de polimerasa PB2 (Subbarao et al., 1993) . De esta forma, los nuevos virus donadores pueden también ser generados portando mutaciones de atenuación introducidas por mutagénesis dirigida a sitio, y tales virus donadores nuevos pueden ser usados en la producción de candidatos de vacunas recolectados atenuados vivos en una forma análoga a aquella descrita anteriormente para los virus donadores ca. Similarmente, otras cepas donadores atenuadas conocidas y adecuadas pueden ser reclasificadas con el virus de la influenza para obtener vacunas atenuadas adecuadas para uso en la vacunación de mamíferos (Enami et al., 1990; Muster et al., 1991; Subbarao et al., 1993). Se prefiere que tales virus atenuados mantengan los genes a partir del virus que codifica los determinantes antigénicos substancialmente similar a aquellos de los aislados clínicos originales. Esto es porque el propósito de la vacuna atenuada es proporcionar substancialmente la misma antigenicidad como el aislado clínico original del virus, mientras que al mismo tiempo carece de la patogenicidad al grado de que la vacuna provoca una oportunidad mínima de inducir una condición de enfermedad seria en el mamífero vacunado . El virus puede de esta forma ser atenuado o inactivado, formulado y administrado, de acuerdo a métodos conocidos, como una vacuna para inducir una respuesta inmune en un animal, por ejemplo, un mamífero. Los métodos son bien conocidos en la técnica para determinar si tales vacunas atenuadas o inactivadas han mantenido antigenicidad similar a aquella del aislado clínico o cepa de alto crecimiento derivada de las mismas . Tales métodos conocidos incluyen el uso de antisuero o anticuerpos para eliminar los virus que expresan determinantes antigénicos del virus donador; selección química (por ejemplo, amantadina o rimantidina) ; actividad e inhibición de HA y NA: y tamizado de ácido nucleico (tal como hibridización de sonda o PCR) para confirmar que los genes donadores que codifican los determinantes antigénicos (por ejemplo, genes HA o NA) no están presentes en los virus atenuados. Ver, por ejemplo, Robertson et al., 1988, Kilbourne, 1969, Aymard-Henry et al., 1985, Robertson et al., 1992. Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, adecuadas para inoculación, por ejemplo, administración nasal, parental u oral, comprenden uno o más aislados de virus de influenza, por ejemplo, uno o más virus de influenza atenuados o inactivados, una subunidad de los mismos, proteínas aisladas de los mismos, y/o ácido nucleico aislado que codifica una o más proteínas de los mismos, opcionalmente además comprende soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Las composiciones pueden además comprender agentes auxiliares o excipientes, como es conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Berkow et al., 1987, Avery"s Drug Treatment, 1987; Osol 1980. La composición de la invención es presentada generalmente en la forma de dosis individuales (dosis de unidad) . Las vacunas convencionales generalmente contienen aproximadamente 0.1 a 200 µg por ejemplo 30 a 100 µ¾ de HA a partir cada uno de las cepas que entran en su composición. La vacuna que forma el constituyente principal de la composición de vacuna de la invención puede comprender un virus de influenza sencillo, o una combinación de virus de influenza, por ejemplo, por lo menos dos o tres virus de influenza, incluyendo uno o más recolectados . Preparaciones para administración oral incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones, y/o emulsiones, las cuales pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en la técnica. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol , polietilenglicol , aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Portadores o suspensiones oclusivas pueden ser usadas para incrementar la permeabilidad a la piel e incrementar la absorción de antígenos . Las formas de dosis líquidas para administración oral pueden comprender generalmente una solución de liposoma que contiene la forma de dosis líquida. Las formas adecuadas para suspender liposomas incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, y elixires que contienen diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como agua purificada. Además de los diluyentes inertes, tales composiciones pueden también incluir adyuvantes, agentes de humectación, agentes emulsificantes y de suspensión, o agentes edulcorantes, saborizantes o de perfumería. Ver, por ejemplo, Berkow et al., 1992; Avery's, 1987; y Osol . , 1980.

Cuando se usa una composición de la presente invención para administración a un individuo, esta puede además comprender sales, amortiguadores, adyuvantes, u otras substancias las cuales son deseables para mejorar la eficacia de la composición. Para las vacunas, los adyuvantes, substancias las cuales pueden aumentar una respuesta inmune específica, pueden ser usados. Normalmente, se mezclan el adyuvante y la composición antes a la presentación al sistema inmune, o presentados por separado, pero en el mismo sitio del organismo que es inmunizado. Ejemplos de materiales adecuados para uso en las composiciones de vacunas se proporcionan en Osol (1980) . Puede ser proporcionada la heterogenicidad en una vacuna al mezclar virus de influenza replicados por al menos dos cepas de virus de influenza, tales como las cepas 2-20 o cualquier intervalo o valor en el mismo. Son preferidas las cepas de virus de Influenza A que tienen una composición antigénicas moderna. Las vacunas pueden ser proporcionadas para variaciones en una cepa sencilla de un virus de influenza, usando técnicas conocidas en la técnica. Una composición farmacéutica de acuerdo a la presente invención puede además o adicionalmente comprender por lo menos un compuesto quimioterapéutico, por ejemplo, para terapia de genes, inmunosupresores, agentes anti-inflamatoriros o mej oradores inmunes, y para las vacunas, los quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, gammma globulina, amantadina, guanidina, hidroxibencimidazol , interferon-a, interferon-ß, interferon-?, factor-alfa de necrosis tumoral, tiosemicarbarzonas, metisazona, rifampina, ribavirina, un análogo de pirimidina, un análogo de purina, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, dideoxinucleósidos , un inhibidor de proteasa o ganciclovir. La composición puede también contener cantidades variables pero pequeñas de formaldehído libre de endotoxina y conservadores, los cuales se ha encontrado que son seguros y no contribuiyen a efectos indeseables en el organismo al cual se administra la composición. Propósitos farmacéuticos La administración de la composición (o el antisuero que se produce) puede ser ya sea un propósito "profiláctico" o "terapéutico" . Cuando se proporcionan profilácticamente, las composiciones de la invención las cuales son vacunas son proporcionadas antes de que sean manifestados cualquier síntoma o signo clínico de una infección patogénica. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o atenuar cualquier infección subsecuente. Cuando se proporcionan profilácticamente, las composiciones de la terapia de genes de la invención, son proporcionadas antes de que se manifieste cualquier síntoma o signo clínico. La administración profiláctica de la composición sirve para prevenir o atenuar uno o más síntomas o signos clínicos asociados con la enfermedad. Cuando se proporcionan terapéuticamente, la vacuna viral atenuada o inactivada es proporcionada ante la detección de un síntoma o signo clínico de infección real . La administración terapéutica del compuesto sirve para atenuar cualquier infección real. Ver por ejemplo, Berkow et al., 1992; y Avery, 1987. Cuando se proporcionan terapéuticamente, se proporcionan una composición de terapia de genes ante la detección de un síntoma o signo clínico de la enfermedad. La administración terapéutica del compuesto sirve para atenuar un síntoma o signo clínico de esa enfermedad. De esta forma, una composición de vacuna atenuada o inactivada de la presente invención puede ser proporcionada ya sea antes al inicio de la infección (para así prevenir o atenuar una infección anticipada) o después del inicio de una infección real. Similarmente, para terapia de genes, la composición puede ser proporcionada antes de que se manifieste cualquier síntoma o signo clínico de un trastorno o enfermedad o después de que se detecten uno o más síntomas . Se dice que una composición es "aceptable farmacológicamente" si la administración puede ser tolerada por un mamífero receptor. Tal agente es para ser administrado en una "cantidad terapéuticamente efectiva" si la cantidad administrada es significativa fisiológicamente. Una composición de la presente invención es significativa fisiológicamente si su presencia resulta en un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor, por ejemplo, incrementa por lo menos una respuesta inmune humoral o celular, primaria o secundaria contra por lo menos una cepa de un virus de influenza de infección. La "protección" proporcionada necesaria no necesita ser absoluta, es decir, la infección de influenza no necesita ser totalmente prevenida o erradicada, si hay una mejora estadísticamente significativa comparada con una población de control o un grupo de mamíferos . La protección puede ser limitada para mitigar la severidad o rapidez de inicio de síntomas o signos clínicos de la infección del virus de influenza . Administración Farmacéutica Una composición de la presente invención puede conferir resistencia a uno o más patógenos, por ejemplo una o más cepas de virus de influenza, por ya sea inmunización pasiva o inmunización activa. En la inmunización activa, se administra una composición de vacuna viva inactivada o atenuada profilácticamente a un huésped (por ejemplo, un mamífero) , y la respuesta inmune del huésped a la administración lo protege contra infección y/o enfermedad. Para inmunización pasiva, el antisuero producido puede ser recuperado y administrado a un receptor el cual se sospecha de tener una infección provocada por al menos una cepa del virus de influenza. Una composición de terapia de genes de .la presente invención puede producir niveles profilácticos o •terapéuticos del producto de gen deseado por inmunización activa . En una modalidad, se proporciona la vacuna a una hembra mamifera (en o antes a ser preñada o al parto) , bajo condiciones de tiempo y cantidad suficientes para provocar la producción de una respuesta inmune la cual sirve para proteger tanto a la hembra y al feto o recién nacido (por medio de incorporación pasiva de los anticuerpos entre a lo largo de la placenta o en le leche de la madre) . La presente invención de esta forma incluye métodos para prevenir o atenuar un trastorno o enfermedad, por ejemplo, una infección por al menos una cepa de patógeno. Como se usa en la presente, una vacuna es para prevenir o atenuar una enfermedad si su administración resulta en ya sea la atenuación total o parcial (es decir, supresión) de un signo clínico o condición de la enfermedad, o en la inmunidad total o parcial del individuo a la enfermedad. Como se usa en la presente, una composición de terapia de genes es para prevenir o atenuar una enfermedad si su administración resulta en ya sea la atenuación total o parcial (es decir, supresión) de un signo clínico o condición de la enfermedad, o en la inmunidad total o parcial del individuo a la enfermedad.

Por lo menos un aislado de virus de influenza de la presente invención, el cual incluye uno el cual es inactivado o atenuado, una o más proteínas virales aisladas del mismo, una o más moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una o más proteínas virales de los mismos o una combinación de los mismos, pueden ser administrados por cualquier medio que logre los propósitos propuestos . Por ejemplo, la administración de tal composición puede ser por varias rutas parentales tales como rutas subcutáneas, intravenosas, intradérmicas, intramusculares, intraperitoneales , intranasales , orales o transdérmicas . La administración parental puede ser llevada a cabo por inyección de bolo o por perfusión gradual al paso del tiempo. Un régimen típico para prevenir, suprimir, o tratar una patología relacionada a virus de influenza, comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición de vacuna como se describe en la presente, administrada como un tratamiento sencillo, o repetido como dosis incrementadas o de refuerzo, sobre un periodo de hasta e incluyendo entre una semana y aproximadamente 24 meses, o cualquier intervalo valor en el mismo. De acuerdo a la presente invención, una "cantidad efectiva" de una composición es una que es suficiente para lograr un efecto deseado. Se entiende que la dosis efectiva puede ser dependiente de la especie, edad, sexo, salud, y peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de dosis efectivas proporcionadas posteriormente no se proponen para limitar la invención y representan intervalos de dosis . La dosis de una vacuna de virus vivo, atenuado o muerto para un animal tal como un organismo adulto mamífero puede ser de aproximadamente 102-1015, por ejemplo 103-1012, unidades formadoras de colonias (PFU por sus siglas en inglés) /kg, o cualquier intervalo o valor en el mismo. La dosis de vacuna inactivada puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 1000, por ejemplo, 30 a 100 µg/ de proteina HA. Sin embargo, la dosis puede ser una cantidad segura y efectiva como se determina por métodos convencionales, usando vacunas existentes como un punto de partida. La dosis de HA inmunorreactiva en cada dosis de vacuna de virus replicado puede ser estandarizada para contener una cantidad adecuada, por ejemplo 30 a 100 µg o cualquier intervalo o valor en la misma, o la cantidad recomendada por las agencias gubernamentales u organizaciones profesionales reconocidas . La cantidad de Na puede también ser estandarizada, sin embargo, esta glicoproteina puede ser lábil durante la purificación y almacenamiento.

Composiciones y Dosificación para Vacunas de Influenza Equina Las vacunas de influenza equina generalmente incluyen cepas representativas de subtipos H7N7 y H3N8 ya sea como virus enteros inactivos o sus subunidades . Ellas proporcionan protección contra la influenza al inducir anticuerpos a las glicoproteínas superficiales, en particular a HA, la cual es esencial para unión viral y entrada en las células, y/o potencialmente importantes respuestas inmunes mediadas por células a otras proteínas virales . La vacunación es útil para prevenir la influenza pero la protección es de vida corta (3-4 meses usando vacunas de virus inactivados convencionales) , de tal forma que la frecuencia de vacunación varía de acuerdo a con que frecuencia el caballo estará probablemente en contacto con el virus (ver la Tabla 1) . El procedimiento usual para el curso primario de vacunación con una dosis sencilla seguido por 3 a 6 semanas más tarde con una segunda dosis . Los fabricantes de vacunas recomiendan que las vacunas de refuerzo serán dadas en intervalos de 5 a 12 meses después de las mismas. Alternativamente, se administra un caballo con una dosis de 1 a 2 mi, por ejemplo, por vía inyección intramuscular (IM) , una segunda dosis de 1 a 2 mi 3 a 4 semanas más tarde en un sitio diferente de inyección, por ejemplo, por medio de inyección 1M, y opcionalmente una tercera dosis de 1 a 2 mi, por ejemplo, una administración IM o intranasal (IN) . Cada dosis de 1 a 2 mi de vacuna puede contener aproximadamente 1-500 billones de partículas de virus, y preferentemente 100 billones de partículas. Los caballos en contacto con un gran número de caballos, por ejemplo, en un establo de caballeriza, centros de entrenamiento, carreras, espectáculos, y otros de tales eventos, son con frecuencia vacunados cada 2-3 meses. Una serie primaria de tres dosis ha sido mostrada para inducir una inmunidad más alta y más persistente que la serie de dos dosis independiente de la edad. Usando vacunas convencionales, es aconsejable vacunar caballos jóvenes, particularmente caballos de carreras y otros caballos de competición, en intervalos de 4 a 6 de meses por varios años después de su curso primario de vacunaciones . Se ha demostrado que la inclusión de una vacunación de refuerzo adicional entre la segunda y tercera vacunación recomendada por los fabricantes de vacuna es de beneficio para caballos jóvenes. Un refuerzo anual será usualmente suficiente para caballos más viejos tales como mostrar saltadores y yeguas de reproducción que han sido vacunados regularmente ya que son potros . La vacunación al momento de un brote es algunas veces practicada, pero no es probable que sea efectiva sin un intervalo de por lo menos 7 a 10 días antes de que se expongan los caballos vacunados recientemente a la infección. Los brotes de influenza equina no son estacionarios como en el hombre sino son asociados frecuentemente con encuentros de ventas o de carreras donde se congregan y mezclan caballos de diferentes regiones. Puede por lo tanto ser ventajoso sincronizar las vacunaciones de refuerzo adicionales para ser dadas antes a tales eventos. Las yeguas de reproducción deben ser vacunadas en las etapas tardías cuando está preñada, pero no más de 2 semanas antes al parto, para asegurar un buen suministro de anticuerpos de calostro para el potro. Las vacunaciones de potros deben empezar en 3-6 meses de edad, sin un refuerzo en 4-7 meses, otra vez en 5-8 meses, y repetido cada tres meses si el potro está en alto riesgo de exposición. Tabla 1 Potros y Potros y Potro de Caballo de Caballos Yeguas de destetado de destetados de dos comportamiento de placer reproducción yeguas yeguas no años vacunadas vacunadas Influenza Primera dosis: 9 1a dosis: Cada 3- Cada 3-5 Anual con Por lo menos | inactivada meses 6 meses 4 meses refuerzos semianual, ¡njectable 2a dosis: 2a dosis: meses antes de con 1 10 meses 7 meses una refuerzo a las 3a dosis: 3a dosis: probable 4-6 semanas 11-12 meses 8 meses exposición de Después en después en preparación intervalos de 3 intervalos de tres meses meses Influenza 1a dosis: 1a dosis: Cada 4- Cada 4-5 Cada Anual antes intranasal 12 meses; HA 12 meses: HA 6 meses meses de la de virus sido administrada sido administrada meses reproducción vivo en forma segura a en forma segura adaptado potros menores a potros menores al frío de 11 meses a 11 meses Las vacunas de influenza pueden ser combinadas con antígenos de tétanos o virus de herpes así como también otros patógenos, por ejemplo, patógenos equinos. La respuesta inmune producida por el toxoide tetánico es mucho más durable que aquel inducido por el antígeno de influenza. En un programa de vacunación de influenza intensivo, las vacunas que contienen la influenza solamente son preferidas de esta forma. Se han identificado niveles de anticuerpos (medidos por el ensayo de SRH) requeridos para la protección de caballos a través de la vacunación y estudios de retos y de datos de campo. Ya que la respuesta a anticuerpo inducida por la vacuna a HA en caballos es remarcadamente de vida corta, los adyuvantes tales como el hidroxido de aluminio o carbómero son normalmente incluidos para incrementar la amplitud y duración de la respuesta inmune a las vacunas de virus enteros . Las vacunas de influenza equina de subunidad que contienen los complejos inmunoestimulantes (ISCOM por sus siglas en inglés) son también inmunogénicos . Históricamente, el contenido antigénico en vacunas inactivadas ha sido expresado en términos de unidades de aglutinación de células de pollo (CCA por sus siglas en inglés) de HA y potencia en términos de respuestas de anticuerpos HI inducidas en coballos y caballos, ninguno de los cuales produce resultados reproducibles . El ensayo de difusión radial sencilla (SRD por sus siglas en inglés) es una prueba de potencia in vitro mejorada que mide la concentración de HA activa inmunológicamente (expresada en términos de microgramos de HA) y puede ser usada para prueba de procesamiento antes de la adición del adyuvante. La invención será además descrita por el siguiente ejemplo no limitante. EJEMPLO Un potro Morgan/Friesian de 36 horas de edad aproximadamente es referido como el animal grande del hospital en la University of isconsin para una evaluación de mentalidad alterada (estado mental) , notada primerablemente después del nacimiento. El parto no ha sido observado, pero se ha encontrado que el potro se separa de la madre por una cerca en unas cuantas horas de edad. El potro es ambulatorio y capaz de comer cuando al descubrir el alimento pero muestra desorientación progresiva, ceguedad aparente, y anda sin dirección durante un periodo de 36 horas. Un ensayo de inmunoglobulina SNAP (IgG) (Idexx Laboratories, Westbrook, ME) en 24 horas de edad ha mostrado una concentración de IgG > 800 mg/dl, y una CBC realizada en ese tiempo es normal. Se trata al potro dos veces con sulfóxido de dimetilo 1 g/kg IV, se diluye en dextrosa al 5% antes de la referencia. En la presentación, el potro que corre sin dirección, se tropieza con objetos, y parece ciego con lentitud pero respuestas a luz pupilares intactas. Cuando se coloca bajo la madre, el potro se amamanta exitosamente. El examinen físico no es remarcable. Un CBC y bioquímica sérica son normales, incluyendo una concentración de IgG sérica de 937 mg/dl medida por radioinmunodifusión. El tratamiento inicial para encefalopatía isquémica, presuntiva hipoxémica incluye una dosis de carga de 250 mi de sulfato de magnesio al 20% por 1 hora, seguido por una infusión de proporción constante en 42 ml/h y clorhidrato de tiamina 2.2 mg/kg Iv q 24 horas. La terapia antimicrobiana consiste de amikacina 20 mg/kg IV q 24 horas y procainpenicilina G 22,000 U/kg 1M q 12 horas. Se administra también omeprazol 1 mg/kg PO q 24 horas al potro para ayudar a prevenir el desarrollo de úlceras gástricas. El estado mental del potro permanece estático durante las siguientes 24 horas, y el tratamiento adicional con manitol 1 g/kg IV q 24 horas y fosfato dexametasona sódica 0.1 mg/kg IV q 24 horas en los días 2 y 3 de hospitalización no está asociada con mejoras. En el día 3, el potro se somete a anestesia general para un análisis tomográfico computarizado del cerebro y espina 1 proximal, la cual es normal. Se obtiene una muestra de fluido cerebroespinal a partir del espacio lumbosacral y es normal en evaluación citológica y tiene una concentración de proteína normal . En el día 4 de la hospitalización, el potro desarrollo una inclinación de la cabeza del lado derecho pero de otra forma permanece estático a través del día 5 de hospitalización. Se discontinua la terapia de sulfato de magnesio en el día 5, pero el resto del régimen terapéutico no cambia. En el día 6, el potro tiene 2 ataques generalizados, breves que son controlados con midazolam 0.05 mg/kg IV. Entre los ataques, el potro esta todavía débil, afebril y en amamantado . En el día 7 de la hospitalización, el potro llega a ser febril (40°C) y desarrolla una descarga nasal mucopurulenta y taquipnea progresiva con crujidos adventicios difusos y resuellos en auscultación. La fiebre, descarga nasal mucopurulenta, y tos han sido notados en varias otras mares y potros en la unidad de cuidado neonatal durante los 7 días previos . Se cambia la terapia antimicrobiana a ticarcillina/ácido clavulánico 50 mg/kg Uv q 8 horas tiene gentamicina 6.6 mg/kg Iv q 24 horas, y se trata el potro con fluidos polifónicos, aunque está todavía en amamantado. Durante los días 8-10, el estado neurológico del potro continua mejorando, con una resolución de la inclinación de la cabeza y un regreso a la mente normal, pero la taquipnea, diseña, y sonidos pulmonares adventicios empeoran. La radiografía torácica en este momento muestra un patrón broncointersticial difuso, severo. La aminofilina 0.5 mg/kg Iv q 12 horas por infusión lenta e insuflación nasal de oxígeno son instituidos en los días 9 y 10 de la hospitalización. El análisis de gas de sangre arterial en serie identifica hipoxemia severa (Pa02, 52 mm Hg) , hipercapnia (PaC02, 68.4 ram Hg) y reduce la saturación de oxígeno (76%) al final del día 10. Consecuentemente, se coloca el potro en un ventilador mecánico. El soporte de ventilador y la nutrición parental total son continuados por 48 horas, tiempo durante el cual los valores de gas de sangre arterial se normalizan en 100% de oxígeno. Se continua la terapia antimicrobiana como antes. Cuando se lleva a reto en el día 13 por la remoción del soporte de ventilador, el potro desarrolla diseña severa y cianosis y se eutaniza a solicitud del propietario. Un cultivo aeróbico de un aspirado transtragueal obtenido en el día 13 hace crecer Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli resistentes a ticarcillina/ácido clavulánico y gentamicina. Se realiza un examen postmorten grande completo e histopatológico, así como también una evaluación de reacción de cadena polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCR por sus siglas en inglés) para la presencia de virus de herpes equino (EHV por sus siglas en inglés) y EHV-4 en muestras de secreciones nasales, pruebas serológicas para determinar si hay exposición a virus de arteritis viral equina; y un ensayo de Flu A Directigen (Bectin Dickinson and Co., Franklin, NJ) , y aislamiento de virus a partir de muestras de secreciones nasales para probar la presencia del virus de influenza. Las muestras de secreciones nasales son recolectadas con cotonetes de Dacron que son colocados subsecuentemente en 2 mi de medio de transporte viral que contienen solución salina amortiguada con fosfato, albúmina sérica bovina al 0.5% y penicilina G, estreptomicina, nistatina y gentamicina. Las muestras de cotonetes nasales son recolectadas en el día 8 de la hospitalización. Las siguientes evaluaciones para el virus de influenza incluyen inmunoquimica en pulmón congelado en pedazos y fijo en formalina, visceras abdominales, y tejidos del sistema nervioso central para la presencia de expresión de nucleoproteína de influenza (NP por sus siglas en inglés) , aislamiento de virus a partir de tejido de pulmón congelado y análisis de secuencias viral. El examen post-morten Gross identifica neumonía intersticial difusa severa y hemorragia subdural en la superficie ventral caudal del cerebro alrededor de la glándula pituitaria pero no evidencia de sepsis o patología en otros órganos . El examen histopatológico del pulmón identifica bronquitis necronizante y broquiolitis, metaplasia escamosa difusa y neumonía intersticial mutifocal. Un infiltrado mononuclear suave forra las vías respiratorias inferiores y, ocasionalmente, áreas de colapso alveolar asociado con congestión y exudado . La evaluación del tej ido cerebral revela una dilatación suave del sistema ventricular con vacuolación de materia blanca difusa, particularmente en el cerebelo. La tinción de violeta de cresilo para la presencia de mielina es realizada en secciones múltiples y muestra mielina disminuida pero presente en todo el cerebro y la espina dorsal cuando se compara con los tejidos a partir de una tinción de control marcada con la edad en paralelo. Anormalidades histopatológicas adicionales en el sistema nervioso central incluyen una ausencia aparente de la capa molecular dentro del cerebelo Las pruebas serológicas para la arteritis viral equina y un ensayo de PCR real en tiempo para ADN de EHV-1 y EHV-4 son negativas. La presencia de virus de influenza en secreciones nasales inicialmente se confirma por un ensayo Directigen positivo. Los estudios previos han documentado la sensibilidad y especificidad de este ensayo cuando se aplican a muestras de secreción nasal equinas (Morely et al., 1995 y Cambers e t 1., 1994) . Las muestras de medio de transporte de cotonete nasal son también inoculadas en la cavidad alantoica de huevos de pollos embrionados y en células de riñon canino Madin-Darbi (MDCK por sus siglas en inglés) que crecen en placas de cultivo celular de 24 pozos. Los efectos histopatológicos consistentes con el crecimiento de virus de influenza son observados en las células MDCK inoculadas, y un agente que provoca la hemaglutinacion de glóbulos rojos de pollo sé aisla de huevos inoculados (Palmar et al., 1975) . La presencia del virus de influenza en los cultivos celulares de MDCK se confirma por la tinción inmunocitoguímica (Landolt et al . , 2003) de las células inoculadas con un anticuerpo monoclonal anti P (Mab) 68 D2 (amablemente proporcionadas por el Dr Yoshihiro Kawaoka, University of Wisconsin-Madison School of Veterinary Medicine) con células de control positivo (virus de influenza porcina inoculado) y negativo (prueba inoculado) incluidas en la misma placa. La identidad del virus como un virus de influenza equina del subtipo 113 se confirma por amplificación de PCR transcripción inversa del gen de hemaglutinina (HA) a partir del aislado, con cebadores descritos en Olsen et al, (1997) , seguido por secuenciación de ciclo de la región de codificación de la proteína de longitud completa del gen HA y comparaciones de doble par a secuencias virales disponibles en GenBank (software DNASTAR, versión 4.0 para Win32. Bestfit, Madison, WI) . El virus es mostrado para ser derivado del linaje de Norteamérica de los virus de influenza equina H3 , por un análisis filogenérico que usa un análisis de secuencia de parsinomia máxima (software PAUP, versión 4,0b6; David Swofford, Smithsonian Institución. Washington, DC) de la secuencia HA comparada con las cepas de virus de referencia con una búsqueda rápida heurística de 1,000 replicados de secuencia. Análisis similares de porciones de las secuencias de nucleótidos del gen de proteína no estructural (544 nucleótidos en secuencia) y el gen NP (885 nucleótidos en secuencia) además confirman la identidad del virus como un virus de influenza equina de linaje Norteamérica. Este virus es ahora identificado como A/Equine/Wisconsin/I/03. La Figura 1 proporciona las secuencias para la región de codificación de cada gen de ese virus . La presencia del virus de influenza también se evalúa en los pulmones y otros tejidos del potro. Específicamente, la inmunoquímica con Mab 68D2 muestra áreas dispersadas ampliamente, difundidas de expresión NP del virus de influenza (predominantemente vías respiratorias circundantes localizadas) en las muestras de tejidos de pulmón congelado así como también fijo en formalina. La expresión NP no es mostrada en el otro sistema visceral o en el nervioso central. Además, se aisla el virus de la influenza en células MDCK (y confirmado por inmunocitoquímica y secuenciación de gen HA) a partir de una muestra del tejido de pulmón congelado. El síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS por sus siglas en inglés) en potros neonatales ha sido documentado como una consecuencia de sepsis bacteriana (Wilkins, 2003; Hoffman et al., 1993), perinatal EHV-1 (Frymus et al., 19986, Gilkerson et al., 1999) y EHV-4 (Gilkerson et al., 1999), e infección de arteritis viral equina (Del Pierro et al., 1997) . Menos enfermedad de las vías respiratorias inferiores severa ocasionalmente es documentada con adenovirus e infecciones EHV-2, particularmente en el paciente inmunocomprometido (Webb et al., 1981, Murria et al., 1996).

La neumonía bronintersticial y ARDS son enfermedades respiratorias de alta mortalidad de potros más viejos con causas potenciales severas, incluyendo infecciones bacteriales y virales (Lukritz et al, 1993) . Si esto ocurre en neonatos que experimentan choque séptico o en potros más viejos con neumonía broncointersticial difusa, se caracteriza la ARDS por taquipnea severa, rápidamente progresiva, de inicio agudo. El esfuerzo respiratorio incrementado, cianosis empeorada, hipoxemia, e hiperapnea que acompaña a ARDS frecuentemente son responsivos deficientemente a terapia agresiva (Wilkins, 2003; Lakritz et al., 1993). Es una categoría de enfermedad respiratoria con varias etiologías potenciales y proporción de mortalidad que frecuentemente excede el 30% a pesar del tratamiento intensivo con antimicrobianos, oxígeno, agentes antiinflamatorios, broncodilatadores , y control termorregulatorio . La influenza equina es una causa bien documentada de enfermedad respiratoria superior en caballos mundialmente (Wilkins, 2003; Van Manen et al., 2002; Wilson, 1993) , pero existe muy poca información en la literatura acerca de las manifestaciones de esta enfermedad en neonatos . Un reporte sencillo describe la neumonía broncointestinal en un potro de 7 días de edad a partir del cual se aisla la influenza A equina (Britton et al., 2002); este potro se asemeja al potro descrito en la presente. El potro detallado en este estudio es uno de varios caballos hospitalizados que desarrolla fiebre, descarga nasal mucopurulenta y tos durante un periodo de 2 ó 3 semanas . Los signos clínicos en los otros caballos afectados, incluyendo los neonatos de alto riesgo, generalmente son confinados al tracto respiratorio superior, excepto para los signos sistémicos suaves de fiebre e inapetencia. La razón para la severidad de la falla pulmonar en este potro no es claro. El tratamiento incluye el fármaco potencialmente inmunosupresor dexametasona y anestesia general para un procedimiento de diagnóstico, ambos los cuales pueden haber predispuesto al potro al desarrollo de neumonía. El impacto de la enfermedad neurológica en el desarrollo y progreso de la enfermedad respiratoria también no es clara. Los descubrimientos histológicos de vacuolización difusa, disminuyen la miclina a través del sistema nervioso central, y capa molecular ausente dentro del cerebelo no se fija a ningún diagnóstico clínico específico o histopatológico . El potro puede haber sido dañado en el control central de la respiración, porque las áreas del cerebro implicadas en el control de la respiración (las vértebras y médula oblongada) muestran vacuolización difusa y tinción disminuida de miclina. Cualquier daño subsecuente de ventilación puede haber sido similarmente un evento terminal dado la normalización de la función ventilar hasta varios días después déla hospitalización. Sin embargo, la mente anormal a partir del nacimiento, la vacuolización, la mielinización disminuida en el sistema nervioso central, y las anormalidades cerebelares son sugestivas de una anormalidad neurológica congenital, concurrente, la cual puede haber comprometida la capacidad del potro para responder a función respiratoria empeorada . La hemorragia focal observada en el aspecto ventral caudal del cerebro es suave y es posiblemente una consecuencia de trauma durante uno de los ataques que experimenta el potro. La yegua ha sido vacunada semianualmente contra la influenza por los pasados 2 años con un producto muerte y se le da una vacunación de refuerzo cuando se preña la última vez. Considerando la evidencia de transferencia pasiva adecuada en este potro, estos anticuerpos aparentemente no confieren protección adecuada para el potro. Adicionalmente, el análisis filogenético del aislado obtenido a partir del potro lo caracterizada como un subtipo H3N8, y el producto comercial usado para vacunar la yegua en la su última inseminación contiene una cepa de virus de influenza del mismo subtipo, lo cual sugiere que la transferencia pasiva no puede ser garantizada para protegerla contra infección natural bajo ciertas circunstancias . Esta carencia de eficacia de vacuna es consistente con un estudio reciente por Munford et al. (2003) que describe la falla de vacunas del virus de influenza equina H7N/ y H3N8 comercialmente disponibles para proteger a los adultos contra enfermedad respiratoria aguda que resulta de una infección natural con ciertas cepas de virus H3N8. La recuperación transtraqueal de 2 especies de bacterias que son resistentes al régimen antimicrobiano en lugar del momento de la muerte confunde la conclusión de que la influenza es la única causa de muerte. Sin embargo, el examen post morten identifica evidencia no de Gross o histopatológica de sepsis, y ocurre sinergia entre el virus de la influenza y algunos patógenos bacterianos, combinándose para provocar neumonía con mortalidad incrementada (McCullers et al., 2003; Simonsen, 1999) . Adicionalmente, el aislamiento del virus infeccioso y la demostración inmunohistoquímica de antígeno viral a partir de tejido de pulmón obtenido post morten, 6 días después de que se recupera inicialmente el virus por un cotonete nasofaríngeo, proporciona fuerte evidencia de una contribuación patológica a partir del virus de influenza en esta falla respiratoria del potro. Para comparar las características de crecimiento de virus de linaje aviario, equino, humano y porcino en células epiteliales respiratorias caninas primarias y para investigar la influencia de las especies en sus características de crecimiento, se infectan las células cultivadas en un MOI de 3 con virus que incluyen A/Equine/Wisconsin/l/03 y se incuban por hasta 10 horas. Los otros virus incluyen seis aislados de virus de influenza A humano y porcino (A/Phillipines/08/98 , A/Panama/2002/99, A/CostaRica/07/99 ; A/Swine/NorthCarolina/44173/00, A/Swine/ innesota/593/99 , A/Swine/Notario/00130/97, y dos virus de influenza equina (A/Eguine/Kentucky/81 y A/Equine/Kentucky/91) . En el final del experimento, se fijan a formalina las células por inmunocitoquimica y análisis de citometría de flujo. Los seis aislados de virus de influenza humana y porcina mencionados anteriormente fácilmente infectan substancialmente todas (80-90%) de las células epiteliales respiratorias caninas y crecen en altos títulos (105-3 -107 TCID50/ml) en aquellas células. A/Equine/Kentucky/81 y A/Equine/Kentucky/91) son altamente restringidos en su capacidad de infección (<10% de las células infectadas) con poco (101"7 TCID50/ml para A/Equine/Kentucky/81) o ningún (para A/Equine/Kentuchi/91) crecimiento viral detectable. En contraste, A/Equine/Wisconsin/l/3 infecta un porcentaje mayor (aproximadamente 30%) de las células epiteliales respiratorias caninas primarias y crecen a substancialmente títulos superiores (aproximadamente 104'8 TCID50/ml) en aquellas células . Los resultados demuestran que todos los virus de influenza A probados son capaces de infectar las células epiteliales respiratorias primarias caninas. Sin embargo, la capacidad de infección y características de replicación de los virus son bastante dependientes al linaje. Dubovi et al. (2004) notan brotes recurrentes de enfermedad respiratoria severa por tos y fiebre en perros Greybound en rieles de carreras en Florida. La mayoría de los perros afectados se recuperan, pero algunos sucumben a una neumonía hemorrágica fatal..Los tejidos de los pulmones de 5 de los perros que mueren de síndrome de neumonía hemorrágica son sometidos a estudios de aislamiento de virus en células epiteliales de riñon de chango verde Africano (Vero) , células epiteliales de riñon canino Madin-Darby (MDCK) , células epiteliales de riñon canino primario, células epiteliales de pulmón canino primario, células epiteliales testiculares de bovino primario, fibroblastos de tumor canino (A-72) y células epiteliales de adenocarcinoma colorrectal humano (HRT-18) (Dubovi et al., 2004) . La citopatología en las células MDCK se nota en el primer paso del homogenado de pulmón a partir de uno de los perros, y la pérdida de citopatología ante pasaje subsecuente a células cultivas sin tripsina acoplada con la presencia de actividad hemaglutinante en sobrenadantes de cultivo sugiere la presencia del virus de influenza (Dubovi et al., 2004). El virus es identificado inicialmente como virus de influenza por PCR usando cebadores específicos para el gen de matriz. El virus de la influenza canina hs sido designado como la cepa A/Canine/Florida/43/04. En base al aislamiento de virus a partir de los pulmones, la presencia de antígenos virales en tejidos de pulmón por inmunohistoguímica, y datos de seroconversión, Dubovi et al. (2004) concluyen que el virus de influenza aislado es más probablemente el agente etiológico responsable para la neumonía hemorrágica fatal en Greybounds durante el brote de Jacksonville 2004, y que este es el primer reporte de un virus de influenza equina asociado con enfermedad respiratoria en perros (Dubovi et al., 2004). La proteína HA del aislado canino difiere de la cepa A/Equine/Wisconsin/l/03 por solamente 6 aminoácidos. Referencias . Avery's Drug Treatment : Principies and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3a edición, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987). Aymard-Henry et al., Virology: A Practical Approach, Oxford IRL Press, Oxford, 119-150 (1985) . Bachmeyer, Intervirology, 5:260 (1975). Berkow et al., eds., The Merck Manual, 15a edición, Merck & Co. , Rahway, NJ (1992). Britton et al., Can. Vet . J., 43:55 (2002). Chambers et al., Vet. Rec, 135: 275 (1994). Daly and Munford, In: Equine Respiratory Diseases Lekeux (ed.) International Veterinary Information Science, Ithaca, NY (2001) . Del Piero et al., Equine Vet. J. , 29: 178 (1997). Dubovi et al . , Proceedings of the Maerican Association of Veterinary Laboratory Diagnostics, pág. 158 (2004) . Enami et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87:3802 (1990) . Frymus et al., Pol. Arch. Med. Wewn, 26:7 (1993).

Gilkerson et al., Vet . Microbiol . 68:27 (1999). Grand and Skehel, Nature, New Biology, 238:145 (1972). Hoffman et al., Am. J. Vet. Res., 54:1615 (1993). Kilbourne, Bull . M2 World Health org. 41:653 (1969). Lakritz et al., J. Vet. Intern. Med. , 7:277 (1984-1989).

Landolt et al., J. Clin. Microbiol. 41 : 1936 (2001). Laver & Webster, Virology, 69 :511 (1976) . Marriott et al., Adv. Virus Res., 53 : 321 (1999). McCullers et al., J. Infect . Dis., 187 :1000 (2003). Morley et al., Equine Vet. J. , 27:13 (1995). Mumford et al., Equine Vet. J., 35:72 (2003). Murphy, Infect . Dis. Clin. Practi . 2: 174 (1993). Murray et al., Eqine Vet. J., 28:432 (1996). Muster et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88 ; 5177 (1991) Neumann et al., Proc. Nati. Acad. Sci, U.S.A. 96:9345 (1999) Ogra et al., J. Infect. Dis., 134 :499 (1977). Olsen et al, Vaccine, 15 -.1149 (1997) . Osol (ed.), Remington^s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 1324-1341 (1980). Palmar et al, Madison WI : University of Wisconsin Department of Health, Education and Welfare Immunology Series (1975) . Park et al., Proc. R. Soc. LondonB., 271 :1547 (2004).

Robertson et al., Biologicals, 20 -.213 (1992) Robertson et al . , giornale di Igiene e Medicina Preventiva, 29 :4 (1988) . Simonsen, Vaccine, 17-.S3 (1999). Subbarao et al . , J. Virol 67:7223 (1993). Van Manen et al., Vet . Q. , 24:79 (2002). Webb et al., Aust . Vet. J. , 57: 142 (1981). ilkins, Vet. Clin orth Am. Equine Pract. 19:19 (2003). Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes son incorporadas en la presente para referencia. Mientras que la especificación mencionada anteriormente ha sido descrita en relación a ciertas modalidades preferidas de la misma, y muchos detalles han sido indicados para propósitos de ilustración, será aparente para aquellos expertos en la técnica que la invención es susceptible para modalidades adicionales y que ciertos de los detalles en la presente pueden ser variados sin alejarse considerablemente de los principios básicos de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un virus de influenza equina H3 aislado caracterizado porque comprende una HA que tiene una SEQ ID N0:1 o una HA que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 1 la cual no tiene una valina en la posición 78 o una arginina en la posición 159. 2. El virus de influenza equina aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende por lo menos uno de los siguientes : NA que tiene la SEQ ID NO: 2 o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID N0:2, PB1 que tiene la SEQ ID N0:3, o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, PB2 que tiene la SEQ ID NO: 4 o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 4; PA que tiene la SEQ ID NO: 5 o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 5; NP que tiene la SEQ ID NO: 6 o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 6; MI que tiene la SEQ ID NO: 7 o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 7; M2 que tiene la SEQ ID NO: 17 o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 17; NSI que tiene la SEQ ID NO: 8 o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 8; y/o NS2 que tiene la SEQ ID NO: 18 o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 18. 3. El virus de la influenza equina aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende ácido nucleico de cadena negativa correspondiente a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican por lo menos una de las secuencias SEQ ID NO: 1-8, 17 ó 18. . El virus de la influenza equina aislado, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene HA que tiene la SEQ ID NO: 1 y NA que tiene la SEQ ID NO: 2. 5. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende un segmento de ácido nucleico para un virus de influenza HA que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como SEQ ID NO: 1, NA que tiene la misma secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, PB1 que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 3; PB2 que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 4; PA que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 5; NP que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 6; MI que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 7; M2 que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 17; NS1 que tiene la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 8, NS2 que tiene la misma secuencia de aminoácidos como la SEQ ID NO: 18; o el complemento del segmento de ácido nucleico, en donde el segmento de ácido nucleico para HA no codifica una valina en la posición 78 o una arginina en la posición 159. 6. El polinucleotido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico tiene substancialmente la misma secuencia de ácido nucleico como una de SEQ ID NO: 9-16, o el complemento de la misma. 7. El polinucleotido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque además comprende un promotor enlazado operablemente y/o una secuencia de terminación de transcripción. 8. El polinucleotido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico está en orientación de sentido. 9. El polinucleotido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el segmento de ácido nucleico está en una orientación antisentido. 10. El polinucleotido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque incluye las secuencias del virus de influenza 5' y 3' en el final del segmento de ácido nucleico. 11. Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como una de las SEQ ID NO: 1-8 ú 17-18, en donde el polipéptido que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos como SEQ ID NO: 1 no tiene una valina en la posición 78 ó una arginina en la posición 159. 12. Una composición caracterizada porque comprende uno o más vectores para el ARNv de influenza y/o producción de proteína, en donde por lo menos un vector comprende un promotor enlazado operablemente a por lo menos uno de los segmentos de ácidos nucleicos del polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 5 opcionalmente enlazado a una secuencia de terminación de transcripción. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende dos o más vectores cada uno que tiene un segmento de ácido nucleico diferente . 14. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque incluye un vector para HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M u opcionalmente MI y/o M2 , y NS u opcionalmente NS1 y/o NS2. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque incluye un vector con un cuadro de lectura abierta para una proteina de virus de influenza funcional para todos pero con excepción de HA, NA, PB1, PB2 , PA, P, MI, M2 , NS1 ó NS2. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende además un vector que comprende un ADN de interés . 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el vector que comprende el ADN de interés es un vector de virus de influenza. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque cada vector es un vector de virus de influenza. 19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque además comprende un vector que comprende un ADN de interés . 20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el vector que comprende el ADN de interés es un vector de virus de influenza . 21. La composición de conformidad con la reivindicación 16 ó 19, caracterizada porque el ADN de interés comprende un cuadro de lectura abierta que codifica un polipéptido o péptido inmunogénico de un patógeno o un polipéptido o péptido terapéutico. 22. Un método para preparar un virus de influenza, caracterizado porque comprende: poner en contacto una célula de ave o de mamífero con el virus de conformidad con la reivindicación 1. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porgue además comprende aislar el virus. 24. El virus aislado caracterizado porque se obtienen de conformidad con el método de la reivindicación 23. 25. Una célula caracterizada porque está infectada con el virus de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 . 26. Un método para inmunizar un mamífero contra la influenza, caracterizado porque comprende: administrar al mamífero una cantidad efectiva del virus de conformidad con la reivindicación 1 ó 24. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el mamífero es un perro o un caballo. 28. Una vacuna caracterizada porque comprende el virus de conformidad con la reivindicación 1 ó 24, en una cantidad efectiva para inducir una respuesta profiláctica o terapéutica contra la infección de influenza. 29. La vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque además comprende un virus de influenza aislado diferente. . 30. La vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque además comprende un virus de influenza aislado diferente. 31. La vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el virus de la influenza equina aislado es un virus recoleccionante . 32. La vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el virus de la influenza equina ha sido alterado por medio químico, físico o molecular. 33. La vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque además comprende un adyuvante. 34. La vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque además comprende un portador aceptable farmacéuticamente. 35. La vacuna de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el portador es adecuado para administración intranasal o intramuscular. 36. La vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque es una forma secada por congelamiento . 37. Un método de diagnóstico caracterizado porque comprende poner en contacto una muestra fisiológica de un animal que se sospecha de contener anticuerpos de virus antiinfluenza con el virus de conformidad con la reivindicación 1 ó 24; y determinar si la muestra comprende anticuerpos específicos para el virus. 38. Un método de diagnóstico caracterizado porque comprende: poner en contacto una muestra fisiológica de un animal que se sospecha contiene los anticuerpos del virus antiinfluenza con el polipéptido de HA aislado de conformidad con la reivindicación 11; y determinar si la muestra comprende anticuerpos específicos para el polipéptido HA aislado. 39. Un método para detectar la replicación específica de especies de virus de influenza, caracterizado porque comprende : a) poner en contacto uno o más virus de influenza aislados con células primarias epiteliales respiratorias mamíferas no humanas ; y b) detectar si uno o más virus son replicados eficientemente en las células . 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque las células son células caninas.