JP2019510481A - ワクチン開発のための改善されたb型インフルエンザウイルス複製 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年2月19日に出願された米国特許出願 62/297,400に基づく優先権を主張しており、その内容は、本明細書において出典明記により全体に組み込まれる。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与されたHHSN272201400008Cに基づく米国政府支援によりなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、本発明の核酸分子(例えば、ベクター又はプラスミド)、ペプチド若しくはポリペプチド(タンパク質)、又はウイルスを指し、その結果、インビボ物質と関連しないか、又はインビトロ物質から実質的に精製される。単離されたウイルス調製物は、一般に、インビトロ培養及び増殖によって、及び/又は卵における継代培養を経て得られ、他の感染因子を実質的に含まない。
B型インフルエンザウイルスは、少なくとも10個のタンパク質をコードする8つの一本鎖ネガティブセンスウイルスRNA(vRNA)のゲノムを保有する。前記インフルエンザウイルスのライフサイクルは、前記ホスト細胞の表面上のシアル酸含有受容体への赤血球凝集素(HA)の結合が始まり、次いで受容体介在性エンドサイトーシスが始まる。後期エンドソームにおける低pHは、HAにおける立体構造のシフトを誘発し、それによってHA2サブユニットのN末端(融合ペプチドと称される)を露出させる。融合ペプチドは、ウイルスとエンドソームの膜の融合を起こし、マトリックスタンパク質(M1)及びRNP複合体が、細胞質に放出される。RNPは、vRNAをカプセル化する核タンパク質(NP)と、PA、PB1、及びPB2タンパク質によって形成されるウイルスポリメラーゼ複合体からなる。RNPは、転写及び複製が起こる核内に輸送される。前記RNAポリメラーゼ複合体は、5’キャップ及び3’ポリA構造を有するmRNAの合成、完全長相補RNA(cRNA)、及びcRNAを鋳型として用いたゲノムvRNAの3つの異なる反応を触媒する。次いで、新たに合成されたvRNA、NP、及びポリメラーゼタンパク質は、RNPに組み立てられ、核から輸出され、子孫ウイルス粒子の出芽が起こる原形質膜に輸送される。ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去することにより感染の後期で重要な役割を担い、前記細胞表面から新しく組み立てられたビリオンを放出し、ウイルス粒子の自己凝集を防止する。ウイルスアセンブリは、タンパク質-タンパク質及びタンパク質-vRNA相互作用を含むが、これらの相互作用の性質はほとんど知られていない。
細胞培養及び/又は孵化鶏卵におけるウイルスの複製能力を増加させる突然変異は、インフルエンザウイルスを増幅し、強力なインフルエンザワクチンプラットフォームを確立することに有効である。現在、ほとんどのB型インフルエンザワクチンは、孵化鶏卵で作成される。MDCK細胞で作成されたインフルエンザワクチンは、現在、米国及び欧州でのヒトへの使用が承認されており、Vero細胞由来のインフルエンザワクチンは、ヒトへの使用が欧州で承認されている。本明細書に記載されるように、ワクチンウイルス単離株の「内部」ウイルス遺伝子(前記ウイルス表面糖タンパク質HA及びNAをコードするものを除くウイルス遺伝子)、例えば、B/ヨコハマ/UT-K31/2012(ヤマガタ-リネージを表す)由来のNA及びHA遺伝子又はB/ヨコハマ/UT-K1A/2011(ビクトリア-リネージを表す)由来のNA及びHA遺伝子を有するB/ヤマガタ1/73の内部遺伝子におけるランダム突然変異を保有するウイルスライブラリーは、細胞(例えば、MDCK又はVero細胞)において作成及び継代培養される。同定された突然変異は、より効率的なB型インフルエンザウイルスの増殖及びより費用効果の高いワクチン製造を可能にする、細胞においてより高いウイルス力価をもたらす(異種細胞及び/又は孵化鶏卵中のウイルス力価も増加し得る)。前記内部ウイルスセグメント及びウイルス糖タンパク質のコード領域における突然変異に加えて、非コード領域の突然変異は、ウイルス力価は、例えば、前記NPセグメントにおけるg1795a、前記NSセグメントにおけるa39g、前記NSセグメントにおける位置38の後のg追加、又は前記PAセグメントにおけるg2213a若しくはa2272t、を増加させることが観察された。増殖増強をもたらす得られたコード配列はまた、例えば、イヌ細胞又は霊長類細胞等の哺乳動物細胞又はニワトリ胚等の鳥類細胞における発現に最適化されたコドン使用頻度であり得る。前記突然変異は、様々な組み合わせで使用することができ、その結果は、使用中の細胞系統(又は卵)及び前記ウイルスの複製における所望するレベルの改善に影響される。1つ以上の選択された突然変異が、ワクチンウイルス単離株の1つ以上の内部遺伝子に導入されてもよく、1つ以上の突然変異を有する1つ以上の内部遺伝子を、ワクチンウイルスとして有用なリアソータントに含めるために選択され得る。次いで、そのウイルスを他のウイルス、例えば1つ以上のA型インフルエンザウイルス及び/又は1つ以上のB型インフルエンザウイルスと組み合わせて多価ワクチンを形成し得る。
何れかの細胞、例えば、何れかの鳥類若しくは哺乳類動物細胞、例えば、ヒト(293T又はPER.C6(登録商標)細胞)、又はイヌ(MDCK)、ウシ、ウマ、ネコ、ブタ、ヒツジ、齧歯類(例えばミンク(例えば、MvLu1細胞))、又はハムスター(例えば、CHO細胞)、又は非ヒト霊長類(例えば、突然変異細胞を含む、Vero細胞)は、インフルエンザウイルスの効率的な複製をサポートし、インフルエンザウイルスを単離及び/又は増殖させるために使用され得る。単離されたウイルスは、リアソータントウイルスを調製するために使用され得る。一実施形態において、ワクチン製造のためのホスト細胞は、継代哺乳動物又は鳥類細胞株若しくは継代細胞系統である。使用される前記細胞の完全な特徴付けは、最終産物の純度に関する適切なテストを含めることが出来るように行われ得る。細胞の特徴付けに使用され得るデータは、(a) その起源、派生、及び継代培養履歴; (b) その増殖及び形態学的特徴に関する情報; (c) 外来性薬剤のテスト結果; (d) 前記細胞が、他の細胞株の中ではっきりと認識出来るようにする生化学的、免疫学的、及び細胞遺伝学的パターン等の特徴を区別すること; 及び(e) 腫瘍原生のテスト結果、を含む。一実施形態において、使用される前記ホスト細胞の継代培養レベル又は集団倍加は可能な限り低い。
本発明のワクチンは、本発明の単離された組換えインフルエンザウイルス、及び任意で他の単離されたインフルエンザウイルスを含む1つ以上の他の単離されたウイルス、1つ以上の免疫原性タンパク質又は1つ以上の単離されたインフルエンザウイルスの糖タンパク質又は1つ以上の他の病原体(例えば、1つ以上の細菌由来の免疫原性タンパク質、非インフルエンザウイルス、酵母又は真菌)、又は本発明の単離されたインフルエンザウイルスの1つ以上の免疫原性タンパク質を含む1つ以上のウイルスタンパク質(例えば、DNAワクチン)をコードする単離された核酸、を含む。一実施形態において、本発明の前記インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス又は他の病原体に対するワクチンベクターであり得る。
不活性化されたインフルエンザウイルスワクチンは、限定されないが、ホルマリン又はβ-プロピオラクトン処理等の既知の方法を用いて複製ウイルスを活性化することによって提供される。本発明において使用することが出来る不活性型ワクチン型は、全ウイルス(WV)ワクチン又はサブビリオン(SV)(スプリット)ワクチンを含むことが出来る。前記WVワクチンは、インタクトな不活性化ワクチンを含み、前記SVワクチンは、脂質含有ウイルスエンベロープを可溶化する界面活性剤で破壊された精製ウイルスを含み、その後残留ウイルスの化学的不活性化を含む。
生存弱毒化インフルエンザウイルスワクチン、例えば本発明の組換えウイルスを含むワクチンを、インフルエンザウイルス感染を予防又は治療するために使用することが出来る。弱毒化は、弱毒化ドナーウイルスから複製された単離株又はリアソータントウイルスへの既知の方法による弱毒化された遺伝子の移入によって単一工程で達成され得る。A型インフルエンザウイルスに対する耐性は、主にHA及び/又はNA糖タンパク質に対する免疫応答の発生によって媒介されるため、これらの表面抗原をコードする遺伝子は、リアソータントウイルス又は臨床分離株に由来する。前記弱毒化遺伝子は、弱毒化親に由来する。このアプローチにおいて、弱毒化をもたらす遺伝子は、一般的に、HA及びNA糖タンパク質をコードしない。
接種に適した(例えば、鼻、非経口又は経口投与)本発明の医薬組成物は、1つ以上のインフルエンザ単離株、例えば1つ以上の弱毒化又は不活性化インフルエンザウイルス、そのサブユニット、及び/又は1つ以上のそのタンパク質をコードする単離された核酸を含み、任意で滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルジョンをさらに含む。前記組成物は、当該分野で公知の補助剤又は賦形剤をさらに含むことが出来る。本発明の組成物は、一般に、個々の用量(単位用量)の形態で提示される。
前記組成物(又はそれが惹起する抗血清)の投与は、「予防的」又は「治療的」目的のためのものであり得る。予防的に提供される場合、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染の症状又は臨床兆候が現れる前に提供される。前記組成物の予防的投与は、その後の何れかの感染を予防又は軽減するために役立つ。予防的に提供される場合、本発明の遺伝子治療組成物は、疾患の何れかの症状又は臨床兆候が現れる前に提供される。前記組成物の予防的投与は、前記疾患に関連する1つ以上の症状又は臨床兆候を予防又は軽減するために働く。
本発明の組成物は、受動免疫又は能動免疫の何れかによって、1つ以上の病原体、例えば1つ以上のインフルエンザウイルス系統に耐性を付与することが出来る。能動免疫において、弱毒化生存ワクチン組成物は、ホスト(例えば、哺乳動物)に予防的に投与され、投与に対する前記ホストの免疫応答は、感染及び/又は疾患に対して保護される。受動免疫のために、誘発された抗血清を回収し、少なくとも1つのインフルエンザウイルス系統によって引き起こされる感染を有することが疑われるレシピエントに投与することが出来る。本発明の遺伝子治療組成物は、能動免疫によって所望の遺伝子産物の予防又は治療レベルをもたらすことが出来る。
一実施形態において、前記組換え又はリアソータントB型インフルエンザウイルスは、
例えば、これに限定されないが、34位にT以外の残基、129位にK以外の残基、168位にN以外の残基、196位にT以外の残基、又はそれら何れかの組合せの残基を含むHAにおける残基; 限定されないが、169位にN以外の残基、及び/又は434位にG以外の残基を含むNAにおける残基; 限定されないが、28位にアラニン(A)以外の残基、40位にP以外の残基、51位にP以外の残基、52位にE以外の残基、57位にS以外の残基、204位にM以外の残基、1795ヌクレオチド位にg以外のヌクレオチド、又はそれらの組合せを含むNPにおける残基; 限定されないが、34位にG以外の残基、54位にアスパラギン酸(D)以外の残基、77位にR以外の残基、86位にM以外の残基を含むM1における残基; 限定されないが、58位にH以外の残基、及び/又は80位にR以外の残基を含むBM2における残基; 限定されないが、117位にM以外の残基、176位にK以外の残基、及び/又は252位にS以外の残基、39位にa以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組み合わせ等のMDCK細胞における複製を増強するアミノ酸を有する。一実施形態において、前記組換えB型インフルエンザウイルスは、例えば、HA1において、34位に残基I、129位に残基E、168位にE、D、196位にP、イソロイシン(I)、A又はN、又はそれら何れかの組合せ; NAにおいて、169位に残基T及び/又は434位に残基E; NPにおいて、28位に残基T、40位に残基S、51位に残基Q、52位に残基K、57位に残基G、214位に残基T、1795ヌクレオチド位でg、又はそれら何れかの組合せ; M1において、34位に残基バリン(V)又はN、54位に残基G、77位に残基K、86位に残基T、97位に残基N、又はそれら何れかの組合せ; BM2において、58位に残基R及び/又は80位に残基Gを含み; NS1において、117位に残基チロシン(Y)、176位に残基グルタミン(Q)、252位に残基T、39ヌクレオチド位にg、38ヌクレオチド位の後にg付加、又はそれら何れかの組合せ等のMDCK細胞における増強された複製をもたらすアミノ酸を有する。
ワクチンの収率は、経済的な観点から重要である。さらに重要なことは、タイトなスケジュールで大多数のワクチンを産生するための能力は、ウイルスが流行している間に多くの命を救う可能性がある。細胞培養及び/又は孵化鶏卵におけるウイルスの複製能力を増加させる突然変異は、インフルエンザウイルスを増幅し、強力なインフルエンザワクチンプラットフォームを確立するために有用である。現在、ほとんどのインフルエンザワクチンは、孵化鶏卵で作成される。MDCK細胞において作成されたインフルエンザワクチンは、現在、米国及び欧州でヒトへの使用が承認されており、Vero細胞由来のインフルエンザワクチンは、欧州において、ヒトへの使用が承認されている。
細胞
MDCK細胞を、5%(vol/vol)のウシ新生仔血清を含むMEM中で増殖させた。Vero細胞を、10%(vol/vol)のFBSを含むMEM中で維持した。293Tヒト胎児腎臓細胞を、10%(vol/vol)FBSを補充したDMEMで増殖させた。
B/ヤマガタ/1/73ウイルスの8つのウイルスRNAの配列を用いて、PCRによって増幅され且つ、連結されたgBlocks遺伝子断片(Integrated DNA Technologies)を設計した; 得られたウイルスcDNAをRNAポリメラーゼIベクターpHH21に挿入した(Neumann et al., 1999)。B/ヨコハマ/UT-K31/2012、B/ヨコハマ/UT-K1A/2011、B/ヨコハマ/P-2922/2005, B/トウキョウ/UTE2/2008、B/トチギ/UT-T1/2011、B/マサチューセッツ/2/2012、及びB/ブリスベン/60/2008ウイルスのvRNAを、RNeasy Kit(Qiagen)を用いてウイルスストックから抽出した。ウイルスHA及びNA遺伝子を、One-Step RT-PCR Kit (Invitrogen)を用いて遺伝子特異的オリゴヌクレオチドで増幅し、PCR産物をpHH21ベクターにクローニングした。B/ヤマガタ/16/1988のHA及びNA遺伝子を、結合したgBlockes遺伝子断片のPCR増幅によって合成し、続いてpHH21へのクローニングによって合成した。B/ヨコハマ/UT-K31/2012、B/ヨコハマ/UT-K1A/2011、B/マサチューセッツ/2/2012及びB/ブリスベン/60/2008ウイルスのA/B型キメラHA及びNA遺伝子を、オーバーラッピングPCRによって作成した。
GeneMorph II Random Mutagenesis Kitを用いたエラープローンPCRにより、B/ヤマガタ/1/73ウイルスの6つの内部遺伝子の各々に1〜4のランダム突然変異を導入した。ランダムに突然変異導入されたPCR産物を、前記pHH21ベクターに挿入し、得られたプラスミドライブラリーの多様性を、各ウイルス遺伝子について少なくとも24個の大腸菌コロニーの配列分析により確認した。
前記内部遺伝子にランダム突然変異を有する野生型ウイルス及びウイルスライブラリーを、逆遺伝学的アプローチを活用して作成した(Neumann et al., 1999)。野生型構築物の代わりに突然変異プラスミドライブラリーを用いて293T細胞に遺伝子導入することによってウイルスライブラリーを作成した。48時間後、プラスミドを遺伝子導入した293T細胞からの上清を回収し、MDCK細胞で増幅してウイルスストックを作成した; 前記ウイルスストックの力価を、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて決定した。
野生型又は組換えウイルスを、感染多重度(MOI).0001でMDCK細胞に三重に接種した。感染後、細胞を0.6μg/mLのTPCK-トリプシンを含むMEM/BSA培地と共にインキュベートした。指定の時点で上清を回収し、ウイルス力価をMDCK細胞におけるプラークアッセイによって評価した。
MDCK細胞を4-Layers Easy-Fill Cell Factories (Thermo Scientific)で増幅させ、細胞が約95%の集密度に達したときにMOI 0.001で野生型又は高収率のB型インフルエンザウイルスに感染させた。細胞培養上清を48時間後に回収し、遠心分離により清澄化した(Beckman SX4750 rotorにて3,500 rpm、15分間、4°C)。ウイルスを、超遠心分離(Beckman Type19 rotorにて18,500rpm、90分間、4℃)によってペレット化し、5mLのPBSに再懸濁し、Beckman SW32 rotorにて90分間、4℃、25,000rpmで遠心分離した20〜50%(wt/vol)連続スクロース勾配にロードした。ウイルス含有バンドを回収し、PBSで希釈し、遠心分離(25,000 rpm、90分間、4°C、Beckman SW32 rotor)によって再びペレット化した。前記ウイルスペレットを400μLのPBSに再懸濁し、等分し、-80℃で保存した。
ウイルス濃縮物の全タンパク質収率を、Pierce BCA protein assay kit (Thermo Scientific)を製造元の指示に従って使用して決定した。
糖部分を除去するために、10μLのウイルス濃縮物を変性させた。次いで、前記サンプルを、2μLの1/10希釈PNGase F酵素液(製造者により提供された緩衝液中)(New England Biolabs)と共に最終濃度1%のNonidet P-40と共に37℃で20時間インキュベートした。
2μLのウイルス濃縮物をPBSと混合して総量10μLとし、2%(vol/vol)のβ-メルカプトエタノール(還元剤として)を含む2.5μLのローディング色素を加え、95℃、5分間加熱した。次いで、サンプルを、NuPage 4〜12%(wt/vol)Bris-Trisプレキャストゲル(Life technology)にロードし、これを1×Mes緩衝液(Bio-Rad)を用いて150Vで120分間ランし、次いでSYPRO-Ruby(Sigma)で染色した。タンパク質量の定量は、ImageJソフトウェア(NIH)を用いて行った。HA含量は、HA1、HA2、NP、及びM1の量の合計でHA量(HA1及びHA2の量を合計することによって計算される)を除算し、この値に全ウイルスタンパク質量を掛けることによって計算した。
6週齢の雌BALB/cマウス(Jackson Laboratory)をイソフルランで麻酔し、106pfuのB型インフルエンザウイルスを50μLの容量で鼻腔内接種した。1群あたり5匹のマウスに感染させた; このサンプルサイズは、群間の大きな影響を検出するのに適している。マウスは無作為化され、試験者は盲検化されなかった。体重変化及び生存を毎日、14日の間モニターした。マウスにおけるウイルス複製を評価するために、1ウイルス当たり10匹のマウスに106pfuで感染させた; 感染後3日目及び6日目に、各群の5匹のマウスを殺し、MDCK細胞におけるプラークアッセイを用いて肺のウイルス力価を測定した。
高収率ワクチンバックボーンの遺伝的安定性を評価するために、B/ヨコハマ/UT-K31/2012及びB/ヨコハマ/UT-K1A/2011のHA及びNA vRNAと組み合わせられたHY(Yam)及びHY(Vic)を保有するウイルスそれぞれを、MOI 0.01でMDCK細胞において10回継代培養した。各継代培養後に回収されたウイルスは、サンガー配列決定によって配列決定された。
ミニレプリコンアッセイについて、293T細胞及びMDCK細胞に、0.05μgのpPolI-B/ヤマガタ/1/73-NS-Luc(ヒトRNAポリメラーゼIプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードする)又はpPolIC250-B/ヤマガタ/1/73-NS-Luc(イヌRNAポリメラーゼIプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードする)のそれぞれと共に、B/ヤマガタ/1/73 PB2、PB1、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミドを、それぞれ0.25μg遺伝子導入した。細胞を0.025μgのpGL4.74(hRluc / TK)(トランスフェクション効率をモニターするための内部コントロール; Promega)で同時に遺伝子導入した。前記遺伝子導入した細胞を、35℃、48時間インキュベートし、溶解させ、デュアルルシフェラーゼシステム検出Kit (Promega)を製造業者のプロトコールを用いてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ホタルルシフェラーゼ発現レベルをウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。示されたデータは、3つの独立した実験の±SDの平均値である。
VLP出芽アッセイのために、293T細胞に、野生型又は突然変異B/ヤマガタ/1/73 M1、HA、NA、NP、BM2、及びNS2の各タンパク質発現プラスミド2μgを遺伝子導入した。遺伝子導入の48時間後に、培養上清を回収し、清澄化し、20%(wt/vol)スクロースクッションにロードし、Beckman SW 60 Ti rotorで60,000rpmで2時間超遠心分離した; ペレット化したVLPを、PBS中、4℃で一晩再懸濁した。並行して、遺伝子導入した細胞をRIPA緩衝液で溶解した。
野生型及び突然変異NS1タンパク質のIFN-アンタゴニスト活性を評価するために、293T細胞に、NS1タンパク質発現プラスミド及びIFN-βプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするレポータープラスミドpGL-IFN-β(Bale et al., 2012)を遺伝子導入した。遺伝子導入の24時間後、細胞にセンダイウイルスをMOI 5で1時間感染させた。細胞を24時間インキュベートし、Glo溶解緩衝液(Promega)で溶解した; 次いで、Steady-Gloアッセイ緩衝液(Promega)を添加し、ルシフェラーゼ発現を測定した。他のセットの実験において、293T細胞に、野生型又は突然変異NS1タンパク質発現プラスミド及びIFN調節プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするレポータープラスミドpISRE-Luc(Promega)を遺伝子導入した。24時間後、細胞を104U/mLのヒトIFN-βでさらに24時間処理し、続いて溶解及びルシフェラーゼ発現レベルの測定を行った。
データの統計分析を、Rソフトウェア(www.r-project.org)、v3.1を使用して実施した。複数の群を、いくつかの時点で独立して収集した測定値と比較するために、2元配置分散分析、続いてテューキーポストホックテストを用いた。1つの時点で収集された複数の群からの測定値を比較するために、1元配置分散分析、続いてテューキー又はダネットのポストホックテストを用いた。複数の群を依存測定と比較するために(例えば、アリコートを異なる時間点で同じ培養物から収集した細胞培養におけるウイルス増殖曲線)、RパッケージNLMEを使用してデータに対する線形混合効果モデル; 時間、ウイルス系統、及びこれら2つの要因間の相互作用を考慮した。RパッケージPHIAを使用して、同じ時点で対の様式で系統を比較するための対比マトリックスを構築した(例えば、感染後24時間で群_1 vs. 群_2、感染後24時間で群_1 vs. 群_3、感染後24時間で群_2 vs. 群_3)。個々に比較を行った; 従って、最終的なP値を、Holmの方法を用いて複数の比較を説明することによって調整した。
マウスにおける実験は、「動物実験の適切な実施に関する基本的なガイドライン」および動物福祉法における関連活動および関連する動物福祉規則および公衆衛生サービス政策に規定されているように、ウィスコンシン大学マディソン校の動物管理及び使用プロトコールに従って行われた。すべての実験は、動物の法的及び倫理的な責任の両方を認識し且つ、承認するウィスコンシン大学マディソン校の動物管理及び使用委員会によって承認される(プロトコール番号V00806)。
MDCK細胞における高収率変異体のウイルスライブラリースクリーン
高収率のA型インフルエンザウイルスPR8ワクチンバックボーンを開発する戦略と類似する、突然変異誘発及びスクリーニングアプローチを使用して、B型インフルエンザウイルスの高収率に関連する突然変異を同定した。前記6つの内部vRNA断片は、B/ヤマガタ/1/73由来であり、これはMDCK細胞で効率的に増殖し、ビクトリア及びヤマガタリネージが分離する前に単離された。エラープローンPCRに基づく突然変異誘発法を用いて、前記ウイルスタンパク質に1〜4個のランダムなアミノ酸変化を保有するcDNAライブラリーを作製した(図2)。次いで、これらのcDNAライブラリーを用いてウイルスライブラリーを作製した。内部のvRNA(すなわち、PB2、PB1、PA、NP、M及びNS)の各々を表す6つの別個のライブラリーが作成された(図2);ポリメラーゼvRNAの組合せのための3つのライブラリー(PB2+PB1、PB2+PA、PB2+PB1+PA); PB2、PB1、PA、及びNPタンパク質がウイルス複製複合体を形成するので、ポリメラーゼ及び核タンパク質(NP)vRNAのための1つのライブラリー(すなわち、PB2+PB1+PA+NP); A型インフルエンザウイルスのPB2及びNS1タンパク質(NS vRNAによってコードされる)が、ホスト毒性の重要な決定因子(Wright et al., 2013)であるので、PB2及びNS vRNA(PB2+NS)のための1つのライブラリー; 及びA型インフルエンザウイルスのM1タンパク質(M vRNAによってコードされる)が高い増殖特性に関連するので、M及びNS vRNAのための1つのライブラリー。これらの12種類のウイルスライブラリーのそれぞれは、ビクトリア(B/ヨコハマ/UT-K1A/2011)又はヤマガタ(B/ヨコハマ/UTK31/2012)リネージの代表的なウイルスのHA及びNA vRNAを用いて作成され、合計24のウイルスライブラリーが得られた。ビクトリア-リネージ又はヤマガタ-リネージのHA及びNA vRNAを用いて作製されたライブラリーは、それぞれ、「ビクトリア-リネージ」又は「ヤマガタ-リネージ」ライブラリーと称される。
次に、逆遺伝学アプローチを使用して、上位8つの高収率のヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージ候補において見出される突然変異の様々な組み合わせを保有するウイルスを作成した(表3及び4)。例えば、高収率候補♯21(MDCK細胞において最も高い力価で複製された)(図3)において見出されたNP-E52K及びM1-R77K突然変異は、高収率候補♯23及び♯26に見出されたNS1-M117Y/S252T突然変異と組み合わせられた(図3)。ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのライブラリーの内部vRNAは、同じウイルスに由来するため、高収率ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージの候補に見出される突然変異も組み合わせられた(表3及び4)。得られたウイルスを、それらのMDCK細胞において赤血球凝集力価及びウイルス力価についてテストした(図4)。高収率候補のヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージは全て、MDCK細胞においてより効率的に複製され、1つ以上の時点で野生型ウイルスより高い赤血球凝集力価を有し、及びこれらの差のほとんどは、統計的に有意であった(図4)。
理想的なワクチンウイルスバックボーンは、ヒトインフルエンザワクチンの商業生産に現在使用されている3つの増殖系、すなわちMDCK細胞、Vero細胞、及び孵化鶏卵において高い収率を与えるはずである。MDCK細胞における高収率B型インフルエンザウイルスワクチンバックボーンの開発と並行して、24の全てのウイルスライブラリー(図2)を、Vero細胞に継代培養した。B型インフルエンザウイルスライブラリーの力価が、Vero細胞において低かったため、最初に前記ライブラリーを、MDCK細胞及びVero細胞の共培養で5回継代培養し、続いて、Vero細胞で5回、継代培養した。並行して、共培養したMDCK及びVero細胞で2回継代培養した後、ウイルスライブラリーを組合せ、共培養細胞にてさらに3回継代培養し、次いでVero細胞で5回継代培養した。合計382の個々のウイルスプラークを前記種々のウイルスライブラリーから無作為に採取し、Vero細胞で増幅した。赤血球凝集アッセイの結果に基づいて、ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのから上位6つの候補を選び、それらの完全なゲノム配列を決定した(表5及び6)。
次に、前記Vero細胞での継代培養後に見出されたPA-a2272t突然変異が、RG(Yam)♯8及び/又はRG(Vic)♯2の増殖特性を増強するか否かをテストした。得られたウイルス(HY(Yam)及びHY(Vic)それぞれ)は、RG(Yam)♯8及びRG(Vic)♯2と比較して、より高い赤血球凝集及びウイルス力価を示し、及び親ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージウイルスと比較された; これらの差のいくつかは小さかった(統計的に有意であった)。故に、HY(Yam) (NP-P40S、M1-R77K、NS1-K176Q、NS-a39g、PA-a2272tをコードする)及びHY(Vic) (NP-P40S/M204T、M1-M86T、NS-(38+1)g、PA-a2272tをコードする)を、高収率候補として選択した。
B/ヤマガタ/UT-K31/2012及びB/ヨコハマ/UT-K1A/2011それぞれのHA及びNA遺伝子を用いてHY(Yam)及びHY(Vic)を開発した。高収率ワクチンウイルスバックボーンHY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンウイルスは、一般的な増殖増強効果を有するため、WHOが推奨するワクチンを含む数十年に渡って単離された6つのB型インフルエンザウイルスのHA及びNA遺伝子を有するHY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンウイルスバックボーンをテストした(図7)。テストされた1つ以上の時点で、HY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンウイルスバックボーンは、親ウイルスと比較してより高いウイルス又は赤血球凝集力価を与えたが、全ての相違が統計的に有意ではなかった。テストしたウイルスに関し、HY(Vic)は、HY(Yam)よりも大きな増殖増強効果を示した。
次に、HY(Yam)及びHY(Vic)バックボーンが、他のB型インフルエンザウイルスリネージ由来のHA及びNA遺伝子を保有するウイルスの効率的な複製をサポートするか否かをテストした(図8)。ビクトリア-リネージのHA及びNA遺伝子をコードするHY(Yam)ウイルス、及びヤマガタ-リネージのHA及びNA遺伝子をコードするHY(Vic)ウイルスについて、高いウイルス力価及び赤血球凝集力価が検出された。全体的に、HY(Yam)ワクチンバックボーンは、いくつかの時点で、HY(Vic)ワクチンバックボーンより、わずかに高いウイルス力価又は赤血球凝集力価をもたらしたが、これらの差のほとんどは統計的に有意ではなかった。これらのデータは、HY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンバックボーンが両方のリネージのウイルスへ効率的な複製をもたらすことを示している。
B型インフルエンザウイルスのHA及びNA遺伝子を保有するキメラA型インフルエンザウイルスが以前に作成されている(Horimoto et al., 2004 and Flandorfer et al., 2003)。A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスの使用は、前記ワクチン製造プロセスを簡易化し得る。A型インフルエンザウイルス及びB型インフルエンザウイルスの間のリアソータントは、インフルエンザvRNAセグメントの5 '及び3'末端領域に位置する型特異的ウイルスパッケージングシグナルのために、おそらく自然発生しない(Fujii et al., 2003; Baker et al., 2014)。従って、A型インフルエンザPR8ウイルスHA及びNAタンパク質の細胞外ドメインをB型インフルエンザウイルスの対応する部分で置換したvRNAセグメントを作成した(図5)。次いで、以下の3つのウイルスの赤血球凝集及びウイルス力価を比較した: 野生型ヤマガタ-リネージB型インフルエンザウイルス; ヤマガタ-リネージウイルスのHA及びNA遺伝子を有するHY(Yam); 及びヤマガタ-リネージウイルスのA型/B型キメラHA遺伝子及びNA遺伝子を有する高収率PR8ウイルス(図9A〜B)。ビクトリア-リネージのウイルスについても同様の実験を行った(図9C〜D)。テストしたほとんどの時点で、高収率のA型インフルエンザワクチン又はB型インフルエンザワクチンウイルスバックボーンは、野生型ウイルスと比較して赤血球凝集力価及びウイルス力価を有意に増加させた。A型インフルエンザワクチン及びB型インフルエンザワクチンバックボーンの比較は、B型インフルエンザワクチンバックボーンにてより高いウイルス力価を示したが、興味深いことに、A型インフルエンザワクチンバックボーンにてより高い赤血球凝集力価を示した。加えて、両方のリネージを代表する2つのB型インフルエンザワクチンについて、A型インフルエンザワクチンバックボーンは、孵化鶏卵における赤血球凝集力価及びウイルス力価に関してB型インフルエンザワクチンバックボーンよりも優れていた(図4E〜F)。B/ヨコハマ/UT-K1A/2011、B/ヨコハマ/P-2922/2005、B/トウキョウ/UTE2/2008、又はB/トチギ/UT-T1/2014由来のHA及びNAを含む他のB型インフルエンザウイルスは、バックボーン(野生型又は高収率)にも関わらず、孵化鶏卵において良く増殖せず、これらヒトウイルスのHA及びNA遺伝子が、孵化鶏卵における効率的な増殖を制限し得ることを示唆している。
不活性化インフルエンザワクチンの大半の調製物は、H1 HA、H3 HA、及びB型HAタンパク質の各々15μgを含む。従って、ワクチンの最適化のために、全ウイルスタンパク質収率及びHA含量が重要なパラメータであり、MDCK細胞におけるそれぞれの野生型ウイルスと異なるHY(Yam)及びHY(Vic)ウイルスの全タンパク質収率及びHA含量を比較することを促した。細胞培養上清を、感染細胞から収集し、ウイルスを濃縮し、スクロース勾配遠心分離を用いて精製した。次いで、全ウイルスタンパク質収率を、Pierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific)を用いて決定した。並行して、精製されたウイルスサンプルをPNGase Fで処理し、得られたHA脱グリコシル化をもたらし、HA2(そのグリコシル化形態では、M1とサイズが類似している)を、より容易に検出することが出来る。SDS / PAGE(図10A〜B)を用いてサンプルを分離し、HA1、HA2、NP及びM1の量をデンシトメトリー分析に基づいて決定した。HA含量は、HA量(HA1及びHA2の量を合計して計算した)をHA1、HA2、NP及びM1の量の合計で割って、この値にゲル電気泳動によって分析されたサンプル中の全ウイルスタンパク質量の値を掛けたものである(図10A〜B)。テストした全てのウイルスについて、全ウイルスタンパク質収率及びHA含量は、HA及びNA vRNAが由来する野生型ウイルスと比較して、HY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンのバックボーンで有意に高かった。
実験的アプローチは、増加された複製能力を有する突然変異を選択するために設計され、これは、哺乳動物においてそれらの毒性を増加し得る。この疑問に対処するために、1つの群あたり5匹のマウスを、野生型ヤマガタ-リネージウイルス、野生型B/ヤマガタ/1/73ウイルス(前記ウイルスライブラリーを作成するために用いられた)の残りの6つの遺伝子の組合せにおいてヤマガタ-リネージウイルスのHA及びNA vRNAを保有するウイルス、及びHY(Yam)ワクチンウイルスバックボーンを有する組合せのヤマガタリネージウイルスのHA及びNA vRNAを保有するウイルスを106pfuで感染させた(図11A-B)。並行して、10匹のマウスの群に106pfuの上述のウイルスを感染させ、肺ウイルス力価を評価するために感染後3日目及び6日目にそれぞれ5匹の動物を殺した(図11C)。同様に、ビクトリア-リネージウイルス及びHY(Vic)ワクチンバックボーンを用いて実験を実施した(図11D〜F)。野生型B/ヤマガタ/1/73ウイルスバックボーンは、B/マサチューセッツ/2/2012及びB/ブリスベン/60/2008バックボーンそれぞれよりも高い病原性を示した。しかしながら、HY(Yam)及びHY(Vic)の収率増強突然変異は、マウスにおける毒性をさらに増加させなかった; 実際には、B/ヤマガタ/1/73バックボーンと比較してわずかに減少効果を示した。
ワクチンウイルスは、それら所望の特性が維持されるように遺伝的に安定でなければならない。高収率候補の遺伝的安定性をテストするために、HY(Yam)ウイルスの10連続継代培養を、MDCK細胞において、B/ヨコハマ/UTK31/2012のHA及びNA vRNA、及びB/ヨコハマ/UT-K1A/2011のHA及びNA vRNAを有するHY(Vic)ウイルスを用いて実施した。各継代培養後、前記ウイルスのゲノム配列をサンガー配列決定によって決定した。ヤマガタ-リネージウイルスに関して、突然変異は、検出されなかった。ビクトリア-リネージウイルスに関して、HY(Vic)の高収率特性を規定する内部遺伝子における突然変異は検出されなかった。しかしながら、5回の継代培養の後にHA1-196T及び-196Iをコードする混合個体分が検出され; 10回の継代培養後に、HA1-196I突然変異体のみが検出された。
HY(Yam)及びHY(Vic)ワクチンバックボーンは、いくつかのvRNAに突然変異を有する。HY(Yam)及びHY(Vic)表現型に対するこれら突然変異の寄与をよりよく理解するために、逆遺伝学を用いて、HY(Yam)又はHY(Vic)の個々の突然変異体vRNAセグメントを保有するウイルスを作成した: 例えば、野生型B/ヤマガタ/1/73(ウイルスライブラリーを生み出すために使用された)、野生型B/ヤマガタ/1/73(HY(Yam)において見出されたNP-P40Sをまたコードする)、又はHY(Yam)の6つの残りのvRNAとヤマガタ-リネージウイルスのHA及びNA vRNAが組み合わされてウイルスが生み出された(図12)。得られたウイルスを、MDCK細胞におけるそれらの複製能力及び赤血球凝集力価についてテストした(図12)。個別にテストした場合、NP-P40S、M1-R77K及びNS-a39g+NS1-K176Q突然変異は、リファレンスウイルスと比較して、1つ以上の時点でヤマガタ-リネージウイルスのウイルス力価及び赤血球凝集力価を有意に増加させた。ビクトリア-リネージのウイルスについて、テストした突然変異の各々は、1つ以上の時点で統計的に有意な増殖増強効果を有した。HY(Yam)又はHY(Vic)に見出される個々の突然変異を有するウイルスの大部分は、高収率ワクチン候補と同じくらいの効率では複製せず、いくつかの突然変異の組合せが、HY(Yam)及びHY(Vic)の高収率特性にとって重要であることを示している。
NP-P40S突然変異は、ヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージライブラリーそれぞれの由来のNP-M204Tと組み合わせて個別に選択した。加えて、これらの突然変異は、他の増殖増強突然変異なしでテストした場合、ウイルス力価及び赤血球凝集力価を増加させた(図12)。これらの突然変異がウイルス複製複合体の活性に影響するか否かを評価するために、293T及びMDCK細胞に、B/ヤマガタ/1/73ウイルスの3つのポリメラーゼサブユニット、野生型又は突然変異B/ヤマガタ/1/73 NP、及び前記ルシフェラーゼレポータータンパク質を発現するB型インフルエンザウイルス様RNAを発現するプラスミドを遺伝子導入した(NP-M204T突然変異は、NP-P40Sと組み合わせてのみウイルスライブラリーから選択されたため、別々にテストしなかった)。興味深いことに、NP-P40S及び-P40S/M204T突然変異は、ウイルス複製複合体の複製活性を有意に減少させた(図13A〜B)。
個々にテストした場合、HY(Yam)及びHY(Vic)におけるM1-R77K及びM1-M86T突然変異は、ウイルス力価及び赤血球凝集力価に影響を与えた(図12)。M1はビリオンの主要な構成成分であり、このタンパク質の突然変異は、ビリオンの組成に影響を及ぼす可能性がある。293T細胞に、B/ヤマガタ/1/73 HA、NA、NP、BM2、NS2、及び野生型又は突然変異M1タンパク質の発現のためのプラスミドを遺伝子導入した; ウイルスタンパク質のこのセットの発現は、効率的なウイルス様粒子(VLP)の形成及び放出をもたらす(Gomez-Puertas et al., 1999)。細胞培養上清を回収し、ウイルスタンパク質のVLP取り込み効率を評価した(図14)。M1における両方の突然変異は、培養上清中のウイルスHA、NP、及びM1タンパク質の量を有意に増加させ、これは、恐らくM1-R77K及び-86T突然変異によって付与されたウイルス力価及び赤血球凝集力価を増加させた。
前記NS1タンパク質は、主要インフルエンザウイルスIFNアンタゴニストである(Yuan et al., 2001; Dauber et al., 2004)。NS1のIFN-β合成を妨害する能力に対するHY(Yam)NS1-K176Q突然変異の効果を評価するために、293T細胞に、野生型又は突然変異NS1タンパク質発現プラスミド及び前記IFN-βプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするレポータープラスミドpGL-IFN-β(Bale et al., 2012)を遺伝子導入した。次に、細胞にセンダイウイルスを感染させてIFN-β合成を刺激し、レポーター遺伝子発現を増加させた。野生型及び突然変異体NS1は、IFN-βをダウンレギュレートする能力が同等であった(図12A)。IFN-β刺激遺伝子の発現を妨げる野生型及び突然変異体NS1の能力を決定するために、293T細胞に、野生型及び突然変異体NS1タンパク質発現プラスミド及びIFN調節プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードする、前記レポータープラスミドpISRE-Luc (Promega)を遺伝子導入した。細胞を、IFN-βで24時間後に刺激し、再び24時間インキュベートし、次いでルシフェラーゼ発現についてアッセイした。NS1-K176Qタンパク質は、IFN調節プロモーターからの遺伝子合成を抑制することが野生型NS1よりもわずかに低い(図12B)。これは、他の機構がその増殖増強効果を説明することを示唆している。
現在まで、高収率のB型インフルエンザワクチンバックボーンを開発するための体系的な取り組みは実施されていない。Vodeiko et al. (Vodeiko et al., 2003)は、孵化鶏卵における複製能力が異なる2つのB型インフルエンザウイルスを比較した。リアソータント実験により、表現型の相違に寄与するいくつかのvRNAが明らかにされた(Vodeiko et al., 2003); しかしながら、増殖特性を決定する特定のアミノ酸は同定されなかった。Kim et al. (Kim et al., 2015)は、B型インフルエンザウイルスの低温適応がそれらの増殖特性を増強することを見出した。HA、NA、及びNPにおけるいくつかのアミノ酸変化(ここで報告された変異ではない)は、ウイルス力価の増加に関与していた(Kim et al., 2015)。Le et al. (2015)は、2002〜2007年に単離されたB/リー/40とヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのB型インフルエンザウイルスの間のリアソータントテストした; 14の高収率候補の全てが、B/リー/40ウイルスのNP vRNAを保有しており、これは、このvRNAが効率的な複製能力を付与することを示唆している。Ping et al. (2015)は、高収率A型インフルエンザウイルスバックボーンを開発するためのより包括的な戦略を発表した。これはB型インフルエンザウイルスに適用される:内部遺伝子にランダム突然変異を保有するウイルスライブラリーから、MDCK及びVero細胞におけるB型インフルエンザウイルス複製が向上した候補が選択された。突然変異の組み合わせにより、MDCK及びVero細胞、並びに孵化鶏卵においても高収率のヤマガタ-リネージ及びビクトリア-リネージのワクチン候補(ヤマガタ-リネージワクチンのNP-P40S、M1-R77K、NS1-K176Q、NS-a39g、及びPA-a2272tをコードする突然変異、並びにビクトリア-リネージワクチンのNP-P40S/M204T、M1-M86T、NS-(38+1)g、及びPA-a2272tをコードする突然変異)が得られた。リネージ特異的ワクチンバックボーンが、両方の系統のウイルスに使用される単一のバックボーンよりも利点を提供するか否かを決定するために、(セミ)産業設定におけるさらなる研究が必要となる。
Claims (20)
- PA、PB1、PB2、NP、NS及びMウイルスセグメント、異種又はキメラインフルエンザウイルスNAウイルスセグメント、及び異種又はキメラインフルエンザウイルスHAウイルスセグメントを有する単離された組換えB型インフルエンザウイルスであって、ここで、前記NSウイルスセグメントが、42位にY以外の残基、117位にM以外の残基、176位にK以外の残基、及び/又は252位にS以外の残基をコードし、及び/又は39ヌクレオチド位にa以外のヌクレオチド又は38位の後にヌクレオチド挿入、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記Mウイルスセグメントが、34位にG以外の残基、54位にD以外の残基、77位にR以外の残基、86位にM以外の残基、又は97位にI以外の残基、又はそれら何れかの組合せを有するM1ポリペプチドをコードし; 又は前記Mウイルスセグメントが、58位にH以外の残基、80位にR以外の残基、27位にH以外の残基、又は26位にG以外の残基、又はそれら何れかの組合せを有するBM2ポリペプチドをコードし; 前記NPウイルスセグメントが、28位にA以外の残基、40位にP以外の残基、51位にP以外の残基、52位にE以外の残基、57位にS以外の残基、204位にM以外の残基、及び/又は343位にP以外の残基を有するNPポリペプチドをコードし、及び/又は1795ヌクレオチド位にg以外のヌクレオチドを有し又は500ヌクレオチド位にc以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記PAウイルスセグメントが、387位にY以外の残基、434位にV以外の残基、494位にD以外の残基、及び/又は524位にT以外の残基を有し、及び/又は2272ヌクレオチド位にa以外のヌクレオチドを有し、1406位にa以外のヌクレオチドを有し、1445位にc以外のヌクレオチドを有し、又は2213位にg以外のヌクレオチドを有し、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記PB2ウイルスセグメントが、16位にN以外の残基を有するPB2ポリペプチドをコードし; 又はそれら何れかの組合せ、である単離された組換えB型インフルエンザウイルス。
- 前記NPポリペプチドが、以下: 28位にT、40位にS、51位にQ、52位にK、57位にG、204位にT、343位にT、1795位にa又は前記NPウイルスセグメントが500位にtを有する、の少なくとも1つを有する、請求項1に記載の単離されたウイルス。
- 前記M1ポリペプチドが、以下: 34位にV又はN、54位にG、77位にK、86位にT、又は97位にN、の少なくとも1つを有する、請求項1又は2に記載の単離されたウイルス。
- 前記BM2ポリペプチドが、以下: 58位にR、80位にG、27位にR又は26位にR、の少なくとも1つを有する、請求項1、2又は3に記載の単離されたウイルス。
- 前記NS1ポリペプチドが、以下: 42位にN、117位にY、176位にQ、252位にTの少なくとも1つを有し、又は前記NSセグメントが、38ヌクレオチド位の後にgの挿入又は39ヌクレオチド位にgを有する、請求項1〜4の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
- 前記PAウイルスセグメントが、以下: 387位にH、434位にA、494位にN、524位にA、1406位にg、2272位にt、1445位にt、の少なくとも1つ、又はそれら何れかの組合せ、を有する、請求項1〜5の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
- 前記NPポリペプチドが、40位にSを有し且つ、前記NP vRNAが500ヌクレオチド位にtを有し、前記M1ポリペプチドが、77位にKを有し、前記NS1ポリペプチドが、176位にQを有し且つ、前記NS vRNAが39ヌクレオチド位にgを有し、並びに前記PA vRNAが1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にt、及び2272ヌクレオチド位にtを有する、請求項1〜6の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
- 前記NPポリペプチドが、40位にS及び204位にTを有し且つ、前記NP vRNAが、500ヌクレオチド位にtを有し、前記M1ポリペプチドが、86位にTを有し、前記NS vRNAが、38ヌクレオチド位の後にgの挿入を有し、並びに前記PA vRNAが、1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にt、及び2272ヌクレオチド位にtを有する、請求項1〜7の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
- 前記NA遺伝子セグメント及び前記HA遺伝子セグメントが、同一インフルエンザウイルス単離株由来である、請求項1〜8の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
- 前記PA、PB1、PB2、NP、NS、及びMウイルスセグメントが、以下: 配列番号2によってコードされるアミノ酸配列を有するPB1又は配列番号2によってコードされるPB1に対して少なくとも80%の配列同一性を有するPB1; 配列番号3よってコードされるアミノ酸配列を有するPB2又は配列番号3によってコードされる前記PB2に対して少なくとも80%の配列同一性を有するPB2; 配列番号1によってコードされるアミノ酸配列を有するPA又は配列番号1によってコードされるPAに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するPA; 配列番号4によってコードされるアミノ酸配列を有するNP又は配列番号4によってコードされるNPに対して少なくとも80%の配列同一性を有するNP; 配列番号5によってコードされるアミノ酸配列を有するM又は配列番号5によってコードされるMに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するM; 又は配列番号6によってコードされるアミノ酸を有するNS又は配列番号6によってコードされるNSに対して少なくとも95%の配列同一性を有する; の少なくとも1つをコードする配列を含む、請求項1〜9の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
- 異種(heterologous)HA遺伝子セグメント又は異種NA遺伝子セグメントを有する、請求項1〜10の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
- 前記M1ポリペプチドが、34位にV、97位にN、又は86位にT、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記BM2ポリペプチドが、58位にR及び/又は80位にGを有し; 又は前記NPポリペプチドが、40位にS又は52位にKを有する、請求項1〜11の何れか1項に記載の単離されたウイルス。
- 請求項1〜12の何れか1項に記載された組換えウイルスを有するワクチン。
- インフルエンザウイルスの調製方法であって、細胞を:
転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB1 DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPB2 DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスHA DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNP DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNA DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスM DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、及び転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスNS DNAに動作可能に連結されたプロモーターを含むvRNA又はcRNA産生のためのベクター、
ここで、vRNA又はcRNA産生のためのベクターにおける前記PB1、PB2、PA、NP、NS、及びM DNAが、1つ以上のインフルエンザワクチンウイルス単離株に由来し、ここで、NAのvRNA又はcRNA産生のためのベクターにおける前記NA DNAは、異種又はキメラNAの配列を有し、及びHAのvRNA又はcRNA産生のためのベクターにおける前記HA DNAは、異種又はキメラHAの配列を有し、ここで、前記NSウイルスセグメントは、42位にY以外の残基、117位にM以外の残基、176位にK以外の残基、及び/又は252位にS以外の残基を有するNS1ポリペプチドをコードし、及び/又は39位にa以外のヌクレオチド又は38位の後にヌクレオチドの挿入、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記Mウイルスセグメントが、34位にG以外の残基、54位にD以外の残基、77位にR以外の残基、86位にM以外の残基、97位にI以外の残基、又はそれら何れかの組合せを有するM1ポリペプチドをコードし、又は前記Mウイルスセグメントが、58位にH以外の残基、80位にR以外の残基、27位にH以外の残基、26位にG以外の残基、又はそれら何れかの組合せを有するBM2ポリペプチドをコードし; 又は前記NPウイルスセグメントが、28位にA以外の残基、40位にP以外の残基、51位にP以外の残基、52位にE以外の残基、57位にS以外の残基、204位にM以外の残基、及び/又は343位にP以外の残基を有するNPポリペプチドをコードし、及び/又は1795位にg以外のヌクレオチド又は500位にc以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記PAウイルスセグメントが、387位にY以外の残基、434位にV以外の残基、494位にD以外の残基、及び/又は524位にT以外の残基を有し、及び/又は2272ヌクレオチド位にa以外のヌクレオチド、1406ヌクレオチド位にa以外のヌクレオチド、1445ヌクレオチド位にc以外のヌクレオチド、及び/又は2213ヌクレオチド位にg以外のヌクレオチド、又はそれら何れかの組合せを有し; 又は前記PB2ウイルスセグメントが、16位にN以外の残基を有するPB2ポリペプチドをコードし; 又はそれら何れかの組合せ; と、
インフルエンザウイルスPAをコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生用ベクター、インフルエンザウイルスPB1をコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生用ベクター、インフルエンザウイルスPB2をコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生用ベクター、及びインフルエンザウイルスNPをコードするDNAセグメントに動作可能に連結されたプロモーターを含むmRNA産生用ベクター; と
感染性インフルエンザウイルスを採取するために有効な量で接触させること: を含むインフルエンザウイルスの調製方法。 - 前記細胞が、鳥類細胞又は哺乳動物細胞である、請求項14に記載の方法。
- 前記細胞が、Vero細胞、ヒト細胞又はMDCK細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記NPポリペプチドが、40位にSを有し且つ、前記NP vRNAが、500ヌクレオチド位にtを有し、前記M1ポリペプチドが、77位にKを有し、前記NS1ポリペプチドが、176位にQを有し且つ、前記NS vRNAが39ヌクレオチド位にgを有し、及び前記PA vRNAが、1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にt、及び2272ヌクレオチド位にtを有する、請求項14〜16の何れか1項に記載の方法。
- 前記NPポリペプチドが、40位にS及び204位にTを有し且つ、前記NP vRNAが、500ヌクレオチド位にtを有し、前記M1ポリペプチドが、86位にTを有し、前記NS vRNAが、38ヌクレオチド位の後にgの挿入を有し、及び前記PA vRNAが、1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にt、及び2272ヌクレオチド位にtを有する、請求項14〜16の何れか1項に記載の方法。
- 前記感染性インフルエンザウイルスを単離することをさらに含む、請求項14〜18の何れか1項に記載の方法。
- a) 配列番号6、18又は19によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、以下: NS1において42位にN、117位にY、176位にQ、又は252位にT、39ヌクレオチド位にg若しくは38ヌクレオチド位の後にgの挿入を有するNS vRNA; の少なくとも1つを有するB型インフルエンザウイルスNS1;
b) 配列番号5、16又は17によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、M1において以下: 34位にV又はN、54位にG、77位にK、86位にT、又は97位にN; の少なくとも1つを有する、B型インフルエンザウイルスM1;
c) 配列番号5、16又は17によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、58位にR、80位にG、27位にR又は26位にRを有するB型インフルエンザウイルスBM2;
d) 配列番号4、14又は15によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、以下: NPにおいて28位にT、40位にS、51位にQ、52位にK、57位にG、204位にT、又は343位にT、又は500ヌクレオチド位にtを有するNP vRNA; の少なくとも1つを有するB型インフルエンザウイルスNP; 又は
e) 配列番号1又は13によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し且つ、以下: 387位にH、434位にA、494位にN、又は524位にA、1406ヌクレオチド位にg、1445ヌクレオチド位にg、又は2272ヌクレオチド位にtを有するPA vRNA; の少なくとも1つを有するB型インフルエンザウイルスPA;
のvRNA、cRNA又はmRNA発現のためのベクター。
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