DE69510207T3

DE69510207T3 - Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren

Info

Publication number: DE69510207T3
Application number: DE1995610207
Authority: DE
Inventors: Martin A. Billeter; Pius Spielhofer; Karin Kälin; Frank Radecke; Henriette Schneider
Original assignee: Schweiz Serum und Impfinstitut Bern; Schweiz Serum und Impfinstitut und Institut zur Erforschung der Infektionskrankheiten
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 1995-08-09
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2015-08-10
Also published as: US8158416B2; EP0846181A1; ATE181112T1; DK0846181T4; DK0780475T3; DE69510207D1; US7851214B2; AU6820896A; WO1997006270A1; US20080124803A1; CA2228956C; CA2228956A1; DE69510207T2; PT846181E; EP0846181B1; DK0780475T4; DE69634407T2; EP0780475A1; US20120003264A1; US7993924B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Herstellung von nicht-segmentierten Paramyxoviridae (Pringle, 1991) aus clonierter Desoxyribonucleinsäure (cDNA). Diese gewonnenen Viren sind zur Verwendung als Impfstoffe oder alternativ als Vektoren in somatischen Gentherapieanwendungen geeignet. Zur Durchführung der Erfindung werden ferner cDNA-Moleküle als Hilfsstoffe in diesem Verfahren und Helferzelllinien zur direkten Gewinnung dieser Viren in Erwägung gezogen. Das Masernvirus (MV) wird als Modell für andere Repräsentanten verwendet.
Die Erfindung stellt die Technologie zur Konstruktion von rekombinanten Impfstoffstämmen bereit, insbesondere von MV-Impfstoffstämmen, die codierende Bereiche enthalten, die Epitope oder das vollständige Protein von anderen Viren, Bakterien oder Parasiten exprimieren. Sie zeigt ferner die Möglichkeit der Konstruktion von heterologe Hüllproteine enthaltenden chimären MV-Stämmen, die zur zielgenauen Bindung an MV-Rezeptor-freie Zellen geeignet sind. So besteht grundsätzlich die Möglichkeit der vom MV-Genom ausgehenden Konstruktion von Plasmiden, die in Hüllen verpackt sind, die zur zielgenauen Bindung an spezielle Zelltypen geeignete Proteine enthalten, und die Genprodukte, die in genetisch defekten Individuen fehlen oder für maligne Zielzellen toxisch sind, codieren.
Durch einfachen Austausch der in der Erfindung beschriebenen MV-spezifischen Helferzelllinien durch Zelllinien, die die verwandten Proteine exprimieren, die von anderen Repräsentanten der Paramyxoviridae codiert werden, kann jedes andere in Wirbeltierzellen replizierende Mitglied dieser viralen Familie für Lebendimpfstoffe oder Vektoren zur Gentherapie anstelle von MV verwendet werden.
Hintergrundinformation
Masernvirus
MV ist ein Mitglied der Familie Paramyxoviridae. Seine genetische Information ist auf einem einzelnen 15894 Nucleotide umfassenden RNA-Strang von negativer Polarität codiert. Das Genom wird vom 3'-Terminus sequentiell transkribiert, wobei zusätzlich zu einer Leader-RNA 6 mit einer Kappe versehene und polyadenylierte Haupt-Messenger-Ribonucleinsäure (RNA)-Moleküle, von denen jedes ein Hauptprotein codiert, erhalten werden. Die Genomkarte ist in 1 dargestellt, in der die Gene dargestellt sind, die als Hauptprodukte N (Nucleokapsidprotein), P (Phosphoprotein), M (Matrixprotein), F (Fusionsprotein), H (Hämagglutinin) und L (großes Protein = Polymerase) liefern. Mehrere zusätzliche RNA- und Proteinmoleküle, die teilweise in Tabelle 1 von 1 erwähnt sind, komplizieren dieses einfache Bild, sie sind hier jedoch nicht relevant.
MV ist eine Hauptursache der akuten Fiebererkrankung bei Säuglingen und Kleinkindern. Gemäß den Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sterben eine Million Kleinkinder jedes Jahr an Masern. Diese hohe Zahl an Todesopfern findet man primär in Entwicklungsländern, in den letzten Jahren waren jedoch auch industrialisierte Länder, wie die USA, erneut von Masernepidemien betroffen, primär aufgrund einer unvollständigen Einhaltung von Immunisierungsprogrammen (Clements und Cutts, 1995). Gegenwärtig werden mehrere lebende abgeschwächte MV-Impfstoffstämme verwendet (einschließlich der Schwarz-, Moraten- und Edmonston-Zagreb-Stämme), die fast alle vom ursprünglichen Edmonston-Stamm (Enders und Peebles, 1954) nach multiplen Passagen in nicht-menschlichen Zellen stammten (Enders, 1962). Über aktuelle MV-Immunisierungsverfahren, einschließlich möglicher Weiterentwicklungen, berichtet Norrby (1995). Masernimpfstoff wird üblicherweise im Alter von 15 Monaten oder in Entwicklungsländern schon im Alter von 6 Monaten verabreicht, und es stellte sich heraus, dass er stark wirksam war und in der Regel eine lebenslange Immunität gegen eine erneute MV-Infektionskrankheit verlieh. Bisher blieben die zur Abschwächung dieser Impfstoffstämme verantwortlichen genetischen Veränderungen unbekannt. Durch die erwiesene Sicherheit des Masernimpfstoffs in Kombination mit seiner hohen und lang anhaltenden Wirksamkeit ist er ein ideales Plasmid zur Expression von heterologen Genen. Ein solcher Impfstoff könnte zur Erzeugung eines lang anhaltenden Immunschutzes gegen andere pathogene Wirkstoffe als das Vektorvirus selber verwendet werden. Ein weiterer möglicher Kandidat für einen Impfvektor ist das Mumpsvirus, eine entfernte Verwandte von MV, die ebenfalls ein hoch wirksamer und sicherer abgeschwächter Lebendimpfstoff ist.
Gewinnung des RNA-Virus von clonierter DNA
Die Untersuchung des Replikationszyklus einer Reihe von RNA-Viren wurde durch die Verfügbarkeit von infektiöse Viren liefernden DNA-Clonen stark erleichtert, was die Anwendung einer reversen Genetik erlaubt. Anfänglich wurden der Bakteriophage Qβ (Taniguchi et al., 1978) und das Poliovirus (Racaniello und Baltimore, 1981) und anschließend das Sindbisvirus (Rice et al., 1987) von clonierter cDNA exprimiert. Bisher konnte eine große Vielzahl von primär Wirbeltiere und Pflanzen infizierenden Positiv-Strang-RNA-Viren von clonierter DNA gewonnen werden (eine aktuelle Zusammenfassung liefern Boyer und Haenni, 1994). Ferner ist die provirale DNA von Retroviren infektiös. Versuche zum Erhalt von infektiösen Viren von cDNA-Clonen von Negativ-Strang-RNA-Viren stießen jedoch auf große Schwierigkeiten. Dies liegt an zwei Eigenschaften dieser Viren: (i) weder genomische noch antigenomische RNAs sind infektiös, da sie nicht als mRNAs dienen; und (ii) sowohl zur Transkription als auch zur Replikation sind Ribonucleocapside, d.h. stäbchenförmige Nucleoproteinkomplexe (RNPs), die die genomische RNA und mehrere Proteine mit einer strukturellen und/oder enzymatischen Funktion enthalten, erforderlich.
Die Gewinnung von clonierter DNA war vor mehreren Jahren beim Influenzavirus, einem acht Genomabschnitte enthaltenden Negativ-Strang-RNA-Virus, erfolgreich. Seine RNPs, die klein und locker strukturiert sind, wie durch die RNase-Empfindlichkeit ihres RNA-Bestandteils gezeigt wurde, können in vitro aus RNA und den erforderlichen viralen Proteinen, N und den Polymerasebestandteilen aufgebaut werden. Anfänglich wurde eine künstliche RNA verwendet, die als Reporter die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-codierende Sequenz, die in die nicht-codierenden terminalen Abschnitte einer Influenzavirus-Genomuntereinheit eingebettet war, trug (Luytjes et al., 1989). Anschließend wurden einzelne ursprüngliche oder veränderte Genomuntereinheits-RNAs verwendet, die in vitro von clonierter DNA transkribiert waren (Enami und Palese, 1991). Die zusammengesetzten RNPs replizierten und transkribierten nach einer Transfektion in Influenza-infizierte Zellen, wie die CAT-Produktion bzw. die Gewinnung von neu zusammengesetzten Influenzaviren zeigte. Die Reinigung des die eingeführte Untereinheit enthaltenden Virus von der weitaus größeren Menge von nicht neu aufgebauten Viren kann in einigen Fällen beispielsweise durch Selektion unter Verwendung eines spezifischen neutralisierenden Antikörpers, der gegen das von der verwandten Untereinheit des Helfervirus codierte Protein gerichtet ist, erreicht werden.
Im Gegensatz dazu waren bei Viren der Ordnung Mononegavirales (Pringle, 1991) mit einem nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Genom die viel enger strukturierten und längeren RNPs, die zusätzlich zu dem N-Protein das Zusammenbau- und Polymerase-Cofaktor-Phosphoprotein (P) und die virale RNA-Polymerase (großes Protein, L) enthielten, widerstandsfähig gegen eine funktionale Reassoziation in vitro. Daher versuchten viele Laboratorien die Gewinnung von Repräsentanten der Mononegavirales, wobei mit subgenomischen RNAs, die nur essentielle Abschnitte der viralen Genome enthielten, begonnen wurde, unter Verwendung von Viren zur Bereitstellung von Helferproteinen, die zur intrazellulären Einkapselung und Replikation dieser Minireplikons erforderlich waren. Zunächst wurden nur natürlich entstehende subgenomische RNAs, die mit der viralen Replikation konkurrierten und daher als defekte interferierende Partikel (DI)-RNAs (Re, 1991) bezeichnet wurden, verwendet, die später durch künstliche DI-RNAs, die von geeignet konstruierten Plasmiden transkribierte Reportergene enthielten, ersetzt wurden. Diese Minireplikons, die zunächst von der Gruppe von M. Krystal (Park et al., 1991) gemäß dem für das anfängliche Influenza-Gewinnungsmodell (Luytjes et al., 1989) verwendete Replikon entwickelt wurden, trugen eine CAT-codierende Sequenz, die in virale nicht-codierende terminate Bereiche des Sendaivirus (SeV) eingeführt und auch erfolgreich für das respiratorische Syncytiavirus (Collins et al., 1993; Collins et al., 1991), menschliche Parainfluenzavirus 3 (Dimock und Collins, 1993), Tollwutvirus (RV) (Conzelmann und Schnell, 1994) und MV (Sidhu et al., 1995) verwendet wurden.
In allen diesen Systemen wurden die essentiellen Helferproteine entweder durch die homologen Viren oder durch den Vacciniavektor vTF7-3, der die RNA-Polymerase des Phagen T7 codierte (Fuerst et al., 1986), bereitgestellt, um die T7-spezifische Transkription von transfizierten Plasmiden, die die erforderlichen Proteine N, P und L codieren, wie von Pattnaik et al. (1990) erstmals festgestellt, durchzuführen. Diese Untersuchungen unter Verwendung von Minireplikons ermöglichten wichtige Erkenntnisse in die nicht-codierenden regulatorischen Bereiche der entsprechenden viralen Genome und Antigenome (eine aktuelle Übersicht geben Wertz et al., 1994). Durch Übernehmen des gleichen Versuchsaufbaus wurde nun auch die Gewinnung von VSV, wie RV ein Mitglied der Rhabdoviridae, beschrieben (Lawson et al., 1995).
Ein wichtiger Nachteil dieses Verfahrens (sowie des für die Gewinnung der Negativ-Strang-RNA-Viren mit einem segmentierten Genom beschriebenen Verfahrens) ist die Beteiligung eines Helfervirus, das vom gewonnenen Virus getrennt werden muss und das die Replikation des zu gewinnenden Virus stören kann. Bei RV und VSV, die beide zu den fest strukturierten Rhabdoviridae gehören und zu höheren Titern replizieren, ist dies kein wichtiges Problem. Jedoch bei locker strukturierten polymorphen Virionen, die für die Mitglieder der Familie Paramyxoviridae typisch sind, und bei Viren, die nur relativ geringe Titer liefern, würde die Gegenwart eines Helfervirus die Gewinnung von Viren schwierig machen, und sie kann auch ihre Gewinnung insgesamt ausschließen.
Daher war das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem die Bereitstellung eines Systems, das zur Erzeugung von nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Viren der Familie Paramyxoviridae und am meisten bevorzugt des Masernvirus, verwendet werden kann, und zur Gewinnung dieser Viren mit einer vernünftigen Effizienz. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die in den Ansprüchen beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines infektiösen nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie Paramyxoviridae, umfassend

(a) Einführen eines cDNA-Moleküls, das die vollständige (+)-Strangsequenz dieses Negativ-Strang-RNA-Virus umfasst, die funktional an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, die die Synthese von authentische 3'-Termini tragenden anti-genomischen RNA-Transkripten ermöglicht, in eine Helferzelle, die eine RNA-Polymerase, vorzugsweise die T7-RNA-Polymerase, ein N- und ein P-Protein, vorzugsweise des zu gewinnenden Virus, wobei diese Proteine von stabil transfizierten Expressorplasmiden exprimiert werden, und ferner ein L-Protein, vorzugsweise des zu gewinnenden Virus, das durch eine cDNA codiert wird, die in einem entweder vorübergehend oder stabil in diese Zelle eingeführten Plasmid enthalten ist; und
(b) Gewinnung des zusammengesetzten infektiösen nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus.

Daher kann die vorliegende Erfindung durch Bereitstellung eines Moleküls zur Herstellung eines beliebigen Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie Paramyxoviridae durchgeführt werden. Vorzugsweise tragen diese antigenomischen RNA-Transkripte auch die ursprünglichen 5'-Termini.
Wie ferner erfindungsgemäß festgestellt wurde, kann das Masernvirus, das ein Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie Paramyxoviridae ist, nur effektiv produziert werden, wenn die durch dieses cDNA-Molekül spezifizierten Replikons aus einem integralen Vielfachen von sechs Nucleotiden bestehen. Dieses Phänomen wird auch als die "Sechser-Regel" in dieser Anmeldung bezeichnet. Die cDNA-Moleküle können einfach zur Gewinnung von Negativ-Strang-RNA-Viren der Familie Paramyxoviridae verwendet werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist diese Expressionskontrollsequenz ein RNA-Polymerase-Promotor.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist dieses cDNA-Molekül in einem Plasmid enthalten. Das Plasmid kann amplifizieren und vorzugsweise auch dieses cDNA-Molekül als eine antigenomische RNA exprimieren.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform enthält dieses Plasmid ein exprimierbares DNA-Fragment, das einen vorzugsweise homologen DNA-Bereich dieses cDNA-Moleküls ersetzt, oder weitere genetische Informationen liefert.
Wie ferner erfindungsgemäß festgestellt wurde, muss bei Replikons auf MV-Basis die „Sechser-Regel" beachtet werden, wenn ein fremdes – homologes oder heterologes – exprimierbares DNA-Fragment in das diese cDNA enthaltende Plasmid eingeführt wird. Jedes neu erzeugte, durch geeignet konstruierte cDNA-Moleküle spezifizierte Replikon kann mit anderen Worten nur bei Beachtung der „Sechser-Regel" vernünftige Mengen des gewünschten Produkts liefern.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist dieses Plasmid dadurch gekennzeichnet, dass das exprimierbare DNA-Fragment in oder benachbart zu einem ein virales Protein codierenden Bereich dieser cDNA eingeführt wird, wobei diese Insertion in einer Weise durchgeführt wird, bei der der Leserahmen zur Bildung eines Fusionsproteins beibehalten wird und die Expression dieses DNA-Fragments unter der Kontrolle der Signalsequenzen dieses viralen Proteins möglich ist. Erfindungsgemäß wird erwartet, dass in verschiedenen Fällen geeignete C-terminate Extensionen der viralen Proteine deren Funktionen nicht stören.
Als Variation zur vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform und ebenfalls als Teil der vorliegenden Erfindung wird das exprimierbare DNA-Fragment so stromabwärts eines Virusprotein codierenden Bereichs exprimiert, dass die Bildung eines Fusionsproteins vermieden wird, jedoch trotzdem die Expression der stromabwärts codierenden Sequenz entweder durch einen Stop/Neustart-Mechanismus, bei dem der letzte A-Rest des stromaufwärts liegenden Terminationstripletts mit dem des Startcodons des stromabwärts liegenden codierenden Bereichs zusammenfällt, oder durch Platzierung einer inneren Ribosomeneintrittsstelle (IRES) zwischen den beiden codierenden Bereichen möglich ist; vgl. Beispiel 12, zweiter Absatz.
In einer weiteren am meisten bevorzugten Ausführungsform ist dieses Plasmid dadurch gekennzeichnet, dass das exprimierbare DNA-Fragment in einen nicht-codierenden Bereich dieser cDNA eingeführt und von viralen Signalsequenzen oder heterologen Signalsequenzen flankiert ist, die die Expression des durch dieses DNA-Fragment spezifizierten RNA-Fragments kontrollieren; vgl. Beispiel 12, erster Absatz.
Beispiele für diese Ausführungsform, die weitere Transkriptionseinheiten erzeugt, sind Plasmide, die MVs spezifizieren, die den in 10 dargestellten heterologen CAT-Leserahmen exprimieren.
In einer weiteren stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Plasmid eine genomische Ribozymsequenz, die dem 3'-terminalen Nucleotid dieses cDNA-Moleküls unmittelbar benachbart ist und gegebenenfalls stromabwärts dieser genomischen Ribozymsequenz mindestens einen Terminator, vorzugsweise den T7-Terminator, aufweist.
Der Einschluss einer Ribozymsequenz in das erfindungsgemäße Plasmid führt zur zuverlässigen Spaltung des RNA-Transkripts, wodurch die Ausbeute an RNA-Transkripten, die die richtigen 3'-Teimini tragen, die bei MV die „Sechser-Regel" befolgen müssen, stark erhöht ist.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist diese genomische Ribozymsequenz die Ribozymsequenz des Hepatitis-Delta-Virusgenoms.
In einer weiteren stärker bevorzugten Ausführungsform kann dieses diese cDNA tragende Plasmid in einem prokaryotischen Wirt replizieren. Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen prokaryotischen Wirts ist E. coli. Dieses bevorzugte Beispiel wird durch alle modifizierte MVs erzeugenden cDNA-Konstrukte erläutert, wie sie in den 2 und 10, die zu hoher Kopienzahl in E. coli replizierende Plasmide zeigen, dargestellt sind.
Ferner kann in einer stärker bevorzugten Ausführungsform dieses diese cDNA(s) tragende Plasmid in einem eukaryotischen Wirt replizieren.
Die Erfindung betrifft die Replikation und Expression (d.h. Transkription mit einer anschließenden Translation der gebildeten Transkripte) des gewonnenen Vektors, d.h. der verpackten RNA-Partikel (RNPs), in einer beliebigen geeigneten eukaryotischen, vorzugsweise Wirbeltier-, Wirtszelle. Bevorzugte Wirtszellen weisen eine hohe Replikations- und Expressionskapazität auf. Am meisten bevorzugt sind die Wirtszellen, die eine leichte Gewinnung der Viren zur weiteren Replikation und einer anschließenden Formulierung in Impfstoffen erlauben.
In einer weiteren stärker bevorzugten Ausführungsform ist dieses exprimierbare DNA-Fragment dieses Plasmids ein DNA-Fragment, das im Hinblick auf das Negativ-Strang-RNA-Virus homolog oder heterolog ist und mindestens ein immunogenes Epitop codiert.
In einer am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform codiert in diesem Plasmid dieses exprimierbare DNA-Fragment mindestens ein immunogenes Epitop von mindestens einem Pathogen, vorzugsweise ein Hüllprotein, und mindestens ein Genprodukt, das in genetisch defekten Individuen fehlt oder für zielgenau gebundene maligne Zellen toxisch ist.
Diese am meisten bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ermöglicht die Konstruktion von Plasmiden als Basis für Impfstoffe, die eine Immunantwort gegen ein oder vorzugsweise verschiedene unterschiedliche Pathogene effektiv induzieren können. Wenn das exprimierbare DNA-Fragment ein Hüllprotein von einem anderen Virus als dem Masernvirus oder von einem anderen Pathogen codiert, kann ein auf dem Masernvirus beruhendes Plasmid zur zielgenauen Bindung an spezifische Zelltypen, die üblicherweise nicht vom Masernvirus erkannt werden, verwendet werden. Diese Zelltypen können anschließend durch gewonnene, vom erfindungsgemäßen Plasmid spezifizierte Viren selektiv zielgenau gebunden und auf diesen Zelltyp, beispielsweise ein von diesem Zelltyp benötigtes Molekül oder ein Toxin zur Eliminierung dieses Zelltyps, übertragen werden. Selbstverständlich wird dieses Molekül oder Toxin auch durch dieses Plasmid codiert. Der Fachmann kann weitere Anwendungen dieses Grundprinzips entwickeln, für das das erfindungsgemäße Plasmid verwendet werden kann.
Ferner kann dieses Plasmid ein Produkt codieren, das in genetisch defekten Individuen fehlt. Das gewonnene Virus kann anschließend zur Gentherapie dieser genetisch defekten Individuen verwendet werden.
Ferner können maligne Zellen durch das gewonnene, auf diesem Plasmid beruhende Virus zielgenau gebunden werden und für diese malignen Zellen toxische Moleküle können übertragen werden.
In einer weiteren am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform stammt dieses exprimierbare DNA-Fragment in diesem Plasmid von einem Virus, Bakterium oder Parasiten.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform codiert dieses exprimierbare DNA-Fragment dieses Plasmids ein immunogenes Epitop, das eine schützende Immunantwort erzeugen kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beruht dieses cDNAMolekül oder Plasmide auf einem RNA-Virus, das das Masernvirus oder Mumpsvirus ist.
Die Erfindung umfasst ferner in ihrer Durchführung eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die mit einem Plasmid transformiert ist, wie vorstehend beschrieben. Bevorzugte Wirtszellen wurden vorstehend erläutert.
Angesichts der Probleme wurde der bisherige Stand der Technik mit der Gewinnung von nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Viren konfrontiert und gemäß der vorliegenden Erfindung wurden paradigmatische Zelllinien, die als Helferfunktionen die T7-RNA-Polymerase und MV-N- und MV-P-Protein bereitstellen, entwickelt. Die Gewinnung von MVs kann direkt nach einer Transfektion mit antigenomische RNAs und MV-L-mRNA spezifizierenden Plasmiden überwacht werden. Grundsätzlich können analoge Helferzelllinien für jeden beliebigen Paramyxovirus erzeugt werden; daher kann dieses Gewinnungsverfahren für alle Paramyxoviridae verwendet werden, die in Wirbeltierzellen replizieren.
Daher sind in einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform diese zur Einkapselung, Transkription und Replikation dieser RNA erforderlichen Proteine eine RNA-Polymerase, vorzugsweise die T7-RNA-Polymerase und gegebenenfalls die T3-RNA-Polymerase, und das N- und P-Protein, vorzugsweise vom zu gewinnenden Virus. Erfindungsgemäß werden diese Proteine von stabil transfizierten Expressionsplasmiden exprimiert, was hier nachstehend als genomische Expression definiert ist.
Da das neu entwickelte Gewinnungssystem im Gegensatz zu dem zur Gewinnung von RV (Schnell et al., 1994), VSV (Lawson et al., 1995) und vor kurzem auch von SeV (D. Kolakofsky, persönliche Mitteilung) verwendeten System nicht auf irgendeinem Helfervirus beruht, gibt es keine Notwendigkeit zur Trennung des gewonnenen Virus von einem hohen Überschuss an Helfervirus. Die Entfernung des Vacciniavirus vom gewonnenen Virus wird durch einen einfachen Filtrationsschritt bei fest strukturierten Virionen von Rhabdoviridae erreicht, würde jedoch komplexere Reinigungsschemata bei pleomorphen Paramyxoviridae, besonders bei denen, die nicht zu hohen Titern replizieren, wie MV, erfordern. Ferner kann bei Viren, deren Replikation und/oder Keimen durch das Vacciniavirus behindert ist, die Gewinnung unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Systeme vollständig misslingen. Ein weiterer möglicher Nachteil der im Stand der Technik bekannten Systeme auf der Basis des Vaccinia-Helfervirus ist die große Häufigkeit der im Cytoplasma der Vacciniavirus-infizierten Zellen auftretenden DNA-Rekombinationen, die eine Rekombination des die antigenomische Sequenz tragenden Plasmids mit den Plasmiden, die das für die Helferfunktion erforderliche N-, P- und L-Protein codieren, bewirken könnten; dies kann zur Gewinnung von Viren führen, die N-, P- und L-Sequenzen enthalten, die teilweise von den Helferplasmiden anstatt vom die antigenomische Sequenz tragenden Plasmid stammen. Das Helferzellsystem umgeht alle diese Probleme und sollte im Prinzip zur Gewinnung von allen in Wirbeltierzellen replizierenden Mononegavirales verwendbar sein.
Zur Gewinnung jedes einzelnen Repräsentanten von Mononegavirales ist das Etablieren einer Helferzelllinie, die das verwandte N- und P-Protein (zusätzlich zur T7-Polymerase) exprimiert, nicht unbedingt erforderlich. Minireplikon-Konstrukte, die die nicht-codierenden terminalen Bereiche (NCTs) des Hundestaupevirus (CDV) enthalten, das wie MV ein Morbillivirus ist, das sich von MV in 35 % der Nucleotide in den NCTs unterscheidet, replizieren in den MV-spezifischen Helferzellen mit einer sich der des homologen MV-Minireplikons annähernden Effizienz. Daher könnte CDV möglicherweise mit den erfindungsgemäß entwickelten 293-3-46-Zellen gewonnen werden.
Zum Etablieren von neuen Helferzelllinien für andere Paramyxoviren, die auch für die vorliegende Erfindung in Frage kommen, sind die nachstehenden Überlegungen hilfreich. Die konstitutive Expression der T7-RNA-Polymerase und der MV-Proteine N und P behinderten nicht die Langzeitstabilität der 293-3-46-Zelllinie, wie in den hier nachstehend beschriebenen Beispielen erwähnt ist. Daher wird die induzierbare Expression dieser Proteine, beispielsweise durch die Verfahren, die von der Gruppe von Bujard beschrieben wurden (Zusammenfassung in Gossen et al., 1993), wahrscheinlich nicht erforderlich sein, obwohl es nicht ausgeschlossen werden kann, dass die N- und P-Proteine von anderen Viren im Vergleich mit denen von MV für das Zeltwachstum schädlicher sind. Die Titration der für die Transfektion verwendeten Plasmide erwies sich als essentiell, da sie zeigte, dass ein Verhältnis von etwa 1:1000 von L-codierendem bzw. Antigenom produzierendem Plasmid optimal war, was mit der schädlichen Wirkung einer hohen VSV L-Expression bei der VSV-Replikation, die von Schubert et al. (1985) beschrieben wurde, übereinstimmte. Ein alternatives Verfahren der vorübergehenden Zugabe von L unter Verwendung eines Plasmids, das einen CMVPromotor/Enhancer und ein Intron stromaufwärts anstatt stromabwärts des L-codierenden Bereichs für einen Export der langen L-mRNA aus dem Kern enthielt, konnte ebenfalls erfolgreich zur Gewinnung verwendet werden, die Effizienz war jedoch nicht besser als bei dem Standardverfahren der cytoplasmatischen T7-abhängigen L-Expression, und mehr als die 100fache Menge von L-codierendem Plasmid war für die Gewinnung optimal. Angesichts dieser Erfahrungen war die Entscheidung, kein L-codierendes Plasmid zur Erzeugung von Helferzellen zur Expression von L in einstellbaren Verhältnissen einzuschließen, wahrscheinlich vorteilhaft. Trotzdem muss erwähnt werden, dass eine Zelllinie, die von SeV stammendes N, P und L stabil exprimiert, das eine Langzeit-Replikation von natürlichen SeV-Dls vermittelt, beschrieben wurde (Willenbrink und Neubert, 1994). Es ist wichtig festzustellen, dass sich diese Zelllinie fundamental von den in der vorliegenden Erfindung definierten Helferzellen durch ihren Mangel an T7-Polymerase unterscheidet. Daher kann kein Virus und nicht einmal ein Minireplikon von clonierter DNA aus dieser Zelllinie gewonnen werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird diese Helferzelle mit mindestens einem dieser vorstehend beschriebenen Plasmide transfiziert, wobei diese Plasmide variable antigenomische cDNA eines Repräsentanten der Paramyxoviridae enthalten, und ferner mit einem Plasmid stabil transfiziert, das die das verwandte virale L-Protein codierende DNA umfasst.
Daher wird statt der Suche nach einer auch per se die virale Polymerase (L-Protein) codierenden Helferzelle dieses L-Protein in diese Helferzelle auf einem anderen Plasmid, vorzugsweise durch Cotransfektion, transfiziert. Ferner kann ein Fachmann unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lehren eine geeignete auch das L-Protein exprimierende Helferzelllinie erzeugen, wobei dann eine Cotransfektion nicht erforderlich ist.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform stammen die Gene, die diese N-, P- und L-Proteine codieren, vom Masern- oder Mumpsvirus. In einer weiteren am meisten bevorzugten Ausführungsform stammt diese Helferzelle von der menschlichen embryonischen Nierenzelllinie 293 (ATCC CRL 1573). Ein bevorzugtes Beispiel einer solchen Zelle ist der in den Beispielen beschriebene Clon 293-3-46.
Es muss daran erinnert werden, dass vor fünf Jahren in einer fehlerhaften Darstellung die MV-Gewinnung durch das Labor der Anmelder (Ballart et al., 1990, und EP-A 0 440 219) unter Verwendung des gleichen Grundprinzips beschrieben wurde. Damals beruhten die Experimente auf der Mikroinjektion von Initiationskomplexen, die aus der T7-RNA-Polymerase und MV-Genome oder Antigenome spezifizierenden Plasmiden bestanden, in eine bestimmte defekte, jedoch replizierende MV-Genome enthaltende Zelllinie. Jedoch konnte die Gewinnung durch Mikroinjektionsexperimente, die unglücklicherweise nur durch einen Mitarbeiter durchgeführt wurden, nicht wiederholt werden, und alle angeblich gewonnenen Viren enthielten nicht den genetischen Marker, wie in einem Kommentar zu diesen extrem bedauerlichen und schädlichen Ereignissen beschrieben wurde (Aldhous, 1992). Es ist heute offensichtlich, dass die Gewinnung von MV mit diesem Versuchsaufbau aus mehreren Gründen nicht erwartet werden konnte, besonders aufgrund von weiteren Nucleotiden an beiden Enden der erzeugten RNAs und aufgrund eines Clonierfehlers, der die RNA mit der „Sechser-Regel" inkompatibel machte (Calain und Roux, 1993; die vorliegende Erfindung).
Die Gewinnungseffizienz ist im Vergleich zur Gewinnung der Positiv-Strang-RNA-Viren (Perrotta und Been, 1990) gering, da nur 1 bis 6 von 10⁶ transfizierten Zellen, die jede durchschnittlich gegen etwa 2,5 × 10⁵ Moleküle von antigenomischem und gegen 80 bis 800 Moleküle von L-codierendem Plasmid exponiert wurden, die Bildung von Syncytien auslösen. Trotzdem zeigt die MV-Gewinnung bei einem Vergleich mit für RV und VSV beschriebenen Gewinnungsverfahren, in dem etwa 2 × 10⁷ Zellen für ein Gewinnungsereignis transfiziert werden mussten (Lawson et ah, 1995; Schnell et al., 1994), gute Ergebnisse, besonders angesichts der Tatsache, dass das MV-Genom etwa 4,5 kb größer und daher im Prinzip schwerer zu gewinnen ist. Bedeutsamerweise braucht die geringe Effizienz keine Schwierigkeit für die Gewinnung von MV-Varianten darzustellen, die nur zu Titerniveaus, die um sogar Größenordnungen geringer als die Edmonston B-Stämme sind, replizieren, da der Engpass in der Gewinnung am wahrscheinlichsten ein frühes Ereignis ist. Es ist wichtig, festzustellen, dass auf zu verschiedenen Zeiten nach der Transfektion fixierten Zellen die die H- oder M-Genexpression anzeigende Immunofluoreszenz ausschließlich in Syncytien nachgewiesen wurde und es kein Anzeichen gab, dass die Gewinnung auf einzelne Zellen beschränkt blieb. Zum Zeitpunkt der direkten Beobachtung der gewonnenen Viren durch Syncytien-Bildung waren bereits tausend Nachkommen-MV-Genome entstanden; beeinträchtigte und daher langsam replizierende Virusvarianten müssen anfänglich keine sichtbaren Syncytien bilden, sollten sich jedoch nach einer Aufteilung der transfizierten Zellkultur oder nach einer Saat in frische Vero-Zellen zeigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Verhältnis des Plasmids, das das cDNA-Molekül umfasst, das die vollständige (+)-Strangsequenz dieses Negativ-Strang-RNA-Virus umfasst, die funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist, die die Synthese von die ursprünglichen 3'-Termini tragenden anti-genomischen RNA-Transkripten ermöglicht, und des Plasmids, das die Virus-L-Protein-codierende DNA umfasst, 1 000:1.
In der Erfindung wurde gezeigt, dass das vorstehend erwähnte Verhältnis für eine Transfektionseffizienz optimal ist.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird diese Gewinnung entweder direkt aus der transfizierten Helferzellkultur nach der Syncytien-Bildung oder nach dem Vermischen von gelösten Helferzellen mit beliebigen anderen infektionskompetenten und die zusammengesetzten RNA-Viren replizierenden Zellen durchgeführt.
In der Vergangenheit wurden eine Reihe von DNA-Viren und Positiv-Strang-RNA-Viren als Träger zur Kontrolle der Expression von heterologen Genen oder Genabschnitten in Wirtszellen, hauptsächlich mit dem Ziel der Erzeugung eines Immunschutzes gegen das das heterologe genetische Material liefernde Pathogen, verwendet. Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Lebendimpfstoffe ist ihre Fähigkeit zur Vervielfachung und üblicherweise Infizierung einer Reihe von unterschiedlichen Zelltypen, die die Antigene von Interesse intrazellulär erzeugen, die dann dem Immunsystem effizient präsentiert werden können, wodurch sowohl die Induktion der T-Zell-Hilfe als auch der Cytotoxizität erleichtert wird. Im Gegensatz dazu sind abgetötete Impfstoffe oder Proteine, die durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt wurden, viel weniger effizient, selbst nach einer Verabreichung in verschiedenen neu entwickelten Partikelformen, die effizienter als traditionell verwendete Adjuvanzien sind. Ferner induzieren diese Impfstoffe üblicherweise keine Schleimhautimmunität, die sehr wichtig für einen Schutz gegen auf dem respiratorischen oder intestinalen Weg eindringende Pathogene ist. Ein Versagen der Induktion einer Schleimhautimmunität ist ebenfalls für das Immunisierungsverfahren durch Injektion von Antigene codierender nackter DNA typisch.
Andererseits stellen die meisten replizierenden Impfstoffe eine mögliche Gefährdung dar, selbst wenn sie nicht proliferieren, wie Avipox-Vektoren in Menschen (Baxby und Paoletti, 1992). Komplexe virale Vektoren (z. B. auf der Basis eines Vacciniavirus und verwandten Pockenviren, Adenoviren oder Herpesviren) und bakterielle Vektoren (z. B. auf der Basis von Derivaten der Tuberkulose oder Cholera verursachenden Wirkstoffe) rufen viele unnötige und/oder unerwünschte Nebenimmunantworten hervor. Ferner hat die DNA-Integration in das Genom von infizierten oder transfizierten Zellen wenigstens das Potential für eine maligne Transformation. Bewertungen von verschiedenen Arten von Impfstoffen durch einige Autoren wurden kürzlich veröffentlicht (Vaccines and Public Health; Internat. J. of Techn. Ass. in Health Care 10 (1994), 1–196; Science 265 (1994), 1371–1451), die auf die besonderen Vorteile von kleinen auf RNA beruhenden Lebendimpfstoffen hinweisen.
Mehrere manipulierte Positiv-Strang-RNA-Viren wurden für eine potentielle Verwendung als Vektoren zu Immunisierungszwecken beschrieben; frühe Beispiele schließen das Poliovirus (Burke et al., 1988) und Sindbisvirus (Xiong et al., 1989) ein, und von mehreren aktuelleren Darstellungen, die von verschiedenen Repräsentanten der Picornaviridae exprimierte größere Polypeptidfragmente einschließen, sollte nur eine hier erwähnt werden (Andino et al., 1994).
Es muss jedoch betont werden, dass die Verwendung von RNA-Viren als Vektoren für Impfzwecke wesentlich von der Stabilität des Fremdgenmaterials während der Replikation des Virus abhängt. Dies ist kein triviales Problem, da sich diese Viren auf eine Polymerase, der die Korrekturleseaktivität fehlt, verlassen. Im Vergleich zu Impfstoffvektoren auf der Basis von Positiv-Strang-RNA-Viren, wie vorstehend erwähnt, zeigt ein Impfstoff, wie beispielsweise di- oder multivalente Impfstoffe auf MV-Basis, mehrere wichtige Vorteile, die im Prinzip für jedes andere Mitglied der Paramyxoviridae, wie das Mumpsvirus, gelten. Erstens ist die Größe der Insertionen nicht a priori durch die Notwendigkeit begrenzt, in eine ikosaedrische Proteinhülle zu passen. Zweitens beseitigt die enge Einkapselung der Genome von Paramyxoviridae die bei Positiv-Strang-RNA-Viren sehr wichtige RNA-Sekundärstruktur über die gesamte Genomlänge, die eine korrekte Replikation ohne Anelierung des Produkts an den Matrizen-RNA-Strang ermöglicht; die Fremdantigene codierenden RNA-Abschnitte werden nicht entwickelt, um diese Erfordernisse zu erfüllen. Drittens können aufgrund des modularen Aufbaus des Genoms unterschiedliche Insertionsstellen und Expressionsarten entweder als zusätzliche Transkriptionseinheiten oder als Verlängerung von existierenden Transkriptionseinheiten Ribosomeneintrittsstelle ins Auge gefasst werden, wobei die eingeführten stromabwärts liegenden Leserahmen durch Stop/Restart oder durch eine interne Robososmeneintrittsstelle exprimiert werden, wodurch ein großes Spektrum von unterschiedlichen Expressionsniveaus gemäß der Position im MV-Transkriptionsgradienten möglich wird. Viertens muss erwartet werden, dass aufgrund der extrem geringen Rekombinationshäufigkeiten Paramyxoviriae nicht-essentielles genetisches Material stabiler beibehalten als Positiv-Strang-RNA-Viren. Schließlich sollte die „Sechser-Regel", die für MV gültig ist, wie es erfindungsgemäß festgestellt wurde, und die für andere Paramyxovirinae (Calain und Roux, 1993) gültig ist, wie jedoch an verwandten Mini- und Midireplikons gesehen wurde, die nicht für Rhabdoviridae (Conzelmann und Schnell, 1994) oder für Pneumoviridae (Collins et al., 1993) gültig ist, die zuverlässige Beibehaltung von in Paramyxoviridae eingeführten fremd-codierenden Bereichen im Vergleich zu anderen Mononegavirales sogar erhöhen. Eine solche zusätzliche genetische Stabilität muss erwartet werden, da nur eine von sechs zufällig entstehenden großen Deletionen und keine kleine Insertion oder Deletion von 1 bis 5 Nucleotiden in einem für die virale Replikation nicht essentiellen Bereich erwartungsgemäß zu lebensfähigen Nachkommen führt.
Ferner ermöglicht die Kenntnis der Nucleotidsequenz-Varianten, die eine Attenuation übertragen, die Veränderung der codierenden Sequenzen, die nicht an den Attenuationseigenschaften beteiligt sind, entsprechend der Evolution der Viren über die Jahre, wodurch ein "Update" der Impfstoffe ohne Heraufbeschwören der Gefahr des Verlustes der Qualität der Attenuation möglich ist.
Die Figuren zeigen:
1: Genomkarte des Masernvirus
2: Plasmidvektoren, die RNAs mit korrekten MV-spezifischen Termini zeigen. Die Zahlen unterhalb der Plasmidnamen zeigen die Länge in Nucleotiden der nach einer Ribozym-Selbstspaltung erzeugten RNAs. Der genomische oder antigenomische Sinn der spezifizierten RNAs ist durch (–) bzw. (+) angegeben. Es ist zu beachten, dass die in diesen Plasmiden vorhandenen MV-Nucleotidsequenzen in 30 Positionen von der EMBL-Hinterlegungsnr. K01711 abweichen, besonders durch eine Deletion eines A-Restes an Position 30, was durch eine Insertion eines A an Position 3402 kompensiert wird. Wegen eines kommentierten Überblicks einer MV-Konsensussequenz vgl. Radecke und Billeter (1995).
3: Western-Blot, der die Expression von MV-N- und -P-Proteinen in MV-infizierten 293-Zellen, nicht-infizierten 293-Zellen und in den Zelllinienclonen 293-3-46 bzw. 293-3-64 zeigt. Pfeile zeigen die Position der strukturellen MV-N- und -P-Proteine sowie das nicht-strukturelle V-Protein, das durch Edition des MV-P-Gen-Transkripts entsteht.
4: Überblick über experimentelle Schritte und Gewinnungsverfahren. A: Minireplikon-Gewinnung, was die Transfektion von in vitro transkribierter RNA und Coinfektion mit MV, das die Helferproteine N, P und L (und in späteren Phasen auch M, F und H, sowie die nicht-strukturellen Proteine C und V) bereitstellt, einschließt. B: MV-Gewinnung, was die Transfektion von Plasmid-DNAs in Helferzellen, die sowohl eine künstliche T7-Transkription als auch N- und P-Funktionen vermitteln, einschließt. Erläuterung der meisten Symbole siehe 2. Das L-codierende Plasmid pEMC-La enthält eine vom Encephalomyocarditisvirus (punktiert oval, EMC IRES) stammende interne Ribosomeneintrittsstelle, die an den L-codierenden Bereich fusioniert ist, sodass das Initiator-AUG von EMCV und L zusammenfallen; ein poly dA-Abschnitt stromabwärts (etwa 40 dAs) wird als pdA angegeben. Diese beiden Vorrichtungen stellen die Transkriptstabilität sowie eine effiziente Translation der im Cytoplasma erzeugten Transkripte sicher.
5: Test der in 293-3-46-Helferzellen erzeugten CAT-Aktivität durch Transfektion der Minireplikons spezifizierenden Plasmidkonstrukte p107MV(–):CAT und p107MV(–):CAT und das ein Midireplikon spezifizierende Konstrukt p(+)NP:CAT. Der Hauptteil des Plasmids pT7P2lacZ gleicht der Beschreibung von Pelletier und Sonenberg (1988). Der CAT-Leserahmen des ursprünglichen Plasmids wird durch den lacZ-Leserahmen ersetzt.
6: Sichtbare Darstellung von in 293-3-46-Helferzellen gebildeten Syncytien. A: Gewinnungsexperiment, das durch Phasenkontrastmikroskopie 4 Tage nach der Transfektion beobachtet wurde. B, C: Zellen, die auf Glasdeckgläschen gezüchtet, 3 Tage nach der Transfektion fixiert und durch Phasenkontrast (B) oder indirekte Immunofluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der gegen das MV-M-Protein gerichtet war (C), beobachtet wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem Antikörper gegen H erhalten. Die Balkenlänge stellt μ 100 m dar.
7: Sequenzermittlung der Plaque-gereinigten Viren, die durch RT-PCR mit einer anschließenden Zyklussequenzierung, wie in den Beispielen beschrieben, durchgeführt wird. Die linken Bahnen des relevanten Bereichs, die von einem Sequenziergel reproduziert wurden, betreffen den Labor-Edmonston B-Stamm, die rechten Bahnen das gewonnene Virus. Die angegebenen Nucleotidpositionen entsprechen denen in der MV-Konsensussequenz, wie in 2 definiert.
8: Replikationsverhalten der Plaque-gereinigten Viren, das durch ein Überschichtungsverfahren, wie in den Beispielen beschrieben, ermittelt wurde. Die Derivate der Gewinnungsexperimente, die Standard-MV-Marker-EdB und die 504-Nucleotiddeletionsmutante MVΔ5F EdB werden mit einem Clon vom Labor-Edmonston B-Virus-Stamm verglichen. Die Ergebnisse von zwei unabhängigen Experimenten unter Verwendung eines repräsentativen Clons von jeder Virusart sind dargestellt.
9: Northern-Blots, die mRNAs des von p(+)MV stammenden gewonnenen MV und die von p(+)MVΔ5F (2) stammende MV-Deletionsmutante zeigen. Die monocistronischen F-, M- und H-mRNA-Moleküle (offene Dreiecke) und die bicistronischen MF- und FH-mRNAs (schwarze Dreiecke) werden durch M-, F- und H-spezifische Sonden gezeigt. Die F-spezifischen mono- und bicistronischen RNAs, die von der Deletionsmutante induziert werden, sind deutlich kleiner als die entsprechenden RNAs, die durch die gewonnene Standard-MV induziert wurde (ΔF, 1869 anstelle von 2372 nt., berechnet, ohne Berücksichtigung der Poly-A-Schwänze; MΔF, 3338 anstelle von 3842 nt., und ΔFH, 3830 anstelle von 4334 nt.).
10: Plasmide zur Produktion von Standard-MVs und deletierten MVs und Hybrid-MVs, die weitere Gene oder ausgetauschte Hüllproteine enthalten.
Zu beachten ist, dass zwei chimäre MV-Clone, die von p(+)MPCATV und von p(+)MHCATV nach 10 Infektionszyklen gewonnen wurden, eine CAT-Aktivität exprimierten, die durch die zusätzliche Transkriptionseinheit in jedem der vom zehnten getesteten Zyklus gewonnenen 10 Clone codiert wurde.
11: Elektronenmikroskopie von BHK-Zellen, die mit dem vom p(+)MGV gewonnenen Replikationsmittel infiziert waren.
Große Reihen von für MV-infizierte Zellen typischen RNPs, die ein unbehindertes Replikationsvermögen der chimären viralen RNA zeigen, sind sichtbar.
12: Elektronenmikroskopie von BHK-Zellen, die mit vom p(+)MGV gewonnenen Replikationsmittel infiziert waren.
Pleomorphe Partikel, die MV-Virionen gleichen, werden trotz der Tatsache gebildet, dass in diesen infizierten Zellkulturen ausschließlich das VSV G-Protein und keine Spur der MV-Hüllproteine F und H durch Western-Blot nachweisbar war.
13: Elektronenmikroskopie von BHK-Zellen, die mit VSV infiziert waren: VSV-Virion-Partikel.
Die üblichen kugelförmigen VSV-Virionen unterscheiden sich vollständig von den in 12 dargestellten pleomorphen MV-ähnlichen Partikeln.
Die Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1: Zellen und Viren
Die Zellen wurden als Monolayer in Dulbeccos-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gehalten, dem 5% fötales Kälberserum (FCS) für Verozellen (Niere der afrikanischen grünen Meerkatze), 10% FCS für 293-Zellen (menschliche embryonale Niere), 10% FCS und 1,2 mg/ml G418 für die stabil transfizierten von 293 stammenden Zellclone zugesetzt wurden.
Zur Züchtung von MV-Virus-Stammlösungen, die Titer von etwa 10⁷ pfu/ml erreichten, wurden rekombinante Viren in Verozellen vermehrt, und der Impfstoffstamm Edmonston B wurde in Vero- oder 293-Zellen gezüchtet. Ein Plaque-Reinigungszyklus erfolgte durch Transfer einer Syncytie in eine 35 mm-Verozellkultur, die zu einem 175 cm²-Gefäß vermehrt wurde. Die Virus-Stammlösung wurde aus 175 cm²-Kulturen hergestellt, wenn eine Syncytienbildung deutlich erkennbar war. Die Zellen wurden in 3 ml OptiMEM 1 (GIBCO BRL) geschabt, wonach ein Gefrier/Auftau-Schritt durchgeführt wurde. Die Virustitrationen wurden auf 35 mm-Verozellkulturen durchgeführt. Nach 2 bis 3 Stunden der Virusadsorption wurde das Inokulum entfernt und die Zellen mit 2 ml DMEM, das 5% FCS und 1 % SeaPlaque-Agarose enthielt, überschichtet. Nach 4 bis 5 Tagen wurden die Kulturen mit 1 m1 10% TCA 1 Stunden fixiert und anschließend 30 Minuten mit UV-Licht vernetzt. Nach der Entfernung der Agaroseüberschicht wurden die einzelligen Schichten mit in 4% Ethanol gelöstem Kristallviolett gefärbt und die Plaques gezählt.
Beispiel 2: Erzeugung der Zelllinie 293-3-46
Vor der Transfektion wurden alle Plasmide durch Spaltung mit Sfil linearisiert und durch Ethanolausfällung sterilisiert. Die Zellen wurden in eine 35 mm-Vertiefung zur 13-stündigen Transfektion, wie nachstehend beschrieben, ausgesät. Das Transfektionsgemisch enthielt 5 μg pSC6-N, 4 μg pSC6-P und 1 μg pSC6-T7-NEO. Anschließend wurden die Zellen einmal mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ und 1,5 mM KH₂PO₄) gewaschen und 10% FCS enthaltendes DMEM zugesetzt. Nach 2 Tagen Züchtung wurden die Zellen der 35 mm-Vertiefung in zwei 75 cm²-Gefäße aufgeteilt, und eine Selektion wurde bei 1,2 mg/ml G418 unter Austausch des Mediums jeden zweiten Tag begonnen. Nach etwa 2 Wochen wurden die ersten Clone von insgesamt etwa 100 Clonen in 5 mm-Vertiefungen transferiert. Wenn ein Clon sich in einer 21 mm- oder 35 mm-Vertiefung vermehrt hatte, wurden die Zellen zur Durchmusterung ausgesät. Die Expression der MV-N- und MV-P-Proteine wurde durch Western-Blot (vgl. auch nachstehend) unter Verwendung von etwa 1/3 bis 1/10 des Gesamtlysats einer konfluenten 21 mm-Vertiefung analysiert. Zur Überwachung der Funktionalität der T7-RNA-Polymerase wurde eine 35 mm-Zellkultur mit 4 μg pEMC-Luc (Deng et al., 1991) transfiziert, und die Luciferase-Aktivität in 1/125 des geklärten Gesamtlysats (Promega-Protokoll; Ernte 1 Tag nach der Transfektion) wurde in einem Luminometer gemessen. Clone, die die MV-N- und MV-P-Proteine vergleichbar mit einer gleichen Zahl von mit MV infizierten 293-Zellen exprimierten und eine möglichst hohe T7-RNAPolymerase-Aktivität zeigten, wurden gewählt, um ihre Fähigkeit zu testen, MV-DI RNAs die Expression von CAT zu ermöglichen. Hier wurden 5 μg der Plasmide p107MV(+):CAT, p107MV(–):CAT oder p(+)NP:CAT mit oder ohne 100 ng pEMC-La transfiziert. Nach 1 Tag wurden die Zellen lysiert, und 1/4 der geklärten Lysate wurde auf eine CAT-Aktivität getestet.
Beispiel 3: Plasmidkonstruktionen
Alle Clonierungsverfahren waren grundsätzlich wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben. PCR-Amplifikationen wurden unter Verwendung der korrekturlesenden Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) und von Primern mit einer 3'-terminalen Phosphorothioat-Bindung anstelle einer Phosphodiesterbindung (Skerra, 1992) durchgeführt. DNA-Sequenzen der synthetischen Oligonucleotide werden in Kleinschrift für Nicht-MV-Nucleotide und in Großschrift für MV-Nucleotide angegeben; Sequenzen von relevanten Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen sind unterstrichen. Die Konstruktion des Plasmids p107MV(–):CAT wird von Sidhu et al., 1995, beschrieben. Das Plasmid p107MV(+):CAT ist analog zu Plasmid p107MV(–):CAT. Der zusätzliche intercistronische Bereich von p(+)NP:CAT, der der intergenen N-P-Grenze ähnelt, wurde durch Insertion von
(5'-ctaGCCTACCCTCCATCATTGTTATMAMACTTAGGAACCAGGTCCACACAGCCGCCAGCCCAT-CAACgcgtatcgcgata-3', MV(+) 1717–1782) und des internen komplementären Oligonucleotids in die SpeI-Stelle des P-Gens konstruiert. Der PCR-amplifizierte CAT-codierende Bereich wurde, wie in 2 dargestellt, eingeführt.
Die Beschreibung des Aufbaus der ersten vollständigen MV-DNA, der Quelle der MV-Nucleotide 2044–14937 in späteren Versionen von vollständigen Clonen, wie peuT7MV(–) (siehe nachstehend), findet sich in Ballart et al., 1990. Die Hauptmerkmale des Plasmids p(+)MV (2) sind nachstehend beschrieben: Der T7-Promotor ermöglicht die genau mit dem ersten Nucleotid startende Synthese der antigenomischen MV-RNA. Das genomische Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym (δ) setzt nach einer Selbstspaltung das korrekte MV-3'-terminale Nucleotid frei. Unmittelbar stromabwärts des 8-Ribozyms stoppt der T7-RNA-Polymerasetenninator Tφ die meisten der transkribierenden Polymerasen. Dies stellt sicher, dass benachbarte Sequenzen, die vom Vektorhauptteil stammen, nicht die Spaltungsaktivität stören. Die Clonierung des p(+)MV begann durch Anelierung der beiden internen komplementären Oligonucleotide
#191 (5'-ggggaaccatcgatgga-taagaatgcggccgcaggtac-3')
und
#192 (5'-ctgcggccgcattcttatccatcgatggt-tccccgc-3')
wobei ein kurzer Polylinker, der die Restriktionsstellen für SacII, ClaI, NotI und KpnI trägt, erhalten wird. Dieser neue Polylinker ersetzte das SacII-KpnI-Fragment in pBloT7, das vom pBluescript KS(+) (Stratagene) stammte, das den an eine NsiI-Stelle fusionierten T7-Promotor enthielt (Kaelin, 1989), wobei das Plasmid pB1oT7NSCNK gebildet wurde. Zur Clonierung in den 5'-Terminus von 2041 bp des MV-Antigenoms (bis zur SacII-Stelle) folgte einer NsiI-Spaltung eine Behandlung mit der Klenow-Polymerase in Gegenwart aller vier dNTPs. Dies erzeugte einen glattendigen Clonierungsstellen-"Flush" zum nicht transkribierten Teil der T7-Promotorsequenz. Ein die Nucleotide 1 bis 2078 umfassendes MV-Fragment wurde vom 3351 bp-PvuI-Fragment von peuMV(–) durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer
#182 (5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGAT-AG-3', MV(+) 1–25)
und
#183 (5'-CAGCGTCGTCATCGCTCTCTCC-3', MV(–) 2077–2056)
erzeugt. Zu beachten ist, dass der zusätzliche A-Rest in Position MV(+) 30 (Sidhu et al., 1995), der von der MV-Sequenz von peuMV(–) stammte, später durch mutierende PCR deletiert wurde. Nach der SacII-Behandlung wurde das MV-Fragment in den Vektor ligiert, um pT7MV(+)5' zu erhalten. Anschließend wurde der 3'-Terminus des Antigenoms an die Sequenz von S gebunden, auf die stromabwärts T) folgte. Das MV-3'-Fragment (Nucleotide 14907–15894) wurde von dem 14046 bp-PvuI-Fragment von peuMV(–) durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer
#186 (5'-GAGAAGCTAGAG-GAATTGGCAGCC-3'; MV(+) 14907–14930)
und
#187 (5'-ttctgaagactcACCA-GACAAAGCTGGG-3', MV(–) 15894–15879)
erzeugt. Eine weitere PCR-Amplikation des Plasmids peu3a8Tφ mit den Primern
#184 (5'-ataagaatgcggccgcatccggatat-agttcctcc-3')
und
#FR4 (5'-ttctgaa-gactcTGGTggccggcatggtcccag-3', MV(+) 15891–15894)
lieferte das genomische HDV-Ribozym, das an Tφ gebunden war. Sowohl der Primer #FR4 als auch #187 enthalten in der Nähe ihrer 5'-Enden die Erkennungssequenz für BbsI, das ein klebriges Ende an beiden die vier 3'-terminalen MV-Nucleotide (MV(+) TGGT) umfassenden Fragmenten erzeugt. Nach den Spaltungen des MV-3'-Fragments mit ClaI und BbsI, des δ/Tφ-Fragments mit BbsI und NotI und von pT7MV(+)5' mit ClaI und NotI wurde durch eine Dreiwege-Ligierung das Plasmid pT7MV(+)5'3' δTφ erhalten. Der letzte Schritt zur Erzeugung von p(+)MV war das Auffüllen der verbleibenden antigenomischen MV-Nucleotide 2044–14937 durch eine Dreiwege-Ligierung. Das SacII-PacI-Fragment (MV(+)-Nucleotide 2044–7242) und das PacI-ClaI-Fragment (MV-Nucleotide 7243–14937) wurden vom Plasmid peuT7MV(–) freigesetzt. Diese beiden Fragmente wurden in pT7MV(+)5'3'δTφ ligiert, von dem die verbleibenden Polylinker (SacII-ClaI) entfernt wurden. Das Plasmid p(–)MV (2) wurde in ähnlicher Weise konstruiert. Die Selbstspaltungsaktivität von S wurde durch Nachweis der erwarteten kleinen 3'-Fragmente von in vitro hergestellten RNAs auf einem 5% Polyacrylamid/7M-Harnstoffgel gezeigt. Zur Erzeugung von p(+)MVΔSF, das eine 504 nt-Deletion (MV(+) 4926–5429) im 5'-nicht-codierenden Bereich des F-Gens trug, wurde zunächst eine PCR des Plasmids pAeF1 (Huber, 1993) unter Verwendung der Primer
#88 (5'-CcGAAT-CAAGACTCATCCAATGTCCAT-CATGG-3', MV(+) 5430–5461)
und
#89 (5'-AGAGAGATTGCCCCAATGGATTTGACCG-3', MV(–) 5550–5523)
durchgeführt. Das mit HpaI gespaltene PCR-Fragment ersetzte das NarI-HpaI-Fragment in pAeF1. Das NarI-PacI-Fragment dieses Vektors ersetzte anschließend das entsprechende Fragment in p(+)MV.
Der Hauptteil des Vektors von pEMC-La beruht auf pTM1 (Moss et al., 1990), in dem eine NcoI-Stelle mit einem ATG-Trinucleotid überlappt. Unter Verwendung dieses ATG als Startcodon wird ein in diese NcoI-Stelle eingeführter offener Leserahmen translational durch die interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) des Encephalomyocarditis (EMC)-Virus kontrolliert. Die MV-L-codierende Sequenz, die an einen künstlichen Poly(dA)-Abschnitt gebunden war, wurde vom Vektor pAeL (Huber, 1993) in zwei Schritten gewonnen: Zunächst wurde ein 405 bp-Fragment, das die MVNucleotide 9234 bis 9630 enthielt, durch PCR unter Verwendung der Primer
#194 (5'-gtggatccATGGACTCGCTATCTGTCAACC-3', MV(+) 9234 bis 9255)
und
#195 (5'-AGTTAGTGTCCCTTAAGCATTGGAAAACC-3', MV(–) 9630 bis 9602)
erzeugt; zweitens wurde ein 6265 bp-Fragment, das die Nucleotide 9572 bis 15835 der mit dem Poly(dA)-Abschnitt verknüpften MV-L-Gensequenz umfasste, mit EcoRI ausgeschnitten. Nach der Entfernung des NcoI-EcoRI-Teils des Polylinkers in pTM1 und Spaltung des PCR-Fragments auch mit NcoI und EcoRI wurde durch eine das 6265 bp-EcoRIFragment einschließende Dreiwege-Ligierung pEMC-La erhalten.
Zur Eliminierung des T7-Promotors, der 5'-seitig des CMV-Promotors/Enhancers in den Vektoren pSC-N und pSC-P lag (Huber et al., 1991), wurden pSC6-N und pSC6-P durch Ersatz eines PvuI-EcoRI-Fragments mit dem entsprechenden Fragment von pSP65 (Promega) konstruiert. pSC6-T7 wurde durch Austausch der N-Geninsertion von pSC6-N durch das Fragment, das das T7-RNAPolymerasegen von pAR 1173 trug (Davanloo et al., 1984), erzeugt. pSC6-T7-NEO wurde durch Ligierung der Phosphoglycerinkinase-Promotor-Neomycin-Resistenz-Kassette (Soriano et al., 1991) in die einzige AvrII-Stelle von pSC6-T7 unter Verwendung von geeigneten Linker-Oligodesoxyribonucleotiden konstruiert. Alle Clonierungsstellen wurden durch Sequenzierung bestimmt.
Beispiel 4: Transfektion von Plasmiden und Ernte von Reportergenprodukten
Die Zellen wurden in eine 35 mm-Vertiefung gesät, um zur Transfektion eine etwa 50 bis 70% Konfluenz zu erreichen. 3 bis 8 Stunden vor der Transfektion wurde das Medium durch 3 ml DMEM, das 10% FCS enthielt, ersetzt. G418 wurde fortan aufgrund seiner toxischen Wirkung während der Transfektion ausgeschlossen. Alle Plasmide wurden gemäß dem QIAGEN-Plasmid-Herstellungskit hergestellt. Das Protokoll für die Ca²⁺-Phosphat-Copräzipitation der DNA wurde von Rozenblatt et al. (1979) adaptiert. Die Plasmide (2 bis 10 μg pro 35 mm-Vertiefung) wurden mit 300 μl Ix-Transfektionspuffer (137 mM NaCl, 4,96 mM KCl, 0,7 mM Na₂HPO₄, 5,5 mM Dextrose und 21 mM HEPES, pH 7,03) verdünnt. 1 M CaCl₂-Lösung wurde zu einer Ca²⁺-Endkonzentration von 125 mM zugesetzt und das Gemisch 30 bis 120 Minuten bei 20°C inkubiert. Die Copräzipitate wurden tropfenweise zur Kultur zugesetzt und die Transfektion bei 37°C und 5% CO₂ etwa 15 Stunden durchgeführt. Anschließend wurde das Transfektionsmedium durch 3 ml DMEM, das 10% FCS enthielt, ersetzt. Die Produkte der Reportergene wurden 24 bis 37 Stunden nach der Transfektion geerntet. Die Zellen wurden gewaschen und mit Reporter-Lysepuffer (Promega) lysiert, und CAT und Luciferasetests wurden gemäß dem Protokoll des Lieferanten durchgeführt.
Beispiel 5: Versuchsaufbau zur Gewinnung von MV
293-3-46-Zellen, die wie vorstehend beschrieben zur Transfektion hergestellt wurden, wurden mit 5 μg des Plasmids, das die antigenomische MV-DNA enthielt, in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 bis 100 ng Plasmid, das die MV-L-mRNA spezifizierte, transfiziert. Als erstes erschienen Syncytien etwa 2 bis 3 Tage nach der Transfektion, als die Zellen noch subkonfluent waren. Zur Erleichterung der Syncytienbildung wurden beinahe konfluente einzellige Schichten von jeder 35 mm-Vertiefung anschließend auf ein 75 cm²-Gefäß transferiert. Bei einer Konfluenz dieser Kulturen wurden die Zellen in das Medium geschabt und einmal einem Gefrier-Auftau-Schritt unterzogen. Geklärte Überstände wurden zur Infektion von einzelligen Schichten von Verozellen entweder zur Züchtung von Virus-Stammlösungen oder zur Ernte von Gesamt-RNA zur Analyse verwendet.
Beispiel 6: RT-PCR, Zyklussequenzierung, Northern-Blot, Western-Blot, Immunofluoreszenz
Für die RT-PCR mit einer anschließenden Zyklussequenzierung wurden Verozellen mit den geklärten Virussuspensionen entweder aus gewonnenen Kulturen oder von späteren Passagen geerntet und die Gesamt-RNA gemäß Chomczynski und Sacchi (1987) isoliert. 2 μg Gesamt-RNAs wurden zunächst mit 10 pmol oder 1 nmol Hexamer-Zufallsprimer durch Erhitzen auf 80°C 1 Minute hybridisiert und anschließend auf Eis schnell abgekühlt. Reverse Transkriptionen wurden mit 200 E MMLV-RT (GIBCO BRL) in Gegenwart von 1 mM dNTPs in einem Puffer, der 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KC1, 2,5 mM MgCl₂, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin und 1 E RNAsin (Promega) enthielt, durchgeführt. Die Gemische wurden 10 Minuten bei 20°C gehalten, 1 Stunden bei 42°C inkubiert und durch Erhitzen 10 Minuten bei 95°C gestoppt. 1/10 der Reaktionsvolumen wurde als Matrizen zur PCR-Amplifikation mit den Primern
#59 (5'-ACTCGGTATCACTGCCGAG-GATGCAAGGC-3', MV(+) 1256–1284)
und
#183 (5'-CAGCGTCGTCATCGCTCTCTCC-3', MV(–) 2077–2056)
verwendet. Nach 40 Zyklen wurden die 822 bp-Fragmente unter Verwendung des QIAquick-Gelextraktionskits (QIAGEN) isoliert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden gemäß dem linearen Amplifikationsprotokoll (Adams und Blakesley, 1991) durchgeführt. Der Primer
#76 (5'-ctaGCCTAC-CCTCCATCATTGTTATAAAAAACTTAG-3', MV(+) 1717–1749)
wurde für den Marker im 5'-nicht-codierenden Bereich des P-Gens und der Primer
#6 (5'-ccggTTATAACAATGATGGAGGG-3', MV(–) 1740–1722)
für den Marker im 3 '-nicht-codierenden Bereich des N-Gens verwendet.
Die gesamte zelluläre RNA für die Northem-Blot-Analyse wurde von Verozellen unter Verwendung des TRI REAGENT^® (Molecular Research Center, Inc.) und die Poly(A)-RNA unter Verwendung von Oligo(dT)25-beschichteten superparamagnetischen Polystyrolkügelchen (Dynal) und einem magnetischen Partikelkonzentrator isoliert. Die RNA wurde durch ein 1 % Agarosegel in 6% Formaldehyd enthaltendem Fließpuffer einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Hybond-N⁺-Membran (Amersham) durch Kapillarelution in 20 × SSC transferiert. Die Filter wurden 4 Stunden bei 42°C vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 42°C in 50% (Vol./Vol.) Formamid, 1 M NaCl, 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat, 1 % SDS, Hefe-tRNA (0,1 mg/ml), die 2 × 10⁶ cpm/ml einer mit Prime-It II (Stratagen) hergestellten, [5-³²P] dATP-markierten DNA-Sonde enthielt, durchgeführt. Die nachstehenden DNA-Fragmente wurden fürs Zufallsprimen verwendet: das 1,4 kb SalI-BamHI-Fragment von pSC-M (Huber et al., 1991), das 1,7 kb-HpaI-PacI-Fragment von pCG-F und das 1,6 kb-SmaI-XbaI-Fragment von pSC-H (Huber et al., 1991). pCG, ein eukaryotischer Expressionsvektor, der einen SV40-Replikationsursprung und einen CMV-Promotor/Enhancer enthielt, wurde durch Deletion des L-Gens sowie der stromabwärts liegenden β-Globin-Spleiß-Stelle von pSC-L (Huber et al., 1991; Severne et al., 1988) und anschließende Insertion der β-Globin-Spleiß-Stelle (von pSG5-Stratagene) stromaufwärts eines neuen Polylinkers konstruiert. Das auf pCG beruhende Plasmid pCG-F enthält eine aus dem vollständigen F-Gen bestehende Insertion. Die Filter wurden in 2 × SSC 10 Minuten bei 20°C und zweimal in 2 × SSC und 1 % SDS 30 Minuten bei 65°C gewaschen. Die Banden wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Zur Analyse der Expression der MV-N- und MV-P-Proteine durch Western-Blot wurden die Zellen mit PBS gewaschen und die cytoplasmatischen Extrakte unter Verwendung von 300 μl Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8, 62,5 mM EDTA, 1 % NP-40, 0,4% Desoxycholat, 100 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 μg/ml Aprotinin) hergestellt. Etwa 1/60 der Gesamtlysate wurden auf einer 8% SDS-PAGE laufen gelassen und auf Immobilon-P-Membranen geblottet. Als erste Antikörper wurden entweder der polyclonale Kaninchen-anti-N-Antikörper #179 (von C. Oervell freundlicherweise zur Verfügung gestellt und gemäß Standardverfahren hergestellt) in einer 6.000-fachen Verdünnung in TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7,2–8, 150 mM NaCl und 0,05 % Tween 20) oder der polyclonale Kaninchen-anti-P-Antikörper #178 (Oervell und Norrby, 1980) in einer 3.000-fachen Verdünnung in TBST verwendet. Der zweite Antikörper war ein Schweine-anti-Kaninchen-Antikörper, der an Meerrettichperoxidase gekoppelt war, was die Sichtbarmachung der Banden durch das Hochchemilumineszenz-Kit (ECL^TM Amersham Life Science, RPN 2106) ermöglichte.
Zur Immunofluoreszenz-Mikroskopie wurden 293-3-46-Zellen für ein Gewinnungsexperiment auf 24 mm × 24 mm-Glasdeckgläschen in 35 mm-Vertiefungen ausgesät, über Nacht gezüchtet und, wie vorstehend beschrieben, transfiziert. 3 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit Aceton:Methanol (1:1) permeabilisiert, und eine indirekte Immunofluoreszenzmessung wurde im Wesentlichen wie beschrieben (Hancock et al., 1990; Oervell und Norrby, 1980) durchgeführt, außer dass PBS mit 1 mM MgCl₂ und 0,8 mM CaCl₂ versetzt und p-Phenylendiamin vom Objektträger weggelassen wurde. Virale M- und H-Proteine wurden unter Verwendung von monoclonalen Maus-anti-M-16BB2- und Maus-anti-H-129-Antikörpern (Sheshberadaran et al., 1983) und von an Rhodamin gekoppelten Kaninchen-anti-Maus-IgG [F(ab')2]-Antikörpern (Pierce, 31666) nachgewiesen.
Beispiel 7: Mini-, Midi- und vollständige Replikons spezifizierende genomische und anti-genomische Plasmide
Die in dieser Untersuchung verwendeten Plasmidkonstrukte sind in 2 dargestellt. p107MV(–):CAT und p107MV(+):CAT bezeichnen Genom- bzw. Antigenom-Sense-RNAs, in denen alle MV-codierenden Bereiche genau durch den CAT-codierenden Bereich ersetzt sind. In MV-infizierten Zellen oder in Helferzellen (siehe nachstehend) bewirken sie die Entstehung von Minireplikons und von einer mit einer Kappe versehenen und polyadenylierten CAT-mRNA, die den 5'N- und den 3'L-nichtcodierenden Bereich umfasst. p(+)NP:CAT, das ferner auch die MV-N- und MV-P-codierenden Bereiche in ihrem normalen MV-Sequenz-Zusammenhang enthält, bewirkt die Entstehung von Midireplikons. Die vollständigen oder partiell deletierten antigenomischen oder genomischen RNAs werden als p(+)MVΔ5F, p(+)MV und p(–)MV bezeichnet: Bei allen diesen Plasmiden lieferte eine Transkription mit der T7-RNA-Polymerase RNAs, die die authentischen Nucleotide der viralen genomischen bzw. antigenomischen Termini tragen (Sidhu et al., 1995). Die richtige Initiation wurde durch eine direkte Fusion des T7-Promotors (dem sein transkribierter Teil fehlte) an die genomische und antigenomische Sequenz erreicht. Der Beginn aller Transkripte mit den MV-spezifischen Nucleotiden ACC anstatt mit den T7-spezifischen GGG reduziert die RNA-Ausbeute um etwa eine Größenordnung, wie durch in vitro-Transkriptionsuntersuchungen unter Verwendung von Vorläuferplasmidkonstruktionen gezeigt wurde. Zur Vermittlung der Bildung der richtigen MV-3'-Termini wurde die Hepatitis-Delta-Virus-Genom-Ribozymsequenz (Perrotta und Been, 1990) unmittelbar benachbart zu den MV-3'-terminalen Nucleotiden cloniert; die Einführung der T7-Terminatoren erhöhte die Effizienz der Selbstspaltung.
Beispiel 8: Stabil MV-N- und MV-P-Protein sowie T7-RNA-Polymerase exprimierende Helferzellen
Die menschliche embryonische Nieren-Zelllinie 293 wurde aufgrund ihrer starken Permissivität für MV gewählt. Ferner können diese Zellen durch das Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren effizient transfiziert werden; 30 bis 60% der Zellen färbten sich 24 Stunden nach der Transfektion mit einem β-Galaktosidasecodierenden Plasmid blau.
Nach der Cotransfektion von 293-Zellen mit pSC6-N, pSC6-P und pSC6-T7-NEO, wie in den Beispielen beschrieben, wurden etwa 100 Kolonien bei einer Neomycinselektion vermehrt. Die Expression von N und P wurde durch Western-Blot überwacht und die Aktivität der T7-RNA-Polymerase durch Transfektion mit einem Reporterplasmid, das den Glühwürmchen-Luciferase codierenden Bereich unter der Kontrolle eines T7-Promotors enthielt, ermittelt. Viele Clone exprimierten hohe Niveaus von P, jedoch nur wenige coexprimierten N effizient. 3 zeigt eine N- und P-Expression der beiden selektierten Zelllinien auf Niveaus, die mit denen von MV-infizierten 293-Zellen vergleichbar waren; die in Clon 293-3-46 nachgewiesene T7-RNA-Polymerase-Aktivität gehörte zu den höchsten aller Clone, während sie etwa 100-fach niedriger in Clon 293-3-64 war, der sich für die Gewinnung von MV als ungeeignet erwies. Eine dritte Zelllinie, 293-3-43, die die drei Proteine auf mit den von 293-3-46 vergleichbaren Niveaus exprimierte, war auch im Gewinnungsverfahren aktiv.
Die Expression der eingeführten Gene reduzierte nicht die Empfindlichkeit für eine MV-Infektion. Die Helferzelllinie 293-3-46 verwendete prinzipiell die MV-Gewinnung, obwohl sie mit einer Geschwindigkeit wuchs, die 2 bis 3 Mal langsamer im Vergleich zur parenteralen 293-Linie war, und erwies sich nach mehr als 80 Zellteilungen bei Verdünnungen von 1:4 bis 1:8 als sehr stabil und vollständig funktionell.
Beispiel 9: Verwendung von Helfer-MVs bis zur MV-Gewinnung unter Verwendung der Helferzelle 293-3-46
Das MV-Gewinnungssystem wurde schrittweise entwickelt, was einen Funktionstest aller Bestandteile ermöglichte. Einerseits wurde die MV-abhängige Gewinnung von Mini- und später nach und nach längerer Midireplikons durch CAT-Reportertests überwacht. In ähnlicher Weise wurde andererseits die Funktionsfähigkeit der 293-3-46-Zellen mit den vorstehend beschriebenen, auf MV beruhenden Helferzellen verglichen (Sidhu et al., 1995).
Der Minireplikon-Gewinnungstest ist schematisch in 4A dargestellt. Kleine Transkripte von p107MV(–):CAT, p107MV(+):CAT (Sidhu et al., 1995) und später längeren Transkripten, z. B. von p(+)NP:CAT (2) erzeugte, verhielten sich wie Mini- bzw. Midireplikons. Sie wurden eingekapselt, zur Produktion von CAT transkribiert, repliziert und in Virionpartikel zur Infektion neuer Zellen verpackt. Während der ersten 2 bis 4 Infektionszyklen amplifizierten sie stark, während in späteren Zyklen die Replikation sowohl von MV als auch den Minireplikons beschnitten wurde, wie bei natürlich vorkommenden DI-RNAs beobachtet wurde (Re, 1991). Analysen der amplifizierten RNAs zeigten, dass die eingekapselten Replikons und die CAT-Transkripte die jeweiligen unterschiedlichen MV-spezifischen terminalen Bereiche enthielten (Sidhu et al., 1995). Das wichtigste Ergebnis war, dass für eine effiziente Funktion die Gesamtzahl der Nucleotide der Replikons ein Mehrfaches von sechs sein musste, eine Anforderung – mit der Bezeichnung „Sechser-Regel" –, von der zuvor festgestellt wurde, dass sie für natürliche und leicht modifizierte SeV-DI-RNAs des "Copy-back"-Typs wesentlich war (Calain und Roux, 1993). Das Einhalten dieser Regel war für die Konstruktion von Plasmiden wesentlich, die eine Reihe von Mini- und Midireplikons, wie die in 2 dargestellten, spezifizierten. Dies war auch der Fall für die vollständigen Clone.
Die Helferfunktion von stabil transfizierten Zellclonen wurde mit dem in 4B dargestellten Aufbau, jedoch entweder unter Verwendung von Plasmid p107MV(–):CAT, p107MV(+):CAT oder p(+)NP:CAT (2) anstelle von p(+)MV getestet. Wie in 5 dargestellt, entwickelte sich die CAT-Aktivität in den transfizierten Zellen, jedoch auf Niveaus, die beträchtlich niedriger als in mit MV infizierten und direkt mit Mini- oder Midireplikon-RNA cotransfizierten 293-Zellen waren. Die Cotransfektion des MV-L-Protein-codierenden Plasmids pEMC-La war absolut unerlässlich. Wie erwartet, wurde eine geringe Hintergrund-CAT-Aktivität nachgewiesen, wenn das Plus-Sense-Minireplikon-Konstrukt verwendet wurde. Die beiden Konstrukte, die nur den CAT-Leserahmen im Plus- und Minus-Sense enthielten, erzeugten etwa gleiche Mengen von CAT-Aktivität; das Midireplikon-Konstrukt bewirkte die Entstehung von etwa 100 Mal weniger CAT-Aktivität als das Minireplikon.
Das Transfektionsprotokoll wurde im Hinblick auf eine maximal erreichbare CAT-Aktivität unter Verwendung von Mini- und Midireplikon-Plasmiden optimiert. Anschließend wurden die vollständigen Konstrukte p(+)MV und p(–)MV getestet. Etwa 10⁶ Zellen, die in jeder 35 mm-Vertiefung enthalten waren, wurden transfiziert, und schätzungsweise erreichten etwa ein Zehntel davon tatsächlich die vollständige Länge sowie die L-codierenden Plasmide. Üblicherweise entwickelten sich nach der Cotransfektion von p(+)MV und pEMC-La 1 bis 6 Syncytien nach 2 bis 3 Tagen in jeder Vertiefung. Keine Syncytien wurden festgestellt, wenn letzteres weggelassen oder das p(–)MV-Plasmid verwendet wurde. Die Gewinnungsexperimente wurden durch verschiedene Experimentatoren unter Verwendung von verschiedenen DNA-Präparationen durchgeführt. Die Effizienz war etwas variabel, jedoch zeigten mindestens 30% der transfizierten Vertiefungen gewinnbares Material. 6 zeigt typische in diesen Experimenten gebildete Syncytien, die entweder direkt (Phasenkontrast, 6A) oder nach der Fixierung von auf Deckgläschen gezüchteten Zellen beobachtet wurden (Phasenkontrast, 6B, oder Immunofluoreszenz des gleichen Bereichs, 6C).
Beispiel 10: Charakterisierung von gewonnenen MVs
Zunächst musste sichergestellt werden, dass die gewonnenen MVs den in die vollständigen MV-Plasmid-Clone eingeführten genetischen Marker enthielten. Der in 2 dargestellte 3 nt-Marker stammte von einem variablen, 176 nt langen, nicht-codierenden N/P-Gengrenzbereich (NCGB), der vom SSPE stammenden MV gewonnen wurde, das in IP-3-Ca-Zellen replizierte (Ballart et al., 1990). Gewonnene Viren wurden entweder direkt von den transfizierten Zellen oder nach einer Plaque-Reinigung in Verozellen amplifiziert; die Produkte, die durch reverse Transkription mit einer anschließenden Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) gewonnen wurden, wurden durch Zyklussequenzierung analysiert. 7 zeigt ein Beispiel dieser Analysen, das den AG-Marker anstelle von CA im Labor der Erfinder passagierten Edmonston B-Stamm zeigt.
Es wurde nicht die vollständige Sequenz von gewonnenen MVs analysiert, um alle Fehler, die entweder während des Zusammenbaus der antigenomischen Plasmidclone oder während der Transkription durch die T7-RNA-Polymerase im Gewinnungsschritt eingeführt wurden, auszuschließen. Es konnten jedoch größere nachteilige Veränderungen durch Analyse des Replikationsverhaltens des gewonnenen Virus im Vergleich zu dem des Edmonston B-Stamms ausgeschlossen werden. 8 zeigt, dass sowohl die Replikationsgeschwindigkeit als auch die in wiederholten Experimenten erreichten Endtiter zwischen Einzelplaque-gereinigten normalen (MVEdB) und gewonnenen (MV-Marker-EdB) Viren ununterscheidbar waren. Der deutliche Unterschied am Tag 1 nach der Infektion wurde nur vorübergehend beobachtet. Nicht-Plaquegereinigte Virusstammlösungen lieferten ähnliche Ergebnisse.
Beispiel 11: MV, dem 504 Nucleotide im nicht-codierenden 5'-Bereich des F-Gens fehlten
Als erste Anwendung des reversen genetischen Systems wurden 504 Nucleotide deletiert, wodurch ein die vorstehend beschriebene „Sechser-Regel" einhaltendes verkürztes Genom erzeugt wurde. Dies eliminierte fast den vollständigen F-Genabschnitt des langen enigmatischen nicht-codierenden M/F-NCGB, der typisch ist für MV und die anderen Morbilliviren, während die Repräsentanten der beiden anderen Gattungen der Unterfamilie Paramyxoviridae, Paramyxovirus und Rubulavirus, nur einen kurzen NCGB enthalten. Überraschenderweise war es lebensfähig und ferner replizierte es in einer Zellkultur mit einer Geschwindigkeit, die von der des Edmonston B und des gewonnenen nicht-deletierten MV-Stamms (8, MVΔ5F EdB) ununterscheidbar ist. Zur Ermittlung der Größe der vom F-Gen stammenden RNAs wurde die MV-spezifische mRNA, die von diesen Plaque-gereinigten Viren induziert wurde, unter Verwendung von Sonden, die für die F- und für die stromaufwärts bzw. stromabwärts von F liegenden M- und H-Gene spezifisch sind, analysiert. Wie in 9 dargestellt, sind die F-mRNA sowie die MF- und FH-bicistronischen RNAs tatsächlich kürzer in mit der MVΔ5F EdB-Variante infizierten Zellen.
Beispiel 12: CAT-Aktivität-exprimierende MVs
Zur Untersuchung der Durchführbarkeit einer Expression von Fremdproteinen von manipulierten MVs wurde ein von intercistronischen Bereichen flankierter CAT-Leserahmen in die antigenomische MV-cDNA-Sequenz eingeführt; zwei Positionen wurden getestet, einerseits zwischen dem N- und P- und andererseits zwischen dem H- und L-Gen (10, p(+)MPCATV bzw. p(+)MHCATV). Der den CAT-Leserahmen flankierende intercistronische Bereich wurde gemäß dem intercistronischen N/P-Gen-Grenzbereich entwickelt, enthält jedoch weitere im ganzen Plasmid einmalige Restriktionsstellen, die für weitere Manipulationen geeignet sind: Von diesen Konstrukten wurden CAT-Aktivität-exprimierende rekombinante MVs mit etwa der gleichen Effizienz wie vom Standard und den deletierten Konstruktionen p(+)MV bzw. p(+)MVΔ5FV gewonnen. Wie vom für alle Mononegavirales typischen natürlichen Transkriptionsgradienten erwartet wurde, exprimierte p(+)MHCATV etwas weniger CAT-Aktivität als p(+)MPCATV. Am wichtigsten ist, dass die CAT-Expression der rekombinanten Viren anscheinend bemerkenswert stabil erscheint, wie in dem in der Legende zu 12 erwähnten Experiment gezeigt wurde, in dem eine Gesamtamplifikation der rekombinanten Viren von mindestens 10³⁰ erreicht wurde. Es wurde eigentlich erwartet, dass von p(+)MPCATV gewonnene Viren weniger stabil als die von p(+)MHCATV waren, da in jenem die Transkription von allen Genen gemäß der eingeführten CAT erwartungsgemäß geringer als normal sein sollte, während im letzteren nur die L-Gen-Transkription geringer sein sollte. Augenscheinlich beeinflusst die Position der Insertion die Lebensfähigkeit der gewonnenen Viren nicht stark. Jedoch wurden bisher keine Konkurrenzexperimente mit Standard-MVs durchgeführt. Ferner muss erwartet werden, dass sich herausstellt, dass rekombinante Viren, die die MV-Replikation aktiv störende Proteine exprimieren, das eingeführte Gen weniger zuverlässig behalten.
Es muss hier erwähnt werden, dass die Insertion einer fremden codierenden Sequenz in vorhandene MV-Gene für die virale Replikation sogar noch weniger schädlich ist als die Erzeugung von neuen Transkriptionseinheiten wie in den vorstehend beschriebenen Konstrukten. Die allgemeine Unfähigkeit der eukaryotischen Translationsmaschinerie zur Expression von mehr als einem Leserahmen von einer mRNA kann grundsätzlich durch (mindestens) zwei Vorrichtungen überwunden werden: durch den Stop/Neustart-Mechanismus und interne Ribosomeneintrittsstellen (IRES). Beide Mechanismen werden tatsächlich in speziellen Fällen für die natürliche Proteinexpression verwendet. Ein Beispiel für den ersten Fall ist die Translation des M2-Polypeptids im Influenza B-Virus (Horvath, C.M., Williams, M.A., und Lamb, R.A., Eukaryotic coupled translation of tandem cistrons; identification of the influenza B virus BM2 polypeptide (EMBO J. 9 (1990), 2639–2947). Für den zweiten Mechanismus gibt es viele anerkannte natürliche Präzedenzfälle, besonders die IRES von Picomaviridae (Sonenberg, N., Poliovirus translation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 161 (1990), 23–47), jedoch auch IRES in zellulären mRNAs, wie den BiP spezifizierenden (Sarnow, P. (1990) Translation of glucose-regulated protein 78/immunoglobulin heavy-chain binding protein mRNA is increased in poliovirusinfected cells at a time when capdependent translation of cellular RNA is inhibited). Sämtliche zitierten Vorrichtungstypen wurden im Zusammenhang mit den MV-N- und MV-H-Genen unter Verwendung von codierenden Bereichen stromabwärts der MV-N- und MV-H-Leserahmen erforscht, die CAT bzw. Glühwürmchen-Luciferase als Reporter lieferten. Die gesamten bicistronischen Konstrukte wurden von üblichen Expressionsplasmiden in Primatenzellen exprimiert und Ausbeuten von Reporterproteinen im Bereich von 10 bis 100% im Vergleich zu von Leserahmen stromaufwärts codierten Proteinen erhalten (Diplomarbeiten, University of Zürich, Verfasser sind A. Cathomen (1991) und O. Peter (1992)).
Beispiel 13: VSV-Hüllprotein-tragende MV-Chimäre
Zur Untersuchung der Durchführbarkeit der Gewinnung von genetisch stabilen chimären Mononegavirales, in denen die Hüllproteine eines Virus durch die eines anderen Virus ersetzt sind, wurden p(+)MGV und pMG/FV (10) konstruiert. In jenem Konstrukt wurden die vollständigen MV-F- und MV-H-codierenden Bereiche durch den Bereich ersetzt, der das VSV-G-Protein codiert, das eine Rezeptorbindung und eine Fusionsfunktion, die zu denen der MV-H- bzw. MV-F-Proteine analog ist, ausfüllt. Das letzte Konstrukt wurde so entwickelt, dass ein Fusionsprotein erzeugt wird, das den großen Außenbereich und den Transmembranbereich des VSV-G-Proteins enthält, das mit dem cytoplasmatischen Schwanz des MV-F-Proteins fusioniert ist, von dem angenommen wird, dass er spezifisch mit dem MV-M-Protein interagiert. Tatsächlich konnten chimäre Viren von beiden Konstrukten gewonnen werden, die voneinander nur durch leicht unterschiedliche cytopathische Wirkungen (die sich beide drastisch von den durch MV erzeugten unterscheiden) und durch die Tatsache unterschieden werden können, dass in Zellen, die durch das vom letzteren Konstrukt gewonnene Virus infiziert sind, der Western-Blot-Nachweis des Fusionsproteins nicht nur durch Antikörper gegen die VSV-G-Exodomäne, sondern auch durch Antikörper gegen den cytoplasmatischen MV-F-Schwanz gelang. Beide Chimären replizierten, wie durch Endpunktverdünnungen ermittelt wurde, zu vernünftig hohen Titern, wobei diese nur etwa eine Größenordnung niedriger als die durch MV erhaltenen Titer waren. Ferner zeigten sie die erwarteten biologischen Spezifitäten: Sie infizieren leicht Nagerzellen (die keinen MV-Rezeptor exprimieren), wie BHK (11 und 12), wo sie reichlich cytoplasmatische und nucleäre RNPs bilden, die für MV typisch sind (11), sowie pleomorphe Partikel, die den MV-Virionen gleichen (12), die sich vollständig von den festschaligen oder zigarrenförmigen VSV-Virionen (13) unterscheiden, von denen angenommen wird, dass sie primär durch das VSV-M-Protein gebildet werden.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass MV und VSV nur sehr entfernt verwandte Mononegavirales sind und eigentlich zu verschiedenen Familien (Paramyxoviridae bzw. Rhabdoviridae) gehören, scheint es ziemlich wahrscheinlich zu sein, dass viele verschiedene Chimäre, die enger verwandte Mononegavirales einschließen, erzeugt werden können, und es scheint nicht unrealistisch zu sein, dass auch Chimäre, die Hüllproteine mit bestimmten Zellrezeptoren als Ziel enthalten, entwickelt werden können.
LITERATURHINWEISE

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Claims

Verfahren zur Herstellung eines infektiösen nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie der Paramyxoviridae, umfassend: (a) Einführung eines cDNA-Moleküls, umfassend die gesamte (+)-Strangsequenz des Negativ-Strang-RNA-Virus, funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden, welche die Synthese von die authentischen 3'-Termini umfassenden antigenomischen RNA-Transkripten ermöglicht, in eine Helferzelle, die eine RNA-Polymerase exprimiert, vorzugsweise T7-RNA-Polymerase, ein N- und ein P-Protein, vorzugsweise des zu gewinnenden Virus, wobei die Proteine von stabil transfizierten Expressionsplasmiden exprimiert werden, und des Weiteren ein L-Protein, vorzugsweise des zu gewinnenden Virus, codiert von einer in einem Plasmid enthaltenen cDNA, das entweder transient oder stabil in die Zelle eingeführt worden ist; und (b) Gewinnung des assemblierten infektiösen nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Expressionskontrollsequenz von 1(a) ein RNA-Polymerase-Promotor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das cDNA-Molekül in einem Plasmid enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Plasmid ein exprimierbares DNA-Fragment enthält, welches eine homologe DNA-Region des cDNA-Moleküls ersetzt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Plasmid ein exprimierbares DNA-Fragment enthält, das zusätzliche genetische Information bereitstellt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Plasmid ein exprimierbares DNA- Fragment enthält, das eine heterologe DNA-Region des cDNA-Moleküls ersetzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Plasmid dadurch gekennzeichnet ist, dass das exprimierbare DNA-Fragment in eine Region der cDNA eingefügt ist, die ein virales Protein codiert, wobei die Insertion in einer Weise ausgeführt ist, die das Leseraster beibehält, vorzugsweise um ein Fusionsprotein herzustellen, und die Expression des DNA-Fragments unter der Kontrolle der Signalsequenzen des viralen Proteins ermöglicht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Plasmid dadurch gekennzeichnet ist, dass das exprimierbare DNA-Fragment derart stromabwärts von einer viralen Protein-codierenden Region exprimiert wird, dass die Bildung eines Fusionsproteins vermieden, aber nichtsdestotrotz die Expression der stromabwärts befindlichen codierenden Sequenz ermöglicht wird, entweder durch einen Stop-/Neustart-Mechanismus, wobei der letzte A-Rest des stromaufwärts liegenden Terminationstriplets mit demjenigen des Startcodons der stromabwärts liegenden codierenden Region übereinstimmt, oder durch das Platzieren einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES) zwischen die beiden codierenden Regionen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Plasmid dadurch gekennzeichnet ist, dass das exprimierbare DNA-Fragment in eine nicht codierende Region der cDNA eingefügt ist und durch virale Signalsequenzen oder heterologe Signalsequenzen flankiert wird, die die Expression des durch das DNA-Fragment bestimmten RNA-Fragments kontrollieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei das Plasmid eine genomische Ribozymsequenz umfasst, die unmittelbar benachbart ist zum 3'-terminalen Nucleotid des cDNA-Moleküls, und gegebenenfalls stromabwärts der genomischen Ribozymsequenz mindestens einen Terminator, vorzugsweise den T7-Terminator.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die genomische Ribozymsequenz die genomische Ribozymsequenz des Hepatitis-Delta-Virus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei das Plasmid in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt replizieren kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 12, wobei das exprimierbare DNA-Fragment des Plasmids ein in Bezug auf das Negativ-Strang-RNA-Virus homologes oder heterologes DNA-Fragment ist und mindestens ein immunogenes Epitop codiert.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das exprimierbare DNA-Fragment des Plasmids mindestens ein immunogenes Epitop von mindestens einem Pathogen codiert, vorzugsweise von einem Hüllprotein, oder mindestens ein Genprodukt, das in genetisch defekten Individuen fehlt oder toxisch für angegriffene maligne Zellen ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das exprimierbare DNA-Fragment des Plasmids von einem Virus, einem Bakterium oder einem Parasiten stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 15, wobei das exprimierbare DNA-Fragment des Plasmids ein immunogenes Epitop codiert, das eine schützende Immunantwort hervorrufen kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Negativ-Strang-RNA-Virus das Masern-Virus oder das Mumps-Virus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei in der Helferzelle die das N-, P- und L-Protein codierenden Gene vom Masern- oder Mumps-Virus stammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Helferzelle von der menschlichen embryonischen Nierenzelllinie 293 (ATCC CRL 1573) stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das Verhältnis des in einem der Ansprüche 3 bis 19 definierten Plasmids und des Plasmids, welches DNA beinhaltet, die das virale L-Protein codiert, etwa 1000:1 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Gewinnung des Virus direkt von der transfizierten Helferzellkultur nach Syncytien-Bildung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Gewinnung des Virus nach Vermischen der transfizierten Helferzelle mit anderen Zellen erfolgt, die infektionskompetent sind und das Virus replizieren können.