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Bereich der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen viralen Vektor zur Gentherapie.
Genauer betrifft diese Erfindung einen Negativstrang-RNA-Virusvektor.
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Hintergrund
der Erfindung
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Im
Zusammenhang mit der Gentherapie an Mensch und Tier sind therapeutische
Wirksamkeit und Sicherheit sehr wichtige Faktoren. Insbesondere
eine Therapie, die unter Verwendung eines „viralen Vektors" oder „Virusvektors", erhalten durch
die virale Genrekombination, durchgeführt wird, muss sehr vorsichtig durchgeführt werden,
wenn solche unbestreitbaren Möglichkeiten
existieren, wie dass ein Gen an unspezifischen Stellen von chromosomaler
DNA eingefügt
werden kann, dass das rekombinante Virus und pathogene Virus in
die natürliche
Umgebung entlassen werden kann und dass die Expressionsstärke des
in die Zellen transfizierten Gens nicht kontrolliert werden kann
oder Ähnliches,
selbst wenn die therapeutische Wirksamkeit anerkannt wird.
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Heutzutage
wird eine große
Anzahl von Gentherapien unter Verwendung rekombinanter Viren durchgeführt, und
es werden viele klinische Gentherapiepläne vorgeschlagen. Die Kennzeichen
dieser rekombinanten viralen Vektoren hängen zum größten Teil von denen der Viren
ab, von denen die Vektoren abgeleitet werden.
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Das
wesentliche Prinzip eines viralen Vektors ist ein Verfahren zum Übertragen
des gewünschten Gens
auf Zielzellen unter Nutzung der viralen Infektiosität. Der Begriff „Infektiosität" in dieser Beschreibung
bedeutet die Fähigkeit
eines Virus, seine Nukleinsäure
etc. in Zellen durch seine erhaltene Adhäsivität an Zellen und Fähigkeit
zur Fusion mit der Membran zu übertragen.
Mit der Oberfläche
von rekombinanten viralen Vektoren, die genetisch manipuliert sind,
um ein gewünschtes
Gen einzufügen,
sind die Nukleokapside und Hüllproteine
etc. verbunden, die aus dem Virus abgeleitet werden und dem rekombinanten
Virus die Infektiosität verleihen.
Diese Proteine erlauben den Transfer des eingeschlossenen rekombinanten
Gens in Zellen. Derartige rekombinante virale Vektoren können nicht
nur zum Zweck der Gentherapie verwendet werden, sondern auch zur
Produktion von Zellen, die ein gewünschtes Gen exprimieren, ebenso
wie transgene Tiere.
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Virale
Vektoren werden in drei Klassen unterteilt, welche den retroviralen
Vektor, den DNA-Virusvektor und
den RNA-Virusvektor umfassen.
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Heutzutage
sind die in der Gentherapie am häufigsten
verwendeten Vektoren retrovirale Vektoren, die aus Retroviren stammen.
Retroviren replizieren sich durch die folgenden Vorgänge. Zunächst erzeugen
sie, nachdem eine virale Infektion begründet ist, komplementäre DNAs
(complementary DNA, cDNA) unter Verwendung ihrer eigenen reversen
Transkriptase als mindestens einem Teil der Katalysatoren und ihrer
eigenen RNA-Matrizen. Nach mehreren Schritten werden die cDNAs in
die chromosomalen DNAs des Wirts aufgenommen, wodurch Proviren entstehen.
Proviren werden durch die DNA-abhängige RNA-Polymerase, die aus
dem Wirt stammt, transkribiert, wodurch virale RNAs erzeugt werden,
die durch die Genprodukte, die durch eigenen Gene kodiert werden,
verpackt werden, wodurch virale Partikel entstehen.
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Im
Allgemeinen sind retrovirale Vektoren, die in der Gentherapie etc.
verwendet werden, in der Lage, die Vorgänge bis zur Erzeugung eines
Provirus durchzuführen.
Allerdings gibt es defiziente Viren, denen die Gene, die zu ihrer
Verpackung notwendig sind, entzogen sind, so dass sie keine Viruspartikel
aus dem Provirus bilden. Retroviren werden beispielsweise durch
das Mäuseleukämie-Virus,
Katzenleukämie-Virus,
Pavian-Onkovirus Typ C, menschliches Immunschwäche-Virus, adulte-T-Zell-Leukämie-Virus
etc. verkörpert.
Weiterhin wurde bisher berichtet, dass rekombinante retrovirale
Vektoren jene einschließen,
die sich vom Mäuseleukämie-Virus
[siehe Virology, 65, 1202 (1991), Biotechniques, 9, 980 (1989),
Nucleic Acids Research, 18, 3587 (1990), Molecular and Cellular
Biology, 7, 887 (1987), Proceedings of National Academy of Sciences
of United States of America, 90, 3539 (1993), Proceedings of National
Academy of Sciences of United States of America, 86, 3519 (1989),
etc.] ableiten, und jenen, die sich vom menschlichen Immunschwäche-Virus
[siehe Journal of Clinical Investigation, 88, 1043 (1991)] ableiten.
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Retrovirale
Vektoren werden hergestellt mit dem Ziel, wirksam eine bestimmte
DNA in chromosomale DNA zu integrieren. Da allerdings die Insertionsposition
des gewünschten
Gens nicht vorher zu sagen ist, gibt es unbestreitbare Möglichkeiten,
wie etwa die Beschädi gung
normaler Gene, die Aktivierung von Onkogenen und die exzessive oder
suppressive Expression des gewünschten
Gens aufgrund einer Inaktivierung durch die Insertion. Um diese
Probleme zu lösen,
ist ein System zur transienten Expression unter Verwendung von DNA-Virusvektoren, die
als extrachromosomale Gene verwendet werden können, entwickelt worden.
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DNA-Virusvektoren
werden von DNA-Viren abgeleitet, die DNA als genetische Information
in viralen Partikeln tragen. Die Replikation dieser DNA wird durch
das Wiederholen des Vorgangs aus Erzeugen eines komplementären DNA-Strangs
unter Verwendung einer DNA-abhängigen DNA-Replikase,
die aus einem Wirt stammt, als mindestens einem der Katalysatoren
mit der eigenen DNA als Matrize durchgeführt. Die eigentliche Gentherapie,
die einen adenoviralen Vektor, einen DNA-Virusvektor, der als extrachromosomales
Gen verwendet werden kann, verwendet, wird in dem Artikel [Nature
Genetics, 3, 1–2,
(1993)] veranschaulicht. Da allerdings im Fall von DNA-Virusvektoren
das Auftreten ihrer unerwünschten
Rekombination mit chromosomaler DNA im Nukleus ebenfalls hoch wahrscheinlich
ist, sollten sie als Vektoren zur Gentherapie sehr vorsichtig angewendet
werden.
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Kürzlich sind
RNA-Virusvektoren auf der Grundlage von RNA-Viren entwickelt worden
als denkbar sicherere Vektoren als die oben beschriebenen DNA-Virusvektoren.
RNA-Viren replizieren durch das Wiederholen der Vorgänge zum
Erzeugen komplementärer
Stränge
unter Verwendung ihrer eigenen RNA-abhängigen RNA-Replikase als dem
Katalysator mit ihrer eigenen RNA als Matrize.
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Die
genomische RNA von Positivstrang-RNA-Viren weist Doppelfunktionen
als messenger-RNA
(im Folgenden einfach als mRNA bezeichnet) auf, die Proteine erzeugt,
was von den translationalen Funktionen der Wirtszellen abhängig ist,
wichtig für
die Replikation und Bildung von Viruspartikeln. Mit anderen Worten, die
genomische RNA von Positivstrang-RNA-Viren selbst hat eine Fähigkeit
zur Verbreitung. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck „Fähigkeit
zur Verbreitung" oder „disseminative
Fähigkeit" die Fähigkeit,
infektiöse
Partikel oder ihre äquivalenten
Komplexe zu bilden und sie in anderen Zellen nach dem Transfer der
Nukleinsäure
in Wirtszellen durch Infektion oder künstliche Techniken und die
intrazelluläre
Replikation der Nukleinsäure
zu verbreiten. Das Sindbis-Virus, das den Posivitstrang-RNA-Viren
zugeordnet wird, und das Sendai-Virus, das den Negativstrang-RNA-Viren zugeordnet
wird, weisen sowohl Infektiosität
als auch die Fähigkeit
zur Verbreitung auf. Das Adenosatelliten-Virus, das den Parboviren
zugeordnet wird, ist infektiös,
verbreitet sich jedoch nicht (es ist eine gemischte Infektion mit
einem Adenovirus für
die Bildung von Viruspartikel erforderlich). Weiterhin verbreitet
sich die Positivstrang-RNA, die aus dem Sindbis-Virus stammt, die
in vitro künstlich
transkribiert wird (sie bildet infektiöse Viruspartikel, wenn Zellen
damit transfiziert werden), jedoch verbreiten sich weder positive
noch negative RNA-Stränge
des Sendai-Virus, die in vitro künstlich
transkribiert werden (sie erzeugen keine infektiösen Viruspartikel, wenn Zellen
damit transfiziert werden).
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Im
Hinblick auf den Vorteil, dass die genomische RNA gleichzeitig als
mRNA fungiert, ging die Entwicklung von RNA-Virusvektoren, die aus
Positivstrang-RNA-Viren stammen, voran [siehe Bio/Technology, 11, 916–920 (1993),
Nucleic Acids Research, 23, 1495–1501 (1995), Human Gene Therapy,
6, 1161–1167
(1995), Methods in Cell Biology, 43, 43–53 (1994), Methods in Cell
Biology, 43, 55–78
(1994)]. Beispielsweise weisen RNA-Virusvektoren, die sich von dem
Semliki-Forest-Virus (SFV) und dem Sindbis-Virus ableiten, im Wesentlichen
die RNA-Struktur auf, wobei die Strukturgenregionen, die mit der
Virusstruktur in Beziehung stehen, deletiert sind, und eine Gruppe
von Genen, welche die Proteine kodieren, die zur viralen Transkription
und Replikation wichtig sind, bleibt in einem gewünschten
Fremdgen, das stromabwärts
vom Transkriptionspromotor verknüpft
ist, erhalten. Ein direkter Transfer derartiger rekombinanter RNA
oder cDNA, welche die RNA [Nucleic Acids Research, 23, 1495–1501 (1995)]
in Zellen durch Microinjektion etc. transkribieren kann, erlaubt
eine autonome Replikation von RNA-Vektoren, die das Fremdgen enthalten,
und die Transkription des Fremdgens, das stromabwärts von
dem Transkriptionspromotor eingefügt ist, was zur Expression
des gewünschten
Produkts von dem Fremdgen in Zellen führt. Weiterhin waren die Erfinder
der vorliegenden Erfindung erfolgreich beim Bilden eines infektiösen, sich
aber nicht verbreitenden Komplexes durch die Co-Präsenz einer
cDNA-Einheit (Helfer) zum Exprimieren des viralen Strukturgens und
zum Exprimieren des RNA-Vektors in den verpackenden Zellen. Allerdings
tritt eine Rekombination zwischen RNA, die aus einem Helfer stammt,
und Vektor-RNA häufig
während
des Verpackens auf, was zu dem Auftauchen infektiöser Partikel
führt.
Dann klärte sich
auf, dass Spike-Proteine, die in den ikosahedralen Kapsiden, die
für Positivstrang-RNA-Viren
charakteristisch sind, vorhanden sind, diese Rekombination katalysieren.
Deshalb wurde versucht, diese Probleme durch das Einführen einer
Variation in den Spike-Proteinen zu lösen [Bio/Technology, 11, 916–920 (1993)].
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Es
wird angenommen, dass Positivstrang-RNA-Virusvektoren als RNA-Vektoren
mit einer Fähigkeit zur
autonomen Replikation nützlich
sind, ihre Verwendung als Vektoren zur Gentherapie wirft jedoch
folgende Probleme auf:
- 1. Da sie die ikosahedrale
Struktur aufweisen, ist die Größe eines
Fremdgens, dessen Einfügen
möglich gemacht
wird, auf höchstens
3700 Nukleotide begrenzt.
- 2. Da die Nukleinsäuren
aus dem verpackten Komplex in die Zellen freigesetzt und repliziert
werden, sind mindestens fünf
Durchgänge
erforderlich, einschließlich
zellulärer
Adhäsion,
Endozytose, Membranfusion, Dekapsidation und Translation von Replikationsenzymen.
- 3. Eine mögliche
Bildung sich verbreitender Viruspartikel, selbst in geringster Menge,
während
des Verpackens kann nicht ausgeschlossen werden. Insbesondere mit
abgeschwächten
Viruspartikeln weist die innere RNA selbst eine Potenz zur Verbreitung
auf und kann verspätet
amplifiziert werden, was eine Überprüfung schwierig
macht.
- 4. Da sich diese Vektoren von Viren ableiten, die auf Tiere
durch Insekten, wie etwa Stechmücken, übertragen
werden können,
können,
wenn die Tiere und Menschen, auf die derartige Vektorgene übertragen
werden, gemischt mit Wildtyp-Viren infiziert sind, sich verbreitende
Rekombinanten gebildet werden, die möglicherweise weiter ein Risiko
schaffen, dass die Rekombinanten in die natürliche Umgebung durch Insekten ausgestreut
werden.
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Derartige
Probleme, wie oben beschrieben, werden als im Wesentlichen überwunden
betrachtet, wenn RNA-Virusvektoren, die von Negativstrang-RNA-Viren
stammen, konstruiert werden. Dies bedeutet, da Negativstrang-RNA-Viren
nicht das Kapsid mit der ikosahedralen Struktur aufweisen und auch,
da bekannt ist, dass die Größe von Hüllpartikeln
in Abhängigkeit
von dem inneren RNA-Gehalt variiert, wird angenommen, dass sie viel
weniger durch die Größe von einzufügenden Fremdgenen
begrenzt werden, wenn sie als RNA-Virusvektoren verwendet werden.
Da weiterhin eine Gruppe von Proteinen, die zur Transkription und
Replikation erforderlich ist, in Partikel verpackt wird, sind nur
zwei Durchgänge
erforderlich, einschließlich
zellulärer
Adhäsion
und Membranfusion, bis Nukleinsäuren
aus dem verpackten Komplex freigesetzt und repliziert werden. Zusätzlich verbreitet
sich virale RNA nicht allei ne, und sich verbreitende Partikel können leicht
identifiziert werden, da sie leicht mit einer Zellmembran fusionieren
und in Zellen proliferieren. Deshalb kann das Vorhandensein sich
verbreitender Partikel leicht nachgewiesen werden. Weiterhin werden
Negativstrang-RNA-Viren nicht
durch Insekten übertragen.
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Trotz
vieler Vorteile von Negativstrang-RNA-Viren, die als Quelle industriell
nützlicher
viraler Vektoren verwendet werden können, sind keine Negativstrang-RNA-Vektoren,
die zur Gentherapie anwendbar sind, bis heute verfügbar geworden.
Dies ist wahrscheinlich auf die enormen Schwierigkeiten beim Rekonstituieren
viraler Partikel durch virale cDNA zurückzuführen. Da die Genmanipulation
auf DNA-Ebene erforderlich ist, um Fremdgene in Vektoren einzufügen, sofern
Viruspartikel nicht aus viraler cDNA mit einem eingefügten Fremdgen
rekonstruiert werden, ist es schwierig, Negativstrang-RNA-Viren
als Vektor zu verwenden. Der Ausdruck „Rekonstruktion viraler Partikel" oder „Rekonstruktion
von Viruspartikeln" bezieht
sich auf die Bildung eines ursprünglichen
Virus oder eines rekombinanten Virus in vitro oder intrazellulär aus künstlich
hergestellten Nukleinsäuren
des viralen Genoms.
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Wie
oben beschrieben ist eindeutig gezeigt worden, dass, selbst wenn
RNA von Negativstrang-RNA-Viren (viral RNA, vRNA) oder RNA ihres
Komplementärstrangs
(complementary RNA, cRNA) alleine in Zellen übertragen wird, kein Negativstrang-RNA-Virus
erzeugt werden kann. In diesem Punkt besteht definitiv ein Unterschied
zu dem Fall von Positivstrang-RNA-Viren. Obwohl in Tokkai H4-211377, „Verfahren zum
Herstellen von cDNA, die dem Negativstrang-RNA-Virusgenom entsprechen
und eines infektiösen
Negativstrang-RNA-Virus" beschrieben werden,
erwiesen sich die gesamten Experimente des in „EMBO J., 9, 379–384 (1990)" beschriebenen Dokuments
später
als nicht reproduzierbar, so dass die Autoren selbst den gesamten
Inhalt des Artikels zurücknehmen
mussten [siehe EMBO J., 10, 3558 (1991)]. Deshalb ist offensichtlich,
dass die in Tokkai H4-211377 beschriebenen Techniken mit dem Stand
der Technik der vorliegenden Erfindung nichts zu tun haben.
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Im
Hinblick auf das System zur Rekonstitution von Negativstrang-RNA-Viren
gibt es Berichte zum Influenza-Virus [Annu. Rev. Microbiol., 47,
765–790
(1993); Curr. Opin. Genet. Dev., 2, 77–81 (1992)]. Das Influenza-Virus
ist ein Negativstrang-RNA-Virus mit acht Segmenten. Nach dieser
Literatur wurde ein Fremdgen zunächst
in eine cDNA, die einem der Segmente entsprach, eingefügt, und
die RNA, die von der cDNA transkribiert wurde, die allen acht Segmenten,
einschließlich
demjenigen, in das das Fremdgen eingefügt war, entsprach, wurde mit
dem virusabgeleiteten NP-Protein zusammengesetzt, um ein RNP zu
bilden. Dann wurde das System zur Virusrekonstitution etabliert,
indem Zellen mit diesen RNPs und RNA-abhängiger
RNA-Polymerase verfügbar
gemacht wurden. Zusätzlich
wurde, wie bei Negativ-Einzelstrang-RNA-Viren, über eine
Virusrekonstitution von cDNA mit dem Rabies-Virus, das zu den Rhabdoviren
gehört,
berichtet [J. Virol., 68, 713–719
(1994)].
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Allerdings
ist es schwierig gewesen, diese Techniken zur Virusrekonstitution
als solche zum Konstruieren von Vektoren zur Gentherapie aufgrund
folgender Probleme zu verwenden.
- 1. Rekonstituierte
Viren werden nur durch die Expression eines Markergens, RT-PCR etc.
identifiziert. Ein System zur Rekonstitution, das zur Produktion
von Vektorviren mit einer befriedigenden Ausbeute nützlich ist,
ist nicht etabliert worden.
- 2. Um Komplexe mit Infektiosität, jedoch ohne die Potenz zur
Verbreitung, als Vektoren zur Gentherapie zu bilden, ist es anders
als bei Positivstrang-RNA-Viren notwendig, Faktoren einzuschließen, die
zur primären Transkription
und Replikation in dem Komplex erforderlich sind. Eine Technik zum
Amplifizieren dieser Komplexe im Großmaßstab ist nicht etabliert worden.
- 3. Zu dem Zweck, Faktoren, die zur viralen Rekonstitution notwendig
sind, intrazellulär
verfügbar
zu machen, werden Zellen, in die cDNAs eingeführt werden, mit Helferviren,
wie etwa Wildtyp-Viren und dem Vaccinia-Virus etc., gemischt infiziert.
Es ist nicht einfach, diese zugegebenen Viren vom natürlichen
Typ zu trennen.
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Weiterhin
ist es als ein Problem im Hinblick auf RNA-Virusvektoren im Allgemeinen
denkbar möglich, im
Voraus Inhibitoren der Replikation von RNA-Virusvektoren, die keine
Auswirkungen auf die Replikation und Transkription des Wirts haben,
verfügbar
zu machen, wodurch für
den Fall Vorsorge getroffen wird, dass RNA, die in großen Mengen
repliziert und transkribiert wird, unerwünschte Wirkungen auf die behandelten
Menschen und Tiere ausübt.
Allerdings sind derartige Inhibitoren nicht entwickelt worden.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
durch die vorliegende Erfindung zu lösenden Aufgaben sind, Negativstrang-RNA-Virusvektoren zur
praktischen Anwendung, Verfahren zum effizienten Herstellen der
Vektoren und Inhibitoren der Replikation der Vektoren zu entwickeln.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung versuchten zunächst, das
Sendai-Virus aus Nukleinsäuren dieses
Virus, das ein typisches Negativstrang-RNA-Virus ist, zu rekonstituieren
und nahmen an, dass dies für einen
Vektor unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit und Zweckmäßigkeit
industriell am nützlichsten
ist. Um dies zunächst
auf den Rekonstitutionstest anzuwenden, wurden verschiedene Untersuchungen
unter Verwendung von cDNA, die aus Sendai-Virus DI-Partikeln (defective
interfering, DI) stammte [siehe EMBO J., 10, 3079–3085 (1991)],
oder von cDNA des Sendai-Virus-Minigenoms als experimentelles Material
durchgeführt. Als
Ergebnis wurden wirksame Bedingungen im Hinblick auf die Gewichtsverhältnisse
zwischen den in die Wirtszellen zu übertragenden Materialien, einschließlich cDNA,
cDNAs, welche die Transkription und Replikation betreffen, aufgefunden
und das rekombinante Vaccinia-Virus, um eine Einheit zum Exprimieren
der T7-RNA-Polymerase verfügbar
zu machen. Weiterhin erhielten die Erfinder der vorliegenden Erfindung
Vollänge-cDNAs,
die sowohl Positiv- als auch Negativsträngen entsprachen, konstruierten
Plasmide zum Induzieren der intrazellulären Biosynthese von entweder
Positiv- oder Negativstrang-RNA des Sendai-Virus, und sie übertrugen die Plasmide in Wirtszellen,
wobei cDNAs, welche die Transkription und Replikation betreffen,
exprimiert wurden. Als Ergebnis waren sie zunächst beim Rekonstruieren von
Sendai-Virus-Partikeln von abgeleiteten cDNAs erfolgreich.
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Zusätzlich fanden
die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass das Sendai-Virus ohne
Verwendung eines rekombinanten Vaccinia-Virus als T7-RNA-Polymerase-Expressionseinheit
rekonstruiert werden konnte. Dies bedeutet, dass, wenn die in vitro
transkribierte Volllänge-RNA des Sendai-Virus
auf Zellen übertragen wurde,
und cDNAs, die Enzyme zum Start der Transkription und Replikation
kodieren, unter der Kontrolle des T7-Promotors transkribiert werden,
Viruspartikel rekonstruiert wurden. Dies zeigt, dass, wenn Zellen,
welche eine Gruppe von allen Enzymen, die zum Start der Transkription
und Replikation erforderlich sind, konstituiert werden, das rekombinante
Sendai-Virus, schließlich
Komplexe, wie oben beschrieben, vollständig und ohne Verwendung von
Helferviren, wie etwa dem Vaccinia-Virus, gebildet werden können. Da
Zellen, die eine Gruppe von allen Enzymen, die zum Start der Transkription
und Replikation erforderlich sind, exprimieren, bereits beschrieben
wurden [J. Virology, 68, 8413–8417
(1994)], werden diejenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen,
derartige Zellen unter Bezugnahme auf den genannten Artikel herstellen.
Zellen, die in der Referenz beschrieben werden, sind diejenigen,
die aus der Zelllinie 293, welche drei der Sendai-Virusgene auf
ihrem Chromosom trägt,
nämlich
NP, P/C und L, welche Proteine exprimieren, die durch die drei Gene
NP, P/C und L kodiert werden, abgeleitet werden.
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Aus
einer Anzahl von Beispielen von viralen Vektoren, falls Viruspartikel
wirksam aus Nukleinsäuren rekonstruiert
werden können,
ist offensichtlich, dass der Fachmann in der Lage ist, ein gewünschtes
Virusgen leicht auszutauschen, ein Fremdgen einzufügen oder
ein gewünschtes
Gen zu aktivieren oder zu deletieren. Beispielsweise zeigt ein Artikel
zur Verwendung von DI-Partikel [J. Virol., 68, 8413–8417 (1994)]
eindeutig, dass, wenn RNA in mindestens einem Teil der Strukturgene
des Sendai-Virus defizient ist, jedoch normale Gene für Replikationsenzyme
in die Zellen übertragen
werden, die erfolgreiche autonome Replikation in der Lage ist, fortzufahren,
falls Gruppen von Enzymen, die zum Start von Transkription und Replikation
erforderlich sind, in den Zellen zur Verfügung stehen. Deshalb, sobald
ein RNA-Molekül,
das ein Fremdgen enthält,
das von einer „bestimmen
viralen cDNA, die in mindestens einem Teil der Strukturgene defizient,
in Bezug auf Gene der Gruppe der Repliktionsenzyme jedoch normal
ist", transkribiert
wird, in die Virusstruktur, welche die Enzyme zum Start der Transkription
und Replikation umfasst, eingeschlossen werden kann, können Komplexe,
die infektiös
und funktionell sind und sich autonom replizieren, die jedoch in
Bezug auf die Potenz zur Verbreitung defizient sind, wie der Fremdgen-Vektor
gebildet werden. Derartige Komplexe sind außerordentlich nützlich als
ein Vektor zur Gentherapie. Dies bedeutet, dass es durch die vorliegende
Erfindung mit einem Negativstrang-RNA-Virus möglich wird, Komplexe herzustellen,
die infektiös
sind, ebenso wie autonom-replikativ, die jedoch in Bezug auf die
Potenz zur Verbreitung defizient sind, beispielsweise Komplexe,
welche die Enzyme zum Start der Transkription und Replikation umfassen.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelten weiterhin ein Verfahren
zum Amplifizieren des selben Komplexes durch Transfizieren von Zellen
mit dem Komplex, welche die Strukturproteine, die den Genen in der
RNA des Komplexes, die deletiert oder inaktiviert worden sind, entsprechen,
exprimieren. Weiterhin, wenn Vogeleier als das geeignetste Medium
zum Proliferieren von Sendai-Virus in Betracht gezogen werden, um
den Komplex zu amplifizieren, stellten die Erfinder fest, dass transgene
Vögel,
ihre Eier und Zellen, die min destens eines oder mehrere Gene der
M-, F- und HN-Gene des Sendai-Virus auf ihrem Chromosom tragen, zum
Amplifizieren von Komplexen geeignet sind. Von Verfahren zum Herstellen
transgener Vögel
ist berichtet worden [Poultry Sci., 65, 1445–1458 (1986); Bio/Technology,
12, 60–63
(1994)], und diejenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen,
können
auf geeignete Weise transgene Vögel,
die mindestens eines oder mehrere Gene der M-, F- und HN-Gene auf
ihren Chromosomen tragen, hervorbringen. Vorzugsweise werden Proteine,
die durch Gene, die mit der Defizienz in Bezug auf die Fähigkeit
zur Verbreitung von RNA, die in dem Komplex unter M-, F- und HN-Genen
enthalten sind, in Beziehung stehen, in transgenen Vögel exprimiert.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelten auch ein Verfahren
zum Herstellen des oben beschriebenen Komplexes. Im Folgenden werden
Fälle,
die mit dem Sendai-Virus in Beziehung stehen, beispielhaft dargestellt.
Das Genom des Sendai-Virus Z ist eine Einzelstrang-RNA, die 15384
Nukleotide umfasst [Virology, 108, 318–324]. Seine gesamte Basensequenz
ist an cDNA-Klonen bestimmt worden, die unter Verwendung von reverser
Transkriptase hergestellt worden sind [Nucleic Acids Research, 11,
7313–7330
(1983); Nucleic Acids Research, 12, 7965–7972 (1984); Nucleic Acids
Research, 14, 1545–1563
(1986)]. Da die genomische RNA ein Negativstrang ist, vollbringt
eine Gruppe von Enzymen zur Transkription und Replikation in den Viruspartikeln
sowohl die Transkription als auch die Replikation der genomischen
RNA als Matrize. Mindestens 6 Proteine, einschließlich NP,
P/C, M, F, HN und L, sind als Proteine bekannt, die durch die genomische
RNA kodiert werden. Es hat sich aufgeklärt, dass von diesen Proteinen
NP, P/C und L Faktoren sind, die essentiell und ausreichend sind
zur Replikation [Journal of Virology, 68, 8413–8417 (1994)], und M, F und
N sind Bestandteile, die zum Aufbau der viralen Struktur notwendig
sind. Auf der Grundlage dieser Fakten ist es möglich, dass, wenn ein bestimmtes
RNA-Virus, von dem sich die RNA ableitet, das Sendai-Virus ist,
einen infektiösen Komplex
zu rekonstruieren, indem sowohl 1) cDNA, die transkribierbar in
DNA ist, und 2) ein Gen, das die RNA-Polymerase, die zum Transkribieren
der cDNA in Zellen oder ein RNA-Molekül selbst, das von der cDNA in
vitro in Zellen transkribiert wurde, zu übertragen, wobei alle Gene
zur autonomen Replikation, NP, P/C und L, und eine Gruppe von Genen
von M-, F- und HN-Genen für
die Defizienz der Fähigkeit
zur Verbreitung exprimiert werden.
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In
diesem Fall können
alle Gene für
die autonome Replikation, NP, P/C und L, und Gene von M-, F- und
HN-Genen für
die Defizienz der Fähigkeit
zur Verbreitung von RNA transient exprimiert werden, indem Zellen
mit den Plasmiden, die die entsprechenden Gene kodieren, zur Transfektion
verwendet werden. Allerdings sind Gene, die mit der Defizienz der
Fähigkeit
zur Verbreitung von RNA zusammenhängen, mindestens vorzugsweise
in Chromosomen aufgenommen, um stabil exprimiert zu werden.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelten weiterhin ein Verfahren
zum Herstellen des Komplexes, der auf diese Weise in großen Mengen
rekonstruiert wurde, wobei der Komplex repliziert wird, indem Zellen
damit transfiziert werden, die keine Gene aufweisen, die mit der
autonomen Replikation in Beziehung stehen, jedoch Gene exprimieren,
ausgewählt
aus M-, F- und HN-Genen, die mit der Defizienz der Potenz zur Verteilung
von RNA in Beziehung stehen. Da Zellen, die keine Gene aufweisen,
die zu der autonomen Replikation in Beziehung stehen, jedoch eine
Gruppe von Genen, ausgewählt
aus M-, F- und HN-Genen, exprimieren, die mit der Defizienz der
Fähigkeit
zur Verbreitung von RNA in Beziehung stehen, sind in diesem Fall
transgene Vogeleier, die diese Gruppe von Genen exprimieren, für die Herstellung
eines Komplexes im Großmaßstab zu
bevorzugen.
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Weiterhin
stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Zellen zum Propagieren
des Komplexes her, die die RNA und Proteine enthielten. Genauer
sind die Zellen diejenigen mit Genen, die einer Gruppe von Genen,
die mit der Defizienz der Fähigkeit
der RNA, die in dem Komplex beibehalten wird, infektiöse Partikel
zu bilden, in Beziehung stehen, entsprechen, und zur intrazellulären Herstellung
von Proteinen, die durch die Gene kodiert werden, in der Lage sind.
In dem Fall, in dem das bestimmte RNA-Virus, von dem sich die RNA ableitet,
das Sendai-Virus ist, werden Zellen, die mindestens mehr als ein
Gen aus den M-, F- und HN-Genen auf
ihren Chromosomen aufweisen, oder Tiere, die solche Zellen aufweisen,
verwendet. Zusätzlich
sind M-, F- und HN-Gene nicht notwendigerweise vom Wildtyp. Jedes
von solchen mit Funktionen, die zu denen des Wildtyps äquivalent
sind, sind anwendbar. Dies bedeutet, dass jedes Gen verwendet werden
kann, wobei das Gen eine Komplementarität zum Wildtyp des defizienten
Virus aufweisen kann, wenn es funktionell in Zellen eingeführt wird.
Bevorzugte Zellen, die verwendet werden sollen, sind Wirtszellen
für das
Sendai-Virus. Es ist bevorzugt, dass Proteine, die durch Gene kodiert
werden, die denen entsprechen, die mit der Defizienz der Fähigkeit,
infektiöse
Partikel zu bilden, in Beziehung stehen, ausgewählt aus M-, F- und HN-Genen
in der viralen Vektor-RNA, intrazellulär hergestellt werden.
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Bisher
ist nur die Steigerung der Expressionseffizienz mit herkömmlichen
Virus-RNA-Vektoren
hervorgehoben worden, und wenig Fortschritt ist gemacht worden,
um Verbindungen zu entwickeln, welche die RNA-Replikation supprimieren,
um unvorteilhafte Ergebnisse aufgrund einer exzessiven Expression
zu verhüten.
In dieser Hinsicht entwickelten die Erfinder der vorliegenden Erfindung
einen Inhibitor für
den Negativstrang-Virusvektor, der spezifisch die RNA-abhängige RNA-Replikation
und die RNA-abhängige
RNA-Transkription hemmt, ohne die Transkription und Translation
von RNAs, die aus Zellen stammen, zu beeinflussen, was nur zu der
Hemmung der RNA-abhängigen
RNA-Replikation führt.
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Dies
bedeutet, dass die vorliegende Erfindung Folgendes umfasst.
- 1. Einen Komplex, der ein RNA-Molekül umfasst,
das sich von einem bestimmten sich verbreitenden Negativstrang-RNA-Virus
und viralen Strukturbestandteilen, die keine Nukleinsäuren enthalten,
ableitet, das die Infektiosität
und die Fähigkeit
zur autonomen RNA-Replikation aufweist, jedoch in der Fähigkeit
zur Verbreitung defizient ist.
- 2. Komplex nach Beschreibung 1, wobei das bestimmte RNA-Virus
ein Negativstrang-RNA-Virus
mit einem nicht-segmentierten Genom ist.
- 3. Komplex nach Beschreibung 2, wobei das bestimmte RNA-Virus
das Sendai-Virus ist.
- 4. Ein RNA-Molekül,
das Sendai-Virus-RNA oder Sendai-Virus-cRNA umfasst, wobei das RNA-Molekül insofern
fehlerhaft ist, als mindestens mehr als ein Gen, das die M-, F-
und HN-Proteine kodiert, deletiert oder inaktiviert ist.
- 5. Ein Komplex, der die RNA nach Beschreibung 4 und virale Strukturbestandteile,
die keine Nukleinsäure enthalten,
umfasst, abgeleitet vom Sendai-Virus, der die Infektiosität und die
Fähigkeit
zur autonomen RNA-Replikation aufweist, jedoch in der Fähigkeit
zur Verbreitung defizient ist.
- 6. Ein DNA-Molekül,
das eine DNA-Matrize umfasst, die in ein RNA-Molekül nach Beschreibung
4 in vitro oder intrazellulär
transkribierbar ist.
- 7. Der Komplex nach einer der Beschreibungen 1 bis 3 oder 5,
wobei das RNA-Molekül,
das in dem Komplex enthalten ist, ein Fremdgen umfasst.
- 8. Der Komplex nach den Beschreibungen 3 oder 5, wobei das RNA-Molekül, das in
dem Komplex enthalten ist, ein Fremdgen umfasst.
- 9. Das RNA-Molekül
nach Beschreibung 4, das ein Fremdgen umfasst.
- 10. Das DNA-Molekül
nach Beschreibung 6, das ein Fremdgen umfasst.
- 11. Ein Inhibitor der RNA-Replikation, der in dem Komplex nach
einer der Beschreibungen 1 bis 3, 5, 7 oder 8 enthalten ist, der
einen hemmenden Wirkstoff der RNA-abhängigen
RNA-Replikation umfasst.
- 12. Ein Wirt, auf den sich der Komplex nach einer der Beschreibungen
1 bis 3, 5, 7 oder 8 ausbreiten kann.
- 13. Der Wirt nach Beschreibung 12, der eine Gruppe von Genen
umfasst, die mit der Infektiosität
des Komplexes nach einer der Beschreibungen 1 bis 3, 5, 7 oder 8
auf seinen Chromosomen in Beziehung steht, und der in der Lage ist,
die selben Kopien des Komplexes zu replizieren, wenn er damit infiziert
ist.
- 14. Der Wirt nach den Beschreibungen 12 oder 13, wobei der Wirt
ein Tier oder Zellen, Gewebe oder Eier, die davon stammen, ist.
- 15. Der Wirt nach Beschreibung 14, wobei das Tier ein Säugetier
ist.
- 16. Der Wirt nach Beschreibung 14, wobei das Tier ein Vogel
ist.
- 17. Ein Wirt, der eine Gruppe von Genen umfasst, die mit der
Infektiosität
des Komplexes nach einer der Beschreibungen 3, 5 oder 8 auf seinen
Chromosomen in Beziehung steht, und der zum Replizieren der selben
Kopien des Komplexes in der Lage ist, wenn er damit infiziert ist.
- 18. Ein Wirt, der mindestens mehr als ein Gen der M-, F- und
HN-Gene des Sendai-Virus oder Gene mit Funktionen, die zu diesen äquivalent
sind, auf seinen Chromosomen umfasst.
- 19. Ein Wirt, der das M-Gen des Sendai-Virus oder sein funktionell äquivalentes
Gen auf seinen Chromosomen umfasst.
- 20. Ein Wirt, der die M-, NP-, P/C- und L-Gene des Sendai-Virus
auf seinen Chromosomen umfasst (wobei jedes Gen durch sein funktionell äquivalentes
Gen substituiert sein kann).
- 21. Ein Wirt, der die M-, F- und HN-Gene des Sendai-Virus auf
seinen Chromosomen umfasst (wobei jedes Gen durch sein funktionell äquivalentes
Gen substituiert sein kann).
- 22. Ein Wirt, der die M-, F-, HN-, NP-, P/C- und L-Gene des
Sendai-Virus auf seinen Chromosomen umfasst (wobei jedes Gen durch
sein funktionell äquivalentes
Gen substituiert sein kann).
- 23. Der Wirt nach einer der Beschreibungen 17 bis 22, wobei
der Wirt ein Tier oder eine Zelle, ein Gewebe oder ein Ei, die bzw.
das davon stammt, ist.
- 24. Der Wirt nach Beschreibung 22, wobei das Tier ein Säugetier
ist.
- 25. Der Wirt nach Beschreibung 23, wobei das Tier ein Vogel
ist.
- 26. Ein Kit, das aus den folgenden drei Bestandteilen besteht:
a)
das RNA-Molekül,
das in dem Komplex nach einer der Beschreibungen 1 bis 3, 5, 7 oder
8 enthalten ist, oder cRNA der RNA oder eine Einheit, die in der
Lage ist, die RNA oder die cDNA zu biosynthetisieren;
b) eine
Gruppe von Enzymen, die für
das Replizieren der RNA oder der cDNA notwendig ist, oder eine Einheit,
die in der Lage ist, die Gruppe von Enzymen zu biosynthetisieren;
und
c) eine Gruppe von Proteinen, die mit der Infektiosität des Komplexes
in Beziehung steht, oder eine Einheit zur Biosynthese der Gruppe
von Proteinen.
- 27. Ein Kit, das aus den folgenden drei Bestandteilen besteht:
a)
das RNA-Molekül,
das in dem Komplex nach einer der Beschreibungen 1 bis 3, 5, 7 oder
8 enthalten ist, oder cRNA der RNA oder eine Einheit, die in der
Lage ist, die RNA oder die cDNA zu biosynthetisieren;
b) eine
Gruppe von Enzymen, die zum Replizieren der RNA oder der cDNA erforderlich
ist, oder eine Einheit, die in der Lage ist, die Gruppe von Enzymen
zu biosynthetisieren; und
c) der Wirt nach einer der Beschreibungen
12 bis 25.
- 28. Ein Kit, das aus den folgenden drei Bestandteilen besteht:
a)
der Komplex nach einer der Beschreibungen 1 bis 3, 5, 7 oder 8;
und
b) der Wirt nach einer der Beschreibungen 12 bis 25.
- 29. Ein Kit, der aus den folgenden drei Bestandteilen besteht:
a)
das RNA-Molekül,
das in dem Komplex nach einer der Beschreibungen 3, 5 oder 8 enthalten
ist, oder cDNA der RNA oder eine Einheit, die in der Lage ist, die
RNA oder die cRNA zu biosynthetisieren;
b) alle NP-, P/C- und
L-Proteine des Sendai-Virus oder eine Einheit zur Biosynthese der
Gruppe von Proteinen; und
c) eine Gruppe von Proteinen, die
mit der Infektiosität
des Komplexes in Beziehung steht, oder eine Einheit zur Biosynthese
der Gruppe von Proteinen.
- 30. Ein Kit, das aus den folgenden drei Bestandteilen besteht:
a)
das RNA-Molekül,
das in dem Komplex nach einer der Beschreibungen 3, 5 oder 8 enthalten
ist, eine cRNA der RNA oder eine Einheit, die in der Lage ist, die
RNA oder die cRNA zu biosynthetisieren;
b) alle NP-, P/C- und
L-Proteine des Sendai-Virus oder eine Einheit, die in der Lage ist,
die Gruppe von Proteine zu biosynthetisieren; und
c) der Wirt
nach einer der Beschreibungen 17 bis 25.
- 31. Ein Kit, das aus den folgenden zwei Bestandteilen besteht:
a)
der Komplex nach einer der Beschreibungen 3, 5 oder 8; und
b)
der Wirt nach einer der Beschreibungen 17 bis 25.
- 32. Ein Verfahren zum Herstellen des Komplexes nach einer der
Beschreibungen 1 bis 3, 5, 7 oder 8 durch Einführen von drei Bestandteilen
der Beschreibungen 26 a), 26 b) und 26 c) in den Wirt.
- 33. Ein Verfahren zum Herstellen des Komplexes nach einer der
Beschreibungen 1 bis 3, 5, 7 oder 8 durch Einführen beider Bestandteile der
Beschreibungen 27 a) und 27 b) in den Wirt nach Beschreibung 27
c).
- 34. Ein Verfahren zum Amplifizieren und Herstellen des Komplexes
nach Beschreibung 28 a) durch Transfizieren des Wirts nach Beschreibung
28 b) mit dem Komplex.
- 35. Ein Verfahren zum Herstellen des Komplexes nach einer der
Beschreibungen 3, 5 oder 8 durch Einführen der drei Bestandteile
nach den Beschreibungen 29 a), 29 b) und 29 c) in einen Wirt.
- 36. Ein Verfahren zum Herstellen des Komplexes nach einer der
Beschreibungen 3, 5 oder 8 durch Einführen beider Bestandteile nach
den Beschreibungen 30 a) und 30 b) in den Wirt nach Beschreibung
30 c).
- 37. Verfahren zum Amplifizieren und Herstellen des Komplexes
nach Beschreibung 31 a) durch Transfizieren des Komplexes in den
Wirt nach Beschreibung 31 b).
- 38. Das RNA-Molekül
nach Beschreibung 9, wobei ein Gen, das dem M-Gen entspricht, deletiert
oder inaktiviert ist.
- 39. Das RNA-Molekül
nach Beschreibung 9, wobei alle Gene, die den M-, F- und HN-Genen entsprechen, deletiert
oder inaktiviert sind.
- 40. Ein Kit, das aus den folgenden drei Bestandteilen besteht:
a)
das RNA-Molekül
nach Beschreibung 38;
b) der Wirt nach Beschreibung 20; und
c)
der Wirt nach Beschreibung 19.
- 41. Ein Verfahren zum Herstellen eines Komplexes durch Einführen des
RNA-Moleküls
nach Beschreibung 40 a) in den Wirt nach Beschreibung 40 b) und
Amplifizieren und Herstellen des Komplexes durch Transfektion des
Wirts nach Beschreibung 40 c).
- 42. Ein Komplex, der durch das Verfahren nach Beschreibung 41
hergestellt wird.
- 43. Ein Kit, das aus den folgenden drei Bestandteilen besteht:
a)
das RNA-Molekül
nach Beschreibung 39;
b) der Wirt nach Beschreibung 22; und
c)
der Wirt nach Beschreibung 21.
- 44. Ein Verfahren zum Herstellen eines Komplexes durch Einführen des
RNA-Moleküls
nach Beschreibung 43 a) in den Wirt nach Beschreibung 43 b) und
Amplifizieren und Herstellen des Komplexes durch Transfektion des
Wirts nach Beschreibung 43 c)
- 45. Ein Komplex, der durch das Verfahren nach Beschreibung 44
hergestellt wird.
- 46. Ein Inhibitor der RNA-Replikation, der in dem Komplex nach
entweder Beschreibung 42 oder 45 enthalten ist, der einen inhibitorischen
Wirkstoff der RNA-abhängigen
RNA-Replikation umfasst.
- 47. Verfahren zum Herstellen der Fremdproteine, wobei das Verfahren
den Vorgang des Einführens
des Komplexes nach Beschreibung 7 in einen Wirt und den Vorgang
des Gewinnens der exprimierten Fremdproteine umfasst.
- 48. Verfahren zum Herstellen der Fremdproteine nach Beschreibung
47, wobei der Wirt eine Zelle ist, die eine Gruppe von Genen exprimiert,
ausgewählt
aus denen, die mit der Fähigkeit
zur Verbreitung in Beziehung stehen, die in Bezug auf das RNA-Molekül, das in
dem Komplex nach Beschreibung 7 enthalten ist, defizient sind.
- 49. Ein Kulturmedium oder eine chorio-allantoide Flüssigkeit,
die die exprimierten Fremdproteine enthält, wobei das Kulturmedium
oder die chorio-allantoide Flüssigkeit durch
Beimpfen eines Wirts mit dem Komplexes nach Beschreibung 7 und das
Gewinnen des Mediums oder der Flüssigkeit
erhalten wird.
-
Jedes
Negativstrang-RNA-Virus mit der Fähigkeit zur Verbreitung kann
als Material im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet
werden. Obwohl unvollständige
Viren, wie etwa beschädigte DI-Partikel
(defective interfering, DI) und synthetische Oligonukleotide, als
Teilmaterial verwendet werden können,
müssen
sie im Allgemeinen die Basensequenz aufweisen, die zu der des Virus
mit der Fähigkeit
zur Verbreitung äquivalent
ist. Negativstrang-RNA-Viren der vorliegenden Erfindung schließen beispielsweise
das Sendai-Virus,
Newcastle-Krankheit-Virus, Mumps-Virus, Masern-Virus, Respiratory
Syncytial-Virus,
Rinderpest-Virus von Rind und Hundestaupe-Vvirus von Paramyxoviridae,
Influenzavirus von Orthomyxoviridae, Vesikuläre-Stomatitis-Virus und Tollwut-Vvirus
von Rhabdoviridae ein.
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Als
das Negativstrang-Virusmaterial können rekombinante Negativstrang-Viren,
die sich von jedem der oben beschriebenen Viren ableiten und die
Fähigkeit
zur Verbreitung beibehalten haben, verwendet werden. Beispielsweise
kann das rekombinante Negativstrang-Virus dasjenige mit dem Gen
für die
Inaktivierung der Immunogenität
oder einer Teilregion eines Gens, das verändert ist, um die Wirksamkeit
der RNA-Transkription oder RNA-Replikation zu steigern, sein.
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RNAs,
die in dem RNA/Protein-Komplex der vorliegenden Erfindung enthalten
sind, können
durch das Transkribieren modifizierter cDNAs, die sich von jedem
der oben beschriebenen Viren oder rekombinanten Viren ableiten,
in vitro oder intrazellulär
erhalten werden. In den dadurch erhaltenen RNAs muß mindestens
ein Gen, das mit der Fähigkeit
zur Verbreitung in Beziehung steht, des ursprünglichen Virus deletiert oder
inaktiviert sein, das Gen, das mit der autonomen Replikationen in
Beziehung steht, sollte dies jedoch nicht sein. Zusätzlich können RNA-Moleküle mit künstlichen
Sequenzen, die durch Transkribieren in vitro oder intrazellulär von DNA,
die durch Einführen
der Gene für
die autonome Replikation in cDNA, die beide Terminusstrukturen des
Virusgenoms, wie etwa ein DI-Molekül aufweist, erhalten worden
sind, verwendet werden.
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Wie
oben beschrieben, bezieht sich der Ausdruck „die Gene, die mit einer autonomen
Replikation in Beziehung stehen" im
Fall des Sendai-Virus auf jedes der NP-, P/C- und L-Gene, und der
Ausdruck „das
Gen, das mit der Fähigkeit
zur Verbreitung in Beziehung steht" bezieht sich auf jedes der M-, F- und
HN-Gene. Deshalb ist das RNA-Molekül des Sendai-Virus vom Stamm
Z, dem nur das M-Gen fehlt, beispielsweise als ein Bestandteil,
der in dem „Komplex" der vorliegenden
Erfindung enthalten ist, geeignet. Auch das RNA-Molekül, bei dem
alle M-, F- und HN-Gene deletiert oder inaktiviert sind, ist ebenfalls
als Bestandteil, der in dem „Komplex" der vorliegenden
Erfindung enthalten ist, zu bevorzugen. Auf der anderen Seite ist
es für
die Gene, die die NP-, P/C- und L-Proteine kodieren, notwendig,
von RNA exprimiert zu werden. Allerdings sind die Sequenzen dieser
Gene nicht notwendigerweise dieselben wie die des Virus und können durch
Einführen
von Variationen oder Ersetzen durch das entsprechende Gen, das aus
anderen Viren stammt, modifiziert werden, sofern die Transkriptions-
und Replikationsaktivität
der resultierenden RNA ähnlich
oder höher
ist als die natürliche.
-
Der
in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck „viraler
Strukturbestandteil, der frei von Nukleinsäure ist" schließt beispielsweise ein Virus
ein, bei dem nur dessen RNA entfernt wurde. Als solcher wird der
strukturelle Bestandteil als derjenige verwendet, der die Infektiosität und die
Fähigkeit
zur autonomen Replikation im frühen
Stadium ergänzt,
nicht jedoch die Fähigkeit
zur Verbreitung. Im Fall des Sendai-Virus weist der Komplex, der
aus seiner RNA zusammengesetzt ist, bei der nur das M-Gen deletiert
ist, und des Sendai-Virus, bei dem nur seine RNA deletiert ist,
die Infektiosität
und die Fähigkeit
zur autonomen Replikation, nicht jedoch die Fähigkeit zur Verbreitung auf.
Der Komplex kann andere Bestandteile enthalten, sofern er nicht
mit einer Fähigkeit
zur Verbreitung verfügbar
gemacht wird. Beispielsweise kann der Komplex ein Adhäsionsmolekül, einen
Liganden, Rezeptoren etc. auf seiner Hülloberfläche enthalten, um das Adhärieren an
bestimmte Zellen zu erleichtern.
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Das
RNA-Molekül,
das in dem Komplex enthalten ist, kann ein Fremdgen an einer geeigneten
Stelle eingefügt
haben. Um ein gewünschtes
Protein zu exprimieren, wird das Fremdgen, das das Protein kodiert, eingefügt. Im Fall
von Sendai-Virus-RNA wird eine Basensequenz mit einer Anzahl von
6 Vervielfältigungen vorzugsweise
zwischen die Sequenzen R1 (5'-AGGGTCAAAGT-3') und R2 (5'-GTAAGAAAAA-3') [Journal of Virology,
Vol. 67, No. 8 (1993), S. 4822–4830]
eingefügt.
Die Expressionstärken
des Fremdgens, das in die RNA eingefügt ist, kann mittels der Stelle
der Insertion des Gens und der Basensequenz, die das Fremdgen flankiert,
reguliert werden. Beispielsweise ist im Fall der Sendai-Virus-RNA
bekannt, dass die Expressionsstärken
des eingefügten
Gens mit zunehmender Entfernung des Gens von dem NP-Gen zunehmen.
Bevorzugte Wirtszellen für
die Einführung
des Komplexes, um gewünschte
Proteine zu exprimieren, sind diejenigen, die Gene exprimieren,
die in dem RNA-Molekül,
das aus dem Komplex zusammengesetzt ist, deletiert sind. Deshalb
werden transgene Vogeleier, die diese Gene exprimieren, zum Herstellen
von Proteinen in großen
Mengen am stärksten
bevorzugt. Beispielsweise können
Proteine, die auf diese Weise exprimiert werden, unter Verwendung
von Standardtechniken aus dem Kulturmedium gewonnen werden, wenn
die Wirtszellen kultivierte Zellen sind, und aus der chorio-allantoiden
Flüssigkeit,
wenn die Wirtszellen Hühnereier
sind. In den Beispielen 5 und 6 wird ein Komplex mit der Fähigkeit
zur Verbreitung anstelle eines zur Verbreitung nicht fähigen Komplexes
der vorliegenden Erfindung verwendet. Allerdings wird denjenigen,
die sich auf dem Fachgebiet auskennen, klar sein, dass ähnliche
Ergebnisse mit dem Komplex der vorliegenden Erfindung wie mit dem Komplex
mit der Fähigkeit
zur Verbreitung in diesen Beispielen erhalten werden, wenn „Zellen,
die Gene exprimieren, die ausgewählt
sind aus Genen, die in Bezug auf die Fähigkeit zur Verbreitung in
dem RNA-Molekül, das
in dem Komplex enthalten ist, deletiert sind" als Wirtszellen verwendet werden.
-
Weiterhin
haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigt, dass
für die
wirksame Konstitution von Sendai-Virus-Partikeln die in die Zellen
einzuführende
cDNA vorzugsweise in der ringförmigen
Form anstelle der linearen Form vorliegt, und dass zur Bildung von
Viruspartikeln mit hoher Effizienz die Transkription der Positivstrang-RNA
gegenüber
der Negativstrang-RNA in den Zellen bevorzugt ist. Obwohl diese
Bedingungen nicht notwendigerweise auf die Rekonstitution aller
anderen Negativstrang-RNA-Viren anwendbar ist, ist es möglich, nach
geeigneten Bedingungen für
die Rekonstitution anderer Negativstrang-RNA-Viren auf der Grundlage der Offenbarung
der vorliegenden Erfindung und herkömmlicher Technologie zu suchen,
wodurch eine Möglichkeit
zum Etablieren von Techniken, um wesentliches Material der gewünschten
Negativstrang-Virusvektoren, d. h. die viralen Rekonstitutionssysteme,
herzustellen.
-
Ebenso
wie der „RNA-Replikationsinhibitor" der vorliegenden
Erfindung kann jeder Wirkstoff zur Hemmung der RNA-abhängigen RNA-Replikation
angewendet werden, und es werden beispielsweise Ribavirin, TJ13025
etc. vorzugsweise verwendet. Derartige Replikationsinhibitoren sind
beispielsweise wirksam, wenn eine Verschlechterung des Gesundheitszustandes
mit der zellulären
Amplifikation von rekombinanter RNA zu verzeichnen ist oder wenn
die Kontrolle der intrazellulären
Expression der Fremdgene, die sich von rekombinanter RNA ableiten,
erforderlich ist.
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Als
eine Ausführung
der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Rekonstitutieren
des Komplexes der vorliegenden Erfindung aus cDNA, bei der das M-Gen
des Sendai-Virus deletiert ist (Schritte A-B), und zum Amplifizieren
des Komplexes (Schritte B-C) in 1 gezeigt.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Darstellung eines Verfahrens zum Erzeugen von
Komplexen der vorliegenden Erfindung aus cDNA, die in Bezug auf
das M-Gen des Sendai-Virus defizient ist (Schritte A → B), und weiter
zum Amplifizieren der Komplexe (Schritte B → C).
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2 ist
eine schematische Darstellung der Konstruktion einer pUC18/T7(+)HVJRz.DNA.
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3 ist
eine schematische Darstellung der Konstruktion einer pUC18/T7(-)HVJRz.DNA.
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4 ist
eine grafische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Zeit
nach der Infektion von SeVgp120 in CV-1-Zellen und dem Wert für HAU und
der Stärke
der Expression von gp120 zeigt.
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Beste Art und Weise, um
die Erfindung auszuführen
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Im
Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele genau
beschrieben, wobei die Erfindung nicht auf die Beispiele beschränkt ist.
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Beispiel 1: Präparation
der Sendai-Virus-Transkriptionseinheiten pUC18/T7(-)HVJRz.DNA und pUC18/T7(+)HVJRz.DNA
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Das
Plasmid pUC18/T7(-)HVJRz.DNA wurde konstruiert, indem ein DNA-Molekül, das den T7-RNA-Polymerasepromotor
umfasste, Sendai-Virus-cDNA, die dazu entworfen war, in die Negativstrang-RNA
transkribiert zu werden, und das Ribozymgen in dieser Reihenfolge
in einen pUC18-Vektor eingefügt
wurde. Auch das Plasmid pUC18/T7(+)HVJRz.DNA wurde konstruiert,
indem ein DNA-Molekül,
das den T7-RNA-Poiymerasepromotor umfasste, Sendai-Virus-cDNA, die
dafür entworfen
wurde, um in die Positivstrang-RNA transkribiert zu werden, und
das Ribozymgen in dieser Reihenfolge in einen pUC18-Vektor eingefügt wurde.
Die Konstruktionen von pUC18/T7(-)HVJRz.DNA und pUC18/T7(+)HVJRz.DNA
werden in den 1 und 2 gezeigt.
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Beispiel 2: Experiment
zur Rekonstitution von Sendai-Virus aus cDNA
-
LLC-MK2-Zellen
(2 × 106), die auf die übliche Weise trypsiniert wurden,
wurden in eine Kunststoff-Petrischale mit 60 mm Durchmesser gesetzt
und in MEM-Medium (MEM, supplementiert mit 10 % FBS) (2 ml) in einer
5 % CO2-Atmosphäre bei 37°C 24 Stunden inkubiert. Nach
Entfernen des Mediums und Waschen der Zellen mit PBS (1 ml) wurde
eine Suspension des rekombinanten Vaccinia-Virus vTF7-3, das die
T7-Polymerase exprimiert, in PBS (0,1 ml) den Zellen zum Zeitpunkt
der Vervielfachung der Infektion (multiplicity of infection, moi)
von 2 zugesetzt. Die Schale wurde alle 15 Minuten vorsichtig bewegt,
um die Viruslösung
während der
einstündigen
Infektion sorgfältig
zu verteilen. Nach Entfernen der Viruslösung und Waschen der Zellen
mit PBS (1 ml) wurde ein Medium, das cDNA enthielt, hergestellt
wie im Folgenden beschrieben, der Schale zugegeben.
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Die
in den Tabellen 1 und 2 gezeigten Nukleinsäuren (die Plasmide enthielten,
die Faktoren exprimierten, die für
die Replikation des Sendai-Virus erforderlich sind, pGEM-L, pGEM-P/C und pGEM-NP)
wurden in ein 1,5 ml Probenröhrchen
gegeben, und das Volumen wurde auf ein Gesamtvolumen von 0,1 ml
mit HBS (Hepes-gepufferte Kochsalzlösung; 20 mM Hepes pH 7,4 mit
150 mM NaCl) eingestellt. In diesen Tabellen stellen (-) und (+)cDNAs
die Plasmide pUC18T7(-)HVJRz.DNA bzw. pUC18T7(+)HVJRz.DNA dar, und
/C und /L zeigen, dass cDNA in Zellen in der ringförmigen Form
und der linearen Form nach Behandlung mit dem Restriktionsenzym
MluI eingeführt
worden ist.
-
Auf
der anderen Seite wurden in ein Polystyrolröhrchen HBS (0,07 ml) und DOTAP
(Boehringer Mannheim) (0,03 ml) gegeben. In dieses Röhrchen wurde
die oben beschriebene Nukleinsäurelösung gegeben,
und die Mischung wurde als solche 10 Minuten lang stehengelassen.
Dann wurde dieser Mischung das oben beschriebene Zellkulturmedium
(2 ml, MEM, supplementiert mit 10 % FBS) zugegeben, gefolgt von
den Vaccinia-Virus-Inhibitoren, Rifampicin und Cytosin-Arabinosid
C (C/Ara/C), um Endkonzentrationen von 0,1 mg/ml bzw. 0,04 mg/ml
zu erreichen, was zu der Herstellung des oben beschriebenen cDNA-haltigen
Mediums führte.
-
Die
oben beschriebene Schale wurde in einer 5 % CO2-Atmosphäre bei 37°C 40 Stunden
inkubiert. Die Zellen in der Schale wurden unter Verwendung eines
Zellschabers („rubber
policeman") geerntet,
in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, durch
Zentrifugieren bei 6000 Upm für
5 Minuten sedimentiert und in PBS (1 ml) resuspendiert. Mit Aliquots
dieser Zellsuspension als solchen oder nach Verdünnung wurden 10 Tage alte, sich
entwickelnde Hühnerei-Embryos angeimpft.
Das heißt,
die Zellsuspension wurde mit PBS auf die in Tabelle 1 angegebene
Zellzahl verdünnt,
und die mit 0,5 ml-Aliquots beimpften Eier wurden bei 35°C 72 Stunden inkubiert,
dann bei 4°C über Nacht.
Die chorio-allantoide Flüssigkeit
wurde als Viruslösung
von diesen Eiern unter Verwendung einer Spritze mit einer Nadel
gewonnen.
-
Die
Hämagglutinin-Einheit
(hemagglutinin unit, HAU) und die Plaque-bildende Einheit (plaque-forming unit,
PFU) der gewonnenen Viruslösung
wurden wie folgt bestimmt.
-
HAU
wurde wie folgt bestimmt. Hühnerblut
wurde bei 400 × g
10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die
auf diese Weise erhaltenen Präzipitate
wurden in 100 Volumen PBS suspendiert und 10 Minuten bei 400 × g zentrifugiert,
um den Überstand
zu verwerfen. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, um eine
0,1 % Blutzell-Lösung
zu erhalten. Es wurden zweifache serielle Verdünnungen der Viruslösungen hergestellt,
und jeweils 0,05 ml der zu untersuchenden Verdünnung wurden in jede Vertiefung
einer 96-Well-Microtiterplatte
verteilt. Die Blutzell-Lösung
(jeweils 0,05 ml) wurde weiterhin jeder Vertiefung zugegeben, es
wurde vorsichtig geschwenkt, um eine sorgfältige Mischung sicherzustellen,
und die Platte wurde 40 Minuten bei 4°C stehengelassen. Die höchste Virusverdünnung, welche
eine mit bloßem
Auge zu beobachtende Hämagglutination
verursachte, wurde als HAU verwendet.
-
Die
PFU wurde wie folgt getestet. CV-1-Zellen wurden zu einer Einzelzellschicht
(monolayer) in einer 6-Well-Kulturplatte wachsen gelassen. Nachdem
das Kulturmedium verworfen worden war, wurde eine 10-fach seriell
verdünnte
Viruslösung
(jeweils 0,1 ml) in jede Vertiefung der Kulturplatte verteilt, um
die Zellen bei 37°C
eine Stunde zu infizieren. Während
der Infektion wurde eine Mischung aus 2x serumfreiem MEM und geschmolzenem
2% Agar (55°C)
hergestellt, und es wurde Trypsin in einer Endkonzentration von
0,0075 mg/ml zu der Mischung gegeben. Nach einer Stunde Infektion
und Entfernen der Viruslösung
wurde das mit Agar gemischte Kulturmedium (jeweils 3 ml) jeder Vertiefung
der Kulturplatte zugesetzt, und die Platte wurde in einer 5 % CO2-Atmosphäre
bei 37°C
drei Tage inkubiert. Jeder Vertiefung wurde Phenolrot (0,1 %) (0,2
ml) zugesetzt, es wurde bei 37°C
drei Stunden inkubiert, und das Phenolrot wurde dann entfernt. Ungefärbte Plaques
wurden gezählt,
um den Virustiter als PFU/ml zu bestimmen.
-
Tabelle
1 zeigt Matrizen-cDNAs des Sendai-Virus, mit denen LLC-2-Zellen
transfiziert wurden, Mengen von cDNA-Faktoren, pGEM-L, pGEM-P/C
und pGEM-NP, die für
die RNA-Replikation
erforderlich sind, die Inkubationszeit, die Zellzahlen, mit denen
die Hühnereier
beimpft wurden, HAU- und PFU-Werte.
-
-
Proben,
die sowohl HAU als auch PFU zeigten, wurden durch Ultrazentrifugation
sedimentiert, resuspendiert, durch eine Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation
von 20% bis 60% gereinigt und durch 12,5 % SDS-PAGE fraktioniert.
Jedes Protein, das in diesen Proben enthalten war, wies die gleiche
Größe auf wie
das des Sendai-Virus.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass das Sendai-Virus durch Einführen von
cDNAs in Zellen rekonstituiert werden kann, und dass Viruspartikel
durch Einführen
von cDNAs, die Positivstrang-RNAs
transkribieren, im Vergleich zu denen, die Negativstrang-RNAs transkribieren,
und weiter durch Einführen
von cDNAs in der ringförmigen
Form anstelle der linearen Form wirksamer rekonstituiert werden
können.
-
Beispiel 3: Erfassung
von RNA-Replikationsfaktoren, die zur Rekonstitution des Sendai-Virus erforderlich
sind
-
Es
wurden Experimente durchgeführt,
um zu untersuchen, ob alle drei Plasmide, die die L-, P/C- und NP-Proteine
exprimieren, für
die Rekonstitution des Sendai-Virus erforderlich sind. Die experimentellen
Verfahren waren ähnlich
wie die in Beispiel 2 beschriebenen, außer dass jede Kombination von
zwei, ausgewählt aus
pGEM-L, pGEM-P/C- und pGEM-NP-Plasmiden,
oder nur eines davon anstelle von allen dreien, die in Beispiel
kombiniert wurden, gemeinsam mit einer Matrizen-cDNA in Zellen eingeführt wurden.
-
Tabelle
2 zeigt Matrizen-cDNAs des Sendai-Virus, die in LLC-MK2-Zellen eingeführt wurden,
die Mengen an den cDNA-Faktoren, die zur RNA-Replikation erforderlich
sind, einschließlich
pGEM-L, pGEM-P/C und pGEM-NP, die Inkubationszeit, die Zellzahl,
mit denen Hühnereier
beimpft wurden, und Werte von HAU und PFU.
-
-
Wie
in Tabelle 2 gezeigt, wurde beim Einführen jeder Kombination von
zwei der drei Faktoren in Zellen keine Virusrekonstitution beobachtet,
was die Notwendigkeit von allen drei Proteinen L, P/C und NP für die Virusrekonstitution
bestätigt.
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Beispiel 4: Experiment
zur Rekonstitution des Sendai-Virus in vitro von transkribierten
RNAs
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Da
die Rekonstitution des Sendai-Virus aus funktionellen cDNA-Klonen
in Beispiel 2 beschrieben wurde, wurde weiterhin untersucht, ob
Transkriptionsprodukte der cDNAs in vitro, d.h. vRNA und cRNA, eine ähnliche
Rekonstitution unterstützen
können.
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Nachdem
die Sendai-Virus-Transkriptionseinheiten pUC18/T7(-)HVJRz.DNA und pUC18/T7(+)HVJRz.DNA
mit dem Restriktionsenzym MluI linearisiert worden sind, wurde unter
Verwendung dieser DNAs als Matrizen eine RNA-Synthese in vitro mit
einer gereinigten T7-Polymerase-Präparation durchgeführt (EPICENTRE
TECHNOLOGIES: Ampliscribe T7 Transcription Kit). Das Verfahren zum
Synthetisieren von RNAs in vitro folgt im wesentlichen den mit dem
Kit zur Verfügung
gestellten Protokollen. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen
RNA-Produkte anstelle der cDNAs in Beispiel 2 wurden ähnliche
Experimente durchgeführt,
und die Virusproduktion wurde durch einen HA-Test bestimmt. Die
Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass das Virus durch Einführen von entweder Negativ-
oder Positivsinnstrang-RNAs in Zellen rekonstituiert werden kann.
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Beispiel 5: Expression
von Fremdgenen, die in Sendai-Virusvektoren in Wirtszellen eingefügt sind
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1. Präparation des Sendai-Virusvektors „pSeVgp120", eingefügt mit einem
Fremdgen (HIV-1gp120)
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Unter
Verwendung eines Satzes von Primern, der Primer a (5'-TGCGGCCGCCGTACGGTGGCAATGAGTGAAGGAGAAGT-3') (SEQ ID NO:1) und
Primer d (5'-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTT
VTTA CTACGGCGTACGTCATCTTTTTTCTCTCTGC-3') (SEQ ID NO:2) umfasste, wurde das HIV-1gp120-Gen
an „pN1432" durch Standard-PCR-Techniken
amplifiziert. Die PCR-Produkte
wurden einer TA-Klonierung unterzogen, mit NotI verdaut und dann
in die NotI-Schnittstelle
von „pSeV18+" eingefügt. Dann wurden
E. coli-Zellen mit diesem rekombinanten Plasmid transformiert. Die
DNAs wurden aus jeder Kolonie von E. coli durch das „Miniprep"-Verfahren extrahiert,
mit DraIII verdaut und dann einer Elektrophorese unterzogen. Die
positiven Klone (nachfolgend als „Klon 9" bezeichnet) wurden danach ausgewählt, dass
sich bestätigte,
dass sie DNA-Fragmente mit der aus der Insertion erwarteten Größe enthielten.
Nachdem bestätigt worden
war, dass die DNA-Fragmente die authentische Nukleotid-Sequenz aufwiesen,
wurden die DNAs durch eine Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation
gereinigt. Im Folgenden wird pSeV18+ mit
dem eingefügten
gp120-Gen als „pSeVgp120" bezeichnet.
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2. Rekonstitution von
Sendai-Virus, das pSeVgp120 (SeVgp120) enthält, und Analyse der Expression
von gp120
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Außer im Fall
der weiteren Transfektion von LLCMK2-Zellen mit pSeVgp120, zusätzlich zu
pGEM-NP, pGEM-P/C und pGEM-L, wurde chorio-allantoide Flüssigkeit
aus Hühnereiembryos
gewonnen und auf die virale HAU genau wie im Beispiel 2 beschrieben
untersucht. Das gewonnene Virus wurde auch auf die Expression von
gp120 durch ELISA wie folgt untersucht.
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Es
wurden Proben (jeweils 100 μl)
in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte verteilt, die mit einem
monoklonalen Antikörper
gegen HIV-1 beschichtet worden war, und bei 37°C 60 Minuten inkubiert. Nach
dem Waschen mit PBS wurde ein HRP-verknüpfter anti-HIV-1- Antikörper (jeweils
100 μl)
jeder Vertiefung zugegeben, und es wurde bei 37°C 60 Minuten inkubiert. Nach
dem Waschen mit PBS wurde jeder Vertiefung Tetramethylbenzidin zugegeben,
und es wurden die Mengen an Reaktionsprodukt, die durch die Wirkung
von HRP unter sauren Bedingungen umgesetzt worden waren, bestimmt,
indem die optische Dichte bei 450 nm verfolgt wurde, um die Expressionsstärke von
gp120 zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in der linken Spalte in
Tabelle 4 gezeigt.
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Mit
der auf diese Weise erhaltenen Viruslösung wurden CV-1-Zellen beimpft
und auf ähnliche
Weise, wie folgt, untersucht. CV-1-Zellen wurden auf eine Kulturplatte
mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/Platte verteilt, wachsen gelassen,
und dann wurde das Kulturmedium verworfen. Nach dem Waschen mit
PBS(-) wurde die Viruslösung
den Zellen bei der Vervielfachung der Infektion von 10 zugesetzt,
und der Ansatz wurde bei Raumtemperatur eine Stunde inkubiert. Nachdem
die Viruslösung
verworfen worden war, wurde mit PBS(-) gewaschen, frisches MEM-Medium
(MEM-Medium, supplementiert mit den Antibiotika AraC und Rif sowie
Trypsin) wurde den Zellen zugegeben, und der Ansatz wurde bei 37°C 48 Stunden
inkubiert. Nach der Reaktion wurde das Medium gewonnen und auf HAU
(durch ein ähnliches
Verfahren wie in Beispiel 2 beschrieben) getestet und auf die Expression
von gp120 (durch ELISA) untersucht. Die Ergebnisse werden in der
mittleren Spalte von Tabelle 4 gezeigt. Zusätzlich wurden Hühnereiembryos
wieder mit dem Zellkulturüberstand
von CV-1-Zellen beimpft, und die auf diese Weise erhaltene Viruslösung wurde
auf HAU getestet und auch auf die gp120-Expression (durch ELISA)
untersucht. Die Ergebnisse werden in der rechten Spalte von Tabelle
4 gezeigt.
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Wie
in Tabelle 4 gezeigt, werden deutlich hohe Konzentrationen an gp120
in CV-1-Zellen in Kultur nachgewiesen (mittlere Spalte in der Tabelle),
und auch in den chorio-allantoiden Flüssigkeiten von Hühnereinembryonen,
die wieder mit dem Virus beimpft worden waren (rechte Spalte der
Tabelle). In den rechten und mittleren Spalten der Tabelle werden
die Mittelwerte der drei Klone gezeigt.
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Weiterhin
wurde die Expression von gp120 durch Westernblot analysiert. Nachdem
das Kulturmedium von CV-1-Zellen, die mit SeVgp120 infiziert waren,
bei 20.000 Upm eine Stunde zentrifugiert worden war, um das Virus
zu sedimentieren, wurde der Überstand
entweder mit TCA (10 Vol.-%) 15 Minuten auf Eis oder mit 70% Ethanol
bei –20°C behandelt
und 15 Minuten bei 15.000 Upm zentrifugiert. Die auf diese Weise
präzipitierten
Proteine wurden gemischt, um mit einem „SDS-PAGE-Probenpuffer" (Daiichi Chemicals)
bei 90°C
3 Minuten zu reagieren, und sie wurden dann einer Elektrophorese
in 10% SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE)
unterzogen. Die auf diese Weise fraktionierten Proteine wurden auf
PVDF-Membranen (Daiichi
Chemicals) übertragen,
mit einem monoklonalen Antikörper
902 bei Raumtemperatur eine Stunde lang reagieren gelassen und dann
mit T-TBS gewaschen. Die Membranen wurden mit anti-mIgG (Amersham)
bei Raumtemperatur eine Stunde reagieren gelassen und mit T-TBS
gewaschen. Die Membranen wurden dann mit HRP-verknüpftem Protein
A (Amersham) bei Raumtemperatur für eine Stunde reagieren gelassen,
mit T-TBS gewaschen, und es wurde 4-Chlor-1-naphthol (4CNPlus) (Daiichi
Chemicals) zugegeben, um gp120 nachzuweisen. Als Ergebnis wurden
Proteinbanden in Positionen sichtbar gemacht, die denen des erwarteten
Molekulargewichts von gp120 entsprachen.
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Zusätzlich wurden
die Wirkungen eines Zeitraums nach Infektion (Postinfektionszeit)
von CV-1-Zellen, die mit SeVgp120 transfiziert worden waren, auf
den HAU-Wert und die Expressionsstärke von gp120 analysiert. CV-1-Zellen
(5 × 106), die auf 10 cm-Platten verteilt worden
waren, wurden mit SeVgp120 bei einer Vervielfachung der Infektion
von 10 infiziert, und das Kulturmedium (jeweils 1 ml) wurde nach
der Infektion zu den Zeitpunkten 30, 43, 53 und 70 h mit einem gleichen
Volumen an frischem Medium gemischt und der Bestimmung des HAU,
der Untersuchung der gp120-Expression (durch ELISA) und einem Westernblot
unterzogen. Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt.
Wie in 3 eindeutig gezeigt, neigt die Produktion von
gp120 dazu, mit dem Ansteigen des HA-Titers des Sendai-Virus anzusteigen.
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Beispiel 6: Analyse der
SeVgp120-Propagation und der Expressionsstärke von gp120 in verschiedenen
Zelltypen
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Unter
Verwendung ähnlicher
Verfahren wie denen in Beispiel 5, mit Ausnahme der Verwendung von verschiedenen
Zelltypen, wurden HAU und die Expressionsstärken von gp120 (durch ELISA)
getestet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
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In
der linken Spalte der Tabelle werden die Zeiten nach Infektion von
verschiedenen Zelltypen, die mit SeVgp120 transfiziert worden waren,
gezeigt. Als Ergebnis wurden die SeVgp120-Propagation und die gp120-Expressionen
in allen Zelltypen getestet.
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Beispiel 7: Studien zur
Expression des Luziferasegens, eingefügt in den Sendai-Virusvektor
in Wirtszellen
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Um
das Luziferasegen zum Einfügen
in Vektoren zu isolieren, wurde das Luziferasegen, begrenzt durch
die konstruierten NotI-Schnittstellen an beiden Termini, durch Standard-PCR
und Verwendung eines Satzes von Primern [5'-AAGCGGCCGCCAAAGTTCACGATGGAAGAC-3' (30mer) (SEQ ID
NO: 3)] und [5'-TGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGATTATTACAATTT
GGACTTTCCGCCC-3-(69mer) (SEQ ID NO: 4)] mit „pHvluciRT4" als Matrize konstruiert.
Das PCR-Produkt wurde in das NotI-Fenster von pSev18+ kloniert,
um einen Sendai-Virusvektor
zu erhalten, in den das Luziferasegen eingefügt wurde. Dann wurden mit diesem
rekombinanten Vektor LLCMK2-Zellen transfiziert, und Hühnereinembryos wurden
damit beimpft. Chorio-allantoide Membranen von sich entwickelnden
Eiern wurden ausgeschnitten, zweimal mit kalter PBS(-) gewaschen,
und es wurde nach der Zugabe eines Lysepuffers (Picagene-WAKO) (25μl) und sorgfältigem Mischen
bei 15.000 Upm 2 Minuten zentrifugiert. Dem Überstand (jeweils 5 μl) wurde das
Substrat (IATRON) (50 μl)
zugegeben, und die Mischung wurde in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte
verteilt. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Luminometer
(Luminous CT-9000D, DIA-IATRON) gemessen, und die Enzymaktivität wurde
in Counts pro Sekunde (cps) ausgedrückt. Als Ergebnis wurde eine
extrem hohe Luziferaseaktivität
mit CV-1-Zellen 24 Stunden nach Infektion nachgewiesen (Tabelle
6). In diesem Fall wurde das Sendai-Virus, das das Luziferasegen
nicht trug, als Kontrolle verwendet (in der Tabelle durch „SeV" dargestellt). Die
von zwei Klonen erhaltenen Ergebnisse werden in der Tabelle gezeigt.
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Tabelle
6 Fluoreszensintensität (Counts/10
sec)
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Gewerbliche Anwendbarkeit
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein System etabliert
worden, das die effiziente Gewinnung von Viruspartikeln von cDNAs
von Negativstrangviren erlaubt, und es ist auch ein Verfahren entwickelt
worden, das die Produktion und Amplifikation von „Komplexen,
die von RNAs umfasst werden, die sich von einem bestimmten sich
verbreitenden Negativstrang-RNA-Virus und strukturellen Virusbestandteilen,
die keine Nukleinsäuren
enthalten, ableiten, damit sie Infektiosität und die Fähigkeit, autonom RNA zu replizieren, jedoch
keine Potenz zur Verbreitung" aufweisen.
Da die Komplexe sich nur in infizierten Zellen replizieren können, sind
diese Techniken besonders nützlich
auf dem Gebiet der Gentherapie etc., auf dem die therapeutische Sicherheit
höchst
wünschenswert
ist.
