CN1198934C - 具有接触侵入能力的rna病毒载体 - Google Patents

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Abstract

一种可用于基因治疗的RNA病毒载体。该RNA病毒载体具有感染细胞、自主复制RNA和接触侵入能力但没有传染性。若使用本发明的RNA病毒载体进行基因治疗，可比现有技术更有效地进行基因转移和细胞移植。

Description

具有接触侵入能力的RNA病毒载体
                             技术领域
本发明涉及一种能用于基因治疗的病毒载体，更具体地说，涉及一种灭活的负链RNA((-)RNA)病毒载体。
                             背景技术
在人和动物的基因治疗中，有效性和安全性非常重要。特别是在使用通过病毒基因重组而得到的“病毒载体”的疗法中，当难以判断非特异性染色体整合、重组或病原性病毒泄露到自然界，以及导入基因的失控表达等情况的概率时，即使疗法很有效也必须非常小心地进行治疗。
病毒载体主要用于借助病毒的感染性将目的基因导入靶细胞。已经通过基因工程插入目的基因插入片段的重组病毒载体在其表面含有病毒的包膜蛋白。由于包膜蛋白维持着病毒的感染性，就有可能使它内在的重组基因插入片段导入到细胞中。这些载体可以用于基因治疗，也可以用于制备表达目的基因的细胞以及产生转基因动物。
病毒载体分为三类：逆转录病毒载体、DNA病毒载体和RNA病毒载体。其中，就安全性而言，那些不会整合到染色体中的RNA病毒载体较有利。根据这一技术背景，已有人提供了来源于非分节段的(-)RNA病毒比如仙台病毒的病毒载体(D.Yu等，基因到细胞(Genes to Cells)2：457-466，1997；M.Hasan等，普通病毒学杂志78：2813-2820，1997)。本发明人建立了一种(-)RNA病毒载体，它有感染性和自主的RNA复制能力，但没有传播能力(WO 97/16538)。
                             发明公开
本发明的一个目的是提供一种能用于基因治疗的RNA病毒载体。
利用仙台病毒(一种代表性(-)RNA病毒，被认为是就安全性和便利性来说，最适合工业应用的载体)的核酸，本发明人成功地获得了多种缺陷突变体，它们是利用已知方法实验重建的。结果本发明人发现由携带M基因缺陷的突变体重建的复合体能形成噬斑，这些噬斑比野生型病毒所形成的小，但不能在鸡胚中增殖。因此，发明人认定所述突变体能感染细胞、自主复制RNA和接触侵入，但不能传播。此外，M基因带有缺陷的缺陷型突变体所形成的噬斑能被抗仙台病毒的抗体染色，不能被抗M的单克隆抗体染色。从这个结果发明人确定由M突变体形成的噬斑缺少完整的M蛋白，这样就实现了本发明。
因此，本发明提供了这样一种RNA，该RNA包含参与接触侵入和自主RNA复制的基因，但没有参与传播的基因或该基因失活。
本发明还提供了一种细胞，它包含上面描述的RNA，能让所述RNA在其中复制并通过接触侵入将该RNA传递到另一个细胞中。
此外，本发明提供了一种复合体，它能感染细胞、接触侵入和自主RNA复制，但不能传播；还提供了制备该复合体的方法、制备该复合体的试剂盒和宿主。
再次，本发明提供了一种DNA，它包含体外或细胞内转录以上描述的RNA的模板DNA。
文中病毒载体的“细胞感染性”意味着“病毒载体发生细胞粘附和膜融合以便将内源核酸导入细胞的能力”。“传播能力”意味着“核酸具有的借助人工或者感染导入细胞以便该核酸在细胞内复制后形成感染颗粒或与此相当的复合体，并向另一细胞传递的一种能力”。“接触侵入能力”意味着“携带病毒载体基因的细胞将该基因通过接触转移给另一个细胞的能力”。
能接触侵入但不能传播的病毒载体可以克服现有的不具备传播和接触侵入能力的病毒载体的一个重要缺点。换句话说，当细胞感染了病毒载体而表达该载体中的一个基因时，现有病毒载体只能在被直接感染的细胞中表达蛋白质。这在使用细胞培养物体系时不成问题，这种情况中细胞长成单层，可以用病毒载体直接感染。但是，当用病毒载体感染那些立体地存在于多层中的体内细胞时，被现有载体直接感染的细胞区域和数量就很有限。例如，要用病毒载体直接感染肿瘤部位所有的肿瘤形成细胞非常困难。
相反，利用本发明所述能够接触侵入的病毒载体来感染肿瘤部位的肿瘤细胞，即使只有部分细胞被直接感染，邻近感染细胞的那些未感染细胞也可以通过接触侵入而被载体感染，使得所有肿瘤细胞被感染。由于载体不是传播性的，它不可能通过血流感染体内的其它细胞。
因此，本发明的病毒载体具有这样的新特点，即它能感染有限区域或特定器官中的所有细胞，而不感染身体其它部分。
此外，携带本发明所述能感染细胞、自主RNA复制和接触侵入，但不能传播的病毒载体的细胞可以用于细胞移植。由于携带能自主复制并能接触侵入的病毒载体的细胞能将所述载体转移给另一个细胞，即有可能以最小剂量将带有所述载体的细胞移植到患病部位，从而治疗该处。
有报道说当麻疹病毒的M基因中有缺陷而使感染颗粒的形成受到抑制时，细胞融合能提高(T.Cathomen等，EMBO杂志17：3899-3908，1998)。但是，它没有暗示利用该病毒作为载体的可能性。
本发明所述(-)RNA病毒的来源包括仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒以及副粘病毒科的犬瘟病毒；正粘病毒科的流感病毒，水疱S和棒状病毒科的狂犬病毒。也可以使用不完全病毒比如DI颗粒(病毒学杂志68：8413-8417，1994)和合成性寡核苷酸。
来源于以上描述的任何病毒的重组(-)RNA病毒也可以作为载体原料。例如，所述重组(-)RNA病毒可以是抗原性基因失活的病毒或者是为了提高RNA转录或复制效率而改变了一部分基因的病毒。
本发明的RNA可以通过在体外或细胞内转录一个改装过的来源于以上描述的任何病毒或重组病毒的改变cDNA来获得。通过此方法得到的RNA中，原始病毒中必须至少有1个涉及传播能力的基因被缺失或失活，但参与自主复制和接触侵入的基因不应被缺失或失活。另外，还可以通过在体外或细胞内转录这样一个DNA，即在诸如DI分子一样的，带有病毒基因组两端结构的DNA中人为地插入一段与自主复制有关的基因之后的DNA，而得到的带有人工序列的RNA来制备。
在仙台病毒中，“参与自主复制的基因”是NP、P/C或L基因，“参与传播的基因”是M、F或HN基因。只将M基因缺失(切除)或失活时，将失去“传播能力”，但保留“接触侵入能力”，因为不能形成将含有基因组RNA之复合体释放到胞外的病毒体或病毒样颗粒。因此，例如，只在M基因中有缺陷的仙台病毒Z株的RNA和含有该RNA的核糖核蛋白(RNP)适用于本发明。所述基因不必与原始的病毒序列相同。可以将它们突变或者用其它病毒的相应基因来取代，只要所得基因的转录和复制活性与野生型的相当或更高。
本发明的RNA可以是在适当位点插入了外来基因的RNA。为了表达所需蛋白质，插入了编码该蛋白质的外来基因。就仙台病毒RNA(GenBank登录号M30202)而言，插入位点指位于R1和R2序列之间的多个6碱基片段的序列(病毒学杂志67(8)，1993，4822-4830)。R1和R2的共有序列分别是5’-AGGGWBAAWGD-3’和5’-DTAAGAAAAA-3’。可以通过此插入位置或者所插入外来基因的旁侧RNA核苷酸序列来调节所述插入基因的表达水平。例如，已知对于仙台病毒RNA来说，插入位置越接近NP基因，插入基因的表达水平越高。
本发明的复合体包含一个不带有以上描述的RNA和核酸的病毒结构。“没有核酸的病毒结构”是，例如，这样一个病毒，只去掉其RNA，但补充本发明所述RNA的感染性和自主复制能力，不使其具备形成病毒颗粒(它能将复合体释放到胞外，并自由移动)的能力，换句话说，不补充传播能力。在仙台病毒中，只缺失M基因的RNA与去除了RNA和M蛋白的病毒结构形成的复合体(RNP)具有感染性和自主复制能力，但没有传播能力。所述复合体可以含有其它成分，只要它们不表现出传播能力。例如，包膜表面上可以包含能结合特定细胞的分子，比如粘附分子、配体或受体。
此外，本发明涉及一种试剂盒，它包含a)以上描述的本发明的RNA，所述RNA的cRNA，或者能生物合成所述RNA或cRNA的单位，以及b)复制所述RNA或cRNA所需的一组酶，或者能生物合成这些酶的单位。可以通过将a)和b)导入适当的宿主来制备本发明所述的，能感染细胞、自主复制RNA和接触侵入，但不能传播的复合体。制备本发明所述复合体意味着重建一个具有自主复制能力的RNP。当来源于仙台病毒的RNA用于a)时，b)优选来自仙台病毒的所有NP、P/C和L蛋白或能生物合成所述蛋白质的单位。
宿主没有限制，只要它能保证所用病毒RNA在其中进行表达。当使用来源于仙台病毒的RNA时，可以用容易被仙台病毒感染的任何细胞，包括培养的哺乳动物细胞、培养的鸟类细胞和鸡胚。培养细胞的例子是LLCMK2、MDCK、MDBK、CV-1、Hela、HepG2、P19、F9、CHO、PC12、293细胞、BAF3、Jerkat、人PBMC、MT-4、Molt-4、NIH3T3、L929、鸡胚成纤维细胞等。
本发明人已证明当导入细胞的仙台病毒cDNA是线形时，比环形能更有效地重建病毒颗粒，(+)RNA在细胞中能比(-)RNA更成功地形成病毒颗粒(A.Kato等，基因到细胞1：569-579，1996)。虽然这些情况并非适合所有其它(-)RNA病毒的重建，但根据本说明书的描述和常规技术，有可能确定重建其它(-)RNA病毒的合适条件。
可以通过常规方法从宿主，例如培养细胞或鸡胚中回收所制备的复合体。
可以通过用所述复合体的感染细胞来表达构成该复合体的RNA所编码的外源基因。即，可以通过将所述复合体或带有复合体的细胞接种到宿主(比如鸡胚或动物体内的合适组织)中来原位表达外来基因。替代的作法是，转化由活体收获的细胞以使所述复合体能自主复制，将转化的细胞送回活体使细胞表达外来基因。
作为本发明的一个实施方案，图9显示了用其M基因被缺失或失活的仙台病毒复合体感染靶细胞，以及经接触侵入使本发明所述RNA侵入到周围未被感染的细胞中的过程。
                             附图简述
图1示意质粒pUC18/T7(+)HVJRz的结构。
图2示意仙台病毒cDNA中带有M基因的区域以及该区域的亚克隆或突变步骤。在该图中，E代表转录终止序列；I，间插序列；S，转录起始序列。盒子指示用于质粒构建的限制位点。
图3示意向仙台病毒cDNA的M基因区域引入突变的步骤。A中上面显示仙台病毒基因组的结构，NP、P(P/C)、M、F、HN和L基因各自的位置。下面显示M基因的结构，限制位点以及用于构建M缺陷型的引物M1和M2的位置。B和C分别示意了M缺陷型(M基因有突变)和M缺失型(M基因切除)的构建过程。划叉的限制位点表明它们被突变，不能被酶消化。D显示M缺陷和野生型M基因在核苷酸和氨基酸序列方面的比较。M缺陷序列中的点表示这些碱基或氨基酸与相应野生型序列相同。[Ter]表示一个终止密码子。编号表示M基因序列中的碱基/氨基酸位置。
图4示意了亚克隆仙台病毒cDNA中M基因区的步骤。划叉的限制位点表明它们被突变，不能被酶消化。
图5示意通过突变亚克隆的仙台病毒M基因区以及用突变的M基因区代替仙台病毒cDNA中的全长M基因区来构建M缺失型cDNA。划叉的限制位点表明它们被突变，不能被酶消化。
图6示意通过突变亚克隆的仙台病毒M基因区以及用突变的M基因区代替仙台病毒cDNA中的全长M基因区来构建M缺陷型cDNA。划叉的限制位点表明它们被突变，不能被酶消化。
图7显示野生型(WT1和WT2)、M缺陷型(dM)和M缺失型(dMEA2-1和dMEA2-2)仙台病毒cDNA的噬斑。
图8显示野生型(WT)、M缺陷型(dM)和M缺失型(dMEA)仙台病毒cDNA的噬斑，它们用抗仙台病毒抗体染色。
图9阐述了野生型仙台病毒基因组(上面)和带有突变的M基因或不带M基因的突变体(下面)的仙台病毒基因组接触侵入的过程。野生型形成感染性病毒颗粒，导致接触侵入，而突变体不能形成感染性颗粒但能通过接触侵入将其基因组导入未被感染的周围细胞中。
                      实施发明的最佳方式
以下将参照实施例详细阐述本发明，但不应理解为对发明的限制。
实施例1.仙台病毒M基因的亚克隆
所有以下连接、钝化和去磷酸化分别用Takara连接试剂盒2代(TakaraShuzo，Kyoto，Japan)、Takara钝化试剂盒(Takara Shuzo)和CIAP(TakaraShuzo)，按照产品所附制造商的实验方案进行操作。通过Sanger法(Sanger，科学214：1205-1210，1981)确定核苷酸序列。
利用野生型cDNA、pUC18/T7(+)HVJRz(A.Kato等，基因到细胞1：569-579，1996)，如下构建M基因缺失的互补DNA(图1)。M基因和它附近的DNA序列如图2所示，构建方案如图3所示。
首先，从pUC18/T7(+)HVJRz中切下含有M基因的ClaI片段，插入pHSG396(Takara Shuzo)中的ClaI位点从而得到pHSG-M-CC(图4)。另外，用ApaLI消化pHSG396，钝化并自连接得到缺少ApaLI位点的pHSG396-dA(图4)。将pHSG-M-CC中带有M基因的EcoRI-BamHI片段插入去磷酸化的EcoRI-BamHI消化过的pHSG396-dA从而得到pHSG396-dA-M-BE(图4)。
实施例2.M缺失型载体的构建
将49-mer的合成寡核苷酸5’-ggcgatatctatagattccctaagttctcatagtagatgtgcaccggca-3’(EA接头F)(SEQ ID NO：1)和5’-tgccggtgcacat ctactatgagaacttagggaatctatagatatcgcc-3’(EA接头R)(SEQ ID NO：2)退火并插入pCR2.1(Invitrogen)从而产生pCR-EAL。核实插入片段的核苷酸序列是否与设计相同。
用EcoRV和ApaLI消化pCR-EAL，并切下接头片段。另外，用EcoRV和ApaLI消化pHSG396-dA-M-BE，将上面的接头片段插入得到pHSG-dA-dM-EA-EB。
用EcoRI消化pHSG396，钝化，并自连接得到缺少EcoRI位点的质粒，后者再用BamHI消化，钝化并自连接得到pHSG-dE-dB，该质粒缺少EcoRI和BamHI位点。
将带有M基因的ClaI片段插入pHSG-dE-dB中的ClaI位点以便产生pHSG-dE-dB-M-CC。将从pHSG-dA-dM-EA-EB中切下的EcoRI-BamHI片段插入EcoRI-BamHI消化过的pHSG-dE-dB-M-CC中得到pHSG-dE-dB-dM-CC。
将pHSG-dE-dB-dM-CC的ClaI片段插入pUC18/T7(+)HVJRz中的ClaI位点得到pHVJ-dMEA。以上构建方案如图5所示。
实施例3.构建M缺陷型载体
以pUC18/T7(+)HVJRz作为模板与寡核苷酸引物M-1(5’-ttaaaggcctaaaccgatctcagaattacg-3’)(SEQ ID NO：3)和M2(5’-tatcattccctgtctcagcctgcc-3’)(SEQ ID NO：4)作PCR。设计引物以便在M基因的BsgI位点引入一个突变，从而使M基因读框中出现一个终止密码子。将PCR产物亚克隆到pCR2.1中得到pCR-M(图6)。
确认pCR-M的核苷酸序列后，从胶中回收pCR-M的StuI-XcmI片段，并插入StuI-XcmI切割过的pHSG-M-CC中。所得质粒命名为pHSG-dM-CC。将pHSG-dM-CC的ClaI片段插入pUC18/T7(+)HVJRz中的ClaI位点得到pHVJ-dM。这个构建方案如图6所示。
实施例4.由M缺失型和M缺陷型cDNA重建病毒体
如下所述由野生型(WT)、M缺失型(dMEA)和M缺陷型(dM)cDNA来重建病毒体。
通过胰蛋白酶处理使培养的LLCMK2细胞(一种猴肾细胞系)从培养皿上脱落下来，将2×106个细胞铺在一个直径10cm的塑料培养皿中，在补充了10％FBS(Gibco BRL)的MEM培养基(Gibco BRL)中于37℃，5％CO2环境中温育24小时。然后移去培养基，用PBS将细胞洗一次。将500μl能够表达T7噬菌体RNA聚合酶的重组痘苗病毒载体vTF7-3(T.R.Fuerst等，美国科学院学报83：8122-8126，1986)滴加到培养皿中，所述载体已用PBS稀释到8×106pfu/ml以使MOI(感染复数)达到2。将细胞感染1小时，每15分钟摇动一次培养皿以便使病毒溶液铺满整个培养皿。
另外，如下制备含有cDNA溶液的培养基。首先，向聚苯乙烯试管中加入500μl不含FCS(胎牛血清)的Opti-MEM(Gibco BRL)，然后加入pUC18/T7(+)HVJRz、pHVJ-dMEA或pHVJ-dM(这些质粒均来源于仙台病毒cDNA)之任一(20μg)、pGEM-NP(5μg)、pGEM-P(2.5μg)和pGEM-L(5μg)。再加入50μl SuperFect(QIAGEN)，让混合体系于室温保持20分钟。然后加入10ml Opti-MEM。随后，加入利福平和阿糖胞苷(AraC)，使之终浓度分别为100μg/ml和40μg/ml。
感染1小时后，从以上含有LLCMK2细胞的培养皿中移去病毒液，向培养物中倾注入含有上述cDNA溶液的培养基，将细胞于37℃，5％CO2环境中保温48小时。用细胞刮刀刮下细胞，不要除去培养基，将细胞和培养基一起转移到1个15ml的离心管中。于1200rpm离心5分钟后，移去上清液，将沉淀的细胞重悬于200μl PBS中。
实施例5.向鸡胚接种细胞悬液以及HA检测
为了评价病毒重建情况，作一个使用鸡胚的检测。将悬浮在200μl PBS中的实施例4所获细胞调节为1×107细胞/ml，然后用PBS连续稀释以便获得1×106细胞/ml和1×105细胞/ml的细胞悬液。用24G针头将悬液各100μl通过气室一端接种10天龄的鸡胚。
鸡卵于35.5℃振荡保温3天。然后切下气室处的蛋壳，用一个带有18G针头的10ml注射器收集尿液。
通过HA检测法来检查收集到的尿液以便评价病毒在鸡胚中的增殖情况。HA检测如下进行。
将50μl PBS分加到96孔圆底培养板第2到12行的每个孔中。向第1行加入100μl尿样。取第1行的50μl样品与第2行的PBS混合制得1∶2稀释液。50μl 1∶2稀释液与第3行的PBS混合得到1∶4稀释液。重复该步骤，制备两倍倍比稀释液。
向所有行中加入50μl用PBS稀释过的1％储存鸡血液(Cosmo Bio)，将培养板于4℃保持1小时。肉眼观察红细胞凝集现象，产生凝集的最高稀释度作为HA活性(表1)。
                  表1
    病毒cDNA     HA活性
    WT(野生型)     ＞16
    dM(缺陷)     ＜2
    dMEA2-1(缺失)     ＜2
    dMEA2-2(缺失)     ＜2
所用病毒cDNA是病毒的野生型(pUC18/T7(+)HVJR；WT)、M缺陷型(pHVJ-dM；dM)和M缺失型(pHVJ-dMEA；dMEA)。对于M缺失型，显示了两个实验的结果(dMEA2-1和dMEA2-2)。野生型病毒显示出16以上的活性，而其他样品没有显著活性。这个结果表明M基因缺失或缺陷的仙台病毒cDNA在常规重建实验中不产生具有传播能力的病毒。
实施例6.噬斑形成
将CV-1细胞以5×105细胞/孔的浓度铺在6孔培养板(Corning，6-孔微滴板)上，过夜培养。
用PBS将实施例4中得到的LLCMK2细胞稀释到1×106细胞/ml，取100μl悬液分加到1.5ml微量管(Eppendorf)中。将部分悬液反复冻融3次：-80℃冷冻10分钟，室温在水中融化3分钟。向所有细胞悬液中加入终浓度0.75μg/ml的胰蛋白酶，混合体系在37℃温育30分钟。
移去CV-1细胞培养板中的培养基，用PBS将细胞洗1次，然后覆盖上100μl上述用胰蛋白酶处理过的稀释细胞悬液。混合物保温1小时，每15分钟摇动一次以便使悬液铺满整板。用3ml含有1％琼脂的1x MEM覆盖培养板，该MEM补充了0.1％BSA、利福平100μg/ml、Ara C 40μg/ml和胰蛋白酶0.75μg/ml，并预热到45℃左右。等琼脂凝固后，将培养板反转，于37℃在5％CO2中培养5天。
然后，向琼脂上加入1ml固定液(乙醇∶乙酸＝5∶1)，培养板在室温保持90分钟。然后除去琼脂，加入200μl胺黑溶液(0.5％胺黑、乙醇∶乙酸∶水＝45∶10∶45)。之后立即用水清洗细胞并染色，计噬斑数目，评价噬斑形状。结果如表2和图7所示。
                  表2
      M基因缺失或缺陷的仙台病毒的重建效率
    M基因              噬斑数目
    冻融过的   没有冷冻的
  第1轮   第2轮
    野生型     38     22     14
    M缺陷型(dM)     2     4     2
  M缺失型(dMEA2-1)     27     26     60
  M缺失型(dMEA2-2)     32     38     42
所用病毒cDNA是病毒的野生型(pUC18/T7(+)HVJR)、M缺陷型(pHVJ-dM)和M缺失型(pHVJ-dMEA)。对于M缺失型，显示了两个实验的结果(dMEA2-1和dMEA2-2)。冻融过的和没有冷冻的细胞悬液的噬斑数目均进行了计数。噬斑数目反映了在1×105个转染的LLCMK2细胞中重建病毒的数目。使用冻融样品的实验进行了2次(第1和第2轮)。虽然有报道说仙台病毒的重建效率在突变病毒(比如在基因组中插入了一个外来基因的附加型)中下降(Hansan等，普通病毒学杂志78：2813-2820，1997)，M缺失型显示出与野生型相当的重建效率。M缺陷型呈现略低的效率。转染细胞的冻融没有显著影响噬斑数目。
由表2和图7清晰可见，能观察到认为是来源于M缺失型和M缺陷型cDNA的噬斑。噬斑的大小比同时形成的野生型阳性对照(图7，WT1和WT2)小得多。为了进一步检验噬斑的形状，用抗仙台病毒多克隆抗体将其染色，所述抗体是由已知方法通过以纯化灭活后的仙台病毒作为抗原接种兔子制备来的。
用抗仙台病毒抗体与实施例6中描述的并已固定和用胺黑染色的噬斑进行杂交，接着用偶联FITC的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗体杂交，然后在荧光显微镜下观察。结果是，在野生型、M缺失型和M缺陷型cDNA形成的噬斑中检测到信号，证实这些噬斑是仙台病毒形成的噬斑(图8)。
观察到野生型cDNA的噬斑是接近圆形的，而M缺失和M缺陷型cDNA形成的噬斑小，并且不圆，具有不规则的形状(图8)。
实施例7.噬斑的抗体染色
为了确定与野生型在大小和形状上不同的噬斑来源于M缺失型或M缺陷型cDNA，检查是否存在M蛋白。即，用抗M蛋白的单克隆抗体将这些噬斑染色，并在荧光显微镜下观察。
如下进行噬斑的免疫荧光染色。
用胺黑将噬斑染色。肉眼检查噬斑的位置并用记号笔标记。用1ml PBS将6孔培养板的每个孔洗一次，覆盖上200μl 1∶40稀释的抗M蛋白单克隆抗体，于37℃在CO2培养箱中保温45分钟。然后用1ml PBS将孔洗三次，覆盖上200μl 1∶100稀释的偶联FITC的抗小鼠IgG抗体(Cosmo Bio)，于37℃在培养箱中保温45分钟。最后，每个孔用1ml PBS洗三次，覆盖上1ml PBS。然后在荧光显微镜下检验标记噬斑的染色情况。
在这之后，以抗仙台病毒多克隆抗体作为一抗，偶联FITC的抗兔IgG抗体(ICN Biomedicals)作为二抗重复与上面相同的步骤。然后再在荧光显微镜下观察各孔。
抗仙台病毒抗体和抗M蛋白单克隆抗体均能将来自野生型cDNA的噬斑染色。相反，来自M缺失或缺陷型cDNA的噬斑能被抗仙台病毒抗体染色，但不被抗M蛋白的单克隆抗体染色。这表明后一类噬斑缺少完整M蛋白，确实来源于M缺失或缺陷型cDNA。
据此，获得了来源于M基因缺失或缺陷的仙台病毒基因的噬斑。由于形成噬斑的病毒不能在鸡胚中增殖，可以认为病毒不能出芽，即不是传播性的。另外，因为病毒能形成噬斑，认为它能接触侵入。
这种模式的增殖可能是由于F和HN蛋白介导的细胞融合造成的。即，在仙台病毒编码的蛋白质中，F和HN蛋白被表达为细胞表面的膜蛋白，M蛋白在病毒出芽中作为一个胞内的锚支撑F和HN蛋白。在M缺失和缺陷型的情况下，由于丢失了锚，不发生出芽。然而F和HN蛋白表达在细胞表面上，而细胞融合由这些蛋白质介导，因此病毒基因组能转移到周围的细胞中。这样，就有可能实现病毒的增殖而不出芽(图9)。
                          工业用途
利用本发明能提供一种RNA病毒载体，它具有感染细胞、自主RNA复制和接触侵入的能力，但不能传播。通过利用本发明所述RNA病毒载体，即可能在基因治疗时实现更有效的基因导入和细胞移植。
                          序列表
<110>DNAVEC Research Inc.
<120>具有接触侵入能力的RNA病毒载体
<130>D3-002PCT
<140>
<141>
<150>JP1998-227398
<151>1998-08-11
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：EcoRV-ApaL1接头
<400>1
ggcgatatct atagattccc taagttctca tagtagatgt gcaccggca         49
<210>2
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：EcoRV-ApaL1接头
<400>2
tgccggtgca catctactat gagaacttag ggaatctata gatatcgcc       49
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于在SeV的M基因内产生一个终止密码子的引物
<400>3
ttaaaggcct aaaccgatct cagaattacg                             30
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于在SeV的M基因内产生一个终止密码子的引物
<400>4
tatcattccc tgtctcagcc tgcc                                   24

Claims (12)

1.一种RNA分子在制备用于将外来基因经由接触侵入而从第一个细胞转移到第二个细胞的制剂中的用途，所述RNA分子来源于非分节段(-)RNA病毒且缺乏编码基质蛋白的基因或包含已失活的编码基质蛋白的基因。
2.权利要求1的用途，其中所述RNA分子来源于副粘病毒科(Paramyxoviridae)。
3.权利要求1的用途，其中所述RNA分子来源于仙台病毒(Sendaivirus)。
4.一种DNA分子在制备用于将外来基因经由接触侵入而从第一个细胞转移到第二个细胞的制剂中的用途，所述DNA分子包含作为体外或在细胞内转录RNA分子的模板，其中所述RNA分子来源于非分节段(-)RNA病毒且缺乏编码基质蛋白的基因或包含已失活的编码基质蛋白的基因。
5.权利要求4的用途，其中所述RNA分子来源于副粘病毒科(Paramyxoviridae)。
6.权利要求4的用途，其中所述RNA分子来源于仙台病毒(Sendaivirus)。
7.一种细胞在制备用于将外来基因经由接触侵入而从第一个细胞转移到第二个细胞的制剂中的用途，所述细胞含有一种RNA分子，该RNA分子来源于非分节段(-)RNA病毒且缺乏编码基质蛋白的基因或包含已失活的编码基质蛋白的基因。
8.权利要求7的用途，其中所述RNA分子来源于副粘病毒科(Paramyxoviridae)。
9.权利要求7的用途，其中所述RNA分子来源于仙台病毒(Sendaivirus)。
10.一种复合体在制备用于将外来基因经由接触侵入而从第一个细胞转移到第二个细胞的制剂中的用途，所述复合体包含一种RNA分子，该RNA分子来源于非分节段(-)RNA病毒且缺乏编码基质蛋白的基因或包含已失活的编码基质蛋白的基因。
11.权利要求10的用途，其中所述RNA分子来源于副粘病毒科(Paramyxoviridae)。
12.权利要求10的用途，其中所述RNA分子来源于仙台病毒(Sendaivirus)。
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