CN1118569C - 具有自主复制能力的负链rna病毒载体 - Google Patents

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Abstract

一种用于通过将仙台病毒导入早期复制基因已被全部表达的宿主来重建仙台病毒颗粒的方法。该方法使得可能生产一种具有高实用价值的(-)-链RNA病毒载体。

Description

具有自主复制能力的负链 RNA病毒载体
本发明涉及一种用于基因治疗的病毒载体。本发明更加特别地涉及一种负链RNA病毒载体。
对于用于人类和动物的基因治疗说来，疗效和安全性是非常重要的因素。尤其是，在存在有不容否认的可能性时，如基因可能被插到染色体DNA的非特异位点、重组病毒和致病病毒可能被释放入自然环境以及不能控制转染到细胞中的基因的表达水平等，通过使用由病毒基因重组获得的“病毒载体”而进行的治疗尽管其疗效被公认，其治疗还是必须十分小心地进行。
近来，进行了大量的使用重组病毒的基因治疗并且提出了很多基因治疗的临床方案。这些重组病毒载体的特征主要取决于衍生出所述载体的病毒的那些特征。
病毒载体的基本本质是一种通过利用病毒的感染性将目的基因转移到靶细胞的方法。本说明书中的“感染性”是指“病毒通过其维持对细胞的附着和融合到膜的能力而将其核酸等转移到细胞的能力”。经遗传操作插入了目的基因的重组病毒载体的表面具有核壳和包膜蛋白等，其保持了厚有病毒的感染性。使得能够将包装的重组基因转移到细胞中。这些重组病毒载体不仅可用于基因治疗的目的，而且可用于生产表达目的基因的细胞以及转基因动物的目的。
病毒载体被分为三类，包括逆转录载体、DNA病毒载体以及RNA病毒载体。
近日来，在基因治疗中使用得最频繁的载体是源自逆转录病毒的逆转录病毒载体。逆转录病毒通过以下过程复制。首先，病毒感染一旦成立、通过利用其自身的逆转录酶作为至少是一部分的催化剂和其自身的RNA作模板产生互补的DNA(cDNA)。几个步骤之后，所述cDNA被掺入至宿主染色体DNA中，成为前病毒。通过源自宿主的依赖于DNA的RNA聚合酶转录前病毒，产生病毒RNA，其被由其自身的基因编码的基因产物包装成病毒颗粒。
一般，用于基因治疗等的逆转录病毒载体能将过程进行至前病毒的产生。但是，其为丧失其包装所需的基因的缺损病毒以致于其不由前病毒形成病毒颗粒。逆转录病毒包括诸如鼠白血病病毒、猫白血病病毒、baboon丙型肿瘤病毒、人免疫缺损病毒、成人T细胞白血病病毒等。此外，迄今报导的重组逆转录载体包括源自鼠白血病病毒[参见“病毒学”(Virology)，65，1202(1991)，“生物技术”(Biotechniques)，9，980(1989)，“核酸研究”(NucleicAcids Research)，18，3587(1990)，“分子和细胞生物学”(Molecular and CellularBiology)，7，887(1987)，“美国国家科学院院刊”(Proceedings of NationalAcademy of Sciences of United States of America)，90，3539(1993)，“美国国家科学院院刊”，86，3519(1989)，等]以及那源自人免疫缺损病毒的那些载体[参见“临床研究杂志”(Joumal of Clinical Investigation)，88，1043，(1991)]等。
逆转录病毒作为目的在于有效地将一个特定的DNA整合到染色体DNA中而制作的载体。但是，由于不能预料目的基因的插入位置，存在着不容否认的可能性，如由于插入灭活损伤正常基因、激活致癌基因以及过量或抑制表达目的基因。为解决这些问题，已研制出了利用可用作染色体外基因的DNA病毒载体的瞬时表达系统。
DNA病毒载体源于DNA病毒，DNA病毒的病毒颗粒中以DNA作为遗传信息。所述DNA的复制是以自身作模板通过以利用源于宿主的依赖于DNA的DNA复制酶作为至少一部分催化剂的产生互补DNA链的过程的重复来进行。实际的利用腺病毒载体(一种可用作染色体外基因的DNA病毒载体)的基因治疗可以“自然遗传学”[(Nature Genetics)，3，1-2(1993)]中的文章为例。但是，由于在DNA病毒载体的情况下，产生不合乎需要的与核中染色体DNA的重组也是非常可能的，应非常小心应用其作为基因治疗载体。
近来，已研究出可能比上述DNA病毒载体更为安全的基于RNA病毒的RNA病毒载体作为。RNA病毒通过重复其以其自身RNA作模板用其自身的依赖于RNA的RNA复制酶作催化剂产生互补链的过程来复制。
正链RNA病毒的基因组RNA具有作为信使RNA(下文简称为mRNA)的双重功能，依赖于宿主细胞的转译功能产生复制和病毒颗粒形成所需的蛋白。换句话说，正链RNA病毒的基因组RNA本身具有传播(disseminative)能力。本说明书中“传播能力”指“通过感染或人工技术将核酸转移至宿主细胞中后存在于细胞的该核的通过复制形成感染的颗粒或其相当的复合体并将它们传播到其他细胞”。属于正链RNA病毒的新培斯病毒和属于负链RNA病毒的仙台病毒均有感染性和传播能力。属于Parboviruses的腺-卫星病毒有感染性但无传播性(形成病毒颗粒需要与腺病毒混合感染)。而且，源于体外人工转录的新培斯病毒的正链RNA是传播性的(在转染到细胞中时形成的病毒颗粒)，但体外人工转录的仙台病毒的正和负RNA链均不是传播性的(在转染到细胞中时不产生病毒颗粒)。
鉴于基因组RNA同时起着mRNA的作用的优点，以前多研制源于正链RNA病毒的RNA病毒载体[参见“生物技术”(Bio/Technology)，11，916-920(1993)，“核酸研究”(Nucleic Acids Research)，23，1495-1501(1995)，“人类基因治疗”(Human Gene Therapy)，6，1161-1167(1995)，“细胞生物学方法”(Methods in Cell Biology)，43，43-53(1994)，“细胞生物学方法”，43，55-78(1994)]。例如，源自Semliki forest virus(SFV)和新培斯病毒的RNA病毒载体的基本结构是RNA，其中包括缺损与病毒结构有关的结构基因区域，后剩下的编码病毒转录和复制所需的蛋白的一组基因，并加上连接在转录启动子下游的目的外源基因。通过直接注射将可转录所述RNA的这些重组RNA或从其转写成的cDNA转染至细胞中[“核酸研究”(Nucleic Acids Reseurch)，23，1495-1501(1995)]使得能够自主复制含外源基因的RNA载体，转录插入到转录启动子下游的外源基因，结果导致细胞中由外源基因表达目的产物。而且，本发明在通过用于表达病毒结构基因的cDNA单元(辅助因子)和用于在包装细胞中表达所述RNA载体的cDNA单元的共存建立起感染的但无传播性的复合体的方面获得了成功。但是，源于辅助因子的RNA和载体RNA之间的重组常常发生在包装中，导致了感染颗粒的出现。随后，阐明了存在于作为正链RNA病毒的特征的二十四面体外壳中的突起蛋白催化这一重组。因而，曾试图以在突起蛋白中导入变异来解决这些问题[“生物技术”，11，916-920(1993)]。
预计正链RNA病毒载体可用作具自主复制能力的RNA载体，但其用作基因治疗载体仍存在以下问题。
1.由于其为二十四面体结构，允许插入的外源基因的大小被限制到至多有3,700个核苷酸。
2.直到核酸由包装复合体释放至细胞中并且被复制，需要多至5个过程，包括细胞粘着、胞吞、膜融合、去衣壳化以及复制酶的转译。
3.不能否认在包装中可能形成即使是少量的传播性的病毒颗粒。尤其是，即使用减毒的病毒颗粒，其内部的RNA本身有传播能力并可能有迟缓扩增，因而检测它们比较困难。
4.由于这些载体源于通过诸如蚊子的昆虫传播的病毒，在被转染这些载体基因的动物和人类被野生型病毒混合感染时，就可能形成有传播性的重组体，还可能产生所述重组体通过昆虫被传播到自然环境中的危险。
设想到如果构建源于负链RNA病毒的RNA病毒载体，上述这些难题会基本解决。即，由于负链RNA病毒不具有二十四面体结构的衣壳，并且也由于了解到颗粒的包膜大小根据内部的RNA含量而变化，推测其在用作RNA病毒载体时更少受待插入的外源基因的大小限制。而且由于一组转录和复制所需的蛋白被包装到颗粒中，直至核酸被从包装的复合体释放并被复制，只需细胞粘着和膜融合两个步骤。另外，单独的病毒RNA本身是无传播性的，且传播性的颗粒能容易地被鉴定，因为其极易与细胞膜融合并在细胞中增殖。因此，可容易地检测到有传播性的颗粒的存在。除此之外，负链RNA病毒还不会被昆虫传播。
虽然可用作工业用病毒载体来源的负链RNA病毒有许多优点，直至现在还未能获得任何能用于基因治疗的负链RNA载体。这可能是由于在通过病毒cDNA重建病毒方面有相当大的难度。由于插入外源基因到载体中需DNA水平的基因操作，如不能从携带插入的外源基因的病毒cDNA重建病毒颗粒，则难以利用负链RNA病毒作为载体。“病毒颗粒的重建”指在体外或胞内由人工制备的病毒基因组核酸建成原病毒或重组病毒。
如上述，已清楚地说明即便是将负链RNA病毒(vRNA：病毒RNA)或仅将其互补链RNA(cRNA，complementary RNA)转染到细胞中，也不能产生任何负链RNA病毒。与正链RNA病毒相比，这是一个明显不同的要点。虽然在特开平4-211377中，描述了“制备相应于负链RNA病毒基因组的cDNA和具感染性的负链RNA病毒的方法”，后来全文登载了该文件所述实验内容的“欧洲分子生物学联合地杂志”，9，379-384(1990)证明所述全部实验不能重现，因而作者本人收回了所有的文章内容[参考“欧洲分子生物学联合会杂志”，10，3558(1991)]。因此，显然于Tokkai H4-211377中描述的技术显然不能作为本发明的先行技术。
关于负链RNA病毒的重建体系，就流感病毒有所报导[微生物学年评”(Annu.Rev.Microbiol.)，47，765-790(1993)；“当今遗传学和发育学观点”(Curr.Opin.Genet.Dev.)，2，77-81(1992)]。流感病毒是分8个节段的负链RNA病毒。根据这些文献，首先将外源基因插入到其中一个节段相应的cDNA中，并把由与包括插入所述外源基因的所有八个节段相应的cDNA转录的RNA与源于病毒的NP蛋白会合装配成RNP。然后，通过向细胞提供这些RNP和依赖于RNA的RNA聚合酶建立起病毒重建体系。此外，关于负的单链RNA病毒，有报导在弹状病毒的狂犬病毒由cDNA重建病毒[“病毒学杂志”，68，713-719(1994)]。
但是，由于以下问题，一直难于以的这些病毒重建技术来构建用于基因治疗的载体。
1.只通过标记基因表达、RT-PCR等鉴定重建的病毒。还未建立起产率上可供利用的产生载体病毒的重建系统。
2.与正链RNA病毒的情况不同，为形成有感染性但缺乏如传播能力的复合体，必需在复合体中包装初转录和复制所需的因子。但至今还未建立起大规模扩增这些复合体的技术。
3.为了在胞内提供病毒重建所需的因子，导入cDNA的细胞需同时用诸如野生型病毒和重组痘苗病毒等的混合感染。不容易分离这些加入的天然型病毒。
此外，还有一个与整个RNA病毒相关的问题，即如果大量复制和转录RNA对治疗的人类和动物产生不希望有的效果，有必要予先提供对宿主复制和转录无影响的用于RNA病毒载体复制的抑制剂。但是，还未研制出任何这样的抑制剂。
本发明要解决的问题是研制可用于实际用途的负链RNA病毒载体、用于有效制备所述载体的方法以及用于所述载体复制的抑制剂。
本发明人首先试图用典型的负链RNA病毒而且从安全性和方便的角度看来，其作为载体在工业上是最有用的仙台病毒的核酸重建仙台病毒。首先，为用于重建实验，用源自仙台病毒DI颗粒(缺损干扰颗粒)[参见“欧洲分子生物学联合会杂志”，10，3079-3085(1991)]的cDNA或仙台病毒小基因组的cDNA作为实验材料进行了各种实验。结果，本发明人发现了有关待转移到宿主细胞的物质间的重量比例的有效条件，这些物质包括cDNA、与转录和复制有关的cDNA群以及作为用于表达T7RNA聚合酶的单元的重组痘苗病毒。此外，本发明人获得了与正链和负链相应的全长cDNA，构建了可进行仙台病毒的正链和负链RNA生物合成的质粒，并将其转移到表达了与转录和复制有关的cDNA的宿主细胞中。结果，他们首次成功地由源自仙台病毒颗粒的cDNA重建了仙台病毒。
另外，本发明人发现可以不用作为T7-RNA聚合酶表达单元的重组痘苗病毒来重建仙台病毒。即，将在体外转录的仙台病毒的全长RNA转移到细胞中，且在T7启动子的控制下转录用于初转录和复制的酶的cDNA时，重建病毒颗粒。这表明，如果构建了表达初转录和复制所需的所有酶的细胞，可以完全不用诸如痘苗病毒的辅助病毒来重组仙台病毒或上述复合体。由于对表达初转录和复制所需的所有酶类的细胞已经描述[“病毒学杂志”，68，8413-8417(1994)]，本领域的熟练技术人员可以参考所述文章建成这样的细胞。所述参考中所述细胞是染色体上携带仙台病毒的三种基因，即NP，P/C和L，并表达由这三种基因编码的蛋白NP，P/C和L的293细胞系的衍生型。
由多例病毒载体看来，如果可从核酸有效重建病毒颗粒，显然本领域中的那些熟练技术人员能够轻易地替换该病毒的基因，或者插入外源基因，或者灭活或缺失目的基因。例如，一篇关于DI颗粒的文章[“病毒学杂志”，68，8413-8417(1994)]清楚地表明，仙台病毒的结构基因将缺损至少一部分但其关于复制酶的基因为正常的RNA转移至细胞中时，如果细胞中提供初转录和复制所需的酶类，随后的自主复制则有可能进行的，因而，一旦含有外源基因且由“缺损至少一部分结构基因但有关复制酶类的基因正常的特异的病毒cDNA”转录的RNA能被包装到含初转录和复制酶的病毒结构中，就能建成感染性的并且可自主复制的但缺损传播能力并且起着外源基因载体功能的复合体。这样的复合体作为基因治疗的载体是非常有用的。即，在本发明中，以负链RNA病毒制备感染的以及自主复制的但传播能力缺损的复合体(如含有初转录和复制酶的复合体)就成为了可能。
本发明还研究出一种通过用所述复合体转染表达了与复合体RNA中的已被缺失或灭活的基因相应的结构蛋白的细胞来扩增同复合体的方法。为扩增所述复合体考虑到禽卵是用于增殖仙台病毒的最合适的培养基，本发明人还发现染色体上携带仙台病毒M，F和HN基因中的至少一个或多个基因的转基因禽，其卵和细胞适于用于扩增复合体。用于制备转基因禽的方法已经报导[“家禽科学”(Poultry Sci.)，65，1445-1448(1986)]；“生物技术”，12，60-63(1994)]，本领域的那些熟练技术人员可以生产在其染色体上携带M、F和HN基因中至少一个或多个基因的转基因鸟类。由M、F和NH基因中涉及复合体中所含RNA的传播能力缺损的基因编码的蛋白优选在转基因鸟类中表达。
本发明还研究出了一种用于制备上述复合体的方法。下文中，举例说明了与仙台病毒有关的情况。仙台病毒Z分离株的基因组是含15384个核苷酸的单链RNA[“病毒学”，108，318-324(1981)]。其全部碱基序列已由通过使用逆转录酶制备的cDNA克隆测得[“核酸研究”，11，7313-7330(1983)；核酸研究”，12，7965-7972(1984)；“核酸研究”，14，1545-1563(1986)]。由于其基因组RNA是负链，病毒颗粒中一组(群)用于转录和复制的酶以基因组RNA作模板，进行转录和复制。已了解到包括NP，P/C，M，F，HN和L在内的至少6种蛋白是由基因组RNA编码的蛋白。已经阐明，这些蛋白中，NP、P/C和L对于复制是必需的且是足够的[“病毒学杂志”，68，8413-8417(1994)]，且M，F和HN是构建病毒结构所必需的成份。基于这些事实，当衍生出RNA的特异RNA病毒是仙台病毒时，可能通过将1)可转录成DNA的cDNA和2)在细胞中转录所述cDNA所需的RNA聚合酶的基因或在试管内(体外)由所述cDNA转录的RNA分子转染到表达所有用于自主复制的所有基因，NP、P/C和L，以及与RNA传播有关的缺损的M、F和HN基因中的一组基因的细胞中来重建感染的复合体，在这一情况下，所有与自主复制有关的基因，NP、P/C和L以及关于RNA的传播能力缺损有关的M、F和NH基因中的基因可通过用编码各基因的质粒转染细胞来瞬时表达。但是，优选将至少涉及RNA的传播能力缺损的基因掺入染色体以便其被稳定地表达。
本发明人还研究出了一种用于大量生产这样重建的所述复合体的方法，其中，通过转染该复合体到不具有涉及自主复制的基因但表达涉及RNA传播能力缺损的M、F和HN基因中的基因来复制所述复合体。在这一情况下，作为不具有涉及自主复制基因但表达涉及RNA传播能力缺损的M、F和NH基因中基因的细胞，可优选制作表达该类基因的转基因禽卵。
本发明者还制作用于繁殖含所述RNA和蛋白质的复合体的细胞。更为特别的是，该细胞带有与所述复合体中包含的RNA传播能力缺损有关的一类基因相应的基因，并且能够在胞内产生由所述基因编码的蛋白。在衍生出RNA的特异RNA病毒是仙台病毒的情况下，使用了在其染色体上具有M、F和HN基因中的至少一个以上基因的细胞或具有这样的细胞的动物。另外，M、F和HN基因不必是野生型的。任何那些具有与野生型的等功能的基因将是可利用的。即，在功能地导入细胞中时，只要所述基因对缺损病毒来说可补增与其野生型差异时，则任何基因都可以使用。优选的待用细胞是仙台病毒的宿主细胞。优选生产(表达〕载体病毒RNA中的M、F和HN基因中的那些涉及感染颗粒传播能力缺损的的基因编码的蛋白的细胞。
本发明人还着眼于迄今仅仅强调现有的RNA病毒载体来看增强表达效率，还未作出任何努力来研制出化合物以抑制RNA复制从而防止由于过量表达而导致的不利结果方面研制出了一种用于负链病毒载体的抑制剂，其特异地抑制依赖于RNA的RNA复制和依赖于RNA的RNA转录，而不影响源于细胞的RNA的转录和转译，只引起对依赖于RNA的RNA复制。
这就是说，本发明包括以下内容：
1.一种复合体，其含有一种源自具有传播性的特异的负链RNA病毒的RNA分子和不含核酸的病毒结构成份，其具有感染性和自主RNA复制能力，但缺损传播能力。
2.描述1的复合体，其中所述特异RNA病毒是一种具不分节段基因组的负链RNA病毒。
3.描述2的复合体，其中所述特异RNA病毒是仙台病毒。
4.一种RNA分子，其含有仙台病毒RNA或仙台病毒cRNA，其编码M、F和HN蛋白的基因中至少一个以上缺失或被灭活。
5.一种复合体，含有描述4的RNA和不含任何源自仙台病毒的核酸的病毒结构成分，其具有感染性和自主RNA复制能力，但缺乏传播能力。
6.一种DNA分子，其含有可在体外或细胞内能转录成描述4的RNA分子的模板DNA。
7.描述1-3或5中任一项的复合体，其中所述复合体中所含RNA分子含有外源基因。
8.描述3或5的复合体，其中所述复合体中所含RNA分子含有外源基因。
9.描述4的RNA分子，其含有外源基因。
10.描述6的DNA分子，其含有外源基因。
11.一种用于描述1-3、5、7或8的中任一项的复合体中所含的RNA复制的抑制剂，其含有用于依赖于RNA的RNA复制的抑制药物。
12.一种能传播描述1-3，5，7或8中任一项的复合体的宿主。
13.描述12的宿主，其染色体含有一组涉及描述1-3，5，7或8中任一项的复合体的感染性的基因，并能在用其感染时能复制相同拷贝的所述复合体。
14.描述12或13的宿主，其中所述宿主是动物，或其细胞，组织或卵。
15.描述14的宿主，其中所述动物是哺乳动物。
16.描述14的宿主，其中所述动物是禽。
17.一种宿主，其染色体上含有一组涉及描述3，5或8中任一项的复合体的感染性的基因，并且在用其感染时能复制相同拷贝的所述复合体。
18.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M、F和HN基因或具有与其同功能的基因中的至少一种基因。
19.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M基因或其同功能基因。
20.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M，NP，P/C和L基因(其中每种基因可分别被其同功能的基因取代)。
21.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M、F和HN基因(其中每种基因均可分别为其同功能的基因取代)。
22.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M，F，HN，NP，P/C和L基因(其中每种基因均可分别为其同功能的基因取代)。
23.描述17-22中任一项的宿主，其中所述宿主是动物或其细胞、组织或卵。
24.描述23的宿主，其中所述动物是哺乳动物。
25.描述23的宿主，其中所运动物是禽类。
26.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述1-3，5，7或8中任一项的复合体中所含的RNA，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成所述RNA或所述cRNA的单元，
b.一组复制所述RNA或所述cRNA所需的酶，或能生物合成所述酶类的单元，以及
c.一组涉及所述复合体的感染性的蛋白或一种用于生物合成所述蛋白
c.一组涉及所述复合体的感染性的蛋白或一种用于生物合成所述蛋白类的单元。
27.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述1-3，5，7或8中任一项的复合体中所含的RNA，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成所述RNA或所述cRNA的单元，
b.一组复制所述RNA或所述cRNA所需的酶，或一种能生物合成所述酶类的单元，以及
c.描述12-25中任一项的宿主。
28.一种试剂盒，其由以下两种成份组成：
a.描述1-3，5，7或8中任一项的复合体，以及
b.描述12-25中任一项的宿主。
29.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述3，5或8中任一项的复合体中所含的RNA，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成所述RNA或所述cRNA的单元，
b.仙台病毒的全部NP，P/C和L蛋白，或一种用于生物合成所述蛋白组的单元，以及
c.一组涉及所述复合体的感染性的蛋白，或一种用于生物合成所述蛋白组的单元。
30.一种试剂盒，其由下列三种成份组成：
a.描述3，5或8中任一项的复合体中所含的RNA，所述RNA的cRNA或能生物合成所述RNA或所述cRNA的单元，
b.仙台病毒的全部的NP，P/C和L蛋白，或能生物合成所述蛋白组的单元，以及
c.描述17-25中任一项的宿主。
31.一种试剂盒，其含有下列两种成份：
a.描述3，5或8中任一项的复合体，以及
b.描述17-25中任一项的宿主。
32.一种用于生产描述1-3，5，7或8中任一项的复合体的方法，其是通过将描述26a，26b和26c的三种成份导入宿主。
33.一种用于生产描述1-3，5，7或8中任一项的复合体的方法，其是通过将描述27a和27b的二种成份都导入描述27c的宿主。
34.一种用于扩增和生产描述28a的复合体的方法，其是通过将所述复合体转染到描述28b的宿主中。
35.一种用于生产描述3，5或8中任一项的复合体的方法，其是通过将描述29a，29b和29c的三种成份导入宿主。
36.一种用于生产描述3，5或8中任一项的复合体的方法，其是通过将描述30a和30b的两种成份都导入描述30c的宿主。
37.一种用于扩增和生产描述31a的复合体的方法，其是通过将所述复合体转染到描述31b的细胞中。
38.描述9的RNA分子，其中与M相应的基因缺失或被灭活。
39.描述9的RNA分子，其中与M、F和HN相应的所有基因均缺失或被灭活。
40.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述38的RNA，
b.描述20的宿主，以及
c.描述19的宿主。
41.一种用于生产复合体的方法，其是通过将描述40a的RNA分子导入描述40b的宿主并通过将由此生成的复合体转染到描述40c的宿主中来扩增和生产所述复合体。
42.一种复合体，其是通过描述41的方法来生产的。
43.一种试剂盒，其由以下三种成份组成：
a.描述39的RNA，
b.描述22的宿主，以及
c.描述21的宿主。
44.一种用于生产复合体的方法，其是通过将描述43a的RNA导入描述43b的宿主并通过将由此生成的复合体导入描述43c的宿主来扩增和生产该复合体。
45.一种复合体，其是通过描述44的方法来生产的。
46.一种抑制剂，其用于描述42或45的复合体中所含的RNA复制，其含有依赖于RNA的RNA复制的抑制药物。
47.一种用于制备外源蛋白的方法，其中所述方法包括将描述7的复合体导入宿主的步骤以及回收所表达的外源蛋白的步骤。涉及传播能力的在描述7的复合体中所含的RNA中缺失的一组基因的细胞。
49.一种含有表达的外源基因的培养基或绒毛膜尿囊液，其中所述培养基或绒毛膜尿囊液是通过将描述7的复合体接种到宿主中并回收它而获得的。
可用任何有传播能力的负链RNA病毒作为本发明的材料。虽然通常也可将诸如缺损干扰颗粒(DI颗粒)等不完全病毒和合成的寡核苷酸用作部分材料，但它们必须具有与具传播能力的病毒的相当的碱基序列。本发明的负链RNA病毒包括，例如，仙台病毒(Sendai virus)、新城疫病毒(Newcastledisease virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncy tial virus)，副粘病毒科(Paramyxoviridae)的牛rinderpest病毒和canine dirstemper病毒，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒，弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水泡性口炎病毒和狂犬病毒。
与负链病毒材料一样，源于上述任何病毒的并保留了传播能力的重组负链病毒也可被使用。例如，重组负链病毒可以是免疫原性基因灭活的或为增强RNA转录和复制的效率而改变了一部分基因的所述病毒。
本发明的RNA-蛋白复合体中所含的RNA可以通过在体外或细胞内转录源于上述任何病毒或重组病毒的修饰的cDNA而获得。在这样获得的RNA中，至少一种涉及原病毒的传播能力的基因必须被缺失或灭活，但涉及自主复制的基因应该不被缺失或灭活。此外，也可使用通过体外或细胞内转录获得的带有人工序列的RNA分子、其是使用将自主复制基因插入到诸如DI分子的带有病毒基因组的两个末端结构的cDNA而形成的DNA。
如上述，在仙台病毒的情况下，“涉及自主复制的基因”指NP，P/C和L基因中的任何一个，且“涉及传播能力的基因”指M、F和HN基因中的任何一个。因而，例如，仅缺损M基因的仙台病毒Z毒株的RNA分子适合作为本发明的“复合体”中所含的成份。也优选带有全部的M、F和HN基因缺失或灭活的RNA分子作为本发明的“复合体”中所含的成份。另一方面，必需从RNA表达编码NP，P/C和L蛋白的基因。但是，这些基因的序列不必和病毒的相同，并且可以通过导入变异或由源于其它病毒的相应基因替代而被修饰，只要得到的RNA的转录和复制活性与天然RNA的相同或比之更高。
本发明的“无核酸的病毒结构物”包括，例如，仅除去RNA的病毒。补充感染性和初期(始)自主复制能力但不补充传播能力的物体被用作这样的结构物。在仙台病毒的情况下，含带有仅缺失M基因的RNA和只去除其RNA的仙台病毒的复合体具有感染性和自主复制力，但无传播能力。复合体可含有其它成份，只要其不提供传播能力就行。例如，复合体可以在其包膜表面含有有利于粘附到特异细胞的粘附分子、配体、受体等。
复合体中所含的RNA分子可在其合适位点具有插入的外源基因。为表达目的蛋白质，插入编码所述蛋白外源基因。在仙台病毒RNA的情况下，优选将一段数目为6的倍数的碱基的序列插入到序列R1(5′-AGGGTCAAAGT-3′)和R2(5′-GTAAGAAAAA-3′)之间[“病毒学杂志”，67卷，8(1993)，4822-4830页]。插入到RNA中的外源基因的表达水平可借助基因插入位点以及外源基因的侧翼碱基序列来调节。例如，在仙台病毒RNA的情况下，已了解到插入基因的表达水平随着所述基因距离NP基因的距离的减小而增加。优选的用于导入以复合体表达目的蛋白的宿主细胞是表达所述复合体所含RNA分子中缺失基因的那些蛋白的细胞。由此，最优选以表达所述基因的转基因组(群)禽卵来大量制备蛋白。例如，在宿主细胞为培养细胞时从培养基而在宿主细胞为鸡卵时从绒毛膜尿囊液以标准技术回收这样表达的蛋白。在实施例5和6中用一种传播性复合体来替代本发明的非传播性复合体。但是，本领域的那些熟练技术人员明了在用“表达复合体中所含RNA分子中有关传播能力的基因中缺失的基因组(群)的细胞”作宿主时，用本发明的复合体获得的结果与用那些实施例中以传播性复合体获得的结果相似。
另外，本发明者已证实，为有效重建仙台病毒颗粒，待导入细胞的cDNA优选是环形的而不是线形的，并且为高效形成病毒颗粒，以细胞中正链RNA的转录优于细胞中负链RNA的转录。虽然这些条件不一定能应用到所有其他负链RNA病毒的重建，但是可以依据本发明的内容和技术常识研究用于重建其他负链RNA病毒的合适条件。这表明可能建立生产目的负链病毒载体的基本物质的技术，即病毒重建系统。
如本发明的“RNA复制抑制剂”，可以应用任何抑制依赖于RNA的RNA复制的药物，例如，优选使用病毒唑，TJ13025等。这样的复制抑制剂是对随着重组RNA的细胞扩增健康恶化或在需要控制源于重组RNA的外源基因的胞内表达时是有效的。
作为本发明的一个实施方案，由缺失仙台病毒的M基因的cDNA重建本发明的复合体的过程(步骤A-B)和扩增所述复合体的那些过程(步骤B-C)示于图1。
                  附图的简要描述
图1是由缺失M基因的仙台病毒的cDNA产生本发明的复合体的过程(步骤A→B)和进一步扩增所述复合体的过程(步骤B→C)的图示。
图2是构建PUC18/T7(+)HVJRz.DNA构造的图示。
图3是构建PUC18/T7(-)HVJRz.DNA构造的图示。
图4是表示将SeVgp120感染至CV-1细胞中以后的时间和HAU及gp/120表达水平的关系的图。
在下文中运用实施例对本发明进行具体说明。但本发明不仅仅局限于这些实施例。
                        实施例1
仙台病毒转录单元PUC18/T7(-)HVJRz.DNA和PUC18/T7(+)HVJRz.DNA的制备
将持有T7RNA聚合酶启动子待被转录成负链RNA的仙台病毒cDNA和核酶基因的DNA插入到PUC18载体来构建质粒PUC18/T7(-)HVJRz.DNA。还将持有T7RNA聚合酶启动子待被转录成正链RNA的仙台病毒cDNA和核酶基因的DNA插入到PUC18载体来构建质粒PUC18/T7(+)HVJRz.DNA。PUC18/T7(-)HVJRz.DNA和PUC18/T7(+)HVJRz.DNA的构造分别示于图1和图2中。
                      实施例2
由cDNA重建仙台病毒的实验
将以常规方式进行胰蛋白酶处理后的LLC-MKZ细胞(2×106)置于直径60mm的塑料平皿中，并在37℃下于5％CO2环境中将其于MEM培养基(补充10％PBS的MEM)(2ml)培养24小时。除去培养基并用PBS(1ml)洗涤后，以感染复数(moi)2向细胞中加入悬浮于PBS(0.1ml)的表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3。每15分钟轻搅拌该平皿以充分分散病毒溶液以感染1小时。除去病毒溶液并用PBS(1ml)洗涤后，向平皿加入如下制备的含cDNA的培养基。
把表1和2中所示的核酸(含表达仙台病毒复制所需的因子的质粒、pGEM-L、pG EM-P/C和pGEM-NP)置于一枚1.5ml的样品管中，并用HBS(Hepes缓冲盐液；20mM Hepes pH7.4，含150mM Nacl)调节至总体积为0.1ml)。这些表中，(-)和(+)cDNA分别代表质粒PUC18/T7(-)HVJRz.DNA和PUC18/T7(+)HVJRzDNA，/C和/L分别表示以环形和在用限制酶MLuI处理后以线形导入细胞。
另一方面，向一枚聚苯乙烯管中置入HBS(0.07ml)，DOTAP(BoehringerMannheim)(0.03ml)。向该管中加入上述核酸溶液，并将该混合液静置10分钟。然后向该混合物加入上述细胞培养基(2ml，加入10％FBS的MEM)，然后加入痘苗病毒抑制剂，利福平和阿糖胞苷C(C/Ara/C)至终浓度分别为0.1mg/mL和0.04mg/mL，结果制备成含上述cDNA的培养基。
将上述平皿于37℃下在5％CO2环境中培养40小时。平皿中的细胞用一橡皮刮棒收获，转移至Eppendorf管中，以6,000rpm离心5分钟沉淀并重悬于PBS(1ml)中。将这样的或稀释后的该细胞悬液的等份接种到10天龄的发育着的受孕鸡卵中。即，该细胞悬液用PBS稀释至表1中所示的细胞数目，以其0.5mL的等份接种的卵于35℃下培养72小时，然后于4℃下过夜。用带有针管的注射器从这些卵中回收绒毛膜尿囊液作为病毒溶液。
如下测回收的病毒溶液的血凝素单位(HAU)和噬斑形成单位(PFU)。
如下测HAU。于400×g将鸡血离心10分钟，弃去上清液。将这样获得的沉淀悬浮于100体积的PBS中，并于400×g离心10分钟以弃去上清液。将这一过程再重复2次以制备0.1％的血细胞溶液。制备病毒溶液的2倍系列稀释液，将待测的每一稀释液的.05mL分加到96-孔微孔板的每一孔中。再将血细胞溶液(各0.05mL)加至每孔中，轻摇以确保完全混合，并置于4℃下40分钟。将引起肉眼可观察到的血凝的最高病毒稀释度作为HAU。
如下测PFU。将CV-1细胞生长至在6孔培养板上成单层。弃去培养基后，将10倍系列稀释的病毒溶液(各0.1mL)分加到培养板的每孔中在37℃下感染细胞1小时。感染中，制备无血清的2×MEM和熔化的2％琼脂(55℃)的混合物，并向混合物加入胰蛋白酶至终浓度为0.0075mg/mL。感染1小时并除去病毒溶液后，向培养板的每孔加入与琼脂混合的培养基(各3mL)，并于37℃下在5％CO2气氛中培养3天。向每孔加入酚红(0.1％)(0.2mL)，于37℃下培养3小时，然后除去。计数未染色的噬斑以测病毒滴度PFU/ml。
表1示转染到LLC-MK2细胞中的仙台病毒模板cDNA，RNA复制所需的cDNA因子、pGEM-L、pGEM-P/C和pGEM-NP的量、培养时间、接种到鸡卵的细胞数HAU和PFU值。
                                 表1模板cDNA    总量     pGEM    pGEM     pGEM   培养 细胞       HAU    PFU
        (μg)    -L      -P/C     -NP    时间 数目
                 (μg)   (μg)    (μg)  (h)(+)cDNA/C   10       4       2        4      40   1.00×105  512    2×109(+)cDNA/C   10       4       2        4      40   1.00×105  256    9×108(+)cDNA/C   10       4       2        4      40   1.00×106  256    9×108(+)cDNA/L   10       4       2        4      40   1.00×105  ＜2    ＜10(+)cDNA/L   10       4       2        4      40   1.00×105  ＜2    ＜10(+)cDNA/L   10       4       2        4      40   1.00×106  ＜2    ＜10(-)cDNA/L   10       4       2        4      40   1.00×104  ＜2    ＜10(-)cDNA/L   10       4       2        4      40   1.00×105  ＜2    ＜10(-)cDNA/L   10       4       2        4      40   1.00×106  ＜2    ＜10(-)cDNA/C   10       4       2        4      40   1.00×104  ＜2    ＜10(-)cDNA/C   10       4       2        4      40   1.00×105  ＜2    ＜10(-)cDNA/C   10       4       2        4      40   1.00×106  4      8×103
既表现HAU也表现出PFU的样品被通过超离心沉淀，重悬，通过20％-60％的蔗糖密度梯度离心纯化，并以12.5％SDS-PAGE分级。这些样品中所含的每种蛋白的大小与仙台病毒的那些蛋白相同。
这些结果表明仙台病毒能通过将cDNA导入细胞重建，并且，与那些转录负链RNA的相比，通过导入转录正链RNA的DNA会更加有效地重建病毒颗粒，通过导入环形cDNA而不是线形cDNA也会更有效地重建病毒颗粒。
                       实施例3
仙台病毒重建所需的RNA复制因子的检测
进行实验以检测重建仙台病毒是否需要表达L，P/C和NP蛋白的全部三种质粒。除开是pGEM-L，pGEM-P/C和pGEM-NP质粒中任两种的组合或它们中的任一种而不是如实施例2中的所有这3种组合与模板cDNA一起导入细胞之外，实验方法与实施例2中所述的那些相同。
表2示导入LLC-MK2细胞的仙台病毒模板cDNA、包括pGEM-L，pGEM-P/C和pGEM-NP在内的RNA复制所需的cDNA因子的量，培养时间、接种到鸡卵中的细胞的数目以及HAU和PFU的值。
                             表2模板cDNA     总量    pGEM  pGEM  pGEM 培养时 培养的细   HA    PFU
         (μg)   -L    -P/C  -NP  间(h)  胞数目     U(+)cDNA/C    10      4     2     4    40     1.00×105  256   6×108(+)cDNA/C    10      4     2     4    40     1.00×106  512   4×109(+)cDNA/C    10      0     2     4    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      0     2     4    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      4     0     4    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      4     0     4    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      4     2     0    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      4     2     0    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      0     0     4    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      0     0     4    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      0     2     0    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      0     2     0    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      4     0     0    40     1.00×106  ＜2   ＜10(+)cDNA/C    10      4     0     0    40     1.00×106  ＜2   ＜10
如表2中所示，通过将这三种因子中的2种的组合导入细胞未观察到病毒重建，证明病毒重建需要这三种蛋白L，P/C和NP。
                          实施例4
于体外由转录的RNA重建仙台病毒的实验
由于实施例2中描述了由cDNA重建仙台病毒，在此还检验了所述cDNA于体外的转录产物，即，vRNA和cRNA，是否能支持同样的重建。
在用限制酶MluI将仙台病毒转录单元，PUC18T7(-)HVJRz.DNA和PUC18T7(+)HVJRz.DNA线性化后，用这些DNA作模板，用纯化的T7聚合酶制剂(EPICENTRE TECHNOLOGIES：Ampliscribe T7转录试剂盒)于体外进行RNA合成。体外合成RNA的方法实际是按随该试剂盒提供的方案。使用这样获得的RNA产物取代实施例2中的cDNA，进行同样的实验，并通过HA实验测定病毒产物。结果示于表3。
                               表3
模板     总量    pGEM   pGEM  pGEM  培养   培养的细    HAU  PFU
                 -L     -P/C  -NP   时间   胞数目
cDNA     (μg)   (μg)  (μg) (μg) (h)
体外     10      4      2     4     40     1.00×106   512  2×109
(-)RNA
体外     10      4      2     4     40     1.00×106   512  ND
(-)RNA
体外     10      4      2     4     40     1.00×106   2    5×103
(+)RNA
体外     10      4      2     4     40     1.00×106   ＜2  ND
(+)RNA
这些结果表明可以通过将负链或正链RNA导入细胞中来重建病毒。
                        实施例5
宿主细胞中的插入仙台病毒载体中的外源基因的表达
1.插入外源基因(HIV-1 gp120)的仙台病毒载体“pSeVgp120”的制备
用由引物a(5′-TGCGGCCGCCGTACGGTGGCAATGAGTGAAGGAGAAGT-3′)(序列1)和引物d(5′-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTVTTACTACGGCGAACGTCATCTTTTTTCTCTCTGC-3)(序列2)组成的一组引物，以标准PCR技术于“PN1432”上扩增HIV-1gp120基因。把PCR产物进行TA充隆，用NotI消化，并插入“pSeV18+”的NotI位点。然后用此重组质粒转化E.coli细胞。以“小量制备”(“Miniprep”)方法从每一克隆E.coli提取DNA，用DraIII消化，然后电泳。通过证实含由插入而预计大小的片段选择阳性克隆(下文称为“克隆9”)。在证实DNA片段具真正的核苷酸序列后，以氯化铯密度梯度离心纯化DNA。下文将以gp120基因插入的pSeV18+称为“pSeVgp120”。
2.含pSeVgp120(SeVgp120)的仙台病毒的重建和gp120表达的分析
除开在pGEM-NP，pGEM-P/C和pGEM-L之外再将pSeVgp120转染至LLCMK2细胞中之外，由受孕鸡卵回收绒毛膜尿囊液并通过实施例2中所述的方法测病毒HAU。如下还通过ELISA对回收的病毒检测gp120的表达。
将样品(各100μl)分加到已包被了抗HIV-1的单克隆抗体的96-孔板的每一个孔中，并于37℃下培养60分钟。用PBS洗涤后，向每孔加入HRP连接的抗HIV-1抗体(各100μl)，并于37℃下培养60分钟。用PBS洗涤后，向每孔中加入四甲基联苯胺，通过按450nm处的光密度测在酸性条件下通过HRP作用转化反应产物的量，以估计gp120的表达量。结果示于表4的左边栏中。
将另获得的病毒接种至CV-1细胞中，并作如下同样检测。以5×105细胞/板将CV-1细胞分加到培养板中，生长，然后弃去培养基。用PBS(-)洗涤后，以感染复数为10将病毒溶液加到细胞中并于室温下培养1小时。弃去病毒溶液后，用PBS(-)洗涤，把普通的MEM培养基(补充了抗生素AraC和Rif以及胰蛋白酶的MEM培养基)加入到细胞中并于37℃下培养48小时。反应后，回收培养基并检测HAU(以与实施例2中所述的方法相似的方法)和gp120的表达(通过ELISA)。结果示于表4的中间栏中。另外，把CV-1细胞培养基的上清液再接种到受孕鸡卵中，并对回收的病毒溶液测HAU和gp120表达(通过ELISA)。结果示于表4的右边栏中。
                       表4
                                           (μg/ml)
绒毛尿囊液(F1)    CV-1培养基(F1)     绒毛尿囊液(F2)
gp120(HAU)        gp120(HAU)         gp120(HAU)
0.10(4)           3.46(128)
0.15(32)          1.81(128)          1.56，1.21
                                     (512，512)
0.05(32)          2.20(128)
如表4中所示，检测到CV-1细胞中有高浓度的gp120，(表的中栏)且在再次用病毒接种的受孕鸡卵的绒毛膜尿囊液中也有相当高浓度的gp120(表的右栏)。表左栏和中栏中示三种克隆的检测。
此外，以Western印迹法分析gp120的表达。将SeVgp120感染的CV-1细胞的培养基在20,000rpm下离心1小时以沉淀病毒后，于冰上用三氯乙酸(TCA)(10％，V/V)处理上清液15分钟或于-20℃下用70％乙醇处理，并于15,000rpm下离心15分钟。将这样沉淀的蛋白与“SDS-PAGE样品缓冲液”(Daiichi Chemicals)混合于90℃下反应3分钟，然后于10％SDS-PAGE上进行电泳。把这样分级分离的蛋白质转移至PVDF膜(DaiichiChemicals)，于室温下与单克隆抗体902反应1小时，再用T-TBS洗涤。然后于室温下把此膜与抗-mIgG(Amersham)反应1小时，并用T-TBS洗涤，然后在室温下将此模与HRP联结的蛋白A(Amerslam)反应1小时，用T-PBS洗涤加入4-氯-1-萘酚(4CNPlus)(Daiichi Chemicals)以检测gp120。结果，在与预计分子量为gp120相应的位置显色蛋白质带。
另外，分析了以SeVgp120转染的CV-1细胞的感染后时间与HAU值以及与gp120表达量的关系。以感染复数10的SeVgp120感染培养于10cm培养血中的CV-1细胞(5×106)，于感染后30，43，53和70小时时回收培养基(各1ml)，并于等量的新鲜培养基混合后并进行HAU分析，gp120表达检测(通过ELISA)和Western印迹。结果示于表4。如图3中清楚地表示，gp120的产物趋向于随着仙台病毒的HA滴度增加而增加。
                         实施例6
对各种类型细胞中的SeVgp120增殖和gp120表达水平的分析
除开使用各种类型的细胞之外，使用与实施5中相同的方法，分析了HAU和gp120的表达水平(通过ELISA)。结果示于表5。
                         表5
细胞类型        时间(感染后) HAU      rgp120(μg/ml)
CV-1            96           32       2.5
LLCMK2          48           16       0.5
CHO             55           4        0.46
NIH3T3          48           4        0.25
MT4             24           16       0.8
MOLTHV          24           16       1.2
表中左栏示以SeVgp120感染的各种类型的细胞的感染后时间。结果，在实验的所有类型的细胞中检测到了SeVg120增殖以及gp120的表达。
                        实施例7
对宿主细胞中仙台病毒载体中插入的荧光素酶基因表达的研究
为分离荧光素酶基因以插入载体，通过以“pHvluciRT4”作模板，用一套引物[5′-AAGCGGCCGCCAAAGTTCACGATGGAAGAC-3′](30个碱基)(序列3)和[5′-TGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTITTCTTACTACGGATTATTACAATTTGGACTTTCCGCCC-3′(69个碱基)(序列4)的PCR构建两端带有NotI位点的荧光素酶基因。将其克隆到pSe18+的NotI窗(window)以获得插入荧光素酶基因的仙台病毒。然后把重组的载体转染到LLCMK2细胞中后，并接种到受孕鸡卵中。切取发育的卵的绒毛膜尿囊膜，用冷PBS(-)洗涤两次，并在加入裂解缓冲液(Picagene WAKO)(25μl)以及充分混合后，于15,000rpm下离心2分钟。向上清液(各5μl)中加入底物(IATRON)(50μl)，把混合物分加到96-孔板的各孔中。用发光计(luminousCT-9000D，DIA-IATRON)测荧光强度酶活性CPS。结果，在感染后24小时后，检测到CV-1细胞有相当高的荧光素酶活性。在这一情况下，把不携带荧光素酶基因的仙台病素用作对照(表中以“SeV”表示)。由两个克隆获得的结果示于表中。
                               表6
                        荧光强度(计数/10秒)
                 绒毛尿囊膜       CV-1(感染后24小时)
Luc/SeV          669187
                 2891560          8707815
SeV              69               48
                 23               49
                      工业上的可应用性
本发明中，已建立起一个由负链病毒的cDNA有效地重建病毒颗粒的系统，并已研究出一种使得能够生产和扩增“由源于传播性特异负链RNA病毒的RNA和不含任何核酸的病毒结构成份组成的有感染性和自主地RNA复制能力但无传播能力的复合体”的方法。由于所述复合体仅能在感染的细胞中复制，这些技术在高度重视治疗安全性的基因治疗等领域中特别有用。
                         序列表序列1
长度：38
类型：核酸
链型：单链
拓朴结构：线性
分子类型：其他核酸合成的DNA
序列
TGCGGCCGCC    GTACGGTGGC    AATGAGTGAA    GGAGAAGT38序列2
长度：69
类型：核酸
链型：单链
拓朴结构：线性
分子类型：其他核酸合成的DNA
序列TTGCGGCCGC    GATGAACTTT    CACCCTAAGT   TTTTVTTACTACGGCGTACG    TCATCTTTTT    TCTCTCTGC            69
序列3
长度：30
类型：核酸
链型：单链
拓朴结构：线性
分子类型：其他核酸合成DNA
序列AAGCGGCCGCCAAAGTTCACGATGGAAGAC                       30
序列4
长度：69
类型：核酸
链型：单链
拓朴结构：线性
分子类型：其他核酸合成DNA
序列TGCGGCCGCG   ATGAACTTTC    ACCCTAAGTT   TTTCTTACTACGGATTATTA   CAATTTGGAC    TTTCCGCCC            69

Claims (49)

1.一种复合体，其含有源于特异的传播性负链RNA病毒的RNA分子以及不含任何核酸的病毒结构成份，其具有细胞感染性并能自主复制RNA，但缺乏传播能力。
2.权利要求1的复合体，其中所述特定RNA病毒是具有不分节段基因组的负链RNA病毒。
3.权利要求1的复合体，其中所述特定RNA病毒是仙台病毒。
4.一种RNA分子，其含有仙台病毒RNA或仙台病毒cDNA，其中所述RNA分子是缺损的，其中至少一个以上的编码M，F和HN蛋白的基因被缺失或灭活。
5.一种复合体，其含有权利要求4的RNA分子和源自不含任何核酸的仙台病毒的病毒结构成份，其具有细胞感染性并能自主复制RNA，但缺乏传播能力。
6.一种DNA分子，其含有能在体外或体内转录权利要求4的RNA分子的模板DNA。
7.权利要求1-3或5中任一项的复合体，其中所述复合体中所含的RNA分子含外源基因。
8.权利要求3或5的复合体，其中所述复合体中所含的RNA分子含有一个外源基因。
9.权利要求4的RNA分子，其含有外源基因。
10.权利要求6的DNA分子，其含有外源基因。
11.RNA复制的抑制剂，所述RNA包含在权利要求1-3，5，7或8任一项的复合体中，所述抑制剂含有抑制RNA依赖性RNA复制的抑制剂。
12.权利要求1的复合体，其中所述特异性RNA病毒属于副粘病毒科。
13.一种宿主，可以向其中传播权利要求1-3，5，7或8中任一项的复合体，在其染色体上含有关于权利要求1-3，5，7或8中任一项所述复合体的感染性的基因，所述宿主当用所述复合体感染时能复制相同拷贝的所述复合体。
14.权利要求13的宿主，其中所述宿主是源于动物的细胞或受孕卵。
15.权利要求14的宿主，其中所述动物是哺乳动物。
16.权利要求14的宿主，其中所述动物是禽类。
17.一种宿主，其表达关于权利要求3，5或8中任一项的复合体的感染性的基因，并能在以它感染时复制相同拷贝的所述复合体。
18.一种宿主，其染色体上含有一个以上源自仙台病毒的M，F和HN基因。
19.一种宿主，其染色体上含仙台病毒的M，F或HN基因。
20.一种宿主，其染色体上含仙台病毒的M，NP，P和L基因。
21.一种宿主，其染色体上含有仙台病毒的M，F和HN基因。
22.一种宿主，其染色体上含有M，F，HN，NP，P和L基因。
23.权利要求17-22中任一项的宿主，其中所述宿主是源自动物的细胞或卵。
24.权利要求23的宿主，其中所述动物是一种哺乳动物。
25.权利要求23的宿主，其中所述动物是禽类。
26.一种试剂盒，其由下列三种成分组成，
a.权利要求1-3，5，7或8中任一项的复合体所含的RNA分子，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成所述RNA或所述cRNA的cDNA；
b.复制所述RNA或所述cRNA所需的酶，或一种能生物合成所述酶的基因，以及
c.与所述复合体的感染性有关的蛋白，或一种能生物合成所述蛋白的基因。
27.一种试剂盒，其由以下三种成份组成，
a.权利要求1-3，5，7或8中任一项的复合体中所含的RNA分子，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成所述RNA或所述cRNA的cDNA，
b.复制所述RNA或所述cRNA所需的酶，或一种能生物合成所述酶的基因，以及
c.权利要求13-25中任一项的宿主。
28.一种试剂盒，其由以下两种成份组成，
a.权利要求1-3，5，7或8中任一项的复合体，以及
b.权利要求13-25中任一项的宿主。
29.一种试剂盒，其由以下三种成份组成，
a.权利要求3，5或8中任一项中所含的RNA分子，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成所述RNA或所述cRNA的cDNA，
b.仙台病毒的全部NP，P/C和L蛋白，或一种能生物合成所述蛋白的基因，以及
c.与所述复合体的感染性有关的蛋白，或一种能生物合成所述蛋白的基因。
30.一种试剂盒，其由以下三种成份组成，
a.权利要求3，5或8中任一项的复合体中所含的RNA分子，或所述RNA的cRNA，或一种能生物合成所述RNA或所述cRNA的cDNA，
b.仙台病毒的全部NP，P/C和L蛋白，或一种能生物合成所述蛋白的基因，以及
c.权利要求17-25中任一项的宿主。
31.一种试剂盒，其由以下两种成份组成，
a.权利要求3，5或8中任一项的复合体，以及
b.权利要求17-25中任一项的宿主。
32.一种用于生产权利要求1-3，5，7或8中任一项的复合体的方法，其是通过将权利要求26a，26b和26c的全部三种成份都导入宿主。
33.一种用于生产权利要求1-3，5，7或8中任一项的复合体的方法，其是通过将权利要求27a和27b的两种成份都导入权利要求27c的宿主中。
34.一种用于扩增和生产权利要求28a的复合体的方法，其是通过将所述复合体转染到权利要求28b的宿主中。
35.一种用于生产权利要求3，5或8中任一项的复合体的方法，其是通过将权利要求29a，29b和29c的三种成份导入宿主。
36.一种用于生产权利要求3，5或8的复合体的方法，其是通过将权利要求30a和30b的两种成份均导入权利要求30c的宿主。
37.一种用于扩增和生产权利要求3，5或8的复合体的方法，其是将所述复合体转染到权利要求17-25中任一项的宿主中。
38.权利要求9的RNA分子，其中与M基因相应的基因被缺失或灭活。
39.权利要求9的RNA分子，其中所有与M，F和HN基因相应的基因均被缺失或灭活。
40.一种试剂盒，其由以下三种成份组成，
a.权利要求38的RNA分子，
b.权利要求20的宿主，以及
c.权利要求19的宿主。
41.一种制备复合体的方法，是将权利要求38的RNA分子导入权利要求20的宿主，并用该复合体转染权利要求19的宿主，从而扩增并生产所述复合体。
42.一种复合体，其通过权利要求41的方法生产。
43.一种试剂盒，其由以下三种成份组成，
a.权利要求39中的RNA，
b.权利要求22的宿主，以及
c.权利要求21的宿主。
44.一种来扩增和生产一种复合体的方法，其通过将权利要求39的RNA分子导入权利要求22的宿主，并通过将其转染到权利要求21的宿主中来扩增和生产所述复合体。
45.一种复合体，其通过权利要求44的方法生产。
46.一种用于权利要求42或45的复合体中所含RNA的复制的抑制剂，其含有一种依赖于RNA的RNA聚合酶的抑制剂。
47.一种用于制备外源蛋白的方法，其中所述方法包括将权利要求7的复合体导入宿主并回收所表达的蛋白的步骤。
48.权利要求47的用于制备外源蛋白的方法，其中该宿主是表达与传播能力有关的一组基因的细胞，所述基因缺失了权利要求7的复合体中所含的RNA分子。
49.一种培养基或绒毛尿囊液，其含有通过将权利要求7的复合体接种到宿主中并回收其培养基或绒毛尿囊液而获得的表达的外源蛋白。
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