KR20040104673A - 헤마글루티닌 활성을 저하시킨 약제 또는 유전자 운반 조성물 - Google Patents

헤마글루티닌 활성을 저하시킨 약제 또는 유전자 운반 조성물 Download PDF

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하라히로토
우에다야스지
하세가와마모루
유준
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Abstract

본 발명은 헤마글루티닌 활성을 저하시킨 약제 또는 유전자 운반 조성물을 제공한다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 화합물을 부가시킴으로써 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우와 비교해 헤마글루티닌 활성을 저하시킨 약제 또는 유전자 운반 조성물을 제조하는 것에 성공하였다. 예를 들면 본 발명의 한 태양에 있어서 제공되는 바이러스 벡터는, 적혈구 응집활성 및 용혈활성이 유의하게 저하되어 있어 혈중에서의 벡터의 안정성이 현저하게 상승되었다. 본 발명에 의해 제공되는 약제 또는 유전자 운반 조성물은 생체내로의 약제 또는 유전자의 도입에 적합하게 사용된다.

Description

헤마글루티닌 활성을 저하시킨 약제 또는 유전자 운반 조성물{Drug- or gene-carrier composition having lowered hemagglutinin activity}
센다이 바이러스(Sendai virus: SeV)의 엔벨로프 단백질은 헤마글루티닌(HN)과 퓨전(fusion; F) 2종류로 구성된다. SeV는 HN 단백질이 세포표면의 시알산(sialic acid)에 결합한 후 F 단백에 의한 융합에 의해 세포질내로 직접, 단시간에 또 고효율로 감염하는 것이 가능하다. 또한, 시알산은 대부분의 세포표면에 존재하기 때문에 광범위한 세포로의 감염이 가능하다. 이러한 우수한 감염특성을 갖는 SeV는 유전자치료를 목적으로 여러 가지 유전자를 탑재한 재조합 SeV 벡터로서의 개발이나(Shiotani et al., Gene Therapy, 2001, 8, 1043-1050), 그의 엔벨로프 단백질을 포함하는 리포솜(liposome)내 수상(aqueous core)에 유전자나 여러 가지 약물을 봉입한, 약물송달 시스템으로서의 연구도 진행되고 있다(Ramani et al., FEBS Letters, 1997, 404, 164-168; Isaka et al., Experimental Nephrology, 1998, 6, 144-147).
이와 같이, SeV 벡터는 많은 이점을 가지고 있지만 그의 광범위한 감염성은 본 벡터의 결점도 된다. SeV 벡터는 시알산을 대량으로 포함하는 적혈구와도 융합하여 강한 용혈활성(hemolytic activity)을 일으키기 때문에 안전성면에서 개선이 요망된다. 또한, 적혈구와 융합하는 것은 표적으로 하는 세포에 필요한 양의 약물을 송달할 수 없는 것을 의미하고 있어 혈액 중에서 매우 불안정하다고 할 수 있다. 그 때문에 생체내로의 투여방법은, 일반적으로 혈류를 멈추거나 또는 환류법 등에 의한 혈액을 매개로 하지 않고 행하는 방법이나, 혈액성분의 영향이 적은 부위로의 국소투여로 한정되는 것이 예측된다.
이러한 안정성, 안정성에 관련된 문제를 해결하기 위해서는 HN 단백질의 헤마글루티닌 활성을 소실 또는 저감시켜 적혈구와의 결합을 적게 하는 것이 필요하다. 그러나, 헤마글루티닌 활성의 소실은 약물을 도입하는 표적세포로의 결합을 저하시키기도 하여, 효율이 현저하게 저하되는 것이 용이하게 추측되기 때문에 연구가 필요하게 된다.
지금까지, SeV의 HN 단백을 디티오스레이톨(dithiothreitol; DTT)에 의해 특이적으로 환원하여 헤마글루티닌 활성을 소실시키는 방법을 이용한 연구가 다수 보고되어 있지만, 그 대부분은 적혈구로의 용혈활성을 지표로 한 연구이다. 예를 들면, 토마시(Tomashi) 등은 FEBS Letters, 1982, 143, (2),252-256에 있어서, SeV를 DTT로 환원하여 그의 헤마글루티닌 활성을 소실시켰다. 그 때 형성되는 HN 단백분자 중의 SH기에 새로, 적혈구를 인식하는 항체분자를 도입함으로써 다시 적혈구로의 결합능력을 보충하여 용혈활성을 다시 나타내는 것을 보고하는 데에만 그치고있다. 게다가, 그의 융합활성은 현저하게 저하되어 있어 이 방법의 발전성에는 의문이 남는다. 또한, 기트맨(Gitman) 등은 Biochemistry, 1985, 24, 2762-2768에 있어서, SeV의 엔벨로프(envelope)로의 화학적인 수식에 대해서 보고하고 있다. 헤마글루티닌 활성을 소실시키는 것에 성공하고 있지만, 융합능력도 동시에 완전히 소실시키고 있어 융합능력을 부여하기 위해서는 새로 수식되어 있지 않은 엔벨로프 단백을 삽입하여 헤마글루티닌 활성을 다시 야기할 필요가 있다고 보고하고 있다.
세포를 표적으로 한 연구도 몇 가지 보고는 되어 있다. 예로서, 바가이(Bagai) 등은 Journal of Virology, 1993, 67, (6), 3312-3318에 있어서, HN을 환원한 SeV를 계면활성제로 가용화(可溶化)를 행한 후 F 단백으로만 되는 미립자를 재구성시켜, F 단백의 당쇄특이적인 감염(sugar chain-specific infection)을 목표로 한 약물송달 시스템을 제창하고 있다. 또한, 라마니(Ramani) 등도 FEBS Letters, 1997, 404, 164-168에서, 동일한 시스템으로 인비트로(in vitro)에 있어서의 유전자 도입의 결과를 보고하고 있다. 이 방법론에서는, 확실히 헤마글루티닌 활성을 소실시킨 후에 표적으로 하는 세포에만 융합시키는 것은 가능하지만, HN 단백과 동시에 F 단백도 적잖이 환원을 받는 것이나 재구성의 과정에서 엔벨로프 단백이 완전히 입자에 삽입되지 않아(Ponimaskin 등, Virology, 2000,269,391-403), 다시 얻어지는 운반체의 융합능력은 저하되기 때문에 투여량이 많아지는 것이 개선해야 할 점으로서 들 수 있다. 또한, 조제에 있어서, 바이러스를 대량으로 필요로 하는 것이나 계면활성제의 제거가 번잡한 것, 더욱이 재구성되는 입자의 불균일성 등 조제방법면에서도 개량의 여지는 크다.
이와 같이, 지금까지, 헤마글루티닌 활성을 현저하게 저감시키고, 또 세포로의 약제 송달능력을 유지한, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 엔벨로프 단백을 기초로 한 약물송달 시스템은 알려져 있지 않다.
본 발명은 마이너스 가닥(minus-strand) RNA 바이러스의 엔벨로프 단백질(envelope protein)을 수식(modification)함으로써 헤마글루티닌 활성을 저감시킨 세포내로의 약물 또는 유전자 운반체에 관한 것이다.
발명의 개시
본 발명은 마이너스 가닥 RNA 바이러스 입자 중의 엔벨로프 단백을 수식함으로써 헤마글루티닌 활성만 크게 저감시키고, 세포내로의 약물 또는 유전자 도입능력은 유지한 운반체를 제공하는 것을 과제로 한다.
약물이나 제제의 개발에 있어서, 바람직하지 않은 작용을 경감시키고 목적으로 하는 기능을 유도하는 방법론으로서, DDS(Drug Delivery System)는 중요한 기술이다. 본 발명자 등은 DDS 기술의 하나인 화학수식을 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 엔벨로프에 대해서 적용함으로써, 적혈구에 대한 작용을 저하시키고 세포로의 도입능력을 유지할 수 있는 것을 생각하였다. 그러기 위해서는 헤마글루티닌 활성을 담당하는 엔벨로프 단백으로의 선택적 수식을 행하여 그 활성을 저감시키는 동시에, 융합에 중요한 엔벨로프 단백으로의 영향은 가능한 한 작게 하는 것이 바람직하다.
본 발명자 등은 예의 검토한 결과, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 고분자 수식이 적혈구 응집반응을 저감시키는 데 유효한 것을 발견하였다. 예를 들면 센다이 바이러스(SeV)의 엔벨로프 단백에 존재하는 아미노기에 대해서 활성화 PEG를 공유결합시켜서 얻어지는 PEG 수식 SeV 벡터(도 1)는 PEG의 반응량에 따라 적혈구 응집반응(HAU)이 현저하게 저하하는 것이 명백해졌다. HAU의 저하에 수반하여 표적세포로의 감염성도 동일하게 저하하는 것이 우려되었지만, 수식 벡터의 세포로의 유전자 도입능력의 저하는 HAU의 저하 정도에 비해 적어 충분한 능력을 유지하고 있는 것을 확인하였다(표 1 및 2). 이 때, PEG의 분자량이 클수록 세포로의 유전자 도입능력을 높게 할 수 있는 것을 밝혔다. 또한, PEG 수식 벡터의 조제방법도 매우 단시간이고 용이하였다.
PEG 수식 SeV 벡터의 구성단백의 전기영동 패턴으로부터 HN 단백질량의 대폭적인 감소와, 그에 대신하는 새로운 고분자의 출현을 확인하였다. 한편, F 단백의 감소는 작기 때문에 HN 단백이 우선적으로 PEG 수식되어 F 단백으로의 결합보다도 우위로 일어나는 것이 시사되었다. 이것이 HAU를 크게 저하시키면서 융합능력을 유지하는 요인이 되고 있는 것으로 추측되었다(도 4, 15 및 16).
PEG 수식 SeV 벡터는 HAU의 저하를 반영하여 랫트 혈액에 대한 용혈활성이 현저하게 저하되어 있어, 안전성면에서 매우 우수한 벡터인 것이 나타났다(도 2). 또한, SeV 벡터는 혈액과 접촉하면 그의 유전자 도입능력이 현저하게 저하하였지만, 수식 벡터에서는 혈액 처리후에도 유전자 도입능력을 충분히 유지하고 있었다(도 3 및 20). 이것은 수식에 의한 적혈구와의 결합을 저하시키는 효과 뿐만 아니라 보체 등의 혈액 중에 존재하는 벡터의 활성을 불안정화한다고 생각되는 인자에 대한 안정화 효과도 동시에 부여할 수 있는 것을 나타내는 결과였다. 더욱이, PEG 수식 벡터가 중화 항체 존재하에 있어서도 실제로 안정되게 유전자 도입이 가능했기 때문에(도 5 및 17), 여러 가지의 생체성분에 대한 안정화 효과도 부여되고 있다고생각되었다.
더욱이, PEG 수식 벡터의 인비보(in vivo) 투여의 효과를 조사했더니 복수회 투여에 있어서 PEG 수식 벡터의 유전자 도입효율은 미수식 벡터에 비해 명백하게 높아, 생체내에 있어서 높은 유전자 도입능력을 가지는 것이 확인되었다(도 19).
이와 같이, PEG 수식의 조건을 적당히 선택함으로써 적혈구와의 상호작용만 저감시키고, 세포로 높은 도입능력을 유지할 수 있는 것을 발견하였다.
더욱이, 본 발명자 등은 헤마글루티닌 활성을 담당하는 엔벨로프 단백에 선택적으로 결합하는 물질 중 하나로서, HN 단백에 대한 정제 단일클론 항체(MAb)가 활성을 저하시키기 때문에(Miura et al., Exp. Cell Res., 1982, 141, 409-420) 그 이용에 대해서도 검토를 행하였다. MAb로 처리한 센다이바이러스 벡터는 적혈구 응집반응을 전혀 나타내지 않고, 그의 헤마글루티닌 활성은 완전하게 차단되어 세포로의 유전자 도입도 확인되지 않았다. 따라서, 새로, MAb 분자에 표적세포로 결합하는 리간드 분자를 도입했더니, 이 리간드결합 MAb로 처리한 센다이 바이러스(도 5)는 적혈구 응집반응이나 용혈활성은 나타내지 않았음에도 불구하고(도 7, 10 및 11), 리간드를 결합할 수 있는 표적세포에 대해서는 유전자를 고효율로 도입할 수 있었다(도 8 및 9). 표적세포 이외에는 유전자 도입할 수 없었고, 과잉의 경합물질 존재하에서 유전자 도입능력이 소실되었기 때문에(표 4), 수식 벡터의 헤마글루티닌 활성이 완전히 소실되어 있음에도 불구하고 표적으로 하는 세포에만 고효율로 유전자 도입이 가능해지는 것을 뒷받침하는 결과를 얻었다.
삽입하는 리간드 분자를 타겟으로 하는 세포에 고발현하고 있는 수용체에 반응한 분자로 변경함으로써, 여러 가지 세포에 대해서 도입 가능한 시스템이 된다고 생각된다.
또한, 이 시스템은 사용 직전에 혼화함으로써 용이하게 제조할 수 있기 때문에 매우 사용하기 쉬운 시스템인 것도 특징으로서 들 수 있다.
이러한 기술은 SeV의 엔벨로프 구성단백으로부터 재구성한 미립자 제제에도 적용할 수 있다. 이 경우, 먼저 서술한 바와 같은 HN 단백을 환원할 필요는 없어진다고 생각된다. SeV를 환원하지 않고 그대로 가용화를 행하여 필요한 약물을 봉입한 미립자를 재구성시킨 후 이 기술을 적용하면, 환원에 의한 F 단백으로의 영향을 주지 않고 보다 융합능력이 높은 운반체가 형성된다고 생각된다.
본 발명은 헤마글루티닌 활성이 저감된 약제 또는 유전자 운반 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는,
(1) 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는 약제 또는 유전자 운반 조성물로서, (a) 상기 단백질에 화합물이 부가되어 있고, (b) 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우에 비해 헤마글루티닌 활성이 저하되어 있으며, (c) 상기 약제 또는 유전자를 표적으로 하는 세포로 도입하는 능력을 갖는 조성물,
(2) (1)에 있어서, 추가로 (d) 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우에 비해 적혈구에 대한 용혈활성이 저하되어 있는 조성물,
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 조성물이, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 포함하는 조성물인 조성물,
(4) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 조성물이, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 불활성화(inactivated) 바이러스 또는 상기 바이러스의 엔벨로프 부분을 포함하는 조성물,
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인 조성물,
(6) (5)에 있어서, 상기 파라믹소바이러스과 바이러스가 센다이 바이러스인 조성물,
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 분자량 1,800 이상인 조성물,
(8) (7)에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 분자량 4,500 이상인 조성물,
(9) (8)에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 분자량 16,000 이상인 조성물,
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 폴리에틸렌글리콜인 조성물,
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질이, 추가로 폴리에틸렌이민과 함께 복합체를 형성하고 있는 조성물,
(12) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질이 세포에 결합하는 화합물과 함께 복합체를 형성하고 있는 조성물,
(13) (12)에 있어서, 상기 세포에 결합하는 화합물이, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물과 결합하고 있는 조성물,
(14) (12) 또는 (13)에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 상기 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편인 조성물,
(15) (12) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포에 결합하는 화합물이 세포표면 수용체의 리간드인 조성물,
(16) (15)에 있어서, 상기 리간드가 엽산(folic acid)인 조성물,
(17) 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편으로서, 세포에 결합하는 화합물이 결합되어 있는 항체 또는 그의 단편,
(18) (17)에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 F(ab')2인 항체 또는 그의 단편,
(19) (17) 또는 (18)에 있어서, 세포에 결합하는 화합물이 세포표면 수용체의 리간드인 항체 또는 그의 단편,
(20) (19)에 있어서, 상기 리간드가 엽산인 항체 또는 그의 단편,
(21) (a) 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편으로서 세포에 결합하는 화합물이 결합되어 있는 항체 또는 그의 단편, 및 (b) 상기 엔벨로프 단백질을 포함하는, 약제 또는 유전자 운반 조성물을 포함하는 약제 또는 유전자 운반 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는 약제 또는 유전자 운반 조성물로서, (a) 상기단백질에 화합물이 부가되어 있고, (b) 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우에 비해 헤마글루티닌 활성이 저하되어 있으며, (c) 상기 약제 또는 유전자를 표적으로 하는 세포로 도입하는 능력을 갖는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는 복합체이다. 이러한 복합체는 예를 들면 감염성 바이러스 입자이어도 되고, 불활성화된 마이너스 가닥 RNA 바이러스, 또는 예를 들면 재구성 리포솜 등의 마이너스 가닥 RNA 바이러스 파쇄물의 엔벨로프 성분을 포함하는 복합체이어도 된다.
감염성 바이러스 입자는 세포로의 감염을 매개로 하여 상기 세포내에 바이러스에 포함되는 약물 또는 유전자를 세포내에 운반한다. 특히 바이러스 게놈에 외래유전자를 삽입함으로써, 감염성 바이러스 입자가 감염된 세포내에 있어서 바이러스 게놈으로부터 상기 유전자를 발현시킬 수 있다. 감염성 바이러스는 복제능력을 갖는 (replication competent) 바이러스이어도 되고, 또는 복제능력을 갖지 않는 (replication deficient) 바이러스이어도 된다. 복제능력을 갖는 바이러스란, 상기 바이러스가 숙주세포에 감염된 경우 상기 세포에 있어서 바이러스가 복제되어 감염성 바이러스 입자가 생산되는 것을 가리킨다.
마이너스 가닥 RNA 바이러스는 세포내에 있어서 상기 바이러스의 게놈 RNA를, 이 게놈 RNA의 전사 및 복제에 필요한 바이러스 단백질의 공존하에서 전사시킴으로써 재구성시킬 수 있다. 재조합 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 재구성은 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다(국제공개번호 WO97/16539; 국제공개번호WO97/16538; 국제공개번호 WO00/70055; 국제공개번호 WO00/70070; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466). 이들 방법에 의해, 파라인플루엔자, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 센다이 바이러스 등을 포함하는 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터를 DNA로부터 재구성시킬 수 있다.
외래유전자를 포함하는 재조합 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 게놈에 외래유전자를 삽입함으로써 얻어진다. 외래유전자로서는 표적으로 하는 세포에 있어서 발현시키고자 하는 원하는 유전자를 사용할 수 있다. 외래유전자는 천연형 단백질을 코드하는 유전자이어도 되고, 또 천연형 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 한 결실, 치환 또는 삽입에 의해 천연형 단백질을 개변한 단백질을 코드하는 유전자이어도 된다. 또는, 천연형 단백질의 결실형이나 인공적인 단백질 등이어도 된다. 예를 들면, 유전자 치료 등을 목적으로 하는 경우에는, 바이러스 벡터의 주형이 되는 DNA(바이러스 벡터 DNA)에 대상이 되는 질환의 치료용 유전자를 삽입하고, 이것을 전사시켜서 바이러스의 재구성을 행한다. 바이러스 벡터 DNA에 외래유전자를 도입하는 경우는, 예를 들면 센다이 바이러스 벡터 DNA에 있어서는 전사종결(E)서열과 전사개시(S)서열과의 사이 등에 6의 배수의 염기수를 갖는 서열을 삽입하는 것이 바람직하다(Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 1993, p. 4822-4830). 파라믹소바이러스 등에 있어서는, 외래유전자는 바이러스의 각 단백질의 오픈 리딩 프레임(ORF)(예를 들면, NP, P, M, F, HN 및 L 단백질의 ORF)의 앞 및/또는 뒤에 삽입할 수 있다. 전후의 유전자의 발현을 방해하지 않도록 하기 위해서, 외래유전자의 앞 또는 뒤에 적절히 E-I-S서열(전사개시서열-개재서열-전사종결서열) 또는 그의 부분을 삽입하여 각 유전자의 사이에 E-I-S 서열의 유닛이 배치되도록 한다.
회수된 바이러스는 실질적으로 순수해지도록 정제할 수 있다. 정제방법은 여과, 원심분리 및 컬럼정제 등을 포함하는 공지의 정제·분리방법 또는 그의 조합에 의해 행할 수 있다. 「실질적으로 순수」란, 바이러스가, 그것이 존재하는 시료 중의 성분으로서 주요한 비율을 차지하는 것을 말한다. 전형적으로는, 실질적으로 순수한 바이러스 벡터는 시료 중에 포함되는 전체 단백질 중 바이러스 벡터 유래의 단백질 비율이 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상을 차지하는 것으로 확인할 수 있다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 구체적인 정제방법으로서는 예를 들면 셀룰로오스 황산에스테르 또는 가교 폴리사카라이드 황산에스테르를 사용하는 방법(일본국 특허공고 제(소)62-30752호 공보, 일본국 특허공고 제(소)62-33879호 공보 및 일본국 특허공고 제(소)62-30753호 공보) 및 푸코오스황산(fucose sulfate) 함유 다당 및/또는 그의 분해물에 흡착시키는 방법(WO97/32010) 등을 예시할 수 있다.
불활성화된 바이러스 또는 파쇄 바이러스의 재구성 생성물은 세포에 약물 또는 유전자를 도입하기 위한 트랜스펙션 시약으로서 사용된다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 불활성화는 예를 들면 UV 조사에 의해 행할 수 있다. 또한, HVJ(Hemmaggulutinating Virus of Japan)-리포솜 등 불활성화 바이러스를 사용한 리포솜의 제조방법은 예를 들면 진탕(vibration)과 초음파에 의해 조제할 수 있다(「라이프 사이언스에 있어서의 리포솜/실험 매뉴얼」 스프링거베어락(Springer-Verlag) 도쿄(1992) pp.282-287 참조). 또한 불활성화된 센다이 바이러스 입자 또는 리포솜 및 핵산을 혼합한 조성물(막융합 리포솜)이 보고되어 있다(가네다 야스시: BIOTHERAPY,8,1265(1994)). 또는 파쇄 바이러스의 재구성은 예를 들면, 바이러스 가용화물로부터 리포솜을 재구성시켜, 소위 비로솜(virosome)을 조제함으로써 실시할 수 있다(Bagai et al., 1993, Biochem. Biophys. Acta 1152, 15-25). 구체적으로는 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 트리톤(Triton) X-100 등의 계면활성제로 가용화한 후 불용성의 RNP를 원심제거한다. 엔벨로프 및 엔벨로프 단백질을 포함하는 가용화액으로부터 계면활성제를 제거함으로써 입자를 재구성시켜 비로솜을 조제할 수 있다. 비로솜은 입자경을 균일화하기 위해서, 원심분리(예를 들면 12000 rpm, 10분)에 의해 입자크기가 일치된 비로솜을 분리하여 회수할 수 있다.
감염성 바이러스 입자를 포함하는 조성물에 있어서는, 그 감염성 바이러스입자는 마이너스 가닥 RNA 바이러스여도 되거나, 또는 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 다른 바이러스여도 된다. 이종 바이러스의 엔벨로프 단백질로 슈도타입화된(pseudotyped) 바이러스는 잘 알려져 있다(국제공개번호 WO01/92508). 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 엔벨로프 단백질을 포함하는 슈도타입 바이러스를 조제하기 위해서는, 예를 들면, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 불활성화 바이러스 또는 상기 바이러스의 엔벨로프 단백질을 갖는 비로솜 등을 조제하고, 이것을 다른 바이러스에 융합시킴으로써 제조할 수 있다. 또는, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 발현하는 발현 벡터를, 다른 바이러스의 팩키징(packaging) 세포에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 다른 바이러스로서는, 예를 들면 레트로바이러스(retrovirus)를 들 수 있고, 구체적으로는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus; MoMLV) 및 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus; MSCV) 등을 포함하는 온코바이러스아과(Oncovirus)에 속하는 레트로바이러스(본 발명에 있어서 온코바이러스라고 부른다) 및 인간 면역부전 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV)(예를 들면 HIV1 또는 HIV2), 원숭이 면역부전 바이러스(simian immunodeficiency virus; SIV), 고양이 면역부전 바이러스(FIV), 마에디비스나 바이러스(maedi·visna virus), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV) 등을 포함하는 렌티바이러스아과(Lentivirus)에 속하는 레트로바이러스(본 발명에 있어서 렌티바이러스라고 부른다)를 들 수 있다. HIV-1로서는 모든 메이저(major: M) 서브타입(A부터 J를 포함한다), N 및 outlier(O)가포함된다(Hu, D. J. et al., JAMA 1996; 275: 210-216; Zhu, T. et al., Nature 1998, 5; 391(6667): 594-7; Simon, F. et al., Nat. Med. 1998, 4(9): 1032-7). SIV 단리주로서는, SIVagm, SIVcpz, SIVmac, SIVmnd, SIVsnm, SIVsyk 등을 예시할 수 있다. 또한, 스푸마바이러스(Spumavirus)에서 유래되는 레트로바이러스 등이어도 되고, 예를 들면 포미바이러스(Foamyvirus)가 포함된다(DE4318387; WO9607749; Virology (1995) 210, 1, 167-178; J. Virol. (1996) 70, 1, 217-22). 포미바이러스에서 유래되는 바이러스 벡터는 인간세포로의 외래유전자 도입, 특히 유전자치료 및 재조합 백신의 투여 등에 이용될 수 있다.
슈도타입 바이러스 벡터는 예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질 뿐만 아니라, 상기 바이러스의 다른 엔벨로프 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 파라믹소바이러스의 HN 및 F 단백을 갖는 슈도타입 바이러스 벡터에서, HN 단백질에 화합물이 부가된 벡터를 포함하는 조성물은 본 발명에 포함된다. 또한 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 포함하는 바이러스 벡터는 다른 바이러스 유래의 엔벨로프 단백질을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 이러한 단백질로서 인간세포에 감염되는 바이러스에서 유래되는 엔벨로프 단백질이 적합하다. 이러한 단백질로서는 특별히 제한은 없지만, 레트로바이러스의 암포트로픽(amphotropic) 엔벨로프 단백질, 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 G 단백질 등을 들 수 있다. 또한, 헤르페스 바이러스과(Herpesviridae)의 단백질로서는, 예를 들면 단순 헤르페스 바이러스의 gB, gD, gH, gp85 단백질, EB 바이러스의 gp350, gp220 단백질 등을 들 수 있다. 헤파도나 바이러스과(Hepadonaviridae)의 단백질로서는 B형 간염 바이러스의 S 단백질 등을 들 수 있다. 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프 단백질로서는, 예를 들면 마우스 백혈병 바이러스(MuLV) 4070A주 유래의 엔벨로프 단백질을 사용할 수 있다. 또한, MuMLV 10A1 유래의 엔벨로프 단백질을 사용하는 것도 가능하다(예를 들면 pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)). 에코트로픽(ecotropic) 엔벨로프 단백질로서는, 예를 들면 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MoMuLV) 유래의 엔벨로프 단백질을 사용할 수 있다. 수포성 구내염 바이러스 G 단백(VSV-G)으로서는, 예를 들면 인디아나(Indiana) 혈청형주(J. Virology 39: 519-528 (1981)) 유래의 단백을 사용할 수 있다. 이들 이외에도 원하는 주 유래의 단백질을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 마이너스 가닥 RNA 바이러스란 마이너스 가닥(바이러스 유전자를 코드하는 센스 가닥에 대한 안티센스 가닥)의 RNA를 게놈으로서 포함하는 바이러스로서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 바이러스를 말한다. 마이너스 가닥 RNA는 네가티브 가닥이라고도 불리운다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는, 예를 들면 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)의 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae)의 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 광견병 바이러스(Rabies virus) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 헤마글루티닌 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질은 바람직하게는 단일 가닥(single-stranded) 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 바이러스 엔벨로프 단백질이다. 단일 가닥 마이너스 가닥 RNA 바이러스는 비분절형(non-segmented) 마이너스 가닥 RNA 바이러스라고도 불리우고, 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus 및 Pneumovirus속 등을 포함한다), 랍도바이러스(Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus 및 Ephemerovirus속 등을 포함한다), 피로바이러스(Firoviridae), 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae; Infuluenza virus A, B, C 및 Thogoto-like viruses속 등을 포함한다), 부냐바이러스(Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus 및 Phlebovirus속 등을 포함한다), 아레나바이러스(Arenaviridae) 등의 과에 속하는 바이러스가 포함된다. 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질로서는, 구체적으로는, 파라믹소바이러스의 HN 단백질, 오르토믹소바이러스의 HA 단백질, 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질, 부냐바이러스의 G1 단백질, 랍도바이러스의 G 단백질, 피로바이러스의 VP1 단백질 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 헤마글루티닌 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질은, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스의 바이러스 엔벨로프 단백질이다. 「파라믹소바이러스」란 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)에 속하는 바이러스를 가리킨다. 파라믹소바이러스로서는, 예를 들면 파라믹소바이러스(Paramyxovirus)속, 모르빌리바이러스(Morbillivirus)속 및 루블라바이러스(Rubulavirus)속, 뉴모바이러스(Pneumovirus)속 및 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus)속이 포함되고, 구체적으로는 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytical virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 2, 3형 등을 들 수 있다. 파라믹소바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질은 구체적으로는 HN 단백질을 들 수 있다(H 단백질이라고도 불리운다). 본 발명에 있어서 헤마글루티닌 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질은, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스속, 모르빌리바이러스속 및 루블라바이러스속을 포함하는 파라믹소바이러스아과의 바이러스이고, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스속 바이러스의 바이러스 엔벨로프 단백질이다. 헤마글루티닌 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질은 가장 바람직하게는 센다이 바이러스의 HN 단백질이다. 각 바이러스는 야생주, 변이주, 라보계대주(laboratory-passaged strain) 및 인위적으로 구축된 주(strain) 등이 포함된다. 예를 들면 Z주 유래 센다이 바이러스의 HN 단백질을 적합하게 사용할 수 있다. 센다이 바이러스의 HN 유전자의 염기서열은, GenBank 액세션번호 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131등에 기재되어 있다.
또한, 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질로서 오르토믹소바이러스과 바이러스의 HA 단백질을 사용하는 것도 바람직하다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스의 엔벨로프 단백 발현 플라스미드를 사용하여 제조된 슈도타입 바이러스는 인간세포를 포함한 넓은 포유동물세포에 감염 가능하다. 인플루엔자 바이러스 엔벨로프에는 원하는 단리주 유래의 것이 사용될 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 출아(budding)에 있어서는 뉴라미니다아제(neuraminidase)가 시알산과의 결합을 절단하는 역할을 담당하고 있다. 이 때문에 HA 슈도타입 바이러스의 제작에 있어서는, HA에 화합물을 부가하기 전, 중 또는 후의 시기에 뉴라미니다아제로 처리함으로써 감염성 바이러스를 얻을 수 있다. 또는, 뉴라미니다아제 활성을 갖는 단백질을 공존시킨 바이러스 벡터를 제작함으로써 자동적으로 시알산과의 결합을 절단시킬 수 있다. 이 경우, 파라믹소바이러스의 HN 단백질 등의 뉴라미니다아제 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질을 사용하는 것이 특히 적합하다. 이와 같이 본 발명은, 오르토믹소바이러스과 바이러스의 HA와 파라믹소바이러스과 바이러스의 HN 단백질 양쪽으로 슈도타입화된 바이러스 벡터로, 이들 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 화합물이 부가되어 있어 헤마글루티닌 활성이 저하된 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다.
바이러스 엔벨로프 단백질은 야생형 바이러스가 갖는 인택트(intact)한 단백질이어도 되고, 천연 또는 인위적으로 변이가 도입되어 있어도 된다. 예를 들면, 이들 엔벨로프 단백질에 있어서 세포표면의 항원분자가 될 수 있는 항원제시 에피토프(epitope) 등을 해석하고, 이것을 이용하여 항원제시능력을 약화시킨 단백질을 사용하여 바이러스를 작성하는 것도 가능하다. 또한, 병원성 바이러스 등에 있어서의 약독주(attenuated strain) 유래의 엔벨로프 단백질 등을 사용하는 것도 가능하다.
예를 들면, 헤마글루티닌 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질이나, 다른엔벨로프 단백질의 세포질측 영역을 결실, 치환 및/또는 부가에 의해 개변한 단백질을 사용하여, 보다 높은 유전자 도입능력을 갖는 벡터를 제조하는 것이 가능하다. 본 발명은 천연에 존재하는 헤마글루티닌 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질의 세포질측 영역의 일부 또는 전부가 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 개변된 단백질을 포함하는 바이러스로서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질에 화합물이 부가되어 있는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 예를 들면 파라믹소바이러스의 HN 단백질의 세포질측 영역을 결실시키거나, 다른 막 단백질(예를 들면 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질)의 세포질측 영역에서 치환 또는 부가된 개변 단백질은 감염효율이 높은 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위해서 적합하게 사용된다.
본 발명에 있어서 헤마글루티닌 활성이란 헤마글루티네이션(Hemagglutination, HA)을 일으키는 활성, 즉 적혈구를 응집시키는 활성을 말한다. 헤마글루티닌 활성은 공지의 방법에 의해 시험할 수 있다(국립예방 위생연구소 학우회편, 개정2판 바이러스 실험학 총론, pp.214-225, 마루젠 가부시키가이샤(Maruzen Co., Ltd.)). 적혈구로서는 예를 들면 닭(병아리 및 성계(adult chicken)를 포함한다), 거위, 랫트(rat), 모르모트(guinea pig), 붉은털원숭이(rhesus monkey), 사바나원숭이(green monkey) 또는 인간 등의 적혈구가 사용될 수 있다. 반응온도는 0℃, 4℃, 실온 또는 37℃ 등 단백질에 따라 적합한 조건에서 행한다. 구체적으로는, 헤마글루티닌 활성의 측정은 예를 들면 「endo-point 희석법」(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda,Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999)에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 조성물은 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 화합물이 부가되어 있고, 이것에 의해 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우에 비해 헤마글루티닌 활성이 저하되어 있다. 본 발명에 있어서 활성의 저하는 유의하게 저하되어 있으면 되고, 예를 들면 통계학적으로 유의(예를 들면 유의수준 5% 또는 그것보다 유의)하게 저하되어 있는 경우가 포함된다. 또한 활성이 완전히 결실(또는 검출한계 미만)되어 있는 경우도 포함된다. 본 발명의 조성물은 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우의 대조 조성물과 비교해, 헤마글루티닌 활성이 바람직하게는 1/2 이하, 보다 바람직하게는 1/3 이하, 보다 바람직하게는 1/5 이하, 보다 바람직하게는 1/10 이하, 보다 바람직하게는 1/20 이하, 보다 바람직하게는 1/50 이하, 보다 바람직하게는 1/100 이하, 보다 바람직하게는 1/200 이하, 보다 바람직하게는 1/500 이하, 보다 바람직하게는 1/1000 이하로 저하되어 있다. 이것에 대해서 본 발명의 조성물이 갖는 약제 또는 유전자를 세포로 도입하는 능력은 상기 헤마글루티닌 활성의 저하에 비해 높게 유지되어 있다. 즉, 본 발명의 조성물이 갖는 약제 또는 유전자를 세포로 도입하는 능력은 화합물이 부가되어 있지 않은 대조 조성물의 경우와 비교해 저하의 정도가, 상기 헤마글루티닌 활성의 저하 정도에 비해 적거나, 보다 바람직하게는 저하되어 있지 않거나 상승되어있다.
또한 본 발명의 조성물은 바람직하게는 용혈활성도 유의하게 저하되어 있다. 용혈활성은 혈액에 피검 조성물을 첨가하여 정치(靜置)한 후 원심하여 혈구성분을 제거하고, 용출된 헤모글로빈을 흡광도 측정에 의해 측정하여 검출할 수 있다(실시예 참조). 본 발명의 조성물은 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우의 대조 조성물과 비교해, 용혈활성이 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 60% 이하, 보다 바람직하게는 1/2 이하, 보다 바람직하게는 1/3 이하, 보다 바람직하게는 1/5 이하, 보다 바람직하게는 1/10 이하, 보다 바람직하게는 1/20 이하, 보다 바람직하게는 1/50 이하로 저하되어 있다.
본 발명의 조성물은, 헤마글루티닌 활성이 저하되어 있고, 바람직한 태양에 있어서는 용혈활성도 저하되어 있지만, 약제 또는 유전자를 세포에 도입하는 능력을 유지하고 있다. 예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스 또는 상기 바이러스의 엔벨로프 성분을 포함하는 조성물에 있어서는, 상기 조성물은 표적세포와의 세포막 융합능력을 가지고 있어 이것에 의해 약제 또는 유전자가 표적세포에 송달된다. 세포막 융합능력이란, 본 발명의 조성물에 포함되는 복합체(운반체)가 세포막에 흡착된 후 상기 복합체가 갖는 융합활성에 의해 세포내에 그 구성성분이 삽입되는 능력을 말한다. 이 활성은 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 엔벨로프에 포함되는, 세포융합을 일으키는 엔벨로프 단백질인 퓨전(F) 단백질의 작용에 의한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포막에는 화합물이 부가된 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질 뿐만 아니라 바람직하게는 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 F 단백질도 포함하고 있다.
세포와의 융합능력은 예를 들면, 1. 적혈구의 용혈을 지표로서 검출한다. 2. 막에 형광물질을 삽입해 두고, 융합에 의한 막의 유동에 의해 형광물질이 희석되어 형광강도의 변화가 일어나는 것을 이용해 검출한다. 또는 3. 내수층에 약물을 봉입한 리포솜을 세포막의 모델로서, 그 누출을 지표로서 검출하는 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.
또한, 상기와 같이 레트로바이러스 등 다른 바이러스에 있어서의 슈도타입 바이러스로서 본 발명의 조성물을 조제하는 경우는, 각각의 바이러스의 엔벨로프 단백질에 의해 바이러스 내의 약제 또는 유전자가 세포에 도입되는 능력이 유지되어 있다. 약물 또는 유전자의 세포로의 도입능력은 세포내에 도입된 이들 약제 또는 유전자를 검출함으로써 확인할 수 있다. 약제라면, 예를 들면 표지된 약제의 세포내로의 섭취(uptake)를 검출하거나, 또는 생리활성 물질을 도입시켜 이것에 의한 세포의 형질변화를 검출함으로써 검출할 수 있다. 유전자라면, 세포내에 있어서의 상기 유전자의 발현을 RT-PCR, 노던 블롯 잡종화, 면역침강, 웨스턴 블롯 등의 방법에 의해 RNA 레벨 또는 단백질 레벨로 검출할 수 있다. 또한 생리활성 단백질을 코드하는 유전자를 삽입시키고, 상기 단백질에 의한 세포의 형질변화를 검출함으로써 검출할 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 바람직하게는 혈중 안정성이 유의하게 상승되어 있다. 혈중 안정성의 상승이란, 본 발명의 조성물이 혈중에 놓였을 때에 약제 또는 유전자의 운반능력의 저하 정도가 작아지는 것을 말한다. 운반능력의 저하가 적을수록 혈중 안정성은 높다. 혈중 안정성의 상승은 본 발명의 조성물을 혈액과 함께 항온처리(incubation)하고, 그 후의 상기 조성물의 약제 또는 유전자의 운반을 측정하여 화합물이 부가되어 있지 않은 경우의 대조 조성물과 비교함으로씨 알 수 있다(실시예 참조). 운반능력은 예를 들면 약제라면 그 약제의 활성크기여도 되고, 유전자라면 그 유전자의 발현레벨이어도 된다. 유전자의 발현은 예를 들면 전사산물(mRNA) 또는 번역산물(단백질)을 직접 또는 간접으로 검출함으로써 결정할 수 있다. 생리활성을 갖는 단백질의 검출은 그 단백질의 활성 측정에 의해 행할 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우의 대조 조성물의 운반능력의 저하 정도와 비교하여, 약제 또는 유전자의 운반능력의 저하 정도가 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 60% 이하, 보다 바람직하게는 1/2 이하, 보다 바람직하게는 1/3 이하, 보다 바람직하게는 1/5 이하, 보다 바람직하게는 1/10 이하로 축소되어 있다. 본 발명의 조성물은 헤마글루티닌 활성에 대한 약제 또는 유전자 운반능력이 미수식의 대조 조성물에 비해 상승되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 화합물이 부가되어 있는 것이란, 상기 단백질과 상기 화합물이 결합되어 있는 것을 말한다. 결합은 공유결합 또는 비공유결합이어도 된다. 비공유결합으로서는 예를 들면 수소결합, 배위결합, 이온결합, 소수(疎水) 상호작용(소수결합) 및 분자간 힘(반데르 발스 힘(Vander Waals force)) 등을 들 수 있다. 상기 단백질과 상기 화합물은 원래는 분리하여 존재하고 있었지만, 결합에 의해 상기 화합물이 상기 단백질에 부가된것이어도 된다. 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질로의 화합물의 부가는 예를 들면 가교에 의한 공유결합 형성에 의해 행할 수 있다. 가교는 원하는 관능기를 매개로 하여 형성시킬 수 있다. 관능기로서는 예를 들면 수산기, 아미노기, 알데히드기, 카르복실기, 티올기, 히드록실기, 실라놀기, 아미드기, 에폭시기, 숙시닐이미드기, 페놀기 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 공유결합의 예로서 에스테르결합, 에테르결합, 아미노결합, 아미드결합, 설피드결합, 이미노결합, 디설피드결합 등을 들 수 있다. 상기 단백질과 상기 화합물은 바람직하게는 비펩티드 결합으로 결합되어 있다. 공유결합법으로서는, 브롬화시안 활성화법, 산 아지드(acid azide) 유도체법, 축합 시약법, 디아조법 및 알킬화법 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제 또는 유전자 운반 조성물의 제조는 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 화합물을 접촉시키는 공정 및 상기 단백질과 상기 화합물을 결합시키는 공정을 포함하는 방법에 의해 실시할 수 있다. 화합물은 상기 엔벨로프 단백질의 엔벨로프 외측에 해당하는 영역에 결합시킨다. 그러기 위해서는, 특히 상기 단백질에 화합물을 접촉시키는 공정을, 상기 단백질을 포함하는 바이러스 입자에 상기 화합물을 접촉시킴으로써 행하는 것이 바람직하다. 이것에 의해, 헤마글루티닌 활성에 관여하는 상기 단백질의 바이러스 표면에 노출된 영역에 특이적으로 화합물을 부가할 수 있다. 특히 본 발명에 있어서, 바이러스 표면에 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질 뿐만 아니라 다른 엔벨로프 단백질이 존재하는 경우이더라도, 화합물의 가교에 의해 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 우선적으로 화합물이 부가되어 유의하게 헤마글루티닌활성이 저하되는 것이 판명되었다. 따라서, 예를 들면 통상의 방법으로 생산된 화합물이 부가되어 있지 않은 바이러스에 화합물을 첨가하고 상기 화합물을 상기 바이러스에 부가하는 공정을 실시함으로써 간단하게 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 화합물이 부가된 바이러스를 제조할 수 있다.
헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 부가하는 화합물로서는 상기 단백질의 헤마글루티닌 활성을 유의하게 저해하는 한 제한받지 않는다. 바람직하게는 유의한 생물독성을 갖지 않고 단백질에 부가된 후에는 화학적으로 안정된 화합물인 것이 바람직하다. 또한, 비항원성 또는 항원성이 낮은 것이 바람직하다. 또한, 부가되는 화합물은 수용성인 것이 바람직하다. 헤마글루티닌 활성을 유효하게 저해하기 위해서는, 화합물의 분자량은 바람직하게는 1,600(달톤; Da) 이상, 보다 바람직하게는 1,800 이상, 보다 바람직하게는 1,900 이상, 보다 바람직하게는 2,000 이상이다. 특히, 분자량이 2,800 이상, 보다 바람직하게는 3,800 이상, 보다 바람직하게는 4,300 이상, 보다 바람직하게는 4,500 이상, 보다 바람직하게는 5,000 이상의 화합물이다. 또한 분자량이 12,000 이상, 보다 바람직하게는 14,000 이상, 보다 바람직하게는 15,000 이상, 보다 바람직하게는 16,000 이상, 보다 바람직하게는 18,000 이상, 보다 바람직하게는 20,000 이상인 화합물은 헤마글루티닌 활성을 특히 현저하게 저해할 수 있다.
부가되는 화합물로서는 각종 폴리머여도 되고, 예를 들면 유기화합물 중합체를 들 수 있다. 부가되는 화합물은 분자량에 분산이 있어도 되고, 그 경우 본 명세서에서 말하는 부가되는 화합물의 분자량이란 평균 분자량이다. 분자량 분산(MW/Mn)은 작은 것이 바람직하며, 예를 들면 5 이하, 바람직하게는 3 이하, 보다 바람직하게는 2 이하, 보다 바람직하게는 1.6 이하, 보다 바람직하게는 1.4 이하이다.
구체적으로는 천연 고분자로서 예를 들면, 항체, 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 피브린(fibrin), 렉틴(lectin), 헤파린 등의 단백질 또는 그의 단편, 또는 덱스트란, 시클로덱스트린, 황산 덱스트란, 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산(alginic acid) 등의 다당류, 더 나아가서는 지질을 사용할 수 있다. 또한, 합성 고분자로서 폴리젖산, 폴리리신, 폴리스티렌, 피란(pyran) 중합체, 폴리글루타민산, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌글리콜, 스티렌-말레산 공중합체, 리신-글루타민산 공중합체, 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트, 피콜(ficoll) 등을 사용할 수 있다.
부가되는 화합물로서는 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 들 수 있다(J.M. Harris, "Polyethylene Glycol Chemistry. Biotechnical and Biomedical Applications", Plenum, New York, NY, 1992; J.M. Harris and S. Zalipsky, "Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol", ACS Books, Washington, D.C., 1997). PEG는 수용성이고 독성이 낮거나 또는 없기 때문에 적합하게 사용된다. PEG란 하기의 구조를 갖는 화합물을 말한다.
-(CH2CH2O)n- [화합물 1]
(여기에서 n은 2 이상의 자연수)
예를 들면 대표적인 PEG로서는 이하의 구조로 되는 화합물을 들 수 있다.
HO-(CH2CH2O)n-H [화합물 2]
(여기에서 n은 2 이상의 자연수)
PEG는 원하는 수식체가 포함되고, 예를 들면 상기 구조의 말단은 히드록실기 등으로부터 치환되어 있어도 된다. 예를 들면 주쇄의 한 말단의 히드록실기가 치환된 모노메틸에테르(mPEG)는 본 발명에 있어서 적합하게 사용된다. PEG는 직쇄상이어도 되고, 또는 분지를 갖는 PEG여도 된다. 예를 들면 1, 2, 3 또는 그 이상의 측쇄(side-chain)를 갖는 PEG를 사용할 수 있다. 측쇄는 에틸렌글리콜 구조를 가지고 있어도 된다. PEG는 각종 분자량의 것이 입수 가능하며, 예를 들면 PEG2000(평균 분자량 2000), PEG3000(평균 분자량 3000), PEG4000(평균 분자량 4000), PEG5000(평균 분자량 5000), PEG8000(평균 분자량 8000), PEG10000(평균 분자량 10000) 또는 PEG20000(평균 분자량 20000) 등을 적합하게 사용할 수 있다. 가교를 위한 관능기를 갖는 PEG를 사용하여 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 이 PEG를 부가할 수 있다.
예를 들면, 말단에 1급 아미노기를 갖는 PEG는 아실화 시약으로 가교하는 것이 가능하다(Buckmann, A. et al (1981) Makromol. Chem. 182:1379; Zalipsky, S. et al (1983) Eur. Polym. J. 19:1177; Eidelman, O. et al (1991) Am. J. Physiol. 260 (Cell Physiol 29):C1094; Pillai, V.N.R. et al (1980) J. Org. Chem. 45:5364). 또는, N-hydroxysuccinimide(NHS) 활성화 에스테르, 활성화 카르복실산 및 알데히드 등을 이용하여 보다 간편하게 가교시킬 수 있다. 구체적으로는, PEG 카르복실산의 NHS 에스테르로서는 예를 들면 PEG-숙시니미딜 숙시네이트(PEG-Succinimidyl succinate), PEG-숙시니미딜 카르보네이트(PEG-Succinimidyl carbonate), PEG-숙시니미딜 프로피오네이트(PEG-Succinimidyl Propionate) 및 PEG-숙시니미딜 부타노에이트(PEG-Succinimidyl Butanoate) 등을 들 수 있다(Olson, K. et al, (1997) J. M. Harris & S. Zalipsky Eds., Poly(ethylene glycol), Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, ACS, Washington, DC.; Harris, J. M. and Kozlowski, A., U.S. Patent 5,672,662). 또한, PEG의 벤조트리아졸 카르보네이트(benzotriazole carbonate) 유도체는 단백질의 아미노기와 안정한 우레탄결합을 형성한다(Dolence, Eric K., U.S. Patent 5,650,234). 또한, 알데히드기를 말단에 갖는 PEG를 사용하는 것도 가능하다. 알데히드기는 NHS 에스테르보다도 완만한 조건에서 아민에 반응시킬 수 있다. 예를 들면 PEG-프로피온알데히드(PEG-Propionaldehyde) 등을 적합하게 사용할 수 있다(Harris, J.M. et al (1984) J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22:341; Kinstler, Olaf B. et al., U. S. Patent 5,824,784; Wirth, P. et al (1991) Bioorg. Chem. 19:133). 또한 PEG의 말레이미드(Maleimide) 유도체는 티올기에 가교할 수 있다(Goodson, R.J. & Katre, N.V. (1990) Bio/Technology 8:343; Kogan, T. P. (1992) Synthetic Comm. 22, 2417). PEG의 카르복시메틸(carboxymethyl)-NHS 유도체, 노르류신(norleucine)-NHS 유도체, 트레실레이트(tresylate) 유도체, 에폭시드(epoxide) 유도체, 카르보닐이미다졸(carbonylimidazole) 유도체 및 PNP 카르보네이트(carbonate) 유도체 등을사용하는 것도 가능하다. 특히, PEG 트레실레이트(Tresylate) 및 PEG 숙시니미딜 프로피오네이트(Succinimidyl Propionate)를 적합하게 사용할 수 있다.
화합물의 결합은 예를 들면 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 포함하는 바이러스 입자를 1 mg 단백/ml 정도의 농도로 조제하여 부가하고자 하는 화합물을 0.1~100 mg, 바람직하게는 1~50 mg 정도 첨가하여 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 바이러스 1 mg 단백에 대해서 pH8.5의 완충액 중에서 SPA-PEG5K를 1~5 mg을 반응시킴으로써, 또, SPA-PEG20K를 10~20 mg 정도 반응시킴으로써 헤마글루티닌 활성이 유의하게 저하되어 세포로의 약제 또는 유전자 도입능력을 유지시킬 수 있다. 단백질로의 화합물의 부가는 반응에 사용하는 화합물의 양 등의 반응조건에 의해 변화할 수 있지만, 헤마글루티닌 활성이 유의하게 저하되어 세포로의 약제 또는 유전자 도입능력은 유지될 수 있도록 적절히 조정된다.
예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 화합물을 부가하는 경우, 그 화합물과 바이러스와의 양비는 화합물을 몰수, 바이러스량을 단백량으로 한 경우에 1~10 μmol/mg 단백질(화합물/바이러스 비), 보다 바람직하게는 2~8 μmol/mg 단백질, 보다 바람직하게는 3~8 μmol/mg 단백질, 예를 들면 약 4 μmol/mg 단백질로 할 수 있다.
약제 또는 유전자를 세포에 도입하는 능력을 상실시키지 않기 위해서, 부가되는 화합물의 분자량은 바람직하게는 100,000 이하, 보다 바람직하게는 80,000 이하, 보다 바람직하게는 60,000 이하, 보다 바람직하게는 50,000 이하이다. 특히 분자량이 40,000 이하, 보다 바람직하게는 35,000 이하, 보다 바람직하게는 30,000이하, 보다 바람직하게는 25,000 이하, 보다 바람직하게는 20,000 이하의 화합물은 상기 도입능력을 유지하여 헤마글루티닌 활성을 특이적으로 저하시키는 데 적합하다.
실시예 28에 나타내는 바와 같이, 헤마글루티닌 단백질을 수식한 경우에 약제 또는 유전자의 도입능력은 폴리에틸렌이민(PEI) 등의 지방족 폴리아민에 의해 추가로 수식함으로써 현저하게 개선할 수 있는 것이 명백해졌다. PEI란 하기의 구조를 갖는 화합물을 말한다.
-(CH2CH2NH)n- [화합물 3]
(여기에서 n은 2 이상의 자연수)
예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 PEG 수식물에 PEI를 부가함으로써 유전자 도입능력을 유의하게 상승시킬 수 있다. 이 경우, PEI와 바이러스의 양비는 화합물을 중량, 바이러스량을 단백량으로 한 경우에 0.001~1(화합물/바이러스 비), 보다 바람직하게는 0.01~0.2, 보다 바람직하게는 0.01~0.1로 할 수 있다. PEI의 평균 분자량은 예를 들면 25 kDa~750 kDa의 것을 적합하게 사용할 수 있지만 이것에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 헤마글루티닌 단백질로의 화합물의 부가에 의해 약제 또는 유전자의 도입효율이 저하 또는 상실되는 경우이더라도, 이 단백질을 포함하는 복합체에 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 부가함으로써 도입효율을 유지할 수 있는 것이 판명되었다. 이것에 의해, 엔벨로프 단백질에 부가되는 화합물의 분자량은 제한받지 않고, 본 발명의 약제 또는 유전자 운반 조성물을 조제하는 것이 가능해졌다. 본 발명은 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는 약제 또는 유전자 운반 조성물로서, (a) 상기 단백질에 화합물이 부가되어 있고, (b) 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우에 비해 헤마글루티닌 활성이 저하되어 있으며, (c) 상기 단백질이 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물과 함께 형성된 복합체를 포함하고, (d) 상기 약제 또는 유전자를 표적으로 하는 세포로 도입하는 능력을 갖는 조성물을 제공한다. 헤마글루티닌 활성을 저해하여 유전자의 도입을 저해하는 화합물을 결합한 경우도 그 화합물에 추가로 리간드를 삽입함으로써 헤마글루티닌 활성을 저해하여 유전자 도입은 유지할 수 있다. 리간드란 세포표면의 수용체에 결합하여 수용체의 기능을 활성화하는 화합물이다. 예를 들면, 항체의 F(ab')2 단편(분자량 약 50 kDa)을 사용한 경우, 결합량을 적게 조절하면 헤마글루티닌 활성의 잔존에 따른 바이러스 벡터의 유전자 도입능력을 유지할 수 있지만, 세포에 결합하는 활성을 갖는 리간드(엽산)을 항체에 결합함으로써 헤마글루티닌 활성을 완전히 저해한 경우이더라도 벡터의 유전자 도입능력을 극적으로 향상시키는 것이 가능하다(실시예 참조).
세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물이 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질과 함께 복합체를 형성하고 있는 것이란, 상기 화합물과 상기 단백질이 공유결합 또는 비공유경합에 의해 직접 또는 간접(예를 들면 다른 화합물을 매개로 하여)으로 결합하고 있는 것을 말한다. 결합은 공유결합이어도 비공유결합이어도 된다. 예를 들면, 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질과 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 갖는 세포막을 포함하는 조성물 등이어도 된다. 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물은 복합체의 표면에 노출되어 있는 것이 필요하고, 예를 들면 상기 복합체가 바이러스 입자라면 상기 단백질과 상기 화합물이 바이러스 엔벨로프 표면에 존재하고 있는 것이어도 되며, 상기 복합체가 리포솜이라면 상기 리포솜 표면에 상기 단백질과 상기 화합물이 존재하고 있는 것이어도 된다. 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 상기 복합체에 결합시키기 위해서는, 예를 들면 상기 화합물을 상기 복합체에 포함되는 원하는 엔벨로프 단백질에 가교하거나, 또는 바람직하게는 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 가교시킬 수 있다. 가교는 상기와 동일하게 원하는 관능기를 이용하여 형성시킬 수 있다. 또는, 상기 화합물이 단백질이라면 막 단백질로서 엔벨로프에 발현시키거나, 상기 복합체에 포함되는 엔벨로프 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다. 바람직한 태양에 있어서는, 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물은 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 부가되어 있는 화합물과 공유결합 또는 비공유결합에 의해 직접 결합하고 있거나, 또는 동일한 화합물이다. 본 발명은 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는, 헤마글루티닌 활성이 저하된 약제 또는 유전자 운반 조성물의 제조방법으로서, (a) 상기 단백질에 화합물을 접촉시키는 공정 및 (b) 상기 단백질과 상기 화합물을 결합시키는 공정을 포함하는 방법으로, (i) 상기 화합물에 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 부가하는 공정을 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 공정 (i)는 공정 (a) 전에 행해도 되고, 또는 공정 (a) 또는 (b)와 동시 또는 (a)와 (b)의 사이, 또는 공정 (b)후에 행해도 된다. 바람직하게는 공정 (i)는 공정 (a) 전에 행해진다. 또는 미리 공정 (i)가 행해진 화합물을 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 부가해도 된다.
세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물로서는, 세포표면에 결합하고 그것에 의해 본 발명의 조성물의 약제 또는 유전자 도입을 돕는 작용을 갖는 한 원하는 것을 사용할 수 있다. 그러한 화합물로서는, 예를 들면 세포표면 단백질에 결합하는 화합물, 또는 세포표면의 당쇄에 결합하는 화합물 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 바이러스의 엔벨로프 단백질, 또는 천연 또는 합성의 리간드, 호르몬, 또는 세포 접착인자 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 엽산, 트랜스페린(transferrin), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 항체, 렉틴, 갈락토오스, 만노오스 등을 예시할 수 있다.
그 중에서도 본 발명에 있어서 엽산은, 본 발명의 조성물에 포함되는 복합체의 약제·유전자 도입능력을 유지시키는 데 매우 유효한 것이 판명되었다. 본 발명은 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는 약제 또는 유전자 운반 조성물로서, (a) 상기 단백질에 화합물이 부가되어 있고, (b) 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우에 비해 헤마글루티닌 활성이 저하되어 있으며, (c) 상기 단백질이 엽산과 함께 형성된 복합체를 포함하고, (d) 상기 약제 또는 유전자를 표적으로 하는 세포로 도입하는 능력을 갖는 조성물을 제공한다. 특히, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물에 엽산이 직접 결합되어 있는 것이 바람직하다.
세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 사용하여 본 발명의 조성물을 제조할 때에 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 부가되는 화합물로서 특히 바람직한 것은 상기 단백질에 결합하는 항체이다. 본 발명의 조성물은 바람직한 태양으로서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편이 결합되어 있는 상기 단백질을 포함하는 조성물로서, 상기 단백질이 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물과 함께 복합체를 형성하고 있는 조성물을 들 수 있다. 즉 본 발명은, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는, 약제 또는 유전자 운반 조성물로서, (a) 상기 단백질에, 상기 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편이 결합되어 있고, (b) 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우에 비해 헤마글루티닌 활성이 저하되어 있으며, (c) 상기 단백질이 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물과 함께 형성된 복합체를 포함하고, (d) 상기 약제 또는 유전자를 표적으로 하는 세포로 도입하는 능력을 갖는 조성물에 관한 것이다. 특히, 세포에 결합하는 활성을 갖는 화합물이 상기 항체 또는 그의 단편과 직접 결합되어 있는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서 항체에는 단일클론 항체 및 다중클론 항체가 포함된다. 또한, 토끼 등의 면역동물에 본 발명의 단백질을 면역하여 얻은 항혈청, 모든 클래스의 다중클론 항체 및 단일클론 항체, 추가로 인간 항체나 유전자 재조합에 의한 인간형화 항체도 포함된다. 다중클론 항체는 예를 들면 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질 또는 그들의 부분 펩티드를 조제하고, 이것을 항원에 토끼, 염소, 양 등을 면역하여 다중클론 항체를 제작한다. 항원 펩티드로서는, 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질의 세포외영역 또는 그의 단편을 사용할 수 있다. 항원 펩티드는 적절히 다른 단백질, 예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)이나 알부민 등의 캐리어 단백질에 결합시켜 면역할 수 있다. 단일클론 항체는 면역된 마우스나 랫트의 비장세포를 사용하여 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻음으로써 제작할 수 있다. 항체의 제작은 공지의 방법에 따라 행할 수 있다(Harlow, E. and Lane, D. (eds.), Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Shepherd, P. and Dean, C. (eds.), Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Practical Approach Series, 227), Oxford Univ Press, 1999). 다중클론 항체는 혈청으로부터, 단일클론 항체는 하이브리도마 배양상청 또는 하이브리도마를 접종한 동물의 복수(ascites)로부터 황산암모늄 분획, 프로테인 G 세파로오스 컬럼, 항원을 고정한 친화성 컬럼 등의 일반적인 생화학적 수법으로 항체를 정제할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 항체는 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질의 엔벨로프의 외측영역(세포외영역)에 결합하는 항체를 사용할 수 있고, 바람직하게는 단일클론 항체, 더욱 바람직하게는 실시예 12에 기재된 HN-1(Miura et al., Exp. Cell Res., 1982, 141, 409-420)이다. 본 발명의 항체는 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질(항원 단백질)에 결합하는 한 그의 항체 단편이어도 된다. 예를 들면, Fab, Fab(t), Fab', F(ab')2, 항체 가변영역 단편(Fv), 단일사슬 가변영역 단편(single chain Fv; scFv) 또는 그들의 수식물이 포함된다. Fab는 항체 H사슬 가변영역을 포함하는 1개의 폴리펩티드 사슬 및 L사슬 가변영역을 포함하는 1개의 폴리펩티드 사슬로 되는 복합체이다. 이들 폴리펩티드는 서로 결합하여 1개의 항원결합 부위(1가)를 형성한다. Fab는 전형적으로는 면역글로불린을 파파인으로 소화(消化)함으로써 얻어지지만, 이것과 동등한 구조를 갖는 것도 본 발명에 있어서 Fab라고 칭한다. 구체적으로는 Fab는 면역글로불린 L사슬과, H사슬 가변영역(Vh) 및 CH1을 포함하는 폴리펩티드 사슬이 결합된 이량체 단백질이 포함된다. Fab'(면역글로불린을 펩신으로 소화한 후, H사슬 사이의 디설피드 결합을 절단하여 얻어진다) 및 Fab(t)(면역글로불린의 트립신 소화로 얻어진다) 등도 Fab와 동등한 구조를 갖는다. 또한 F(ab')2란, 항체의 정상영역을 결실한 항체 또는 그것과 동등한 형태의 단백질 복합체를 말하고, 구체적으로는 항체 H사슬 가변영역을 포함하는 1개의 폴리펩티드 사슬 및 L사슬 가변영역을 포함하는 1개의 폴리펩티드 사슬로 되는 복합체를 2개 갖는 단백질 복합체를 말한다. F(ab')2는 항원 결합부가 2개 있는 2가 항체이고, 전형적으로는 항체를 pH 4 부근에서 펩신에 의해 소화되어 얻어지며, H사슬의 힌지(hinge)영역을 갖고 있지만 다른 프로테아제 또는 약제에 의해 절단된 것, 또는 인공적으로 설계된 것이어도 된다. scFv란, 항원 H사슬 가변영역 및 L사슬 가변영역이 단일의 폴리펩티드 사슬에 포함되어 있는 폴리펩티드를 말한다. H사슬 가변영역 및 L사슬 가변영역은 적당한 길이의 스페이서를 사이에 두고 연결되어 있고, 서로 결합하여 항원 결합부를 형성한다. 이와 같은 항체 단편은 예를 들면 「일본 생화학회편 신생화학 실험강좌 12 분자면역학 III 185-195쪽(도쿄 화학동인)」 및/또는 「Current Protocols inImmunology, Volume 1, (John Wiley & Sons, Inc.)」의 기재에 따라 제작할 수 있다. 항체 단편은 예를 들면 항체를 펩신, 파파인, 트립신 등의 단백질 분해효소로 소화함으로써 얻을 수 있다. 또는 가변영역의 아미노산서열을 해석하고 재조합 단백질로서 발현시켜 조제하는 것이 가능하다. 또한 항체에는 인간형 항체 또는 인간 항체 등도 포함된다. 항체는 프로테인 A 컬럼 또는 프로테인 G 컬럼 등을 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명에 있어서는 특히 항체의 가변영역(항원 결합영역)을 포함하는 단편을 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 부가하는 것이 바람직하다. 이와 같은 단편으로서는 항체의 H사슬 및/또는 L사슬의 가변영역을 포함하는 원하는 단편을 사용할 수 있지만, 예를 들면 상기와 같이 Fab, Fab(t), Fab', F(ab')2, Fv, scFv 또는 그들의 수식물을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 세포에 도입하는 약제는 원하는 화합물이어도 되고, 예를 들면 천연 화합물, 합성 화합물, 무기 또는 유기 화합물, 저분자 또는 고분자 화합물 등을 들 수 있다. 또한 유전자는 원하는 핵산이어도 되고, DNA 또는 RNA 등의 핵산 및 그의 유도체를 들 수 있다. 핵산으로서는 고리상 및 직쇄상의 단일 가닥 또는 이중 가닥의 데옥시리보핵산이어도 리보핵산이어도 된다. 핵산의 유도체로서는 예를 들면 포스포티오에이트(phosphotioate), 포스포디티오에이트(phosphodithioate) 등이 예시된다. 본 발명의 조성물로 운반되는 약제 또는 유전자로서는 구체적으로는 예를 들면 안티센스 핵산(Drug Delivery System,10,91-97,1995), 데코이(decoy)(The Journal of Biological Chemistry,267,12403-12406,1994), 리보자임(The Drug Delivery System,10,91-97,1995), 삼중 가닥 DNA(세포공학, 13권, No.4, 277-285, 1994), 플라스미드 DNA(Methods Enzymology,221,317-327,1993), RNA 벡터 및 이들과 캐리어(Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America,89,7934-7938,1992) 또는 단백(Journal of Biological Chemistry,266 (6),3361-3364,1991)과의 복합체, 또는 항암제, 항바이러스제, 톡신(디프테리아 톡신;Biochim Biophys Acta,1192,253-262,1994/리신;Biochim Biophys Acta,1070,246-252,1991), 효소(Immunology,81,280-284,1994), 또는 기타 원하는 생리활성 물질을 사용할 수 있다. 원하는 유전자를 게놈핵산 중에 삽입하고, 재조합 바이러스로부터 상기 유전자를 발현시키는 것도 가능하다.
본 발명의 조성물은 생체로의 직접 투여(인비보) 및 간접 투여(엑스비보: ex vivo)에 있어서 사용할 수 있다. 또한, 생체외세포에 있어서 투여(인비트로: in vitro)할 수 있다. 인비보에서의 적용에 있어서는 투여경로는 약제 또는 유전자가 표적세포 또는 조직에 도달하는 한 원하는 투여경로로 투여되어도 된다. 유효성분의 성질에 따라, 예를 들면 경구적, 경피적, 비강내적(intranasally), 경기관지적(perbronchially), 근내적(intramuscularly), 복강내, 정맥내, 관절내 또는 피하 등에 행해질 수 있지만 그들로 한정되지 않는다. 또한, 전신적 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 인비트로(엑스비보를 포함한다)에서의 적용에 있어서는, 본 발명의 조성물은 표적세포에 접촉하도록 첨가된다. 예를 들면 세포 배양액에 첨가된다. 본발명의 조성물은 특히 혈중에서의 안정성이 우수하기 때문에 정맥주사 등의 혈중 투여에 사용되는 주사제 등으로서 유용하다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는 복합체는, 필요에 따라 약리학적으로 허용되는 원하는 항체 또는 매체와 조합할 수 있다. 「약학적으로 허용되는 항체 또는 매체」란 상기 복합체와 함께 투여하는 것이 가능하고, 복합체에 의한 약제 또는 유전자의 세포로의 도입을 유의하게 저해하지 않는 재료이다. 이러한 담체 또는 매체로서는, 예를 들면 멸균수, 생리식염수, 배양액, 혈청, 인산완충 생리식염수(PBS) 등과 적절히 조합하여 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터를 계란으로 증식시킨 경우 등에 있어서는 뇨액을 포함해도 된다. 또한 본 발명의 조성물은 탈이온수, 5% 덱스트로오스 수용액 등의 담체 또는 매체를 포함하고 있어도 된다. 또한, 리포솜의 막 안정화제(예를 들면 콜레스테롤 등의 스테롤류)를 포함하고 있어도 된다. 또한, 항산화제(예를 들면 토코페롤 또는 비타민 E 등)를 포함하고 있어도 된다. 더욱이, 그 밖에도 식물유, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 살생물제(biocide) 등이 함유되어 있어도 된다. 또한 보존제나 기타 첨가제를 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 수용액, 캅셀, 현탁액, 시럽 등의 형태일 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 용액, 동결 건조물 또는 에어로졸 형태의 조성물이어도 된다. 동결 건조물의 경우는 안정화제로서 소르비톨, 수크로오스, 아미노산 및 각종 단백질 등을 포함하고 있어도 된다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 시약으로서 및 의약으로서 유용하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 질환, 환자의 체중, 연령, 성별, 증상, 투여목적, 투여 조성물의 형태, 투여방법, 도입하는 약제 또는 유전자 등에 따라 다르지만, 당업자라면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스를 포함하는 조성물이라면, 투여량은 바람직하게는 약 105CIU/ml 내지 약 1011CIU/ml, 보다 바람직하게는 약 107CIU/ml 내지 약 109CIU/ml, 가장 바람직하게는 약 1×108CIU/ml 내지 약 5×108CIU/ml의 범위내의 양을 약학상 용인 가능한 담체 중에서 투여하는 것이 바람직하다. 인간에게 있어서는 1회당 투여량은 2×109CIU~2×1010CIU가 바람직하고, 투여 횟수는 1회 또는 임상상 용인 가능한 부작용의 범위에서 복수회 가능하며 1회의 투여 횟수에 대해서도 동일하다. 인간 이외의 동물에 대해서도, 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 체중비 또는 투여 표적부위의 용적비(예를 들면 평균값)로 상기 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여대상이 되는 생물로서는 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 닭, 메추라기, 마우스, 랫트, 개, 돼지, 고양이, 소, 토끼, 양, 염소, 원숭이 및 인간 등을 포함하는 조류, 포유동물 및 기타 척추동물을 들 수 있다. 본 발명의 방법을 인비트로(엑스비보를 포함한다)에서 사용하는 경우는, 적용 개체로서는 예를 들면 인간, 비인간 포유동물 및 조류 등을 들 수 있다. 본 발명의 방법을 인비보에서 사용하는 경우는 적용 개체로서는 특히 비인간 포유동물 및 조류 등을 들 수 있다.
또한 본 발명은 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편으로서, 세포에 결합되는 화합물이 결합되어 있는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 이러한 항체 또는 그의 단편은 마이너스 가닥 RNA 바이러스 또는 그의 처리물에 첨가함으로써 상기 단백질에 결합하고, 이것에 의해 헤마글루티닌 활성을 저하시키지만 세포에 결합하는 화합물에 의해 세포로의 접착을 돕는 작용이 유지된다. 따라서, 이러한 항체 또는 그의 단편은 본 발명의 약제 또는 유전자 운반 조성물의 제조에 매우 유용하다. 항체 또는 그의 단편은 상기와 같이 항체의 L사슬 및/또는 H사슬의 가변영역을 포함하는 원하는 단편 등이어도 된다. 구체적으로는, 예를 들면 Fab, Fab(t), Fab', F(ab')2, Fv, scFv 등을 들 수 있다. 특히, F(ab')2는 적합하게 사용된다. 세포에 결합하는 화합물로서는, 특히 세포표면 수용체의 리간드가 바람직하며, 예를 들면 엽산, 트랜스페린, 에리스로포이에틴, 항체, 렉틴, 갈락토오스, 만노오스 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물로 할 수 있다. 이러한 담체로서는 예를 들면 물, 알코올, 글리세롤, 염, 단백질, 젤라틴, 공지의 pH 완충제, 안정제, 현탁제, 보존제 등을 들 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 마이너스 가닥 RA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편으로서, 세포에 결합하는 화합물이 결합되어 있는 항체 또는 그의 단편 및 (b) 상기 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는 약제 또는 유전자 운반 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는 약제 또는 유전자 운반 조성물로서는, 예를 들면 감염성 바이러스 입자 또는 불활성화 바이러스 또는 상기 바이러스의 엔벨로프를 포함하는 리포솜 등을 들 수 있다. 감염성 바이러스 입자는 예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스이어도 되고, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 포함하는 다른 바이러스이어도 된다. 이들에 상기 항체 또는 그의 단편을 첨가함으로써 상기 엔벨로프 단백질에 항체 또는 그의 단편이 결합되고, 헤마글루티닌 활성이 저하된 약제 또는 유전자 운반 조성물을 조제할 수 있다. 예를 들면 생체내 투여에 있어서 혈중 안정성을 높이고자 하는 경우 등 목적에 맞추어 적절히 헤마글루티닌 활성을 제어하는 것이 가능해진다. 이들은 사용 직전에 혼화함으로써 용이하게 조제할 수 있기 때문에 매우 사용하기 쉬운 시스템이 된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 SeV 벡터의 엔벨로프 단백(HN 및 F 단백)으로의 TPEG 및 SPA-PEG 수식 시약에 의한 PEG 수식을 모식적으로 나타내는 도면이다.
도 2는 SeV 벡터 및 TPEG 수식 SeV 벡터에 의한 랫트 혈액에 대한 용혈활성을 37℃, 15분의 조건에서 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 SeV 벡터 및 TPEG 수식 SeV 벡터의 랫트 혈액 중에서의 안정성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 37℃에서 1, 15 및 30분 처리한 후에 혈장을 분리하고, HeLa세포에 감염을 행하여 24시간 후의 LacZ 유전자 발현을 정량한 결과이다. 결과는 3개 예의 평균값±표준편차로 나타냈다.
도 4는 SeV 벡터 및 TPEG 수식 SeV 벡터를 SDS 전기영동을 행하여 은 염색법에 의해 염색한 결과를 나타내는 사진이다. HN 단백과 F 단백의 영동위치를 화살표로 나타낸다. O는 SeV 벡터를, 8~10은 표 2의 검체번호 8~10에 상당한다.
도 5는 SeV 벡터 및 SPA-PEG5K 수식 SeV 벡터를 토끼 항SeV 항혈청 존재하(10, 100 및 1000배 희석 혈청)에서 LLCMK2 세포에 유전자 도입 후의 LacZ 발현을 X-gal 염색법에 의해 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 SeV 벡터에 엽산결합형 항HN 단일클론 항체에서 HN 단백으로의 선택적 수식을 행하는 모식도이다.
도 7은 HN-1, HN-1/F(ab')2 및 그의 NHS법에 의해 조제된 엽산결합형 항체로 수식한 SeV 벡터의 HAU를 나타내는 도면이다. 가로축은 항체농도, 세로축은 적혈구 응집활성의 log 표기(log2(HAU))를 나타낸다.
도 8은 SeV 벡터, HN-1 수식 SeV 벡터 및 엽산결합 HN-1 수식 SeV 벡터의 닭 적혈구에 대한 용혈활성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. SeV 벡터는 1×107, 1×108및 1×109pfu/mL로, 수식 벡터는 모두 1×109pfu/mL의 SeV 벡터를 100 ㎍/mL의 항체로 수식한 벡터에서의 결과를 나타낸다. 도면의 세로축은 유리(遊離)된 헤모글로빈량을 570 nm에 있어서의 흡광도로 나타냈다.
도 9는 SeV 벡터, HN-1 수식 SeV 벡터 및 엽산결합 HN-1 수식 SeV 벡터를 KB세포에 감염을 행하여 2일 후에 LacZ 유전자 발현을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 과잉 엽산 존재조건이란, 감염실험에 있어서, 배양액 중에 1 mM의 엽산을 첨가하여 행한 계를 나타낸다. 결과를 3개 예의 평균값±표준오차로 나타냈다.
도 10은 HN-1 또는 HN-1/F(ab')2 및 그의 엽산결합체로 SeV 벡터를 수식하여 KB세포에 감염했을 때의 감염 2일 후의 LacZ 유전자 발현을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 3개 예의 평균값±표준오차로 나타냈다.
도 11은 SeV 벡터를 HN-1 또는 EDC법으로 조제한 엽산결합 HN-1로 항체량을 바꾸어 수식한 벡터의 HAU의 변화를 나타내는 도면이다. 가로축은 항체농도, 세로축은 적혈구 응집활성의 log 표기(log2(HAU))를 나타낸다.
도 12는 PFG 수식된 SeV의 역가 변화를 나타내는 도면이다. PEG 반응량을 바꾸어 SeV를 수식하고, 수식 SeV 벡터의 상대 감염효율을 조사하였다.
도 13은 PFG 수식된 SeV의 HA활성 변화를 나타내는 도면이다. PEG 반응량을 바꾸어 SeV를 수식하고, 수식 SeV 벡터의 HA활성을 조사하였다.
도 14는 PFG 수식된 SeV의 감염성과 HA활성의 상관을 나타내는 도면이다. PEG 수식에 의해 HA활성에 대한 감염성은 상승할 수 있음을 알 수 있다.
도 15는 은 염색에 의해 PFG 수식된 SeV의 조성단백을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 엔벨로프 단백인 F와 HN에 유래하는 밴드가 PEG 반응량의 증대에 따라 감소하고 대신에 고분자량 분획에 밴드가 출현하였다.
도 16은 웨스턴 블롯팅에 의해 PFG 수식된 SeV의 조성단백을 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 17은 PEG 수식된 SeV의 중화 항체로의 저항성을 나타내는 도면 및 사진이다. 수식 SeV의 총 입자수(총 단백량)을 일정하게 한 조건에서 비교하였다.
도 18은 PEG10K 수식 SeV의 in vivo 평가를 나타내는 도면이다. 수식 SeV의 투여 스케줄 및 투여조건, 및 항SeV 항체값의 변화가 나타내어져 있다.
도 19는 PEG10K 수식 SeV의 in vivo 평가를 나타내는 사진이다. 도 18에 나타낸 수식 SeV의 in vivo 투여에 있어서의 폐에서의 도입유전자의 발현을 나타낸다.
도 20은 PEG 수식 SeV의 4℃ 보존조건에서의 감염성의 유지효과를 나타내는 도면이다.
도 21은 폴리에틸렌이민(PEI750K)의 수식효과를 나타내는 도면이다. PEI는 PEG 수식 SeV의 감염성을 상승시켰다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서 중에 인용된 문헌은 모두 본 명세서의 일부로서 삽입된다.
[실시예 1] NLS-LacZ 유전자 탑재 SeV 벡터의 조제와 정제
핵이행 시그날 부착 LacZ 유전자(NLS-LacZ)를 탑재한 NLS-LacZ/SeV는 이미 보고된 방법에 의해 제작하였다(Kato et al., Genes Cells, 1996, 1, 569-579; Hasan et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 2813-2820). 이 벡터를 닭 유정란(10일란)에 접종하여 35.3℃에서 3일간 배양한 후 요막액(allantoic fluid)을 회수하였다. 4,000 rpm, 15분의 원심 후 상청을 10,000 rpm, 1시간 원심하여 벡터를 침전시켰다. PBS에 재현탁한 후 수크로오스 밀도 구배(30/50%)로 중층하여 25,000 rpm, 1시간 원심하였다(Beckman, 로터(rotor) SW28). 수크로오스 계면의 벡터를 회수 원심침전한 후 PBS에 재현탁하여 정제 벡터의 스톡(stock)(이하 SeV 벡터라고 표기)을 조제하였다. 벡터의 단백농도는 등용(equal volume)의 2% SDS 용액으로 가용화한 것을 검체로서 사용하고, BSA를 표품(standard)으로 하여 BCA 프로테인 어세이(BCA protein assay)(Pierce사)로 측정하였다. 적혈구 응집활성(HAU)은 이하와 같이 구하였다. 벡터를 96웰(96-well) 둥근바닥 플레이트(아사히 테크노글라스(Asahi Technoglass)) 내에서 PBS로 순차 2배 희석을 행하였다(각 50 ㎕). 각 웰에 PBS로 세정한 1% 닭 적혈구액을 50 ㎕씩 가하여 4℃에서 1시간 정치한 후에 판정을 행하였다. HAU는 혈구응집을 일으키는 벡터의 최대 희석배수로 나타냈다. 또한, pfu(plaque forming unit)의 산출은 SeV 1HAU=약 106pfu의 관계를 사용하였다. 정제 벡터는 1 mg 단백/ml=4096~5120 HAU/ml=약 5×109pfu/ml였다.
[실시예 2] TPEG 수식 SeV 벡터의 조제
실시예 1의 SeV 벡터의 스톡을 PBS로 2 mg 단백/ml로 희석하였다. 이 용액 0.5 ml에 0.5 M 붕산완충액(pH 8.5)을 0.5 ml 가하여 1 mg 단백/ml의 pH 8.5 용액을 조제하였다. 트레실 활성화 PEG 시약(TPEG, 분자량 5000: Shearwater Polymers사) 1 mg을 상기 용액에 교반하면서 소량씩 가하여 실온에서 90분 반응을 행하였다(도 1). 반응종료 후 반응액을 빙랭 PBS 14 ml로 희석하여 15,000 rpm, 1시간의 원심(Beckman, 로터 SW28.1)에 의해 벡터를 회수하고, 0.8 ml의 PBS에 재현탁하여 TPEG 수식 SeV 벡터를 얻었다. 수식 벡터의 단백농도 및 HAU는 실시예 1과 동일하게 구하였다.
[실시예 3] TPEG 수식 SeV 벡터에 의한 인비트로 유전자 발현
실시예 1의 SeV 벡터의 스톡을 PBS로 희석하여 1×105pfu/ml로 하였다. 실시예 2의 TPEG 수식 SeV 벡터는 미수식 벡터와 단백농도를 갖춤으로써 바이러스 입자수를 동일하게 하였다. 실험 전날에 HeLa세포(인간 자궁경부암 유래)를 12웰 플레이트(스미토모 베이클라이트(Sumitomo Bakelite))에 1웰당 5×104세포수(10% 비동화(inactivated) 소 태아 혈청(이하 FCS) 첨가 MEM 배지 1 ml/웰)로 시드(seed)하였다. 배지를 0.5 ml로 줄이고, 상기 벡터 희석액을 50 ㎕/웰로 가하여(SeV 벡터 환산으로 5×103pfu/웰, moi=0.1) 37℃, 5% CO2에서 감염을 행하였다. 1시간 후에 벡터를 제거하고, 배지에서 2회 세정 후 새롭게 2 ml의 배지를 가하여 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양하였다. LacZ 유전자 발현의 측정은 Galacto-Light PlusTM(Tropix사)의 프로토콜에 따라 행하였다. 세포단백의 측정은 BCA법(Pierce사)에 따랐다. 결과는 세포단백당 light unit(RLU/㎍ 프로테인)으로 나타냈다.
표 1에 TPEG-SeV 벡터의 HAU와 유전자 발현량을 나타낸다. 동일 단백농도, 즉 동일 바이러스 입자수로, TPEG-SeV 벡터는 SeV 벡터에 비해 2,000분의 1 이하의HAU였다. 한편, 동일 입자수로 HeLa세포에 있어서의 유전자 발현은 약 50% 유지하고 있었다. 이와 같이 세포로의 유전자 도입능력을 극단으로 저해하지 않고 HAU만 현저하게 감소시킨 벡터를 조제하는 것이 가능해졌다.
[실시예 4] 용혈활성 시험
SD계 랫트(수컷)를 에테르 마취하, 경정맥(carotid artery)으로부터 헤파린처리 시린지(syringe)로 채취된 신선 혈액을 실험에 사용하였다. 실시예 1의 SeV 벡터 및 실시예 2의 TPEG 수식 SeV 벡터를 PBS로 희석하여 1 내지 1000 ㎍ 단백/ml의 용액을 조제하였다. 벡터 희석액 50 ㎕와 37℃로 보온한 랫트 혈액 50 ㎕를 혼화하여 15분간 항온처리를 행하였다. 4℃에서 빙랭 후 혈장을 원심분리하였다. 혈장 중에 방출된 헤모글로빈량을 570 nm에 있어서의 흡광도(OD570)에 의해 측정하였다. 또한, 벡터용액 대신에 PBS를 사용했을 때를 음성대조, 증류수를 양성대조(100% 용혈)로 하고, 이하의 계산식으로부터 벡터의 용혈활성을 산출하였다.
용혈활성(%)={(벡터용액의 OD570)-(PBS로의 OD570)}/{(증류수의 OD570)-(PBS로의 OD570)}×100
도 2에 나타내는 바와 같이 SeV 벡터는 벡터농도에 의존한 강한 용혈활성을 나타냈다. 한편, TPEG 수식 SeV 벡터의 용혈활성은 매우 낮은 것을 알았다. TPEG 수식 SeV 벡터 1000 ㎍의 용혈활성은 SeV 벡터 5 ㎍에 상당하기 때문에 안전성이 약 200배 향상되어 있다고 생각되었다.
[실시예 5] 랫트 혈액 중의 안정성 시험
실시예 1의 SeV 벡터를 PBS로 희석하여 1×108pfu/ml로 하였다. 실시예 2의 TPEG 수식 SeV 벡터는 바이러스 단백농도가 동일해지도록 PBS로 희석하였다. 벡터 희석액 250 ㎕에 SD계 랫트(수컷)의 신선혈액 250 ㎕를 혼화하여 37℃에서 항온처리를 행하였다. 소정의 시간 경과 후에 혈액을 80 ㎕ 샘플링하여 4℃에서 원심분리를 행하여 혈장을 회수하였다. 혈장 10 ㎕를 PBS로 50배로 희석한 용액 50 ㎕를 사용하고, 실시예 3에 기재된 방법에 준하여 HeLa세포에 있어서의 LacZ 유전자 발현을 조사하였다.
도 3에 나타내는 바와 같이 SeV 벡터는 혈액처리 직후부터 현저하게 불안정화되어, 15분의 처리로 혈액 미처리에 비해 1000분의 1까지 유전자 발현능력은 저하되었다. 한편, TPEG 수식 SeV 벡터에서는 혈액 중에서의 안정성이 개선되어 있어, 미수식 벡터에 비해 현저하게 높은 유전자 발현능력을 유지하고 있었다.
[실시예 6] SPA-PEG2K 수식 SeV 벡터의 조제
실시예 1의 SeV 벡터의 스톡용액을 PBS로 희석하여 2 mg 단백/ml로 조제하였다. 이 용액을 0.5 M 붕산완충액(pH8.5)으로 2배 희석하여 1 mg 단백/ml 용액을 조제하였다. 분자량 2000의 숙시니미딜 프로피온산 유도체 PEG 시약(SPA-PEG2K, Shearwater Polymers사) 1, 2 또는 4 mg을 상기 용액에 교반하면서 소량씩 가하여 실온에서 30분 반응을 행하였다(도 1). 반응종료 후 반응액을 빙랭 PBS 14 ml로 희석을 행하고, 13,000 rpm, 1시간의 원심(Beckman, 로터 SW28.1)에 의해 벡터를 회수해, 0.8 ml의 PBS에 재현탁하여 SPA-PEG2K 수식 SeV 벡터를 얻었다(표 2, 검체번호 1~3). 수식 벡터의 단백농도는 실시예 1과 동일하게 구하였다.
[실시예 7] SPA-PEG5K 수식 SeV 벡터의 조제
실시예 6의 SPA-PEG2K를 분자량 5000의 SPA-PEG5K(Shearwater Polymers사)로 변경하고, PEG 반응량을 1, 2.5, 5 또는 10 mg으로 동일하게 반응·정제를 행하여SPA-PEG5K 수식 SeV를 얻었다(표 2, 검체번호 4~7).
[실시예 8] SPA-PEG20K 수식 SeV 벡터의 조제
실시예 6의 SPA-PEG2K를 분자량 20,000의 SPA-PEG20K(Shearwater Polymers사)로 변경하고, PEG 반응량을 10, 20 또는 40 mg으로 동일하게 반응·정제를 행하여 SPA-PEG20K 수식 SeV를 얻었다(표 2, 검체번호 8~10).
도 4에 SPA-PEG20K 수식 벡터를 SDS-전기영동을 행하고, 은 염색에 의해 각 구성단백을 염색한 결과를 나타낸다. PEG 반응량의 증대에 수반하여 HN 단백에서 유래되는 밴드가 감소하고, 대신에 고분자량 분획에 밴드가 출현하였다. 이것은 PEG가 결합된 HN 단백이 고분자화된 것으로 추측되었다. 한편, F 단백의 밴드의 감소는 적었다. 이것으로부터, SeV 엔벨로프로의 PEG 수식에서는 HN과 F의 2종류의 단백 중 HN으로의 수식이 주가 되는 것을 알았다.
[실시예 9] SPA-PEG 수식 SeV 벡터의 HAU 활성과 인비트로 유전자 발현
실시예 1의 SeV 벡터 및 실시예 6, 7 및 8에 기재된 PEG 수식 SeV 벡터(검체번호 1~10)에 대해서 실시예 1에 기재된 방법으로 HAU 활성을 측정하였다. 추가로, HeLa 세포에 있어서의 LacZ 유전자 발현을 감염 moi를 0.5, 감염 후의 배양일수를 2일간으로 변경한 것 이외에는 실시예 3에 기재된 방법에 따라 측정하였다.
표 2에 HAU와 LacZ 발현의 결과를 나타낸다. PEG 반응량의 증가에 수반하여 얻어지는 수식체의 HAU는 저하되었다. LacZ 유전자 발현은 SeV 벡터에 비하면 저하되지만, PEG 반응량을 표에 나타낸 바와 같이 제한함으로써 발현능력의 저하를 억제한 채로 HAU를 대폭으로 저하시킬 수 있었다. 이와 같이 수식조건을 선택함으로써 충분한 발현능력을 갖는 수식벡터가 얻어지는 것을 알았다.
[실시예 10] 혈구 존재하에서의 SPA-PEG 수식 SeV 벡터에 의한 인비트로 유전자 발현
실시예 3과 동일하게 HeLa세포를 준비하였다. 실험 직전에 배양액을 제거하고, 대신에 1×109개/ml로 조제한 PBS 세정 닭 적혈구를 300 ㎕ 첨가하였다. 대조군은 적혈구액 대신에 PBS를 사용하였다. 실시예 1의 SeV 벡터 또는 표 2에 기재된 PEG 수식 SeV 벡터(검체번호 1, 2, 4, 5, 6, 8 및 9)를 50 ㎕ 가하여 37℃에서 5분의 극단시간에서의 감염을 행하였다. 벡터 첨가량은 표 2를 근거로 동일한 발현효율이 되도록 조정하였다. 실시예 3에 준하여 세포를 처리하고, 48시간 후에 있어서의 LacZ 유전자 발현을 측정하였다.
표 3에 적혈구 존재하에서의 각 검체의 유전자 발현량을 나타낸다. 결과는 적혈구 비존재하에서의 발현량을 100으로 한 상대비로 나타냈다. SeV 벡터에서는 적혈구의 존재에 의해 유전자 발현량은 약 20%까지 저하되었다. 한편, PEG 수식 검체는 HAU 활성의 저하에 수반하여 적혈구와의 상호작용이 저감하기 때문에, 그 결과 적혈구 존재하에서도 높은 유전자 도입을 나타냈다. 이들 결과는, PEG 수식 SeV 벡터는, 임상의 장에 있어서 혈액을 매개로 한 단시간으로의 유전자 도입 가능성을 시사하는 것이다.
[실시예 11] 중화 항체 존재하에서의 SPA-PEG5K 수식 SeV 벡터에 의한 유전자 도입
(1) SPA-PEG5K 수식 SeV 벡터의 조제
실시예 1에 준하여 NLS-LacZ/SeV 벡터를 조제·정제를 행하고, 스톡을 조제하였다. 이 벡터에 대해서 SPA-PEG5K(5 mg)를 실시예 7에 기재된 방법에 준하여 반응을 행하여 SPA-PEG5K 수식 SeV 벡터를 조제하였다. 벡터의 LLCMK2 세포에 대한 역가(titer)는 이하와 같이 구하였다. 실험 전날에 LLCMK2 세포를 6웰 플레이트(스미토모 베이클라이트)에 1웰당 1×106세포수(10% FCS 첨가 MEM 배지 2 ml/웰)로 시드하였다. 벡터를 1% FCS 함유 PBS로 1 mg 단백/ml로 희석하고 추가로 10배 희석계열을 조제하였다. 상기 세포의 배지를 제거하고 희석 벡터용액을 1웰당 1 mL를 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 1시간 감염을 행하였다. 벡터용액을 제거한 후 배지에서 세정, 새로운 배지를 웰당 2 ml 가하고 추가로 37℃, 5% CO2에서 배양을 계속하였다. 2일 후에 배지를 제거하고 PBS로 세정한 후 LacZ 유전자를 발현하고 있는 세포를 β-Gal staining kit(Invitrogen)에 의해 X-gal 염색을 행하였다. x200배의 시야에 있어서의 감염세포수를 웰내의 임의의 10개소에서 계수하여 그 평균값과 시야면적으로부터 웰 전체에서의 역가를 다음 식에 의해 구하였다.
LacZ 감염 역가(CIU/mL) = (감염세포수)×854.865×(희석 배수)
그 결과, SeV 벡터 및 SPA-PEG5K 수식 SeV의 역가는 각각 1.4×1010CIU/ml 및 2.7×109CIU/ml였다.
(2) 중화 항체 존재하에서의 유전자 도입
실시예 11-(1)에 기재된 SeV 벡터 및 SPA-PEG5K 수식 SeV 벡터를 PBS로 희석하여 1×107CIU/ml로 조제하였다. 벡터용액 30 ㎕에 SeV를 토끼에 면역하여 조제한 항SeV 항혈청(56℃, 1시간 처리)의 10, 100 및 1000배 희석 혈청 또는 PBS 30 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 처리하였다. 실험 전날에 LLCMK2 세포를 12웰 플레이트(스미토모 베이클라이트)에 1웰당 2×105세포수(10% FCS 첨가 MEM 배지 1 ml/웰)로 시드하였다. 배지를 0.5 ml로 줄이고 상기 항혈청 처리 벡터용액 40 ㎕를 웰에 가하여 37℃, 5% CO2에서 1시간 감염을 행하였다. 이하, 실시예 11-(1)과 동일하게 2일 후의 LacZ 유전자 발현을 X-gal 염색으로 평가하였다.
도 5에 나타내는 바와 같이, SeV 벡터는 항혈청의 존재에 의해 유전자 도입효율이 현저하게 저하하였다. 한편, SPA-PEG5K 수식 SeV 벡터는 항혈청 존재하에서도 충분한 유전자 도입능력을 유지할 수 있었다.
[실시예 12] 항HN 단일클론 항체, HN-1의 조제 및 정제
항HN 단일클론 항체, HN-1을 생산하는 하이브리도마 세포(Miura et al., Exp. Cell Res., 1982, 141, 409-420)를 하이브리도마-SFM 배지(Gibco-BRL)에서 37℃ 5% CO2에서 계대배양을 계속하여, 2×105세포수/ml의 세포 부유액 1000 ml를 조제하였다. 추가로 2시간 배양을 계속한 후 3,000 rpm, 10분의 원심분리에 의해 얻은 상청을 0.45 ㎛의 필터로 여과를 행하였다. 단일클론 항체의 정제는 프로테인 G 컬럼 크로마토그래피에 의해 행하였다. 배양상청을 20 mM 인산나트륨 완충액(pH7.0)으로 평형화한 5 ml의 프로테인 G 컬럼(파르마시아(pharmacia))에 연동식 펌프(peristaltic pump)(P-1 펌프; 파르마시아)를 사용하여 유속 4.2 ml/분으로 첨가하고, 항체를 컬럼에 결합시켰다. 20 mM 인산나트륨 완충액(pH7.0)으로 세정한 후, 0.1 M 글리신-염산 완충액(pH2.7)으로 항체를 용출하였다. 용출액을 1 M 트리스-염산 완충액(pH9.0)으로 중화한 후 한외여과(ultrafiltration)(센트리플러스-20(Centriplus-20), 분자량 커트 30,000: Amicon)로 농축하였다. PBS로 평형화한 PD-10 탈염 컬럼(파르마시아)으로 PBS로 버퍼 교환한 후 다시 한외여과로 농축하여 HN-1의 PBS용액 160 ㎕를 얻었다. 단백농도를 소·감마 글로불린을 표품으로 하고BCA 프로테인 어세이(Pierce사)에 의해 구한 결과 37.6 mg/ml였다.
[실시예 13] 항HN 단일클론 항체, HN-1의 F(ab')2 단편화
실시예 12의 정제 단일클론 항체 HN-1을 0.2 M 초산완충액(pH4.5)으로 희석하여 2 mg 단백/ml로 조제하였다. 단백용액 2.35 ml에 0.1 mg/ml로 조제한 펩신(Sigma사)의 0.2 M 초산완충액(pH4.5)을 2.35 ml 첨가하여 37℃에서 21시간 반응을 행하였다. 1 N 수산화나트륨 700 ㎕로 중화한 후 PBS를 가하여 전량 25 ml로 하였다. 이 용액을 PBS로 평형화한 1 ml의 프로테인 A 컬럼(파르마시아)에 부하하여 미반응의 항체를 흡착시켰다. 컬럼을 통과한 분획을 회수하고, 실시예 12에 준하여 한외여과에 의해 농축하였다. 농축액을 추가로 PBS로 평형화한 세파덱스(Sephadex) 75 컬럼(파르마시아)을 사용한 겔 여과법에 의해 정제하였다. 한외여과에 의해 농축하고, HN-1의 F(ab')2 단편(이하 HN-1/F(ab')2)의 PBS 용액을 300 ㎕ 회수하였다. 실시예 12와 동일하게 단백농도 측정을 행한 결과 4.08 mg/ml의 HN-1/F(ab')2를 얻었다.
[실시예 14] NHS법에 의한 엽산결합 단일클론 항체의 조제
(1) NHS 활성화 엽산의 합성
합성은 로버트(Robert) 등의 방법(Journal of Biological Chemistry: Feb. 4, 269 (5), 3198-3204, 1994)에 준하여 행하였다. 즉, 엽산(Sigma사)을 디메틸설폭시드(DMSO)에 용해하여 50 mg/ml의 용액을 조제하였다. 250 ㎕의 트리에틸아민(Pierce사), 470 mg의 디시클로헥실카르보디이미드(도쿄가세이(Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.)) 및 260 mg의 N-히드록시숙신이미드(NHS, Sigma사)를 순서대로 가하여실온, 암소(暗所)에서 하룻밤 교반하였다. 석출된 부반응물을 여과에 의해 제거하여 여과액을 250 ml의 디에틸에테르에 교반하면서 적하하였다. 석출된 황색침전을 에테르 세정을 반복하고 감압 건조하여 NHS 활성화 엽산을 얻었다.
(2) 엽산결합 HN-1의 조제
실시예 12의 방법에 준하여 정제한 HN-1의 2.0 mg 단백/ml PBS용액 100 ㎕와 0.5 M 붕산완충액(pH8.5) 100 ㎕를 혼화한 것을 반응용액으로 하였다. 실시예 14-(1)에 기재된 NHS 활성화 엽산의 DMSO용액(5 mg 또는 10 mg/ml) 2.5 ㎕를 적하하여 실온, 암소 1시간 반응을 행하였다. 실온, 암소에서 1시간 반응을 행한 후에 PBS로 평형화한 PD-10 컬럼으로 미반응의 엽산을 제거하여 단백 분획을 회수하였다. 한외여과법으로 농축하여 엽산결합 HN-1을 얻었다. 단백농도는 실시예 12에 준하여 측정하였다.
(3) 엽산결합 HN-1/F(ab')2의 조제
실시예 14-(2)의 HN-1을 HN-1/F(ab')2 용액으로, NHS 활성화 엽산의 농도를 10 mg/ml로 변경하고, 동일하게 반응, 정제를 행하여 엽산결합 HN-1/F(ab')2를 얻었다.
[실시예 15] 엽산결합 단일클론 항체 수식 SeV 벡터의 HA활성
실시예 1에 기재된 NLS-LacZ/SeV를 PBS로 1×108pfu/ml로 희석하고, 96웰 둥근바닥 플레이트에 50 ㎕씩 분주(分注)하였다. 실시예 12의 방법에 준하여 정제한 HN-1, 실시예 13의 HN-1/F(ab')2 및 실시예 14에 기재한 엽산결합 HN-1 및 엽산결합 HN-1/F(ab')2를 PBS로 희석하여 1~100 ㎍ 단백/ml로 조제하였다. 항체 희석액 50 ㎕를 벡터와 혼화하고 실온에서 30분 정치하여 수식 벡터를 조제하였다(도 6). 그 후, 실시예 1의 방법에 따라 HAU를 측정하였다.
도 7에 HAU의 측정결과를 나타낸다. 어떤 수식체도 항체 첨가량의 증가에 수반하여 HAU가 저하되고, 10 ㎍/ml 이상의 항체농도에서는 검출한계 이하가 되었다. 또한, 엽산의 결합에 의한 HAU의 저해활성의 극단적인 저하는 확인되지 않았다. 이들 사실로부터 적혈구와의 상호작용을 현저하게 감소시킨, 엽산결합 항체수식 SeV 벡터의 조제가 가능해졌다.
[실시예 16] 엽산결합 단일클론 항체 수식 SeV 벡터의 용혈활성
실시예 1에 기재된 NLS-LacZ/SeV를 PBS로 1×109pfu/ml로 희석하고, 96웰 둥근바닥 플레이트에 50 ㎕씩 분주하였다. 실시예 12의 방법에 준하여 정제한 HN-1 및 실시예 14에 기재한 엽산결합 HN-1을 PBS로 100 ㎍ 단백/ml로 희석하였다. 항체 희석액 또는 PBS 50 ㎕를 벡터와 혼화하고 실온에서 30분 정치하여 수식 벡터를 조제하였다. 용혈활성은 실시예 4에 기재된 방법의 랫트 혈액을 1×109세포수/mL의 닭 적혈구 PBS 용액으로, 항온처리 시간을 30분으로 변경한 것 이외에는 동일하게 행하여 용혈활성을 조사하였다.
도 8에 용혈활성의 측정결과를 나타낸다. HN-1 및 엽산결합 HN-1로 수식한 SeV 벡터의 용혈활성은 매우 작았다. SeV 벡터의 용혈활성과 비교하면 1/100 농도의 SeV 벡터보다도 낮은 용혈활성이었다.
[실시예 17] 엽산결합 단일클론 항체 수식 SeV 벡터의 인비트로 유전자 도입시험
실시예 15의 SeV 벡터를 1×107pfu/ml로, 항체농도를 10 ㎍/ml로 변경하여 수식 벡터를 조제하였다. 실험 전날에 KB세포(인간 비인강암(human rhinopharyngeal carcinoma) 유래)를 12웰 플레이트에 1웰당 2×105세포수(10% FCS 첨가, 엽산 불함유 RPMI1640 배지: Gibco-BRL, 1 ml/웰)로 시드(seed)하였다. 실험 1시간 전에 배지를 0.5 ml의 엽산 불함유 RPMI1640 배지 또는 동일 배지에 1 mM의 엽산을 첨가한 배지로 교환하여 사용하였다. 상기 벡터액을 20 ㎕/웰로 가하여 37℃, 5% CO2에서 감염을 행하였다. 3시간 후에 벡터를 제거하고, 배지로 2회 세정한 후 새로 웰당 2 ml의 배지를 가하여 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양하였다. LacZ 유전자 발현의 측정은 실시예 3에 준하여 행하였다.
도 9에 KB세포에 있어서의 LacZ 유전자 발현의 결과를 나타낸다. HN-1 수식 SeV 벡터의 유전자 발현은 미수식의 SeV 벡터의 100분의 1 이하가 되어 HAU의 소실에 수반하는 유전자 도입의 저하를 확인하였다. 한편, 엽산결합 HN-1에 대해서는 엽산 비결합에 비해 유의한 유전자 발현의 증가를 확인하여 미수식 SeV 벡터의 약 15%의 유전자 도입을 나타냈다. 과잉 엽산이 배지 중에 존재했을 때에 엽산결합 HN-1에 있어서 유전자 도입에 저해가 확인되었기 때문에 엽산결합 HN-1에 의한 유전자 도입은 리간드로서 결합된 엽산이 KB세포의 엽산 수용체에 결합하고, 그 후 F단백에 의한 융합에 의해 일어났다고 추측되었다.
도 10에 항체분자가 HN-1/F(ab')2일 때의 비교를 행하였다. HN-1과 동일하게 HN-1/F(ab')2에 있어서도 엽산결합일 때에만 높은 유전자 도입을 나타냈다.
[실시예 18] EDC법에 의한 엽산결합 HN-1의 조제와 수식체의 평가
(1) EDC법에 의한 엽산결합 HN-1의 조제
리몬(Leamon) 등이 보고한 방법에 따라서 조제하였다(Journal of Biological Chemistry, 1992,267,(35),24966-24971). 즉, 디메틸설폭시드(DMSO)에 용해한, 10 mg/ml의 엽산(Sigma사) 용액 1 ml에 21.7 mg/ml의 1-에틸-3-(-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC: Sigma사)의 DMSO 용액 1 ml를 가하여 실온, 암소에서 30분 정치하였다. PBS로 1 mg 단백/ml로 조제한 실시예 12의 HN-1 용액 300 ㎕에 상기의 엽산-EDC 용액 16.6 ㎕를 교반하면서 적하하였다. 실온, 암소에서의 1시간 반응을 행한 후에 실시예 14-(2)와 동일하게 하여 엽산결합 HN-1을 얻었다.
(2) 엽산결합 HN-1 수식 SeV 벡터의 HA 활성
실시예 15의 엽산결합 HN-1을 실시예 18-(1)에 기재한 것으로 변경하고 수식 벡터를 조제하여 HAU를 측정하였다.
도 11에 나타내는 바와 같이 EDC법으로 조제한 엽산결합 HN-1에 대해서도 동일하게 SeV 벡터를 수식함으로써 그의 HAU를 소실시키는 효과가 있었다.
(3) 엽산결합 HN-1 수식 SeV 벡터에 의한 유전자 발현
실시예 1의 SeV 벡터의 1×107pfu/ml 용액과 실시예 12의 HN-1 및 실시예18-(1)에 기재한 엽산결합 HN-1의 100 ㎍/ml 용액을 사용하여 수식 벡터를 조제하였다. 실시예 16의 KB세포 뿐만 아니라 A549 세포(인간 폐 암종(carcinoma))를 사용하여 동일하게 감염실험을 행하였다.
표 4에 엽산 수용체를 고발현하고 있는 KB세포와, 수용체가 거의 없는 A549세포(Wang et al., Bioconjugate Chemistry. 1997, 8, 673-679)의 유전자 발현의 비교를 행하였다. 엽산결합 HN-1 수식 SeV 벡터는 KB세포의 과잉 엽산 비존재하에서만 높은 유전자 도입을 나타냈기 때문에 HN 단백의 헤마글루티닌 활성으로 치환한 엽산 리간드가 엽산 수용체로의 결합을 담당함으로써 특이적으로 유전자 도입을 하는 것을 알았다.
[실시예 19] GFP 탑재 SeV 벡터의 조제와 정제
GFP 유전자를 탑재한 SeV/GFP는 이미 보고된 방법에 의해 제작하였다(Kato et al., Genes Cells, 1996, 1, 569-579; Hasan et al., J. Gen. Virol., 1997,78, 2813-2820). 이 벡터를 닭 유정란(10일란)에 접종하여 35.3℃에서 3일간 배양한 후 요막액을 회수하였다. 4℃, 3000 rpm, 30분의 원심 후 상청을 4℃, 35000 g, 1시간 원심하여 벡터를 침전시켰다. PBS에 재현탁한 후 다시 4℃, 3000 rpm, 30분의 원심을 하고 상청을 4℃, 35000 g, 1시간 원심하여 벡터를 침전시켰다. PBS에 재현탁하여 정제벡터의 스톡(이하 SeV 벡터라고 표기)을 조제하였다. 벡터의 단백농도는 등용의 3% 트리톤(Triton) X-100 용액으로 가용화한 것을 검체로서 사용하고, BSA를 표품으로 하여 BCA 프로테인 어세이(Pierce사)로 측정하였다. 정제 벡터는 약 1 mg 단백/ml였다.
[실시예 20] SPA-PEG2K 수식 SeV 벡터의 조제
실시예 19의 SeV 벡터의 스톡 0.5 ml에 0.5 ml 붕산완충액(pH8.5)을 가하여 0.5 mg 단백/ml의 pH8.5 용액을 조제하였다. 분자량 2000의 숙시니미딜 프로피온산 유도체 PEG 시약(SPA-PEG2K, Shearwater Polymers사)을 0, 2, 4, 6, 8, 10 mg을 상기 용액에 교반하면서 소량씩 가하여 실온에서 1시간 반응을 행하였다. 반응종료 후 반응액을 4℃, 15000 rpm, 1시간 원심 후 침전을 빙랭 PBS에 현탁하여 다시 4℃, 15000 rpm, 1시간 원심에 의해 벡터를 회수하고, 0.5 ml의 PBS에 재현탁하여 SPA-PEG2K 수식 SeV 벡터를 얻었다. 수식 벡터의 단백농도는 실시예 19와 동일하게 구하였다.
[실시예 21] SPA-PEG5K 수식 SeV 벡터의 조제
실시예 20의 SPA-PEG2K를 분자량 5000의 SPA-PEG5K(Shearwater Polymers사)로 변경하고 PEG 반응량을 0, 5, 10, 15, 20, 25 mg으로 동일하게 반응·정제를 행하여 SPA-PEG5K 수식 SeV를 얻었다. 수식 벡터의 단백농도는 실시예 19와 동일하게 구하였다.
[실시예 22] PEG2NHS-10K 수식 SeV 벡터의 조제
실시예 20의 SPA-PEG2K를 분자량 10000의 PEG2NHS-10K(이중 가닥, Shearwater Polymers사)로 변경하고 PEG 반응량을 0, 10, 20, 30, 40, 50 mg으로 동일하게 반응·정제를 행하여 PEG2NHS-10K 수식 SeV를 얻었다. 수식 벡터의 단백농도는 실시예 19와 동일하게 구하였다.
[실시예 23] PEG 수식 SeV 벡터의 적혈구 응집활성(HAU)과 인비트로 감염성(CIU)
실시예 20, 21, 22에 기재한 PEG 수식 SeV 벡터에 대해서 적혈구 응집활성(HAU) 및 인비트로 감염성(CIU)을 조사하였다. 도 12, 13 및 14에 나타낸 바와 같이 상기 3종류 PEG 수식 SeV 벡터의 HAU 및 CIU를 측정했더니 어느 것이나 PEG 반응량의 증가에 의해 HAU와 CIU가 저하하는 경향이 보였다. 분자량이 클수록 반응량의 증가에 의한 HAU와 CIU의 저감폭이 작다. 또한, HAU와 CIU의 상관을 고찰했더니 적당량의 SPA-PEG5K로 수식한 경우 미수식과 비교하여 1 HAU당 CIU가 약 7-8배 높았다. 이것은 PEG 수식에 의해 감염성을 유지하면서 적혈구 응집을 저감시켜 혈중 안정성을 향상할 수 있을 가능성을 나타낸다고 생각된다.
HAU는 이하와 같이 구하였다. 벡터를 96웰 둥근 바닥 플레이트(아사히 테크노글라스사) 내에서 PBS로 순차 2배 희석을 행하였다(50 ㎕). 각 웰에 PBS로 세정한 1% 닭 적혈구액을 50 ㎕씩 가하여 4℃에서 1시간 정치 후에 판정을 행하였다.HAU는 적혈구 응집을 일으키는 벡터의 최대 희석 배수로 나타냈다.
CIU는 이하와 같이 구하였다. 벡터를 PBS/1% BSA로 순차 10배 희석을 행하고, 24웰에서 콘플루언트(confluent)가 된 LLC-MK2 세포로 10 ㎕/웰 감염시켜 2일 후 웰당 GFP 발현세포수를 세어 산출하였다.
[실시예 24] PEG 수식의 확인
실시예 20, 21, 22에 기재한 PEG 수식 SeV 벡터를 0.5 ㎍/레인을 사용하여 SDS-PAGE를 행하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이 겔을 은 염색하여 바이러스 벡터의 조성단백을 분석했더니, 엔벨로프 단백인 F와 HN에 유래하는 밴드가 PEG 반응량의 증대에 수반하여 감소하고, 그 대신에 고분자량 분획에 밴드가 출현하였다. HN 단백과 비교하여 F 단백량의 감소가 적었기 때문에 비교적으로 HN 단백이 F 단백보다 많이 수식된 것이 생각된다. 또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯팅으로 토끼 유래의 항F1 다중클론 항체와 마우스 유래 항HN 단일클론 항체를 사용하여 PEG 수식 SeV 벡터의 엔벨로프 단백인 F와 HN 단백을 분석했더니 은 염색과 동일한 결과가 얻어졌다.
[실시예 25] 중화 항체 존재하에서의 PEG2-NHS10K 수식 SeV 벡터에 의한 인비트로에서의 유전자 도입
실시예 22에 준하여 PEG 반응량을 0, 15, 20, 25 mg으로 동일하게 반응·정제를 행하여 PEG2-NHS10K 수식 SeV를 얻었다. 수식 벡터의 단백농도는 실시예 19와 동일하게 구하였다. 벡터용액을 PBS/1% BSA로 희석하여 0.01 ㎍/㎕로 조제하였다. 벡터용액 35 ㎕에 SeV를 토끼로 면역하여 조제한 항SeV 항혈청(56℃, 1시간 처리)의 10, 100 및 1000배 희석혈청 또는 PBS/1%BSA 35 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 처리하였다. 24웰에 콘플루언트가 된 LLC-MK2 세포로 상기 항혈청 처리 벡터 용액을 웰당 20 ㎕를 가하여 감염을 행하였다. 감염 후 3일째의 GFP 발현은 형광현미경으로 사진을 촬영하고, 또 형광 플레이트 리더(reader)를 사용하여 여기파장 485 nm, 형광파장 530 nm로 측정한 GFP 형광강도로 정량적으로 평가하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 미수식의 SeV 벡터는 항체농도의 증가에 따라 감염효율이 저하하는 경향이 보였지만, PEG2-NHS10K의 수식에 의해 그 저하가 억제되어 어떤 항체농도이더라도 미수식과 비교하여 감염효율이 높아 최대 약 70%의 감염효율의 개선이 보였다.
[실시예 26] PEG2-NHS10K 수식 SeV 벡터에 의한 인비보에서의 유전자 도입
실시예 25에 PEG 반응량을 0 mg으로 조제한 미수식 SeV 대조와 20 mg으로 조제한 PEG 수식 SeV를 사용하여 마우스로의 반복 투여를 행하였다. 도 18 및 19에 나타낸 바와 같이 실험군은 5그룹으로 나누고, 1회째에서 루시퍼라아제(Luciferase) 탑재 SeV를 점비투여(点鼻投與)하여 항SeV 항체를 만들고, 2주일 후에 그룹 B에서는 GFP 탑재의 미수식 SeV 대조, 그룹 C에서는 PEG 수식 SeV를 사용하여 2회째 투여를 행하였다. 그룹 A는 미처치 대조, D와 E는 1회만 투여한 대조로 하였다. 1회째 투여 전, 투여 후 1주일, 2주일의 시점에서 마우스로부터 채혈하고, 시판의 ELISA 키트(프레자임(Prezyme) 「세이켄(Seiken)」 덴카 세이켄 가부시키가이샤(Denka Seiken Co., Ltd.)를 사용하여 항SeV 항체값을 측정하였다. 1회째 투여를 한 그룹 B, C의 마우스에서는 항SeV 항체값의 상승이 보였다. 이 항체값이 충분히 오른 2주일째에 2회째의 투여를 행하고, 2일 후 마우스를 해부하여 폐에서의 GFP 발현을 형광현미경으로 관찰하여 사진을 촬영하였다.
도 19의 형광사진으로 나타낸 바와 같이, 1회째의 투여에서는 넓은 범위에 걸쳐 SeV의 감염이 보이고, 미수식과 PEG 수식한 벡터 사이에 커다란 차이는 보이지 않았다. 2회째의 투여에서는 미수식인 경우 GFP 발현이 전체 상(full image)으로부터 거의 보이지 않고, 확대하더라도 폐 표면의 일부에 드문드문 밖에 관찰할 수 없었다. 한편, PEG 수식된 경우 1회째와 비교하면 적었지만, GFP 발현세포는 미수식과 비교하여 많고 보다 넓은 범위로 관찰되었다. 특히 확대한 사진에 보이는 바와 같은 GFP 발현세포의 콜로니가 관찰되었다.
[실시예 27] PEG 수식에 의한 SeV의 4℃ 보존조건에서의 감염성 유지효과
실시예 20의 SPA-PEG2K를 분자량 20000의 PEG2NHS-20K(이중가닥, Shearwater Polymers사)로 변경하고 PEG 반응량을 10, 20, 40 mg으로, 분자량 40000의 PEG2NHS-40K(이중가닥, Shearwater Polymers사)로 변경하고 PEG 반응량을 20, 40, 80 mg으로 동일하게 반응·정제를 행하여 PEG2NHS-20K 수식 SeV와 PEG2NHS-40K 수식 SeV를 얻었다. 수식 벡터의 단백농도는 실시예 19와 동일하게 구하였다.
실시예 5에서 사용한 방법으로 4℃에서 8일과 20일 보존한 상기 PEG 수식 SeV와 미처치 SeV의 CIU를 측정하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이 미처치 SeV 대조는 4℃에서 2주동안 보존한 후 역가가 3분의 1로 저하했지만, 적당량의 고분자량의 이중 가닥 PEG로 수식한 것은 최대 80%에 가까운 감염효율을 유지하였다.
[실시예 28] PEI 수식에 의한 PEG 수식 SeV의 감염효율의 개선
실시예 21에 PEG 반응량을 0, 5, 10, 15 mg으로 조제한 것을 분자량 750000의 폴리에틸렌이민(PEI, SIGMA사)을 사용하고 PEI:SeV 중량비 0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2로 수식하여 LLC-MK2 세포로의 감염효율을 측정하였다(측정방법은 실시예 23을 참조). 도 21에 나타낸 바와 같이 일정량의 PEI 첨가에서는 PEG 수식된 SeV의 감염효율이 약 10배 증가하는 효과가 있었다. PEG 수식량이 많을수록 PEI의 감염효율의 개선효과가 있었다. 분자량 25000의 PEI(SIGMA사)에서도 동등한 결과가 얻어졌다.
약물치료 또는 유전자 치료에 있어서 약물(특히 고분자 화합물)이나 핵산 등의 생리활성 물질을, 목적으로 하는 세포 또는 세포내 조직에 도달시키는 시스템, 즉 약물 송달 시스템(Drug Delivery System; 이하 간단히 DDS라고 말한다)은 중요한 기술분야이다. DDS는 바이러스 벡터를 사용하여, 또는 인공적인 또는 반인공적인 수송담체(캐리어)에 원하는 생리활성 물질을 봉입 또는 담지시킨 조성물을 투여함으로써 실시할 수 있지만, 본 발명에 의해 이 양쪽에 있어서 헤마글루티닌 활성을 저하시켜 혈중에서의 안정성 및 유전자 도입효율을 향상시키는 것이 가능해졌다. 예를 들면 바이러스 벡터를 사용한 DDS에서는 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터 또는 상기 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 유전자로 슈도화한 바이러스 벡터 등에 본 발명을 적용하면 헤마글루티닌 활성을 특이적으로 저하시킨 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 또한 인공적으로 리포솜 등을 조제하는 경우에 있어서도 본 발명을 적용함으로써 헤마글루티닌 활성을 저하시킬 수 있다. 본 발명을 사용하여 제조되는 DDS를 위한 조성물은 생체내로의 적용이 매우 우수한 효과를 발휘한다.

Claims (21)

  1. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질을 갖는 세포막을 포함하는 약제 또는 유전자 운반 조성물로서, (a) 상기 단백질에 화합물이 부가되어 있고, (b) 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우에 비해 헤마글루티닌 활성이 저하되어 있으며, (c) 상기 약제 또는 유전자를 표적으로 하는 세포로 도입하는 능력을 갖는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 추가로 (d) 상기 화합물이 부가되어 있지 않은 경우에 비해 적혈구에 대한 용혈활성이 저하되어 있는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 포함하는 조성물인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 불활성화 바이러스 또는 상기 바이러스의 엔벨로프 부분을 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 파라믹소바이러스과 바이러스가 센다이 바이러스인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 분자량 1,800 이상인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 분자량 4,500 이상인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 분자량 16,000 이상인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 폴리에틸렌글리콜인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 추가로 폴리에틸렌이민과 함께 복합체를 형성하고 있는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 세포에 결합하는 화합물과 함께 복합체를 형성하고 있는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포에 결합하는 화합물이, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물과 결합되어 있는 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 단백질에 부가되어 있는 화합물이 상기 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편인 조성물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에 결합하는 화합물이 세포표면 수용체의 리간드인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 리간드가 엽산인 조성물.
  17. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편으로서, 세포에 결합하는 화합물이 결합되어 있는 항체 또는 그의 단편.
  18. 제17항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 F(ab')2인 항체 또는 그의 단편.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 세포에 결합하는 화합물이 세포표면 수용체의 리간드인 항체 또는 그의 단편.
  20. 제19항에 있어서, 상기 리간드가 엽산인 항체 또는 그의 단편.
  21. (a) 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 헤마글루티닌 활성을 갖는 엔벨로프 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편으로서 세포에 결합하는 화합물이 결합되어 있는 항체 또는 그의 단편, 및 (b) 상기 엔벨로프 단백질을 포함하는, 약제 또는 유전자 운반 조성물을 포함하는 약제 또는 유전자 운반 키트.
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