KR100525687B1 - 재조합체 센다이바이러스 - Google Patents

재조합체 센다이바이러스 Download PDF

Info

Publication number
KR100525687B1
KR100525687B1 KR10-1998-0703241A KR19980703241A KR100525687B1 KR 100525687 B1 KR100525687 B1 KR 100525687B1 KR 19980703241 A KR19980703241 A KR 19980703241A KR 100525687 B1 KR100525687 B1 KR 100525687B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sendai virus
dna
rna
virus
protein
Prior art date
Application number
KR10-1998-0703241A
Other languages
English (en)
Other versions
KR19990067271A (ko
Inventor
요시유끼 나가이
아쯔시 가또
후까시 무라이
쯔네아끼 사까따
마모루 하세가와
다쯔오 시오다
Original Assignee
가부시끼가이샤 디나벡 겡뀨쇼
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시끼가이샤 디나벡 겡뀨쇼 filed Critical 가부시끼가이샤 디나벡 겡뀨쇼
Publication of KR19990067271A publication Critical patent/KR19990067271A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100525687B1 publication Critical patent/KR100525687B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18851—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/18852—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명자들은 초기 복제 유전자가 모두 발현되어 있는 숙주에 센다이 바이러스 게놈을 도입하여 센다이 바이러스 입자를 재구성하는 방법을 개발하였다. 이에 따라 센다이 바이러스의 유전자 조작이 가능해져 센다이 바이러스를 벡터로서 유용하게 이용할 수 있게 되었다.

Description

재조합체 센다이 바이러스 {Recombinant Sendai Virus}
본 발명은 재조합체 센다이 바이러스 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
센다이 바이러스(Sendai virus)는 HVJ(Hemagglutinating virus of Japan)이라고도 하며 파라믹소 바이러스과(Paramyxoviridae), 파라믹소 바이러스속 (Paramyxovirus)에 속하는 파라인플루엔자 바이러스 1형으로 분류된다.
센다이 바이러스 입자는 다형성으로서 직경 150 내지 200 nm의 외피(envelope)를 가지며, 내부에 번역의 주형이 되지 않는 게놈 RNA(이하, "(-)쇄 RNA"라 한다)를 갖는다. 센다이 바이러스는 역사적으로 보아도 산업상 유용한 바이러스로서 알려져 있으며, 특히 세포의 헤테로칼리온 또는 잡종 세포의 제작, 즉 세포 융합에 널리 이용되고 있다. 또한, 막융합성 리포좀의 재료로서, 유전자 치료용의 벡터로서도 개발이 진행되고 있다. 나아가, 각종 인터페론의 유도제로서도 센다이 바이러스는 이용되고 있다.
게놈 핵산의 형태에 의한 분류에서 센다이 바이러스는 RNA 바이러스의 (-)쇄 RNA 바이러스의 (-) 일축쇄 RNA 바이러스 그룹에 속한다. RNA 바이러스는 dsRNA 바이러스(double stranded RNA virus), (+)쇄 RNA 바이러스 및 (-)쇄 RNA 바이러스의 3가지로 분류된다. dsRNA 바이러스 그룹에는 레오 바이러스, 로타 바이러스, 식물 레오바이러스 등이 있고, 분절형의 복수의 선상 dsRNA 게놈을 가지고 있다. (+)쇄 RNA 바이러스에는 폴리오 바이러스, 신드비스 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 일본 뇌염 바이러스 등이 있고, 1개의 (+)쇄 RNA를 게놈으로서 가지고 있어 이 RNA 게놈은 동시에 mRNA로서도 기능하며, 복제 또는 입자 형성에 필요한 단백질을 숙주 세포의 번역 기능에 의존하여 생산할 수가 있다. 바꾸어 말하면, (+)쇄 RNA 바이러스가 갖는 게놈 RNA 자체가 전파력을 갖는다. 또한, 본 명세서에서 "전파력"이란 "감염 또는 인공적인 수법으로 핵산이 세포 내에 도입된 후 세포 내에 존재하는 상기 핵산이 복제 후 감염성 입자 또는 이에 준하는 복합체를 형성하여 다른 세포로 계속해서 전파할 수 있는 능력"을 말한다. (+)쇄 RNA 바이러스로 분류되는 신드비스 바이러스 또는 (-)쇄 RNA 바이러스로 분류되는 센다이 바이러스는 감염 능력과 전파력을 갖지만, 파르보 바이러스과로 분류되는 아데노 수반 바이러스(Adeno-associated Virus)는 감염 능력을 갖지만 전파력을 갖지 않는다(바이러스 입자가 형성되기 위해서는 아데노 바이러스의 동시 감염이 필요하다). 또한, 시험관 내에서 인공적으로 전사된 신드비스 바이러스 유래의 (+)쇄 RNA는 전파력을 갖지만(세포 내로 도입되는 바이러스 입자를 형성한다), 시험관 내에서 인공적으로 전사된 센다이 바이러스 RNA는 (+)쇄, (-)쇄 모두 전파력을 갖지 않는다(세포 내에 도입되어도 바이러스 입자는 형성되지 않는다).
근래에는 유전자 치료용 벡터로서 바이러스 유래의 것이 사용되고 있다. 바이러스를 벡터로서 이용하기 위해서는 바이러스 입자의 재구성을 위한 수법이 확립될 필요가 있다("바이러스 입자의 재구성" 이란, 바이러스 게놈의 핵산을 인공적으로 제작하여 시험관 내 또는 세포 내에서 원래의 바이러스 또는 재조합체 바이러스를 제작하는 것이다.). 외래 유전자를 바이러스 벡터에 도입하기 위해서는 유전자 조작에 의해 외래 유전자를 도입한 바이러스 게놈에서 바이러스 입자가 재구성되어서는 안되기 때문이다. 바이러스의 재구성 기술이 확립되면 바이러스에 목적하는 외래 유전자를 도입하거나 바이러스의 목적하는 유전자가 결실되거나 불활성화된 바이러스를 제작하는 것이 가능해진다,
또한, 바이러스의 재구성계가 구성되어 바이러스의 유전자 조작이 가능해지면 바이러스의 기능을 유전학적으로 해석하는 커다란 툴이 된다는 것은 명백하다. 바이러스 기능의 유전학적 해석은 질병의 예방, 치료 등의 의학적 견지에서 매우 중요하다. 예를 들면, 바이러스 핵산의 복제 메카니즘이 규명되면 그 숙주 세포 내의 핵산의 복제 기구와의 차이를 이용하여 숙주 세포에 충격이 적은 핵산의 복제를 작용점으로 한 항바이러스제를 개발하는 것이 가능하다. 또한, 바이러스 유전자가 코딩하는 단백질이 어떠한 기능을 갖는지를 규명함으로써 바이러스 입자 감염 능력 또는 바이러스 입자 형성 능력에 관한 단백질을 타겟으로 한 항 바이러스제를 개발할 수도 있을 것이다. 또한, 막 융합 능력에 관한 유전자를 개량함으로써 보다 우수한 막 융합성 리포좀을 제작하여 유전자 치료용의 벡터로서 사용하는 것이 가능해지는 것을 기대할 수 있다. 또한, 인터페론으로 대표되는 바와 같이 바이러스에 감염됨으로써 숙주 유전자의 바이러스 저항성에 관한 유전자가 활성화되어 바이러스 저항성을 나타내는 경우도 있다. 이와 같은 숙주 유전자의 활성화에 관해서도 바이러스 기능의 유전학적 해석에 의해 중요한 지식이 얻어질 것이다.
DNA를 게놈 핵산으로 하는 DNA 바이러스의 재구성은 비교적 일찍부터 이루어지고 있으며, 예를 들면 SV40(J.Exp.Cell Res., 43, 415-425(1983))과 같이 정제한 게놈 DNA 그 자체를 원숭이 세포에 도입함으로써 행하는 것이 가능하다.
RNA를 게놈 핵산으로 하는 RNA 바이러스의 재구성은 (+)쇄 RNA 바이러스에서 개발이 선행되었다. 그 이유는 게놈 RNA가 동시에 mRNA로서 기능하기 때문이다. 예를 들면, 폴리오 바이러스에서는 정제한 RNA 자체가 전파력을 갖는다는 것이 이미 1959년에 보고되어 있다(Journal of Experimental Medicine, 110, 65-89 (1959)). 셈리키 삼림 바이러스(Semliki forest virus; SFV)에서는 숙주 세포의 DNA 의존성 RNA 전사 활성을 이용함으로써 cDNA를 세포 내에 도입함으로써 바이러스의 재구성이 가능하다는 것이 보고되었다(Journal of Virology, 65, 4107-4113 (1991)).
나아가, 이러한 재구성 기술을 이용하여 유전자 치료용 벡터의 개발도 진행되고 있다. 문헌 [Bio/Technology,11,916-920(1993), Nucleic Acids Research,23,1495-1501(1995), Human Gene Therapy,6,1161-1167(1995), Method in Cell Biology, 43, 43-53 (1994), Method in Cell Biology, 43, 55-78, (1994)].
그런데, 상술한 바와 같이 센다이 바이러스는 산업적으로 유용한 바이러스로서 이용할 수 있는 장점을 다수 가지고 있음에도 불구하고 (-)쇄 RNA 바이러스이기 때문에 재구성계가 확립되어 있지 않았다. 그것은 바이러스 cDNA를 경유한 바이러스 입자 재구성계가 매우 곤란했다는 것에 기인한다.
상술한 바와 같이, (-)쇄 RNA 바이러스의 RNA(vRNA; viral RNA) 또는 그 상보쇄 RNA(cRNA; complementary RNA)를 단독으로 세포 내에 도입하여도 (-)쇄 RNA 바이러스는 생성되지 않는다는 것이 밝혀져 있다. 이것은 (+)쇄 RNA 바이러스의 경우와 결정적으로 다른 점이다. 또한, 일본 특개평 제4-211377호 공보에는 "(-)쇄 RNA 바이러스의 게놈에 대응하는 cDNA 및 감염성의 (-)쇄 RNA 바이러스의 제조 방법"에 대한 기재가 있는데, 상기 공보의 실험 내용이 그대로 기재되어 있는 문헌 [EMBO. J., 9,3 79-384 (1990)]은 실험의 재현성이 없다는 것이 밝혀져 필자 스스로 논문 내용을 전면적으로 철회하고 있는 문헌 [EMBO. J. 10, 3558 (1991) 참조]으로 미루어 보아 특개평 제4-211377호 공보에 기재한 기술이 본 발명의 선행 기술에 해당하지 않는다는 것은 명확하다.
(-)쇄 RNA 바이러스의 재구성계에 대하여 인플루엔자 바이러스에 관한 보고가 있다(Annu. Rev. Microbiol., 47, 765-790 (1993), Curr. Opin. Genet. DEV., 2, 77-81 (1992)). 인플루엔자 바이러스는 8분절 게놈으로 구성되는 (-)쇄 RNA 바이러스이다. 이러한 보고에 의하면, 미리 그 중의 하나의 cDNA에 외래 유전자를 삽입하고, 또한, 외래 유전자를 포함하는 8개 모두의 cDNA에서 전사된 RNA를 미리 바이러스 유래의 NP 단백질과 회합시켜 RNP로 하였다. 이러한 RNP와 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 세포 내에 공급함으로써 재구성이 성립되었다. 또한, (-)쇄 RNA 바이러스에 대해서는 라브도 바이러스에 속하는 광견병 바이러스에서 cDNA로부터의 바이러스 재구성에 대한 보고가 있다(J. Virol. 68, 713-719 (1994)).
따라서, (-)쇄 RNA 바이러스의 재구성계 기술은 기본적으로는 공지되었으나, 센다이 바이러스의 경우에는 이 수법을 그대로 적용하여도 바이러스를 재구성할 수가 없었다. 또한, 라브도 바이러스에서 바이러스 입자가 재구성되었다는 보고에 대해서는 마커 유전자의 발현 또는 RT-PCR 등으로 확인을 행하고 있을 뿐이며 생산량의 면에서 충분하다고는 할 수 없었다. 나아가, 종래에는 재구성에 필요한 인자를 세포 내에서 결합할 목적으로 천연형의 바이러스 또는 재조합형의 박시니아 바이러스 등의 바이러스를 재구성해야 할 바이러스의 핵산과 동시에 세포에 공급하고 있고, 재구성된 목적하는 바이러스와 그러한 유해한 바이러스의 분리가 용이하지 않다는 문제가 있었다.
<발명의 개시>
본 발명은 제조 효율이 좋은 센다이 바이러스 재구성계를 확립하여 센다이 바이러스의 유전자 조작을 가능하게 하며, 유전자 치료 분야에서 충분히 실용적인 센다이 바이러스 벡터를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 우선 센다이 바이러스의 재구성 시험에 적용하기 위하여 센다이 바이러스 DI 입자(defective interfering particle/EMBO J.,10,3079-3085(1991) 참조) 유래의 cDNA 또는 센다이 바이러스 미니게놈의 cDNA를 사용하여 각종 검토를 행하였다. 그 결과, 세포 내에 도입도는 cDNA, 전사 복제에 관한 cDNA군 및 T7 RNA 폴리머라제 발현 유니트인 재조합체 박시니아 바이러스의 양비(量比)에 대하여 효율이 좋은 조건을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 센다이 바이러스 전체 길이의 cDNA를 (+)쇄와 (-)쇄의 2가지 모두를 수득하고, 세포 내에서 (+)쇄 또는 (-)쇄의 센다이 바이러스 RNA가 생합성되는 플라스미드를 구축하고, 전사 복제에 관한 cDNA군을 발현하고 있는 세포 내에 도입하였다. 그 결과, 센다이 바이러스 cRNA로부터 센다이 바이러스 입자를 재구성하는 것에 비로소 성공하였다. 또한, 본 발명자들에 의해 고효율의 입자 재구성을 위해서는 세포 내에 도입되는 cDNA의 형태가 선상보다는 환상이 적당하며, (-)쇄 RNA가 세포 내에서 전사되기보다는 (+)쇄 RNA 바이러스가 세포 내에서 전사되는 것이 입자 형성 효율이 높다는 것이 새로이 발견되었다.
또한, 본 발명자들은 T7 RNA 폴리머라제 발현 유니트인 재조합체 박시니아 바이러스를 사용하지 않는 경우에도 센다이 바이러스의 재구성을 행할 수 있다는 것을 발견하였다. 즉, 시험관 내에서 전사한 센다이 바이러스 전체 길이의 RNA를 세포 내에 도입하고, 초기 전사 복제 효소군의 cDNA를 T7 프로모터 지배하에 전사시켰을 경우, 바이러스 입자가 재구성되었다. 이것은 초기 전사 복제 효소군을 모두 발현하는 세포를 구축하면 박시니아 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스를 모두 사용하지 않고 재조합체 센다이 바이러스를 만들어내는 것이 가능하다는 것을 나타내고 있다. 또한, 초기 전사 복제 효소군을 모두 발현하는 세포는 문헌[J. Virology, 68, 8413-8417 (1994)]에 기재되어 있고, 이 기재를 참조하여 당업자가 만들어내는 것이 가능하다. 또한, 상기 문헌 기재의 세포는 센다이 바이러스 유전자 중, NP, P/C, L의 3가지를 염색체 상에 갖고 있는 293 세포 유래의 세포이며, 이것은 NP, P/C, L의 3가지의 단백질을 발현하고 있다.
많은 바이러스 벡터의 예에서, 핵산으로부터 바이러스 입자의 재구성이 고효율로 만들어지면, 목적하는 바이러스 유전자를 재조합하거나, 외래 유전자를 삽입하거나 또는 목적하는 바이러스 유전자를 불활성화시키거나 결실시키는 것은 당업자에게 용이하다는 것은 명확하다. 즉, 본 발명에서 처음으로 센다이 바이러스 입자의 재구성에 성공함으로써 본 발명에 있어서 센다이 바이러스의 유전자 조작이 가능해졌음이 당업자에게는 명백한 일이다.
즉, 즉 발명은 이하의 것을 포함한다.
(1) 목적하는 외래 유전자를 포함하거나 또는 목적하는 유전자가 결실 또는 불활성화된 게놈을 보유하고, 전파력을 갖는 재조합체 센다이 바이러스,
(2) 하나 이상의 기능 단백질 유전자가 변이되어 있는 것을 특징으로 하는 (1)에 기재한 재조합체 센다이 바이러스,
(3) 숙주내에서 발현 가능한 외래 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2)에 기재한 재조합체 센다이 바이러스,
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재한 재조합체 센다이 바이러스에 포함되는 RNA를 포함하는 RNA,
(5) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재한 재조합체 센다이 바이러스에 포함되는 RNA의 cRNA를 포함하는 RNA,
(6) (a) (4) 또는 (5)에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 주형 cDNA를 포함하는 DNA 및 (b) 상기 DNA를 주형으로 하여 시험관 내 또는 세포 내에서 (4) 또는 (5)에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 유니트를 포함하는 키트,
(7) (a) 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질(각 단백질은 동등한 활성을 갖는 단백질이어도 좋다)을 발현하는 숙주 및 (b) (4) 또는 (5)에 기재한 RNA를 포함하는 키트,
(8) 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질(각 단백질은 동등한 활성을 갖는 단백질이어도 좋다)을 발현하는 숙주에 (4) 또는 (5)에 기재한 RNA를 도입하는 것을 포함하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재한 재조합체 센다이 바이러스의 제조 방법,
(9) (a) 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질을 발현하는 숙주, (b) (4) 또는 (5) 중 어느 하나에 기재한 RNA 또는 cRNA를 전사할 수 있는 주형 cDNA를 포함하는 DNA 및 (c) 상기 DNA를 주형으로 하여 시험관 내 또는 세포 내에서 (4) 또는 (5)에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 유니트의 3가지를 포함하는 키트,
(10) 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질을 발현하는 숙주에 (4) 또는 (5)에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 주형 cDNA를 포함하는 DNA 및 상기 DNA를 주형으로 하여 시험관 내 또는 세포 내에서 (4) 또는 (5)에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 유니트를 도입하는 것을 포함하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재한 재조합체 센다이 바이러스의 제조 방법,
(11) 숙주에 (3)에 기재한 재조합체 센다이 바이러스를 감염시키고, 발현된 외래 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 외래 단백질의 제조 방법,
(12) (3)에 기재한 재조합체 센다이 바이러스를 숙주에 도입하고 배양액 또는 장뇨액을 회수함으로써 수득할 수 있는, 발현된 외래 단백질을 포함하는 배양액 또는 장뇨액 및,
(13) 코딩하는 단백질의 안티센스 RNA가 전사되는 방향으로 프로모터 하류에 배치된 외래 유전자 및 상기 프로모터를 포함하는, 센다이 바이러스 벡터 중에 도입된 상기 외래 유전자가 코딩하는 단백질을 발현시키기 위한 DNA.
본 발명의 재조합체 센다이 바이러스 벡터는 예를 들면 유전공학적으로 제조한 재조합체 센다이 바이러스 벡터 게놈을 코딩하는 재조합 cDNA를 시험관 내에서 전사하여 재조합체 센다이 바이러스 게놈 RNA를 제조하고, 상기 RNA를 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질(각 단백질은 동등한 활성을 갖는 단백질이어도 좋다)을 동시에 발현하는 숙주에 도입함으로써 얻을 수 있다. 또 다른 방법으로서, 본 발명의 센다이 바이러스 벡터는 ① 유전공학적으로 제조한 재조합체 센다이 바이러스 벡터 게놈을 코딩하는 재조합 cDNA, ② 상기 DNA를 주형으로 하여 세포 내에서 RNA를 전사할 수 있는 유니트를 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질(각 단백질은 동등한 활성을 갖는 단백질이어도 좋다)을 동시에 발현하는 숙주에 도입함으로써 얻을 수가 있다. 이 경우, 예를 들면 ①은 특정 프로모터 하류에 연결되어 있고, ②는 상기 특정 프로모터에 작용하는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 발현하는 DNA일 수 있다.
본 발명의 재조합체 센다이 바이러스에서 목적하는 외래 유전자를 삽입하거나 또는 목적하는 유전자를 결실 또는 불할성화시키기 전의 재료가 되는 센다이 바이러스로서는 파라인플루엔자 1형으로 분류되는 주이면 좋고, 예를 들면 Z주(Sendai virus Z strain), 후시미주(Sendai virus Fushimi strain) 등을 들 수 있다. 또한, DI 입자 등의 불완전 바이러스 또는 합성한 올리고뉴클레오티드 등도 재료의 일부로서 사용할 수가 있다.
또한, 본 발명의 재조합체 센다이 바이러스는 전파력을 보유하는 한 그 재조합체에 포함되는 RNA의 어떠한 부위에 어떠한 외래 유전자가 삽입되어 있어도, 또한, 어떠한 게놈 유전자가 결실 또는 변이되어 있어도 좋다. 삽입되는 외래 유전자로서는 숙주 내에서 발현 가능한 각종 시토킨을 코딩하는 유전자 또는 각종 펩티드 호르몬을 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 목적하는 단백질을 발현시키기 위해서는 목적하는 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 삽입한다.
센다이 바이러스 RNA에는 R1 서열(5'-AGGGTCAAAGT-3')과 R2 서열(5'-GTAAGAAAAA-3') 사이에 6의 배수의 염기수를 갖는 서열을 삽입하는 것이 바람직하다(Journal of Virology, Vol. 67, No. 8 (1993) p.4822-4830). 삽입한 외래 유전자의 발현량은 유전자의 삽입 위치 및 유전자 전후의 RNA 염기 서열에 의해 조절할 수 있다. 예를 들면, 센다이 바이러스 RNA에서는 삽입 위치가 NP 유전자와 가까울수록 삽입된 유전자의 발현량이 많다는 것이 알려져 있다. 또한, 목적하는 단백질을 발현시키기 위한 숙주로서는 재조합체 센다이 바이러스가 감염되는 세포이면 어떠한 것이어도 좋은데, 예를 들면 배양된 포유 동물 세포 또는 계란 등을 들 수 있다. 이러한 숙주에 발현 가능한 외래 유전자를 도입한 재조합체 센다이 바이러스를 감염시켜 발현된 외래 유전자 산물을 회수함으로써 외래 유전자 산물을 고효율로 제조할 수 있다. 발현된 단백질은 예를 들면 배양 세포를 숙주로 하는 경우에는 배양액에서, 계란을 숙주로 하는 경우에는 뇨장액에서, 통상법에 따라 회수할 수 있다. 또한, 외래 유전자를 (-)쇄의 센다이 바이러스 RNA가 생합성되는 플라스미드에 도입할 때에 외래 유전자가 코딩하는 단백질의 안티센스 RNA가 전사되는 쪽으로 외래 유전자를 프로모터 하류에 삽입할 필요가 있다. 이와 같은 "코딩하는 단백질의 안티센스 RNA가 전사되는 방향으로 프로모터 하류에 배치된 외래 유전자와 상기 프로모터를 포함하는, 센다이 바이러스 벡터 중에 도입된 상기 외래 유전자가 코딩하는 단백질을 발현시키기 위한 DNA"는 본 발명에 의해 비로소 이용 가능하게 된 것이며 본 발명의 일부이다.
또, 예를 들면 면역원성에 관여하는 유전자를 불활성화시키거나 RNA의 전사 효율 또는 복제 효율을 높이기 위하여 일부의 센다이 바이러스의 RNA 복제에 관여하는 유전자를 변이시킨 것도 좋다. 구체적으로는 예를 들면 복제 인자인 NP 단백질, P/C 단백질, L 단백질의 적어도 하나를 변이시켜 전사, 복제 기능을 높이거나 약하게 할 수도 있다. 또한, 구조체 단백질의 하나인 HN 단백질은 적혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin) 활성과 노이라미니다제(neuraminidase) 활성 2가지의 활성을 갖는데, 예를 들면 전자의 활성을 약하게 할 수 있으면 혈액 중에서의 바이러스의 안정성을 향상시키는 것이 가능할 것이며, 예를 들면 후자의 활성을 변이시킴으로써 감염 능력을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 막 융합에 관한 F 단백질을 변이시킴으로써 재구성된 센다이 바이러스와 목적하는 약제 또는 유전자 등을 봉입한 인공적인 리포좀을 융합시킨 막 융합 리포좀의 개량에 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 의해 게놈 RNA의 임의의 위치에 점변이 또는 삽입을 도입하는 것이 가능해졌는데, 이에 따라 바이러스 기능의 유전학적 발견이 가속도적으로 축적되는 것이 크게 기대된다. 예를 들면 바이러스 RNA의 복제 메카니즘이 규명되면 그 숙주 세포 유래의 핵산 복제 기구와의 차이를 이용하여 숙주 세포에 충격이 적은 핵산의 복제를 작용점으로 한 항바이러스제를 개발하는 것이 가능하다. 또한, 바이러스 유전자가 코딩하는 단백질이 어떠한 기능을 갖는지를 규명함으로써 바이러스 입자 감염 능력 또는 바이러스 입자 형성 능력에 관한 단백질을 타겟으로 한 항바이러스제를 개발할 수도 있을 것이다. 구체적으로는, 예를 들면 세포 표면의 항원 분자가 될 수 있는 F 단백질 또는 HN 단백질의 항원 제시 에피토프의 해석 등에 이용할 수 있다. 또한, 바이러스에 감염됨으로써 숙주 유전자의 바이러스 저항성에 관한 유전자가 활성화되어 바이러스 항원성을 나타내는 경우, 이와 같은 숙주 유전자의 활성화에 관해서도 바이러스 기능의 유전학적 해석에 의해 중요한 발견을 얻을 수 있을 것이다. 센다이 바이러스는 인터페론의 유도 효과를 갖기 때문에 각종 기초적 실험에 사용되고 있다. 이 유도에 필요한 영역을 해석함으로써 비바이러스성의 인터페론의 유도제를 제작하는 것도 생각할 수 있다. 또한, 본 발명의 기술은 백신의 개발에도 이용할 수 있다. 생백신은 인공적으로 유전자를 변이시킨 재조합체 센다이 바이러스를 발육 계란에 접종하여 제조하는 것도 가능하며, 이와 같이 하여 얻어진 발견을 다른 (-)쇄 RNA 바이러스, 예를 들면 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스와 같은 백신의 필요성이 높은 바이러스에 응용할 수도 있을 것이다. 또한, 본 발명에 의해 유전자 치료용 벡터로서 재조합체 센다이 바이러스를 이용하는 것도 가능해졌다. 본 발명의 바이러스 벡터는 센다이 바이러스에서 유래하므로 안전성이 높으며, 본 바이러스 벡터는 전파력을 유지하고 있으므로 소량의 투여로도 커다란 치료 효과를 올릴 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 치료가 완료되어 바이러스 벡터의 증식을 억제할 필요가 발생했을 때 또는 치료중에 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 저해제를 투여하면 숙주에 충격을 주지 않고 바이러스 벡터의 증식만을 특이적으로 억제할 수가 있다.
도 1은 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA의 구성을 나타내는 도면이다.
도 2는 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA의 구성을 나타내는 도면이다.
도 3는 CV-1 세포로의 SeVgp120의 염색 후의 시간과 HAU의 값 및 gp120의 발현량과의 관계를 나타내는 도면이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하겠는데, 본 발명은 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
센다이 바이러스 전사 유니트 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA 및 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA의 제작
T7 프로모터, (-)쇄 RNA가 전사되도록 설계된 센다이 바이러스 cDNA, 리보자임 유전자를 이 순서로 보유하는 DNA를 pUC18 플라스미드에 삽입한 플라스미드 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA를 제작하였다. 또, T7 프로모터, (+)쇄 RNA가 전사되도록 설계된 센다이 바이러스 cDNA, 리보자임 유전자를 이 순서로 보유하는 DNA를 pUC18 플라스미드에 삽입한 프라스미드 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA를 제작하였다. pUC18/T7(-)HVJRz.DNA 및 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA의 구성을 도 1 및 도 2에 나타냈다.
<실시예 2>
cDNA로부터의 센다이 바이러스 재구성 실험
직경 6 ㎝의 플라스틱 샬레에 통상의 트립신 처리를 실시한 LLC-MK2 세포 2,000,000개와 MEM 배지(MEM+FBS 10 %) 2 ㎖를 첨가하여 CO2 5 %, 37 ℃의 조건하에서 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 1 ㎖의 PBS를 사용하여 세정한 후, 다중 감염도(moi/multiplicity of infection)가 2가 되도록 조제하였다. T7 폴리메라이제를 발현하는 재조합 박시니아 바이러스 vTF7-3을 0.1 ㎖의 PBS에 현탁하여 첨가하였다. 15분마다 바이러스액이 전체에 분산되도록 샬레를 흔들어 1시간 동안 감염을 행하였다. 바이러스 용액을 제거하고 1 ㎖의 PBS를 사용하여 세정하였다. 이 샬레에 cDNA 용액을 포함하는 배지를 첨가하였다. cDNA 용액을 포함하는 배지의 제작은 이하와 같이 행하였다.
표에 나타낸 핵산(센다이 바이러스의 제작에 필요한 인자를 발현하는 플라스미드, pGEM-L, pGEM-P/C, pGEM-NP 포함)을 1.5 ㎖의 셈플링 튜브에 도입하고 HBS(Hepes buffered saline; 20mM Hepes pH7.4, 150mM NaCl)을 첨가하여 총량을 0.1 ㎖로 하였다. 표 중의 (-) 또는 (+)cDNA는 플라스미드 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA 또는 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA 그 자체를 나타내고 /C는 환상인 채, /L은 제한 효소 M1uI에 의해 직쇄화한 후에 세포에 도입되었다는 것을 나타낸다.
다른 한편, 폴리스티렌 튜브 중에서 HBS 0.07 ㎖, DOTAP(베링거 만하임사 제품) 0.03 ㎖을 조합하고 핵산 용액을 이 폴리스티렌 튜브로 옮겼다. 이 상태에서 10분간 정치시켰다. 여기에 세포 배양액(2 ㎖ MEM+FBS 10 %)을 첨가하였다. 다시 이 속에 박시니아 바이러스 저해제인 리팜피신(Rifampicin)과 시토신 아라비노시드(cytosin arabinoside C/Are C)를 최종 농도가 각각 0.1 ㎎/㎖, 0.04 ㎎/㎖이 되도록 첨가하였다. 이에 따라 cDNA 용액을 포함하는 배지가 제작되었다.
상기 샬레를 40시간 동안 CO2 5 %, 37 ℃의 조건하에서 배양하였다. 라바 폴리스만을 사용하여 샬레 내의 세포를 긁어 모아 에펜도르프 튜브로 옮겨 6000 rpm에서 5분간 원심분리를 행하여 세포 성분만을 침전시키고, 다시 1 ㎖의 PBS에 현탁하였다. 이 세포액의 일부를 그대로의 상태, 또는 희석하여 10일령의 발육 계란에 접종하였다. 이 세포액을 표 1에 나타낸 세포수가 되도록 PBS로 희석하고 0.5 ㎖ 접종한 알을 35 ℃에서 72시간 배양한 후 4 ℃로 옮겨 하루밤 정치시켰다. 주사기와 주사침을 사용하여 이 알의 장뇨액을 바이러스액으로서 회수하였다.
회수한 바이러스액의 HAU(hemmaglutinin unit)와 PFU(plaque forming unit)의 측정을 이하에 나타내는 방법으로 행하였다.
HAU의 측정은 이하와 같이 행하였다. 닭의 혈청을 400x g에서 10분간 원심분리하고 상청액을 버렸다. 남은 침전물을 침전물의 100배량의 PBS(-)로 현탁하고, 이것을 다시 400x g에서 10분간 원심분리하여 상청액을 버렸다. 이 조작을 다시 2회 반복하여 0.1 % 혈구 용액을 제작하였다. 바이러스 용액을 단계 희석법으로 2배씩 희석하고, 그 0.05 ㎖씩을 96 구멍의 타이터 플레이트에 주입하였다. 이 타이터 플레이트에 다시 0.05 ㎖씩의 혈구 용액을 주입하고 가볍게 진동시켜 잘 섞은 후 4 ℃에서 40분 정치시켰다. 그 후 적혈구의 응집을 육안으로 관찰하여 응집된 것 중 바이러스 용액의 희석율이 가장 높은 것의 희석율을 HAU로서 나타냈다.
PFU의 측정은 이하와 같이 행하였다. CV-1 세포를 6 구멍의 배양 플레이트 상에 단층이 되도록 생육시켰다. 배양 플레이트의 배지를 버리고 단계 희석법으로 10배씩으로 희석한 바이러스 용액 0.1 ㎖씩을 각각의 배양 플레이트 내의 웰에 주입하여 37 ℃에서 1시간 동안 감염시켰다. 감염중에 혈청이 포함되어 있지 않은 2X MEM과 2 % 한천을 55 ℃에서 혼합하고, 다시 최종 농도 0.0075 ㎎/㎖가 되도록 트립신을 첨가하였다. 1시간 동안의 감염 후에 바이러스 용액을 제거하고 한천과 혼합한 배지 3 ㎖씩을 각각의 배양 플레이트 내의 웰에 첨가하고, 5 % CO2 조건 하에서 37 ℃에서 3일동안 보온하였다. 0.2 ㎖의 0.1 % 페놀 레드를 첨가하여 37 ℃에서 3시간 동안 보온한 후 제거하였다. 색이 부착되지 않은 플라크의 수를 세어 바이러스의 역가를 PFU/㎖로서 평가하였다.
표 1에는 LLC-MK2 세포에 도입한 주형이 되는 센다이 바이러스 cDNA, RNA 복제에 필요한 인자의 cDNA인 pGEM-L, pGEM-P/C 및 pGEM-NP의 양, 인큐베이션 시간, 계란에 접종한 세포수, HAU, PFU를 각각 나타냈다.
주형 cDNA 합계(㎍) pGEM-L(㎍) pGEM-P/C(㎍) pGEM-NP(㎍) 배양시간(시간) 세포수 HAU PFU
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x105 512 2x109
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x105 256 9x108
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x106 256 9x108
(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x105 <2 <10
(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x105 <2 <10
(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x106 <2 <10
(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x104 <2 <10
(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x105 <2 <10
(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x106 <2 <10
(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x104 <2 <10
(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x105 <2 <10
(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x106 4 8x103
HAU, PFU를 함께 나타낸 샘플을 초원심분리로 침전시킨 후, 재부유시켜 20 % 내지 60 %의 자당 밀도 구배 원심분리로 정제하고 12.5 % SDS-PAGE로 단백질을 분리한 결과, 여기에 함유되는 단백질은 센다이 바이러스의 단백질과 같은 크기의 것이었다.
이 결과로부터 cDNA를 세포에 도입하여 센다이 바이러스를 재구성할 수 있다는 것이 나타났다. 또, (+)쇄를 전사하는 cDNA를 세포 내에 도입했을 때에는 (-)쇄를 전사하는 cDNA를 도입했을 때에 비해 바이러스 입자가 고효율로 재구성되는 것으로 밝혀졌다. 또한, cDNA를 환상인 채로 도입했을 때에는 직쇄상으로 도입했을 때에 비해 바이러스 입자가 고효율로 재구성된다는 것이 밝혀졌다.
<실시예 3>
센다이 바이러스 재구성에 필요한 RNA 복제 인자의 검토
L, P/C, NP를 발현하는 플라스미드 3가지 모두가 필요한지 여부를 조사하는 실험을 행하였다. 방법은 실시예 2와 마찬가지이지만 , 실시예 2에서는 cDNA와 함께 pGEM-L, pGEM-P/C 및 pGEM-NP의 3가지를 세포 내에 도입한데 반하여 본 실험에서는 pGEM-L, pGEM-P/C, pGEM-NP 중 임의의 2가지 또는 1가지만을 cDNA와 함께 세포 내에 도입하였다.
표 2는 LLC-MK2 세포에 도입된 주형이 되는 센다이 바이러스 cDNA, RNA 복제에 필요한 인자의 cDNA인 pGEM-L, pGEM-P/C 및 pGEM-NP의 양, 인큐베이션 시간, 계란에 접종한 세포수, HAU, PFU를 각각 나타냈다.
주형 cDNA 합계(㎍) pGEM-L(㎍) pGEM-P/C(㎍) pGEM-NP(㎍) 배양시간(시간) 세포수 HAU PFU
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x105 256 6x108
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x106 512 4x109
(+)cDNA/C 10 0 2 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 2 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 0 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 0 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 2 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 2 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 0 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 0 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 2 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 2 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 0 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 0 0 40 1.00x106 <2 <10
표 2로부터 어떤 조합의 2가지를 도입한 경우에도 바이러스의 생산이 발견되지 않았다. 이 결과, 이 3종의 단백질 모두가 바이러스 재구성에 필수적이라는 것이 확인되었다.
<실시예 4>
시험관 내 전사 RNA로부터의 센다이 바이러스 재구성 실험
실시예 2에서 cDNA로부터 센다이 바이러스가 재구성되는 것을 나타냈는데, 다시 cDNA를 시험관 내에서 전사한 산물, 즉 vRNA 및 cRNA에서도 마찬가지로 되는지 여부를 검토하였다.
센다이 바이러스 전사 유니트 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA 및 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA를 제한 효소 MluI로 직쇄상으로 만든 후 이것을 주형으로서 이용하여 정제 T7 폴리머라제(EPICENTRE TECHNOLOGIES: Ampliscribe T7 Transcription Kit)에 의한 시험관 내 RNA 합성을 행하였다. 시험관 내 RNA 합성 방법은 키트의 프로토콜에 따랐다. 여기에서 얻어진 RNA 산물을 실시예 2의 cDNA 대신에 사용하여 마찬가지의 실험을 행하고 바이러스 생산의 평가는 HA 시험에 의해 행하였다.
결과를 표 3에 나타냈다.
주형 cDNA 합계(㎍) pGEM-L(㎍) pGEM-P/C(㎍) pGEM-NP(㎍) 배양시간(시간) 세포수 HAU PFU
시험관내 (-)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 512 2x109
시험관내 (-)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 512 ND
시험관내 (+)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 2 5x103
시험관내 (+)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 <2 ND
이 결과에 의해 어느쪽 센스의 RNA를 세포 내에 도입하여도 바이러스를 재구성할 수가 있었다.
<실시예 5>
센다이 바이러스 벡터내에 삽입한 외래 유전자의 숙주내 발현의 검토
(1) 외래 유전자(HIV-1 gp120 유전자)가 삽입된 센다이 바이러스 벡터 "pSeVgp120"의 제조
프라이머 a (서열 번호: 1) 및 프라이머 d (서열 번호: 2)를 사용하여 "pNI432" 상의 HIV-1 gp120 유전자를 표준 PCR법으로 증폭하였다.
프라이머 a (서열 번호 1)
프라이머 d (서열 번호 2)
TA 클로닝을 행하여 NotI로 소화시키고 이것을 NotI로 소화한 "pSeV18+"에 삽입하였다. 이어서, 이 플라스미드로 이. 콜라이(E. coli)를 형질전환시키고 이. 콜라이의 각 콜로니의 DNA를 "Miniprep"법으로 추출하여 DraIII 소화후 전기 영동을 행하고 영동된 DNA 중 삽입에 의해 기대되는 크기의 DNA 단편을 포함하고 있다는 것이 확인된 클론을 선발함으로써 양성 클론을 얻었다(이하, 이 양성 클론을 "클론 9"라 칭한다). 목적하는 염기 서열이라는 것을 확인한 후, 염화 세슘 밀도 구배 원심분리로 DNA를 정제하였다. 또한, 이것에 의해 얻어진 gp120이 삽입된 pSeV18+를 "pSeVgp120"이라 칭한다.
(2) pSeVgp120을 보유하는 센다이 바이러스(SeVgp120)의 재구성 및 gp120 발현의 해석
LLCMK2 세포에 pGEM NP, P, L 외에 다시 pSeVgp120을 도입한 것 이외는 실시예 2와 마찬가지 방법으로 발육 계란의 뇨액을 회수하고 HAU의 측정 및 gp120 발현의 검토(ELISA)를 행하였다. HAU의 측정은 실시예 2와 같은 방법으로 행하였다.
또, ELISA는 이하와 같이 행하였다. HIV-1에 대한 모노클로날 항체가 주입된 96 웰 플레이트에 100 μl의 시료를 첨가하여 37 ℃에서 60분 반응시켰다. PBS로 세정한 후, 100 μl의 HRP 결합 항 HIV-1 항체를 첨가하여 37 ℃에서 60분 반응시켰다. 이것을 PBS로 세정후, 테트라메틸벤티딘을 첨가하여 HRP 활성으로 전환되는 반응 생성물의 양을 산성 조건하에 450 nm의 흡광도로 검출함으로써 gp120의 발현량을 측정하였다. 이 결과를 표 4 좌측에 나타냈다.
또, 얻어진 바이러스액은 CV-1 세포에 감염시켜 동일한 검토를 행하였다. CV-1 세포를 1 플레이트당 5×105 세포가 되도록 주입한 후 생육시켜 배지를 버리고 PBS(-)로 세정하여 감염 다중도 10에서 바이러스액을 첨가하여 실온에서 1시간 감염시켰다. 바이러스액을 버리고 PBS(-)로 세정하여 plainMEM 배지(MEM 배지에 항생 물질 AraC, Rif 및 트립신을 첨가한 것)를 첨가하여 37 ℃에서 48시간 반응시켰다. 반응 후 배지를 회수하고 HAU의 측정(실시예 2와 같은 방법) 및 gp120 발현의 검토(ELISA)를 행하였다. 이 결과를 표 4 중앙에 나타냈다. 또한, CV-1 세포의 배양 상청액을 다시 발육 계란에 접종하고 이것에 의해 얻은 바이러스액의 HAU의 측정 결과 및 gp120 발현의 검토(ELISA) 결과를 표 4 우측에 나타냈다.
뇨장액 (F1)gp120(HAU) CV-1 배지 (F1)gp120(HAU) 뇨장액 (F2)gp120(HAU) 단위: ㎍/ml
0.10(4) 3.46(128) 1.56, 1.21(512, 512)
0.15(32) 1.18(128)
0.05(32) 2.20(128)
표 4에서 밝혀졌듯이, CV-1 세포에서 특히 고농도의 gp120이 생산되고(표 중앙), 또 다시 발육 계란에 접종한 뇨장액으로부터도 고농도의 gp120이 검출되었다(표 우측). 또한, 표 4 좌측과 표 4 중앙에는 3가지 클론의 결과를 나타냈다.
또한, gp120의 발현을 웨스턴 블로팅법으로 해석하였다. SeVgp120을 감염시킨 CV-1 세포의 배지를 20,000 rpm으로 1시간 원심분리하여 바이러스를 침전시키고, 상청액을 TCA(10 %(v/v), 빙상에서 15분) 또는 70 % 에탄올(-20 ℃)로 처리하고 15,000 rpm으로 15분 원심분리하고, 침강된 단백질을 "SDS-PAGE Sample buffer"(다이이찌 가가꾸)와 혼합하여 90 ℃에서 3분간 반응시키고, 10 % 아크릴아미드겔 상에서 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 행하였다. 영동 후, 단백질을 PVDF막(다이이찌 가가꾸)에 전사하고, 모노클로날 항체 902를 실온에서 1시간 반응시켰다. 이어서, T-TBS로 세정하고 항mIgG(애머샴사)를 실온에서 1시간 반응시켜 T-TBS로 세정하였다. 다시 HRP 결합 프로테인 A(애머샴사)를 실온에서 1시간 반응시켜 T-TBS로 세정하였다. 여기에 4-클로로-1-나프톨(4CNPlus)(다이이찌 가가꾸)을 첨가하여 gp120을 검출하였다. 그 결과, 예상되는 gp120의 분자량의 위치에 밴드가 검출되었다.
또한, CV-1 세포로의 SeVgp120의 감염 후의 시간과 HAU의 값 및 gp120의 발현량과의 관계를 해석하였다. 10 ㎝ 플레이트에 5×106 세포가 되도록 CV-1 세포를 주입하고 감염 다중도 10에서 SeVgp120을 감염시키고, 그 후 30, 43, 53, 70 시간째에 1 ㎖의 배지를 회수하여 등량의 신선 배지와 혼합하여 HAU의 측정, gp120 발현의 감토(ELISA) 및 웨스턴 프로팅을 행하였다. 이 결과를 도 3에 나타냈다. 도 3에서 밝혀졌듯이, 센다이 바이러스의 HA 타이터의 증가에 따라 gp120 생산량도 증가하는 경향을 나타냈다.
<실시예 6>
각종 형태의 세포에서의 SeVgp120의 증식 및 gp120 발현의 해석
각종 형태의 세포를 사용한 것 이외는 실시예 5와 마찬가지 방법으로 HAU의 측정 및 gp120 발현의 검토(ELISA)를 행하였다. 이 결과를 표 5에 나타냈다.
세포형 시간 (감염후) HAU rgp120 (㎍/ml)
CV-1 96 32 2.5
LLCMK2 48 16 0.5
CHO 55 4 0.46
NIH3T3 48 4 0.25
MT4 24 16 0.8
MOLT4' 24 16 1.2
또한, 표 좌측은 각종 형태의 세포로의 SeVgp120의 감염 후의 시간을 나타냈다. 이 결과 실험을 행한 모든 세포에서 SeVgp120의 증식 및 gp120의 발현이 검출되었다.
<실시예 7>
센다이 바이러스 벡터 내에 삽입한 루시퍼라제 유전자의 숙주내에서의 발현 검토
벡터 삽입용 루시퍼라제 유전자를 단리하기 위하여 하기 30 mer의 프라이머 (서열 번호: 3) 및 69 mer의 프라이머 (서열 번호: 4)를 사용하고 주형으로서 "pHvluciRT4"를 사용하여 표준 PCR법으로 양단에 NotI 부위가 부가된 루시퍼라제 유전자를 단리하였다.
30 mer 프라이머 (서열 번호: 3)
69 mer 프라이머 (서열 번호: 4)
이어서, 이것을 NotI로 소화한 pSeV18+에 삽입하여 루시퍼라제 유전자가 삽입된 센다이 바이러스 벡터를 얻었다. 이어서, LLCMK2 세포에 도입하여 발육 계란에 접종하였다. 발육란의 뇨막을 제거하고 냉 PBS(-)로 2회 세정하여 "lysis buffer"(Picagene WACO) 25 μl을 첨가하여 잘 교반한 후 15000 rpm으로 2분간 원심분리하였다. 상청액 5 μl을 채취하고 기질(IATRON) 50 μl를 첨가하여 96웰 플레이트에 넣어 루미노메타(Luminous CT-9000D, DIA-IARON)로 형광 강도를 측정하였다. 활성은 cps(counts per second)로 표시하였다. 그 결과, 감염 후 24시간째의 CV-1 세포에서 특히 높은 루시퍼라제 활성이 검출되었다(표 6). 또한, 루시퍼라제 유전자가 도입되지 않은 센다이 바이러스를 대조용으로 사용하였다(표 중의 "SeV"로 표시되어 있다). 또, 표에는 2가지 클론의 검출 결과를 나타냈다.
형광 강도 (총수/10초)
뇨장막 CV-1 (감염후 24시간째)
Luc/SeV 669187
2891560 8707815
SeV 69 48
23 49
본 발명에 의해 센다이 바이러스 cDNA로부터 효율좋게 바이러스 입자를 재구성하는 계가 확립되고, 센다이 바이러스에서의 유전자 조작이 가능해져 목적하는 외래 유전자를 포함하거나 또는 목적하는 유전자가 결실 또는 불활성화된 게놈을 유지하고 잔파력을 갖는 재조합체 센다이 바이러스를 얻는 것이 기능해졌다.
서열표
서열 번호: 1
서열의 길이: 38
서열의 형태: 핵산
쇄의 수: 일축쇄
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA
서열
서열 번호: 2
서열의 길이: 69
서열의 형태: 핵산
쇄의 수: 일축쇄
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA
서열
서열 번호: 3
서열의 길이: 30
서열의 형태: 핵산
쇄의 수: 일축쇄
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA
서열
서열 번호: 4
서열의 길이: 69
서열의 형태: 핵산
쇄의 수: 일축쇄
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA
서열

Claims (14)

  1. 목적하는 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함하거나 또는 목적하는 유전자가 결실 또는 불활성화된 센다이 바이러스 유전자를 함유하는 재조합체 센다이 바이러스 게놈을 보유하고, 상기 게놈을 코딩하는 재조합 DNA로부터 헬퍼 바이러스를 이용하지 않고 재구성되어 전파력을 갖는 재조합체 센다이 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 기능 단백질 유전자가 변이되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합체 센다이 바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간을 제외한 숙주 내에서 발현 가능한 외래 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합체 센다이 바이러스.
  4. 제1항 또는 제2항에 기재한 재조합체 센다이 바이러스에 포함되는 RNA로 구성되는 RNA.
  5. 제1항 또는 제2항에 기재한 재조합체 센다이 바이러스에 포함되는 RNA의 cRNA로 구성되는 RNA.
  6. (a) 제4항에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 주형 cDNA를 포함하는 DNA 및 (b) 상기 DNA를 주형으로 하여 시험관 내 또는 세포 내에서 제4항에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 재조합 센다이 바이러스 cDNA에 연결된 전사 프로모터에 작용하는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 발현하는 DNA를 포함하는 재조합체 센다이 바이러스 제조용 키트.
  7. (a) 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질을 발현하는 인간을 제외한 숙주 및 (b) 제4항에 기재한 RNA를 포함하는 재조합체 센다이 바이러스 제조용 키트.
  8. 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질을 발현하는 인간을 제외한 숙주에 제4항에 기재한 RNA를 도입하는 것을 포함하는, 재조합체 센다이 바이러스의 제조 방법.
  9. (a) 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질을 발현하는 인간을 제외한 숙주, (b) 제4항에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 주형 cDNA를 포함하는 DNA 및 (c) 상기 DNA를 주형으로 하여 시험관 내 또는 세포 내에서 제4항에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 재조합 센다이 바이러스 cDNA에 연결된 전사 프로모터에 작용하는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 발현하는 DNA의 3가지를 포함하는 재조합체 센다이 바이러스 제조용 키트.
  10. 센다이 바이러스의 NP 단백질, P/C 단백질 및 L 단백질을 발현하는 인간을 제외한 숙주에 제4항에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 주형 cDNA를 포함하는 DNA 및 상기 DNA를 주형으로 하여 시험관 내 또는 세포 내에서 제4항에 기재한 RNA를 전사할 수 있는 재조합 센다이 바이러스 cDNA에 연결된 전사 프로모터에 작용하는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 발현하는 DNA를 도입하는 것을 포함하는 재조합체 센다이 바이러스의 제조 방법.
  11. 인간을 제외한 숙주에 제3항에 기재한 재조합체 센다이 바이러스를 감염시키고, 발현된 외래 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 외래 단백질의 제조 방법.
  12. 제3항에 기재한 재조합체 센다이 바이러스를 인간을 제외한 숙주에 도입하고, 배양액 또는 장뇨액을 회수함으로써 수득할 수 있는, 발현된 외래 단백질 및 센다이 바이러스 입자를 포함하는 배양액 또는 장뇨액.
  13. 센다이 바이러스 벡터 DNA 중에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 DNA 분자로서,
    a. 프로모터;
    b. 제1항의 센다이 바이러스 게놈에 해당하는 RNA 분자를 코딩하는 cDNA; 및
    c. 외래 DNA를 코딩하는 DNA
    를 포함하고, 상기 외래 DNA는 상기 센다이 바이러스 게놈 중에 도입되었으며, 상기 외래 DNA를 함유하는 센다이 바이러스 게놈은 상기 센다이 바이러스 게놈 과 상기 외래 DNA 모두의 안티센스 RNA가 전사되는 방향으로 상기 프로모터의 하류에 배치된 DNA 분자.
  14. 제1항에 있어서, NP 단백질, P/C 단백질, L 단백질 중 하나 이상을 코딩하는 유전자가 결실 또는 불활성화된 재조합체 센다이 바이러스 게놈을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합체 센다이 바이러스.
KR10-1998-0703241A 1995-11-01 1996-10-22 재조합체 센다이바이러스 KR100525687B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP28541795 1995-11-01
JP95-285417 1995-11-01
PCT/JP1996/003069 WO1997016539A1 (fr) 1995-11-01 1996-10-22 Virus sendai recombinant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR19990067271A KR19990067271A (ko) 1999-08-16
KR100525687B1 true KR100525687B1 (ko) 2005-11-25

Family

ID=17691258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-1998-0703241A KR100525687B1 (ko) 1995-11-01 1996-10-22 재조합체 센다이바이러스

Country Status (11)

Country Link
US (2) US7101685B2 (ko)
EP (1) EP0863202B1 (ko)
KR (1) KR100525687B1 (ko)
CN (1) CN1143892C (ko)
AT (1) ATE470704T1 (ko)
AU (1) AU7335296A (ko)
CA (1) CA2236378C (ko)
DE (1) DE69638196D1 (ko)
DK (1) DK0863202T3 (ko)
HK (1) HK1018078A1 (ko)
WO (1) WO1997016539A1 (ko)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1143892C (zh) * 1995-11-01 2004-03-31 株式会社载体研究所 重组仙台病毒
EP1747889B1 (en) * 1998-05-18 2010-03-10 Seiko Epson Corporation Ink cartridge for an ink-jet printing apparatus
ES2326101T3 (es) * 1998-07-03 2009-09-30 Dnavec Research Inc. Vector de virus arn cadena (-) para celulas nerviosas.
US7241617B2 (en) 1998-07-03 2007-07-10 Dnavec Research, Inc. Sendai viral vectors comprising foreign genes inserted between the R1 and R2 Loci
US6828138B1 (en) 1998-08-11 2004-12-07 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus vector including a gene encoding a chemokine
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
EP1013667B1 (en) * 1998-11-09 2006-10-11 Nippon Biologicals, Inc. Process for preparation of cytokine using a sendai virus expression system
US6490775B1 (en) * 1999-04-23 2002-12-10 Veri-Tek Inc. Press operation verification system
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US7226786B2 (en) 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
WO2000070070A1 (fr) * 1999-05-18 2000-11-23 Dnavec Research Inc. Vecteur de virus paramyxoviridae defectueux dans un gene enveloppe
EP1211318B1 (en) * 1999-09-06 2007-08-08 DNAVEC Research, Inc. Paramyxoviruses comprising a modified transcription start sequence
WO2001032898A2 (en) 1999-11-02 2001-05-10 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
US7314614B1 (en) 1999-11-02 2008-01-01 Dnavec Research, Inc. Recombinant sendai virus vector for introducing exogenous genes to airway epithelia
JP4838962B2 (ja) * 1999-11-02 2011-12-14 株式会社ディナベック研究所 気道上皮細胞への外因性遺伝子導入用組換えセンダイウイルスベクター
CN1418252A (zh) * 2000-01-19 2003-05-14 株式会社载体研究所 副粘病毒属载体在血管内基因转移中的用途
WO2001072340A1 (fr) * 2000-03-30 2001-10-04 Dnavec Research Inc. Vaccin contre le virus du sida, contenant un vecteur du virus de sendai
JP2001275684A (ja) * 2000-03-31 2001-10-09 Nippon Medical Research Kk 組換え体イヌジステンパーウイルスおよびその作製方法
CA2322057A1 (en) 2000-05-18 2001-11-18 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes
KR100807016B1 (ko) * 2000-06-01 2008-02-25 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입레트로바이러스 벡터
AU2001264824A1 (en) * 2000-06-01 2001-12-11 St. Jude Children's Research Hospital Vaccine and gene therapy vector and methods of use thereof
KR20030014392A (ko) * 2000-06-27 2003-02-17 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 신장세포에 유전자를 도입하기 위한 바이러스 벡터
CA2424992A1 (en) * 2000-10-06 2003-04-04 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors for introducing foreign genes into skeletal muscle
JP2002142770A (ja) 2000-11-08 2002-05-21 Dnavec Research Inc 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター
AU2002224113A1 (en) 2000-11-27 2002-06-03 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vector encoding angiogenesis gene and utilization thereof
US6596206B2 (en) * 2001-03-30 2003-07-22 Picoliter Inc. Generation of pharmaceutical agent particles using focused acoustic energy
JP2005523698A (ja) 2002-04-26 2005-08-11 メディミューン・ヴァクシンズ・インコーポレーテッド インフルエンザウイルスの生産用多重プラスミドシステム
US7465456B2 (en) 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
JPWO2003092738A1 (ja) * 2002-04-30 2005-09-08 株式会社ディナベック研究所 ヘマグルチニン活性を低下させた薬剤または遺伝子運搬組成物
WO2003102183A1 (fr) * 2002-06-03 2003-12-11 Dnavec Research Inc. Vecteurs de paramyxovirus codant pour un anticorps et son utilisation
JPWO2004022731A1 (ja) * 2002-09-04 2005-12-22 株式会社ディナベック研究所 シアル酸結合活性を有する膜蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターをグラム陽性菌由来ノイラミニダーゼを用いて製造する方法
CA2503317A1 (en) * 2002-10-24 2004-05-06 Dnavec Research Inc. Method of transferring gene into t cells
CA2816222A1 (en) 2003-06-16 2005-03-03 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
US20070105208A1 (en) * 2003-06-30 2007-05-10 Jun You Minus strand rna virus vector carrying gene modified in high mutation region
KR101279748B1 (ko) * 2003-11-04 2013-07-04 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 유전자 도입된 수상세포의 제조방법
EP1697521B1 (en) 2003-12-23 2010-06-02 MedImmune, LLC Multi plasmid system for the production of influenza virus
CA2553377A1 (en) 2004-01-13 2005-07-28 Dnavec Research Inc. Gene therapy for tumors using minus-strand rna viral vectors encoding immunostimaulatory cytokines
EP1715048A4 (en) * 2004-01-22 2007-02-07 Dnavec Research Inc PROCESS FOR PRODUCING A VIRAL VECTOR
AU2005206410A1 (en) 2004-01-22 2005-08-04 Dnavec Research Inc. Method of producing minus strand RNA virus vector with the use of hybrid promoter containing cytomegalovirus enhancer and avian beta-actin promoter
US20080199438A1 (en) * 2004-03-16 2008-08-21 Dnavec Research Inc. Methods For Suppressing Tumor Proliferation
JPWO2005097988A1 (ja) * 2004-03-23 2008-02-28 株式会社ディナベック研究所 組織の維持および／または修復に関連する骨髄関連細胞
ES2454266T3 (es) 2004-05-25 2014-04-10 Medimmune, Llc Variantes de la hemaglutinina y la neuraminidasa de influenza
JP5296983B2 (ja) 2004-06-24 2013-09-25 株式会社ディナベック研究所 Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
DE102005006388A1 (de) 2005-02-11 2006-08-24 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replikationsdefiziente RNA-Viren als Impfstoffe
ES2527503T3 (es) 2005-03-08 2015-01-26 Medimmune, Llc Virus influenza reordenantes
KR20080016955A (ko) 2005-06-14 2008-02-22 디나벡크 가부시키가이샤 항체의 제작방법
EP2993235B1 (en) 2005-10-28 2019-02-13 ID Pharma Co., Ltd. Gene transfer into airway epithelial stem cell by using simian lentiviral vector pseudotyped with sendai rna virus spike protein
CA2636600A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Dnavec Corporation Novel protein expression system
WO2007139178A1 (ja) 2006-05-31 2007-12-06 Dnavec Corporation アルツハイマー病治療薬
EP2048232A4 (en) * 2006-07-13 2010-10-13 Dnavec Corp NON-REPLICATIVE PARAMYXOVIRIDAE VIRUS VECTOR
WO2008133701A1 (en) 2006-07-21 2008-11-06 Medimmune, Llc. Methods and compositions for increasing replication capacity of an influenza virus
CN101983069B (zh) 2006-08-09 2014-07-16 米迪缪尼有限公司 流感血凝素和神经氨酸酶变体
JPWO2008029790A1 (ja) 2006-09-04 2010-01-21 協和発酵キリン株式会社 新規核酸
EP2426142A3 (en) 2006-10-16 2012-06-13 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
JPWO2008084319A1 (ja) 2006-12-18 2010-04-30 協和発酵キリン株式会社 新規核酸
US20100323428A1 (en) 2007-02-07 2010-12-23 Dnavec Corporation Attenuated minus-stranded rna virus
WO2008129971A1 (ja) * 2007-04-13 2008-10-30 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 改良された持続感染型センダイウイルスベクター
US20100203027A1 (en) 2007-04-27 2010-08-12 Kyushu Univeristy National University Viral vector for gene therapy
JP5666905B2 (ja) 2007-06-18 2015-02-12 メディミューン，エルエルシー ヘマグルチニンポリペプチド中に変化を有するインフルエンザｂウイルス
WO2009044899A1 (ja) 2007-10-03 2009-04-09 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 細胞の増殖を制御する核酸
US20110130442A1 (en) 2008-06-04 2011-06-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Nucleic acid capable of controlling degranulation of mast cell
AU2009268576B2 (en) 2008-07-11 2014-03-27 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CA2731007A1 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Dnavec Corporation Method for production of reprogrammed cell using chromosomally unintegrated virus vector
CN102272302B (zh) 2008-10-31 2015-04-15 生物载体株式会社 增强重组蛋白表达的方法
CN102361649A (zh) 2009-02-12 2012-02-22 米迪缪尼有限公司 流感血凝素和神经氨酸酶变体
JP2009268471A (ja) * 2009-08-07 2009-11-19 Dnavec Research Inc センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質
CN102711812B (zh) 2010-01-08 2014-07-16 国立大学法人京都大学 Tau蛋白病治疗用疫苗
EP2612911B1 (en) 2010-08-30 2018-01-17 ID Pharma Co., Ltd. Composition for inducing pluripotent stem cell, and use thereof
CN102205118B (zh) * 2011-03-25 2013-05-22 天津济命生生物科技有限公司 一种生物制品及其制备方法
US9637758B2 (en) 2011-04-28 2017-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Modified Sendai virus vaccine and imaging vector
WO2013049389A1 (en) * 2011-09-27 2013-04-04 Yale University Compositions and methods for transient expression of recombinant rna
RU2519763C9 (ru) 2012-11-26 2015-04-27 Ольга Вячеславовна Матвеева Метод иммунотерапии онкологических заболеваний и фармацевтические композиции на основе онколитического вируса сендай
CN105916980A (zh) 2013-09-24 2016-08-31 株式会社爱迪药业 用于改进诱导多能干细胞的效率的方法
CN110234347A (zh) 2016-11-17 2019-09-13 国立传染病研究所长代表日本国 使用了非感染性副粘病毒粒子的传染病疫苗
CN111479920A (zh) 2017-07-21 2020-07-31 株式会社爱医隆集团 用于修饰靶序列的多核苷酸及其用途
EP3744847A4 (en) 2018-01-22 2021-12-08 Japan as Represented by The Director-General of National Institute of Infectious Diseases SELECTIVE CD8 POSITIVE T CELL INDUCING VACCINE ANTIGEN
CN112538498B (zh) * 2020-04-20 2023-04-25 梅尔顿(深圳)生物医药技术有限公司 重组仙台病毒的构建方法及其应用
US20230220025A1 (en) 2020-09-04 2023-07-13 Heartseed Inc. Quality Improving Agent for IPS Cells, Method of Producing IPS Cells, IPS Cells, and Composition for Producing IPS Cells
EP4269571A1 (en) 2020-12-25 2023-11-01 Kyoto University Method for producing naive human ips cells from somatic cells
WO2023227758A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vaccine with reduced anti-vector antigenicity

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5217879A (en) * 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5166057A (en) * 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
AU7007491A (en) * 1990-02-02 1991-08-08 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses
JP3029272B2 (ja) * 1990-05-29 2000-04-04 邦忠 下遠野 構造蛋白質遺伝子、組換えベクター、組換えウイルス、ポリペプチドおよびポリペプチドの製造方法
US5665362A (en) * 1990-09-25 1997-09-09 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral vaccines
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5318898A (en) * 1991-04-02 1994-06-07 Genetics Institute, Inc. Production of recombinant bone-inducing proteins
JPH0585943A (ja) * 1991-07-18 1993-04-06 Tonen Corp 組換えワクシニアウイルスを用いる非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現および非ａ非ｂ型肝炎ワクチン
US5445953A (en) * 1991-08-26 1995-08-29 Immuno Aktiengesellschaft Direct molecular cloning of a modified poxvirus genome
JPH05301895A (ja) * 1992-04-22 1993-11-16 Nippon Zeon Co Ltd ハイブリッド抗原タンパク質、それを発現する組み換えウイルス、及びその製造方法
ZA937164B (en) 1992-09-28 1994-05-23 Commw Scient Ind Res Org Delivery system
EP0702085B2 (en) * 1994-07-18 2010-01-13 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Recombinant infectious non-segmented negative strand RNA virus
US5716821A (en) * 1994-09-30 1998-02-10 Uab Research Foundation Prevention and treatment of respiratory tract disease
WO1996010400A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 The Uab Research Foundation Gene therapy vectors and vaccines based on non-segmented negatives stranded rna viruses
DK0780475T4 (da) 1995-08-09 2006-10-23 Schweiz Serum & Impfinst Fremgangsmåde til fremstilling af infektiöse negativ-streng RNA-virus
ATE298789T1 (de) * 1995-10-31 2005-07-15 Dnavec Research Inc Negativstrand rna virus mit selbständiger replikationsaktivität
CN1143892C (zh) * 1995-11-01 2004-03-31 株式会社载体研究所 重组仙台病毒
JP2000509280A (ja) 1996-05-01 2000-07-25 アメリカ合衆国 組換えｄｎａ由来ヌクレオキャプシドタンパク質を用いるウイルストランスフェクタントの作製
AT405939B (de) 1997-02-24 1999-12-27 Immuno Ag Verfahren zur inaktivierung von lipidumhüllten viren
US6231868B1 (en) * 1997-09-30 2001-05-15 University Of Maryland-Biotechnology Institute Method for generating nonpathogenic infections birnavirus from synthetic RNA transcripts
US7241617B2 (en) * 1998-07-03 2007-07-10 Dnavec Research, Inc. Sendai viral vectors comprising foreign genes inserted between the R1 and R2 Loci
US6828138B1 (en) 1998-08-11 2004-12-07 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus vector including a gene encoding a chemokine
EP1013667B1 (en) * 1998-11-09 2006-10-11 Nippon Biologicals, Inc. Process for preparation of cytokine using a sendai virus expression system
US7226786B2 (en) * 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
CN1418252A (zh) * 2000-01-19 2003-05-14 株式会社载体研究所 副粘病毒属载体在血管内基因转移中的用途
WO2001072340A1 (fr) * 2000-03-30 2001-10-04 Dnavec Research Inc. Vaccin contre le virus du sida, contenant un vecteur du virus de sendai
CA2322057A1 (en) * 2000-05-18 2001-11-18 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes
KR20030014392A (ko) * 2000-06-27 2003-02-17 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 신장세포에 유전자를 도입하기 위한 바이러스 벡터
CA2424992A1 (en) * 2000-10-06 2003-04-04 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors for introducing foreign genes into skeletal muscle
AU2002224113A1 (en) * 2000-11-27 2002-06-03 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vector encoding angiogenesis gene and utilization thereof
CA2503317A1 (en) 2002-10-24 2004-05-06 Dnavec Research Inc. Method of transferring gene into t cells
CA2514937A1 (en) 2003-01-31 2004-08-12 Dnavec Research Inc. Paramyxoviral vectors encoding ribozymes and uses thereof
US20070105208A1 (en) * 2003-06-30 2007-05-10 Jun You Minus strand rna virus vector carrying gene modified in high mutation region
KR101279748B1 (ko) 2003-11-04 2013-07-04 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 유전자 도입된 수상세포의 제조방법
CA2553377A1 (en) * 2004-01-13 2005-07-28 Dnavec Research Inc. Gene therapy for tumors using minus-strand rna viral vectors encoding immunostimaulatory cytokines
AU2005206410A1 (en) * 2004-01-22 2005-08-04 Dnavec Research Inc. Method of producing minus strand RNA virus vector with the use of hybrid promoter containing cytomegalovirus enhancer and avian beta-actin promoter
EP1715048A4 (en) * 2004-01-22 2007-02-07 Dnavec Research Inc PROCESS FOR PRODUCING A VIRAL VECTOR
JPWO2005097988A1 (ja) * 2004-03-23 2008-02-28 株式会社ディナベック研究所 組織の維持および／または修復に関連する骨髄関連細胞
JP5296983B2 (ja) * 2004-06-24 2013-09-25 株式会社ディナベック研究所 Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. of Virology, Vol.67(8):4822-4830(1993) *
J. of Virology, Vol.68(12):8413-8417 (1994) *
Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.88:5537-5541 (1991. 7) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1207124A (zh) 1999-02-03
CA2236378A1 (en) 1997-05-09
DK0863202T3 (da) 2010-09-27
US20020098576A1 (en) 2002-07-25
EP0863202A4 (en) 1999-03-03
EP0863202B1 (en) 2010-06-09
EP0863202A1 (en) 1998-09-09
AU7335296A (en) 1997-05-22
US20050266566A1 (en) 2005-12-01
HK1018078A1 (en) 1999-12-10
US7442544B2 (en) 2008-10-28
CN1143892C (zh) 2004-03-31
CA2236378C (en) 2011-01-25
KR19990067271A (ko) 1999-08-16
DE69638196D1 (de) 2010-07-22
US7101685B2 (en) 2006-09-05
WO1997016539A1 (fr) 1997-05-09
ATE470704T1 (de) 2010-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100525687B1 (ko) 재조합체 센다이바이러스
KR100754091B1 (ko) 자율 복제 능력을 갖는 (-)쇄 ｒｎａ 바이러스 벡터
Kato et al. The paramyxovirus, Sendai virus, V protein encodes a luxury function required for viral pathogenesis
Lee et al. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs
Roner et al. Identification of the 5′ sequences required for incorporation of an engineered ssRNA into the reovirus genome
Parks et al. Expression of a foreign gene by recombinant canine distemper virus recovered from cloned DNAs
JP3992200B2 (ja) 組換え体センダイウイルスを利用した膜融合性リポソーム
JP3991339B2 (ja) 組換え体センダイウイルス
JP3638019B2 (ja) 組換え体センダイウイルス
Mühlebach et al. Development of Entry-Targeted Oncolytic Measles Viruses
JP2005102702A (ja) 組換え体センダイウイルス
Salinas et al. Replication and packaging properties of short Paramyxovirus defective RNAs
JP3732204B2 (ja) 自律複製能を有する（−）鎖ｒｎａウイルスベクター
CA2236113C (en) Negative strand rna viral vector having autonomous replication capability
JP2010022338A (ja) ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用
WO2024009086A2 (en) Viral vectors
CN117947022A (zh) 促进t细胞外源性蛋白表达的序列及应用
CN114350619A (zh) 一种携带狂犬病毒基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用
CN117264028A (zh) 一种重组vsv载体、重组vsv病毒及其制备方法和应用
JP2001275684A (ja) 組換え体イヌジステンパーウイルスおよびその作製方法
CN114040979A (zh) 稳定地保持外源基因的人工重组rna病毒的制作方法
JP2004187533A (ja) 非分節（−）鎖ｒｎａウイルス発現ベクター
Jogalekar Analysis of Gene Junction Sequences of Human Parainfluenza Virus Type 3
Cell-Lines 195. Application of Chimeric Adeno-Retroviral Hybrid Vector System for ector System for In Situ Generation of Recombinant Retrovirus and Integrated Liver-Directed Gene T Retrovirus and Integrated Liver-Directed Gene Transfer

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121019

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131018

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee