JP3732204B2 - 自律複製能を有する(−)鎖rnaウイルスベクター - Google Patents
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ヒトや動物に対する遺伝子治療において、治療効果と安全性は極めて重要な課題である。特に、ウイルスの遺伝子を組換えることにより得られる「ウイルスベクター」を用いて行われる治療は、たとえ治療効果が認められる場合でも、遺伝子が染色体DNAの不特定な位置に挿入されたり、組換え体ウイルスや病原性ウイルスが自然界に放出されたり、細胞内に導入された遺伝子発現の制御ができない等の可能性を否定できない場合には、治療行為を極めて慎重に行う必要がある。
(1) 正二十面体構造のカプシドを有するため、外来性遺伝子として挿入できるサイズが、最大約3700ヌクレオチドと限られている。
(2) パッケージされた複合体から核酸が細胞に放出され複製されるまでに、細胞接着、エンドサイトーシス、膜融合、脱殻、複製酵素の翻訳という5段階もの過程が必要である。
(3) パッケージングのときに伝播力のあるウイルス粒子がごく微量形成されるという可能性が否定できない。とくに、感染力が弱まったウイルス粒子でも、内部のRNA自体は伝播力を持つので、遅発的に増幅する可能性があり、チェックすることが困難である。
(4) 蚊等の昆虫により媒介されるウイルスに由来するため、ベクター遺伝子を導入された動物やヒトに野生型のウイルスが混合感染した場合、伝播力を有する組換え体ができる可能性があり、さらにその組換え体が昆虫により自然界に飛散する危険性がある。
(1) 再構成されたウイルスは、マーカー遺伝子の発現やRT-PCR等で確認を行なっているだけであり、生産量の面からベクターウイルスとして十分利用できる再構成系が確立されていない。
(2) 遺伝子治療用のベクターとして、感染能を有するが伝播力を欠如した複合体を作製するためには、(+)鎖RNAウイルスの場合とは異なり、複合体内部に初期転写、複製に必要な因子を包含させる必要があり、このような複合体を大量に増幅させる技術は知られていない。
(3) 再構成に必要な因子を細胞内で供給する目的で、天然型のウイルスや組換え型のワクチニアウイルス等のウイルスをcDNAが導入される細胞に同時に感染させており、それら天然型ウイルスの分離が容易でない。
(1)伝播力を有する特定の(−)鎖RNAウイルスに由来するRNAと、核酸を含まないウイルス構造体とを含む複合体で、細胞感染能とRNA自律複製能とを有するが伝播力を欠如する複合体、
(2)特定のRNAウイルスが非分節型(−)鎖RNAウイルスであることを特徴とする(2)記載の複合体、
(3)特定のRNAウイルスがセンダイウイルスであることを特徴とする(3)記載の複合体、
(4)センダイウイルスRNAまたはセンダイウイルスcRNAを含むRNAで、M,F,HN 蛋白質に相当する遺伝子のうち少なくとも1つ以上の遺伝子が欠失または不活化しているRNA、
(5)(4)記載のRNAと、センダイウイルス由来の核酸を含まないウイルス構造体とを含む複合体で、細胞感染能とRNA自律複製能とを有するが伝播力を欠如する複合体、
(6)(4)記載のRNAを試験管内または細胞内で転写することのできる鋳型DNAを含むDNA、
(7) 複合体内に含まれるRNAが外来性遺伝子を含むことを特徴とする(1)〜(3)または(5)のいずれかに記載の複合体、
(8) 複合体内に含まれるRNAが外来性遺伝子を含むことを特徴とする(3)または(5)に記載の複合体、
(9) 外来性遺伝子を含むことを特徴とする(4)に記載のRNA、
(10) 外来性遺伝子を含むことを特徴とする(6)に記載のDNA、
(11) RNA依存性RNA複製を阻害する薬剤を含む、(1)〜(3)、(5)、(7)または(8)のいずれかに記載の複合体に含まれるRNAの複製阻害剤、
(12) (1)〜(3)、(5)、(7)または(8)のいずれかに記載の複合体が伝播しうる宿主、
(13) (1)〜(3)、(5)、(7)または(8)のいずれかに記載の複合体の、感染能に関わる遺伝子群を染色体上に有し、該複合体を感染せしめたとき、該複合体と同一のものを複製しうることを特徴とする(12)に記載の宿主、
(14) 宿主が動物、動物に由来する細胞、動物の組織または動物の卵であることを特徴とする(12)または(13)に記載の宿主、
(15) 動物が哺乳類であることを特徴とする(14)に記載の宿主、
(16) 動物が鳥類であることを特徴とする(14)に記載の宿主、
(17) (3)、(5)または(8)のいずれかに記載の複合体の、感染能に関わる遺伝子群を染色体上に有し、該複合体を感染せしめたとき、該複合体と同一のものを複製しうることを特徴とする宿主、
(18) センダイウイルスのM遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子またはそれらと同等の機能を有する遺伝子のうち少なくとも1つ以上の遺伝子を染色体上に有する宿主、
(19) センダイウイルスのM遺伝子または同等の機能を有する遺伝子を染色体上に有する宿主、
(20) センダイウイルスのM遺伝子, NP遺伝子, P/C遺伝子および L遺伝子(各遺伝子は同等の機能を有する遺伝子で置換されていてもよい)を染色体上に有する宿主、
(21) センダイウイルスのM遺伝子, F遺伝子およびHN遺伝子(各遺伝子は同等の機能を有する遺伝子で置換されていてもよい)を染色体上に有する宿主、
(22) センダイウイルスのM遺伝子, F遺伝子, HN遺伝子, NP遺伝子, P/C遺伝子およびL遺伝子(各遺伝子は同等の機能を有する遺伝子で置換されていてもよい)を染色体上に有する宿主、
(23) 宿主が動物、動物に由来する細胞、動物の組織または動物の卵であることを特徴とする(17)〜(22)のいずれかに記載の宿主、
(24) 動物が哺乳類であることを特徴とする(23)に記載の宿主、
(25) 動物が鳥類であることを特徴とする(23)に記載の宿主、
(26) a)(1)〜(3)、(5)、(7)または(8)のいずれかに記載の複合体に含まれるRNAもしくは該RNAのcRNA、または該RNAもしくは該cRNAを生合成しうるユニット
b)該RNAもしくは該cRNAの複製に必要な酵素群、または該酵素群を生合成しうるユニット
c)該複合体の、感染能に関わる蛋白質群、または該蛋白質群を生合成しうるユニット
の3者を含むキット、
(27) a)(1)〜(3)、(5)、(7)または(8)のいずれかに記載の複合体に含まれるRNAもしくは該RNAのcRNA、または該RNAもしくは該cRNAを生合成しうるユニット
b)該RNAもしくは該cRNAの複製に必要な酵素群、または該酵素群を生合成しうるユニット
c)(12)〜(25)のいずれかに記載の宿主
の3者を含むキット、
(28) a)(1)〜(3)、(5)、(7)または(8)のいずれかに記載の複合体
b)(12)〜(25)のいずれかに記載の宿主
の2者を含むキット、
(29) a)(3)、(5)または(8)のいずれかに記載の複合体に含まれるRNAもしくは該RNAのcRNA、または該RNAもしくは該cRNAを生合成しうるユニット
b)センダイウイルスのNP,P/C, L蛋白質のすべて、または該蛋白質群を生合成しうるユニット
c)該複合体の感染能に関わる蛋白質群、または該蛋白質群を生合成しうるユニット
の3者を含むキット、
(30) a)(3)、(5)または(8)のいずれかに記載の複合体に含まれるRNAもしくは該RNAのcRNA、または該RNAもしくは該cRNAを生合成しうるユニット
b)センダイウイルスのNP, P/C, L蛋白質のすべて、または該蛋白質群を生合成しうるユニット
c)(17)〜(25)のいずれかに記載の宿主
の3者を含むキット、
(31) a)(3)、(5)または(8)のいずれかに記載の複合体
b)(17)〜(25)のいずれかに記載の宿主
の2者を含むキット、
(32) 宿主内に、(26)a),b)およびc)に記載の3者を導入することにより、(1)〜(3)、(5)、(7)または(8)のいずれかに記載の複合体を製造する方法、
(33) (27)c)に記載の宿主内に、(27)a)およびb)に記載の両者を導入することにより、(1)〜(3)、(5)、(7)または(8)のいずれかに記載の複合体を製造する方法、
(34) (28)a)に記載の複合体を、(28)b)に記載の宿主に感染させることにより、該複合体を増幅し製造する方法、
(35) 宿主内に、(29)a),b)およびc)に記載の3者を導入することにより、(3)、(5)または(8)のいずれかに記載の複合体を製造する方法、
(36) (30)c)に記載の宿主に、(30)a)およびb)に記載の両者を導入することにより、(3)、(5)または(8)のいずれかに記載の複合体を製造する方法、
(37) (31)a)に記載の複合体を、(31)b)に記載の宿主に感染させることにより、該複合体を増幅し製造する方法、
(38) Mに相当する遺伝子が欠失または不活化していることを特徴とする(9に記載のRNA、
(39) M,F,HN に相当する遺伝子がすべて欠失または不活化していることを特徴とする(9)に記載のRNA、
(40) a)(38)に記載のRNA
b)(20)に記載の宿主
c)(19)に記載の宿主
の3者を含むキット、
(41) (40)a)に記載のRNAを、(40)b)に記載の宿主に導入することにより得られる複合体を、(40)c)に記載の宿主に感染させて該複合体を増幅し製造する方法、
(42) (41)の方法により製造された複合体、
(43) a)(39)に記載のRNA
b)(22)に記載の宿主
c)(21)に記載の宿主
の3者を含むキット、
(44) (43)a)に記載のRNAを、(43)b)に記載の宿主に導入することにより得られる複合体を、(43)c)に記載の宿主に感染させて該複合体を増幅し製造する方法、
(45) (44)の方法により製造された複合体、および
(46) RNA依存性RNA複製を阻害する薬剤を含む、(42)、(45)のいずれかに記載の複合体に含まれるRNAの複製阻害剤、
(47) (7)記載の複合体を宿主に導入し、発現した外来性タンパク質を回収する工程を含む、外来性タンパク質の製造方法、
(48)宿主が、伝播力に関する遺伝子のうち、(7)記載の複合体に含まれるRNAにおいて欠如している遺伝子群を発現している細胞である、(47)記載の外来性タンパク質の製造方法。
(49)(7)記載の複合体を宿主に導入し、培養液または漿尿液を回収することによって取得しうる、発現した外来性タンパク質を含む培養液または漿尿液。
T7 プロモーター、(-)鎖RNAが転写されるように設計されたセンダイウイルスcDNA、リボザイム遺伝子をこの順に保持するDNAを、pUC18プラスミドに挿入したプラスミドpUC18/T7(-)HVJRz.DNAを作製した。また、T7 プロモーター、(+)鎖RNAが転写されるように設計されたセンダイウイルスcDNA、リボザイム遺伝子をこの順に保持するDNAを、pUC18プラスミドに挿入したプラスミドpUC18/T7(+)HVJRz.DNAを作製した。pUC18/T7(-)HVJRz.DNAおよびpUC18/T7(+)HVJRz.DNAの構成を図2および図3に示した。
直径6cmのプラスチックシャーレに通常のトリプシン処理を施したLLC-MK2細胞を2,000,000個とMEM培地(MEM +FBS 10%) 2mlとを添加し、CO2 5%, 37℃の条件下で24時間培養した。培養液を取り除き、1mlのPBSを用いて洗浄した後、多重感染度(moi/multiplicity of infection)が2となるように調製した、T7ポリメラーゼを発現する組換えワクチニアウイルスvTF7-3を0.1mlのPBSに懸濁したものを添加した。15分毎にウイルス液が全体にいきわたるようにシャーレを揺らし、1時間の感染を行った。ウイルス溶液を除去し、1mlのPBSを用いて洗浄した。このシャーレに、cDNA溶液を含む培地を添加した。cDNA溶液を含む培地の作製は、以下のように行なった。
L, P/C, NPを発現するプラスミドが三者ともに必要かどうかを調べる実験を行った。方法は実施例2と同様であるが、実施例2ではcDNAとともに、pGEM-L, pGEM-P/C, pGEM-NPの3者を細胞内に導入したのに対し、本実験では、pGEM-L, pGEM-P/C, pGEM-NPのうちの任意の2者または一者のみをcDNAとともに細胞内に導入した。
実施例2で、cDNAからセンダイウイルスが再構成されることを示したが、さらにcDNAをin vitroで転写した産物、すなわちvRNA および cRNAでも同様のことができうるかどうかを検討した。
(1) 外来遺伝子(HIV-1 gp120遺伝子)が挿入されたセンダイウイルスベクター「pSeVgp120」の調製
プライマーa(5'-TGCGGCCGCCGTACGGTGGCAATGAGTGAAGGAGAAGT-3')(配列番号:1)及びプライマーd(5'-TTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTVTTACTACGGCGTACGTCATCTTTTTTCTCTCTGC-3')(配列番号:2)を用い、「pNI432」上のHIV-1 gp120遺伝子を標準的なPCR法により増幅した。TAクローニングを行い、NotIで消化し、これをNotIで消化した「pSeV18+」に挿入した。次いで、これをE.Coliに形質転換し、E.Coliの各コロニーのDNAを「Miniprep」法で抽出し、DraIII消化後電気泳動を行い、泳動されたDNAのうち挿入により期待される大きさのDNA断片を含んでいることが確認されたクローンを選抜することで、陽性クローンを得た(以下、この陽性クローンを「クローン9」と称する)。目的の塩基配列であることを確認後、塩化セシウム密度勾配遠心により、DNAを精製した。なお、これにより得られた、gp120の挿入されたpSeV18+を「pSeVgp120」と称する。
LLCMK2細胞にpGEM NP, P,Lの他に、さらにpSeVgp120を導入した以外は、実施例2と同様の方法で、発育鶏卵のしょう尿液を回収し、HAUの測定及びgp120発現の検討(ELISA)を行った。HAUの測定は、実施例2と同様の方法で行った。
種々の型の細胞を用いた以外は実施例5と同様の方法で、HAUの測及びgp120発現の検討(ELISA)を行った。この結果を表5に示す。
ベクター挿入用のルシフェラーゼ遺伝子を単離するため、プライマー(5'-AAGCGGCCGCCAAAGTTCACGATGGAAGAC-3'(30mer))(配列番号:3)及びプライマー(5'-TGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGATTATTACAATTTGGACTTTCCGCCC-3'(69mer))(配列番号:4)を用い、鋳型として「pHvluciRT4」を用いて、標準的なPCR法により両端にNotI部位の付加したルシフェラーゼ遺伝子を単離した。次いで、これをNotIで消化したpSeV18+に挿入し、ルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターを得た。次いで、LLCMK2細胞に導入し、発育鶏卵に接種した。発育卵のしょう尿膜を切り取り、冷PBS(-)で2回洗浄し、「lysis buffer」(Picagene WACO)25μlを添加し、よく攪拌してから15000rpmで2分間遠心した。その上清を5μlを採取し、基質(IATRON)50μlを添加し、96ウェルプレートに入れ、ルミノメーター(Luminous CT-9000D,DIA-IATRON)で蛍光強度を測定した。活性は、cps(counts per second)で表した。この結果、感染後24時間目のCV-1細胞で、特に高いルシフェラーゼ活性が検出された(表6)。なお、ルシフェラーゼ遺伝子の導入されていないセンダイウイルスを対照として用いた(表中の「SeV」で示してある)。また、表には2クローンの検出結果を示した。
Claims (14)
- 試験管内または細胞内において人工的に作製されたウイルスゲノムの核酸より組換え体センダイウイルスを製造する方法であって、
(a) 組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNA、および
(b) センダイウイルスのNPタンパク質、P/Cタンパク質、およびLタンパク質またはこれらのタンパク質を発現するDNA、
を、宿主に導入する工程を含む方法。 - 試験管内または細胞内において人工的に作製されたウイルスゲノムの核酸より組換え体センダイウイルスを製造する方法であって、
(a) 組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNAを転写しうるDNA、
(b) DNA依存性RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス、ならびに
(c) センダイウイルスのNPタンパク質、P/Cタンパク質、およびLタンパク質またはこれらのタンパク質を発現するDNA、
を、宿主に導入する工程を含む方法。 - 試験管内または細胞内において人工的に作製されたウイルスゲノムの核酸より組換え体センダイウイルスを製造する方法であって、
(a) 組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNAを転写しうるDNA、
(b) DNA依存性RNAポリメラーゼを発現するDNA、ならびに
(c) センダイウイルスのNPタンパク質、P/Cタンパク質、およびLタンパク質またはこれらのタンパク質を発現するDNA、
を、宿主に導入する工程を含む方法。 - 該組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNAが外来性遺伝子を含むことを特徴とする、請求の範囲1〜3のいずれかに記載の方法。
- 該組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNAをコードするDNAにおいて、該外来性遺伝子が5'-AGGGTCAAAGT-3'および5'-GTAAGAAAAA-3'の間に位置する、請求の範囲4に記載の方法。
- 該組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNAが、センダイウイルスゲノムRNA((−)鎖RNA)を含むRNAである、請求の範囲1〜3のいずれかに記載の方法。
- 該組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNAが、センダイウイルスゲノムRNAのcRNA((+)鎖RNA)を含むRNAである、請求の範囲1〜3のいずれかに記載の方法。
- 該宿主をシトシンアラビノシドC存在下で培養する工程をさらに含む、請求の範囲3に記載の方法。
- 該宿主をトリプシン存在下で培養する工程をさらに含む、請求の範囲1〜3のいずれかに記載の方法。
- 該宿主が、鶏卵もしくは発育鶏卵である、、請求の範囲1〜3のいずれかに記載の方法。
- 該宿主が、LLC-MK2細胞、CV-1細胞、CHO細胞、NIH3T3細胞、MT4細胞、MOLT4細胞から成る群より選択される、請求の範囲1〜3のいずれかに記載の方法。
- 以下の(a)〜(c)を含む、試験管内または細胞内において人工的に作製されたウイルスゲノムの核酸より組換え体センダイウイルスを製造するためのキット:
(a) 組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNA、
(b) センダイウイルスのNPタンパク質、P/Cタンパク質、およびLタンパク質またはこれらのタンパク質を発現するDNA、ならびに
(c) (a)および(b)を導入しうる宿主。 - 以下の(a)〜(d)を含む、試験管内または細胞内において人工的に作製されたウイルスゲノムの核酸より組換え体センダイウイルスを製造するためのキット:
(a) 組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNAを転写しうるDNA、
(b) DNA依存性RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス、
(c) センダイウイルスのNPタンパク質、P/Cタンパク質、およびLタンパク質またはこれらのタンパク質を発現するDNA、ならびに
(d) (a)〜(c)を導入しうる宿主。 - 以下の(a)〜(d)を含む、試験管内または細胞内において人工的に作製されたウイルスゲノムの核酸より組換え体センダイウイルスを製造するためのキット:
(a) 組換え体センダイウイルスゲノムRNAまたはそのcRNAを含むRNAを転写しうるDNA、
(b) DNA依存性RNAポリメラーゼを発現するDNA、
(c) センダイウイルスのNPタンパク質、P/Cタンパク質、およびLタンパク質またはこれらのタンパク質を発現するDNA、ならびに
(d) (a)〜(c)を導入しうる宿主。
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